ES2234274T3 - Proteina 3 recombinante activa de la zona pelucida humana (hzp3). - Google Patents

Abstract

Un glicopolipéptido recombinante purificado, de 65 kDa 100 kD, que comprende aproximadamente 40% a 60% de hidrato de carbono en peso, y que puede unirse a espermatozoides humanos a una concentración de glicopolipéptido inferior a 1 µg/ml e inducir una reacción del acrosoma en una hora desde la unión, en el que dicho glicopolipéptido es expresado por una línea de células ováricas humanas o una célula que tiene una maquinaria de glicosilación similar a la de un ovocito, y comprende una secuencia de aminoácidos que es más del 54% homóloga de la siguiente secuencia: Ser Trp Phe Pro Val Glu Gly Pro Ala Asp Ile Cys Gln Cys Cys Asn Lys Gly Asp Cys Gly Thr Pro Ser His Ser Arg Arg Gln Pro His Val Met Ser Gln Trp Ser Arg Ser Ala Ser.

Description

Proteína 3 recombinante activa de la zona pelúcida humana (hZP3).

Campo de la invención

Esta invención se refiere a pruebas de infertilidad masculina y a usos de la proteína recombinante de la zona pelúcida humana en investigaciones clínicas y aplicaciones prácticas.

Descripción de la técnica relacionada

La fertilización es el proceso por el cual los gametos individuales de la hembra (huevo) y el macho (espermatozoide) se unen para crear un cigoto cuya constitución genética es diferente de la de ambos progenitores. La interacción espermatozoide-huevo requiere la proteína 3 de la zona pelúcida (ZP3) como ligando de unión del espermatozoide y el ovocito y como inductor de la reacción del acrosoma.

En pacientes masculinos con infertilidad de etiología desconocida, se observa frecuentemente una interacción anormal espermatozoide-zona pelúcida entre el espermatozoide y el huevo. Esta anomalía se asocia con una reducción de la capacidad de fertilidad del esperma y puede explicar una importante proporción de casos de infertilidad. La infertilidad masculina es un importante problema en la actualidad, y aproximadamente un 30-40% de los casos de infertilidad pueden ser atribuidos a una disfunción reproductora masculina. Por consiguiente, existe una necesidad fundamental de obtener un conocimiento más profundo de la interacción esperma humano-ovocito a nivel de la zona pelúcida. Un mayor entendimiento de este problema ofrecerá a estos pacientes una terapia mejorada y mejor dirigida desde el punto de vista fisiopatológico.

La infertilidad procede en muchos casos de un problema con la unión del huevo con el espermatozoide para formar un cigoto. La unión del espermatozoide con la zona pelúcida del huevo es un acontecimiento de reconocimiento crucial en este proceso que conduce a la fertilización. Una profunda investigación de sistemas de fertilidad murinos ha dado lugar a la identificación y el aislamiento de la proteína de la zona pelúcida 3 ("ZP3") como receptor primario para el espermatozoide dentro de la zona pelúcida, Bleil y Wassarman, Dev. Biol. 76; 185-202 (1980). La ZP3 es una glicoproteína que desempeña un papel crucial durante la fertilización. Como parte de su papel biológico, la ZP3 se une a un espermatozoide y produce la reacción del acrosoma después de menos de 30 minutos de exposición al espermatozoide. Esta actividad biológica consta de dos partes. La primera parte es la unión de ZP3 a un espermatozoide. La segunda parte es la inducción de la reacción del acrosoma dentro de un espermatozoide. Las dos partes pueden detectarse por varios procedimientos que son conocidos por los expertos en la técnica.

La evidencia actual indica que, como se ha demostrado en el modelo murino, la ZP3 está implicada en dos eventos necesarios para la fertilización. Primero, la ZP3 sirve como receptor primario para la unión del espermatozoide a la zona pelúcida, Saling, Oxf. Rev. Reprod. Biol. 11; 339-388 (1991). La mayoría de los estudios en este campo han usado ZP3 nativa obtenida de otros animales. Las publicaciones acerca del glicopéptido ZP3 humano indican que esta proteína tiene un peso molecular de aproximadamente 60 a 100 kD, con aproximadamente la mitad de este total en forma de carbohidrato.

El papel biológico del carbohidrato de ZP3 en la fertilidad ha sido supuesto, pero no se han hecho conclusiones definitivas relativas a la discriminación entre especies. En un experimento reciente, células de carcinoma embrionario de ratón se transfectaron con mZP3 en donde cinco restos de serina arracimados en el exón 7, Ser-329, Ser-331, Ser-332, Ser-333 y Ser-334, se convirtieron en pequeños aminoácido no hidroxi por mutagénesis dirigida a sitio. La ZP3 transgénica fue sintetizada y segregada en forma activa, habiendo perdido su capacidad para unirse al espermatozoide, como se describe en Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6193-97 (1998). Sin embargo, este trabajo no enfoca adecuadamente posibles diferencias entre especies entre ZP3s y no caracteriza adecuadamente diferencias entre las cinco distintas serinas. Además, actualmente se desconocen las especificidades de la familia de UDP-GalNAc:polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferasa que une el carbohidrato Gal-NAc a la cadena lateral de ciertos restos de serina y treonina en glicopolipéptidos de tipo mucina. Sin embargo, pueden usarse datos empíricos ya obtenidos con secuencias peptídicas de mamífero conocidas para predecir la probabilidad de glicosilación para una secuencia dada con un elevado grado de confianza, como se ha publicado por el Denmark Center for Biological Sequence Analysis. Véase, por ejemplo, el sitio web del centro en www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc-2.0 (en adelante "sitio web NetOglyc"). Puede encontrarse una base de datos de proteínas O-glicosiladas en Hansen et al., Nucl. Acids Res., 25: 278-282 (1997) y un algoritmo para predecir sitios de glicosilación basado en el contexto de la secuencia se encuentra en Hansen et al., Glyco. J., 15: 115-130 (1998).

