ES2292426T3 - Metodo para detectar probnp n-terminal. - Google Patents
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Abstract
Método para detección de proBNP N-terminal nativo en una muestra, el cual se realiza en formato sandwich con al menos dos anticuerpos capaces de reconocer diferentes epítopos del proBNP N-terminal nativo y fijarse simultáneamente a ellos, caracterizado porque dichos anticuerpos se fijan en la región de los aminoácidos 10-50 del proBNP N-terminal y se obtienen inmunizando un organismo adecuado con NT-proBNP recombinante.
Description
Método para detectar proBNP
N-terminal.
La presente invención se refiere a un método
para la detección de proBNP N-terminal en una
muestra, con al menos dos anticuerpos que reconocen diversos
epítopos del proBNP N-terminal. El método puede
usarse para distinguir o clasificar muestras de personas sanas y
muestras de pacientes según las clases I a IV de la NYHA. Asimismo
la presente invención se refiere al uso de proBNP
N-terminal recombinante como patrón en un método
para la detección de proBNP N-terminal, así como a
anticuerpos que reconocen el proBNP N-terminal
recombinante y a su preparación.
La insuficiencia cardiaca es un fenómeno muy
extendido, particularmente en el mundo occidental. Según el
diccionario médico Roche (1993, Urban & Schwarzenberg) la
insuficiencia cardiaca se define como la incapacidad aguda o
crónica del corazón, ya sea sometido a esfuerzo o en reposo, para
expulsar la sangre necesaria para el metabolismo o para recibir el
retorno venoso (la llamada insuficiencia cardiaca retrógrada y
anterógrada). Por lo tanto falta capacidad de bombeo. Las causas de
insuficiencia cardiaca son múltiples. Entre otras cabe mencionar
las alteraciones inflamatorias y degenerativas del músculo cardiaco,
el trastorno circulatorio coronario, el infarto de miocardio y
lesiones cardiacas. Como consecuencia se producen alteraciones de la
circulación sanguínea periférica, trastornos respiratorios, renales
y del metabolismo electrolítico (edemas) o disminuye la potencia de
la musculatura esquelética.
Según la New York Heart Association (NYHA) la
insuficiencia cardiaca se clasifica en los siguientes tipos NYHA de
acuerdo con pruebas de esfuerzo corporal: I significa ausencia total
de fatiga en caso de un esfuerzo corporal normal, II significa
capacidad de esfuerzo corporal algo limitada, III significa
capacidad de esfuerzo corporal muy limitada y IV que para cualquier
actividad corporal hay un aumento de la mayor parte de signos de
insuficiencia ya existentes incluso en reposo.
Para un tratamiento farmacológico eficaz de la
insuficiencia cardiaca con glicósidos, vasodilatadores, inhibidores
de ACE y/o bloqueadores \beta, antes hay que diagnosticar
exactamente la existencia de una insuficiencia cardiaca,
clasificarla asimismo del modo más preciso posible según su gravedad
y además controlar el curso del tratamiento.
En el estado técnico se discuten algunos
marcadores de suero para el diagnóstico temprano de la insuficiencia
cardiaca, como por ejemplo ANP (hormona peptídica natriurética
atrial N-terminal) y pro-ANP, CNP
(péptido C natriurético), adrenomedulina, neuropéptido Y,
endotelina y BNP (péptido natriurético cerebral). En principio la
ANP y la pro-ANP son adecuadas como marcadores para
diagnosticar la insuficiencia cardiaca, pero tienen poca
estabilidad o poco tiempo medio de vida en sangre, lo cual dificulta
las mediciones diagnósticas (Clin. Sci. 95(3) (1998),
235-239; Cleland y otros, Heart 75 (1996),
410-413).
Un marcador frecuentemente citado y considerado
de gran valor informativo es el BNP (péptido natriurético
cerebral). El BNP fue identificado inicialmente en el cerebro de
cerdos. Se trata de una hormona cardiaca estructural y
funcionalmente análoga al ANP (péptido natriurético atrial) (Sudoh y
otros, Nature 332 (1988), 78-81). El BNP humano,
constituido por 32 aminoácidos, es secretado sobre todo por los
ventrículos del corazón y circula en el plasma sanguíneo humano. El
empleo de BNP como marcador diagnóstico se conoce por ejemplo a
través de la patente EP-A-0 542 255.
El BNP posee un puente de disulfuro intramolecular y como analito no
es muy estable, debido seguramente a su función fisiológica como
hormona, que debe degradarse rápidamente, por lo cual su uso como
marcador diagnóstico es limitado (Masuta y otros, Clin. Chem. Vol.
44 No. 6 Supplement A (1998), 130; Tsuji y otros, Clin. Chem. 40
(1994), 672).
La molécula precursora del BNP, el proBNP,
consta de 108 aminoácidos, de los cuales, los 32 aminoácidos
C-terminales antes citados
(77-108), designados como BNP, desarrollan el
verdadero efecto hormonal. Los aminoácidos
N-terminales 1-76 separados del
precursor se designan como proBNP N-terminal. Además
del BNP (77-108) por el plasma también circula
proBNP N-terminal y otros productos de
descomposición 1-76) (Hunt y otros, Biochem.
Biophys. Res. Com. 214 (1995), 1175-1183), de modo
que el proBNP N-terminal también entra en
consideración como marcador para la insuficiencia cardiaca. No se
ha aclarado si la molécula precursora proBNP también se halla en el
plasma, pero se ha descrito (Hunt y otros, Peptides. Vol.18, No. 10
(1997), 1475-1481) que en el plasma es detectable
una pequeña descarga de proBNP (1-108), aunque,
debido a una descomposición parcial muy rápida en el extremo
N-terminal, le faltan algunos aminoácidos. Esta
molécula está descrita en la literatura como BNP de alto peso
molecular.
