ES2232876T3 - Formula de vacuna polinucleotidica aviar. - Google Patents

Formula de vacuna polinucleotidica aviar.

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ES2232876T3
ES2232876T3 ES97934579T ES97934579T ES2232876T3 ES 2232876 T3 ES2232876 T3 ES 2232876T3 ES 97934579 T ES97934579 T ES 97934579T ES 97934579 T ES97934579 T ES 97934579T ES 2232876 T3 ES2232876 T3 ES 2232876T3
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virus
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promoter
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Jean-Christophe Audonnet
Annabelle Bouchardon
Michel Riviere
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Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS
Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
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Merial SAS
Merial Inc
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Abstract

LA FORMULA DE VACUNA AVIAR, COMPRENDE AL MENOS TRES VALENCIAS DE VACUNA POLINUCLEOTIDICA QUE INCLUYEN CADA UNA UN PLASMIDO QUE INTEGRA, PARA EXPRESAR IN VIVO EN LAS CELULAS HUESPEDES, UN GEN DE UNA VALENCIA DE PATOGENO AVIAR, SIENDO ELEGIDAS ESTAS VALENCIAS EN EL GRUPO QUE CONSISTE EN VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE MAREK, VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE, VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE GUMBORO, VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA Y VIRUS DE LA ANEMIA INFECCIOSA Y LOS PLASMIDOS COMPRENDEN, PARA CADA VALENCIA, UNO O VARIOS GENES ELEGIDOS EN EL GRUPO QUE CONSISTE EN GB Y GD PARA EL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE MAREK, NM Y F PARA EL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE, VP2 PARA EL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE GUMBORO, S, M Y N PARA EL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA Y C + NS1 PARA EL VIRUS DE LA ANEMIA INFECCIOSA.

Description

Fórmula de vacuna polinucleotídica aviar.
La presente invención trata de una vacuna que permite la vacunación de especies aviares, en particular de los pollos, contra la enfermedad de Newcastle, y eventualmente contra una o varios patógenos aviares.
En el pasado ya se han propuesto las asociaciones de vacunas contra un cierto número de virus responsables de patologías del pollo.
Las asociaciones desarrolladas hasta la fecha se han realizado a partir de vacunas inactivas o a partir de vacunas vivas. Su puesta en práctica causa problemas de compatibilidad entre sus valencias y de estabilidad. En efecto, hace falta asegurar a la vez la compatibilidad entre las diferentes valencias de la vacuna, bien sea a nivel de los diferentes antígenos utilizados o a nivel de las propias formulaciones. Igualmente, se plantea el problema de la conservación de tales vacunas combinadas, y de su inocuidad, principalmente en presencia de adyuvante. En general, estas vacunas son bastantes costosas.
WO-A-96/21.034 es representativa de otro tipo de vacunas, que utilizan un virus recombinado vector que porta y expresa in vivo el gen que codifica un inmunogén del patógeno contra el cual se dirige la vacuna. En este documento, el virus vector es un virus de la enfermedad de Marek, por ejemplo, el HVT, y se describe la inserción de genes de patógenos aviares, por ejemplo, los genes F y HN del virus de la enfermedad de Newcastle.
Las solicitudes de patentes WO-A-90/11.092, WO-A-93/19.183, WO-A-94/21.797 y WO-A-95/20.660 hacen uso de la técnica recientemente desarrollada de las vacunas polinucleotídicas. Se dice que estas vacunas utilizan un plásmido capaz de expresar, en las células del huésped, el antígeno insertado en el plásmido. Se han propuesto todas las vías de administración (intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, transcutánea, intradérmica, mucosal, etc.) De igual modo, pueden usarse diferentes medios de vacunación, tales como el ADN depositado sobre la superficie de partículas de oro y proyectado de forma que penetre dentro de la piel del animal (Tang et al., Nature 356:152-154 (1992)), y los inyectores mediante chorro de líquido que permiten transfectar a la vez dentro de la piel, el músculo, los tejidos grasos, y los tejidos mamarios (Furth et al., Analytical Biochemistry 205:365-368 (1992)).
Las vacunas de polinucleótidos pueden utilizar tanto los ADN desnudos como los ADN formulados por ejemplo, en el seno de liposomas o de lípidos catiónicos.
WO-A-98/12.808 se refiere este tipo de vacunas, y describe un protocolo de vacunación contra la enfermedad de Newcastle. Los autores comparan un plásmido circular que expresa el gen F y plásmidos lineales que expresan el mismo gen. Los resultados muestran la ausencia de protección con el plásmido circular. La enseñanza de este ejemplo, así como la enseñanza global de este documento, es que un plásmido circular que contiene un gen de un virus de la enfermedad de Newcastle no constituye una solución adaptada a la vacunación de la especie aviar contra esta enfermedad. Al contrario, se preconiza el uso de los plásmidos linealizados.
De forma contraria a esta enseñanza, el solicitante ha hallado que un plásmido circular que expresa un gen del virus de la enfermedad de Newcastle permite la producción de una vacuna de polinucleótido eficaz.
Por tanto, la invención pretende proporcionar una vacuna que permite asegurar una vacunación contra la enfermedad de Newcastle.
Otro objetivo de la invención es proporcionar una vacuna que asocia otras valencias, a la vez que presenta todos los criterios requeridos de compatibilidad y de estabilidad de las valencias entre ellas.
Otro objetivo de la invención es proporcionar una vacuna que permita asociar diferentes valencias en un mismo vehículo.
Otro objetivo de la invención es proporcionar una vacuna de este tipo que sea de realización fácil y poco costosa.
Aún otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento de vacunación de las gallináceas que permita obtener una protección, inclusive una protección multivalente, con un elevado nivel de eficacia, y de larga duración, así como una buena inocuidad y una ausencia de residuos.
La presente invención tiene por objeto una vacuna aviar que comprende, un plásmido circular que contiene el gen NH del virus de la enfermedad de Newcastle, y un vehículo apropiado.