Los avances en biología molecular han revelado nueva información acerca de la proteína ZP3 y su gen asociado (s). Se han aislado clones de cDNA de longitud completa de ZP3 humana, y los loci genómicos de este gen han sido caracterizados, como se describe en Chamberlin y Dean, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6014-6018 (1990). Ha sido obtenida la secuencia genómica procedente del ratón y puede obtenerse un exón 7 que codifica la secuencia en el extremo terminal carboxilo de la proteína por métodos conocidos. Kinloch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 6409-13 (1988). Los clones que contienen información de secuencia del gen de ZP3 de ratón expresan cantidades utilizables de ZP3 recombinante ("rZP3") de, por ejemplo, ratón, en líneas de cultivo de tejidos. Sin embargo, desgraciadamente la producción de ZP3 humana recombinante ("rhZP3") está plagada de dificultades técnicas, de las que no es la menor el hecho de que la expresión de rhZP3 conduce frecuentemente a una proteína generalmente inestable. Chapman y Barratt, Mole. Human Repro. 3: 646-648 (1997). Además, la hZP3 apropiadamente glicosilada no ha sido nunca purificada anteriormente, por lo que cualquier información acerca de este material se determina indirectamente.

El peso molecular aparente de ZP3 puede diferir ligeramente dependiendo de dónde fue hecha. Por ejemplo, Beebe et al., Dev. Biol. 151: 48-54 (1992), determinaron que la ZP3 murina recombinante ("rmZP3") derivada de células de ovario de hamster chino ("CHO" por sus siglas en inglés) transfectadas era aproximadamente 60 a 70 kDa, que difería del peso molecular del tamaño medio de la ZP3 nativa, que es 83 kDa. Estos investigadores atribuyeron esta incongruencia a una diferencia en el patrón de glicosilación.

A pesar de la supuesta diferencia en la glicosilación, la rmZP3 demostró actividad biológica en ensayos de competición de zona pelúcida de esperma homólogo (ratón), y la rmZP3 fue capaz de desencadenar exocitosis acrosomal en suero de ratón capacitado, como se describe en Beebe et al., Id. Sin embargo, cuando se ensaya en un sistema humano, la rmZP3 mostró solamente un efecto competitivo parcial bajo condiciones de ensayo de la hemizona y no actuó como agonista de la reacción del acrosoma. Chamberlin y Dean, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6014-6018 (1990).

Otra publicación posterior indicó la posible producción de rhZP3 a partir de células de CHO que tienen actividad biológica. Van Duin et al., Biol. Repro. 51: 607-17 (1994). Sin embargo, los autores de la publicación de Van Duin no demostraron que la rhZP3 hecha tenga la capacidad de unirse al espermatozoide. Además, la rhZP3 requería al menos tres horas de contacto con los espermatozoides a una concentración de rhZP3 de 10-20 \mug/ml extremadamente elevada antes de que pudiese observarse cualquier reacción acrosomal significativa, no puede decirse que la ZP3 tenga una actividad biológica real. Esta conclusión se desprende de los hechos de que la actividad biológica es una unión específica (es decir, puede ocurrir a baja concentración) de los espermatozoides a la proteína ZP3 y también ocurre una rápida reacción del acrosoma. La unión específica y una reacción rápida son un preludio necesario para que un espermatocito entre a través de la zona pelúcida. La concentración de ZP3 bajo condiciones biológicas más naturales es al menos 100 veces más baja que la publicada por Van Duin, y la reacción biológica acrosomal ocurre en menos de 30 minutos, no en un mínimo de unas cuantas horas.

Un medio para ensayar la reacción biológica es con el ensayo de la hemizona (HZA). El HZA analiza funcionalmente el establecimiento de una unión estrecha del espermatozoide con la zona pelúcida, una etapa crítica que desencadena la reacción fisiológica del acrosoma que lleva a la fertilización y al desarrollo temprano del embrión.

Debido a las dificultades para obtener rhZP3 adecuada que pueda usarse en tales ensayos, la mayor parte del trabajo se ha realizado con genes de otras especies. A pesar de los problemas, se sabe que la ZP3 humana, como la ZP3 de ratón, comprende aproximadamente un 50% de carbohidratos (es decir, entre el 40% y el 60% en peso de carbohidratos) y el polipéptido de 424 aminoácidos de longitud difiere de la secuencia de ratón en aproximadamente un tercio. También, se entiende de un modo general que tipos diferentes de células hospedadoras pueden glicosilar la hZP3 de forma distinta. Sin embargo, "es equivocado suponer que tales diferencias alterarían la actividad biológica de la rhZP3", como se ha resumido recientemente (Id. en la pág. 648).