En la patente WO 93/24531 (US 5,786,163) se
describe un método inmunológico para detectar proBNP
N-terminal y anticuerpos utilizados para ello. En
este caso, para obtener los anticuerpos se emplean péptidos sueltos
preparados sintéticamente a partir de la secuencia del proBNP
N-terminal. Aunque en principio los anticuerpos se
pueden preparar por inmunización con péptidos, la afinidad con la
molécula completa es en general demasiado baja para lograr la
sensibilidad requerida en un método de ensayo. Asimismo existe el
peligro de que al emplear péptidos se obtengan anticuerpos que
reconozcan, por ejemplo, el extremo C del péptido y por lo tanto
solo puedan fijarse a este fragmento de la molécula completa. La
consecuencia es que estos anticuerpos no pueden fijar la molécula
completa o solo débilmente. En la patente WO 93/24531 se preparan
anticuerpos policlonales contra un péptido suelto derivado del
proBNP N-terminal. Se demuestra que los anticuerpos
fijan el péptido inmunizador (aminoácidos 47-64) en
el ensayo de formato competitivo, pero no se indica que los
anticuerpos sean capaces de fijar proBNP N-terminal
nativo como molécula completa en una muestra. Además el ensayo
"sandwich" descrito en la patente WO 93/24531 no puede
efectuarse en una muestra del modo planteado, ya que no se disponía
de ningún material estándar apropiado y no había previamente ningún
anticuerpo contra dos epítopos distintos.
Otro problema del estado técnico es la
sensibilidad del ensayo. Mediante el ensayo competitivo realizado en
la patente WO 93/24531 -en el cual el péptido 47-64
en forma marcada compite como trazador con una muestra o con el
patrón peptídico no marcado por la fijación a anticuerpos
policlonales de suero de conejo- después de 48 horas de incubación
solo se alcanza una competición muy moderada, de la que en el mejor
de los casos puede deducirse un límite inferior de detección de
aproximadamente 250 fmol/ml. Esto es insuficiente, tanto para
distinguir personas sanas de pacientes con insuficiencia cardiaca,
como para la clasificación diferenciada de muestras de pacientes
según la gravedad de la insuficiencia cardiaca. Además, los largos
tiempos de incubación del ensayo competitivo no son aceptables para
las mediciones rutinarias de las muestras en un laboratorio
automatizado.
Hunt y otros (Clinical Endocrinology 47 (1997),
287-296) también describen un ensayo competitivo
para detectar proBNP N-terminal. Para ello debe
extraerse la muestra de plasma con gran trabajo antes de la
medición, lo cual entraña el peligro de destruir el analito y
producir mediciones falsas. El antisuero empleado en este caso se
genera de manera análoga a la patente WO 93/24531 mediante
inmunización con un péptido sintético. En el caso de Hunt y otros
el antisuero se genera por inmunización con los aminoácidos
1-13 del proBNP N-terminal, como
patrón se utiliza el péptido constituido por los amino-ácidos
1-21. En este ensayo también hay que asumir un
tiempo de incubación prolongado. Después de 24 horas de incubación
se alcanza un límite inferior de detección de 1,3 fmol/ml.
Por tanto en el estado técnico no existe ningún
método para detectar proBNP N-terminal que permita
la detección sensible de proBNP N-terminal nativo
con tiempos de incubación cortos.
Por tanto el objetivo era disponer de un método
para detectar proBNP N-terminal en una muestra,
evitando los citados inconvenientes del estado técnico en la mayor
medida posible. Sobre todo había que conseguir un método de gran
sensibilidad que permitiera distinguir las muestras de las personas
sanas y de los pacientes, así como los tipos I hasta IV de la
NYHA.
Este objetivo se resuelve mediante el método
definido con más detalle en las reivindicaciones, para detectar
proBNP N-terminal en una muestra. El método se
caracteriza por el uso de al menos dos anticuerpos que reconocen
epítopos diferentes del proBNP N-terminal. Estos
anticuerpos se obtienen mediante la inmunización de un organismo
adecuado con proBNP N-terminal recombinante y se
fijan en la región de los amino-ácidos 10-50 del
proBNP N-terminal. Lo fundamental del método de la
presente invención es que se detecta proBNP
N-terminal nativo en una muestra. Es decir, los
anticuerpos deben ser capaces de reconocer en una muestra la
molécula intacta y proBNP no partido (1-108)
eventualmente presente y también, a ser posible, fragmentos
proteolíticamente digeridos y fijarse específicamente a todos
ellos. En el método se usan al menos dos anticuerpos distintos que
se fijan a los diversos epítopos del proBNP
N-terminal. Los epítopos pueden ser lineales o del
tipo llamado conformacional. Los epítopos están localizados
preferentemente de manera que ambos anticuerpos se puedan fijar
simultáneamente y no queden muy alejados entre sí.
Como el método de la presente invención no
permite distinguir entre proBNP N-terminal, proBNP N
y péptidos afines (productos de descomposición) en lo sucesivo se
entiende como NT-proBNP el conjunto de todos los
péptidos reconocidos en el método de ensayo, sobre todo el conocido
proBNP N-terminal (1-76).
Con el término "epítopo" la presente
invención se refiere al sitio donde un anticuerpo se fija
específicamente sobre un complemento de fijación inmunológico, como
por ejemplo un antígeno. Un "epítopo" se define casi siempre
inequívocamente mediante 6 hasta 8 aminoácidos. El complemento de
fijación corresponde en la presente invención al proBNP
N-terminal o a una secuencia parcial del mismo.
Entonces, el epítopo al que se fija el anticuerpo es una región
parcial sobre el complemento de fijación. El epítopo puede existir
en forma lineal o conformacional.
Los dos anticuerpos de diferente especificidad
permiten llevar a cabo un método más rápido de detección del
analito, en lugar del tedioso método de ensayo competitivo del
estado técnico. El método de detección de la presente invención se
puede realizar mediante un ensayo de tipo homogéneo o heterogéneo.
Se prefiere el ensayo de tipo heterogéneo y sobre todo el método
Sandwich, corriente para el especialista.
