ES2234220T3 - Intercambio de linfocitos t. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un procedimiento de intercambio de linfocitos T. Este procedimiento comprende por ejemplos la utilización de una población de linfocitos T, para la preparación de una composición destinada a administrarse a un sujeto que ha padecido una depleción de sus linfocitos T. La invención se refiere también a composiciones y a medios para la puesta en práctica de este procedimiento. La invención puede utilizarse para el tratamiento de numerosas patologías, en particular para el control de las inmunopatologías.
Description
Intercambio de linfocitos T.
La presente invención se refiere a los campos de
la inmunología y de la medicina. Se refiere más particularmente a
un nuevo enfoque inmunológico que permite el tratamiento de
numerosas patologías. La invención se refiere más particularmente a
un procedimiento "de intercambio de linfocitos T" con fines
terapéuticos, tras la supresión de los linfocitos T del hospedante.
La invención se puede aplicar al tratamiento de numerosas
patologías en las que están implicados los linfocitos T, tales como
las enfermedades autoinmunitarias, los injertos, las enfermedades
víricas, la alergia, etc.
Los linfocitos T son células esenciales para
desarrollar las respuestas inmunitarias eficaces que permiten
proteger al organismo especialmente contra los agentes infecciosos
o las células tumorales. Sin embargo, aunque la respuesta de los
linfocitos T es frecuentemente muy beneficiosa, en algunas
situaciones puede ser, por el contrario, una fuente de patologías
(enfermedades autoinmunitarias, rechazos de injertos, etc.). Por lo
tanto, en estas situaciones es particularmente importante poder
controlar la respuesta de los linfocitos T a fin de tratar la
inmunopatología.
Existen varios métodos terapéuticos utilizados
actualmente con el objetivo de controlar las respuestas
inmunitarias T cuando sea necesario. El tratamiento que sigue a un
injerto de órgano ofrece un buen ejemplo de la utilización de estos
diferentes tratamientos. Los injertos de órganos siempre van
seguidos de tratamientos con inmunosupresores denominados
convencionales, como, por ejemplo, el Endosan, los
corticosteroides, la ciclosporina o el FK506, destinados a proteger
al injerto de la respuesta inmunitaria del hospedante, que conduce
al rechazo. Aunque se comprueba que estos tratamientos son
relativamente eficaces, tal como lo atestiguan los progresos
realizados en los injertos de órganos, no siempre consiguen impedir
el rechazo de los injertos. Por otra parte, estos tratamientos
tienen otros dos inconvenientes: (i) sólo "congelan" la
respuesta inmunitaria, y por lo tanto se deben administrar de
manera permanente (la parada total de los tratamientos
inmunosupresores lleva generalmente al rechazo del órgano, incluso
después de varios años), y (ii) son totalmente no específicos, y
por lo tanto inhiben también las respuestas inmunitarias favorables
durante la duración de este tratamiento. De ello resulta un aumento
de la sensibilidad a las infecciones y a algunos cánceres. Esta
situación compromete el pronóstico vital de los pacientes.
Cuando sobrevienen rechazos no controlados por
estos tratamientos inmunosupresores, existen dos opciones
terapéuticas aparte del simple aumento de las dosis de los
medicamentos utilizados. Por ejemplo, la utilización de anticuerpos
que destruyen los linfocitos T: sueros policlonales o anticuerpos
monoclonales que reconocen moléculas de superficie expresadas en la
superficie de los linfocitos T (anti-CD3,
anti-CD4). Estos tratamientos actúan destruyendo
todos los linfocitos T, tanto los responsables del rechazo de
injerto como el conjunto de los demás linfocitos T, y presentan por
lo tanto igualmente un defecto de especificidad, induciendo un
estado de inmunodepresión importante en los sujetos.
Para algunas patologías de tipo
auto-inmunitarias, el injerto de médula ósea
("GMO") autóloga ha aparecido como un nuevo enfoque
terapéutico. El interés de estos tratamientos es hacer que el
injerto de médula ósea vaya precedido de un acondicionamiento, que
lleva a una destrucción de su sistema inmunitario, y después
injertar al enfermo sus propias células hematopoyéticas, con el
objetivo de una reconstitución por linfocitos T que no han tenido
ningún tratamiento previo. Sin embargo, como estos linfocitos son
autólogos, podrán estar nuevamente implicados en los procesos
inmunopatológicos que han llevado a realizar este tratamiento.
Además, la reconstitución de los linfocitos T a partir de las
células de la médula parece ser, en el adulto, un proceso muy
poco
eficaz.
eficaz.
Ahora se propone la GMO alogénica para algunas de
estas patologías, como las patologías
auto-inmunitarias graves, con el objetivo de
reconstituir al paciente con linfocitos diferentes que no deberían
participar en las reacciones inmunopatológicas. Sin embargo, el
injerto de médula ósea alogénica tiene una morbilidad importante,
debido a la GVH, lo que limita su utilización. En efecto, los
linfocitos T, presentes en el injerto hematopoyético y reinyectados
en un paciente inmunodeprimido, por el hecho del acondicionamiento
necesario para el injerto, serán responsables de un ataque dirigido
contra las células del hospedante denominado también reacción del
injerto contra el hospedante (GVH). A veces esta reacción es
difícil de controlar mediante los tratamientos inmunosupresores
clásicos, y a veces es incluso mortal.
Hoy en día no es legítimo proponer a un paciente
que presenta trastornos articulares crónicos, pero que pueden
evolucionar en varios años e incluso varias decenas de años, un
tratamiento que tiene una mortalidad mayor que 10%.
El control de las respuestas inmunitarias
patológicas descansa por lo tanto, hoy en día, esencialmente sobre
tratamientos inmunosupresores no específicos que sólo
"congelan" transitoriamente estas respuestas. A pesar del
interés de estos tratamientos, que han demostrado ampliamente su
eficacia en clínica, es importante desarrollar hoy en día otras
modalidades terapéuticas cuyo objetivo sería obtener una
inmunosupresión más específica y, eventualmente, permanente.
Algunos documentos describen la administración de
linfocitos T modificados para que tengan un gen suicida que
codifica la timidina quinasa del virus del herpes simple (documento
WO 97/45142; Contassot et al., 1998, Transplantation 65,
1365-70; Tiberghien, 1997, Hum. Gene Ther., 8,
615-624; Cohen et al., 1997, Blood, 89,
4636-4645; Tiberghien, 1997, Transfusion clinique et
biologique, 4, 275-80; Helene et al., 1997,
Journal of Immunology, 158, 5079-82; Bordignon
et al., 1995, Human Gene Therapy, 6,
813-9).
El documento WO 96/05287 describe un método de
selección de linfocitos T con una especificidad antigénica.
La presente invención representa un nuevo enfoque
terapéutico para la regulación de la respuesta inmunitaria. La
presente invención se refiere más particularmente a un nuevo
concepto de modulación de la respuesta inmunitaria de los
linfocitos T, especialmente de la respuesta linfocitaria T
inmunopatológica. La invención presenta numerosas ventajas con
relación a los enfoques descritos en la técnica anterior,
especialmente en términos de especificidad, de estabilidad
(duración) y de comodidad para los sujetos.
Un primer aspecto de la invención describe más
particularmente un método de modificación del sistema inmunitario de
un sujeto, que comprende la sustitución de los linfocitos T de este
sujeto. Más particularmente, este método comprende la supresión de
los linfocitos T (o de subpoblaciones de linfocitos) del sujeto
(sin supresión de las demás células hematopoyéticas, incluyendo las
células madre), seguido de la administración de una composición que
comprende linfocitos T modificados (o de subpoblaciones de
linfocitos T), autólogos, singénicos o alogénicos. Este método está
destinado más particularmente a controlar las respuestas
inmunopatológicas mediadas por los linfocitos T.
Otro aspecto particular de la invención describe
igualmente un método de regulación de las respuestas
inmunopatológicas inducidas por los linfocitos T, que comprende la
sustitución de todos o de parte de los linfocitos T de un sujeto
por una población de linfocitos T modificados.
La invención describe igualmente un método de
tratamiento de patologías provocadas por linfocitos T, que
comprende la sustitución de todos o de parte de los linfocitos T de
un sujeto por una composición que comprende linfocitos T
modificados.
La invención se refiere igualmente a la
utilización de una población de linfocitos T para la preparación de
una composición destinada al tratamiento de una inmunopatología
medida por los linfocitos T, en un sujeto que ha sufrido una
supresión específica de todos o de parte de sus linfocitos T sin
supresión de sus otras células hemopoyéticas, incluyendo las
células madre.
La invención se refiere igualmente a la
preparación de una composición de linfocitos T cuyo repertorio se
ha modificado (enriquecido en, o por lo contrario carente de,
algunas especificidades antigénicas).
La presente invención describe por lo tanto un
nuevo enfoque médico, basado en la sustitución de los linfocitos T
de un sujeto, denominado frecuentemente en lo siguiente por la
expresión "intercambio de linfocitos T".
La presente invención se basa, en parte, en un
nuevo concepto de la homeostasis de los linfocitos T.
Particularmente, la invención se basa en el concepto según la cual,
en el adulto, la homeostasis de los linfocitos T se produce
esencialmente a partir de movimientos de poblaciones de linfocitos T
maduros, y no, como se pensaba hasta hoy en día, a partir de la
diferenciación de células madre hematopoyéticas que se diferencian
en linfocitos T vía el timo.
La totalidad de los datos (i) sobre la
reconstitución de la inmunopoyesis T después del injerto de médula
ósea realizado a partir de células madre hematopoyéticas inmaduras
purificadas (carentes de linfocitos y/o purificadas sobre CD34),
(ii) sobre la inmunopoyesis después del injerto de médula ósea en
función de la edad, y finalmente (iii) sobre la homeostasis de los
linfocitos T durante la infección por el virus del VIH, apoyan este
nuevo concepto.
Estos datos son igualmente coherentes con el
conjunto de los datos actuales que se refieren a la homeostasis de
linfocitos T en el ratón. Particularmente, se ha descrito de un
ratón timectomizado más de tres días después de su nacimiento vive
de manera normal con un número de linfocitos T normal. Por lo
contrario, un ratón timectomizado antes de D3 no desarrolla
linfocitos T, pero si se le inyectan linfocitos T maduros estos se
desarrollan y el ratón vive normalmente con un número normal de
linfocitos T.
