ES2283105T3 - Vacunas en el adn con polimeros de acido acrilico o metacrilico o de ema (r) para los caballos. - Google Patents
Vacunas en el adn con polimeros de acido acrilico o metacrilico o de ema (r) para los caballos. Download PDFInfo
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Abstract
Vacuna para la vacunación del caballo, que comprende un ADN desnudo que incorpora al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico de un agente patógeno del caballo, y que expresa in vivo dicho polipéptido antigénico, y al menos un compuesto adyuvante escogido de entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y de etileno.
Description
Vacunas en el ADN con polímeros de ácido
acrílico o metacrílico o de EMA (R) para los caballos.
La presente invención concierne a un
perfeccionamiento de las vacunas de ADN, también denominada vacunas
plasmídicas o polinucleotídicas, que comprenden y expresan in
vivo uno o varios genes heterólogos. En particular, tiene por
objeto tales vacunas perfeccionadas, la utilización de compuestos
adyuvantes determinados para la puesta en práctica de tales
vacunas, así como los procedimientos de vacunación que están
relacionados. Además, tiene por objeto un procedimiento de
preparación de estas vacunas.
Las solicitudes de patentes
WO-A-90 11092,
WO-A-93 19183,
WO-A-94 21797,
WO-A-95 11307 y
WO-A-95 20660 han hecho uso de la
técnica recientemente desarrollada de las vacunas polinucleotídicas.
Se sabe que estas vacunas utilizan un plásmido capaz de expresar en
las células del huésped un gen insertado en el plásmido, el cual
codifica un inmunogén. Se han propuesto todas las vías de
administración (intraperitoneal, intravenosa, intramuscular,
transcutánea, intradérmica, mucosal, etc.). Pueden usarse igualmente
diferentes medios de vacunación, tales como el ADN depositado sobre
la superficie de partículas de oro y proyectado de forma que penetre
dentro de las células de la piel del animal (Tang et al.,
Nature, 356:152-154 (1992)), y los inyectores
mediante chorro líquido que permiten transfectar a la vez en la
piel, el músculo, los tejidos grasos y los tejidos mamarios (Furth
et al., Analytical Biochemistry, 205:365-368
(1992)).
Estas vacunas polinucleotídicas se pueden usar
bajo la forma de ADN desnudo o bajo la forma de complexo con
liposomas o lípidos catiónicos.
La invención tiene por objeto mejorar la
eficacia de las vacunas de ADN proponiendo nuevas formulaciones de
vacunas simples y fáciles de preparar.
Tiene por objeto también proporcionar una
solución tal que no comporte interacciones intensas entre el ADN y
terceros ingredientes, susceptibles de conducir a la formación de un
complejo.
Tiene también por objeto propones una solución
tal que permita, o preparar vacunas estables, mediante mezcla
sencilla, formuladas bajo una forma líquida, o realizar de forma
fácil una vacuna líquida mediante mezcla extemporánea.
La solicitante ha encontrado de forma
sorprendente que los compuestos de la clase de los carbómeros
responden a estos diversos objetivos, y especialmente que están en
condiciones de adyuvar de manera simple, pero en proporciones muy
ventajosas, las vacunas de ADN desnudas.
Por tanto, la presente invención tiene por
objeto una vacuna de ADN que comprende ADN desnudo, en particular
un plásmido de vacuna circular, superenrollado o no, o una molécula
de ADN lineal, que incorpora y expresa in vivo una secuencia
nucleotídica que codifica un polipéptido antigénico, preferiblemente
un gen de un agente patógeno, y al menos un compuesto adyuvante
escogido de entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y
los copolímeros de anhídrido maleico y del derivado alquenilo.
Se entiende por ADN desnudo, tal y como es
actualmente aceptado, una unidad de transcripción de ADN bajo forma
de una secuencia polinucleotídica que comprende al menos una
secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido antigénico, o un
antígeno de una valencia, y los elementos necesarios para su
expresión in vivo. Se prefiere la forma de plásmido
circular, superenrollados o no. En la presente invención, se
entiende por valencia al menos un antígeno que asegura una
protección contra un patógeno, pudiendo contener la valencia, a
título de subvalencia, uno o varios genes naturales o modificados,
de una o varias cepas del patógeno considerado.
Los compuestos adyuvantes preferidos son los
polímeros del ácido acrílico o metacrílico reticulados,
especialmente por los éteres polialquenílicos de azúcar o de
polialcoholes. Estos compuestos se conocen con el término carbómero
(Pharmeuropa, vol. 8, n° 2, junio de 1996). El especialista
en la técnica puede referirse también a
US-A-2.909.462 (incorporada por
referencia) que describe tales polímeros acrílicos reticulados por
un compuesto polihidroxilo que tiene al menos 3 grupos hidroxilos,
preferiblemente más de 8, estando sustituidos los átomos de
hidrógeno de al menos tres hidroxilos por radicales alifáticos
insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales
preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por
ejemplo, los vinilos, los alilos y otros grupo etilénicamente
insaturados. Los radicales insaturados pueden contener a su vez
otros sustituyentes, tales como el metilo. Los productos vendidos
bajo la denominación Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son
particularmente apropiados. Están reticulados por una alilsacarosa o
por un alilpentaeritritol. Entre éstos, se pueden citar los
Carbopol® 974P, 934P y 971P.
Entre los copolímero de anhídrido maleico y del
derivado alquenilo, se prefieren los EMA® (Monsanto) que son
copolímeros de anhídrido maleico y de etileno, lineales o
reticulados, por ejemplo, reticulados por el diviniléter. Uno se
puede referir a J. Fields et al., Nature,
186:778-780, 4 de junio de 1960 (incorporada por
referencia).
Sobre el plano de su estructura, los polímeros
de ácido acrílico o metacrílico y los EMA® se forman preferiblemente
a partir de motivos de base con la fórmula siguiente:
en la
cual:
- R_{1} y R_{2}, idénticos o diferentes,
representan H ó CH_{3}
- x = 0 ó 1, preferiblemente x = 1
- y = 1 ó 2, con x+y = 2
Para los EMA®, x = 0 e y = 2. Para los
carbómeros, x = y = 1.