Este tipo de método para determinar el proBNP
N-terminal se realiza preferentemente en las
siguientes etapas:
- a)
- transformación de la muestra con un primer anticuerpo específico para el proBNP N-terminal que lleva un grupo capaz de fijarse a una fase sólida, o transformación de la muestra con un primer anticuerpo específico para el proBNP N-terminal que ya está unido a una fase sólida,
- b)
- transformación de esta solución con el segundo anticuerpo, el cual reconoce un epítopo del NT-proBNP diferente del reconocido por el primer anticuerpo y lleva un marcador,
- c)
- fijación del complejo inmunológico a una fase sólida que ya puede existir en la etapa a),
- d)
- separación de la fase sólida y la fase líquida,
- e)
- detección del marcador en una o en ambas fases.
Para la determinación cuantitativa se realiza la
misma medición con una cantidad definida de proBNP
N-terminal como patrón y una vez determinada la
muestra se lleva a cabo como etapa f) una comparación entre los
valores medidos del patrón y de la muestra y se efectúa la
cuantificación.
El término "anticuerpo" en el sentido de la
presente invención se refiere a anticuerpos mono o policlonales,
quiméricos o humanizados o a otros anticuerpos obtenibles mediante
modificaciones de tecnología genética, así como a todos los
fragmentos conocidos del especialista - como los fragmentos
F(ab')_{2}, Fab' o Fab. Solo debe estar garantizada la
capacidad de fijación inmunológica específica al proBNP
N-terminal.
El primer anticuerpo específico para el proBNP
N-terminal puede estar unido directamente a la fase
sólida o la fijación a la fase sólida puede tener lugar
indirectamente mediante un sistema de fijación específico. La
fijación directa de este anticuerpo a la fase sólida se realiza por
métodos conocidos del especialista, por ejemplo por adsorción. Si
la fijación se realiza indirectamente mediante un sistema
específico, el primer anticuerpo es un conjugado que consta de un
anticuerpo contra proBNP N-terminal y un componente
reactivo de un sistema de fijación específico. Como sistema de
fijación específico debe entenderse aquí dos partes complementarias
capaces de reaccionar específicamente entre sí. Su poder de fijación
puede estar fundado en una reacción inmunológica o en otra reacción
específica. Como sistema de fijación específico se prefiere una
combinación de biotina y avidina o de biotina y estreptavidina.
Otras combinaciones preferidas son biotina y antibiotina, hapteno y
antihapteno, fragmento Fc de un anticuerpo y anticuerpo contra este
fragmento Fc, o hidrato de carbono y lecitina. Una de las partes
reactivas del sistema de fijación específico forma parte luego del
conjugado.
La otra parte reactiva del sistema de fijación
específico para el primer componente de la unión se encuentra como
recubrimiento de la fase sólida. Aquí se usa preferentemente
estreptavidina o avidina. La unión de la otra parte reactiva del
sistema de fijación específico a un material soporte insoluble puede
efectuarse por métodos conocidos del especialista. En este caso es
adecuada tanto una fijación covalente como adsorbente.
Como fase sólida son adecuados los tubitos de
ensayo o las placas de microtitulación de poliestireno o de
plásticos similares, cuya superficie interna está recubierta con una
parte reactiva del sistema de fijación específico. Asimismo son
apropiadas y especialmente preferidas las sustancias en forma de
partículas, por ejemplo partículas de látex, partículas magnéticas,
tamices moleculares, corpúsculos de vidrio, tubos flexibles de
plástico y similares. También se pueden utilizar soportes porosos
estratificados como papel o nitrocelulosa. Se prefieren
especialmente las bolitas magnéticas, llamadas perlas, que también
están recubiertas con la correspondiente parte del sistema
específico de fijación arriba descrito. Estas micropartículas se
pueden separar de la fase líquida tras la reacción de ensayo, por
ejemplo mediante filtración, centrifugación o, en caso de partículas
magnéticas, con un imán, para llevar a cabo la reacción de
detección.
detección.
El segundo anticuerpo específico reconoce otro
epítopo del proBNP N-terminal, diferente del
reconocido por el primer anticuerpo. La distancia entre ambos
epítopos sobre la molécula tiene que ser suficientemente grande,
para permitir la fijación simultánea de ambos anticuerpos al proBNP
N-terminal sin restricciones, de lo contrario no
puede formarse ningún complejo sandwich.
La reacción de fijación específica entre los
anticuerpos contra el proBNP N-terminal y el proBNP
N-terminal puede detectarse de diversas maneras.
Generalmente el segundo anticuerpo va marcado. Los marcadores
habituales son cromógenos, fluoróforos, sustancias quimio- o
electroquimioluminiscentes, radio-isótopos,
haptenos, marcadores enzimáticos o sustancias igualmente capaces de
formar un par de fijación, por ejemplo biotina/estreptavidina.
Entonces el inmunocomplejo se detecta mediante la señal enviada por
el marcador. El segundo anticuerpo puede estar marcado con el
hapteno digoxigenina, por ejemplo. Este hapteno es fijado a su vez
por otro anticuerpo específico para digoxigenina. El propio
anticuerpo específico para digoxigenina está marcado por ejemplo con
un enzima como la peroxidasa. Luego la detección final tiene lugar
mediante la variación de color o de extinción resultante de la
reacción de la peroxidasa con un substrato adecuado.
Como muestras para la realización del método de
detección de proBNP N-terminal pueden emplearse
todos los fluidos biológicos conocidos del especialista. Las
muestras preferidas son líquidos corporales como sangre entera,
suero sanguíneo, plasma sanguíneo, orina o saliva. Con especial
preferencia se usa suero y plasma sanguíneo.
Aparte de los llamados ensayos húmedos, en los
cuales los reactivos están en fase líquida, también pueden
emplearse todos los formatos de ensayo secos, apropiados para
detectar antígenos, haptenos, péptidos, proteínas, anticuerpos,
etc. En estos ensayos secos o tiras de ensayo, como las descritas
por ejemplo en la patente EP-A-0
186 799, todos los componentes del ensayo, excepto la muestra
analizada, están generalmente aplicados sobre un soporte. La
reacción de detección se produce cuando la tira de ensayo se pone en
contacto con la muestra líquida.