El principio de la invención es por lo tanto
original porque propone que la sustitución de los linfocitos T de
un paciente no pasa obligatoriamente por un injerto de médula ósea
o de células madre hematopoyéticas (precedido de una aplasia
medular (acondicionamiento)), sino que se puede realizar mediante un
método menos invasivo, objeto de esta invención, que es "el
intercambio de linfocitos T".
La invención ofrece por lo tanto una primera
ventaja con relación a las técnicas anteriores, que reside en la
reconstitución rápida de la inmunidad. Así, según la presente
invención, los linfocitos T inyectados a un paciente permiten una
expansión mucho más rápida que la reconstitución a partir de los
linfocitos T que provienen de la diferenciación de células
hematopoyéticas, lo que lleva a obtener la sustitución completa (o
casi) de los linfocitos T del paciente por un conjunto de
linfocitos T que provienen de los inyectados.
La invención presenta otra ventaja importante en
comparación con las técnicasanteriores, que reside en su carácter
de especificidad. Así, al contrario que las técnicas clásicas, que
utilizan inmunosupresores, o que los GMO, que van precedidos de
aplasias medulares completas, la presente invención:
- presenta una especificidad frente a linfocitos
T inmunopatológicos, y
- modifica sólo una porción del sistema
inmunitario de un sujeto.
Finalmente, la invención se basa también en la
destrucción de clones de linfocitos T inmunopatológicos, y posee
por lo tanto igualmente un carácter de estabilidad en la medida en
la que los clones se supriman de manera definitiva.
La presente invención ofrece por lo tanto
numerosas ventajas con relación a los métodos anteriores, y presenta
múltiples aplicaciones.
Los resultados descritos en lo anterior, que
indican la existencia de un compartimiento autónomo y homeostático
que contiene linfocitos T, son la base de un principio general de
tratamiento mediante linfocitos T maduros, comprendiendo dicho
tratamiento al menos 3 operaciones, que se pueden separar en el
tiempo si es necesario.
- 1)
- la extracción de linfocitos T autólogos, singénicos o alogénicos, teniendo el donante linfocitos T que presentan características de inmunidad, de antigenicidad, de edad u otra, que se desea conferir al receptor,
- -
- en su caso, la transformación genética de los linfocitos extraídos, para conferirles una propiedad particular,
- -
- en su caso, la modificación (enriquecimiento, supresión, empobrecimiento, etc.) de esta población de linfocitos en una subclase antigénica particular, mediante supresión, enriquecimiento o empobrecimiento in vitro o ex vivo, por ejemplo mediante inmunoafinidad,
- 2)
- la destrucción total o parcial de los linfocitos T del paciente receptor,
- 3)
- la inyección de dichos linfocitos enriquecidos, suprimidos, transformados o no, en el receptor tras la destrucción de todos o de parte de sus propios linfocitos.
La población de los linfocitos del donante, en su
caso transformada genéticamente o enriquecida mediante supresión de
una o de las subclases no buscadas, se puede administrar al
receptor.
De la misma manera, la destrucción total o
parcial de los linfocitos T del paciente no se requiere
necesariamente en todas las aplicaciones del procedimiento.
Las aplicaciones de este tipo de tratamiento son
numerosas, y cubren todas las patologías o alteraciones fisiológicas
que implican al sistema inmunitario. En particular, este tipo de
tratamiento se puede aplicar a las enfermedades
auto-inmunitarias, a las alergias, al envejecimiento
de las funciones inmunitarias como las anergias, etc.
Esta invención presenta al menos dos
especificidades:
- -
- la sustitución total o parcial de las células T de un paciente,
- -
- la destrucción total o parcial de clones patológicos que sean responsables de la GVH, y/o de una patología preexistente como la autoinmunidad, y/o más generalmente que presentan una mala regulación de la respuesta inmunitaria. Esta destrucción se realiza mediante un sistema que destruye específicamente los clones activados de las células reinyectadas en el momento elegido. Esta destrucción se puede realizar mediante cualquier medio elegido por el experto en la técnica, como se detalla en lo siguiente.
Más específicamente, un primer objeto de la
invención se refiere a la utilización de una población de
linfocitos T para la preparación de una composición destinada a ser
administrada a un sujeto que haya sufrido una supresión de sus
linfocitos T, sin la supresión de sus otras células
hematopoyéticas, incluyendo las células madre.
La presente invención reposa por lo tanto, por
una parte, en la supresión de los linfocitos T del receptor y, por
otra parte, en la administración de una composición de linfocitos
T. En la figura 1 se representa un esquema general de este
"intercambio de linfocitos T".
Como se observa en esta figura, la población de
linfocitos T utilizada puede comprender linfocitos T autólogos,
singénicos o alogénicos con respecto al sujeto.
El termino "autólogo" designa una población
de células que proceden del sujeto al que se le administran. En
este modo de realización, las células T se extraen entonces del
sujeto antes de realizar la supresión.
El término "singénico" designa una población
de células que proceden de un gemelo idéntico al sujeto al cual se
le administran.
El término "alogénico" designa una población
de células que proceden de otro sujeto de la misma especie
(emparentada o no), es decir, de otro ser humano en el caso del
tratamiento de un paciente humano.
La población de linfocitos T se puede obtener y
preparar mediante cualquier técnica conocida por el experto en la
técnica. Así, los linfocitos se pueden aislar en un sujeto mediante
las técnicas clásicas (citaféresis, gradientes de densidad,
selección celular, etc.), bien de la sangre, de los órganos
linfoides u otros, o bien se pueden obtener a partir de bancos
almacenados. Para la extracción en un sujeto, los linfocitos se
obtienen preferentemente a partir de las células mononucleadas de
la sangre periférica (PBMC), o de la sangre del cordón umbilical.
La sangre del cordón umbilical es una fuente interesante. En efecto,
los linfocitos T del cordón umbilical presentan la ventaja de tener
un repertorio muy diverso, y de poder soportar numerosas
divisiones.
En cuanto a la población de linfocitos T
autólogos, en un modo de realización particular, se pueden extraer
por lo tanto del sujeto en sí (o de su gemelo homozigótico si
existe) mediante citaféresis a partir de las PBMC o de la sangre
umbilical.
En cuanto a la población de linfocitos T
alogénicos, en un modo de realización particular de la invención, se
pueden extraer a partir de cualquier donante alogénico, elegido
preferentemente porque presenta compatibilidades HLA con el
receptor, a fin de que haya cooperación entre las células
presentadoras de antígenos del receptor y los linfocitos T del
donante. En algunas situaciones particulares, los linfocitos T se
podrán extraer a partir de un donante elegido por una
característica particular (por ejemplo, su capacidad demostrada de
responder a un agente infeccioso).
Para la realización del intercambio de linfocitos
T según la invención, se prefiere que la población de linfocitos T
utilizada comprenda linfocitos T que representan un repertorio
diverso. En efecto, esto permite favorecer una reconstitución
rápida de la inmunidad del sujeto, y evitar así la persistencia de
una inmunodepresión importante en el sujeto. Por ello, se estima que
la sangre periférica tiene aproximadamente 2% de la totalidad de
los linfocitos T maduros de un sujeto. Por otra parte, se considera
que, para un antígeno específico dado, la frecuencia de los clones
de los linfocitos T específicos es de aproximadamente una célula
por cada 10^{5}. Así, a partir de aproximadamente 10^{8}
linfocitos T de la sangre periférica, se tiene una población de
linfocitos T para la cual cada especificidad antigénica está
representada por aproximadamente 1000 células. Una población de este
tamaño permite por lo tanto una representación muy satisfactoria
del repertorio de los linfocitos T. Preferentemente, durante la
extracción, se desea obtener una cantidad de linfocitos T del orden
de 10^{6} a 10^{9}, preferentemente 10^{7} a 10^{8} células
aproximadamente, a fin de cubrir un repertorio inmunológico
suficiente. Después, si es necesario, estas células se pueden
cultivar y desarrollar in vitro (ex vivo).
Preferentemente, la población de linfocitos T utilizados para la
administración comprende aproximadamente 10^{7} a 10^{12}
células T, más preferentemente entre 10^{8} y 10^{11},
ventajosamente entre 10^{9} y 10^{10} células T. Se entiende
que estas cantidades se pueden adaptar por el experto en la
técnica.
Por otra parte, la población de linfocitos T
(Ly-T) utilizada puede comprender algunas células
de naturaleza diferente (no Ly-T). Así,
ventajosamente, la población de linfocitos T comprende al menos 60%
de Ly-T, preferentemente al menos 80%, más
preferentemente al menos 95% de Ly-T. Los otros
tipos celulares presentes pueden ser, por ejemplo, linfocitos B, u
otras células sanguíneas, generalmente hematopoyéticas. La calidad
de la población de linfocitos T se puede determinar mediante
cualquier técnica conocida por el experto en la técnica, y
especialmente mediante marcación con diferentes anticuerpos
específicos, y mediante análisis por citometría de flujo. Por otra
parte, la calidad de los linfocitos se puede verificar igualmente
mediante análisis de su repertorio por citometría de flujo o
mediante la técnica de la inmunoscopía.
En el ámbito de la presente invención, la
población utilizada de linfocitos es generalmente una población
modificada para mejorar las propiedades inmunitarias del sujeto. La
o las modificaciones aportadas a las células T pueden ser de
diversa naturaleza.
Así, por ejemplo, se puede tratar de
modificaciones de orden genético o inmunológico.
En una primera variante particular de la
invención, la población de linfocitos T utilizada comprende
linfocitos T modificados genéticamente.
La expresión "modificado genéticamente"
indica que los linfocitos comprenden un ácido nucleico que no está
presente naturalmente en los linfocitos en estado no modificado, o
un ácido nucleico presente en el estado no natural en los
linfocitos (por ejemplo, una secuencia artificialmente amplificada).
En lo siguiente, este ácido nucleico se denominará ácido nucleico
heterólogo.