Se necesitan grandes cantidades de hZP3 biológicamente activa para aplicaciones clínicas que aprovechan el evento crítico de la unión del espermatozoide a la zona pelúcida, para diagnosticar una condición clínica. Por ejemplo, un "ensayo de la hemizona" normalizado y controlado internamente comprueba este evento evaluando la capacidad de unión de los espermatozoides humanos a la zona pelúcida humana, como se describe en Burkman et al., Fertil. Steril. 49: 688-693 (1988) y Oehninger et al., Andrologia 24: 307-321 (992). Desgraciadamente, esta necesidad no puede ser satisfecha a partir de fuentes animales o a partir de la rhZP3 disponible en la actualidad. Por ello, se desea un procedimiento para obtener grandes cantidades de material de calidad reproducible con una o más propiedades biológicas de la hZP3, tanto para uso en investigación como para ensayos diagnósticos y productos farmacéuticos que requieren una proteína completamente activa.

Sumario de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un glicopolipéptido que tiene una o más propiedades biológicas de la hZP3. Es otro objeto proporcionar la proteína rhZP3 aislada y biológicamente funcional. Otro objeto más es proporcionar el glicopolipéptido rhZP3 que se une al espermatozoide humano y que tiene un uso diagnóstico y terapéutico relacionado con la fertilidad humana. Otro propósito es proporcionar métodos para comprobar la infertilidad masculina basados en la inducción de la reacción del acrosoma provocada por la unión de hZP3 biológicamente activa a materiales de muestras clínicas. Otro propósito más es proporcionar niveles elevados de hZP3 activa biológicamente de calidad consistente para ser usada en química clínica y de investigación.

Al lograr estos y otros objetivos, la invención proporciona un glicopolipéptido recombinante de aproximadamente 65 kD a aproximadamente 100 kD que comprende aproximadamente 50% de carbohidratos en términos de peso, y que puede unirse a espermatozoides humanos e inducir una reacción del acrosoma. La invención proporciona también un glicopolipéptido recombinante de aproximadamente 65 kD a aproximadamente 100 kD que comprende aproximadamente 50% de carbohidratos en peso, y que puede unirse a espermatozoides humanos e inducir una reacción del acrosoma, en donde el patrón de glicopolipéptido es producido por una célula que tiene una maquinaria de glicosilación similar a la de un ovocito. La invención proporciona además un procedimiento para producir un glicopolipéptido que tiene la actividad biológica de la proteína hZP3, que comprende las etapas de transfectar una célula de una línea celular ovárica con un gen que codifica un polipéptido hZP3, cultivar la célula para producir un cultivo de células productoras de hZP3, y aislar el glicopolipéptido.

La invención incluye también un método para detectar la infertilidad masculina a partir de una muestra de semen, que comprende las etapas de poner en contacto una solución de glicopolipéptido recombinante de aproximadamente 65 kD a aproximadamente 100 kD, que comprende aproximadamente 50% en peso de carbohidratos, y que puede unirse a espermatozoides humanos e inducir una reacción del acrosoma con los espermatozoides de la muestra para formar una mezcla, detectar la reacción del acrosoma y la lisis acrosomal en la mezcla, y comparar la cantidad de lisis acrosomal con un valor de referencia. La invención proporciona además una célula de una línea celular ovárica humana transformada, que comprende un gen de la rhZP3.

Otra realización de la invención es un glicopolipéptido transgénico que tiene una porción activa (es decir, una región de secuencia de aminoácidos glicosilada) que se une preferentemente al espermatozoide humano, en el que la porción activa tiene un tamaño de polipéptido de menos de 25 kDa, comprende una secuencia de aminoácidos que es más del 54% idéntica a la SEQ ID No: 1 y muestra un sitio de O-glicosilación predicho en la quinta posición a partir del término carboxilo. Otra realización más es un método para detectar la infertilidad masculina a partir de una muestra de espermatozoides, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto el glicopolipéptido transgénico que tiene una porción activa que se une preferentemente a espermatozoides humanos, en el que la porción activa tiene un tamaño de polipéptido de menos de 25 kDa, comprende una secuencia de aminoácidos que es más del 54% homóloga a la SEQ ID No: 1 y muestra un sitio de O-glicosilación predicho en la quinta posición a partir del término carboxilo, con espermatozoides de dicha muestra para formar una mezcla; (b) detectar actividad biológica de dichos espermatozoides en dicha mezcla; y (c) comparar la actividad biológica con un valor de referencia. Otra realización más es un vector de ácidos nucleicos útil para producir un glicopolipéptido, el glicopolipéptido se une específicamente a espermatozoides humanos, en donde el vector codifica una secuencia de aminoácidos que es más del 54% homóloga con la SEQ ID No: 1. Otra realización más es una célula humana que contiene un vector de ácidos nucleicos útil para producir un glicopolipéptido de menos de 200 aminoácidos de longitud, en el que el glicopolipéptido se une específicamente a espermatozoides humanos, y el vector codifica una secuencia de aminoácidos que es más del 75% idéntica a la SEQ ID No: 1.

Descripción de las figuras

La figura 1 es la secuencia de aminoácidos para los restos 308 a 348 de la ZP3 humana (SEQ ID No: 1).

La figura 2 es un resumen representativo de predicción de sitios de O-glicosilación en la región de los aminoácidos 308-348 de la ZP3 humana (SEQ ID No: 1).

