ES2233690T3 - Mutantes de la proteina fluorescentes verde. - Google Patents
Mutantes de la proteina fluorescentes verde.Info
- Publication number
- ES2233690T3 ES2233690T3 ES01972260T ES01972260T ES2233690T3 ES 2233690 T3 ES2233690 T3 ES 2233690T3 ES 01972260 T ES01972260 T ES 01972260T ES 01972260 T ES01972260 T ES 01972260T ES 2233690 T3 ES2233690 T3 ES 2233690T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gfp
- protein
- amino acid
- fluorescent protein
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 61
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims abstract description 156
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 128
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 127
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 121
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 111
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 110
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 52
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 51
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 34
- 108091005971 Wild-type GFP Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000004289 sodium hydrogen sulphite Substances 0.000 claims description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 5
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002284 excitation--emission spectrum Methods 0.000 claims 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract description 7
- 230000003915 cell function Effects 0.000 abstract description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 17
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 15
- 102220566687 GDNF family receptor alpha-1_F64L_mutation Human genes 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- 102220566469 GDNF family receptor alpha-1_S65T_mutation Human genes 0.000 description 8
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 102220566560 GDNF family receptor alpha-1_E222G_mutation Human genes 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 5
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102220566451 GDNF family receptor alpha-1_Y66H_mutation Human genes 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000001782 photodegradation Methods 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 102000036364 Cullin Ring E3 Ligases Human genes 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 101000801742 Homo sapiens Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102220528919 Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1_F64A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000002292 fluorescence lifetime imaging microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 102220094076 rs63750214 Human genes 0.000 description 2
- 102220256863 rs767019998 Human genes 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000243290 Aequorea Species 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100034042 Alcohol dehydrogenase 1C Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 1
- 108010029675 Bacillus licheniformis alpha-amylase Proteins 0.000 description 1
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102220543132 Bis(5'-adenosyl)-triphosphatase_Y145F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000012437 Copper-Transporting ATPases Human genes 0.000 description 1
- 108010022637 Copper-Transporting ATPases Proteins 0.000 description 1
- 101000796894 Coturnix japonica Alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- -1 DDAO galactoside Chemical class 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 102220566524 GDNF family receptor alpha-1_F99S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220566467 GDNF family receptor alpha-1_S65A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220566468 GDNF family receptor alpha-1_S65G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 102000058061 Glucose Transporter Type 4 Human genes 0.000 description 1
- 102220486246 Glucosidase 2 subunit beta_S65V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000125500 Hedypnois rhagadioloides Species 0.000 description 1
- 101000780463 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1C Proteins 0.000 description 1
- 101000741885 Homo sapiens Protection of telomeres protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000235087 Lachancea kluyveri Species 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 108010009254 Lysosomal-Associated Membrane Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 1
- 102100038745 Protection of telomeres protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091006300 SLC2A4 Proteins 0.000 description 1
- 108010011005 STAT6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000013968 STAT6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102220615016 Transcription elongation regulator 1_S65C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010056354 Ubiquitin C Proteins 0.000 description 1
- 108091034131 VA RNA Proteins 0.000 description 1
- BTKMJKKKZATLBU-UHFFFAOYSA-N [2-(1,3-benzothiazol-2-yl)-1,3-benzothiazol-6-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound C1=CC=C2SC(C3=NC4=CC=C(C=C4S3)OP(O)(=O)O)=NC2=C1 BTKMJKKKZATLBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGDAGYXJBDILKZ-UHFFFAOYSA-N [2-methyl-1,1-dioxo-3-(pyridin-2-ylcarbamoyl)-1$l^{6},2-benzothiazin-4-yl] 2,2-dimethylpropanoate Chemical compound CC(C)(C)C(=O)OC=1C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)N(C)C=1C(=O)NC1=CC=CC=N1 LGDAGYXJBDILKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- OFEZSBMBBKLLBJ-BAJZRUMYSA-N cordycepin Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)C[C@H]1O OFEZSBMBBKLLBJ-BAJZRUMYSA-N 0.000 description 1
- OFEZSBMBBKLLBJ-UHFFFAOYSA-N cordycepine Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)CC1O OFEZSBMBBKLLBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000009937 cyclo 3 Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010061330 glucan 1,4-alpha-maltohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000010198 maturation time Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 102000010838 rac1 GTP Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010062302 rac1 GTP Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102220243291 rs1555194026 Human genes 0.000 description 1
- 102200089551 rs5030826 Human genes 0.000 description 1
- 102220071789 rs794728512 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
- Carbon And Carbon Compounds (AREA)
- Glass Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Una proteína fluorescente que se obtiene de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) o cualquier análogo funcional de GFP y que tiene una secuencia de aminoácidos que está modificada por sustitución de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la Proteína Fluorescente Verde de tipo silvestre, comprendiendo dicha proteína fluorescente modificada: i) una sustitución de aminoácido en la posición F64; ii) una sustitución única de aminoácido en la posición seleccionada entre el grupo compuesto por las posiciones S65 y E222, donde el aminoácido en la posición 65 se ha sustituido por una aminoácido seleccionado entre el grupo compuesto por G, A, L, C, V, I y T; y iii) una sustitución de aminoácido en la posición S175; donde dicha GFP modificada tiene un espectro de excitación y/o especto de emisión diferentes en comparación con GFP de tipo silvestre.
Description
Mutantes de la proteína fluorescentes verde.
La presente invención se refiere a nuevas
variantes de la proteína fluorescente GFP que tiene propiedades de
fluorescencia mejoradas.
El uso de la Proteína Fluorescente Verde (GFP)
que se obtiene de Aequorea victoria ha revolucionado la
investigación de muchos procesos celulares y
biológico-moleculares. GFP permite a los
investigadores marcar proteínas en células con un flúor intrínseco,
haciendo innecesario el requisito de realizar marcaje químico de
proteínas, y permitiendo el desarrollo de ensayos de procesos
biológicos en células vivas intactas.
El documento US 5491084 describe el uso de GFP
como un informador biológico. Las primeras aplicaciones de GFP como
un informador biológico (Chalfie et al. Science, (1994),
263, 802-5; Charlfie, et al.,
Photochem.Photobiol., (1995), 62 (4), 651-6)
usaron GFP de tipo silvestre (nativo) (wtGFP), pero estos estudios
demostraron rápidamente dos áreas de deficiencia de wtGFP como un
informador para el uso en células de mamífero. En primer lugar, la
proteína que se obtiene de un organismo marino poiquilotermo no
experimenta una unión a proteínas eficaz cuando se expresa en
células de mamífero cultivadas a 37ºC, dando como resultado una
fluorescencia débil. En segundo lugar, las características
espectrales de la wtGFP no son perfectamente apropiadas para usar
como un informador celular, requiriendo excitación con radiación
electromagnética en el intervalo cercano a UV, que es potencialmente
dañino para células vivas.
Por consiguiente, se ha hecho un esfuerzo
significativo para producir formas mutadas variantes de GFP con
propiedades más apropiadas para usar como un informador
intracelular.
Se han descrito varias formas mutadas de GFP con
propiedades espectrales alteradas. Una variante de GFP (Heim et
al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 12501) contiene una
mutación Y66H que cambia al azul el espectro de excitación y emisión
de la proteína. Sin embargo, esta proteína sólo es ligeramente
fluorescente y requiere excitación con UV potencialmente dañina.
Una mutación adicional de GFP (Heim et al,
Nature, (1995), 373, 663-664) contiene una
mutación S65T que cambia al rojo las longitudes de onda de
excitación y emisión óptimas en relación con wtGFP y que es
4-6 veces más brillante que wtGFP cuando se expresa
como una proteína recombinante a 25ºC. Sin embargo, esta variante no
produce fluorescencia brillante cuando se expresa en hospedadores
cultivados a 37ºC.
Ehrig et al (FEBS Lett., (1995),
367, 163-6) describe dos mutaciones de GFP,
T203I y E222G, que suprimen individualmente uno de los máximos de
excitación de wtGFP. La mutación de E222G suprime el pico de
excitación a 395 nm cercano a UV y produce un cambio al rojo en el
pico de excitación de 475 nm a 481 nm. El pico de emisión para esta
proteína mutante es a 506 nm.
El documento WO 96/27675 describe dos variantes
de GFP, obtenidas por mutagénesis al azar y posterior selección de
luminosidad, que contiene las mutaciones V163A y V163A+S175G,
respectivamente. Se mostró que estas variantes producen una
expresión más eficaz en células vegetales en relación con wtGFP e
incrementan la termotolerancia de la unión de la proteína. Se
observó que el doble mutante V163A+S175G era más luminoso que la
variante que contiene la mutación única V163A sola; sin embargo,
este mutante muestra un pico de excitación no deseable cambiado al
azul.
Un mutante adicional, denominado
ciclo-3, generado por evolución molecular a través
de redistribución de ADN (Crameri, A. et al., Nature
Biotechnology, (1996), 14, 315-9), está
disponible en el comercio por Invitrogen Inc. GFP
ciclo-3 contiene tres mutaciones (F99S+M153T+V163A)
que incrementan la fluorescencia celular total aproximadamente 42
veces cuando se compara con wtGFP. Sin embargo, este mutante
conserva el máximo de excitación cercano a UV de la wtGFP,
haciéndola menos apropiada como un informador para el uso en células
vivas.
Las mutaciones anteriores tratan eficazmente
algunas deficiencias espectrales de wtGFP como un informador
biológico para proporcionar formas variantes de GFP que son
compatibles con excitación con energía más baja y que emite
longitudes de onda compatibles con los instrumentos de detección
habitualmente en uso para medir informadores biológicos. Sin
embargo, dichas mutaciones no tratan el problema de unión eficaz y
formación del cromóforo cuando wtGFP o variantes espectrales se
expresan en hospedadores que requieren crecimiento a temperaturas
significativamente mayores de las de ambiente.