Más preferentemente, los linfocitos genéticamente
modificados, utilizados en el ámbito de la presente invención,
comprenden un ácido nucleico heterólogo que comprende un gen
suicida. Más particularmente, en el sentido de la presente
invención, mediante la expresión "gen suicida" se entiende
cualquier ácido nucleico que codifica un producto tó-
xico, es decir, un producto (ARN, proteína, etc.) susceptible de inducir la destrucción de la célula que le contiene, mediante cualquier mecanismo. Preferentemente, se refiere a un ácido nucleico que codifica un producto (por ejemplo, una
proteína) que tiene una toxicidad condicional, es decir, que es capaz de transformar un fármaco normalmente inactivo en un metabolito altamente tóxico para la célula. En este tipo de toxicidad, aunque todas las células modificadas genéti-
camente expresan el gen suicida, la toxicidad celular se controla estrictamente mediante la administración del fármaco.
xico, es decir, un producto (ARN, proteína, etc.) susceptible de inducir la destrucción de la célula que le contiene, mediante cualquier mecanismo. Preferentemente, se refiere a un ácido nucleico que codifica un producto (por ejemplo, una
proteína) que tiene una toxicidad condicional, es decir, que es capaz de transformar un fármaco normalmente inactivo en un metabolito altamente tóxico para la célula. En este tipo de toxicidad, aunque todas las células modificadas genéti-
camente expresan el gen suicida, la toxicidad celular se controla estrictamente mediante la administración del fármaco.
En un modo de realización particularmente
preferido, el ácido nucleico utilizado (es decir, el gen suicida)
es un ácido nucleico cuya acción tóxica afecta específicamente a
las células en división. Los ejemplos de este tipo de ácidos
nucleicos son especialmente la timidina quinasa (TK).
El gen suicida más utilizado, y que parece tener
las propiedades biológicas más interesantes para el control de las
respuestas inmunitarias celulares, codifica la timidina quinasa del
virus Herpes simplex de tipo 1 (HSV1-TK).
Esta enzima, al contrario de las timidina quinasas celulares, es
capaz de fosforilar diferentes análogos nucleosídicos, tales como
el aciclovir (ACV) o el ganciclovir (GCV), en derivados
monofosfatados que se transformarán a continuación en compuestos di-
y trifosfatados mediante las enzimas celulares. Después, estos
compuestos trifosfatados se pueden incorporar mediante los
polimerasas celulares en el ADN durante la elongación. Esta
incorporación induce una terminación de la elongación e inicia la
apoptosis de estas células [11-18]. Así, las dosis
tóxicas de GCV necesarias para destruir las células que expresan
HSV1-TK son por lo menos 100 veces menores que las
necesarias para destruir las células emparentadas (aproximadamente
10 veces para el ACV). Siendo el GCV mucho más eficaz que el ACV en
este sistema, es el fármaco más utilizado, aunque necesita una
administración por perfusión (venoclisis) dos veces al día. La
inducción de la muerte celular por bloqueo de la elongación del ADN
implica que solamente las células en división se ven afectadas por
el GCV, lo que se ha confirmado experimentalmente. Así, el gen
HSV-1 TK se ha utilizado para la terapia génica del
cáncer [5,6], y más recientemente para la destrucción de los
ly-T originarios de respuestas inmunitarias
patológicas [1,2,7-9].
Este sistema posee por lo tanto tres propiedades
particularmente interesantes para la presente invención: (i) una
toxicidad condicional que depende de la administración de un
fármaco (un análogo de nucleósido), que permitirá controlar el
periodo de destrucción de los ly-T; (ii) una
toxicidad restringida a las células en división, propiedad de los
ly-T activados, y (iii) una gran flexibilidad de
utilización, que permite diferentes esquemas de administración del
fármaco.
El prototipo del gen suicida es el gen
HSV1-TK que funciona con el ganciclovir.
Igualmente se pueden utilizar otras timidina
quinasas, como la timidina quinasa derivada de los virus del herpes
Equin de tipo IV. Igualmente pueden ser genes TK truncados, como el
gen delta TK, o una enzima de origen humano que se ha mutado a fin
de adquirir las propiedades de estas enzimas víricas.
Por ello, varios equipos han comenzado ensayos
terapéuticos basados en la transferencia de un gen
HSV1-TK en los Ly-T maduros que,
después, se reinyectan durante el tratamiento de la leucemia
mediante GMO alogénica [27,28]. Los primeros resultados conocidos
de estos estudios indican que es posible controlar in vivo
la reactividad de estos ly-T mediante un tratamiento
con ganciclovir (GCV) [7]. Los experimentos realizados sobre el
animal y sobre el ser humano muestran por lo tanto que es posible
controlar la GVH tras el injerto de médula ósea alogénica, si los
ly-T inyectados son portadores del gen
HSV1-TK. Sin embrago, el modo de realización
propuesto sigue siendo extremadamente pesado porque comprende la
sustitución del conjunto de las líneas hematopoyéticas del
receptor.
La utilización de un ácido nucleico que codifica
una toxina condicional constituye un modo de realización
particularmente preferido de la invención. En efecto, la presencia
de este tipo de construcción en los linfocitos utilizados para la
administración permite controlar de manera específica las respuestas
T inmunopatológicas. Así, en el caso de linfocitos T autólogos, la
presencia del gen suicida se utiliza para destruir los linfocitos T
implicados en las respuestas inmunitarias patológicas y suprimir
así, de manera duradera, los clones de linfocitos responsables de
estas patologías. En el caso de linfocitos T alogénicos utilizados
en el ámbito de un injerto de médula ósea, la presencia del gen
suicida se utiliza para destruir los linfocitos T implicados en una
reacción del injerto contra el hospedante, y evitar así el
desarrollo de este tipo de patologías.
Así, en un ejemplo de aplicación de la presente
invención, un paciente afectado por una patología mediada por una
respuesta T inmunopatológica se somete a una supresión eficaz de
linfocitos T (como se describe más abajo), y después se
reconstituye con linfocitos T. Estos linfocitos T pueden ser los
linfocitos T del propio paciente (autólogos), después de que hayan
sido transducidos por un gen suicida (es decir, modificados
genéticamente), o bien linfocitos T alogénicos, igualmente
modificados. Los linfocitos T maduros inyectados de este modo en el
sujeto, al que se le han suprimido sus propios linfocitos T
maduros, van a proliferar muy rápidamente y a extenderse a fin de
reconstituir el conjunto de los linfocitos T maduros, según la
propiedad de la homeostasis de los linfocitos T maduros de sufrir
una expansión in vivo, de tal manera que su número alcance
los valores antes de la supresión. Por ello, los pocos
Ly-T que quedan en el sujeto por lo tanto podrán
multiplicarse menos, porque el compartimiento dedicado a los
Ly-T se habrá "llenado" por las células
inyectadas. Después, durante las fases patológicas, el sujeto se
trata con el fármaco susceptible de ser transformado en metabolito
tóxico mediante el gen suicida utilizado, lo que conduce a una
eliminación preferente sólo de los linfocitos T en división, es
decir, sólo de los linfocitos T activados y, por lo tanto,
responsables de la patología. Este intercambio de linfocitos T y el
tratamiento subsiguiente en presencia del fármaco permite por lo
tanto modificar in vivo y de manera duradera (incluso
permanente) el repertorio linfocitario del sujeto.
La invención presenta además la ventaja de poder
ser realizada incluso en ausencia de conocimiento, a priori,
de los antígenos implicados en el desarrollo de la patología
implicada.
Según otra variante de la invención, la población
de linfocitos T utilizada comprende linfocitos T modificados
inmunológicamente. Más particularmente, esta modificación
inmunológica comprende la modificación in vitro (o ex
vivo) del repertorio de los linfocitos T de dicha población. De
manera más preferida, esta modificación inmunológica comprende la
supresión in vitro o ex vivo de clones de linfocitos
implicados en respuestas inmunopatológicas y/o de subpoblaciones de
linfocitos T que tienen propiedades inmunológicas particulares
(CD4+ o CD8+, TH1 o TH2, etc.).
Ventajosamente, la población de linfocitos T
utilizada comprende por lo tanto un "espacio vacío" en el
repertorio inmunológico.
Este modo de realización se adapta
particularmente a las situaciones en las que el o los antígenos
reconocidos por los clones inmunopatológicos son conocidos. En
efecto, en este caso, es posible realizar una supresión in
vitro o ex vivo de la población de linfocitos T,
mediante inmunoafinidad por medio de dichos antígenos o de
fragmentos u homólogos de estos, por ejemplo. Tal supresión se
puede realizar, por ejemplo, poniendo en contacto a la población de
linfocitos T con un soporte en el que dichos antígenos o fragmentos
u homólogos están inmovilizados. La supresión de los clones que
reconocen antígenos específicos implicados en la inmunopatología se
puede realizar igualmente después de una transferencia de genes
suicidas en los linfocitos T, si estos se estimulan después in
vitro en presencia del antígeno y de un tratamiento mediante el
tóxico condicional (GCV). En ausencia de una modificación genética,
estos clones de linfocitos activados por el antígeno in
vitro se pueden también destruir mediante anticuerpos acoplados
a toxinas que reconocen específicamente moléculas expresadas por
los linfocitos T activados (receptores de
II2).
II2).
Este modo de realización se puede poner en
práctica, por ejemplo, en el caso de patologías tales como el
injerto de órgano, en las que están implicados los aloantígenos del
donante de órgano.
Esta modificación inmunológica de los linfocitos
T se puede realizar también tanto con una población autóloga o
singénica como con una población alogénica. Además, se puede
igualmente combinar con una modificación genética tal como se
describe aquí arriba.
Así, en un modo particular de realización, la
población de linfocitos T utilizada comprende linfocitos
modificados:
- -
- inmunológicamente, por supresión de los clones específicos y/o de subpoblaciones de linfocitos T que tienen propiedades inmunológicas particulares (CD4+ o CD8+, TH1 o TH2, etc.), y
- -
- genéticamente, por introducción de un ácido nucleico que codifica un producto tóxico.
Según otra variante de la invención, la población
de linfocitos T utilizada comprende linfocitos T alogénicos que
proporcionan una inmunidad aumentada. En particular, es posible
utilizar linfocitos T que provienen de un sujeto que presenta una
respuesta apropiada (pronunciada o aumentada) a agentes
infecciosos. Así, se sabe que la respuesta inmunitaria T está
controlada en parte por factores genéticos de gran diversidad. Por
esto, frente a un antígeno dado, algunos sujetos son capaces de
mostrar respuestas apropiadas (beneficiosas), mientras que otros no
lo son. Según la invención, es posible sustituir así los linfocitos
T de un sujeto, sensible a una patología dada, por los de un sujeto
insensible.