El método de la presente invención está
caracterizado porque el nivel inferior de detección del proBNP
N-terminal es menor de 1 fmol/ml (equivale a 1
pmol/l). La alta sensibilidad según la presente invención, < 1
fmol/ml, se logra sin tiempos de incubación prolongados. En un
ensayo con placas de microtitulación el método suele tener una
duración inferior a 2 horas, preferiblemente de 15 minutos empleando
métodos de detección más sensibles como la
electroquimioluminiscencia. Para el método de detección no existe
prácticamente ningún límite superior en cuanto a la concentración
determinable. En general el límite superior tecnológico viene
predeterminado por el método de medición empleado. El método
también detecta en principio concentraciones muy altas de proBNP
N-terminal.
Otra ventaja del método de la presente invención
es la buena diferenciación de las muestras de pacientes con y sin
insuficiencia cardiaca mediante las mediciones obtenidas. El método
de detección es tan sensible que permite diferenciar entre
pacientes sin enfermedad coronaria y pacientes con una insuficiencia
cardiaca débil o incipiente de los tipos NYHA I y II. El
reconocimiento precoz de una insuficiencia cardiaca incipiente puede
decidir la adopción de un tratamiento farmacológico temprano y, por
tanto, alargar claramente el plazo de supervivencia del
paciente.
También se revela proBNP
N-terminal preparado mediante recombinación. Como
proBNP N-terminal se entiende la fracción
N-terminal, formada por los aminoácidos
1-76, escindida de la molécula precursora proBNP
cuyo tamaño es de 108 aminoácidos. Como proBNP
N-terminal también se entienden partes del mismo que
pueden encontrarse en la sangre debido a reacciones de degradación
de esta molécula.
Hasta la fecha no se conoce en el estado técnico
ningún proBNP N-terminal recombinante, pues no es
fácil de preparar a causa de su corta secuencia de aminoácidos. La
síntesis química de un péptido mayor de 30 aminoácidos no es
ninguna alternativa para la preparación recombinante en un organismo
huésped, debido a la aparición de secuencias erróneas y a la fuerte
disminución del rendimiento por ciclo de síntesis.
No obstante, en un método de detección para
diagnóstico siempre se necesita un material patrón o de control,
mediante el cual, por una parte, se pueda determinar
cuantitativamente el analito y, por otra parte, se pueda comprobar
la capacidad funcional del ensayo. Para proceder a una
cuantificación debe realizarse una calibración cuantitativamente
definida mediante una serie de patrones. Pero una calibración de
este tipo solo tiene sentido si el material usado como patrón se
comporta de manera igual o muy parecida al analito en el ensayo
inmunológico. Lo esencial es que el patrón posea una analogía
estructural y, sobre todo, inmunológica con el analito, suficiente
para que la fijación del patrón a los anticuerpos de detección tenga
lugar del mismo modo que ocurre luego en la muestra con la molécula
nativa.
Según el estado técnico, para un método de
detección de proBNP N-terminal no se dispone de un
material patrón de tal tipo. Solamente se describen péptidos
sintéticos cortos. Con la presente invención se ha podido preparar
por primera vez mediante síntesis genética una secuencia de ADN
codificadora para proBNP N-terminal y conseguir a
continuación una expresión recombinante del proBNP
N-terminal en E. coli. El procedimiento está
explicado en el ejemplo 1.
Por tanto es objeto de la presente invención el
uso de proBNP N-terminal recombinante como patrón en
un método para detectar proBNP N-terminal en una
muestra mediante al menos dos anticuerpos que reconocen diferentes
epítopos del proBNP N-terminal. Estos anticuerpos se
obtienen mediante la inmunización de un organismo adecuado con
proBNP N-terminal recombinante y se fijan en la
región de los aminoácidos 10-50 del proBNP
N-terminal. Asimismo, según el estado técnico, para
la inmunización solo se han usado hasta la fecha péptidos cortos
sintéticos derivados del proBNP N-terminal. La
desventaja de la inmunización peptídica es que la mayoría de las
veces solo se obtienen anticuerpos de muy baja afinidad, o que los
anticuerpos resultantes solo reaccionan con epítopos lineales y el
antígeno nativo doblado no puede ser fijado en la muestra (véase
ejemplo 3).
Por lo tanto, para las inmunizaciones destinadas
a preparar anticuerpos es esencial el empleo de un inmunógeno que
tenga una analogía suficientemente grande con el analito que en
definitiva debe detectarse. Solo así se garantiza que el analito
nativo sea fijado en la muestra por los anticuerpos, con gran
afinidad.
Por tanto también se revela el uso de proBNP
N-terminal recombinante como inmunógeno para
preparar anticuerpos contra proBNP N-terminal.
Otro objeto de la presente invención son los
anticuerpos contra el proBNP N-terminal
recombinante. Los anticuerpos se preparan inmunizando un organismo
apropiado con proBNP N-terminal recombinante y su
característica es que se fijan en la región de los aminoácidos
10-50 del proBNP N-terminal. La
definición del término anticuerpo corresponde a la expresada en las
secciones sobre la realización del ensayo. Los anticuerpos de la
presente invención reconocen epítopos de modo preferentemente
específico en la parte N-terminal del proBNP
N-terminal de 76 aminoácidos, sobre todo en la
región de los aminoácidos 10 a 66, con especial preferencia en la
región de los aminoácidos 10 hasta 50 o 10 hasta 38. Es conveniente
que los epítopos reconocidos por los anticuerpos estén localizados
de tal manera, que el proBNP N-terminal contenido en
una muestra y en fase inicial de digestión proteolítica desde los
extremos aún contenga estos epítopos. Por eso la estabilidad del
analito dentro de la muestra tiene una importancia secundaria. En
las regiones preferenciales del proBNP N-terminal
los epítopos pueden ser lineales o conformacionales.
Por tanto un objeto preferente de la presente
invención son los anticuerpos monoclonales producidos por las
líneas celulares MAK M 10.1.11 y MAK M 13.4.14, depositados y
registrados en el DSMZ-Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH [Banco alemán de
microorganismos y cultivos celulares], Braunschweig, Alemania. Los
anticuerpos producidos por ambas líneas celulares son del tipo IgG.