La presente invención puede asociar, al menos, otro plásmido integrante, de forma que se exprese in vivo en las células huéspedes, un gen de otra valencia de patógeno aviar; escogiéndose esta valencia de entre el grupo consistente en el virus de la enfermedad de Marek (MDV), el virus de la enfermedad de Gumboro (IBDV), el virus de la bronquitis infecciosa (IBV), el virus de la anemia infecciosa (CAV), el virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV), el virus de le encefalomielitis (AEV, o todavía virus de la leucosis aviar (ALV)), el virus de la pneumovirosis, y el virus de la peste aviar; comprendiendo los plásmidos, para cada valencia, uno o varios de los genes escogidos de entre el grupo consistente en gB y gD para el virus de la enfermedad de Marek, HN y F para el virus de la enfermedad de Newcastle, VP2 para el virus de la enfermedad de Gumboro, S, M y N para el virus de la bronquitis infecciosa, C + NS1 para el virus de la anemia infecciosa, env y gag/pro para el virus de la laringotraqueitis, F y G para el virus de la pneumovirosis, y HA, N y NP para el virus de la peste aviar.
En la presente invención, se entiende por valencia al menos un antígeno que asegura una protección contra el virus del patógeno considerado, pudiendo contener la valencia, a título de sub-valencia, uno o varios genes naturales o modificados de una o varias cepas del patógeno considerado.
Por gen de agente patógeno, se entiende, no solamente el gen completo, sino también las secuencias nucleotídicas diferentes, inclusive fragmentos, que conservan la capacidad de inducir una respuesta protectora. La noción de gen abarca las secuencias nucleotídicas equivalentes a las descritas con precisión en los ejemplos, es decir, las secuencias que son diferentes pero que codifican la misma proteína. De este modo, abarca las secuencias nucleotídicas de otras cepas del patógeno considerado, asegurando una protección cruzada o una protección específica de la cepa o del grupo de la cepa. También abarca las secuencias nucleotídicas que han sido modificadas para facilitar la expresión in vivo por parte del animal huésped, y que codifican la misma proteína.
Preferiblemente, la vacuna según la invención comprende otras valencias seleccionadas de entre Marek, Gumboro y anemia infecciosa. También se puede añadir preferiblemente la valencia bronquitis infecciosa.
Sobre esta base de 3, 4 ó 5 valencias, se podrá añadir una o varias de las valencias peste aviar, laringotraqueitis, pneumovirosis, y encefalomielitis.
En lo que concierne a la valencia Marek, se pueden poner en práctica los dos genes que codifican el gB y gD, en plásmidos diferentes o en un único y mismo plásmido. En cualquier caso, es preferible no utilizar el gen gB.
Para la valencia Newcastle, se utilizan preferiblemente los dos genes NH y F integrados en dos plásmidos diferentes o un único y mismo plásmido.
Para la valencia bronquitis infecciosa, se utiliza preferiblemente el gen S. Eventualmente, pero de forma menos preferida, se pueden asociar S y M en un único plásmido o en dos plásmidos diferentes.
Para la valencia anemia infecciosa, se prefiere asociar los dos genes C y NS1 en el mismo plásmido.
Para la valencia laringotraqueitis infecciosa, se utiliza preferiblemente el gen gB solo. Eventualmente, pero de forma menos preferida, se pueden asociar los dos genes gB y gD en un único plásmido o en dos plásmidos diferentes.
Para la valencia pneumovirosis, se prefiere el uso de los dos genes F y G, en un único plásmido o en dos plásmidos diferentes.
Para la valencia peste aviar, se utiliza preferiblemente el gen HA. Eventualmente, pero de forma menos preferida, se pueden utilizar las asociaciones HA y NP o HA y N, en plásmidos diferentes o en un único y mismo plásmido. Preferiblemente, se asocian en la misma vacuna las secuencias HA de más de una cepa del virus influenza, en concreto de las diferentes cepas halladas sobre el terreno. Por contra, NP asegura una protección cruzada y, por tanto, uno se podrá contentar con la secuencia de una sola cepa de virus.
Para la valencia encefalomielitis, se prefiere utilizar env.
La vacuna según la invención se podrá presentar en un volumen de dosis comprendido entre 0,1 y 1 ml, y en particular entre 0,3 y 0,5 ml.
La dosis estará generalmente comprendida entre 10 ng y 1 mg, preferiblemente entre 100 ng y 500 \mug, y preferiblemente entre 0,1 \mug y 50 \mug por tipo de plásmido.
Preferiblemente, se utilizarán plásmidos desnudos, colocados simplemente en el vehículo de vacunación, el cual será generalmente agua fisiológica o un análogo. Se sobreentiende que pueden utilizarse todas las formas de vacuna polinucleotídica descritas en la técnica previa, y principalmente las formuladas en liposomas.
Cada plásmido comprende un promotor capaz de asegurar la expresión del gen insertado bajo su dependencia, en las células huésped. Generalmente se trata de un promotor eucariota fuerte, y en concreto de un promotor temprano del citomegalovirus CMV-IE, de origen humano o de ratón, o aún, eventualmente, de otro origen, tal como de rata, de cerdo, o de cobaya.
De forma más general, el promotor podrá ser, biende origen viral, buen de origen celular. Como promotor viral distinto del CMV-IE, se puede citar el promotor temprano o tardío del virus SV40, o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Puede tratarse también de un promotor del virus del que proviene el gen, por ejemplo, el promotor propio del gen.
Como promotor celular, se puede citar el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como, por ejemplo, el promotor de la desmina (Bolmont et al., Journal of Submicroscopy Cytology and Pathology 22:117-122 (1990); y Zhenlin et al., Gene 78:243-254 (1989)), o incluso el promotor de la actina.
Desde el momento en que varios genes están presentes en el mismo plásmido, éstos pueden estar presentes en la misma unidad de transcripción o en dos unidades diferentes.
La combinación de las diferentes valencias de la vacuna según la invención puede hacerse, preferiblemente, mediante la mezcla de plásmidos polinucleotídicos que expresan el antígeno o los antígenos de cada valencia, peroigualmente se puede conseguir la expresión de las diversas valencias mediante un mismo plásmido.
También pueden utilizarse las vacunas monovalentes, (i) para la preparación de una vacuna polivalente tal como la descrita más arriba, (ii) a título individual contra la patología apropiada, (iii) asociadas a una vacuna de otro tipo (completa viva o inactivada, recombinante, de subunidad) contra una patología distinta, o (iv) como recuerdo de una vacuna como la descrita en ésta más abajo.