En este modo de realización, no es necesario que
los linfocitos T se modifiquen inmunológicamente. Sin embargo, es
preferible, para poder controlar cualquier reacción del injerto
contra el hospedante, que estos linfocitos T se modifiquen
genéticamente como se describe anteriormente.
Por otra parte, en un modo de realización
particular de la invención, es posible utilizar una población de
linfocitos T tal como se describe aquí arriba, modificada genética
y/o inmunológicamente, y/o que proporciona una inmunidad aumentada,
que comprende además un ácido nucleico que codifica un producto
terapéutico. En efecto, según la presente invención, es posible
igualmente conferir a los linfocitos T utilizados una nueva
propiedad. En efecto, siendo los linfocitos T células fácilmente
extraíbles, aislables y cultivables, se pueden utilizar
simultáneamente como fuente para introducir (o reintroducir), en un
sujeto, proteínas o funciones ausentes o anormales.
Para la modificación genética de los linfocitos
T, se pueden utilizar varios enfoques, según las técnicas del
experto en la técnica.
En un modo de realización particular de la
invención, los linfocitos se modifican genéticamente por medio de
un vector vírico. En este modo de realización, el ácido nucleico
heterólogo se introduce por ejemplo en un vector vírico, que,
después, se utiliza para infectar una población de linfocitos T tal
como se describe anteriormente.
Se pueden utilizar diferentes tipos de vectores
víricos, especialmente vectores retrovíricos o AAV. En un modo de
realización preferido, los linfocitos se modifican genéticamente
por medio de un vector retrovírico.
Los retrovirus son vectores de elección para la
transferencia de genes en los linfocitos T, porque la infección
retrovírica conduce a la integración estable del genoma en las
células. Esto es una propiedad muy importante teniendo en cuenta que
la expansión linfocitaria, ya sea in vitro o in vivo,
después de la inyección en el sujeto, supone que el transgen sea
muy estable durante la segregación para ser trasmitido a cada
división celular. En cuanto a los tipos de retrovirus que se pueden
utilizar, se pueden citar, por ejemplo, los retrovirus que
pertenecen a la familia de los oncovirus, de los lentivirus o de
los espumavirus. En la familia de los oncovirus, se pueden citar
especialmente los oncovirus lentos, no portadores de oncogén, tal
como por ejemplo MoMLV, ALV, BLV o MMTV, y los oncovirus rápidos,
tales como, por ejemplo, RSV. En la familia de los lentivirus, se
pueden citar, por ejemplo, HIV, SIV, FIV o CAEV.
En la bibliografía se han descrito ampliamente
técnicas de construcción de retrovirus recombinantes defectuoso
(documentos WO89/07150, WO90/02806, WO94/19478, etc.).
En un modo particular de realización de la
invención, se utiliza ventajosamente un retrovirus recombinante que
comprende una cubierta del virus GALV (retrovirus seudotipado con
GALV). En efecto, se ha demostrado que la infección de las células
hematopoyéticas por un retrovirus recombinante se realiza más
eficazmente cuando la cubierta retrovírica deriva de un retrovirus
llamado Gibbon Ape Leukemia Virus (GALV) (Movassagh et al.,
Hum. Gene Ther. 9 (1998) 225). Con la ayuda de esta cubierta
retrovírica, se ha demostrado por otra parte que era posible
obtener porcentajes de transducción mayores que 95% en los
linfocitos T maduros antes de cualquier selección de las células
transducidas (resultados no publicados).
Por otra parte, el virus recombinante utilizado
puede comprender secuencias reguladoras de la expresión
(promotores), específicas de algunas subpoblaciones de linfocitos
T. Así, en algunas situaciones, puede ser deseable expresar el
ácido nucleico sólo en algunas poblaciones de células T, como por
ejemplo las células CD4+ o CD8+, o también las células denominadas
Th1 o Th2, para las cuales se acaban de describir en el ratón
marcadores específicos, que permiten sus separaciones. Estando
caracterizadas estas células por el tipo de citoquinas que producen
(por ejemplo, IL2 o IFNg para las Th1, e IL4 para las Th2), es
posible utilizar las secuencias reguladoras de estos genes
diferentes para controlar la expresión del ácido nucleico
heterólogo (especialmente del gen suicida). Igualmente es posible
utilizar promotores que controlen una expresión específica en una u
otra población de linfocitos T, como por ejemplo el promotor que
codifica la molécula CD4.
Por otra parte, en otro modo particular de
realización de la invención, los linfocitos se modifican
genéticamente por medio de un retrovirus producido en una línea de
encapsidamiento que comprende un gen pol truncado.
Uno de los riesgos asociados con la utilización
de vectores víricos para la transferencia de genes es la
posibilidad de generar virus replicativos. La utilización de
líneas, denominadas con genoma separado, ha permitido limitar este
fenómeno. También es posible minimizar éste utilizando
construcciones concebidas específicamente para disminuir lo más
posible los sucesos de recombinación. Por ejemplo, se ha demostrado
que el truncamiento del extremo 3' del gen Pol hasta el sitio de
corte por la enzima Sma1, sobre el genoma del retrovirus de Moloney
ecotropo (PNCA), permite conservar íntegramente la función
polimerasa suprimiendo al mismo tiempo el conjunto de las
secuencias superpuestas entre el gen Pol y el gen que codifica la
cubierta de los virus Moloney. La utilización de este tipo de
construcciones, para obtener los retrovirus recombinantes capaces de
transducir los linfocitos T, permite por lo tanto una mejora en
términos de seguridad.
La infección de los linfocitos T por los vectores
retrovíricos se puede realizar según cualquier técnica conocida por
el experto en la técnica (incubación con un sobrenadante de
retrovirus, cocultivo de linfocitos T con células de
encapsidamiento de retrovirus, técnicas de Transwell, etc.).
Movassagh et al. (véase más arriba) ha descrito un método
particularmente eficaz, que comprende una etapa de centrifugación,
que se repite eventualmente. Este método se puede realizar
ventajosamente para la modificación genética de los linfocitos T
según la invención.
Para una mejor realización de la presente
invención, es deseable obtener una transferencia de genes lo más
eficaz posible en los linfocitos T. Así, se prefiere utilizar una
población de linfocitos T que comprende al menos 50%,
preferentemente al menos 65%, más preferentemente al menos 80% de
linfocitos T genéticamente modificados. En un modo de realización
ideal, se utiliza una población de linfocitos T cuyo porcentaje de
modificación genética es lo más próximo posible al 100%.
Como se indica anteriormente, tales niveles se
pueden obtener in vitro o ex vivo, utilizando por
ejemplo una cubierta GALV y, en su caso, en ciertas condiciones de
infección (Movassagh et al., más arriba). Por otra parte, en
el medida en la que la modificación genética se realiza in
vitro, es posible igualmente mejorar los niveles de
transducción seleccionando las células efectivamente infectadas.
Para eso, hay disponibles diferentes técnicas de selección conocidas
por el experto en la técnica, y especialmente la utilización de
anticuerpos que reconocen marcadores específicos en la superficie de
las células infectadas, o la utilización de genes de resistencia
(como el gen de resistencia a la neomicina y al fármaco G418, por
ejemplo), o también de compuestos tóxicos para las células que no
expresan el transgen (es decir, la timidina quinasa). Por ello,
sería posible utilizar una molécula no tóxica únicamente para las
células portadoras del gen HSV1-TK. El método para
encontrar esta molécula es realizar un identificación sistemática
con una biblioteca de moléculas conocidas por su toxicidad, y
ensayar 1) las que están modificadas por la enzima
HSV1-TK y 2) cuyos metabolitos ya no son tóxicos. La
ventaja de tal método es que no se necesita transferir un segundo
gen, y que la selección es llevada sólo sobre las células
indeseables.
Preferentemente, la selección se realiza
utilizando un gen marcador introducido en el vector retrovírico,
que expresa una proteína de la membrana. La presencia de esta
proteína permite así una selección mediante las técnicas clásicas de
separación, como la clasificación mediante perlas magnéticas,
mediante columnas, o la clasificación mediante citómetro de flujo.
Desde este enfoque, es ventajoso un gen como el que codifica la
molécula Thy1 humana. También se puede considerar el uso de una
molécula tal como la molécula CD34, ausente de los
Ly-T maduros, porque ya existen sistemas de
selección de células que portan esta molécula de superficie, siendo
ya estos sistemas válidos para la clasificación de células y siendo
utilizados en clínica. Además, estos marcadores pueden comprender
igualmente secuencias etiquetas ("tag"), por ejemplo el tag
c-myc.
La utilización de un gen marcador de expresión de
la membrana presenta por otra parte dos ventajas suplementarias en
el ámbito de la presente invención: (i) permite seguir fácilmente
los linfocitos T genéticamente modificados cuando se hayan
inyectado, y sobre todo (ii) permite destruirlos (igualmente en
ausencia de división) gracias a la acción de un anticuerpo
específicamente dirigido contra esta molécula (si es
necesario).
Ventajosamente, para realizar la expresión del
gen marcador (tal como Thy-1), se prefiere utilizar
vectores denominados bicistrónicos para los cuales los genes
tóxicos (por ejemplo, HSV1-TK) y el marcador (por
ejemplo, Thy1) están separados mediante una secuencia IRES.
La población de linfocitos T obtenida, en su caso
modificada genética y/o inmunológicamente, y/o que tiene una
inmunidad aumentada, se puede acondicionar en cualquier medio y en
cualquier dispositivo apropiado. Así, los medios utilizables son
todos los medios de cultivo de células de mamíferos (RPMI, DMEM,
etc.), o cualesquiera otras disoluciones adaptadas para la
conservación y/o el almacenamiento de células de mamíferos
(disoluciones salinas, tampones, etc.). El dispositivo utilizado
puede ser, por ejemplo, un tubo, un matraz, una caja, una ampolla,
una jeringuilla, una bolsa, etc., preferentemente en estado de
esterilidad apropiada para un uso farmacéutico. La composición
celular se puede utilizar de forma extemporánea, o se puede
almacenar (en frío, congelada, o liofilizada, por ejemplo) con
vistas a una utilización posterior. Por otra parte, como se indica
más adelante, se pueden realizar ventajosamente bancos de tales
células, en las condiciones de preparación y de almacenamiento
descritas aquí arriba.