El documento US 6172188 describe variantes de GFP
donde el aminoácido en posición 1 que precede el cromóforo se ha
mutado para proporcionar un incremento de la intensidad de
fluorescencia. Dichas mutaciones incluyen F64I, F64V, F64A, F64G y
F64L, con F64L siendo la mutación preferida. Estas mutaciones dan
como resultado un incremento sustancial en la intensidad de
fluorescencia de GFP sin cambiar los máximos de excitación y
emisión. Se ha mostrado que F64L-GFP produce un
incremento de aproximadamente 6 veces en fluorescencia a 37ºC debido
a un tiempo de maduración del cromóforo más corto.
Además de las mutaciones únicas o combinaciones
derivadas al azar de mutaciones descritas anteriormente, se ha
creado una variedad de mutantes de GFP que contiene dos o más
mutaciones seleccionadas deliberadamente de las descritas
anteriormente y otras mutaciones, y que pretenden combinar las
propiedades ventajosas de las mutaciones individuales para producir
una proteína con propiedades de expresión y espectrales que son
apropiadas para usar como un informador biológico sensible en
células de mamífero.
Un mutante, habitualmente denominado EGFP,
disponible en el mercado por Clontech Inc., contiene las mutaciones
F64L y S65T (Cormack, B.P. et al, Gene, (1996), 173,
33-38). Cuando se combinan estas mutaciones, otorgan
un incremento de aproximadamente 35 veces en la luminosidad sobre
wtGFP y las características espectrales permiten la excitación y
detección de EGFP con excitación con fluoresceína habitualmente
usada (488 nm) y filtros de emisión (505 nm-530 nm).
EGFP se ha optimizado para la expresión en sistemas de mamíferos,
siendo construida con codones de mamífero preferidos.
El documento US 6194548 describe GFP con
características de fluorescencia y unión mejoradas a 37ºC que
contienen, al menos, los cambios F64L y V163A y S175G. Se ha
descrito un mutante adicional de GFP que contiene las mutaciones
F64L, S65T y V163A (Cubitt, A.B. et al, Methods in Cell
Biology, (1999), 58, 19-29).
El documento US 6077707 describe una proteína
fluorescente azul (BFP) que contiene la mutación F64L en combinación
con Y66H, y el documento US 6194548 describe una BFP adicional que
contiene las sustituciones F64L, Y66H, Y145F y L236R.
El documento US 8.054.321 describe GFP que son
útiles en transferencia de energía por resonancia de fluorescencia
(FRET) y enumera las sustituciones de aminoácidos en una amplia
variedad de posibles posiciones, siendo F64L, S65 y E222 entre los
muchos mutantes especificados.
Los mutantes de GFP que son útiles en FRET y
ensayos de vida de fluorescencia (FLIM) se describen en el documento
WO00/08054. Dichos ensayos son muy específicos en el medio natural y
las proteínas apropiadas para FRET y FLIM no son necesariamente
apropiadas para ensayos de fluorescencia convencionales. Los
mutantes de GFP que tienen sustituciones en F64L, S65T y S175G son
sólo descritos como tres posibles mutaciones con una amplia serie de
mutaciones potenciales.
Brejc Katjusa et al. (Proc. Natl. Acad.
Sci. Estados Unidos (1997), 94, 2306-2311) examina
la estructura cristalina de rayos X de GFP de tipo silvestre y
describe GFP que tienen mutaciones puntuales únicas en S65 o G222.
El documento está implicado en dilucidar las propiedades
espectroscópicas de GFP de tipo silvestre y porqué la mutación S65T
tiene dicho efecto profundo en estas propiedades.
La presente invención proporciona nuevos
derivados modificados de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) que
muestra fluorescencia aumentada en relación con wtGFP cuando se
expresa en células no homólogas a temperaturas por encima de 30ºC, y
cuando se excita aproximadamente a 490 nm en comparación con las
proteínas precursoras, es decir, wtGFP. Los mutantes de GFP de
acuerdo con la invención proporcionan un medio para detectar
informadores GFP en células de mamífero a niveles más bajos de
expresión y/o sensibilidad aumentada en relación con wtGFP. Esto
mejora enormemente la utilidad de proteínas fluorescentes para
estudiar las funciones celulares en células vivas. Las GFP mutadas
en múltiples sitios de esta invención tienen propiedades de
fluorescencia que no son predecibles a partir de las propiedades de
las mutaciones individuales cuando se estudian aisladas. Además, se
ha descubierto sorprendentemente que ciertas GFP de acuerdo con la
presente invención, que no contienen ninguna mutación en la región
cromófora en relación con wtGFP, muestran fluorescencia aumentada
comparada con los mutantes de GFP descritos previamente.
En un primer aspecto de la invención, se
proporciona una proteína fluorescente que deriva de la Proteína
Fluorescente Verde (GFP) o cualquier análogo funcional de GFP y que
tiene una secuencia de aminoácidos que está modificada por
sustitución de aminoácidos en comparación con la secuencia de
aminoácidos de la Proteína Fluorescente Verde de tipo silvestre,
comprendiendo dicha proteína fluorescente modificada:
i) una sustitución de aminoácido en la posición
F64;
ii) una sustitución única de aminoácido en la
posición seleccionada entre el grupo compuesto por las posiciones
S65 y E222, donde el aminoácido S en la posición 65 se ha sustituido
por un aminoácido seleccionado entre el grupo compuesto por G, A, L,
C, V, I y T; y
iii) una sustitución de aminoácido en la posición
S175;
donde dicha GFP modificada tiene un
espectro de excitación y/o una espectro de emisión diferentes en
comparación con GFP de tipo
silvestre.
Apropiadamente, el aminoácido F en la posición 64
puede sustituirse por una aminoácido seleccionado entre el grupo
compuesto por L, I, V, A y G, proporcionando de este modo
sustituciones F64L, F64I, F64V, F64A, o F64G. En una realización
preferida del primer aspecto, el aminoácido F se sustituye por L en
la posición 64.
Apropiadamente, el aminoácido S en la posición
175 puede sustituirse por un aminoácido seleccionado entre el grupo
compuesto por G, A, L, I y T, proporcionando de este modo
sustituciones S175G, S175A, S175L, S175I y S175T. En una realización
preferida del primer aspecto, el aminoácido S se sustituye por G en
la posición 175.
En realizaciones donde el aminoácido en la
posición 65 se sustituye, se sustituye apropiadamente por un
aminoácido seleccionado entre el grupo compuesto por G, A, L, C, V,
I y T, proporcionando de este modo sustituciones S65G, S65A, S65L,
S65C, S65V, S65I o S65T. Preferiblemente, la sustitución de
aminoácido en la posición 65 es la sustitución S65T.
En realizaciones donde el aminoácido E en la
posición 222 se sustituye, se sustituye apropiadamente por un
aminoácido seleccionado entre el grupo compuesto por G, A, V, L, I,
F, S, T, N y Q, proporcionando de este modo sustituciones E222G,
E222A, E222V, E222L, E222I, E222F, E222S, E222T, E222N o E222Q.
Preferiblemente, la sustitución de aminoácido en la posición 222 es
la sustitución E222G.
Apropiadamente, las nuevas proteínas
fluorescentes muestran fluorescencia alta en células que la expresan
cuando dichas células se incuban a una temperatura de 30ºC o
superior, preferiblemente una temperatura de 32ºC a 39ºC, más
preferiblemente de 35ºC a 38ºC y aún más preferiblemente a una
temperatura de aproximadamente 37ºC.
Preferiblemente, la proteína fluorescente de
acuerdo con el primer aspecto tiene una secuencia de aminoácidos que
está modificada por sustitución de aminoácidos en comparación con la
secuencia de aminoácidos de la Proteína Fluorescente Verde de tipo
silvestre teniendo la secuencia: SEC ID Nº: 2.
Una proteína preferida de acuerdo con la presente
invención es una proteína en la que, en relación con SEC ID Nº: 2 de
GFP, el aminoácido F en la posición 64 se ha sustituido por L, el
aminoácido S en la posición 175 se ha sustituido por G y el
aminoácido E en la posición 222 se ha sustituido por G, y se muestra
en este documento que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la
expuesta en SEC ID Nº: 3.
Una proteína preferida alternativa de acuerdo con
la presente invención es una proteína en la que, en relación con SEC
ID Nº: 2 de GFP, el aminoácido F en la posición 64 se ha sustituido
por L, el aminoácido S en la posición 65 se ha sustituido por T y el
aminoácido S en la posición 175 se ha sustituido por G, y se muestra
en este documento que tiene la misma secuencia de aminoácidos que
expuesta en SEC ID Nº: 4.
Apropiadamente, la GFP o el análogo funcional de
GFP usado para obtener la proteína fluorescente pueden obtenerse a
partir de cualquier fuente conveniente. Por ejemplo, la GFP nativa
obtenida de especies del género Aequorea, apropiadamente
Aequorea victoria. El cromóforo en wtGFP de Aequorea
victoria está en las posiciones 65-67 de la
secuencia de aminoácidos primaria predicha (SEC ID Nº: 2). En una
realización preferida, la GFP se obtiene de Aequorea
victoria.
Las proteínas modificadas de la presente
invención pueden producirse por introducción de mutaciones en una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína. Como se usa
en este documento, una secuencia preferida del gen que codifica
wtGFP se obtiene de Aequorea victoria, publicada por Chalfie
et al. (Science, (1994), 263, 802-5)
descrita como SEC ID Nº: 1 (Figura 1). La secuencia de aminoácidos
correspondiente se muestra en SEC ID Nº: 2 (Figura 2). Pueden usarse
secuencias alternativas del gen de GFP, por ejemplo, las secuencias
de nucleótidos (y los aminoácidos predichos) del gen de GFP descrito
por Prasher et al., (Gene (1992), 111, 229) y las
secuencias como se describen en el documento WO 97/11094. Además,
las secuencias génicas alternativas que codifican la proteína
fluorescente pueden incorporar una secuencia consenso de nucleótidos
Kozak (Kozak, M., Cell (1986), 44, 283), o codones de
mamífero preferidos, para proporcionar una traducción mejorada en
sistemas de mamífero. La secuencia de nucleótidos correspondiente a
la proteína fluorescente puede también codificar sitios de enzimas
de restricción útiles y elementos adicionales tales como sitios
diana para enzimas y señales de purificación. Los métodos para la
incorporación de una región Kozak, codones de mamífero preferidos,
sitios de enzimas de restricción, sitios de enzimas y señales de
purificación son bien conocidos en la técnica y pueden dar como
resultado una incorporación de restos de aminoácidos y un cambio en
la numeración de los restos de aminoácidos en la proteína
fluorescente en relación con la numeración de wtGFP en la secuencia
proporcionada.