La presente invención tiene efectivamente todavía como objeto la utilización de uno o de varios plásmidos según la invención para la fabricación de una vacuna aviar destinada a vacunar los animales vacunados primero por medio de una primera vacuna clásica (monovalente o multivalente), del tipo de las de la técnica anterior, escogida principalmente de entre el grupo consistente en la vacuna entera viva, la vacuna entera inactivada, la vacuna de subunidad, la vacuna recombinante; presentando esta primera vacuna (es decir, conteniendo o pudiendo expresar) el antígeno o los antígenos codificados por el plásmido o los plásmidos o antígenos que aseguran una protección cruzada.
De forma destacable, la vacuna polinucleotídica tiene un efecto de recuerdo que se puede traducir por una amplificación de la respuesta inmune e la instauración de una inmunidad de larga duración.
De forma general, las vacunas de primera vacunación puede escogerse de entre las vacunas comerciales disponibles a partir de los diferentes productores de vacunas veterinarias.
La invención tiene también por objeto un equipo de vacunación que agrupa una vacuna según la invención, y una vacuna de primera vacunación tal como las descritas más arriba. También trata de una vacuna según la invenciónacompañada de una nota que indica el uso de esta vacuna como recuerdo de una primera vacunación tal como la descrita más arriba.
Todavía se puede precisar un procedimiento de vacunación aviar, que comprende la administración de una vacuna eficaz tal como la descrita más arriba. Este procedimiento de vacunación comprende la administración de una o de varias dosis de vacuna, pudiendo administrarse estas dosis sucesivamente en un corto lapso de tiempo y/o sucesivamente en momentos distanciados el uno del otro.
Las vacunas según la invención pueden administrarse, en el marco de este procedimiento de vacunación, por las diferentes vías de administración propuestas en la técnica anterior en el marco de la vacunación polinucleotídica, y por medio de las técnicas de administración conocidas.
Se consideran en particular las vías intramuscular, en huevo, intraocular, la nebulización, y el agua de bebida.
La eficacia de la presentación de los antígenos al sistema inmune varía en función de los tejidos. En particular, las mucosas del tracto respiratorio sirven como barreras a la entrada de patógenos, y están asociadas a los tejidos linfoides que apoyan una inmunidad local. Por otra parte, la administración de una vacuna por contacto con las mucosas, en particular la mucosa bucal, de la faringe, y de la región bronquial, presentan un interés cierto para la vacunación en masa.
En consecuencia, las vías de administración mucosales forman parte de un modo de administración preferido para la invención, utilizándose principalmente la nebulización o vaporización, o el agua de la bebida. Las vacunas según la invención podrán aplicarse en este marco.
La invención proporciona aún una primera vacunación tal como la descrita más arriba, y un recuerdo con una vacuna según la invención.
En una forma de realización preferida del procedimiento según la invención, en un primer momento se administra al animal una dosis eficaz de vacuna del tipo clásico, principalmente inactivada, viva, atenuada o recombinante, o incluso una vacuna de subunidad, con objeto de asegurar una primera vacunación, y, transcurrido un tiempo, preferiblemente de 2 a 6 semanas, se asegura la administración de vacuna polivalente o monovalente según la invención.
La invención también concierne al procedimiento de preparación de las fórmulas de la vacuna, a saber, la preparación de las valencias y sus mezclas, de tal forma que ésta sea el resultado de esta descripción.
A continuación se describirá la invención con más detalle mediante la ayuda de modos de realización de la invención, tomados en referencia a los diseños anexos.
Lista de las figuras
Figura Nº 1: Plásmido pVR1012
Figura Nº 2: Plásmido pAB045
Figura Nº 3: Plásmido pAB080
Figura Nº 4: Secuencia del gen NDV HN, cepa Texas GB
Figura Nº 5: Plásmido pAB046
Figura Nº 6: Secuencia del gen NDV F, cepa Texas GB
Figura Nº 7: Plásmido pAB047
Figura Nº 8: Secuencia del gen IBDV VP2, cepa Faragher
Figura Nº 9: Plásmido pAB048
Figura Nº 10: Secuencia del gen IBV S, cepa Massachusetts 41
Figura Nº 11: Plásmido pAB049
Figura Nº 12: Secuencia del gen IBV M, cepa Massachusetts 41
Figura Nº 13: Plásmido pAB050
Figura Nº 14: Secuencia del gen IBV N, cepa Massachusetts 41
Figura Nº 15: Plásmido pAB051
Figura Nº 16: Plásmido pAB054
Figura Nº 17: Plásmido pAB055
Figura Nº 18: Plásmido pAB076
Figura Nº 19: Plásmido pAB089
Figura Nº 20: Plásmido pAB086
Figura Nº 21: Plásmido pAB081
Figura Nº 22: Plásmido pAB082
Figura Nº 23: Plásmido pAB077
Figura Nº 24: Plásmido pAB078
Figura Nº 25: Plásmido pAB088
Figura Nº 26: Plásmido pAB079
Lista de las secuencias SEC. Nº ID.