Las líneas celulares MAK M 10.1.11 y MAK M 13.4.14 también son
objeto de la presente invención.
Asimismo son objeto de la presente invención los
anticuerpos producidos de manera equivalente por las líneas
celulares MAK M 10.1.11 y MAK M 13.4.14 que son capaces de fijar
específicamente el pro-BNP
N-terminal recombinante. "De manera
equivalente" significa que los anticuerpos se obtienen por
inmunización con pro-BNP N-terminal
recombinante.
También son objeto de la presente invención los
métodos para preparar anticuerpos que fijan específicamente
pro-BNP N-terminal recombinante.
Los anticuerpos monoclonales se preparan
preferentemente siguiendo las etapas de inmunizar un organismo
adecuado -por ejemplo de tipo ovino- con pro-BNP
N-terminal producido por recombinación, separación
de los anticuerpos, selección según los epítopos más reactivos y
purificación de los anticuerpos mediante inmunoabsorción sobre
péptidos apropiados. Este procedimiento está descrito en el ejemplo
2.
Los anticuerpos monoclonales se preparan
preferentemente siguiendo las etapas de inmunizar un organismo
adecuado -por ejemplo ratones- con pro-BNP
N-terminal producido por recombinación y selección
de los clones según la reactividad de los anticuerpos con
pro-BNP N-terminal recombinante
nativo en varios grupos de sueros de pacientes. Este procedimiento
está descrito en el ejemplo 3.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente
la presente invención.
Ejemplo
1
La secuencia nucleótida del
pro-BNP N-terminal (secuencia de
aminoácidos 1-76) se preparó por síntesis genética.
A fin de conseguir una expresión óptima del gen en E. coli,
la secuencia de ADN se ajustó a los codones utilizados con mayor
frecuencia en E. coli. Las secuencias de oligonucleótidos que
se emplearon para preparar el gen son las siguientes:
El gen se preparó mediante la PCR (reacción de
polimerasa en cadena) con estos cebadores. El gen amplificado se
clonó y secuenció en un vector adecuado, como p. ej. el vector
pUC19. Para clonarlo en el vector de expresión pQE8 el gen se
recortó del vector pUC19 por los sitios de restricción Bam HI
y Hind III, se ligó al vector pQE8, que permite la expresión
de proteínas con histidina-tag
N-terminal, y se transformó en E. coli M 15
[pREP4].
Para expresar el gen en E. coli se
inoculó un cultivo nocturno de un clon recombinante de E.
coli 1/60 en caldo de Luria (con 100 \mug/ml de ampicilina y
50 \mug/ml de kanamicina) y se indujo con IPTG
(isopropiltiogalactósido; concentración final 1 mM) a una OD 550 de
1. Tras la inducción, los cultivos se incubaron 4 horas más a 37ºC;
luego se centrifugaron y el precipitado celular se recogió en tampón
de fosfato-Na 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM. Una vez
disgregada por ultrasonidos, la suspensión celular se centrifugó y
el sobrenadante se aplicó sobre una columna de
Ni-NTA (nitrilo-triacetato). Tras
una etapa de lavado con tampón de fosfato-Na 50 mM,
pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, el proBNP
N-terminal etiquetado con histidina se eluyó con
tampón de fosfato-Na 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM,
imidazol 300 mM. Las fracciones eluidas se juntaron y se dializaron
contra Tris 50 mM pH 8,0. Para separar impurezas se aplicó el
dializado sobre una columna de
Q-sefa-rosa. La masa del proBNP
N-terminal purificado se determinó mediante
MALDI-TOF.
Ejemplo
2
Se inmunizaron ovejas con
pro-BNP N-terminal recombinante
(1-76) en adyuvante de Freund completo. La dosis
fue de 0,1 mg por animal. Las inmunizaciones se repitieron a
intervalos de 4 semanas durante 10 meses. A las 6 semanas de la
primera inmunización y después una vez al mes, se obtuvieron
muestras de suero que se analizaron para determinar la sensibilidad
y el título.
Del suero crudo de una oveja inmunizada con
pro-BNP N-terminal recombinante se
eliminaron componentes lípidos por deslipidación con Aerosil
(1,5%). Luego se precipitaron las inmunoglobulinas con sulfato
amónico (2 M). El precipitado disuelto se dializó contra KPO_{4}
15 mM, NaCl 50 mM pH 7,0 y se cromatografió sobre
DEAE-sefarosa. La fracción IgG, PAK<rec.
NT-pro-BNP>S-IgG(DE),
pasó al efluente.
Para purificar los anticuerpos policlonales
específicos del NT-proBNP dirigidos contra los
aminoácidos 1-21, PAK<rec.
NT-pro-BNP>M-IgG(IS,
1-21), se utilizó el péptido biotinilado
C-terminal HPLGSPGSASDLETSGLQE
QR-Bi (1-21-Bi, SEQ ID Nº 7). La matriz de afinidad se preparó cargando 10 ml de partículas de polimetacrilato recubierto de estreptavidina (nº de pedido 1529188, Boehringer Mannheim) con 1 mg de péptido (1-21-Bi).
QR-Bi (1-21-Bi, SEQ ID Nº 7). La matriz de afinidad se preparó cargando 10 ml de partículas de polimetacrilato recubierto de estreptavidina (nº de pedido 1529188, Boehringer Mannheim) con 1 mg de péptido (1-21-Bi).
Se cargó una columna con 10 ml de la matriz de
afinidad y se equilibró con KPO_{4} 50 mM, NaCl 150 mM pH 7,5
(PBS). Para la primera etapa de la cromatografía de afinidad
secuencial se aplicaron 850 mg de
PAK<NT-pro-BNP>S-IgG(DE)
a la columna. El efluente se reservó para una segunda etapa (véase
abajo). La columna se lavó con PBS y KPO_{4} 20 mM, NaCl 500 mM,
Triton X-100 0,1%, ácido
deoxicólico-Na pH 7,5. La IgG unida específicamente
a la matriz de afinidad se eluyó con el tampón de elución
ImmunoPure® Gentle Ag/Ab (Pierce, Product #: 21013). La matriz de
afinidad se regeneró con ácido propiónico 1 M y se conservó en
PBS/NaN_{3}.