La disolución de estos polímeros en el agua
conduce a una solución ácido que se neutralizará, preferiblemente
hasta un pH fisiológico, para rendir una solución adyuvante en la
cual se incorporará la vacuna propiamente dicha. Los grupos
carboxílicos del polímero están entonces parcialmente en forma de
COO-.
De manera preferida, se prepara una solución de
adyuvante según la invención, especialmente de carbómero, en agua
destilada, preferiblemente en presencia de cloruro sódico, teniendo
la solución obtenida un pH ácido. Se diluye esta solución madre
añadiéndola en la cantidad necesaria (para la obtención de la
concentración final deseada), o una parte importante de la misma,
de agua cargada de NaCl, preferiblemente agua fisiológica (NaCl, 9
g/l), en una o varias veces, con la neutralización concomitante o
subsiguiente (pH 7,3 a 7,4), preferiblemente mediante NaOH. Esta
solución con pH fisiológico se utilizará tal cual para la mezcla con
la vacuna, conservada especialmente bajo forma liofilizada, líquida
o congelada.
La concentración en polímero en la composición
de vacuna final será de 0,01% a 2% P/V, más especialmente de 0,06 a
1% P/V, preferiblemente de 0,1 a 0,6% P/V.
Para la vacunación de los cerdos, la invención
puede aplicarse especialmente a la vacunación contra el virus de la
enfermedad de Aujeszky (virus PRV o de la pseudorabia), virus de la
gripe porcina (virus Influenza porcino, SIV), virus de la
enfermedad misteriosa del cerdo (virus PRRS), virus de la
parvovirosis porcina (virus PPV), virus de la peste porcina clásica
(virus HCV, o "Hog Cholera Virus") y bacterias responsables de
la actinobacilosis (A. pleuro- pneumoniae). Los
plásmidos utilizables en la invención comprenden, para cada
valencia, uno o varios de los genes que codifican los inmunogenes
principales de los agentes patógenos considerados. En particular,
se pueden citar los genes gB y gD para el virus de la enfermedad de
Aujeszky, los genes HA, NP, N para el virus de la gripe porcina,
los genes ORF5 (E), ORF3, ORF6 (M) para el virus PRRS, VP2 para el
virus de la parvovirosis, E2, E1 + E2, E1 + E2 + C para el virus de
la peste porcina clásica, y apxl, apxll y apxlll para A.
pleuropneumoniae. De forma particularmente ventajosa, se podrá
referirse a las fórmulas de vacunas polinucleotídicas descritas en
la solicitud de patente, incorporada por referencia,
WO-A-98 03.658
(FR-A-2.751.224), la cual conciernen
a vacunas contra las patologías respiratorias y reproductoras de
los cerdos. Esta solicitud describe especialmente un cierto número
de plásmidos, que podrían utilizarse directamente a título de
ejemplos en el marco de la presente invención, en combinación con un
adyuvante según la invención. El especialista en la técnica podrá
combinar de ese modo, con los adyuvantes según la invención, los
plásmidos específicamente descritos en esta solicitud anterior, a
saber, pAB090 que comprende el gen gB del virus PRV, pPB098 que
comprende el gen gD del virus PRV, pPB143 que comprende el gen HA de
la gripe porcina, cepa H1N1, pPB142 que comprende el gen NP de la
gripe porcina de la cepa H1N1, pPB144 que comprende el gen HA de la
gripe porcina, cepa H3N2, pPB132 que comprende el gen NP de la gripe
porcina, cepa H3N2, pAB025 que comprende el ORF5 del virus PRRS,
cepa Lelystad, pAB001 que comprende el ORF5 del virus PRRS, cepa
USA, pAB091 que comprende el ORF3 del virus PRRS, cepa Lelystad,
pAB092 que comprende el ORF3 del virus PRRS, cepa USA, pAB004 que
comprende el gen VP2 del parvovirus porcino, pAB069 que comprende el
gen E1 del virus de la peste porcina (HCV), pAB061 que comprende el
gen E2 del virus de la peste porcina (HCV), pAB162 que comprende el
gen apxl suprimido de A. pleuropneumoniae, pPB163 que
comprende el gen apxll suprimido de A. pleuropneumoniae,
pPB174', pPB189 et pPB190 que comprende el gen apxIII suprimido de
A. pleuropneumoniae.
Para la vacunación de los caballos se puede
cirta en particular la vacunación contra el virus de la
rinoneumonía equina (EHV), especialmente del tipo 1
(EHV-1) y del tipo 4 (EHV-4), contra
el virus de la gripe equina EIV, contra el tétanos (Cl.
tetani), contra el virus de la encefalitis del Oeste (WEV) y de
la encefalitis venezolana (VEV), o también contra la enfermedad de
Lyme (B. burgdorferi), contra la arteritis equina (EAV) y
contra la rabia. Entre los genes que codifican los inmunogenes
principales utilizables según la invención, se pueden citar los
genes gB y gD para la valencia rinoneumonía equina, especialmente de
los tipos 1 y 4, los genes HA, NA y NP para la gripe equina, la
subunidad C, eventualmente modificada mediante mutación o
supresión, para la valencia tétanos, los genes C y E2 para las
encefalitis, los genes OspA, OspB y p100 para la enfermedad de
Lyme, los genes E, M y N para la arteritis equina, el gen G para la
rabia. Tales fórmulas de vacunas polinucleotídicas contra las
patologías del caballo se describen especialmente en la solicitud
de patente incorporada por referencia
WO-A-98 03.198
(FR-A-2.751.226). Esta misma
solicitud describe un cierto número de plásmidos directamente
utilizables en la presente invención en combinación con un adyuvante
según la invención. El especialista en la técnica podrá combinar
por tanto, con el adyuvante conforme con la invención, un plásmido
tal como el descrito precisamente en esa solicitud, a saber, el
pAB042 que comprende el gen gB del virus EHV-1,
pAB031 que comprende el gen gB del virus EHV-4,
pAB013 que comprende el gen gD del virus EHV-1,
pAB032 que comprende el gen gD del virus EHV-4,
pAB043 que comprende el gen HA de la gripe equina, cepa Prague,
pAB033 que comprende el gen HA de la gripe equina, cepa Suffolk,
pAB099 que comprende el gen HA de la gripe equina, cepa
Fontainebleau, pAB085 que comprende el gen NP de la gripe equina,
cepa Prague, pAB084 que comprende el gen NP de la gripe equina,
cepa Jillin, pAB070 que comprende el gen de la subunidad C de la
toxina tetánica, pAB017 que comprende el gen OspA de Borrelia
burgdorferi, pAB094 que comprende el gen E2 del virus de la
encefalitis del Este, pAB093 que comprende el gen C del virus de la
encefalitis del Este, pAB096 que comprende el gen E2 del virus de
la encefalitis del Oeste, pAB095 que comprende el gen C del virus
de la encefalitis del Oeste, pAB098 que comprende el gen E2 del
virus de la encefalitis venezolana, pAB097 que comprende el gen C
del virus de la encefalitis venezolana, pAB041 que comprende el gen
G del virus de la rabia.