SEC. Nº 1: Oligonucleótido AB062
SEC. Nº 2: Oligonucleótido AB063
SEC. Nº 3: Oligonucleótido AB148
SEC. Nº 4: Oligonucleótido AB149
SEC. Nº 5: Oligonucleótido AB072
SEC. Nº 6: Oligonucleótido AB073
SEC. Nº 7: Secuencia del gen NDV NH, cepa Texas GB
SEC. Nº 8: Oligonucleótido AB091
SEC. Nº 9: Oligonucleótido AB092
SEC. Nº 10: Secuencia del gen NDV F, cepa Texas GB
SEC. Nº 11: Oligonucleótido AB093
SEC. Nº 12: Oligonucleótido AB094
SEC. Nº 13: Secuencia del "gen" IBDV VP2, cepa Faragher
SEC. Nº 14: Oligonucleótido AB095
SEC. Nº 15: Oligonucleótido AB096
SEC. Nº 16: Secuencia del gen IBV S, cepa Massachusetts 41
SEC. Nº 17: Oligonucleótido AB097
SEC. Nº 18: Oligonucleótido AB098
SEC. Nº 19: Secuencia del gen IBV M, cepa Massachusetts 41
SEC. Nº 20: Oligonucleótido AB099
SEC. Nº 21: Oligonucleótido AB100
SEC. Nº 22: Secuencia del gen IBV N, cepa Massachusetts 41
SEC. Nº 23: Oligonucleótido CD064
SEC. Nº 24: Oligonucleótido CD065
SEC. Nº 25: Oligonucleótido CD066
SEC. Nº 26: Oligonucleótido AB105
SEC. Nº 27: Oligonucleótido AB140
SEC. Nº 28: Oligonucleótido AB141
SEC. Nº 29: Oligonucleótido AB164
SEC. Nº 30: Oligonucleótido AB165
SEC. Nº 31: Oligonucleótido AB160
SEC. Nº 32: Oligonucleótido AB161
SEC. Nº 33: Oligonucleótido AB150
SEC. Nº 34: Oligonucleótido AB151
SEC. Nº 35: Oligonucleótido AB152
SEC. Nº 36: Oligonucleótido AB153
SEC. Nº 37: Oligonucleótido AB142
SEC. Nº 38: Oligonucleótido AB143
SEC. Nº 39: Oligonucleótido AB144
SEC. Nº 40: Oligonucleótido AB145
SEC. Nº 41: Oligonucleótido AB156
SEC. Nº 42: Oligonucleótido AB158
SEC. Nº 43: Oligonucleótido AB146
SEC. Nº 44: Oligonucleótido AB147
Ejemplos Ejemplo 1 Cultivo de los virus
Los virus se cultivan sobre el sistema celular apropiado hasta la obtención de un efecto citopático. Los sistemas celulares a utilizar con cada virus son bien conocidos por el especialista. En resumen, las células sensibles a los virus utilizados, cultivadas en medio mínimo esencial de Eagle (medio "MEM"), o en otro medio apropiado, se inoculan con la cepa viral estudiada utilizando una multiplicidad de infección de 1. Las células infectadas se incuban a continuación a 37ºC durante el tiempo necesario para la aparición de un efecto citopático completo (en promedio, 36
horas).
Ejemplo 2 Extracción de los ADN genómicos virales
Después del cultivo, se recolectan el sobrenadante y las células lisadas, y la totalidad de la suspensión viral se centrifuga a 1000 g, durante 10 minutos, a +4ºC, para eliminar los restos celulares. A continuación se recolectan las partículas virales mediante ultracentrifugación a 400.000 g, durante 1 hora, a +4ºC. El precipitado se resuspende en un volumen mínimo de tampón (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Esta suspensión viral concentrada se trata con la proteinasa K (100 \mug/ml final), en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS) (0,5% final), durante 2 horas, a 37ºC. El ADN viral se extrae a continuación con una mezcla de fenol/cloroformo, después se precipita con 2 columnas de etanol absoluto. Después de una noche a -20ºC, el ADN se centrifuga a 10.000 g, durante 15 minutos, a 4ºC. El precipitado de ADN se seca, después se resuspende en un volumen mínimo de agua ultrapura estéril. A continuación puede digerirse con los enzimas de restricción.
Ejemplo 3 Aislamiento de los ARN genómicos virales
El virus de ARN se purifican según las técnicas bien conocidas por el especialista. El ADN viral genómico de cada virus se ha aislado a continuación utilizando la técnica de extracción "tiocianato de guanidino/fenol-cloroformo" descrita por P. Chomczynski y N. Sacchi (Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)).
Ejemplo 4 Técnicas de biología molecular
Todas las construcciones de plásmidos de han realizado utilizando las técnicas estándares de biología molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). Todos los fragmentos de restricción utilizados para la presente invención se han aislado utilizando el equipo "Geneclean" (BIO101 Inc., La Jolla, CA).
Ejemplo 5 Técnicas de RT-PCR
Se han sintetizado oligonucleótidos específicos (que portan en sus extremos 5' sitios de restricción para facilitar la clonación de los fragmentos amplificados) de tal forma que cubren completamente las regiones codificantes de los genes que deben amplificarse (ver los ejemplos específicos). La reacción de transcripción inversa (RT) y la amplificación en cadena mediante la polimerasa (PCR) se han efectuado según las técnicas estándares (Sambrook et al., 1989). Cada reacción de RT-PCR se ha realizado con una pareja de "amplímeros" específicos y tomando como plantilla el ARN genómico viral extraído. El ADN complementario amplificado se ha extraído con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) antes de digerirlo con los enzimas de restricción.
Ejemplo 6 Plásmido pVR1012
El plásmido pVR1012 (Figura nº 1) se obtuvo a partir de Vical Inc., San Diego, CA, EE.UU. Su construcción se ha descrito en J. Hartikka et al. (Human Gene Therapy 7:1205-1217 (1996)).
Ejemplo 7 Construcción del plásmido pAB045 (gen gB del MDV)
Se ha realizado una reacción de PCR con el ADN genómico del virus de la enfermedad de Marek (MDV) (Cepa RB1B) (L. Ross et al., J. Gen. Virol. 70:1789-1804 (1989)), preparado según la técnica del Ejemplo 2, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB062 (37-meros) (SEC Nº ID: 1)
5' AAAACTGCAGACTATGCACTATTTTAGGCGGAATTGC 3'
AB063 (35-meros) (SEC Nº ID: 2)
5' GGAAGATCTTTACACAGCATCATCTTCTGAGTCTG 3'
para aislar el gen codificante de la glicoproteína gB del virus MDV bajo la forma de un fragmento PstI-BgIII. Después de la purificación, el producto de la PCR de 2613 p.b. se ha digerido con PstI y BgIII para aislar un fragmento PstI-BgIII de 2602 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con PstI y BgIII, para obtener el plásmido pAB045 (7455 p.b.) (Figura nº 2).
Ejemplo 8 Construcción del plásmido pAB080 (gen gD del MDV)
Se ha realizado una reacción de PCR con el ADN genómico del virus de la enfermedad de Marek (MDV) (Cepa RB1B) (L. Ross et al., J. Gen. Virol. 72:949-954 (1991)), preparado según la técnica del Ejemplo 2, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB148 (29-meros) (SEC Nº ID: 3)
5' AAACTGCAGATGAAAGTATTTTTTTTTAG 3'
AB149 (32-meros) (SEC Nº ID: 4)
5' GGAAGATCTTTATAGGCGGGAATATGCCCGTC 3'
para aislar el gen codificante de la glicoproteína gD del virus MDV bajo la forma de un fragmento PstI-BgIII. Después de la purificación, el producto de la PCR de 1215 p.b. se ha digerido con PstI y BgIII para aislar un fragmento PstI-BgIII de 1199 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con PstI y BgIII, para obtener el plásmido pAB080 (6051 p.b.) (Figura nº 3).