En este documento, las abreviaturas usadas para
los aminoácidos son las establecidas en J. Biol. Chem., (1968),
243, 3558.
En un segundo aspecto de la invención, se
proporciona un compuesto de fusión que comprende una proteína de
interés fusionada con una proteína fluorescente que se obtiene de la
Proteína Fluorescente Verde (GFP) o cualquier análogo funcional de
GFP y que tiene una secuencia de aminoácidos que está modificada por
sustitución de aminoácidos en comparación con la secuencia de
aminoácidos en la Proteína Fluorescente Verde de tipo silvestre,
comprendiendo dicha proteína fluorescente modificada:
i) una sustitución de aminoácido en la posición
F64;
ii) una sustitución única de aminoácido en la
posición seleccionada entre el grupo compuesto por las posiciones
S65 y E222, donde el aminoácido S en la posición 65 se ha sustituido
por un aminoácido seleccionado entre el grupo compuesto por G, A, L,
C, V, I y T; y
iii) una sustitución de aminoácido en la posición
S175;
donde dicha GFP modificada tiene un
espectro de excitación y/o espectro de emisión diferentes en
comparación con GFP de tipo
silvestre.
En el contexto de la presente invención, se
pretende que el término "proteína de interés" también incluya
polipéptidos y fragmentos peptídicos. Los ejemplos de dichas
proteínas de interés incluyen: NF\kappaB y subunidades de la
misma, RAC1, dominios PLC, MAPKAP2, PKC, Citocromo C, RHO,
actina-\beta, STAT6, isótopos de la proteína
quinasa C, LAMP1/2 TGN, ATP7A TGN y GLUT4.
En un tercer aspecto de la presente invención se
proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína fluorescente que
se obtiene de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) o cualquier
análogo funcional de GFP y que tiene una secuencia de aminoácidos
que está modificada por sustitución de aminoácidos en comparación
con la secuencia de aminoácidos de la Proteína Fluorescente Verde de
tipo silvestre, comprendiendo dicha proteína fluorescente
modificada:
i) una sustitución de aminoácido en la posición
F64;
ii) una sustitución única de aminoácido en la
posición seleccionada entre el grupo compuesto por las posiciones
S65 y E222, donde el aminoácido S en la posición 65 se ha sustituido
por un aminoácido seleccionado entre el grupo compuesto por G, A, L,
C, V, I y T; y
iii) una sustitución de aminoácido en la posición
S175;
donde dicha GFP modificada tiene un
espectro de excitación y/o espectro de emisión diferentes en
comparación con GFP de tipo
silvestre.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico de
acuerdo con el tercer aspecto codifica una proteína fluorescente que
tiene una secuencia de aminoácidos que está modificada por
sustitución de aminoácidos en comparación con la secuencia de
aminoácidos de la Proteína Fluorescente Verde de tipo silvestre que
tiene la secuencia: SEC ID Nº: 2.
En una realización particular del tercer aspecto,
la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica una proteína fluorescente obtenida de la Proteína
Fluorescente Verde (GFP) o cualquier análogo funcional de GFP de
acuerdo con la invención fusionada con una secuencia de nucleótidos
que codifica una proteína de interés.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es
una construcción que comprende una secuencia de ADN.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico
codifica una proteína fluorescente que tiene una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por SEC ID Nº: 3 y
SEC ID Nº: 4.
Como bien se sabe, un aminoácido único puede
estar codificado por más de un codón nucleotídico y de este modo
cada una de las secuencias de nucleótidos anteriores puede
modificarse para producir una secuencia de nucleótidos alternativa
que codifica el mismo péptido. De este modo, las realizaciones
preferidas de la invención incluyen secuencias de ADN alternativas
que codifican las proteínas preferidas como se describió
previamente. Debe entenderse que las proteínas preferidas (y las
secuencias de ácido nucleicos de las que se obtienen) pueden incluir
restos adicionales, particularmente aminoácidos N- y C- terminales o
secuencias de nucleótidos 5' o 3', y aún ser esencialmente como se
describe en este documento.
Apropiadamente, la construcción de ADN que
codifica las nuevas proteínas fluorescentes puede prepararse
sintéticamente por métodos establecidos, por ejemplo, el método de
fosforamidita descrito por Beaucage y Caruthers, (Tetrahedron
Letters (1981), 22, 1859-1869), o el método
descrito por Matthes et al., (EMBO Journal (1984), 3,
801-805). De acuerdo con el método de fosforamidita,
los oligonucleótidos se sintetizan, por ejemplo, en un sintetizador
de ADN automático, se purifican, se anillan, se ligan y clonan en
vectores apropiados.
La construcción de ADN que codifica la proteína
fluorescente puede también prepararse por metodología de ADN
recombinante, por ejemplo, clonación de ADNc. Véase por ejemplo,
Sambrook, J. et al (1989) Molecular Cloning - A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
La construcción de ADN también puede prepararse
por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores
específicos, por ejemplo, como los descritos en el documento US
4683202 o por Saiki et al (Science (1988), 239,
487-491). Puede encontrarse una revisión reciente de
los métodos de PCR en PCR Protocols (1990), Academic Press, San
Diego, California, Estados Unidos.
La secuencia génica que codifica la proteína
fluorescente puede unirse en la pauta de lectura con un gen que
codifica la proteína de interés y la proteína de fusión deseada
producida cuando se inserta en un vector de expresión apropiado. Por
ejemplo, puede emplearse la reacción en cadena de la polimerasa u
oligonucleótidos complementarios para modificar una secuencia
polinucleotídica que corresponde a la proteína fluorescente, 5' o 3'
de la secuencia génica que corresponde a la proteína de interés.
Como alternativa, pueden usarse las mismas técnicas para modificar
la secuencia polinucleotídica que corresponde a la secuencia 5' o 3'
de la proteína fluorescente en un sitio de clonación múltiple de un
vector de expresión antes de la inserción de una secuencia génica
que codifica la proteína de interés. La secuencia polinucleotídica
que corresponde a la secuencia de la proteína fluorescente puede
comprender secuencias de nucleótidos adicionales para incluir sitios
de clonación, engarces, señales de inicio de la transcripción y de
la traducción y/o de terminación, señales de marcaje y
purificación.
En un cuarto aspecto, se proporciona un vector de
expresión que comprende secuencias de control de expresión
apropiadas unidas de manera operativa a una molécula de ácido
nucleico de acuerdo con la presente invención. La construcción de
ADN de la invención puede insertarse en un vector recombinante, que
puede ser cualquier vector que pueda someterse convenientemente a
procedimientos de ADN recombinante. La elección del vector a menudo
dependerá de la célula hospedadora en la que tiene que introducirse.
De este modo, el vector puede ser un vector de replicación autónomo,
es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, la
replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica,
por ejemplo, un plásmido. Como alternativa, el vector puede ser uno
que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el
genoma de la célula hospedadora y se replica junto con el cromosoma
o cromosomas en que se ha integrado.
El vector es preferiblemente un vector de
expresión en el que la secuencia de ADN que codifica una proteína
fluorescente de la invención está unida de manera operativa a
segmentos adicionales que se necesitan para la transcripción del
ADN, en general, el vector de expresión se obtiene de ADN plasmídico
o viral, o puede contener elementos de ambos. La expresión, "unido
de manera operativa" indica que los segmentos están colocados de
modo que funcionan de acuerdo con los propósitos pretendidos, por
ejemplo, la transcripción se inicia en un promotor y continúa a
través de la secuencia de ADN que codifica la proteína fluorescente
de la invención.
El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN
que muestra actividad transcripcional en una célula hospedadora
apropiada de la elección (por ejemplo, una célula bacteriana, una
célula de mamífero, una célula de levadura, o una célula de insecto)
para expresar una proteína fluorescente. El promotor puede obtenerse
de genes que codifican proteínas homólogas o heterólogas en la
célula hospedadora.
Los ejemplos de promotores apropiados para
dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica la
proteína fluorescente de la invención en células de mamífero son el
promotor de CMV (documentos US 5168062, US5385839), el promotor de
la Ubiquitina C (Wulff, M. et al., FEBS Lett. (1990),
216, 101-105), el promotor de SV40 (Subramani
et al., Mol. Cell. Biol. (1981), 1,
854-864) y el promotor de MT-1 (gen
de la metalotioneína) (Palmiter et al., Science (1983),
222, 809-814). Un ejemplo de un promotor
apropiado para usar en células de insecto es el promotor de la
poliedrina (documento US 4745051; Vasuvedan et al., FEBS
Lett., (1992) 311, 7-11). Los ejemplos de
promotores apropiados para usar en células hospedadoras de levadura
incluyen promotores de genes glicolíticos de levaduras (Hitzeman
et al., J. Biol. Chem., (1980), 255,
12073-12080; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen.,
(1982), 1, 419-434) o genes de la alcohol
deshidrogenasa (Young et al., en Genetic Engineering of
Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al., eds.),
Plenum Press, Nueva York, 1982), o los promotores de TPI1 (documento
US 4599311) o ADH2-4c (Russell et al., Nature
(1983), 304, 652-654).