La figura 3 es un resumen representativo de predicción de sitios de O-glicosilación en la región de los aminoácidos 309-349 de la ZP3 de ratón (SEQ ID No: 2).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Los presentes inventores han descubierto que las diferencias específicas del tejido y específicas de la especie en el patrón de glicosilación de la proteína hZP3, y más en particular el papel de los restos 308 a 348, afectan en gran medida a la actividad biológica de esta proteína. A partir de este descubrimiento, los presentes inventores han desarrollado un sistema de expresión celular que usa la maquinaria de glicosilación ovárica para glicosilar apropiadamente la hZP3. Los inventores han desarrollado también glicopolipéptidos que se unen al espermatozoide humano. En el presente contexto, "glicosilado apropiadamente" quiere decir dar un patrón de glicosilación que es similar al del ovocito humano (es "humano-funcional") de forma que el glicopolipéptido tenga actividad biológica (es decir, unión específica con el ovocito) con el espermatozoide humano. Usando el presente sistema, los presentes inventores han aislado por primera vez rhZP3 que, a diferencia de la rhZP3 anterior, es totalmente activa biológicamente y contiene carbohidrato, que se parece más estrechamente a la proteína del ovocito humano en comparación con la rhZP3 conocida con anterioridad. Los presentes inventores han desarrollado también un ensayo que utiliza el glicopolipéptido recombinante biológicamente activo para diagnosticar causas de la infertilidad masculina. Además, los presentes inventores han descubierto usos terapéuticos de rhZP3 y glicopolipéptidos de rhZP3 menores que rhZP3 que no han sido llevados a cabo antes.

Basándose en su conocimiento del papel de los restos 308 a 348 de la hZP3 en la especificación de la glicosilación del ovocito humano, los presentes inventores han descubierto glicopolipéptidos biológicamente funcionales alternativos que simulan la unión del ovocito humano al espermatozoide humano. La expresión "glicopolipéptidos biológicamente funcionales" en este contexto significa un polipéptido que comprende al menos el segmento de aminoácidos que tienen la secuencia SEQ ID No: 1 y que se une al espermatozoide humano mejor que al espermatozoide murino. Preferentemente el polipéptido comprende además carbohidrato que ha sido añadido por una célula humana durante la síntesis del polipéptido. Más preferentemente, la célula humana es de una línea celular del ovario o el folículo. En una realización, la línea celular es una línea de células de mamífero no ováricas (y preferentemente humanas) que ha sido alterada genéticamente para la inducción y/o la estimulación de enzimas de glicosilación del ovocito. En este contexto, la producción a gran escala de pequeños glicopolipéptidos de menos de 200 aminoácidos que tienen una identidad de secuencia de más del 54% y preferentemente más del 75% con la SEQ ID No: 1 permite nuevos usos tales como, por ejemplo, la anticoncepción, en la que el glicopolipéptido interfiere la fertilización normal.

Los presentes inventores han descubierto que la especificidad biológica de la rhZP3 procede predominantemente de la porción de carbohidrato de esta sección de la hZP3. Más concretamente, los presentes inventores han descubierto que la rZP3 humana hecha por líneas de células ováricas no humanas, tales como la línea de células de CHO, aun teniendo la misma secuencia de aminoácidos que la ZP3 humana, no son activas con huevos humanos debido a su componente de carbohidrato. Por ejemplo, la eliminación del carbohidrato de la hZP3 por una glicosidasa elimina la actividad biológica de la hZP3. Las diferencias precisas en la glicosilación pueden determinarse haciendo primero una hZP3 que tiene actividad biológica completa. Después, la porción de carbohidrato del glicopéptido puede ser alterada parcialmente o eliminada. Después de la alteración se ensaya el glicopéptido para ver si conserva actividad completa con huevos humanos.

El conocimiento por los autores de las sutiles diferencias bioquímicas entre ZP3 humana y de ratón que explican directamente la discriminación entre especies de esta proteína, proporciona nuevos útiles y técnicas tanto para crear como para usar glicopolipéptido glicosilado para diagnósticos y terapias relacionados con la fertilidad humana. Más concretamente, la secuencia primaria de ZP3, en contra de muchas opiniones mantenidas, se dirige a una glicosilación diferente que, junto con la maquinaria de glicosilación única y relacionada, específica de la especie y específica del tejido, en el ovocito humano, proporciona un patrón de glicosilación único del ovocito humano. Así, un aspecto de la invención es el descubrimiento de que la glicosilación del ovocito específica humana en ovocitos humanos importa realmente cuando se expresa la proteína ZP3. Otro aspecto de la invención es que la secuencia de aminoácidos dentro de los restos 308 a 348 de ZP3 afecta y dirige la glicosilación del ovocito específica humana, siendo específica de la especie. Otro aspecto más de la invención es que pueden hacerse cambios a esta secuencia específica de acuerdo con características predictivas de un algoritmo diseñado específicamente para observar el efecto de la secuencia sobre la probabilidad de O-glicosilación dentro de esa secuencia.

El descubrimiento de una región de unión especifica de la especie dentro de hZP3 proporciona la capacidad de mejorar la potencia de los glicopolipéptidos que imitan la o las actividades biológicas de la hZP3. Así, otro aspecto de la invención es que puede expresarse un glicopolipéptido más pequeño, que comprende menos de 400 aminoácidos, que tiene la capacidad de unión de la ZP3 humana en virtud de la presencia de una región activa que es glicosilada en un patrón humano-funcional (es decir, con carbohidrato similar al humano adecuado para la función específica de la especie con espermatozoides humanos). El carbohidrato específico similar al humano útil en este contexto se caracteriza y se explica, por ejemplo, en Clark et al., Human Reproduction 11: 467-473 (1996); Clark et al., Molecular Human Reproduction 2: 513-517 (1996); Patankar et al., Molecular Human Reproduction 3: 501-505 (1997); y Ozgur et al., Molecular Human Reproduction 4 (4): 318-324 (1998).