Ejemplo 9 Construcción del plásmido pAB046 (gen HN del NDV)
Se ha realizado una reacción de RT-PCR según la técnica del Ejemplo 5 con el ARN genómico del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) (Cepa Texas GB), preparado según la técnica del Ejemplo 3, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB072 (39-meros) (SEC Nº ID: 5)
5' ATAAGAATGCGGCCGCCATGGACCGTGCAGTTAGCAGAG 3'
AB073 (34-meros) (SEC Nº ID: 6)
5' CGCGGATCCTTAAATCCCATCATCCTTGAGAATC 3'
para aislar el gen codificante de la glicoproteína HN del virus NDV, cepa Texas GB (Figura nº 4 y SEC. Nº ID. 7), bajo la forma de un fragmento NotI-BamHI. Después de la purificación, el producto de la RT-PCR de 1741 p.b. se ha digerido con NotI y BamHI para aislar un fragmento NotI-BamHI de 1723 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con NotI y BamHI, para obtener el plásmido pAB046 (6616 p.b.) (Figura nº 5).
Ejemplo 10 Construcción del plásmido pAB047 (gen F del NDV)
Se ha realizado una reacción de RT-PCR según la técnica del Ejemplo 5 con el ARN genómico del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) (Cepa Texas GB), preparado según la técnica del Ejemplo 3, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB091 (37-meros) (SEC Nº ID: 8)
5' AGAATGCGGCCGCGATGGGCTCCAGATCTTCTACCAG 3'
AB092 (34-meros) (SEC Nº ID: 9)
5' TGCTCTAGATCATATTTTTGTAGTGGCTCTCATC 3'
para aislar el gen codificante de la glicoproteína F del virus NDV, cepa Texas GB (Figura nº 6 y SEC. Nº ID. 10), bajo la forma de un fragmento NotI-XbaI. Después de la purificación, el producto de la RT-PCR de 1684 p.b. se ha digerido con NotI y XbaI para aislar un fragmento NotI-XbaI de 1669 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con NotI y XbaI, para obtener el plásmido pAB046 (6578 p.b.) (Figura nº 7).
Ejemplo 11 Construcción del plásmido pAB048 (gen VP2 del IBDV)
Se ha realizado una reacción de RT-PCR según la técnica del Ejemplo 5 con el ARN genómico del virus de la enfermedad de Gumboro (IBDV) (Cepa Faragher), preparado según la técnica del Ejemplo 3, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB093 (33-meros) (SEC Nº ID: 11)
5' TCAGATATCGATGACAAACCTGCAAGATCAAAC 3'
AB094 (38-meros) (SEC Nº ID: 12)
5' AGAATGCGGCCGCTTACCTCCTTATAGCCCGGATTATG 3'
para aislar la secuencia codificante de la proteína VP2 del virus IBDV, cepa Faragher (Figura nº 8 y SEC. Nº ID. 13), bajo la forma de un fragmento EcoRV-NotI. Después de la purificación, el producto de la RT-PCR de 1384 p.b. se ha digerido con EcoRV y NotI para aislar un fragmento EcoRV-NotI de 1367 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con EcoRV y NotI, para obtener el plásmido pAB048 (6278 p.b.) (Figura nº 9).
Ejemplo 12 Construcción del plásmido pAB049 (gen S1 del IBV)
Se ha realizado una reacción de RT-PCR según la técnica del Ejemplo 5 con el ARN genómico del virus de la bronquitis infecciosa del pollo (IBV) (Cepa Massachusetts 41), preparado según la técnica del Ejemplo 3, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB095 (32-meros) (SEC Nº ID: 14)
5' ACGCGTCGACATGTTGGTAACACCTCTTTTAC 3'
AB096 (35-meros) (SEC Nº ID: 15)
5' GGAAGATCTTCATTAACGTCTAAAACGACGTGTTC 3'
para aislar la secuencia codificante de la subunidad S1 de la glicoproteína S del virus IBV, cepa Massachusetts 41 (Figura nº 10 y SEC. Nº ID. 16), bajo la forma de un fragmento SalI-BgIII. Después de la purificación, el producto de la RT-PCR de 1635 p.b. se ha digerido con SalI y BgIII para aislar un fragmento SalI-BgIII de 1622 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con SalI y BgIII, para obtener el plásmido pAB049 (6485 p.b.) (Figura nº 11).
Ejemplo 13 Construcción del plásmido pAB050 (gen M del IBV)
Se ha realizado una reacción de RT-PCR según la técnica del Ejemplo 5 con el ARN genómico del virus de labronquitis infecciosa del pollo (IBV) (Cepa Massachusetts 41), preparado según la técnica del Ejemplo 3, y con losoligonucleótidos siguientes:
AB097 (37-meros) (SEC Nº ID: 17)
5' ATAAGAATGCGGCCGCATGTCCAACGAGACAAATTGTAC 3'
AB098 (38-meros) (SEC Nº ID: 18)
5' ATAAGAATGCGGCCGCTTTAGGTGTAAAGACTACTCCC 3'
para aislar el gen codificante de la glicoproteína M del virus IBV, cepa Massachusetts 41 (Figura nº 12 y SEC. Nº ID. 19), bajo la forma de un fragmento NotI-NotI. Después de la purificación, el producto de la RT-PCR de 710 p.b. se ha digerido con NotI y NotI para aislar un fragmento NotI-NotI de 686 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con NotI y NotI, para obtener el plásmido pAB050 (5602 p.b.), el cual contiene el gen IBV M en la orientación correcta en relación al promotor (Figura nº 13).
Ejemplo 14 Construcción del plásmido pAB051 (gen N del IBV)
Se ha realizado una reacción de RT-PCR según la técnica del Ejemplo 5 con el ARN genómico del virus de la bronquitis infecciosa del pollo (IBV) (Cepa Massachusetts41), preparado según la técnica del Ejemplo 3, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB099 (34-meros) (SEC Nº ID: 20)
5' AAAACTGCAGTCATGGCAAGCGGTAAGGCAACTG 3'
AB100 (33-meros) (SEC Nº ID: 21)
5' CGCGGATCCTCAAAGTTCATTCTCTCCTAGGGC 3'
para aislar el gen codificante de la glicoproteína N del virus IBV, cepa Massachusetts 41 (Figura nº 14 y SEC. Nº ID. 22), bajo la forma de un fragmento PstI-BamHI. Después de la purificación, el producto de la RT-PCR de 1250 p.b. se ha digerido con PstI y BamHI para aislar un fragmento PstI-BamHI de 1233 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con PstI y BamHI, para obtener el plásmido pAB051 (6092 p.b.) (Figura nº 15).