Para la vacunación de los perros, la invención
puede aplicarse especialmente a la vacunación contra el virus de la
enfermedad de Carré (CDV), el parvovirus canino (CPV), el
coronavirus canino (CCV), el virus herpes canino (CHV), la
enfermedad de Lyme, la rabia. Entre los genes que codifican los
inmunogenes principales utilizables en el marco de la presente
invención, se pueden citar de forma particular, los genes HA, F, M
y N para virus de la enfermedad de Carré, el gen VP2 para parvovirus
canino, los genes S y M para el coronavirus canino (CCV), los genes
gB y gD para el virus CHV, los genes OspA y OspB y p100 para B.
burgdorferi (enfermedad de Lyme), el gen G para la rabia. Tales
fórmulas de vacunas polinucleotídicas se describen particularmente
en la solicitud de patente incorporada por referencia
WO-A-98 03.199
(FR-A-2.751.227). El especialista en
la técnica podrá, por tanto, referirse a los plásmidos descritos en
esa solicitud, en combinación con los adyuvantes según la
invención. De forma particular, podrá combinar, con los adyuvantes
según la invención, los plásmidos específicos descritos en esa
demanda, a saber, pAB044 que comprende el gen HA del CDV, pAB036
que comprende el gen F del CDV, pAB024 que comprende el gen VP2 del
parvovirus canino, pAB021 que comprende el gen S del CCV, pAB022
que comprende el gen M del CCV, pAB037 que comprende el gen gB del
CHV, pAB038 que comprende el gen gD del CHV, pAB017 que comprende
el gen OspA de B. burgdorferi, pAB041 que comprende el gen G
del virus de la rabia.
Para la vacunación de los bovinos, la invención
puede aplicarse especialmente a la vacunación contra el virus
herpes bovino del tipo 1 ó 5 (BHV-1 y
BHV-5, responsables de la forma nerviosa de la
enfermedad), el virus respiratorio sincitial bovino (BRSV), el
virus de la enfermedad de las mucosas o pestivirus bovino (BVD), el
virus parainfluenza bovino del tipo 3 (BPI-3). Entre
los genes que codifican los inmunogenes principales, que permiten
la vacunación contra estos virus, se pueden citar en particular los
genes gB y gD para el virus herpes bovino, F y G para el virus
respiratorio sincitial bovino, E2, C + E1 + E2 y E1 + E2 para el
virus de la enfermedad de las mucosas, HN y F para el virus
parainfluenza bovino del tipo 3. Tales fórmulas de vacunas se
describen particularmente en la solicitud de patente incorporada por
referencia WO-A-98 03.200
(FR-A-2.751.229). El especialista
en la técnica podrá, por tanto, utilizar los plásmidos descritos en
esa solicitud, en combinación con los adyuvantes según la
invención. En particular, podrá combinar, con los adyuvantes según
la invención, los plásmidos específicamente descritos en esa
solicitud, a saber, pPB156 que comprende el gen gB del
BHV-1, pAB087 que comprende el gen gD del
BHV-1, pAB011 que comprende el gen F del BRSV,
pAB012 que comprende el gen G del BRSV, pAB058 que comprende el gen
C del BVD, pAB059 que comprende el gen E1 del BVD, pAB060 que
comprende el gen E2 del BVD, pAB071 que comprende el gen HN del
BPI-3, pAB072 que comprende el gen F del
BPI-3.
Para la vacunación de los gatos, la invención
puede aplicarse especialmente a la vacunación contra el virus de la
leucemia felina FeLV, especialmente los subtipos A y B, el virus de
la panleucopenia felina (FPV), el virus de la peritonitis
infecciosa felina (FIPV), el virus de la coriza o herpesvirus felino
(FHV), el virus de la calicivirosis felina (FCV), el virus de la
inmunodeficiencia felina (FIV), y el virus de la rabia
(rabdovirus). Entre los genes que codifican los inmunogenes
principales, que permiten la vacunación contra estos patógenos, se
pueden citar en particular los genes env y gag/pol para la leucemia
felina, el VP2 para la panleucopenia, el S modificado
(FR-A-2.724.385 incorporada por
referencia) y el M para la peritonitis infecciosa, gB y gD para la
coriza, el de la cápside para la calicivirosis, env y gag/pro para
la inmunodeficiencia felina y G para la rabia. Las fórmulas de las
vacunas polinucleotídicas se describen de este modo en la solicitud
de patente incorporada por referencia
WO-A-98 03.660
(FR-A-2.751.223). El especialista en
la técnica podrá combinar plásmidos, tales como los descritos en
esa solicitud, con adyuvantes según la invención. En particular,
podrá combinar, con los adyuvantes según la invención, los plásmidos
específicamente descritos en esa solicitud, a saber, pPB179 que
comprende el gen env del virus FeL VA, pPB180 que comprende el gen
env del virus FeLV-B, pPB181 que comprende el gen
gag/pol del FeL V-A, pAB009 que comprende el gen VP2
del FPV, pAB053 que comprende el gen S modificado del virus FIPV,
pAB052 que comprende el gen M del FIPV, pAB056 que comprende el gen
N del FIPV, pAB028 que comprende el gen gB del FHV, pAB029 que
comprende el gen gD del FHV, pAB010 que comprende el gen C de. FCV,
pAB030 que comprende el gen env del FIV, pAB083 que comprende el gen
gag/pro del FIV, pAB0841 que comprende el gen G del virus de la
rabia.