Los ejemplos de promotores apropiados para usar
en células hospedadores bacterianas incluyen el promotor del gen de
la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus, el gen
de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis,
el gen de la amilasa BAN de Bacillus amyloliquefaciens, el
gen de la proteasa alcalina de Bacillus subtilis, o el gen de
la xilosidasa de Bacillus pumilus, o los promotores PR o PL
del fago Lambda o los promotores lac, trp o tac
de Escherichia coli.
La secuencia de ADN que codifica las nuevas
proteínas fluorescentes de la invención puede también, si es
necesario, conectarse de manera operativa a un terminador apropiado,
tal como el terminador de la hormona de crecimiento humana (Palmiter
et al., op. cit.) o (para hospedadores fúngicos) los
terminadores de TPI1 (Alber y Kawasaki, op. cit.) o de ADH3
(McKnight, et al., op.cit). El vector puede comprender
adicionalmente elementos tales como señales de poliadenilación (por
ejemplo, de SV40 o la región Elb de adenovirus 5), secuencias
potenciadoras de la transcripción (por ejemplo, el potenciador de
SV40) y secuencias potenciadoras de la traducción (por ejemplo, las
que codifican los ARN de adenovirus VA).
El vector puede comprender adicionalmente una
secuencia de ADN que permite la entrada al interior del ribosoma y
la expresión de dos proteínas a partir de una molécula de ARNm
bicistrónica transcrita. Por ejemplo, la secuencia de entrada al
interior del ribosoma del virus de la encefalomiocarditis (Rees S
et al. BioTechniques (1996), 20,
102-110 y el documento US 4937190).
El vector recombinante puede comprender
adicionalmente una secuencia de ADN que permite al vector replicarse
en la célula hospedadora en cuestión. Un ejemplo de dicha secuencia
(cuando la célula hospedadora es una célula de mamífero) es el
origen de replicación de SV40.
Cuando la célula hospedadora es una célula de
levadura, los ejemplos de secuencias apropiadas que permiten al
vector replicarse, son los genes de replicación REP
1-3 del plásmido 2 \mu de levadura y el origen de
replicación.
El vector también puede comprender marcadores de
selección, tales como un gen que confiere resistencia a un fármaco,
por ejemplo, ampicilina, kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol,
puromicina, neomicina o higromicina.
Los procedimientos usados para unir las
secuencias de ADN que codifican la proteína fluorescente de la
invención, el promotor y opcionalmente el terminador y/o secuencia
de dirección, respectivamente, y para insertarlos en vectores
apropiados que contienen la información necesaria para la
replicación, son bien conocidos por los especialistas en la técnica
(por ejemplo, Sambrook, et al., op. cit).
En un quinto aspecto de la invención, se
proporciona una célula hospedadora transformada o transfectada con
una construcción de ADN que comprende un vector de expresión de
acuerdo con la presente invención.
La construcción de ADN o el vector recombinante
de la invención se introduce apropiadamente en una célula
hospedadora que puede ser cualquier célula que es capaz de expresar
la construcción de ADN e incluye bacterias, levaduras y células
eucarióticas superiores (Unger, T.F., The Scientist (1997),
11(17), 20-23; Smith, C., The Scientist
(1998), 12(22): 20; Smith, C., The Scientist (1998),
12(3), 18; Fernandez, J.M. & Hoeffier, J.P., Gene
Expression Systems- using nature for the art of expression, Academic
Press 1999).
Los ejemplos de células hospedadoras bacterianas
que, en cultivo, son capaces de expresar la construcción de ADN de
la invención, son bacterias Gram-positivas, por
ejemplo, especies de Bacillus o bacterias
Gram-negativas tales como E. coli. La
transformación de las bacterias puede hacerse usando células
competentes en un modo conocido per se (consúltese Sambrook
et al., supra).
Los ejemplos de líneas celulares de mamífero
apropiadas son las líneas celulares HEK293 y HeLa, células
primarias, y las líneas celulares COS (por ejemplo, ATCC CRL 1650),
BHK (por ejemplo, ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (por ejemplo,
ATCC CCL39) o CHO (por ejemplo, ATCC CCL 61). Los métodos para
transfectar células de mamífero y expresar secuencias de ADN
introducidas en las células se describen en, por ejemplo, Kaufman y
Sharp, J. Mol. Biol., (1982), 159, 601-621;
Southern y Berg, J. Mol. Appl. Genet., (1982), 1,
327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. Estados Unidos, (1982), 79, 422-426;
Wigler et al., Cell (1978), 14, 725; Corsaro y
Pearson, Somatic Cell Genetics, (1981), 7, 603, Graham y van
der Eb, Virology (1973), 52, 456; y Neumann et al.,
EMBO J., (1982), 1, 841-845.
Los ejemplos de células de levadura apropiadas
incluyen células de Saccharomyces spp. o
Schizosaccharomyces spp., en particular cepas de
Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces kluyveri. Los
métodos para transformar células de levadura con ADN heterólogo y
producir polipéptidos heterológos del mismo se describen, por
ejemplo, en los documentos US 4599311, US 4931373, US 4870008, US
5037743, y US 4845075, todos los cuales se incorporan por la
presente como referencia. Las células transformadas se seleccionan
por un fenotipo determinado por un marcador de selección,
habitualmente resistencia a fármaco o la capacidad de crecer en
ausencia de un nutriente particular, por ejemplo, leucina. Un vector
preferido para el uso en levaduras es el vector POT1 descrito en el
documento US 4931373. La secuencia de ADN que codifica la proteína
fluorescente de la invención puede estar precedida por una secuencia
señal y opcionalmente una secuencia líder, por ejemplo, como se
describió anteriormente. Ejemplos adicionales de células de levadura
apropiadas son cepas de Kluyveromyces, tal como K. lactis,
Hansenula, por ejemplo, H. polymorpha, o Pichia,
por ejemplo P. pastoris (consúltese Gleeson et al., J.
Gen. Microbiol., (1986), 132, 3459-3465,
documento US 4882279).
La transformación de células de insecto y la
producción de polipéptidos heterólogos en las mismas puede
realizarse como se describe en los documentos US 4745051; US
4879236; US 5155037; US 5162222; EP 397485, todos los cuales se
incorporan en este documento como referencia. La línea celular de
insecto usada como hospedador puede ser apropiadamente una línea
celular de Lepidoptera tal como células de Spodoptera
frugiperda o células de Trichoplusia ni (consúltese el
documento US 5077214). Las condiciones de cultivo pueden ser
apropiadamente como las descritas en, por ejemplo, los documentos WO
89/01029 o WO 98/01028, o cualquiera de las referencias mencionadas
anteriormente.
En un sexto aspecto, la invención proporciona un
método para preparar una Proteína Fluorescente Verde (GFP) o un
análogo funcional de GFP de acuerdo con la presente invención,
comprendiendo el método cultivar una célula hospedadora transformada
o transfectada con una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la
invención, y obtener de la misma el polipéptido expresado por dicha
secuencia de nucleótidos.
Apropiadamente, las células hospedadoras
transformadas o transfectadas como se describió anteriormente se
cultivan en un medio nutritivo apropiado en condiciones que permiten
la expresión de una construcción de ADN de acuerdo con la invención,
después de esto las células pueden usarse en el método de
exploración de la invención. Como alternativa, las células pueden
alterarse, después de lo cual los extractos celulares y/o
sobrenadantes pueden analizarse por fluorescencia y/o usarse para
purificar la GFP o el análogo funcional de GFP de la invención.
El medio usado para cultivar las células puede
ser cualquier medio convencional apropiado para el crecimiento de
células hospedadoras, tales como los medios mínimos o complejos que
contienen suplementos apropiados. Los medios apropiados están
disponibles por proveedores comerciales o pueden prepararse de
acuerdo con los protocolos publicados (por ejemplo, en catálogos de
la American Type Culture Colection; Sambrook et al.,
supra).
Por ejemplo, puede construirse una proteína de
fusión que comprende glutatión S-transferasa (GST) y
GFP y expresarse en E. coli. La GFP puede unirse en la pauta
de lectura con el C-terminal de GST en un vector
plasmídico pGEX (Amersham Pharmacia Biotech). La producción
recombinante de la proteína de fusión se realiza utilizando un
hospedador de expresión de E. coli convencional, seguido por
purificación empleando cromatografía de afinidad por glutatión y
retirada de la señal de GST por escisión proteolítica.
En un séptimo aspecto de la presente invención,
se proporciona un método para medir la expresión de una proteína de
interés en una célula. El método comprende: i) introducir en una
célula una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína fluorescente que se obtiene de
la Proteína Fluorescente Verde (GFP) o cualquier análogo funcional
de GFP de acuerdo con la presente invención, estando dicha molécula
de ácido nucleico unida de manera operativa a y bajo el control de
una secuencia de control de expresión que modera la expresión de
dicha proteína de interés; ii) cultivar la célula en condiciones
apropiadas para la expresión de la proteína de interés; y iii)
detectar la emisión de fluorescencia de la Proteína Fluorescente
Verde (GFP) o un análogo funcional de GFP como un medio para medir
la expresión de la proteína de interés.
En un octavo aspecto de la invención, se
proporciona un método para determinar la localización celular y/o
extracelular de una proteína de interés, comprendiendo el
método:
i) introducir en una célula una molécula de ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una
Proteína Fluorescente Verde (GFP) o un análogo funcional de GFP de
acuerdo con la invención fusionada a una secuencia de nucleótidos
que codifica una proteína de interés, estando dicha molécula de
ácido nucleico unida de manera operativa a y bajo el control de un
secuencia de control de expresión apropiada;
ii) cultivar dicha célula en condiciones
apropiadas para la expresión de dicha proteína de interés; y
iii) determinar la localización celular y/o
extracelular de dicha proteína de interés por detección de la
emisión de fluorescencia por un medio óptico.