Ejemplo 15 Construcción del plásmido pAB054 (gen VP1 del CAV)
Se ha realizado una reacción de PCR con el ADN genómico del virus de la anemia del pollo (CAV) (Cepa Cuxhaven-1) (B. Meehan et al., Arch. Virol. 124:301-319 (1992), preparado según la técnica del Ejemplo 2, y con los oligonucleótidos siguientes:
CD064 (39-meros) (SEC Nº ID: 23)
5' TTCTTGCGGCCGCCATGGCAAGACGAGCTCGCAGACCGA 3'
CD065 (38-meros) (SEC Nº ID: 24)
5' TTCTTGCGGCCGCTCAGGGCTGCGTCCCCCAGTACATG 3'
para aislar el gen codificante de la proteína de la cápsula VP1 del CAV, bajo la forma de un fragmento NotI-NotI. Después de la purificación, el producto de la PCR de 1377 p.b. se ha digerido con NotI para aislar un fragmento NotI-NotI de 1359 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con NotI, para obtener el plásmido pAB054 (6274 p.b.), el cual contiene el gen CAV VP1 en la orientación correcta respecto el promotor (Figura nº 16).
Ejemplo 17 Construcción del plásmido pAB055 (gen VP2 del CAV)
Se ha realizado una reacción de PCR con el ADN genómico del virus de la anemia del pollo (CAV) (CepaCuxhaven-1) (B. Meehan et al., Arch. Virol. 124:301-319 (1992), preparado según la técnica del Ejemplo 2, y con los oligonucleótidos siguientes:
CD066 (39-meros) (SEC Nº ID: 25)
5' TTCTTGCGGCCGCCATGCACGGGAACGGCGGACAACCGG 3'
CD065 (32-meros) (SEC Nº ID: 26)
5' CGCGGATCCTCACACTATACGTACCGGGGCGG 3'
para aislar el gen codificante de la proteína VP2 del virus CAV, bajo la forma de un fragmento NotI-BamHI. Después de la purificación, el producto de la PCR de 674 p.b. se ha digerido con NotI y BamHI para aislar un fragmento NotI-BamHI de 659 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con NotI y BamHI, para obtener el plásmido pAB055 (5551 p.b.) (Figura nº 17).
Ejemplo 18 Construcción del plásmido pAB076 (gen gB del ILTV)
Se ha realizado una reacción de PCR con el ADN genómico del virus de la laringotraqueitis infecciosa del pollo (ILTV) (Cepa SA-2) (K. Kongsuwan et al., Virology 184:404-410 (1991)), preparado según la técnica del Ejemplo 2, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB140 (39-meros) (SEC Nº ID: 27)
5' TTCTTGCGGCCGCCATGGCTAGCTTGAAAATGCTGATC 3'
AB141 (36-meros) (SEC Nº ID: 28)
5' TTCTTGCGGCCGCTTATTCGTCTTCGCTTTCTTCTG 3'
para aislar el gen codificante de la glicoproteína gB del virus ILTV, bajo la forma de un fragmento NotI-NotI. Después de la purificación, el producto de la PCR de 2649 p.b. se ha digerido con NotI para aislar un fragmento NotI-NotI de 2631 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con NotI, para obtener el plásmido pAB076 (7546 p.b.), el cual contiene el gen ILTV gB en la orientación correcta respecto al promotor (Figura nº 18).
Ejemplo 20 Construcción del plásmido pAB089 (gen gD del ILTV)
Se ha realizado una reacción de PCR con el ADN genómico del virus de la laringotraqueitis infecciosa del pollo (ILTV) (Cepa SA-2) (M. Johnson et al., 1994, Nº de acceso en Genbank = L31965), preparado según la técnica del Ejemplo 2, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB164 (33-meros) (SEC Nº ID: 29)
5' CCGGTCGACATGGACCGCCATTTATTTTTGAGG 3'
AB165 (33-meros) (SEC Nº ID: 30)
5' GGAAGATCTTTACGATGCTCCAAACCAGTAGCC 3'
para aislar el gen codificante de la glicoproteína gD del virus ILTV, bajo la forma de un fragmento SalI-BglII. Después de la purificación, el producto de la PCR de 1134 p.b. se ha digerido con SalI y BglII para aislar un fragmento SalI-BglII de 1122 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con SalI y BglII, para obtener el plásmido pAB089 (5984 p.b.) (Figura nº 19).
Ejemplo 21 Construcción del plásmido pAB086 (gen env del AEV)
Se ha realizado una reacción de RT-PCR según la técnica del Ejemplo 5 con el ARN genómico del virus de la encefalomielitis aviar (AEV) (Tipo C) (E. Bieth et al., Nucleic Acids Res. 20:367 (1992)), preparado según la técnica del Ejemplo 3, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB160 (54-meros) (SEC Nº ID: 31)
5' TTTGATATCATGGAAGCCGTCATTAAGGCATTTCTGACTGGATACCCT GGGAAG 3'
AB161 (31-meros) (SEC Nº ID: 32)
5' TTTGGATCCTTATACTATTCTGCTTTCAGGC 3'
para aislar la secuencia codificante de la glicoproteína Env del virus AEV, bajo la forma de un fragmento EcoRV-
BamHI. Después de la purificación, el producto de la RT-PCR de 1836 p.b. se ha digerido con EcoRV y BamHI
para aislar un fragmento EcoRV-BamHI de 1825 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejem-
plo 6), previamente digerido con EcoRV y BamHI, para obtener el plásmido pAB086 (6712 p.b.) (Figura nº
20).