Para la vacunación de las especies aviarias, la
invención puede aplicarse especialmente a la vacunación contra el
virus de la enfermedad de Marek (MDV), el virus de la enfermedad de
Newcastle (NDV), el virus de la enfermedad de Gumboro (IBDV o
"Infectious Bursal Disease Virus"), el virus de la bronquitis
infecciosa (IBV o Virus de la Bronquitis Infecciosa), el virus de
la anemia infecciosa (CAV), el virus de la laringotraqueitis
infecciosa (ILTV), el virus de la encefalomielitis (AEV o también el
virus de la leucosis aviaria ALV), el virus de la neumovirosis o
neumovirus, y el virus de la peste aviaria o gripe aviaria. Entre
los genes que codifican los inmunogenes principales utilizables en
el marco de la presente invención, se pueden citar de forma
particular, los genes gB y gD para el virus de la enfermedad de
Marek, HN y F para el virus de la enfermedad de Newcastle, VP2 para
el virus de la enfermedad de Gumboro, S, M y N para el virus de la
bronquitis infecciosa, C + NS1 para el virus de la anemia
infecciosa, gB y gD para el virus de la laringotraqueitis
infecciosa, env y gag/pro para el virus de la encefalomielitis, F y
G para el virus de la neumovirosis y HA, N y NP para el virus de la
peste aviaria. Tales fórmulas de vacunas polinucleotídicas se
describen en la solicitud de patente incorporada por referencia
WO-A-98 03.659
(FR-A-2.751.225). El especialista en
la técnica podrá, por tanto, referirse a los plásmidos descritos en
esa solicitud, con objeto de combinarlos con adyuvantes según la
invención. Muy particularmente, el especialista en la técnica podrá
combinar, con adyuvantes según la invención, los plásmidos
descritos específicamente en esa demanda, a saber, el pAB045 que
comprende el gen gB de MDV, pAB080 que comprende el gen gD del MDV,
pAB046 que comprende el gen HN del NDV, pAB047 que comprende el gen
F del NDV, pAB048 que comprende el gen VP2 del IBDV, pAB049 que
comprende el gen S1 del IBV, pAB050 que comprende el gen M del IBV,
pAB051 que comprende el gen N del IBV, pAB054 que comprende el gen
VP1 del CAV, pAB055 que comprende el gen VP2 del CAV, pAB076 que
comprende el gen gB del ILTV, pAB089 que comprende el gen gD del
ILTV, pAB086 que comprende el gen env del AEV, pAB081 que comprende
el gen gag/pro del AEV, pAB082 que comprende el gen G del
neumovirus, pAB077 que comprende el gen HA de la peste aviaria, cepa
H2N2, pAB078 que comprende el gen HA de la peste aviaria, cepa
H7N7, pAB088 que comprende el gen NP de la peste aviaria, cepa H1N1,
pAB079 que comprende el gen N de la peste aviaria, cepa H7N1.
Cada ADN desnudo en un plásmido concreto,
comprende un promotor capaz de asegurar la expresión del gen
insertado bajo su dependencia en las células huéspedes. En general
se tratará de un promotor eucariota fuerte y, en particular, de un
promotor temprano del citomegalovirus CMV-IE de
origen humano o múrido, o también, eventualmente, de otro origen,
tal como de rata, cerdo o cobaya. De manera más general, el promotor
podrá ser, bien de origen vírico, bien de origen celular. Como
promotor viral distinto del CMV-IE, se puede citar
el promotor temprano o tardío del virus SV40 o el promotor LTR del
virus del Sarcoma de Roux. Puede tratarse también de un promotor
del virus de donde procede el gen, por ejemplo, el promotor propio
del gen. Como promotor celular, se puede citar el promotor de un
gen del citoesqueleto, tal como, por ejemplo, el promotor de la
desmina (Bolmont et al., Journal of Submicroscopic Cytology and
Pathology, 22:117-122 (1990); y Zhenlin et
al., Gene, 78:243-254 (1989)), o también el
promotor de la actina. Cuando múltiples genes están presentes en el
mismo ADN desnudo, en particular un plásmido, pueden estar presentes
en la misma unidad de transcripción o en dos unidades
diferentes.
Por supuesto, una vacuna podrá combinar, para
cada una de las valencias descritas más arriba, múltiples genes en
el seno de un mismo ADN desnudo, en particular un plásmido, y/o
múltiples plásmidos, y/o múltiples ADN desnudos, en particular
plásmidos, comprendiendo cada uno uno o múltiples genes del mismo
virus.
La invención tiene también por objeto las
vacunas recombinantes multivalentes, es decir, que contienen uno, o
preferiblemente dos o múltiples ADN desnudos, en particular
plásmidos, que expresan los antígenos de dos o múltiples
enfermedades, mezclados en una solución adyuvante según la
invención.
En la vacuna lista para su uso, el ADN desnudo,
en particular el plásmido de vacuna, está presente en las cantidades
habitualmente utilizadas y descritas en la literatura.
La invención tiene también por objeto un
procedimiento de vacunación consistente en administrar por vía
parenteral, preferiblemente intramuscular, intradérmica, o por vía
de las mucosas, una vacuna de ADN según la invención, a razón de una
o varias administraciones.
La invención tiene también por objeto la
utilización de los compuestos adyuvantes según la invención para la
realización de vacunas de ADN adyuvadas tales como las descritas en
la presente invención.
La invención va a describirse ahora con más
detalle, con la ayuda de modos de realización escogidos a título de
ejemplos no limitantes, y refiriéndose a las figuras anexas.
Figura Nº 1: Secuencia del gen de la
hemaglutinina (HA) del virus de la gripe equina cepa Newmarket
2/93.
Figura Nº 2: Secuencia del gen de la
hemaglutinina (HA) del virus de la gripe equina cepa Kentucky
1/94.
Figura Nº 3: Secuencia del gen de la
neuraminidasa (NA) del virus de la gripe equina cepa Newmarket
2/93.
Figura Nº 4: Secuencia del gen de la
neuraminidasa (NA) del virus de la gripe equina cepa Kentucky
1/94.
Figura Nº 5: Secuencia del gen de la
nucleoproteína (NP) del virus de la gripe equina cepa Newmarket
2/93.
Figura Nº 6: Secuencia del gen de la
nucleoproteína (NP) del virus de la gripe equina cepa Kentucky
1/94.