Como se indica anteriormente, la invención
consiste en un intercambio de linfocitos T de un sujeto, y
comprende por lo tanto la administración de linfocitos T maduros a
un sujeto que haya sufrido una supresión de sus propios linfocitos
T.
Antes de la administración, el sujeto se somete
por lo tanto a una etapa de supresión de sus linfocitos T
existentes. Se entiende que cuando la población de linfocitos T
utilizada es una población de linfocitos T autólogos, esta
población se prepara anteriormente a la supresión.
La supresión se puede efectuar de diferentes
maneras. Así, cuando hay un injerto de médula ósea concomitante, la
supresión se puede realizar mediante el acondicionamiento,
incluyendo la radioterapia.
Sin embargo, la supresión se realiza más
preferentemente mediante el tratamiento del sujeto en presencia de
uno o varios agentes inmunosupresores, en particular en presencia
de un agente inmunosupresor específico de los linfocitos T. Por
este motivo, el sujeto no se somete a una aplasia total de la médula
y conserva cierta inmunidad, a pesar de la inmunosupresión de los
linfocitos T.
Preferentemente, el agente inmunosupresor
utilizado es un "suero antilinfocitario", o uno o varios
anticuerpos monoclonales específicos de las moléculas de superficie
de los linfocitos T. En particular, es posible utilizar un suero o
anticuerpos anti-CD3, CD4 y/o CD8. Este tipo de
inmunosupresores (suero o anticuerpos supresores) ya se ha
utilizado en terapéutica. Así, ensayos realizados en el ratón y en
el ser humano muestran que es posible suprimir muy eficazmente los
linfocitos T maduros de un animal o de una enfermedad mediante estos
tratamientos (Muller et al., Transplantation 64 (1997) 1432;
Caillat-Zucman et al., Transplantation 49
(1990) 156).
No es necesario que la supresión de linfocitos T
maduros sea completa para que el intercambio de linfocitos T según
la invención sea eficaz. Así, aunque subsista cierto porcentaje de
linfocitos T, es poco probable que éstos basten para reinducir la
inmunopatología. Generalmente, los tratamientos inmunosupresores
descritos aquí arriba conducen a una supresión mayor que 90%,
frecuentemente 95%, lo que es muy apropiado para la presente
invención.
La composición de linfocitos T se puede
administrar de diferentes maneras y según diferentes protocolos. Es
deseable administrar los linfocitos T en una fecha tal que los
tratamientos administrados a los pacientes, con el objeto de
destruir sus propios linfocitos T, hayan sido eliminados, de manera
que no puedan atacar a los linfocitos T que van a ser
inyectados.
Preferentemente, la composición se administra
poco tiempo después (por ejemplo, menos de 48 horas después) de la
supresión, a fin de favorecer la expansión de los linfocitos T
maduros inyectados, que van tender naturalmente a llenar el
"espacio vacío" con linfocitos maduros. Por otra parte, los
tratamientos se pueden repetir, en caso de necesidad, con las
mismas células, o con células de donantes diferentes pero según el
mismo principio terapéutico. La administración se puede realizar
ventajosamente por inyección intravenosa o intrarterial.
Como se indica aquí arriba, las dosis
administradas están generalmente comprendidas entre 10^{8} y
10^{11} linfocitos T por sujeto.
Por otra parte, durante los procedimientos
descritos aquí arriba para la preparación de las poblaciones de
linfocitos T, es posible conservar células del paciente (normales
y/o transducidas por el gen suicida) que pueden servir en caso de
necesidad (lotes 1 y 2, en la Figura 1). Por ejemplo, si aparecen
efectos indeseables, todavía sería posible suprimir las células
reinyectadas (por ejemplo, alogénicas) para reinyectar entonces las
células (normales) del paciente.
Asimismo, en el caso de un intercambio alogénico,
las células del donante (transducidas o normales) se pueden
igualmente conservar para su utilización posterior en caso de
necesidad (lotes 3 y 4, en la Figura 1). Igualmente, es posible que
en un paciente que ha recibido linfocitos T alogénicos transducidos,
de los cuales se habrá controlado la GVH, sea entonces posible
inyectar linfocitos normales del mismo donante sin que haya GVH
(tolerancia activa). Esto tendría la ventaja de reinyectar células
que no habrían sido cultivadas. Por ello, ventajosamente, el
procedimiento de la invención comprende igualmente una etapa de
constitución de bancos de células T, transducidas o no, que
provienen del donante y del receptor.
Tras la administración de las composiciones
descritas aquí arriba, la invención permite controlar la aparición
o el desarrollo de inmunopatologías, bien por administración del
fármaco metabolizado en producto tóxico (en el caso de linfocitos T
modificados genéticamente por un gen tóxico), o bien simplemente
por la constitución de una inmunidad aumentada en el sujeto.
Otro objeto de la presente invención reside
igualmente en un producto que comprende:
- -
- uno o varios agentes inmunosupresores, y
- -
- una composición que comprende una población de linfocitos T tal como se define aquí arriba,
con vistas a una utilización separada o espaciada
en el tiempo, especialmente para el control de las respuestas
inmunopatológicas.
Preferentemente, la composición comprende un
repertorio diversificado de linfocitos T.
Ventajosamente, la composición comprende una
población de linfocitos T que comprende un gen suicida, y el
producto de la invención comprende además un fármaco susceptible de
ser transformado en metabolito tóxico por el gen suicida.
La invención se refiere también a un
procedimiento de preparación de una composición de linfocitos T
modificados, que comprende:
- -
- la extracción de linfocitos T de un sujeto, y
- -
- la creación de un espacio vacío del repertorio en estos linfocitos, o más generalmente la modificación selectiva del repertorio.
Más particularmente, el espacio vacío del
repertorio se produce mediante supresión de los linfocitos T
específicos de antígenos implicados en patologías.
La invención se refiere también a cualquier
población de linfocitos T extraída de en un sujeto y a la que se le
han suprimido los clones de linfocitos específicos de uno o varios
antígenos implicados en una o varias patologías.
Por otra parte, la invención se puede igualmente
realizar con cualquier otro tipo de célula con compartimiento, es
decir, cualquier tipo de célula que responda a los criterios
siguientes:
- -
- que se puedan extraer, que se pueda destruir el conjunto de la población y que se puedan (re)inyectar (con modificación), y adopten el sitio de las que se han destruido.
- -
- que se pueda prever por ejemplo una subpoblación de Ly-T o de otras células circulantes (células musculares satélites).
Las aplicaciones de la invención son
extremadamente numerosas. Se refieren especialmente, tanto para los
linfocitos T autólogos como alogénicos, modificados según la
invención, a cualquier patología auto-inmunitaria e
inflamatoria crónica en el sentido amplio (poliartritis reumatoide,
esclerosis en placas, etc.), a la infecciones víricas (hepatitis A,
B, C, VIH, etc.), o las enfermedades genéticas. La sustitución de
los linfocitos T se refiere igualmente a los trasplantes de órganos
o de células (alogénicas, incluso xenogénicas) así como a todas las
patologías para las cuales puede ser deseable reinyectar linfocitos
modificados para, por ejemplo, segregar una proteína terapéutica.
Este sistema puede ser igualmente ventajoso para poder controlar la
respuesta inmunitaria contra una proteína terapéutica administrada
por ejemplo para corregir una deficiencia genética de esta
proteína. Uno de los inconvenientes en esta situación es que, por
el hecho de la deficiencia genética, el paciente reconoce esta
proteína como extraña y la rechaza mediante una respuesta
inmunitaria. Según los principios de la invención, si los
linfocitos T expresan un gen suicida, es posible controlar entonces
esta respuesta inmunitaria perjudicial.
Así, las enfermedades autoinmunitarias,
denominadas enfermedades de sistema (por ejemplo: lupus eritematoso
diseminado, poliartritis reumatoide, polimiositis, etc.), son
afecciones que tienen claramente una composición inmunológica como
lo atestiguan las investigaciones biológicas e histológicas
realizadas en los pacientes. Para muchas de estas patologías, no se
conoce el primum movens, y parece ser que el origen de la
patología es multifactorial. Sin embargo, el elemento central sigue
siendo una respuesta inmunitaria inadaptada. Además, en estas
patologías, generalmente es posible definir el periodo durante el
cual los ly-T, responsables de la patología, se
activan y por lo tanto se dividen. Por ello, la administración del
profármaco durante esta fase permite, según la presente invención,
afectar principalmente a estas células. Además, esta estrategia
lleva a la supresión de los clones de células responsables de la
patología, y por lo tanto, normalmente, a una inmunosupresión
duradera, incluso permanente en ausencia de la producción principal
de ly-T.
Por ejemplo, en un modo particular de realización
de la invención, un paciente que sufre poliartitis reumatoide
recibe, tras la supresión de sus propios linfocitos T, una
administración de una composición que comprende sus propios
linfocitos T, modificados genéticamente para expresar un gen suicida
(composición autóloga), o linfocitos T alogénicos, modificados o
no. Después, durante ataques eventuales de poliartritis reumatoide
que aparecen después de la administración, un tratamiento con un
fármaco transformado en metabolito tóxico por el gen suicida
permite destruir los clones reactivos y por lo tanto suprimir la
respuesta inmunopatológica.
La presente invención es utilizable igualmente
para el tratamiento de las inmunopatologías inducidas víricamente.
La respuesta inmunitaria contra los agentes infecciosos puede tener
frecuentemente consecuencias inmunopatológicas, pudiendo llevar a
veces a la muerte. El ejemplo más clásico es el de la respuesta a
ciertos virus responsables de hepatitis. Estos virus se replican en
los hepatocitos, y la destrucción por el sistema inmunitario de los
hepatocitos infectados es lo que lleva a la hepatitis, a veces
mortal. En otras situaciones, la respuesta inmunitaria del
hospedante parece incapaz de erradicar el virus, y, por el
contrario, participa en el mantenimiento de una hepatitis crónica.