Ejemplo 22 Construcción del plásmido pAB081 (gen gag/pro del AEV)
Se ha realizado una reacción de RT-PCR según latécnica del Ejemplo 5 con el ARN genómico del virus de la encefalomielitis aviar (AEV) (Tipo C) (E. Bieth et al., Nucleic Acids Res. 20:367 (1992)), preparado según la técnica del Ejemplo 3, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB150 (31-meros) (SEC Nº ID: 33)
5' ACGCGTTCGACATGGAAGCCGTCATTAAGGTG 3'
AB151 (32-meros) (SEC Nº ID: 34)
5' TGCTCTAGACTATAAATTTGTCAAGCGGAGCC 3'
para aislar la secuencia codificante de las proteínas Gag y Pro del virus AEV, bajo la forma de un fragmento SalI-XbaI. Después de la purificación, el producto de la RT-PCR de 2125 p.b. se ha digerido con SalI y XbaI para aislar un fragmento SalI-XbaI de 2111 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con SalI y XbaI, para obtener el plásmido pAB081 (6996 p.b.) (Figura nº 21).
Ejemplo 23 Construcción del plásmido pAB082 (gen G del Pneumovirus)
Se ha realizado una reacción de RT-PCR según la técnica del Ejemplo 5 con el ARN genómico del virus de la rinotraqueitis del pavo (TRV) (Cepa 2119) (K. Juhasz et al. J. Gen. Virol. 75:2873-2880 (1994)), preparado según la técnica del Ejemplo 3, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB152 (32-meros) (SEC Nº ID: 35)
5' AAACTGCAGAGATGGGGTCAGAGCTCTACATC 3'
AB153 (31-meros) (SEC Nº ID: 36)
5' CGAAGATCTTTATTGACTAGTACAGCACCAC 3'
para aislar el gen codificante la glicoproteína G del virus TRV, bajo la forma de un fragmento PstI-BglII. Después de la purificación, el producto de la RT-PCR de 1265 p.b. se ha digerido con PstI y BglII para aislar un fragmento PstI-BglII de 1249 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con PstI y BglII, para obtener el plásmido pAB082 (6101 p.b.) (Figura nº 22).
Ejemplo 24 Construcción del plásmido pAB077 (gen HA de la Peste aviar, Cepa H2N2)
Se ha realizado una reacción de RT-PCR según la técnica del Ejemplo 5 con el ARN genómico del virus de la peste aviar (AIV) (Cepa H2N2 Postdam) (J. Schäfer et al., Virology 194:781-788 (1993)), preparado según la técnica del Ejemplo 3, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB142 (33-meros) (SEC Nº ID: 37)
5' AAACTGCAGCAATGGCCATCATTTATCTAATTC 3'
AB143 (31-meros) (SEC Nº ID: 38)
5' CGAAGATCTTCATATGCAGATTCTGCATTGC 3'
para aislar el gen codificante la glicoproteína HA del virus de la peste aviar (cepa H2N2), bajo la forma de un fragmento PstI-BglII. Después de la purificación, el producto de la RT-PCR de 1709 p.b. se ha digerido con PstI y BglII para aislar un fragmento PstI-BglII de 1693 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con PstI y BglII, para obtener el plásmido pAB082 (6545 p.b.) (Figura nº 23).
Ejemplo 25 Construcción del plásmido pAB078 (gen HA de la Peste aviar, Cepa H7N7)
Se ha realizado una reacción de RT-PCR según la técnica del Ejemplo 5 con el ARN genómico del virus de la peste aviar (AIV) (Cepa H7N7 Leipzig) (C. Rohm et al., Virology 209:664-670 (1995)), preparado según la técnica del Ejemplo 3, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB144 (31-meros) (SEC Nº ID: 39)
5' AAACTGCAGATGAACACTCAAATCCTGATAC 3'
AB145 (31-meros) (SEC Nº ID: 40)
5' TTTGGATCCTTATATACAAATAGTGCACCGC 3'
para aislar el gen codificante la glicoproteína HA del virus de la peste aviar (cepa H7N7), bajo la forma de un fragmento PstI-BamHI. Después de la purificación, el producto de la RT-PCR de 1707 p.b. se ha digerido con PstI y BamHI para aislar un fragmento PstI-BamHI de 1691 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con PstI y BamHI, para obtener el plásmido pAB082 (6549 p.b.) (Figura nº
24).
Ejemplo 26 Construcción del plásmido pAB088 (gen NP de la Peste aviar, Cepa H1N1)
Se ha realizado una reacción de RT-PCR según la técnica del Ejemplo 5 con el ARN genómico del virus de la peste aviar (AIV) (Cepa H1N1 Bavaria) (M. Gammelin et al., Virology 170:71-80 (1989)), preparado según la técnica del Ejemplo 3, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB156 (32-meros) (SEC Nº ID: 41)
5' CCGGTCGACATGGCGTCTCCAGGCACCAAACG 3'
AB158 (30-meros) (SEC Nº ID: 42)
5' CGCGGATCCTTAATTGTCATACTCCTCTGC 3'
para aislar el gen codificante la nucleoproteína NP del virus de la peste aviar, bajo la forma de un fragmento SalI-BamHI. Después de la purificación, el producto de la RT-PCR de 1515 p.b. se ha digerido con SalI y BamHI para aislar un fragmento SalI-BamHI de 1503 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con SalI y BamHI, para obtener el plásmido pAB088 (6371 p.b.) (Figura nº 25).
Ejemplo 27 Construcción del plásmido pAB079 (gen N de la Peste aviar, Cepa H7N1)
Se ha realizado una reacción de RT-PCR según la técnica del Ejemplo 5 con el ARN genómico del virus de la peste aviar (AIV) (Cepa H7N1 Rostock) (J. Mc Cauley, 1990, nº de acceso de la secuencia en Genebank = X52226), preparado según la técnica del Ejemplo 3, y con los oligonucleótidos siguientes:
AB146 (35-meros) (SEC Nº ID: 43)
5' CGCGTCGACATGAATCCAAATCAGAAAATAATAAC 3'
AB147 (31-meros) (SEC Nº ID: 44)
5' GGAAGATCTCTACTTGTCAATGGTGAATGGC 3'
para aislar el gen codificante la glicoproteína N del virus de la peste aviar (cepa H7N1), bajo la forma de un fragmento SalI-BglII. Después de la purificación, el producto de la RT-PCR de 1361 p.b. se ha digerido con SalI y BglII para aislar un fragmento SalI-BglII de 1350 p.b. Este fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (Ejemplo 6), previamente digerido con SalI y BglII, para obtener el plásmido pAB079 (6212 p.b.) (Figura nº 26).