Las proteínas fluorescentes de la presente
invención pueden también usarse en un método para detectar y
comparar el efecto de una sustancia de ensayo en la regulación de la
expresión y/o desplazamiento de dos o más proteínas diferentes en
una célula. Como alternativa, pueden usarse en un método para
comparar la expresión de una proteína de interés y la actividad
simultánea de una secuencia de control de expresión en respuesta a
una sustancia de ensayo. Las proteínas fluorescentes también pueden
usarse en un método para comparar la actividad de dos o más
secuencias de control de expresión en una célula en respuesta a una
sustancia de ensayo. Dichos métodos pueden realizarse en presencia y
en ausencia de una sustancia de ensayo cuyo efecto en el proceso es
para medirlo. Por ejemplo, puede usarse una molécula informadora
detectable como una referencia interna y otra como un marcador
variable, ya que la expresión regulada de un gen puede controlarse
cuantitativamente por fusión de una secuencia de control de
expresión a una construcción de ADN que codifica, por ejemplo,
F64L-S175G-E222G-GFP,
midiendo la fluorescencia, y normalizándola a la fluorescencia de
una molécula fluorescente diferente en el espectro expresada
constitutivamente. La molécula fluorescente distinta en el espectro
expresada constitutivamente, por ejemplo BFP, actúa como una
referencia interna.
De este modo, en un noveno aspecto de la
invención, se proporciona un método para comparar el efecto de una o
más sustancias de ensayo en la expresión y/o localización de una o
más proteínas diferentes de interés en una célula, comprendiendo el
método:
i) introducir en una célula:
- a)
- una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una Proteína Fluorescente Verde (GFP) o un análogo funcional de GFP de acuerdo con la invención fusionada opcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de interés, estando dicha molécula de ácido nucleico unida de manera operativa a y bajo el control de una primera secuencia de control de expresión; y opcionalmente,
- b)
- al menos una molécula de ácido nucleico diferente que codifica una molécula informadora de proteína fusionada opcionalmente a una proteína de interés diferente, estando cada molécula de ácido nucleico unida de manera operativa a y bajo el control de una segunda secuencia de control de expresión, donde dicha molécula informadora de proteína tiene o es capaz de generar una señal de emisión que es distinta en el espectro de dicha Proteína Fluorescente Verde (GFP) o un análogo funcional de GFP;
ii) cultivar dichas células en condiciones
apropiadas para la expresión de dicha proteína o proteínas de
interés en presencia y ausencia de dicha sustancia o sustancias de
ensayo;
iii) determinar la expresión y/o localización de
dicha proteína o proteínas de interés en dichas células detectando
la emisión de fluorescencia por un medio óptico; y
iv) comparar la emisión de fluorescencia obtenida
en presencia y ausencia de dicha sustancia o sustancias de ensayo
para determinar el efecto de dicha sustancia o sustancias de ensayo
en la expresión y/o localización de dicha proteína o proteínas de
interés.
\newpage
En una realización preferida del noveno aspecto,
las muestras de dichas células en un medio fluido se introducen en
recipientes por separado para cada una de dichas sustancias de
ensayo a estudiar.
Preferiblemente, la primera y segunda secuencias
de control de expresión son diferentes.
Apropiadamente, la molécula informadora de
proteína puede seleccionarse entre el grupo compuesto por proteínas
y enzimas fluorescentes. Las proteínas fluorescentes preferidas son
las que tienen una longitud de onda de emisión distinguible en el
espectro comparada con la longitud de onda de emisión de las
proteínas fluorescentes de acuerdo con la presente invención, por
ejemplo, BFP. Los informadores de enzima apropiados son los que son
apropiados para generar una señal detectable (por ejemplo, una
luminiscente o fluorescente) en un sustrato. Las enzimas/sustratos
incluyen: luciferasa/luciferina;
\beta-galactosidasa/DDAO galactósido;
\beta-galactosidasa/fluoresceína
di-\beta-D-galactopiranósido;
fosfatasa alcalina/Attophos.
En los métodos de la invención, la fluorescencia
de células transformadas o transfectadas con la construcción de ADN
de acuerdo con la invención pueden medirse apropiadamente por un
medio óptico en por ejemplo, un espectrofotómetro, un fluorímetro,
un microscopio de fluorescencia, una cámara de dispositivo acoplado
por carga (CCD) refrigerada (tal como una cámara de exploración o
una cámara de superficie), un clasificador de células activadas por
fluorescencia, un microscopio confocal o un dispositivo confocal de
exploración, donde pueden determinarse las propiedades espectrales
de las células en cultivo como exploraciones de excitación y emisión
de luz.
Las proteínas fluorescentes de la presente
invención tienen muchas aplicaciones adicionales, por ejemplo:
i) Uso como un marcador no tóxico para la
selección de células transfectadas que contienen un vector de
expresión que codifica al menos la proteína fluorescente de la
invención. La emisión fluorescente puede usarse para aislar células
transfectadas superando de este modo la necesidad de selección con
moléculas tóxicas tales como antibióticos.
ii) Uso como un marcador de proteína en células
vivas y fijadas. Las nuevas proteínas muestran fuerte fluorescencia
y tienen un marcaje apropiado para proteínas presentes a bajas
concentraciones. Ya que no se necesita sustrato y la visualización
de la proteína fluorescente no daña las células, se puede realizar
un análisis dinámico.
iii) Uso como un marcador en fusión de células u
orgánulos. Marcando una o más células u orgánulos con las nuevas
proteínas, por ejemplo,
F64L-S175G-E222G-GFP,
y otras células u orgánulos con el mismo o distinto flúor, pueden
controlarse fusiones tales como la formación del heterocarion.
iv) Puede visualizarse el desplazamiento de
proteínas fusionadas a nuevas proteínas de la invención. El
desplazamiento de proteínas intracelulares a un orgánulo específico
se puede visualizar fusionando la proteína de interés a una proteína
fluorescente, por ejemplo,
F64L-S175G-E222-GFP,
y marcando el orgánulo con otra molécula fluorescente, por ejemplo,
una proteína fluorescente. El desplazamiento se puede detectar
después como un cambio de espectro fluorescente en las proteínas en
el orgánulo específico.
v) Uso como un marcador de secreción. Por fusión
de una proteína fluorescente de la invención a un péptido señal o a
un péptido a ser secretado, puede seguirse la secreción en células
vivas.
vi) Uso como un informador genético o señal de
proteína en animales transgénicos. Debido a la fuerte fluorescencia
de las nuevas proteínas, son apropiadas como señales para la
expresión de proteínas y genes, ya que la señal está mejorada de
manera significativa a la proporción de ruido sobre las proteínas de
la técnica anterior, tales como GFP de tipo silvestre.
vii) Uso como un marcador de integridad de célula
u orgánulo. Expresando las proteínas nuevas dirigidas a un orgánulo,
es posible calcular el escape de la proteína y usar eso como una
medida de la integridad celular.
viii) Uso como un marcador de transfección, y
como un marcador a usar en combinación con clasificación FACS (por
ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3). Debido a la luminosidad
aumentada de las nuevas proteínas, la calidad de detección y
clasificación celular puede mejorarse de manera significativa.
ix) Uso como sonda a tiempo real trabajando a
concentraciones cercanas a las fisiológicas. Ya que las nuevas
proteínas de la presente invención son más luminosas de manera
significativa que wtGFP cuando se expresan en células
aproximadamente 37ºC, y se excitan con luz a aproximadamente 490 nm,
puede disminuirse la concentración necesaria para la visualización.
Por lo tanto puede haber sitios diana para enzimas manipulados en
las nuevas proteínas, por ejemplo
F64L-S175G-E222G-GFP,
en la célula a bajas concentraciones en células vivas. Es importante
por dos razones: i) la sonda debe interferir lo menos posible con el
proceso intracelular que se está estudiando; y ii) los sistemas de
traducción y transcripción deben estresarse lo mínimo.
x) Puede realizarse mutagénesis de vector de
transposón usando las nuevas proteínas como marcadores en fusiones
de transcripción y traducción. Los transposones pueden usarse en
microorganismos que codifican las nuevas proteínas. Los transposones
pueden construirse para fusión de la traducción y la transcripción a
usar para explorar promotores. Los vectores de transposón que
codifican las nuevas proteínas, por ejemplo
F64L-S175G-E222G-GFP,
pueden usarse para marcar plásmidos y cromosomas.
xi) Uso como un informador para la detección de
bacterias introduciendo las nuevas proteínas en el genoma de
bacteriófagos. Manipulando las nuevas proteínas, por ejemplo
F64L-S175G-E222G-GFP,
en el genoma de un fago, puede diseñarse una herramienta de
diagnóstico.
F64L-S175G-E222G-GFP
puede expresarse sólo sobre la transfección del genoma en un
hospedador vivo. El hospedador se define específicamente por el
bacteriófago.
La invención ilustra adicionalmente como
referencia los siguientes ejemplos y figuras en los que:
La Figura 1 es la secuencia de nucleótidos de
wtGFP (Chalfie et al., Science, (1994), 263,
802-5) y se menciona en este documento como SEC ID
Nº: 1.
La Figura 2 es la secuencia de aminoácidos
correspondiente a wtGFP (Chalfie et al, Science, (1994), 263,
802-5) y se menciona en este documento como SEC ID
Nº: 2.
La Figura 3 es la secuencia de aminoácidos
predicha de
F64L-S175G-E222G-GFP
y se menciona en este documento como SEC ID Nº: 3
La Figura 4 es la secuencia de aminoácidos
predicha de
F64L-S65T-S175G-GFP
y se menciona en este documento como SEC ID Nº: 4.
La Figura 5 es una representación que muestra la
media de intensidades de fluorescencia de mutantes de GFP de acuerdo
con la invención.
La Figura 6 es una representación que muestra la
fotodegradación relativa de mutantes de GFP de acuerdo con la
invención.
La Figura 7 es una representación que demuestra
el aumento de la proporción de intensidad de fluorescencia del
núcleo al citoplasma en el desplazamiento de P65-GFP
desde el citoplasma al núcleo de células CHO-hir
después de la adición del agonista.