Esto se ilustra bien por la evolución de las hepatitis denominadas
de virus C. Mientras que dos tercios de los pacientes
aproximadamente son capaces de liberarse del virus, el tercio
restante desarrolla una hepatitis crónica. La evolución de esta
hepatitis crónica es independiente del porcentaje de replicación
vírica y, por el contrario, va acompañada de señales biológicas que
atestiguan una respuesta disfuncional inmunitaria (por ejemplo,
presencia frecuente de anticuerpos anti-ADN o de
una crioglobulinemia). La presente invención permite eliminar
el/los clones de linfocitos T activos responsables de la
inmunopatología, y por lo tanto disminuir las consecuencias de la
infección en el hospedante.
Por otra parte, la síntesis de las IgE implicadas
en algunas alergias está igualmente bajo control de los linfocitos
T. Por otra parte, la producción de los linfocitos B se realiza a
partir de células inmaduras de la médula ósea, y estas células
tienen una semi-vida mucho más corta que los
linfocitos T. Por ello, es igualmente posible, utilizando la
técnica del intercambio de linfocitos T según la invención,
controlar las respuestas alérgicas, y más generalmente las
respuestas anticuerpos, controlando las respuestas T.
La presente invención es utilizable igualmente
para el tratamiento o la prevención del rechazo de injertos de
órganos.
El tratamiento clásico de cierto número de
patologías de órganos es, cuando llega a ser necesario, la
sustitución de este órgano por un órgano sano que proviene de un
donante fallecido (o de un donante vivo en algunos casos, incluso
de otra especie en último caso). Aunque se pone una extremada
precaución en la selección de los donantes de órganos que presentan
el máximo de compatibilidad frente a antígenos de
histocompatibilidad, excepto en las situaciones de injertos entre
gemelos homocigotos, el injerto de órgano conduce siempre al
desarrollo de una respuesta inmunitaria dirigida contra antígenos
expresados específicamente por este órgano. A pesar de los
tratamientos inmunosupresores utilizados, esta reacción lleva
frecuentemente al rechazo del órgano injertado (es la causa
principal de los fracasos de los injertos alogénicos). Aparte de
algunos rechazos sobreagudos o agudos que implican esencialmente
respuestas tumorales, la mayoría de las veces el rechazo de los
injertos de órganos está mediado esencialmente por linfocitos T.
Numerosos equipos han desarrollado proyectos de
injertos de células alogénicas o xenogénicas, modificadas o no, a
fin de que produzcan un factor con un objetivo terapéutico (por
ejemplo, células de los islotes \beta del páncreas, fibroblastos,
etc.). En particular, esto se ha propuesto en enfermedades tan
variadas como la diabetes, la enfermedad de Parkinson, incluso
también en terapia génica en los organoides. El obstáculo principal
para tales injertos sigue siendo el rechazo de las células alo o
xenogénicas. Para paliar este inconveniente, se han propuesto
numerosos dispositivos a fin de separar las células injertadas del
sistema inmunitario. Estos sistemas van desde el
microencapsidamiento hasta la inserción de las células en materiales
porosos o semipermeables, etc. Desafortunadamente, ninguno de estos
sistemas ha demostrado tener una eficacia suficiente para poder ser
propuesto en clínica.
Por otra parte, teniendo estos enfermos buena
salud inmunológica, es totalmente ilícito considerar el intercambio
estándar de linfocitos T conservando un lote de los linfocitos de
los enfermos en el caso en el que aparezca un problema
eventual.
La presente invención ofrece desde ahora un nuevo
enfoque médico para favorecer el éxito de los injertos de órganos o
de células. En particular, se practica un intercambio de linfocitos
T en el sujeto receptor, lo que permite, si es necesario, controlar
cualquier desarrollo de una respuesta inmunitaria eventual dirigida
contra el injerto, mediante destrucción selectiva de los linfocitos
T alorreactivos. En el campo de los injertos de órganos o de
células, es posible aplicar estos enfoques terapéuticos, bien
reimplantando en el receptor un órgano o células y linfocitos T
alogénicos que provienen del mismo donante (y que son por lo tanto
tolerantes al órgano o a las células transplantadas), o bien
transplantando un órgano o células de un donante alogénico y
reimplantando al paciente sus propios linfocitos T genéticamente
modificados a fin de controlar la respuesta contra este órgano o
estas células. Finalmente, es posible considerar el injerto de un
órgano o células y linfocitos T alogénicos que provienen de dos
donantes distintos.
Un modo de realización particularmente ventajoso
de la presente invención reside en el tratamiento de las
inmunopatologías en el campo del injerto de órganos o de células.
Más particularmente, el tratamiento se dirige a la prevención, total
o parcial, o a la reducción o supresión de las inmunopatologías
mediadas por los linfocitos T, que son los responsables de los
fracasos de injerto.
De manera similar, la invención se puede
igualmente realizar para el tratamiento (la prevención, la
reducción o la supresión total, por ejemplo) de la enfermedad del
injerto contra el hospedante (GVHD). El injerto de médula ósea es un
tratamiento clásico en gran número de situaciones clínicas,
especialmente para muchas leucemias. El tratamiento convencional
descansa por lo tanto sobre el acondicionamiento del donante, cuyo
objetivo es eliminar el máximo de células tumorales, y que tiene
por consecuencia crear una aplasia medular que necesita un injerto
de médula ósea. Este injerto de médula ósea se realiza
preferentemente con células alogénicas porque han demostrado que
pueden ser responsables de un efecto llamado del "injerto contra
la leucemia" que limita de manera considerable el porcentaje de
las recaídas de las leucemias así tratadas. Desafortunadamente, las
células T alogénicas son también responsables de la enfermedad del
injerto contra el hospedante, siempre grave y a veces mortal. La
utilización de la presente invención permite destruir las células T
responsables de la GVH, y por lo tanto tratar esta
inmunopatología.
Otros ejemplos de patologías que se pueden tratar
mediante sustitución de linfocitos T son especialmente las
infecciones por el virus del VIH, o algunas enfermedades
genéticas.
Así, los linfocitos T son una diana principal de
la infección por el virus del VIH, cuya evolución clínica depende
en gran parte del porcentaje de estos linfocitos en el paciente
infectado. Algunas estrategias terapéuticas de la infección por el
virus del VIH se basan en la transferencia de linfocitos T
genéticamente modificados para resistir al virus. Sin embargo,
existen también pacientes cuyos linfocitos T son menos susceptibles
a la infección por el virus del VIH, por el hecho de mutaciones
espontáneas en genes que codifican proteínas implicadas en el ciclo
replicativo del virus. Así, al igual que para la respuesta al virus
de la hepatitis, existen diferencias genéticas expresadas por los
linfocitos T que les hacen más o menos sensibles a una infección por
el virus del VIH. La presente invención permite aprovechar estos
factores genéticos de gran diversidad, especialmente por la
sustitución de los linfocitos T de un sujeto sensible a una
patología dada por los de un sujeto insensible.
Por otra parte, existe un gran número de
enfermedades genéticas relacionadas con la incapacidad de sintetizar
una proteína que, si se sintetiza por ciertos tipos celulares
específicos (no necesariamente los linfocitos T), tiene sin embargo
una acción general. Así, estas patologías se pueden tratar
frecuentemente mediante injerto de médula ósea, cuando se puede
encontrar un donante compatible. Estas mismas enfermedades se
podrían tratar mediante transferencia de linfocitos T
(mucopolisacaridosis, etc.).
Existen igualmente enfermedades genéticas que
afectan específicamente a los linfocitos (falta de adenosina
desaminasa, etc.), que se pueden tratar también mediante el
intercambio estándar de linfocitos T según la invención. Finalmente,
los posibles accidentes de irradiación o de cualquier otra
insuficiencia medular aguda (por ejemplo, tóxica, medicamentosa,
etc.) se pueden también manejar mediante un intercambio de
linfocitos T según la invención. Se pueden así constituir bancos de
células madre hematopoyéticas y bancos de linfocitos T que provienen
de los mismos donantes, para los cuales sólo los linfocitos T
habrían sufrido una modificación genética, permitiendo el control
de las reacciones inmunopatológicas. Así, se dispone por lo tanto de
"bancos universales" que permiten los injertos de médula con
linfocitos T maduros para las situaciones que lo necesiten.
Según otra variante de la invención, la población
de linfocitos T del donante se puede utilizar en la prevención o el
tratamiento del envejecimiento de las funciones inmunitarias tales
como las anergias.
La presente invención se describe con más detalle
con la ayuda de los ejemplos siguientes, que se deben de considerar
como ilustrativos y no limitativos.
Figura 1: representación esquemática del
principio del intercambio estándar de linfocitos T.
Figura 2: Sensibilidad al GCV de células T que
expresan una timidina quinasa. Se han cultivado esplenocitos 2 días
en presencia de ConA y de concentraciones crecientes de GCV, y
después se cargan durante la noche con la TdR tritiada (se observa
un "uptake" del 100% en ausencia de GVC). Los triángulos,
cuadrados y círculos corresponden a diferentes formas de TK. La
curva superior corresponde a los linfocitos T no transducidos.
Figura 3: Efecto protector de la GVH de un
tratamiento de 7 días mediante el GCV. El grupo de control de la
irradiación está constituido por ratones irradiados no injertados
(n=15). Se induce una GVH mortal a D35 para el 100% de los ratones
mediante la coinyección de células de la médula ósea y de
Ly-T alogénicos (n=25). La supervivencia de los
ratones tratados (n=13) se compara con la obtenida en ratones que
reciben sólo la médula y que por lo tanto no desarrollan GVH
(n=15).
Figura 4: Control farmacogenético de la
coriomeningitis linfocitaria en ratones que expresan el gen suicida
en las poblaciones de linfocitos CD4 y CD8. Se han irradiado
ratones FVB o C57BL/6 y se han reconstituido mediante médula ósea
singénica que proviene de ratones FVB o de ratones transgénicos
EPDTKL20, o mediante médula alogénica. Después de la reconstitución
del sistema inmunitario, los receptores se han infectado por vía
intracerebral mediante el virus de la coriomeningitis linfocitaria
(10^{4} pfu de la cepa Arm/53b del LCMV), y se han tratado con el
GCV durante 7 días (inyecciones dos veces al día por vía
intraperitoneal de 100 mg/kg/d). Los ratones que expresan el gen TK
en sus linfocitos están protegidos, sobreviven, han eliminado el
LCMV y poseen un título alto de anticuerpos
anti-LCMV.