SEC. Nº ID 1: Oligonucleótido CCL007
SEC. Nº ID 2: Oligonucleótido CCL018
SEC. Nº ID 2: Secuencia del gen HA cepa EIV
Newmarket 2/93
SEC. Nº ID 4: Oligonucleótido CCL020
SEC. Nº ID 5: Secuencia del gen HA cepa EIV
Kentucky 1/94
SEC. Nº ID 6: Oligonucleótido AB260
SEC. Nº ID 7: Oligonucleótido AB262
SEC. Nº ID 8: Secuencia del gen NA cepa EIV
Newmarket 2/93
SEC. Nº ID 9: Secuencia del gen NA cepa EIV
Kentucky 1/94
SEC. Nº ID 10: Oligonucleótido CCL019
SEC. Nº ID 11: Oligonucleótido CCL021
SEC. Nº ID 12: Secuencia del gen NP cepa EIV
Newmarket 2/93
SEC. Nº ID 13: Secuencia del gen NP cepa EIV
Kentucky 1/94
El carbómero utilizado en las vacunas según la
presente invención es el Carbopol® 974P fabricado por la sociedad BF
Goodrich (PM aproximado de 3 millones).
En primer lugar se preparar una solución madre
de 1,5% de Carbopol® 974P en agua destilada que contiene cloruro
sódico a 1 g/l.
Esta solución madre se utiliza a continuación
para la preparación de una solución de Carbopol® en agua
fisiológica a 4 mg/ml. La solución madre se vierte en la totalidad
del agua fisiológica (o eventualmente en la mayoría de ésta) de 1
vez, o eventualmente en múltiples veces, ajustando cada vez el pH
con la ayuda de NaOH (por ejemplo, 1 N o más concentrado).
Se obtiene entonces una solución de Carbopol® a
punto para su empleo.
Los virus se cultivan sobre el sistema celular
apropiado hasta obtener un efecto citopático. Los sistemas
celulares a utilizar para cada virus son bien conocidos por el
especialista. De forma resumida, se inoculan unas células sensibles
al virus utilizado, cultivada en medio mínimo esencial de Eagle
(medio "MEM") o en otro medio apropiado, con la cepa viral
estudiada, utilizando una multiplicidad de infección de 1. Las
células infectadas se incuban entonces a 37ºC durante el tiempo
necesario para la aparición de un efecto citopático completo (en
promedio, 36 horas).
Después de su cultivo, se recuperan el
sobrenadante y las células lisadas, y la totalidad de la suspensión
vírica se centrifuga a 1000 g durante 10 minutos a +4ºC para
eliminar los restos celulares. Las partículas virales se recuperan
a continuación mediante ultracentrifugación a 400.000 g durante 1
hora a +4ºC. El precipitado se retoma en un volumen mínimo de
tampón (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Esta suspensión vírica concentrada
se trata con la proteinasa K (100 \mug/ml final) en presencia de
dodecilsulfato sódico (SDS) (0,5% final) durante 2 horas a 37ºC. El
ADN vírico se extrae a continuación con una mezcla de
fenol/cloroformo, después se precipita con 2 volúmenes de etanol
absoluta. Después de una nocha -20ºC, el ADN se centrifuga a 10.000
g durante 15 minutos a +4ºC. Se seca el precipitado de ADN, después
se retoma en un volumen mínimo de agua ultrapura estéril. A
continuación se puede digerir con enzimas de restricción.
Los virus de ARN se han purificado según
técnicas bien conocidas por el especialista. El ARN vírico genómico
de cada virus se ha aislado luego utilizando la técnica de
extracción del "tiocianato de
guanidinio/fenol-cloroformo" descrita por P.
Chomczynski y N. Sacchi (Anal. Biochem.,
162:156-159 (1987)).
Todas las construcciones de plásmidos se han
realizado utilizando las técnicas estándares de biología molecular
descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2ª edición. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold
Spring Harbor. Nueva York. 1989). Todos los fragmentos de
restricción utilizado para la presente invención se han aislado
utilizando el equipo "Geneclean" (BIO101 Inc., La Jolla,
CA).
Los oligonucleótidos específicos (que tienen en
sus extremos 5' sitios de restricción para facilitar la clonación
de los fragmentos amplificados) se han sintetizado de tal forma que
abarcan completamente las regiones codificantes de los genes que
deben ser amplificados (ver ejemplos específicos). La reacción de
transcripción inversa (RT) y la amplificación en cadena por
polimerasa (PCR) se han efectuado según las técnicas estándares (J.
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª
edición. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. Nueva
York. 1989). Cada reacción de RT-PCR se ha realizado
con un par de amplímeros específicos, y tomando como matriz el ARN
genómico viral extraído. El ADN complementario amplificado se ha
extraído con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) antes de
ser digerido por los enzimas de restricción.
El plásmido pVR1012 se ha obtenido de Vical
Inc., San Diego, CA, EE.UU. Su construcción se ha descrito en J.
Hartikka et al. (Human Gene Therapy,
7:1205-1217 (1996), incorporada por referencia).
Se ha realizado una reacción de
RT-PCR, según la técnica descrita en el Ejemplo 6,
con el ARN genómico del virus de la gripe equina ("Equine
Influenza Virus" o EIV)(cepa Newmarket 2/93) (Daly et al., J.
Gen. Virol., 77:661-671 (1996)), preparada
según la técnica descrita en el Ejemplo 5, y con los
oligonucleótidos siguientes:
- CCL007 (40 meros)(SEC. Nº ID 1)
- 5' TTGTCGACTCAATCATGAAGACAACCATTATTTTGATACT 3'
\vskip1.000000\baselineskip
- CCL018 (34 meros)(SEC. Nº ID 2)
- 5' TTGGATCCTTACTCAAATGCAAATGTTGCACCTG 3'
para aislar el gen que codifica la
glicoproteína HA del virus de la gripe equina (cepa Newmarket 2/93)
(Figura nº 1, SEC. Nº ID 3) bajo la forma de un fragmento de la PCR
de aproximadamente 1750 pb. Este fragmento se ha purificado, a
continuación se ha ligado con el vector pCRII (Cat#
K2000-01. In Vitrogen Corp. Carlsbad, CA) para
proporcionar el plásmido pCCL026. El plásmido pCCL026 se ha digerido
a continuación con los enzimas de restricción SalI y NotI para
aislar un fragmento SalI-NotI de 1751 pb que
contiene el gen EIV HA Newmarket 2/93. Este fragmento se ha ligado
a continuación con el plásmido pVR1012 (ver Ejemplo 7), previamente
digerido por SalI y NotI, para proporcionar el plásmido pCCL027
(6642
pb).