Por el mismo proceso arriba descrito se usó el
péptido Bi-ELQVEQTSL
(Bi-30-38 SEQ ID Nº 8) en la
preparación de una matriz de afinidad para purificar
inmunoglobulinas específicas de
NT-pro-BNP dirigidas contra los
aminoácidos 30-38. Del efluente de la primera
purificación por afinidad se obtuvo PAK<rec.
NT-pro-BNP>M-IgG(IS,
30-38).
Los anticuerpos purificados por afinidad se
dializan contra el tampón de biotinilación (KPO_{4} 100 mM, NaCl
70 mM pH 8,0) y la disolución se ajusta seguidamente a una
concentración proteica de 1 mg/ml. Se disuelve
D-biotinoíl-ácido amino
caproico-N-hidroxisuccinimidoéster
en DMSO y se mezcla con la solución de anticuerpos en relación
molar 1:7,5. La reacción se para añadiendo L-lisina
y el exceso de reactivo marcador se elimina por diálisis.
Los anticuerpos purificados por afinidad se
dializan contra el tampón de digoxigenilación (KPO_{4} 100 mM,
NaCl 70 mM pH 7,6) y la disolución se ajusta seguidamente a una
concentración proteica de 1 mg/ml. Se disuelve
digoxigenin-3-CME-N-hidroxisuccinimidoéster
en DMSO y se mezcla con la disolución de anticuerpos en una relación
molar 1:5. La reacción se para añadiendo L-lisina y
el reactivo marcador sobrante se elimina por diálisis.
\newpage
Ejemplo
3
Se inmunizan ratones Balb/c de
8-12 semanas de edad con 100 \mug del antígeno
proBNP N-terminal recombinante en adyuvante de
Freund completo por vía intraperitoneal. Después de 6 semanas se
realizan las otras tres inmunizaciones a intervalos de 4 semanas.
Una semana después de la última inmunización se extrae sangre y se
determina el título de anticuerpos en el suero de los animales de
experimentación. Del bazo de los ratones que han dado reacción
positiva se obtienen los linfocitos B y se fusionan con una línea
celular permanente de mieloma. La fusión tiene lugar según el
conocido método de Köhler y Millstein (Nature 256, 1975, p.
495-497). Los cultivos primarios de células
híbridas así formados se clonan del modo habitual, p.ej. empleando
un medio selectivo comercial o mediante "dilución limitante".
Solo se tratan los cultivos de clones que en un ensayo adecuado
-como por ejemplo un ensayo inmunológico enzimático (método ELISA)-
reaccionan positivamente con proBNP N-terminal
recombinante y reconocen proBNP N-terminal natural
en sueros de pacientes (véase punto 2.). De esta manera se obtienen
varias líneas celulares de hibridomas productoras de los anticuerpos
monoclonales conforme a la presente invención.
Para provocar ascitis se inyectan 5 x 10^{6}
hibridomas por vía intraperitoneal en ratones Balb/c tratados
1-2 veces previamente con 0,5 ml de Pristan. Después
de 2-3 semanas puede obtenerse líquido ascítico de
la cavidad abdominal. De ahí se pueden aislar los anticuerpos del
modo habitual. Estos anticuerpos monoclonales están dirigidos
específicamente contra proBNP N-terminal humano y se
designan de aquí en adelante como MAK M 10.1.11 y MAK M 13.4.14.
Ambos anticuerpos monoclonales pertenecen a la subclase IgG1,
kappa.
De este modo se pudieron aislar ambas líneas
celulares, clon MAK M 10.1.11 y MAK M 13.4.14, que se depositaron
en la DSMZ, tal como se ha mencionado anteriormente.
Para reconocer la presencia y la especificidad
de anticuerpos contra NT-pro-BNP en
el suero de los ratones inmunizados, en el sobrenadante del cultivo
de células híbridas o en líquido ascítico se evaluaron los clones
según las normas de ensayo siguientes:
Se fijan placas de microtitulación (Maxisorb, de
Nunc) con 2,5 \mug/ml de NT-proBNP recombinante
como antígeno en tampón de carga (carbonato/bicarbonato sódico 0,2
M, pH 9,3-9,5, de la firma Boehringer, nº de cat.
726 559), 100 \mul/pocillo, agitando 1 hora a temperatura
ambiente. El postratamiento se efectúa en tampón PBS (salino
tamponado con fosfato, de la firma Oxid, código-BR
14a) y 1% de Byco C, 30 minutos. A continuación se lava con un
tampón de lavado (0,9% de disolución de cloruro sódico, 0,05% de
Tween 20). La incubación de las muestras con anticuerpos se realiza
con 100 \mul/pocillo, agitando 1 hora a temperatura ambiente.
Luego se lava dos veces más con solución de lavado y se efectúa
otra incubación con el anticuerpo detector
PAK<M-Fc\gamma>S-Fab-peroxidasa-conjugado
(Boehringer Mannheim, nº de catálogo 1500 686), 100 mU/ml, 100
\mul/pocillo, agitando 1 hora a temperatura ambiente. Después de
lavar otra vez con tampón de lavado se determina la reactividad de
peroxidasa del modo habitual (por ejemplo con ABTS®, 30 minutos a
temperatura ambiente, se lee la diferencia de extinción en mE, a
405 nm, mediante un lector ELISA).
En este caso se fijan placas de microtitulación
cargadas de estreptavidina, empleando como antígeno 250 ng/ml de
péptidos de proBNP N-terminal conjugados con
biotina, de las secuencias 1-10,
8-18, 1-21, 16-30,
30-38, 39-50, 50-63
o 64-76, en tampón PBS (salino tamponado con
fosfato, de la firma Oxid, código-BR 14a) con 0,5%
de Byco C, 100 \mul/pocillo, agitando 1 hora a temperatura
ambiente. A continuación se lava con tampón de lavado (0,9% de
disolución de cloruro sódico, 0,05% de Tween 20). La incubación de
las muestras con anticuerpos y la reacción de detección tiene lugar
del modo descrito en a). Por la reactividad con determinados
péptidos de NT-pro-BNP se puede
captar la situación del epítopo.