El gen de GFP usado en el presente estudio estaba
contenido en el plásmido pGFP (Chalfie et al., Science,
(1994), 263, 802-805; Número de Acceso a
GenBank U17997) obtenido por Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto,
Ca, Estados Unidos). El gen se amplifico por PCR usando la
polimerasa Pfu (Promega, Madison, WI, Estados Unidos) de acuerdo con
protocolos reconocidos (Saiki et al., Science, (1988),
239, 487-491). Las secuencias de los
cebadores usados eran:
| GFP-1 | 5'-ggtacgggccgccaccatgagtaaaggagaagaacttttcac | SEC ID Nº: 5 | |
| GFP-2 | 5'-ggtacgggttaaccggttttgtatagttcatccatg | SEC ID Nº: 6 | |
| GFP-3 | 5'-ggtacgggccgccaccatgggatccaaaggagaagaacttttcac | SEC ID Nº: 7 |
El cebador GFP-1 muestra
homología con la región 5' del gen de GFP y contiene un sitio Kozak
parcial (Kozak, M, Cell, (1986), 44, 283) antes del codón de
inicio para la iniciación eficaz de la traducción en sistemas de
mamífero. El cebador GFP-2 muestra homología con la
región 3' del gen de GFP y contiene un sitio adicional de enzima de
restricción AgeI inmediatamente antes del codón de parada
para facilitar la clonación de proteínas por fusión al
C-terminal de GFP. El cebador GFP-3
es similar al cebador GFP-1 que muestra homología
con la región 5' del gen de GFP, pero contiene un sitio de
restricción adicional (BamHI) inmediatamente después del
codón de iniciación para facilitar la clonación de proteínas por
fusión al N-terminal de GFP. Los productos
amplificados resultantes de las reacciones de PCR que contenían los
cebadores GFP-1 y GFP-2, y
GFP-3 y GFP-2 se prolongaron con una
3'-desoxiadenosina única usando la polimerasa Taq
(Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK) y se ligaron al vector
pTARGET (Promega) de clonación TA de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. La orientación correcta en relación con el promotor
de CMV y la secuencia del inserto se determinó por secuenciación de
ADN automática.
Los siguientes mutantes de GFP se generaron en el
presente estudio: F64L-GFP,
V163A-GFP, S175G-GFP,
E222G-GFP,
F64L-E222G-GFP,
F64L-V163A-GFP,
F64L-S175G-GFP,
V163A-S175G-GFP,
V163A-E222G-GFP,
S175G-E222G-GFP,
F64L-S175G-E222G-GFP,
V163A-S175G-E222G-GFP,
F64L-V163A-E222G-GFP,
F64L-S65T-
S175G-GFP, F64L-S65T-V163A-GFP. Los mutantes de la construcción del gen GFP (SEC ID Nº: 3) en pTARGET (Véase el Ejemplo 1) se generaron usando el kit de mutagénesis dirigido de sitio QuikChange^{TM} (Stratagene, La Jolla, Ca, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de los cebadores usados para generar los mutantes únicos F64L, S65T, V163A, S175G y E222G se han documentado en la Tabla 1. Las moléculas de GFP mutadas en múltiples sitios se generaron a través de reacciones de mutagénesis sucesivas. Todas las secuencias de los mutantes de GFP se verificaron por secuenciación automática.
S175G-GFP, F64L-S65T-V163A-GFP. Los mutantes de la construcción del gen GFP (SEC ID Nº: 3) en pTARGET (Véase el Ejemplo 1) se generaron usando el kit de mutagénesis dirigido de sitio QuikChange^{TM} (Stratagene, La Jolla, Ca, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de los cebadores usados para generar los mutantes únicos F64L, S65T, V163A, S175G y E222G se han documentado en la Tabla 1. Las moléculas de GFP mutadas en múltiples sitios se generaron a través de reacciones de mutagénesis sucesivas. Todas las secuencias de los mutantes de GFP se verificaron por secuenciación automática.
El plásmido de ADN a usar para la transfección se
preparó para todas las construcciones de GFP y EGFP usando el kit de
purificación de plásmido HiSpeed (Qiagen, Westberg, NL). Se diluyó
el ADN a 100 ng. \mul-1 en 18- en agua Megohm
(Sigma) y se usó 1 \mug para las transfecciones. Para una
confluencia del 50-80% en el día de la transfección,
se plaquearon células HeLa a una densidad de 5 x 10^{4}/pocillo en
placas de 6 pocillos y se incubaron durante una noche. Se usó una
proporción 1:3 (1 \mug: 3 \mul) de ADN a reactivo FuGene6
(Roche) para cada reacción de transfección transitoria; se añadió 3
\mul de FuGene6 a 87 \mul de medio DMEM libre de suero (Sigma)
(que contenía penicilina/estreptomicina, L-glutamina
(GibcoBRL) y se golpeó suavemente para mezclar, después se añadió 10
\mul (1 \mug) de la construcción de ADN y se mezcló suavemente
otra vez. El complejo FuGene6:ADN se incubó a temperatura ambiente
durante 40 minutos, después se añadió gota a gota directamente a las
células sin cambiar el medio, y se agitaron las placas para una
distribución uniforme.
Las mediciones de fluorescencia se hicieron 24 o
48 horas después de la transfección. Brevemente, las células se
lavaron en solución salina tamponada con fosfato, se liberaron con
la adición de 2 gotas de Trypsin (GibcoBRL) y se resuspendieron en 1
ml de medio DMEM completo (que contenía penicilina/estreptomicina,
L-glutamina y suero bovino fetal (Sigma)). Las
células se agitaron y analizaron en un citómetro de flujo FACS
Calibur (Becton Dickinson & Co., NJ, Estados Unidos) para la
caracterización de la fluorescencia celular total, con excitación a
488 nm y se vio la emisión con un lote de filtros de fluorescencia
530/30 nm (intervalo de 515-545 nm). Se recogieron
10.000 acontecimientos para cada transfección y se realizaron
6-10 replicados para cada construcción. La media de
intensidades fluorescentes del análisis FACS se obtuvo como un medio
geométrico (medio fluorescente en escala log) y se muestra en la
Figura 5.
El gen del mutante
F64L-S157G-E222G-GFP
(Ejemplo 2) se escindió de pTARGET con BamHI y SalI y
se subclonó en el vector pGEX-6P1 de fusión de GST
inducible por IPTG (Amersham Pharmacia Biotech). Se hicieron crecer
células JM109 de E. coli (Promega) que contenían un vector de
expresión con el gen de fusión GST-GFP a 30ºC a una
OD_{600} = 0,6 en caldo YT 2x que contenía 100 \mug/ml de
ampicilina. Se indujo la expresión de la proteína con IPTG (0,1 mM)
y se continuó la incubación durante 16 horas. Las células se
sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en PBS y se
lisaron por sonicación (cuatro ráfagas de 10 segundos a 20 \mum
con enfriamiento intermitente en hielo). Se retiraron los restos
celulares por centrifugación y se purificó el lisado que contenía la
proteína de fusión soluble GST-GFP usando columnas
de glutatión sepharose (Amersham Pharmacia Biotech). Después la
proteína se intercambió y se eluyó en PBS usando una columna PD10
(Amersham Pharmacia Biotech). Se confirmó la presencia de una banda
única de peso molecular correcto en la preparación de la proteína
por PAGE en SDS usando electroforesis en gel de
Bis-Tris NuPAGE al 4-12%
(Invitrogen). Para evaluar la concentración y pureza de la proteína,
la preparación de proteína se sometió, en duplicado, a hidrólisis
ácida y filtración antes del análisis de aminoácidos por
cromatografía de intercambio iónico usando un analizador Pharmacia
alpha plus series II.
El coeficiente de extinción (Tabla 2) se
determinó en un espectrómetro UV/vis (Unicam). El rendimiento
cuántico (QY) (Tabla 2) se determinó de acuerdo con el método
documentado por Patterson et al (Biophysical Journal, (1997),
73, 2782-2790). Se prepararon muestras de
densidad óptica iguales a máximos de absorbancia respectivos, se
diluyeron en Tris.HCl pH 8 a 10 mM para la preparación de GFP
purificada y un patrón de referencia de fluoresceína (Molecular
Probes). La emisión de fluorescencia se midió en la región
490-600 nm usando un espectrómetro de luminiscencia
LS50B (Perkin Elmer) y los resultados para la preparación de GFP se
compararon directamente con los del patrón de fluoresceína (QY =
0,85).
| Proteína | Pico de absorbancia | Coeficiente de extinción | Pico de emisión | QY |
| (nm) | (M^{-1} cm^{-1}) | (nm) | ||
| F64L-S175G-E333G-GFP | 481 | 46213* | 506 | 0,6* |
| * Media de dos mediciones |
Para evaluar el grado de fotodegradación de los
mutantes
F64L-S175G-E222G-GFP
y F64L-E222G en relación con wtGFP, se transfectaron
50 ng de ADN en células HeLa de acuerdo con el método descrito en el
Ejemplo 3. Para una confluencia del 50-80% en el día
de la transfección, se plaquearon células HeLa a un densidad de 5 x
10^{3}/pocillo en un ViewPlate^{TM}-96 (Packard,
Meriden, CT, Estados Unidos). Veinticuatro horas después de la
transfección, se hicieron imágenes de las células en un Sistema de
Análisis Celular LEADseeker^{TM} (Amersham Pharmacia Biotech) y se
aclararon a una potencia alta de láser (19,94 mW) con un láser de
Argon a 488 nm (filtro de emisión 535-45 nm). Se
tomaron treinta y dos imágenes individuales sobre 260 con
iluminación no continua y todas las proteínas fluorescentes
mostradas marcaron fotodegradación como se muestra en la Figura
6.
NF\kappaB es un activador de la transcripción y
un componente de vías de señalización que son responsables de una
diversidad de inductores incluyendo citoquinas, linfoquinas, y
algunos agentes inmunosupresores.