A fin de estudiar la posibilidad de controlar
respuestas inmunitarias patológicas con la ayuda de genes suicidas,
se han desarrollado ratones transgénicos que expresan el gen
HSV1-TK en los ly-T. Esta expresión
se obtiene con la ayuda de las secuencias reguladores derivadas del
gen que codifica la molécula CD4, de la cual se había demostrado
anteriormente que conducía a la expresión específica de un transgen
en los linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} maduros, con la exclusión
de los timocitos inmaduros CD4^{-} CD8^{-} o CD4^{+}CD8^{+}
[26]. Los ly-T de estos ratones transgénicos se
destruyen eficazmente in vitro mediante el GCV (figura
2).
En todos los ejemplos siguientes, los linfocitos
T provienen de ratones transgénicos, con el único objeto de
simplificar el procedimiento experimental. Los mismos experimentos
se pueden reproducir utilizando linfocitos T de ratones o de seres
humanos en los que se puede transferir el mismo gen suicida mediante
un vector retrovírico según las técnicas anteriores.
Utilizando ratones transgénicos que expresan el
gen HSV1-TK en los linfocitos T, se ha demostrado
que era perfectamente posible controlar la respuesta alogénica
responsable de la reacción del injerto contra el hospedante en estos
animales. Por lo tanto, se ha demostrado el principio de esta
capacidad para controlar los linfocitos T responsables de la GVH.
Se ha de mencionar que esta eficacia terapéutica se puede obtener
mediante tratamientos extremadamente cortos con el ganciclovir, y
que se ha demostrado que al final de estos tratamientos no sólo se
evitaba la patología sino que el ratón tenía una respuesta
inmunitaria normal.
Estos ratones transgénicos se han utilizado como
donantes de ly-T HSV1-TK^{+} para
la realización de un modelo de enfermedad del injerto contra el
hospedante (GVH) después del injerto de médula ósea (GMO) alogénica
[8]. Así, en el ratón irradiado mortalmente, una GMO alogénica, a
la que se le suprimen los ly-T maduros, conduce a
una supervivencia de la totalidad de los animales y a una
reconstitución hematopoyética completa por las células del donante.
Por el contrario, el injerto suplementado con ly-T
conduce a una mortalidad del 100% de los animales que presentan las
señales clínicas e histológicas de GVH. En este modelo, se ha
demostrado que si los ly-T expresan el gen suicida
HSV1-TK, el tratamiento mediante el GCV, comenzado
el día del injerto y prolongado durante 7 días, permite la
prevención de la GVH clínica (Figura 3). Cuando se sacrifica a
estos animales, el análisis histológico hace objetiva la ausencia
de toda señal histológica de GVH en estos animales. El tratamiento
es igualmente eficaz sobre una GVH declarada.
Las células de origen hematopoyético presentes en
estos animales provienen del donante. De manera interesante, se ha
observado que los ly-T que han sobrevivido al
tratamiento mediante el GCV son capaces todavía de responder in
vitro a estimulaciones por un mitógeno o un tercer aloantígeno,
pero no por células que provienen del donante o del receptor. Estos
resultados han demostrado que un tratamiento mediante el GCV
permite eliminar los clones de ly-T alorreactivos,
conservando un compartimiento de ly-T capaces de
responder a otras estimulaciones antigénicas.
Este experimento tiene por objeto demostrar la
eficacia del intercambio de linfocitos T genéticamente modificados
sobre el control de una enfermedad autoinmunitaria (MAI)
espontánea, representada aquí por el modelo del ratón diabético
autoinmunitario NOD. El intercambio de linfocitos T se realiza en
condiciones próximas a las previstas en clínica. El intercambio de
linfocitos T se hace con linfocitos T alogénicos al receptor,
permitiendo la destrucción de células eventuales autoinmunitarias
residuales. El intercambio de linfocitos T se hace con linfocitos T
genéticamente modificados que expresan el gen suicida TK. En este
modelo, el control de la GVH descansa sobre la utilización de
linfocitos T genéticamente modificados que expresan el gen TK
asociada con un tratamiento con ganciclovir (GCV). Este sistema
permite la destrucción de los linfocitos T TK en división,
controlando así la GVH. El intercambio de linfocitos T se hace tras
un acondicionamiento no mieloablativo de los ratones NOD mediante
una irradiación de 8-9 Gy conduciendo a una
supervivencia del 100% a D120 en tales ratones. El intercambio de
linfocitos T se hace mediante inyección, en el seno
retro-orbital de los ratones irradiados, de 10^{7}
células, asociado con un tratamiento preventivo de 7 días con el
ganciclovir, iniciado en el momento mismo del injerto. Se
constituye un primer grupo de control de ratones que reciben
10^{7} células de médula ósea alogénica, pero nada de linfocitos
T. En estos ratones, el injerto puede ser parcial o totalmente
rechazado, y la MAI puede reaparecer. Se constituye un segundo grupo
de control de ratones que reciben 10^{7} células de médula ósea
que provienen de ratones NOD, pero nada de linfocitos T.
La eficacia de la estrategia se evalúa
mediante:
- -
- el análisis de la presencia de linfocitos T genéticamente modificados, caracterizados por la expresión de moléculas del CMH procedentes del donante;
- -
- la determinación de señales clínicas de la diabetes autoinmunitaria (glucemia mayor que 2 g/l);
- -
- la presencia de infiltrados linfocitarios en los islotes de Langerhans.
\bullet Origen de los CSMNSP
| Linfocitos T procedentes del donante | ||
| Control NOD | 2 | 0/2 |
| NOD irradiados subletalmente | 3 | 0/3 |
| NOD injertados sing. | 6 | 0/6 |
| NOD injertados y protegidos | 3 | 3/3 |
La reconstitución hematopoyética se evalúa 180
días después del injerto, tras marcación de los CSMNSP por Ac
monoclonales, y se analiza mediante citometría de flujo. Las
células B y T procedentes del donante se determinan mediante la
expresión de moléculas de clase I del CMH
(H-2^{q}). Las células B y T del receptor se
determinan mediante la expresión de moléculas de clase II del CMH
(J-A^{k}).
En los ratones NOD en los que se ha realizado un
intercambio de linfocitos T, sólo están presentes las células
procedentes del donante.
\bullet Presencia de infiltrados linfocitarios
después del intercambio de linfocitos T
\vskip1.000000\baselineskip
| N | Presencia de infiltrados linfocitarios de Langerhans | |
| NOD injertados sing. | 4 | 4/4 |
| NOD injertados y protegidos | 3 | 0/3 |
Se extrae el páncreas de los ratones 180 días
después del injerto, se fija en un líquido de Bouin, y después se
introduce en parafina. La presencia de infiltrados linfocitarios se
evalúa sobre cortes de 4 micrómetros tras la marcación mediante
hematoxilina y eosina.
No se ha observado infiltrado linfocitario en
ningún páncreas de ratón que haya sufrido un intercambio de
linfocitos T.
Por otra parte, los ratones han permanecido
normoglicémicos atestiguando así la ausencia de diabetes.
En conclusión, los ratones receptores se
reconstituyen mediante los linfocitos T alogénicos, y ya no
desarrollan la enfermedad autoinmunitaria.
Se ha deseado aplicar el mismo sistema al control
de una reacción de inmunopatología inducida por un virus. El sistema
experimental más clásico es el del control de la encefalopatía
inducida por el virus de la CML en el ratón.
Se conoce muy bien la respuesta inmunitaria al
virus de la CML. Así, los animales inoculados por vía intracerebral
con este virus mueren rápidamente de un ataque cerebral fatal
mediado por los linfocitos T citotóxicos. En los animales que han
recibido una inmunización anterior, la cinética de reactividad de
los linfocitos T sensibilizados se acelera, conduciendo a la
protección y a la supervivencia de los ratones. En los animales que
reciben ganciclovir en el momento de la inyección intracerebral, la
destrucción de los linfocitos T citotóxicos activados por la
replicación vírica conduce a un control del ataque cerebral (figura
4).
Estos ratones se han utilizado después para
intentar controlar las respuestas de inmunidad responsables del
rechazo de un injerto de órgano. El modelo utilizado es el que se
puede considerar como el más fisiológico. Se trata de un injerto de
corazón vascularizado en posición heterotópica en el ratón. Cuando
este injerto alogénico se realiza en los ratones no tratados, el
rechazo sobreviene de manera regular en los días siguientes al
injerto. Cuando los ratones se tratan con el ganciclovir en un
periodo de tiempo corto (7 días a partir del día del injerto), el
corazón se tolera de manera permanente y guarda sus funciones
vitales, tal como lo demuestran sus latidos.
El tratamiento comienza con una ablación de los
linfocitos T. Esta ablación se puede realizar, por ejemplo,
combinando la administración de "suero antilinfocitario"
(inmunoglobulinas capaces de reconocer linfocitos T y de
destruirlos en presencia del complemento del paciente, que son
producidas habitualmente en el conejo, por ejemplo por los
laboratorios Merieux). La cantidad de este SAL que se administra, y
la duración de la administración, depende de los datos clínicos
sobre el lote farmacéutico y de las recomendaciones del fabricante.
Este tratamiento se puede realizar al mismo tiempo que la
administración de otros inmunosupresores, como la ciclofosfamida y
la ciclosporina. Finalmente, a fin de llegar a los linfocitos T
tisulares que podrían ser más resistentes a estos tratamientos, es
posible añadir una irradiación deliberada protegiendo al mismo
tiempo la médula ósea del paciente.
Al final de este tratamiento, la supresión de los
linfocitos T se puede analizar a nivel de la sangre periférica
mediante sus numeraciones clásica. Se prefiere una supresión mayor
que 90% de los linfocitos de la sangre periférica.