En realizaciones ventajosas el glicopolipéptido tiene una longitud entre 41 y 400 aminoácidos. Cuando se usa principalmente para la reacción de unión específica de la especie, el glicopolipéptido debe ser menor, tal como entre 41 y 300, o entre 50 y 200, o entre 50 y 150 e incluso entre 50 y 100 aminoácidos de longitud, para permitir más sitios de unión para una cantidad de material dada. Lo más ventajoso para reacciones de unión es un glicopolipéptido que comparta al menos un 54% de identidad de la secuencia, en particular más del 75% de identidad de la secuencia, y lo más en particular más de un 80% de identidad de la secuencia, con la SEQ ID No: 1, y que está entre 41 y 65 aminoácidos de longitud.

La glicosilación se lleva a cabo ventajosamente mediante expresión en células humanas (es decir, células que expresan enzimas de glicosilación humanas) y en particular se lleva a cabo mediante expresión en una línea de células ováricas o células foliculares humanas tal como PA-1. En otras realizaciones, el glicopolipéptido que contiene esta región, mostrada en la SEQ ID No: 1, puede ser de una longitud tan pequeña como 41 aminoácidos. Sin embargo, ventajosamente, puede hacerse un glicopolipéptido grande de hasta 200, 400 o incluso más aminoácidos de longitud, a partir de unidades repetidas de la porción de unión mostrada en la SEQ ID No: 1.

En el contexto del uso de la región específica de la especie, los presentes inventores descubrieron 3 parámetros. El primero, los restos 308 a 348 de ZP3 contienen información interespecies, y vectores de ácidos nucleicos que contienen los restos humanos 308 a 348 de ZP3 son particularmente útiles para hacer polipéptidos que tienen glicosilación humano-especifica. El segundo, los aminoácidos codificados por los restos 308 a 348 como se muestran en la SEQ ID No: 1, difieren de los de ZP3 encontrados en otras especies, en particular en la capacidad de las serinas para convertirse en O-glicosiladas por la maquinaria celular. El tercero, al contrario que la N-glicosilación, el patrón de la O-glicosilación predicha de las serinas carboxilo terminales de los restos 308 a 348 en péptidos o péptidos que comprenden la secuencia, afecta en gran medida a la glicosilación real de un polipépti-
do.

Los presentes inventores descubrieron que la secuencia de la ZP3 humana tiene un resto 344 de serina que es lo más probablemente glicosilada. En cambio una secuencia correspondiente a partir de otras especies tal como, por ejemplo, el ratón, muestra una probabilidad de O-glicosilación predicha muy diferente. Por ejemplo, el resto análogo (serina 345) en el ratón tiene una glicosilación predicha drásticamente menor y, en vez de ello, la serina 322 se mantuvo siendo la más probablemente glicosilada. Así, la técnica descubierta puede usarse para distinguir y predecir qué secuencias y modificaciones de secuencias pueden proporcionar una secuencia humana adecuada que se convierta en glicosilada en células humanas, y en particular células de una línea celular ovárica o folicular humana. Las Figuras 2 y 3 representan respectivamente parámetros predictivos de O-glicosilación. Como se observa en estas figuras, cuanto más alto es el valor potencial con respecto a su correspondiente valor umbral, tanto mayor es la probabilidad de que el aminoácido reaccione con una N-acetilgalactosaminiltransferasa. Más concretamente, el valor "potencial" es una medida relativa de si el resto designado debe ser O-glicosilado. El valor "umbral" es una medida relativa que se relaciona inversamente con la probabilidades de glicosilación.

Los presentes inventores puntualizan que la producción mostrada en las Figuras 2 y 3 refleja el conocimiento empírico obtenido a partir de proteínas encontradas en otras células no ováricas y es una medida relativa. Claramente este análisis indica que, basándose en la influencia de la secuencia en la glicosilación en otros sistemas, la glicosilación de los restos 308 a 348 de la ZP3 humana se dirige de forma primaria a la posición 344, mientras que la correspondiente secuencia de ratón tiene glicosilación dirigida a 13 posiciones hacia el lado terminal amino de ese resto de serina. Además, alterando la secuencia humana de manera que elimine esta propensión calculada para la O-glicosilación, disminuirá también la afinidad del polipéptido glicosilado para la superficie del espermatozoide humano. El análisis usado aquí puede usarse para derivar otras secuencias contempladas como invención. En particular, pueden hacer sustituciones de aminoácidos a restos en posiciones listadas en la Tabla 1, que preservan la glicosilación única específica de la especie humana del glicopolipéptido de la presente invención. Esta tabla expone aminoácidos representativos que, de acuerdo con al algoritmo, pueden ser sustituidos al tiempo que se mantiene el patrón único de glicosilación humano.