Ejemplo 28 Preparación y purificación de los plásmidos
Para la preparación de los plásmidos destinados a la vacunación de los animales, se puede utilizar toda técnica que permita obtener una suspensión de plásmidos purificados, mayoritariamente en forma superenrollada. Estas técnicas son bien conocidas por el especialista en la técnica. Se puede citar en concreto la técnica de lisis alcalina seguida por dos ultracentrifugaciones sucesivas sobre gradiente de cloruro de cesio en presencia de bromuro de etidio, tal como la descrita en J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). Se puede referir igualmente a las solicitudes de patentes PCT WO-95/21.250 y PCT WO-96/02.658, las cuales describen procedimientos para producir a escala industrial plásmidos utilizables para la vacunación. Para las necesidades de fabricación de las vacunas (ver Ejemplo 17), los plásmidos purificados se resuspenden de forma que se obtienen soluciones de concentración elevada (> 2 mg/ml) compatibles con el almacenamiento. Para prepararlos, los plásmidos se resuspenden, bien en agua ultrapura, bien en tampón TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 8,0).
Ejemplo 29 Fabricación de las vacunas asociadas
Los diversos plásmidos necesarios para la fabricación de una vacuna asociada se mezclan a partir de sus soluciones concentradas (Ejemplo 16). Las mezclas se realizan de tal forma que la concentración final de cada plásmido corresponde a la dosis eficaz de cada plásmido. Las soluciones utilizables para ajustar la concentración final de vacuna pueden ser, bien una solución NaCl al 0,9%, bien tampón PBS.
También pueden ponerse en práctica formulaciones particulares, tales como los liposomas, los lípidos catiónicos, para la fabricación de las vacunas.
Ejemplo 30 Vacunación de los pollos
Los pollos se vacunan con dosis de 10, 50 ó 100 \mug por plásmido. Las inyecciones pueden realizarse con aguja por vía intramuscular. Los sitios de inyección son la pechuga (para los pollos de más de 2 semanas) y el muslo (para los pollos de 1 día y más). En este caso, las dosis de vacuna se administran en un volumen de 0,1 a 0,3 ml.
En el pollo adulto (de más de 20 semanas de edad), las inyecciones se realizan igualmente por vía intramuscular utilizando un aparato de inyección mediante chorro líquido (sin aguja), el cual está especialmente desarrollado para la vacunación de los pollos (por ejemplo, el aparato AVIJET). En este caso, el volumen inyectado es de 0,3 ml. La inyección puede efectuarse en la pechuga, o a nivel del muslo. Del mismo modo, en el pollo adulto, las inyecciones pueden realizarse mediante aguja por vía intramuscular, en la pechuga o en el muslo, en un volumen de 0,3 ml. La inyección de las vacunas plasmídicas puede realizarse igualmente in ovo. En este caso, pueden utilizarse formulaciones concretas, tales como las citadas en el Ejemplo 29. El volumen inyectado en el huevo embrionario de 18 días está comprendido entre 50 \mul y 200 \mul.

Claims (13)

1. Vacuna aviar que comprende un plásmido circular que contiene el gen HN del virus de la enfermedad de Newcastle, y un vehículo apropiado.
2. Vacuna según la reivindicación 1, en la cual el plásmido comprende los dos genes F y HN del virus de la enfermedad de Newcastle.
3. Vacuna según la reivindicación 1, que comprende además un plásmido circular que contiene el gen F del virus de la enfermedad de Newcastle.
4. Vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la cual el plásmido comprende un promotor escogido de entre el grupo consistente en el promotor CMV-IE, el promotor temprano del SV40, el promotor tardío del SV40, el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous, y el promotor de un gen del citoesqueleto.
5. Vacuna según la reivindicación 4, en la cual el promotor es un promotor CMV-IE.
6. Vacuna según la reivindicación 4, en la cual el promotor de un gen del citoesqueleto es el promotor de la desmina o el promotor de la actina.
7. Vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por comprender otro plásmido que contiene y expresa un gen de otro patógeno aviar.
8. Vacuna según la reivindicación 7, caracterizada por comprender dos plásmidos escogidos de entre el grupo consistente en un plásmido que contiene el gen gB o gD del virus de la enfermedad de Marek, un plásmido que contiene el gen VP2 del virus de la enfermedad de Gumboro, un plásmido que contiene los genes C + NS1 del virus de la anemia infecciosa.
9. Fórmula de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada por comprender de 10 ng a 1 mg, preferiblemente de 100 ng a 500 \mug, aún más preferiblemente de 0,1 \mug a 50 \mug de cada plásmido.
10. Utilización de uno o de varios plásmidos, tales como los descritos en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la fabricación de una vacuna aviar destinada a vacunar, contra la enfermedad de Newcastle, la enfermedad de Marek, la enfermedad de Gumboro, y/o la anemia infecciosa, animales primo-vacunados por medio de una primera vacuna escogida de entre el grupo consistente en una vacuna entera viva, una vacuna entera inactiva, una vacuna de subunidad, una vacuna recombinante, presentando esta primera vacuna el antígeno o los antígenos codificados por el plásmido o los plásmidos, o antígenos que aseguran una protección cruzada.
11. Equipo de vacunación que agrupa una vacuna polinucleotídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y una vacuna aviar escogida de entre el grupo consistente en una vacuna entera viva, una vacuna entera inactivada, una vacuna de subunidad, una vacuna recombinante, presentando esa primera vacuna el antígeno codificado por la vacuna polinucleotídica o un antígeno que asegura una protección cruzada, para una administración de ésta última en una primo-vacunación y para un recuerdo con la fórmula de la vacuna.
12. Vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, acompañada de una nota que indica que esa vacuna polinucleotídica es utilizable como recuerdo de una primera vacuna aviar escogida de entre el grupo consistente en una vacuna entera viva, una vacuna entera inactivada, una vacuna de subunidad, una vacuna recombinante, presentando esa primera vacuna el antígeno codificado por la vacuna polinucleotídica o un antígeno que asegura una protección cruzada.
13. Utilización de un plásmido, tal como el descrito en una de las reivindicaciones 1 a 9, para la fabricación de una vacuna destinada a vacunar la especie aviar contra el virus de la enfermedad de Newcastle, en asociación con una vacuna entera viva o inactiva, recombinante o de subunidad, dirigida contra una patología aviar.
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