El gen de la subunidad P65 de NF\kappaB humana
(Número de Acceso a GenBank: M62399) se amplifico usando PCR de
acuerdo con los protocolos reconocidos (Saiki et al.,
Science, (1988), 239, 487-491). Las
secuencias de los cebadores usados eran:
| NF\kappaB-1 | 5'-ttttactcgagatggacgaactgttccccctca | SEC ID Nº: 18 | |
| NF\kappaB | 5'-ttttgaagcttggagctgatctgactcagcagg | SEC ID Nº: 19 |
La subunidad P65 se fusionó con el
N-terminal de GFP (SEC ID Nº: 3) en el vector pCORON
1000 (Amersham Pharmacia Biotech) bajo el control de un promotor de
CMV. Éste se transfectó en células CHO-hir usando el
reactivo FuGene6 (Roche) y procedimientos de transfección
convencionales, y se produjo una línea celular estable que contenía
la construcción P65-GFP.
Las células CHO-hir,
P65-GFP se sembraron en placas de microtitulación de
96 pocillos a una confluencia de 5 x 10^{3} células/pocillo en
medio DMEM (Sigma) que contenía penicilina/estreptomicina,
L-glutamina (GibcoBRL) y se incubaron durante una
noche a 37ºC. Una hora antes de ejecutar el ensayo, se retiró el
medio y se reemplazo por 100 \mul de DMEM libre de suero/pocillo.
Se añadieron 100 \mul de DRAQ5 5 \muM (Biostatus) en tampón
Krebs a cada pocillo y se incubaron durante 15 minutos a 37ºC.
Después se colocó la placa en la cámara (Sistema de Análisis Celular
LEADseeker) y se hicieron imágenes de los pocillos a tiempos
puntuales variados después de la adición del agonista (50 \mul de
IL 1\beta 40 ng/ml). Se observó el desplazamiento de
P65-GFP del citoplasma al núcleo después de la
adición del agonista. Se muestra la proporción de fluorescencia
nuclear/citoplasmática en la Figura 7.
<110> Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteínas Fluorescentes
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Mutante de GFP
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB01/09858.1
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-01-23
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 717
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aequorea victoria
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Chalfie,
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Science
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 263
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 802-805
\vskip0.400000\baselineskip
<307> 1994
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aequorea victoria
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Chalfie,
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Science
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 263
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 802-805
\vskip0.400000\baselineskip
<307> 1994
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
proteína artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
proteína sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtacgggcc gccaccatga gtaaaggaga agaacttttc ac
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtacgggtt aaccggtttt gtatagttca tccatg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtacgggcc gccaccatgg gatccaaagg agaagaactt ttcac
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaacacttg tcactactct ctcttatggt gttcaat
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgaacacc ataagagaga gtagtgacaa gtgttgg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaacacttg tcactactct cacctatggt gttcaatgct tttca
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Chalfie,
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Science
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 263
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 802-805
\vskip0.400000\baselineskip
<307> 1994
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaaaagcat tgaacaccat aggtgagagt agtgacaagt gttgg
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400>12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacaaacaaa agaatggaat caaagccaac ttcaaaatta gacac
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400>13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgtctaatt ttgaagttgg ctttgattcc attcttttgt ttgtc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400>14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacattgaa gatggaggcg ttcaactagc agacc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400>15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtctgctag ttgaacgcct ccatcttcaa tgttg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400>16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacatggtc cttcttggct ttgtaacagc tgctgg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400>17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagcagctg ttacaaagcc aagaaggacc atgtgg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400>18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttactcga gatggacgaa ctgttccccc tca
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400>19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttgaagct tggagctgat ctgactcagc agg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Una proteína fluorescente que se obtiene de la
Proteína Fluorescente Verde (GFP) o cualquier análogo funcional de
GFP y que tiene una secuencia de aminoácidos que está modificada por
sustitución de aminoácidos en comparación con la secuencia de
aminoácidos de la Proteína Fluorescente Verde de tipo silvestre,
comprendiendo dicha proteína fluorescente modificada:
i) una sustitución de aminoácido en la posición
F64;
ii) una sustitución única de aminoácido en la
posición seleccionada entre el grupo compuesto por las posiciones
S65 y E222, donde el aminoácido en la posición 65 se ha sustituido
por una aminoácido seleccionado entre el grupo compuesto por G, A,
L, C, V, I y T; y
iii) una sustitución de aminoácido en la posición
S175;
donde dicha GFP modificada tiene un
espectro de excitación y/o especto de emisión diferentes en
comparación con GFP de tipo
silvestre.
2. Una proteína fluorescente de acuerdo con la
reivindicación 1, donde el aminoácido F en la posición 64 se ha
sustituido por un aminoácido seleccionado entre el grupo compuesto
por L, I, V, A y G.
3. Una proteína fluorescente de acuerdo con la
reivindicación 1, donde el aminoácido S en la posición 175 se ha
sustituido por una aminoácido seleccionado entre el grupo compuesto
por G, A, L, I y T.
4. Una proteína fluorescente de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 3, donde el aminoácido E en la posición 222 se
ha sustituido por una aminoácido seleccionado entre el grupo
compuesto por G, A, V, L, I, F, S, T, N y Q.
5. Una proteína fluorescente de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, seleccionada entre
F64L-S175G-E222G-GFP
y
F64L-S65T-S175G-GFP.
6. Una proteína fluorescente de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene una secuencia de
aminoácidos que está modificada por sustitución de aminoácidos en
comparación con la secuencia de aminoácidos de la Proteína
Fluorescente Verde de tipo silvestre que tiene la secuencia:
SEC.ID.Nº ID Nº: 2.
7. Una proteína fluorescente obtenida de la
proteína Fluorescente Verde (GFP) y que tiene una secuencia de
aminoácidos como la expuesta en SEC.ID.Nº ID Nº: 3.
8. Una proteína fluorescente obtenida de la
Proteína Fluorescente Verde (GFP) y que tiene una secuencia de
aminoácidos como la expuesta en SEC.ID.Nº ID Nº: 4.
9. Un compuesto de fusión que comprende una
proteína de interés fusionada a una proteína fluorescente, siendo
dicha proteína fluorescente una proteína modificada de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Una molécula de ácido nucleico que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína fluorescente
que se obtiene de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) o cualquier
análogo funcional de GFP y que tiene una secuencia de aminoácidos
que está modificada por sustitución de aminoácidos en comparación
con la secuencia de aminoácidos de la Proteína Fluorescente Verde de
tipo silvestre, comprendiendo dicha proteína fluorescente
modificada:
i) una sustitución de aminoácido en la posición
F64;
ii) una sustitución única de aminoácido en la
posición seleccionada entre el grupo compuesto por las posiciones
S65 y E222, donde el aminoácido S en la posición 65 se ha sustituido
por un aminoácido seleccionado entre el grupo compuesto por G, A, L,
C, V, I y T; y
iii) una sustitución de aminoácido en la posición
S175;
donde dicha GFP modificada tiene un
espectro de excitación y/o espectro de emisión diferentes en
comparación con GFP de tipo
silvestre.
11. Un ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 10, que codifica una proteína fluorescente que tiene
una secuencia de aminoácidos que está modificada por sustitución de
aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la
Proteína Fluorescente Verde de tipo silvestre que tiene la
secuencia: SEC.ID.Nº ID Nº: 2.
12. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con
las reivindicaciones 10 u 11, que codifica una proteína fluorescente
que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo
compuesto por SEC.ID.Nº ID Nº: 3 y SEC.ID.Nº ID Nº: 4.
13. Una molécula de ácido nucleico que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que
comprende una proteína de interés fusionada a una proteína
fluorescente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 8.
14. Un vector de expresión que comprende
secuencias de control de expresión apropiadas unidas de manera
operativa a un molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 10 a 13.
15. Una célula hospedadora transformada o
transfectada con una construcción de ADN que comprende un vector de
expresión de acuerdo con la reivindicación 14.
16. La célula hospedadora de acuerdo con la
reivindicación 15, donde dicha célula hospedadora se selecciona
entre el grupo compuesto por una célula de mamífero, una célula
bacteriana, una célula de levadura y una célula de insecto.
17. Un método para preparar una Proteína
Fluorescente Verde (GFP) o un análogo funcional de GFP de acuerdo
con la presente invención, comprendiendo dicho método cultivar un
hospedador de acuerdo con la reivindicación 15 o reivindicación 16 y
obtener del mismo el polipéptido expresado por dicha secuencia de
nucleótidos.
18. Un método para medir la expresión de una
proteína de interés en una célula, comprendiendo dicho método:
i) introducir en una célula una molécula de ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una
proteína fluorescente que se obtiene de la Proteína Fluorescente
Verde (GFP) o cualquier análogo funcional de GFP de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, estando dicha molécula de
ácido nucleico unida de manera operativa a y bajo el control de una
secuencia de control de expresión que modera la expresión de dicha
proteína de interés;
ii) cultivar dicha célula en condiciones
apropiadas para la expresión de dicha proteína de interés; y
iii) detectar la misión de fluorescencia de dicha
Proteína Fluorescente Verde (GSP) o un análogo funcional de GFP como
un medio para medir la expresión de dicha proteína de interés.
19. Un método para determinar la localización
celular y/o extracelular de una proteína de interés, comprendiendo
dicho método:
i) introducir en una célula una molécula de ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una
proteína fluorescente que se obtiene de la Proteína Fluorescente
Verde (GFP) o cualquier análogo funcional de GFP de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, fusionada a una secuencia
de nucleótidos que codifica una proteína de interés, estando dicha
molécula de ácido nucleico unida de manera operativa a y bajo el
control de una secuencia de control de expresión apropiada;
ii) cultivar dicha célula en condiciones
apropiadas para la expresión de dicha proteína de interés; y
iii) determinar la localización celular y/o
extracelular de dicha proteína de interés detectando la emisión de
fluorescencia por un medio óptico.