\newpage
Se ha realizado una reacción de
RT-PCR, según la técnica descrita en el Ejemplo 6,
con el ARN genómico del virus de la gripe equina ("Equine
Influenza Virus" o EIV)(cepa Kentucky 1/94) (Daly et al., J.
Gen. Virol., 77:661-671 (1996)), preparada
según la técnica descrita en el Ejemplo 4, y con los
oligonucleótidos siguientes:
- CCL007 (40 meros)(SEC. Nº ID 1)
- 5' TTGTCGACTCAATCATGAAGACAACCATTATTTTGATACT 3'
\vskip1.000000\baselineskip
- CCL020 (34 meros)(SEC. Nº ID 4)
- 5' TTGGATCCTTACTCAAATGCAAATGTTGCATCTG 3'
para aislar el gen que codifica la
glicoproteína HA del virus de la gripe equina (cepa Kentucky 1/94)
(Figura nº 2, SEC. Nº ID 5) bajo la forma de un fragmento de la PCR
de aproximadamente 1750 pb. Este fragmento se ha purificado, a
continuación se ha ligado con el vector pCRII (Cat#
K2000-01, InVitrogen Corp Carlsbad, CA) para
proporcionar el plásmido pCCL028. El plásmido pCCL028 se ha digerido
con los enzimas de restricción SacI y BamHI para aislar un
fragmento SacI-BamHI de 1153 pb (fragmento A) que
contiene la parte 3' del gen EIV HA Kentucky 1/94. El plásmido
pCCL028 se ha digerido con los enzimas de restricción SacI y EcoRV
para aislar un fragmento SacI-EcoRV de 621 pb
(fragmento B) que contiene la parte 5' del gen EIV HA Kentucky 1/94.
Los fragmentos A y B se han ligado a continuación juntos con el
plásmido pVR1012 (ver Ejemplo 7), previamente digerido por EcoRV y
BamHI, para proporcionar el plásmido pPB242 (6688
pb).
Se ha realizado una reacción de
RT-PCR, según la técnica descrita en el Ejemplo 6,
con el ARN genómico del virus de la gripe equina ("Equine
Influenza Virus" o EIV)(cepa Newmarket 2/93) (Daly et al., J.
Gen. Virol., 77:661-671 (1996)), preparada
según la técnica descrita en el Ejemplo 4, y con los
oligonucleótidos siguientes:
- AB260 (35 meros) (SEC. Nº ID 6)
- 5' TTTGTCGACATGAAYCCAAATCAAAARATAATAAC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
- AB262 (32 meros)(SEC. Nº ID. 7)
- 5' TTTGGATCCYTACATCTTRTCGATGTCAAAGG 3'
para aislar el gen que codifica la
glicoproteína neuraminidasa (NA) del virus de la gripe equina (cepa
Newmarket 2/93) (Figura nº 1, SEC. Nº ID. 8) bajo la forma de un
fragmento de la PCR de aproximadamente 1430 pb. Este fragmento se
ha purificado, a continuación se ha digerido con los enzimas de
restricción SalI y BamHI para aislar un fragmento
SalI-BamHI de 1418 pb que contiene el gen EIV NA
Newmarket 2/93. Este fragmento se ha ligado a continuación con el
plásmido pVR1012 (ver Ejemplo 7), previamente digerido por SalI y
BamHI, para proporcionar el plásmido pAB142 (6287
pb).
Se ha realizado una reacción de
RT-PCR, según la técnica descrita en el Ejemplo 6,
con el ARN genómico del virus de la gripe equina ("Equine
Influenza Virus" o EIV)(cepa Kentucky 1/94) (Daly et al., J.
Gen. Virol., 77:661-671 (1996)), preparada
según la técnica descrita en el Ejemplo 4 y con los oligonucleótidos
siguientes: AB260 y AB262 (Ejemplo 10) para aislar el gen que
codifica la glicoproteína neuraminidasa (NA) del virus de la gripe
equina (cepa Kentucky 1/94) (Figura nº 4, SEC. Nº ID. 9) bajo la
forma de un fragmento de la PCR de aproximadamente 1430 pb. Este
fragmento se ha purificado, a continuación se ha digerido con los
enzimas de restricción SalI y BamHI para aislar un fragmento
SalI-BamHI de 1418 pb que contiene el gen EIV NA
Kentucky 1/94. Este fragmento se ha ligado a continuación con el
plásmido pVR1012 (ver Ejemplo 7), previamente digerido por SalI y
BamHI, para proporcionar el plásmido pAB116 (6287 pb).
Se ha realizado una reacción de
RT-PCR, según la técnica descrita en el Ejemplo 6,
con el ARN genómico del virus de la gripe equina ("Equine
Influenza Virus" o EIV)(cepa Newmarket 2/93) (Daly et al., J.
Gen. Virol., 77:661-671 (1996)), preparada
según la técnica descrita en el Ejemplo 4, y con los
oligonucleótidos siguientes:
- CCL019 (25 meros)(SEC. Nº ID. 10)
- 5' TTGTCGACCATGGCGTCTCAAGGCAC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
- CCL021 (28 meros)(SEC. Nº ID. 11)
- 5' TTTCTAGACTTTAAYTGTCAWACTCYTC 3'
para aislar el gen que codifica la
nucleoproteína (NP) del virus de la gripe equina (cepa Newmarket
2/93) (Figura nº 5, SEC. Nº ID. 12) bajo la forma de un fragmento
de la PCR de aproximadamente 1520 pb. Este fragmento se ha
purificado, a continuación se ha digerido con los enzimas de
restricción SalI y XbaI para aislar un fragmento
SalI-XbaI de 1506 pb que contiene el gen EIV NP
Newmarket 2/93. Este fragmento se ha ligado a continuación con el
plásmido pVR1012 (ver Ejemplo 7), previamente digerido por SalI y
XbalI, para proporcionar el plásmido pPB245 (6389
pb).