Para la mayoría de las posiciones, ejemplificadas por la posición 326, puede hacerse una sustitución de aminoácidos conservadora. Por sustituciones "conservadoras" se entiende reemplazar un resto de aminoácido con otro que es biológicamente y/o químicamente similar, p. ej. un resto hidrófobo por otro, o un resto polar por otro. Las sustituciones incluyen combinaciones tales como Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. Preferentemente, la porción de la secuencia que se pretende que imite sustancialmente al péptido de la SEQ ID No: 1 diferirá menos del 50% de la SEQ ID No:1, excepto cuando pueden añadirse aminoácidos adicionales en cualquier término.

Una considerable cantidad de trabajo en esta área ha proporcionado algoritmos que pueden usarse para hacer tales cambios. Por ejemplo, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir función biológica interactiva en una proteína se conoce en la técnica de un modo general, como se menciona en la patente de EE.UU. nº 5.703.057. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria del péptido resultante, que a su vez define la interacción del péptido con otras moléculas, por ejemplo receptores, DNA, glicosidasas, y similares. A cada aminoácido se la ha asignado un índice hidropático sobre la base de sus características de hidrofobicidad y carga; estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

En la técnica se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen una puntuación o índice hidropático similar, con el resultado de un péptido que tiene una actividad biológica similar, es decir, obteniendo aún un péptido con una funcionalidad biológica equivalente. Al hacer tales cambios, se prefiere la sustitución de los aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de \pm2, siendo particularmente preferidos los que están dentro de \pm1, y siendo incluso más particularmente preferidos los que están dentro de \pm0,5. También se sabe en la técnica que puede hacerse la sustitución de aminoácidos similares efectivamente sobre la base de la hidrofilicidad. La patente de EE.UU. nº 4.554.101, por ejemplo, establece que la hidrofilicidad media local más alta de una proteína, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente de EE.UU. nº 4.554.101, los siguientes valores de hidrofilicidad han sido asignados a los restos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 \pm 1); glutamato (+3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5);
cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina(-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).

Se sabe que puede sustituirse un aminoácido por otro que tenga un valor similar de la hidrofilicidad, y seguirse obteniendo un péptido biológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro del intervalo \pm2, se prefieren particularmente los que están dentro del intervalo \pm1, y se prefieren incluso más particularmente los que están dentro del intervalo \pm0,5. Como se señaló antes, las sustituciones de aminoácidos están por ello basadas generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral del aminoácido, por ejemplo su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y propiedades similares. Los ejemplos de sustituciones que tienen en cuenta varias de las características precedentes son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. En el caso presente, los inventores han descubierto que, con la excepción de las sustituciones mostradas en la Tabla 1, las serinas en la SEQ ID No: 1 no pueden ser sustituidas debido a su papel en la glicosilación.

Un glicopolipéptido "biológicamente funcional" o rhZP3, en el contexto de la presente invención, significa que el polipéptido (que contiene como mínimo los aminoácidos 308 a 348 y derivados funcionales de los mismos) o la ZP3 (si se hace la proteína completa), se unen a los espermatozoides cuando están presentes en una concentración inferior a 1 \mug/ml, e inducen una reacción del acrosoma en aproximadamente una hora a partir de la unión. Ventajosamente, la rhZP3 se une cuando está presente en una concentración por debajo de 0,1 \mug/ml, y lo más ventajosamente cuando está presente en una concentración de 0,01 \mug/ml a 0,1 \mug/ml. El tiempo de la reacción del acrosoma puede ser inferior a 1 hora o incluso inferior a 30 minutos. Esta unión de la proteína ZP3 a los espermatozoides es específica de la especie y puede usarse también para detectar deficiencias en los espermatozoides que justifiquen la infertilidad
masculina.

Una "línea de células ováricas", como se denomina en el presente texto, significa una línea celular humana de tejido de ovario, de forma que las células de esta línea producen glicopolipéptido que tiene carbohidrato característico de los glicopolipéptidos del ovocito. Un patrón de carbohidrato de glicopolipéptido similar al ovocito puede ser comparado con un patrón de carbohidrato de glicopolipéptido no similar al ovocito por uno cualquiera entre varios métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Los métodos para comparar patrones de glicopolipéptidos en el contexto usado anteriormente incluyen, por ejemplo, el uso de anticuerpos monoclonales, como describe Barbosa para detectar cambios en la porción carbohidrato del glicopéptido de HLA, usando mutagénesis dirigida a oligonucleótido, técnicas de transferencia génica (Barbosa et al., J. Exp. Med. 166: 1329-50 (1987)) y métodos bioquímicos más recientes para establecer directamente el contenido de carbohidrato.

Otro método que puede usarse para comparar directamente si un glicopolipéptido recombinante tiene un patrón de glicosilación correcto es determinar si el glicopolipéptido puede bloquear la unión del espermatozoide a ovocitos nativos en un "ensayo de la hemizona". En condiciones normales sin el glicopolipéptido, los espermatozoides se unen a los ovocitos. Sin embargo, cuando se incuba con los espermatozoides el glicopolipéptido que tiene glicosilación de ovocitos adecuada, el glicopolipéptido se unirá primero al espermatozoide e impedirá que el espermatozoide prosiga la unión o reacción con el ovocito. En cambio, si el glicopolipéptido carece de un patrón de glicosilación correcto, el glicopolipéptido no bloqueará la unión del espermatozoide con el ovocito.