Se fijan placas de microtitulación (Maxisorb, de
Nunc) con 5 \mug/ml de PAK<human
pro-BNP>S-IgG (IS,
1-21) o
(30-38)S-IgG en tampón de
recubrimiento (carbonato/bicarbonato sódico 0,2 M, pH
9,3-9,5, de la firma Boehringer, nº de cat. 726
559), 100 \mul/pocillo, agitando 1 hora a temperatura ambiente. El
postratamiento se efectúa en tampón PBS (salino tamponado con
fosfato, de la firma Oxid, código-BR 14a) y 1% de
Byco C, 30 minutos. A continuación se lava con un tampón de lavado
(0,9% de disolución de cloruro sódico, 0,05% de Tween 20). La
incubación con antígeno nativo en plasma del paciente diluido en
tampón PBS tiene lugar con 100 \mul/pocillo, agitando 1 hora a
temperatura ambiente. Tras otra etapa de lavado se incuban las
muestras de anticuerpos, con 100 \mul/pocillo, agitando 1 hora a
temperatura ambiente. Luego se lava dos veces más con solución de
lavado y se efectúa otra incubación con el anticuerpo detector
PAK<M-Fc\gamma>S-Fab-peroxidasa-conjugado
(de la firma Boehringer Mannheim, nº de cat. 1500 686), 100 mU/ml,
100 \mul/pocillo, agitando 1 hora a temperatura ambiente. Después
de lavar otra vez con tampón de lavado se determina la reactividad
de peroxidasa del modo habitual (por ejemplo con ABTS®, 30 minutos
a temperatura ambiente, se lee la diferencia de extinción en mE, a
405 nm, mediante un lector ELISA).
a) Reactividad de los MAKs (c = 5 \mug/ml)
resultantes de la inmunización con péptidos de proBNP
N-terminal:
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos monoclonales obtenidos de las
inmunizaciones con diferentes péptidos reaccionan muy fuertemente
con los respectivos péptidos. La reactividad con el proBNP
N-terminal recombinante solo es apreciable para 2
anticuerpos monoclonales, mientras que en un grupo de pacientes no
tiene lugar ninguna reacción con proBNP N-terminal
nativo (ver tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
b) Reactividad de los anticuerpos monoclonales
(MAK) resultantes de la inmunización con proBNP
N-terminal recombinante:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos monoclonales obtenidos de la
inmunización con proBNP N-terminal recombinante solo
reaccionan ocasionalmente con los péptidos, pero muy fuertemente
con proBNP N-terminal recombinante o con proBNP
N-terminal nativo en un grupo de pacientes. La
falta de reacción de algunos anticuerpos monoclonales con los
péptidos denota la detección de los llamados epítopos
conformacionales (ver tabla 2).
\newpage
c) Reactividad de los PAKs resultantes de la
inmunización con proBNP N-terminal recombinante:
El PAK obtenido reaccionó más fuertemente con
los péptidos 1-21 y 30-38. Por este
motivo se eligieron estos epítopos y el PAK fue inmunosorbido
positivamente mediante estos péptidos. El PAK inmunosorbido con el
péptido 1-21 tiene la reacción más fuerte con la
región 8-20 y claramente más débil con la secuencia
1-10 N-terminal. Los PAKs
inmunosorbidos de este modo reaccionan muy fuertemente con el proBNP
N-terminal recombinante y en el formato sandwich
PAK/PAK con la muestra nativa (ver tabla 3).
Ejemplo
4
Con los anticuerpos obtenidos en los ejemplos 2
y 3 se pudo organizar un inmunoensayo muy sensible. En general son
adecuados todos los formatos de ensayo que permiten el uso de 2
anticuerpos con diferente reconocimiento de epítopos. Como ejemplo
se describe uno denominado Sandwich-ELISA.
Como fase sólida se empleó una placa de
microtitulación (PMT) recubierta de estreptavidina. En los pocillos
de la PMT se pipetean 10 \mul de muestra no tratada o calibrador
junto con 100 \mul de tampón que contiene ambos anticuerpos
epítopo-específicos y se incuban 1 hora a
temperatura ambiente. Como anticuerpos se emplearon 1 \mug/ml de
PAK<rec.
NT-pro-BNP>S-IgG
(IS,1-21) biotinilado y 0,5 \mug/ml de PAK<rec.
NT-pro-BNP>S-IgG(IS,
30-38) digoxigenilado. A continuación se aspira la
solución y se lava con 3 x 350 \mul de tampón de lavado. Luego se
pipetean adicionalmente 100 \mul de solución de conjugado y se
incuba de nuevo 1 h a temperatura ambiente. Como conjugado se
utiliza un anticuerpo antidigoxina conjugado con POD a una
concentración de 100 mIU/ml. Después se aspira la solución de
conjugado y se lava con 3 x 350 \mul de tampón de lavado. Por
último se pipetea solución de substrato ABTS® en los pocillos y se
tiene 30 minutos a temperatura ambiente. Una vez transcurridos los
30 minutos de la reacción del substrato se mide enseguida la placa
de microtitulación en un lector de PMT a una longitud de onda de
405 nm frente a la longitud de referencia de 495 nm.
Para determinar la sensibilidad se formó una
curva de calibración y se midió la precisión del patrón cero (n =
21). Como calibrador se empleó plasma EDTA humano incrementado con
proBNP N-terminal recombinante en la concentración
necesaria. Como patrón cero se usó plasma bovino. Los resultados
están indicados en la tabla 4.