Se ha realizado una reacción de
RT-PCR, según la técnica descrita en el Ejemplo 6,
con el ARN genómico del virus de la gripe equina ("Equine
Influenza Virus" o EIV) (cepa Kentucky 1/94) (Daly et al., J.
Gen. Virol., 77:661-671 (1996)), preparada
según la técnica descrita en el Ejemplo 4 y con los oligonucleótidos
siguientes: CCL019 y CCL021 (Ejemplo 12) para aislar el gen que
codifica la nucleoproteína (NP) del virus de la gripe equina (cepa
Kentucky 1/94) (Figura nº 6, SEC. Nº ID. 13) bajo la forma de un
fragmento de la PCR de aproximadamente 1520 pb. Este fragmento se
ha purificado, a continuación se ha digerido con los enzimas de
restricción SalI y XbaI para aislar un fragmento
SalI-XbaI de 1506 pb que contiene el gen EIV NP
Kentucky 1/94. Este fragmento se ha ligado a continuación con el
plásmido pVR1012 (ver Ejemplo 7), previamente digerido por SalI y
XbalI, para proporcionar el plásmido pPB246 (6389 pb).
Su construcción se ha descrito en
WO-A-98 03200.
\vskip1.000000\baselineskip
Su construcción se ha descrito en
WO-A-98 03200.
\vskip1.000000\baselineskip
Su construcción se ha descrito en
WO-A-98 03658.
\vskip1.000000\baselineskip
Su construcción se ha descrito en
WO-A-98 03658.
Su construcción se ha descrito en
WO-A-98 03199.
\vskip1.000000\baselineskip
Su construcción se ha descrito en
WO-A-98 03199.
\vskip1.000000\baselineskip
Su construcción se ha descrito en
WO-A-98 03199.
\vskip1.000000\baselineskip
La vacuna ensayada es una mezcla de los 3
plásmidos pCCL027 (Ejemplo 8), pAB142 (Ejemplo 10) y pPB245
(Ejemplo 12) que contienen y expresan respectivamente los genes HA,
NA y NP del virus EIV cepa Newmarket 2/93. Esta mezcla está
asociada o no a un carbómero de la presente invención. El protocolo
de vacunación/ensayo ha sido el siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Para este estudio se utilizaron ponis (ponis
Welsh Mountain) de 7 a 8 meses de edad, que no presentaban
anticuerpos detectables contra los virus H3N8 y H7N7, medidos
mediante el ensayo SRH (por "Single Radial Hemolysis" o
hemolisis radial simple). Los ponis se repartieron aleatoriamente
entre los 4 grupos. Los caballos se vacunaron en J0 y J35 por vía
intramuscular. La vacuna comercial utilizada para el grupo C se
administró a los caballos en un volumen de dosis de 1 ml. Los ponis
de los grupos A y B recibieron cada uno 2 dosis de 5 ml en J0 y J35
mediante inyección intramuscular profunda en el cuello. En J56, tres
semanas después de la segunda vacunación, se infectó cada poni
mediante una exposición a un aerosol proveniente de aproximadamente
1 ml de líquido alantoideo que contenía un total de 107,3 ElD50 del
virus Influenza A-equi-2/Sussex/ 89,
utilizando un nebulizador modelo ULTRA 2000 (De Vilbiss, Somerset
PA), como el descrito por Mumford et al., Equine Vet. J.,
22:93-98 (1990).
Después del ensayo, los ponis se monitorizaron
para observar los signos clínicos (establecimiento de una
puntuación clínica) y la temperatura. Se realizaron barridos nasales
con escobilla diariamente, desde el día 0 de la prueba hasta el 10º
día después de la prueba, para medir la cantidad de virus excretado
por cada caballo ensayado. Finalmente, se efectuaron extracciones
de sangre a lo largo de todo el protocolo, antes y después del
ensayo (días J0, J7, J14, J35, J49, J56, J63 y J70) con objeto de
medir la cinética de aparición y la tasa de los anticuerpos SRH e
IHA (anticuerpos hemaglutinantes) de cada grupo vacunado.
La eficacia de una vacuna plasmídica, asociada o
no al carbómero, se estudió en el cerdo en un modelo de
vacunación/ensayo de la enfermedad de Aujeszky. La vacuna ensayada
es una mezcla de los 2 plásmidos pAB090 (Ejemplo 16) y pPB098
(Ejemplo 17), que contienen y expresan respectivamente los genes gB
y gD del virus PRV. La mezcla se asoció o no a un carbómero de la
presente invención. El protocolo de vacunación/ensayo utilizado ha
sido el siguiente:
En J0, los cerdos de los grupos A y B se
vacunaron con la mezcla de plásmidos pPB098 y pAB090 (200 \mug de
cada plásmido), asociada o no con el carbómero, por vía
intramuscular, y en un volumen de 2 ml. Los cerdos del grupo C
recibieron una inyección de la vacuna comercial Geskypur (vacuna de
subunidades, MERIAL, Lyon, Francia) por vía intramuscular en un
volumen de 2 ml. Los cerdos del grupo D no se vacunaron. En J21,
todos los cerdos se ensayaron con 2 ml (a razón de 1 ml por fosa
nasal) de una suspensión viral de la cepa de ensayo Aujeszky cepa
NlA3 (dilución al 1/5 de una solución de depósito con un título de
108,25 DICC50/ml).
Después del ensayo, se monitorizó la mortalidad
y el criterio de delta G7 (pesos individuales en J0 y J7 del
ensayo) de los cerdos. Se realizaron barridos nasales con escobilla
diariamente, desde J0 hasta J14 del ensayo, para medir la cantidad
de virus excretado después del ensayo. Finalmente, se tomaron
muestras de sangre en J0, J7, J14, J21 y J28 del protocolo para
medir la cinética y la tasa de los anticuerpos seroneutralizantes
del virus de la enfermedad de Aujeszky (PRV). Del mismo modo, se
midieron los anticuerpos ELISA anti-PRV de los
isotipos IgG1 e lgG2 en los sueros obtenidos de los cerdos vacunados
y no vacunados.