Otro método más para determinar si un glicopolipéptido posee un patrón de glicosilación correcto es eliminar las cadenas laterales de carbohidrato del glicopolipéptido con péptido N-glicosidasa F y O-gliconasa, y después incubar los productos de reacción con espermatozoides. Si el preparado de glicopolipéptido puede bloquear la unión del espermatozoide a un ovocito humano antes de la digestión, pero no después de la digestión, entonces el preparado no digerido posee un patrón de glicosilación correcto.

Una "proteína 3 recombinante de la zona pelúcida humana" significa una proteína transgénica (o proteína nativa bajo el control de un elemento de control transgénico) que comprende al menos parte del gen de hZP3 y que conserva sustancialmente toda la actividad del glicopolipéptido de hZP3. "Sustancialmente toda" significa que la proteína muestra actividad de unión y estimulación de la reacción del acrosoma cuando está presente junto con espermatozoides en solución acuosa a una concentración inferior a aproximadamente 1 \mug/ml (p. ej 1 \mug/ml), y en particular inferior a aproximadamente 0,1 \mug/ml (p. ej 0,1 \mug/ml), durante un periodo de tiempo inferior a aproximadamente 1 hora (p. ej. 1 hora) y en particular inferior a aproximadamente 30 minutos (p. ej. 30 minutos).

Las secuencias de DNA útiles para la expresión de la proteína transgénica hZP3 completa son conocidas por los profesionales con experiencia en la técnica y se derivan de la secuencia conocida de 424 aminoácidos de hZP3, que está descrita por Chamberlin y Dean, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 6014-6018 (1990). La transducción de células desde una línea de células ováricas con tal secuencia puede realizarse por métodos conocidos. Generalmente se usa una construcción de DNA que contiene un promotor secuencia arriba del gen estructural que codifica la secuencia de proteína deseada. Se describen promotores adecuados, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.618.698. De acuerdo con esta realización, son transducidos a la célula hospedadora tanto un gen estructural de rhZP3 como un elemento regulador para controlar el gen.

De acuerdo con otra realización de la invención, una célula de una línea celular ovárica es transducida ex vivo con un DNA que comprende un promotor y un DNA homólogo (pero no un gen estructural intacto) que puede enlazarse con un gen endógeno dentro del núcleo de la célula y funcionar con él (es decir, conectar o aumentar la expresión). En esta realización, el DNA que comprende una secuencia reguladora, un exón y un donador de ayuste, se introducen en una célula mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula en el sitio preseleccionado. La introducción de este DNA tiene por resultado la producción de una nueva unidad de transcripción en la que la secuencia reguladora, el exón y el sitio donador de ayuste están unidos operativamente al gen endógeno.

La expresión "unidos operativamente" se refiere a una primera secuencia (o secuencias) que está situada suficientemente próxima a una segunda secuencia (o secuencias) de manera que la primera secuencia (o secuencias) puede ejercer influencia sobre la segunda secuencia (o secuencias) o una región bajo el control de esa segunda secuencia. Por ejemplo, una secuencia reguladora puede estar unida operativamente a un promotor, con lo que esta secuencia potencia la fuerza transcripcional del promotor. En esta situación, la secuencia reguladora sería típicamente 5' respecto del promotor. La secuencia reguladora y el promotor pueden, a su vez, unirse operativamente a un gen de forma que el gen se exprese bajo el control de la combinación de secuencia reguladora/promotor, que sería típicamente 5' respecto del gen.

La introducción de DNA viene seguida típicamente por la selección de células que han recibido un promotor en la posición deseada para conectar el gen deseado. La metodología de la selección aplicable se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. números 5.641.670 y 5.272.071. Las técnicas de selección se describen también en Mansour et al., Nature 136: 348, 349 (1988). Después de la selección, se cultivan las células que expresan el gen deseado y se recolecta el producto génico expresado.

De acuerdo con realizaciones preferidas, la secuencia de DNA útil para la expresión transgénica de hZP3 codifica una molécula de proteína más corta (polipéptido) (es decir, un polipéptidfo inferior a 25 kDa, en particular un polipéptido menor que 10 kDa, y más en particular menor que 5 kDa). Tales secuencias de proteína preferidas incluyen una región de núcleo como se muestra en la SEQ ID No: 1. Los presentes inventores comprobaron que la SEQ ID No: 1 es el determinante más importante con respecto al patrón de glicosilación inter-especies de la ZP3 y que una pequeña proteína que tiene esta secuencia, para una masa dada, será particularmente potente en la unión del espermatozoide. La SEQ ID No: 1 es un 54% homóloga con la correspondiente secuencia de ZP3 de ratón. Por "homóloga" se entiende que, cuando se comparan las dos secuencias, el 54% de los aminoácidos son los mismos. A pesar de la homología, la ZP3 de ratón tiene una pequeña cantidad de unión con el espermatozoide humano, aunque esta afinidad es menor que una décima, y típicamente menor que una centésima del nivel observado con la ZP3 humana. La expresión "puede unirse intensamente a los espermatozoides humanos" se usa en el presente texto para indicar la unión que está en un nivel de aproximadamente 10 veces (p. ej. 10 veces) la intensidad de una cantidad molar equivalente de ZP3 de ratón. En la práctica, tal determinación cualitativa se lleva a cabo incubando diferentes concentraciones de material en un ensayo de unión y determinando la unión directa o indirectamente por competición. Tales ensayos de unión se ejemplifican en los ejemplos del presente texto y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Así, una secuencia de péptidos que difiere de la ZP3 humana en hasta un 46%, mantiene alguna actividad residual de unión con el espermatozoide humano que es más fuerte que la de la cantidad molar equivalente de ZP3 de ratón. En consecuencia, un péptido de acuerdo con una realización es más del 46% idéntico a la secuencia de la ZP3 humana mostrada en la SEQ ID No: 1. Además, se prefiere que cualquier desviación de esta secuencia esté limitada a las posiciones 3, 8, 13, 16, 17, 19, 21-23, 25, 27, 28, 30, 32-35, 38 y 39 (posiciones listadas en la Figura 1) ya que las posiciones no listadas son más conservadas.