Al final de este tratamiento, se realiza una
inyección i.v. de linfocitos T a los pacientes, a razón de una
dosis preferentemente comprendida entre 10^{9} y 10^{11}
células. En este caso se han obtenido linfocitos T de un donante
alogénico que presentan la máxima compatibilidad de los antígenos
mayores de histocompatibilidad. Por ejemplo, puede ser un primo
hermano con HLA idéntico, para las situaciones en las que no es muy
elevado el riesgo genético familiar de volver a encontrar las
mismas patologías en el seno de la familia. Las células
reinyectadas han sido anteriormente transducidas mediante un gen
suicida, como el gen HSV1-TK, y las células
reinyectadas contienen al menos 90% de células transducidas. Por
otra parte, se lleva a cabo el conjunto de los controles de calidad
de estas células (fenotipo, análisis del repertorio.).
En los días siguientes a la inyección,
preferentemente en la semana siguiente a las inyecciones, 48 horas
después de la inyección, se administra al paciente un tratamiento
de ganciclovir, a razón de 10 mg/kg dos veces al día. Si aparecen
más precozmente señales de GVH, el tratamiento también se puede
prever de manera más precoz. El tratamiento dura al menos una
semana. Al final de este tratamiento, el paciente sigue en
observación, especialmente para verificar la reconstitución de los
linfocitos T.
Igualmente se siguen las señales indicadoras de
una reacción del injerto contra el hospedante, como por ejemplo los
ataques cutáneos. Si sobrevienen tales manifestaciones, se empieza
un tratamiento curativo con el ganciclovir.
El tratamiento se repite y se termina cuando el
número de linfocitos ha vuelto a valores de al menos 200 linfocitos
T por mm^{3}.
En caso de efectos secundarios graves durante el
tratamiento, como por ejemplo una GVH que no se pudiera controlar
mediante ganciclovir, es posible entonces volver a tratar al
paciente con los medicamentos que permiten la destrucción de los
linfocitos T, para reinyectar después sus propias células que se han
crioconservado anteriormente. Por otra parte, teniendo estos
linfocitos T por construcción un marcador membranario, una
inyección del anticuerpo anti-marcador ayuda a la
eliminación de los linfocitos T, si es necesario.
Para otros tipos de patologías autoinmunitarias,
los linfocitos que se reinyectan pueden ser linfocitos del paciente
transducidos similarmente por el gen HSV1-TK. En
estas condiciones, al final de la reinyección de las células, no se
empieza ningún tratamiento con el ganciclovir. Tras haber constatado
la reconstitución del conjunto de linfocitos T del paciente, cuando
sobrevengan fases agudas de accesos de la patología, se empezará un
tratamiento con ganciclovir de manera tan precoz como sea posible
después de la identificación de estos accesos, que pueden ser, por
ejemplo, accesos de artritis inflamatoria para el tratamiento de una
poliartritis reumatoide, o de un ataque neurológico y muscular en
el caso de la esclerosis en placas.
En esta indicación terapéutica, el paciente se
acondiciona como se describe anteriormente, y después se
reconstituye, por ejemplo, con sus propias células que expresan el
gen suicida, y en ausencia de tratamiento con ganciclovir. Cuando
el paciente ha reconstituido su sistema inmunitario, se puede
empezar el injerto de órgano propiamente dicho. Justo después del
injerto, se puede empezar un tratamiento profiláctico de
aproximadamente una semana con ganciclovir. Después, el paciente se
vigila en cuanto a la evolución de las señales clínicas que
pudieran revelar un comienzo del rechazo del injerto. En este caso,
se empezaría un nuevo tratamiento con el ganciclovir. Se indica que
los tratamientos inmunosupresores clásicos, como por ejemplo la
ciclosporina, se pueden utilizar en esta situación.
En otro modo terapéutico, los linfocitos pueden
provenir del donante de órgano. En este caso, son tolerantes al
injerto y, por lo tanto, el modo de realización es un tratamiento
con GCV inmediatamente después de la administración de los
linfocitos T genéticamente modificados con el objetivo de suprimir
la GVH.
El sistema inmunitario está sujeto al
envejecimiento, lo que se caracteriza por una mala regulación de la
respuesta inmunitaria, tal como la aparición de enfermedades
auto-inmunitarias o la incapacidad de producir una
respuesta inmunitaria eficaz contra un nuevo antígeno.
En esta aplicación, el tratamiento es preventivo.
Cuando el paciente es aún joven, se le extraen linfocitos T. La
extracción de 10^{8} linfocitos durante una citaféresis es fácil
y no conlleva peligro.
Esta operación se puede repetir de forma bastante
frecuente con intervalos de tiempo del orden de algunos meses.
Se admite actualmente que las subpoblaciones de
linfocitos T, llamadas "memorias", son circulantes. Si no es
el caso, habría que extraerlas quirúrgicamente o después de una
movilización por un factor de crecimiento u otro.
En el modo de realización preferente, los
linfocitos T se cultivan y se amplifican a fin de alcanzar
10^{10}-10^{11} linfocitos T.
Entonces, las células se reparten y se congelan
para varios años. Cuando se necesitan: aparición de un problema
inmunológico o dificultad para mostrar una respuesta inmunitaria,
los linfocitos T se descongelan y se reinyectan al sujeto.
Esta reinyección puede portar todo o parte de los
linfocitos T congelados, y se puede preceder de una ablación total
o parcial de los linfocitos T circulantes.
Por ejemplo, se puede prever muy bien la
sustitución de sólo una clase de linfocitos T por otra subclase de
linfocitos T. Por ejemplo, es muy posible destruir selectivamente
sólo los linfocitos CD8 (o los portadores de un TCR particular) y
seleccionar los linfocitos T anteriormente congelados a fin de
inyectar solamente la subclase de linfocitos T deseada, incluso de
suprimir selectivamente el injerto de una u otra subclase de
linfocitos T.
Se obtiene entonces la sustitución de los
linfocitos T del paciente por linfocitos T más jóvenes y en
condiciones de asegurar sus funciones. En el caso de enfermedades
autoinmunitarias, los linfocitos T alorreactivos se destruyen y se
sustituyen por linfocitos T inofensivos. En el caso de una patología
relacionada con el envejecimiento de la población de linfocitos T,
se trata de una terapéutica preventiva. En efecto, se trata de un
"rejuvenecimiento" real de los linfocitos T y por lo tanto del
sistema inmunitario.
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herpes-simplex thymidine kinase in allogeneic bone
marrow transplantation: a phase I-II study, Hum
Gene Ther 8 (1997) 615-624.
Claims (22)
1. Uso de una población de linfocitos T, para la
preparación de una composición destinada al tratamiento de una
inmunopatología mediada por los linfocitos T en un sujeto que ha
sufrido una supresión específica de sus linfocitos T o de
subpoblaciones de linfocitos T, sin supresión de sus otras células
hematopoyéticas, incluyendo las células madre.
2. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la población de linfocitos T comprende
linfocitos T autólogos o singénicos con respecto al sujeto.
3. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la población de linfocitos T comprende
linfocitos T alogénicos con respecto al sujeto.
4. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque la población de linfocitos T comprende
linfocitos T modificados genéticamente.
5. Uso según la reivindicación 4,
caracterizado porque los linfocitos comprenden un ácido
nucleico que codifica un producto tóxico.
6. Uso según la reivindicación 5,
caracterizado porque el ácido nucleico codifica una proteína
que presenta una toxicidad condicional, tal como por ejemplo la
timidina quinasa.
7. Uso según las reivindicaciones 4 ó 5,
caracterizado porque los linfocitos comprenden un ácido
nucleico que codifica un producto terapéutico.
8. Uso según una de las reivindicaciones 4 a 7,
caracterizado porque los linfocitos se modifican
genéticamente por medio de un vector vírico.
9. Uso según la reivindicación 8,
caracterizado porque el vector vírico es un vector
retrovírico o AAV, preferentemente retrovírico.
10. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque la población de linfocitos T comprende
linfocitos T modificados inmunológicamente.
11. Uso según la reivindicación 10,
caracterizado porque la modificación inmunológica comprende
la modificación del repertorio de los linfocitos T de la
composición.
12. Uso según una de las reivindicaciones 1, 3 a
4, ó 10, caracterizado porque la población de linfocitos T
comprende linfocitos T que proporcionan una inmunidad
aumentada.
13. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la supresión de los linfocitos T se
realiza mediante tratamiento del sujeto en presencia de uno o
varios agentes inmunosupresores.
14. Uso según la reivindicación 13,
caracterizado porque la supresión de los linfocitos T se
realiza mediante tratamiento del sujeto en presencia de un agente
inmunosupresor específico de los linfocitos T.
15. Uso según la reivindicación 13,
caracterizado porque el agente inmunosupresor es un suero o
un anticuerpo anti-CD3, CD4 y/o CD8.
16. Uso según la reivindicación 6, que comprende
además la administración al sujeto de un fármaco susceptible de ser
transformado por la proteína en metabolito tóxico.
17. Producto que comprende:
- -
- uno o varios agentes inmunosupresores, y
- -
- una composición que comprende una población de linfocitos T modificados inmunológicamente mediante la supresión in vitro o ex vivo de clones de linfocitos implicados en respuestas inmunopatológicas y/o de subpoblaciones de linfocitos T que tienen propiedades inmunopatológicas particulares,
- con vistas a una utilización separada o espaciada en el tiempo.
18. Producto según la reivindicación 17,
caracterizado porque
- -
- la composición comprende una población de linfocitos T que comprende un gen suicida, y porque comprende además
- -
- un fármaco susceptible de ser transformado por el gen suicida en metabolito tóxico.
19. Procedimiento de preparación de una
composición de linfocitos T modificados, que comprende:
- -
- la extracción de linfocitos T en un sujeto, y
- -
- la modificación del repertorio de estos linfocitos mediante supresión in vitro o ex vivo de clones de linfocitos implicados en respuestas inmunopatológicas y/o de subpoblaciones de linfocitos T que tienen propiedades inmunopatológicas particulares.
20. Procedimiento según la reivindicación 19,
caracterizado porque el espacio vacío del repertorio se
realiza mediante supresión de los linfocitos T específicos de
antígenos implicados en estas patologías.
21. Uso según la reivindicación 1, para la
preparación de una composición destinada a la prevención o al
tratamiento de las inmunopatologías, especialmente en el campo de
injerto de órgano o de células.
22. Uso según la reivindicación 1, para la
preparación de una composición destinada a la prevención o al
tratamiento del envejecimiento del sistema inmunitario celular.
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