20. Un método para comparar el efecto de una o
más sustancias de ensayo en la expresión y/o localización de una o
más proteínas diferentes de interés en una célula, comprendiendo
dicho método:
i) introducir en una célula:
- a)
- una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una Proteína Fluorescente Verde (GFP) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o un análogo funcional de GFP de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, fusionada opcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de interés, estando dicha molécula de ácido nucleico unida de manera operativa a y bajo el control de una primera secuencia de control de expresión; y opcionalmente,
- b)
- al menos una molécula de ácido nucleico diferente que codifica una molécula informadora de proteína opcionalmente fusionada a una proteína de interés diferente, estando cada molécula de ácido nucleico unida de manera operativa a y bajo el control de una segunda secuencia de control de expresión, donde dicha molécula informadora de proteína tiene o es capaz de generar una señal de emisión que es distinta en el espectro de dicha Proteína Fluorescente Verde (GFP) o análogo funcional de GFP;
ii) cultivar dichas células en condiciones
apropiadas para la expresión de dicha proteína o proteínas de
interés en presencia y ausencia de dicha sustancia o sustancias de
ensayo;
iii) determinar la expresión y/o localización de
dicha proteína o proteínas de interés en dichas células, detectando
la emisión de fluorescencia por un medio óptico; y
\newpage
iv) comparar la emisión de fluorescencia obtenida
en presencia y ausencia de dicha sustancia o sustancias de ensayo
para determinar el efecto de dicha sustancia o sustancias de ensayo
en la expresión y/o localización de dicha proteína o proteínas de
interés.
21. El método de acuerdo con la reivindicación
20, donde las muestras de dichas células en un medio fluido se
introducen en recipientes por separado para cada una de dichas
sustancias de ensayo a estudiar.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0109858 | 2001-04-23 | ||
| GBGB0109858.1A GB0109858D0 (en) | 2001-04-23 | 2001-04-23 | Fluorscent proteins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2233690T3 true ES2233690T3 (es) | 2005-06-16 |
Family
ID=9913232
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01972260T Expired - Lifetime ES2233690T3 (es) | 2001-04-23 | 2001-09-28 | Mutantes de la proteina fluorescentes verde. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6919186B2 (es) |
| EP (1) | EP1381625B1 (es) |
| JP (1) | JP4060191B2 (es) |
| AT (1) | ATE283283T1 (es) |
| AU (1) | AU2001292040B2 (es) |
| CA (1) | CA2445035C (es) |
| DE (1) | DE60107471T2 (es) |
| ES (1) | ES2233690T3 (es) |
| GB (2) | GB0109858D0 (es) |
| IL (1) | IL158348A0 (es) |
| WO (1) | WO2002085936A1 (es) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998021355A1 (en) | 1996-11-15 | 1998-05-22 | Life Technologies, Inc. | Mutants of green fluorescent protein |
| IL153113A0 (en) | 2000-06-19 | 2003-06-24 | Bioimage As | Fluorescent proteins |
| JP3829252B2 (ja) | 2001-06-08 | 2006-10-04 | 独立行政法人理化学研究所 | 蛍光蛋白質 |
| AU2003208520B2 (en) * | 2002-01-22 | 2008-06-05 | Takara Bio Usa, Inc. | Fluorescent protein from aequorea coerulscens and uses therof |
| GB0329353D0 (en) * | 2003-12-19 | 2004-01-21 | Amersham Biosciences Uk Ltd | Cytochrome C protein and assay |
| GB0410105D0 (en) * | 2004-05-06 | 2004-06-09 | Amersham Biosciences Uk Ltd | Method for characterising compounds |
| SE525999C2 (sv) * | 2004-05-12 | 2005-06-14 | Trevor Fortes | Anordning för rundning av degstycken |
| ES2399563T3 (es) | 2005-11-04 | 2013-04-02 | Evrogen, Jsc | Proteínas verdes fluorescentes modificadas y método para la utilización de las mismas |
| US20080293086A1 (en) * | 2006-09-18 | 2008-11-27 | Cobalt Technologies, Inc. A Delaware Corporation | Real time monitoring of microbial enzymatic pathways |
| US8680235B2 (en) * | 2006-09-22 | 2014-03-25 | Stowers Institute For Medical Research | Branchiostoma derived fluorescent proteins |
| US20090081715A1 (en) * | 2007-09-07 | 2009-03-26 | Cobalt Technologies, Inc., A Delaware Corporation | Engineered Light-Emitting Reporter Genes |
| CN102057046A (zh) | 2008-04-09 | 2011-05-11 | 钴技术有限公司 | 固定的产物耐受的微生物 |
| US8497105B2 (en) | 2009-06-26 | 2013-07-30 | Cobalt Technologies, Inc. | Integrated system and process for bioproduct production |
| WO2015080178A1 (ja) * | 2013-11-28 | 2015-06-04 | 学校法人 京都産業大学 | 新規蛍光タンパク質 |
| EP3553080A1 (en) | 2018-04-12 | 2019-10-16 | ETH Zürich | Piezo1-based fluorescent reporter |
| KR20240033101A (ko) | 2019-05-02 | 2024-03-12 | 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 합성 단백질 안정성을 증가시키기 위한 시스템 및 방법 |
| CN117088989A (zh) * | 2023-10-20 | 2023-11-21 | 浙江迪福润丝生物科技有限公司 | 一种荧光报告蛋白 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5491084A (en) | 1993-09-10 | 1996-02-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Uses of green-fluorescent protein |
| US5625048A (en) * | 1994-11-10 | 1997-04-29 | The Regents Of The University Of California | Modified green fluorescent proteins |
| GB9504446D0 (en) | 1995-03-06 | 1995-04-26 | Medical Res Council | Improvements in or relating to gene expression |
| ATE184613T1 (de) | 1995-09-22 | 1999-10-15 | Novo Nordisk As | Varianten des grünen fluoreszenzproteins, gfp |
| US5804387A (en) | 1996-02-01 | 1998-09-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP) |
| US6027881A (en) * | 1996-05-08 | 2000-02-22 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Mutant Aequorea victoria fluorescent proteins having increased cellular fluorescence |
| US6124128A (en) | 1996-08-16 | 2000-09-26 | The Regents Of The University Of California | Long wavelength engineered fluorescent proteins |
| US6194548B1 (en) * | 1998-01-23 | 2001-02-27 | Takashi Osumi | Green fluorescent proteins and blue fluorescent proteins |
| US6150176A (en) * | 1998-06-09 | 2000-11-21 | The Regents Of The University Of California | Fluorescent protein sensors for measuring the pH of a biological sample |
| AU5429399A (en) | 1998-08-08 | 2000-02-28 | Imperial Cancer Research Technology Limited | Fluorescent assay for biological systems |
| IL153113A0 (en) | 2000-06-19 | 2003-06-24 | Bioimage As | Fluorescent proteins |
-
2001
- 2001-04-23 GB GBGB0109858.1A patent/GB0109858D0/en not_active Ceased
- 2001-09-28 WO PCT/GB2001/004363 patent/WO2002085936A1/en not_active Ceased
- 2001-09-28 IL IL15834801A patent/IL158348A0/xx unknown
- 2001-09-28 US US09/967,301 patent/US6919186B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-28 ES ES01972260T patent/ES2233690T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-28 CA CA2445035A patent/CA2445035C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-28 AU AU2001292040A patent/AU2001292040B2/en not_active Expired
- 2001-09-28 EP EP01972260A patent/EP1381625B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-28 JP JP2002583462A patent/JP4060191B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-28 AT AT01972260T patent/ATE283283T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-09-28 GB GB0123288A patent/GB2374868B/en not_active Revoked
- 2001-09-28 DE DE60107471T patent/DE60107471T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-01-14 US US10/757,624 patent/US7091317B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-10-14 US US11/251,209 patent/US7300762B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7300762B2 (en) | 2007-11-27 |
| US7091317B2 (en) | 2006-08-15 |
| GB2374868B (en) | 2003-07-09 |
| GB0109858D0 (en) | 2001-06-13 |
| EP1381625B1 (en) | 2004-11-24 |
| US20040138420A1 (en) | 2004-07-15 |
| US20060036078A1 (en) | 2006-02-16 |
| AU2001292040C1 (en) | 2002-11-05 |
| EP1381625A1 (en) | 2004-01-21 |
| ATE283283T1 (de) | 2004-12-15 |
| GB2374868A (en) | 2002-10-30 |
| GB0123288D0 (en) | 2001-11-21 |
| JP4060191B2 (ja) | 2008-03-12 |
| CA2445035A1 (en) | 2002-10-31 |
| AU2001292040B2 (en) | 2007-07-26 |
| US20030175859A1 (en) | 2003-09-18 |
| DE60107471D1 (de) | 2004-12-30 |
| IL158348A0 (en) | 2004-05-12 |
| CA2445035C (en) | 2010-04-06 |
| US6919186B2 (en) | 2005-07-19 |
| DE60107471T2 (de) | 2005-12-29 |
| JP2005502323A (ja) | 2005-01-27 |
| WO2002085936A1 (en) | 2002-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2233690T3 (es) | Mutantes de la proteina fluorescentes verde. | |
| CA2232727C (en) | Novel variants of green fluorescent protein, gfp | |
| US8138320B2 (en) | Fluorescent proteins and methods for using same | |
| AU2001292040A1 (en) | Mutants of green flourescent protein | |
| US20130344591A1 (en) | Modified Fluorescent Proteins and Methods for Using Same | |
| US7678893B2 (en) | Fluorescent proteins from Copepoda species and methods for using same | |
| EP1565559B1 (en) | Fluorescent proteins and chromoproteins from non-aequorea hydrozoa species and methods for using same | |
| CA2432782A1 (en) | Dimeric fluorescent polypeptides | |
| US7972834B2 (en) | Modified fluorescent proteins and methods for using same | |
| EP1430079A1 (en) | Fluorescent proteins | |
| US8563703B2 (en) | Fluorescent proteins and methods for using same | |
| AU2002326047A1 (en) | Fluorescent proteins |