Con una pendiente de la curva de calibración de
22,5 mE x ml/fmol y una desviación estándar de 5,7 mE, según la
fórmula de Kaiser resulta el siguiente límite inferior de
detección:
LID = 3 \
DE_{patrón \ cero}/pendiente \ CC = 3 \ x \ 5,7/22,5 = 0,76 \
fmol/ml
Ejemplo
5
Con la ayuda del Sandwich-ELISA
descrito en el ejemplo 4 se midió la estabilidad del analito proBNP
N-terminal. Para ello se extrajo sangre de 4
pacientes de NYHA tipo II-III con tubitos que
contenían EDTA y se conservó 3 días a temperatura ambiente. Se tomó
una muestra cada día y se midió el contenido de proBNP
N-terminal. Tanto la muestra de referencia como las
muestras para determinación de estabilidad en
plasma-EDTA se enfriaron enseguida a
4ºC-8ºC y se centrifugaron al cabo de 15 minutos.
Los plasmas-EDTA se guardaron a 4ºC y a temperatura
ambiente, y se midieron en diferentes momentos dentro de un periodo
de exposición de 24 horas. Los resultados están indicados en la
tabla 5:
Estos datos demuestran que el proBNP
N-terminal es totalmente estable dentro de los
intervalos de prueba y por tanto puede usarse como parámetro
rutinario. Este resultado se contradice con la literatura (Hunt y
otros, Clinical Endocrinology, 47, 287 (1997)) y confirma la
suposición de que se puede influir en la sensibilidad del analito
seleccionando y diseñando este formato de ensayo con 2 anticuerpos
específicos cuyos epítopos no estén situados en los extremos
externos del analito.
Ejemplo
6
Para determinar la sensibilidad diagnóstica se
empleó de nuevo el ensayo descrito en el ejemplo 4. Para ello se
examinaron 114 personas sanas y 235 pacientes con una clasificación
NYHA entre I y IV. La distinción entre personas sanas y pacientes
de tipo NYHA-I suele ser especialmente crítica.
Mediante este ensayo de gran sensibilidad se
calculó una mediana de 6,6 fmol/ml de NT-proBNP con
una desviación estándar de 7, 3 fmol/ml para los 110 donantes de
sangre sanos. El valor más bajo fue de 0,2 fmol/ml, lo cual
demuestra claramente que es necesaria una sensibilidad < 1,0
fmol/ml para abarcar exactamente el intervalo de referencia. Con la
ayuda de esta distribución se calculó un valor de 26,6 fmol/ml para
el margen normal superior (percentil del 97,5%).
Tomando como referencia el intervalo de
0-26,6 fmol/ml, de los 233 pacientes con NYHA
I-IV solo se hallaron 16 con un valor comprendido
en el margen normal, lo cual corresponde a una sensibilidad clínica
del 93,3%. Si solo se consideran los pacientes con una NYHA del
tipo I, dan positivo 30 de los 37 pacientes, lo cual corresponde a
una sensibilidad del 81,1%.
Este resultado demuestra que con este ensayo de
proBNP N-terminal se pueden distinguir claramente
los pacientes con una insuficiencia cardiaca del tipo I del
conjunto normal de personas sanas, lo cual no había podido
conseguirse hasta la fecha con los ensayos disponibles en el estado
técnico (Dagubatti y otros, Cardiovascular Research 36 (1997),
246.
<110> Roche Diagnostics GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Verfahren zum Nachweis van
N-terminalem proBNP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 51810AWO -SZ
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggatccca cccgctg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaagctta acgcggagc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Método para detección de proBNP
N-terminal nativo en una muestra, el cual se realiza
en formato sandwich con al menos dos anticuerpos capaces de
reconocer diferentes epítopos del proBNP N-terminal
nativo y fijarse simultáneamente a ellos, caracterizado
porque dichos anticuerpos se fijan en la región de los aminoácidos
10-50 del proBNP N-terminal y se
obtienen inmunizando un organismo adecuado con
NT-proBNP recombinante.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque el límite de detección del proBNP
N-terminal está por debajo de 1 fmol/ml en la
muestra empleada.
3. Método según la reivindicación 1 o 2,
caracterizado porque los valores obtenidos permiten
diferenciar las muestras de los pacientes sanos y las muestras de
los pacientes con insuficiencia cardiaca de los tipos NYHA I a
IV.
4. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque los valores obtenidos
permiten distinguir entre muestras de pacientes sanos y muestras de
pacientes con insuficiencia cardiaca del tipo
NYHA-I.
5. Empleo del método según una de las
reivindicaciones precedentes para distinguir entre muestras de
pacientes sanos y muestras de pacientes con insuficiencia cardiaca
de los tipos NYHA I a IV.
6. Empleo del proBNP N-terminal
recombinante como patrón en un método para detectar proBNP
N-terminal según las reivindicaciones 1 a 4.
7. Anticuerpos contra proBNP
N-terminal preparados mediante inmunización de un
organismo apropiado con proBNP N-terminal preparado
por recombinación, caracterizados porque se fijan
específicamente en la región de los aminoácidos 10 hasta 50 del
proBNP N-terminal.
8. Anticuerpos según la reivindicación 7,
adquiribles de las líneas celulares M 10.1.11 (DSM ACC 2386) o M
13.4.14 (DSM ACC 2387) depositadas el 26.01.1999 en la DSMZ.
9. Anticuerpos según la reivindicación 8
preparados mediante proBNP N-terminal de modo
equivalente a los anticuerpos de las líneas celulares M 10.1.11
(DSM ACC 2386) o M 13.4.14 (DSM ACC 2387).
10. Líneas celulares M 10.1.11 (DSM ACC 2386) o
M 13.4.14 (DSM ACC 2387) depositadas el 26.01.1999 en la DSMZ.
11. Método para preparar anticuerpos
policlonales según la reivindicación 7 o 9, que comprende las etapas
de inmunizar un organismo apropiado con proBNP
N-terminal preparado por recombinación, separar los
anticuerpos, seleccionar según los epítopos más reactivos y
purificar los anticuerpos mediante inmunosorción en péptidos
adecuados.
12. Método para preparar anticuerpos
monoclonales según las reivindicaciones 7 a 9, que comprende las
etapas de inmunizar un organismo apropiado con proBNP
N-terminal preparado por recombinación y seleccionar
los clones según la reactividad de los anticuerpos con proBNP
N-terminal nativo en diversos grupos de sueros de
pacientes.
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| DE19903489 | 1999-01-29 | ||
| DE19903489 | 1999-01-29 | ||
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