La eficacia de una vacuna plasmídica, asociada o
no al carbómero, se estudió en el bovino en un modelo de
vacunación/ensayo de la rinotraqueitis infecciosa bovina. La vacuna
ensayada es una mezcla de los 2 plásmidos pPB156 (Ejemplo 14) y
pAB087 (Ejemplo 15), que contienen y expresan respectivamente los
genes gB y gD del virus BHV-1. La mezcla se asoció
o no a un carbómero de la presente invención. El protocolo de
vacunación/ensayo utilizado ha sido el siguiente:
En J0, las terneras de los grupos A y B se
vacunaron con la mezcla de plásmidos pPAB087 y pPB156 (300 \mug
de cada plásmido), asociada o no con el carbómero, por vía
intramuscular, y en un volumen de 5 ml. Las terneras del grupo C
recibieron una inyección de la vacuna comercial Ibepur (vacuna de
subunidades, MERIAL, Lyon, Francia) por vía intramuscular en un
volumen de 2 ml. Las terneras del grupo D no se vacunaron. En J21,
los grupos A, B y C recibieron una segunda inyección de vacuna según
las mismas modalidades que en J0. En J35, se ensayaron las terneras
con 2,5 ml (a razón de 1,25 ml por fosa nasal) de una suspensión
viral de la cepa de ensayo BHV-1 cepa B901
(dilución al 1/5 de una solución de depósito con un título de 108,15
DICC50/ml). Después del ensayo, las terneras se monitorizaron para
observar los signos clínicos (establecimiento de una puntuación
clínica). Se realizaron barridos nasales con escobilla diariamente,
desde J0 hasta J14 del ensayo, para medir la cantidad de virus
excretado después del ensayo. Finalmente, se tomaron muestras de
sangre en J0, J7, J14, J21 y J28 del protocolo para medir la
cinética y la tasa de los anticuerpos seroneutralizantes del virus
de la rinotraqueitis infecciosa bovina (BHV-1). Del
mismo modo, se midieron los anticuerpos ELISA
anti-BHV-1 de los isotipos IgG1 e
lgG2 en los sueros obtenidos de las terneras vacunadas y no
vacunadas.
\vskip1.000000\baselineskip
La eficacia de una vacuna plasmídica, asociada o
no al carbómero, se estudió en el perro en un modelo de
vacunación/ensayo de la enfermedad de Carré (CDV). La vacuna
ensayada es una mezcla de los 2 plásmidos pAB044 (Ejemplo 18) y
pAB036 (Ejemplo 19), que contienen y expresan respectivamente los
genes HA y F del virus CDV. El protocolo de vacunación/ensayo
utilizado ha sido el siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los perros de los grupos A, B y C se vacunaron
en J0 y J28 por vía intramuscular. Los perros de los grupos A y B
recibieron por cada vacunación una inyección de solución plasmídica
de 400 \mug en total (2 \times 200 \mug) en un volumen de 1
ml.
Los perros del grupo C se vacunaron con la
vacuna EURICAN (CHPPI2) que es una vacuna comercializada por
Mérial, Lyon, Francia. Una dosis comercial contiene aproximadamente
10\4 pfu de la cepa de vacunación CDV Onderstepoort, así como las
valencias para la vacunación contra la hepatitis de Rubarth, la
parvovirosis canina y el virus parainfluenza del tipo 2.
El ensayo se efectuó en J49, mediante la
administración intracerebral de una dilución a la 1/10ª de la cepa
de ensayo CDV "Synder-Hill" (lote preparado y
suministrado por el USDA, EE.UU.).
Se efectuó un seguimiento clínico diariamente
durante 21 días después del ensayo para anotar los signos (estado
general, síntomas oculo-nasales, síntomas
digestivos, síntomas nerviosos, temperatura) (anotación según las
reglas de la farmacopea europea). Del mismo modo, los perros
ensayados se pesaron una vez por semana.
La protección se apreció según los criterios
siguientes:
- -
- puntuaciones clínicas promedio de cada grupo
- -
- niveles de viremia CDV después del ensayo (medición de la carga viral en los linfocitos en J56, J61, J66, J70).
- -
- numeración/fórmula en las tomas de sangre efectuadas en J48, J54, J56, J59, J63 y J70 (sobretodo, días -1, 5, 7, 10, 14 y 21 después del ensayo).
- -
- evolución ponderal después del ensayo.
Para todos estos criterios, se compararon las
tasas promedio de cada grupo entre ellos y con la tasa promedio del
grupo control.
Se realizaron extracciones de sangre en los días
J0, J14, J28, J56 y J70 para la titulación de los anticuerpos ELISA
y seroneutralizantes del virus de la enfermedad de Carré.
Claims (11)
1. Vacuna para la vacunación del caballo, que
comprende un ADN desnudo que incorpora al menos un ácido nucleico
que codifica un polipéptido antigénico de un agente patógeno del
caballo, y que expresa in vivo dicho polipéptido antigénico,
y al menos un compuesto adyuvante escogido de entre los polímeros
del ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido
maleico y de etileno.
2. Vacuna de la reivindicación 1, que comprende
un polímero reticulado del ácido acrílico o metacrílico.
3. Vacuna de la reivindicación 2, en la cual el
polímero está reticulado por un éter polialquenílico de azúcar o de
polialcohol.
4. Vacuna de la reivindicación 3, en la cual el
polímero está reticulado por una alil-sacarosa o por
el alilpentaeritritol
5. Vacuna de la reivindicación 1, que comprende
un carbómero.
6. Vacuna de la reivindicación 1, que comprende
un polímero lineal o reticulado de anhídrido maleico y de
etileno.
7. Vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la cual el compuesto adyuvante está
presente en la vacuna en proporción del 0,01% al 2% P/V.
8. Vacuna de la reivindicación 7, en la cual la
concentración de compuesto adyuvante es del 0,06% al 1% en P/V.
9. Vacuna de la reivindicación 8, en la cual la
concentración de compuesto adyuvante es del 0,1% al 0,6% en P/V.
10. Vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en la cual el ADN desnudo es un plásmido
circular.
11. Vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en la cual el agente patógeno del caballo
es:
- -
- el virus de la rinoneumonía equina
- -
- el virus de la gripe equina
- -
- Cl. Tetani
- -
- el virus de la encefalitis del Este
- -
- el virus de la encefalitis del Oeste
- -
- el virus de la encefalitis venezolana.
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