En otra realización la secuencia es idéntica a los al menos 11 aminoácidos en el extremo del terminal carboxilo de la porción representada en la Figura 1. Esto es porque la serina en el medio de esta secuencia es particularmente importante para la glicosilación humana específica.

En otra realización más, la invención es un vector reactivo de ácido nucleico que comprende una secuencia de DNA que codifica la SEQ ID No: 1. Tal vector es ventajosamente un vehículo para el suministro de una secuencia génica para la expresión de la actividad de unión de ZP3. En una realización el vector comprende los restos 308 a 348 pero le falta el resto del gen de codificación de ZP3. La construcción de un vehículo así es conocida por los expertos en la técnica como se describe, por ejemplo, en las referencias citadas en el presente texto. De acuerdo con esta última realización, se contempla un polipéptido glicosilado útil para diagnóstico y productos farmacéuticos relacionados con efectos sobre la unión del espermatozoide y la fertilidad humana, que está hecho de un vector que comprende los restos humanos 308 a 348 u otro DNA que codifica la SEQ ID No: 1.

La expresión "análogo de rhZP3" se refiere a mutantes de hZP3 y derivados alterados químicamente que tienen los atributos bioquímicos y biológicos de la rhZP3 nativa listados anteriormente. En particular, en la presente invención se contemplan cambios en la secuencia de aminoácidos de la hZP3. La hZP3 puede ser alterada cambiando el DNA que codifica la proteína. Preferentemente, se realizan solamente alteraciones conservadoras de los aminoácidos, usando aminoácidos que tienen las mismas o similares propiedades, y los sitios de reconocimiento de la glicosilación no son alterados, como se describió antes.

Adicionalmente, pueden usarse otras variantes y especies derivatizadas de hZP3 en la presente invención. Las variantes incluyen análogos, homólogos, derivados, muteínas y miméticos de hZP3 que conservan la capacidad de unirse a los espermatozoides e inducen la reacción del acrosoma. Los fragmentos de la hZP3 se refieren a porciones de la secuencia de aminoácidos de hZP3 que también conservan esta capacidad. Las variantes y fragmentos pueden generarse directamente a partir de la propia hZP3 por modificación química, por digestión con enzimas proteolíticas o por combinaciones de las mismas. Adicionalmente, pudo llevarse a cabo la construcción por ingeniería genética de líneas de células no ováricas para alterar su maquinaria de glicosilación proteica para emular la del ovocito, para permitir la expresión de la proteína hZP3 en células no ovocitos.

También pueden crearse variantes y fragmentos (es decir, análogos) de rhZP3 por técnicas recombinantes empleando métodos de clonación genómica o de cDNA. Pueden emplearse técnicas de mutagénesis específica del sitio y dirigida a una región. Véase CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol. 1, cap. 8 (Ausubel et al., Eds., J. Wiley and Sons 1989 y Sup. 1990-93); PROTEIN ENGINEERING (Oxender and Fox Eds., A. Liss, Inc. 1987). Además, pueden emplearse técnicas de rastreo de enlazador y mediadas por PCR para la mutagénesis. Véase PCR TECHNOLOGY (Erlich Ed., Stockton Press 1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol. 1 y 2., supra. Los planteamientos de secuenciación, estructura y modelado de proteínas para su uso con cualquiera de las técnicas anteriores se describen en PROTEIN ENGINEERING, loc. cit., y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol. 1 y 2., supra. Una variante preferida en este contexto es una secuencia de 424 aminoácidos de hrZP3 que tiene seis aminoácidos histidina añadidos al extremo amino terminal. La porción añadida permite una purificación más cómoda de la proteína sintetizada por afinidad, con resina de afinidad
Ni-NTA.

La proteína hZP3 recombinante hecha por células cultivadas de acuerdo con la presente invención puede ser purificada por varias técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Un método preferido es recoger medio de cultivo de las células que hacen la proteína rhZP3 y después purificar esta proteína mediante cromatografía de afinidad. Se prefiere para la cromatografía de afinidad una columna de lectina, en particular una columna de aglutinina de germen de trigo. También se prefiere usar resina de afinidad Ni-NTA y eluir la proteína desde esta resina a pH bajo, en combinación con un análogo de rhZP3 tal como el mencionado antes, que tiene una porción de poli-histidina.

La presente descripción permite la expresión a gran escala de glicopolipéptido hZP3 biológicamente activo por métodos de DNA recombinante. Mediante ella el glicopolipéptido puede ser obtenido en forma aislada por métodos recombinantes conocidos. El término "aislado" en el contexto de las proteínas denota un grado de purificación tal que la hZP3 está libre de otras proteínas humanas que se encuentran con hZP3 en su contexto nativo. Preferentemente la proteína aislada estaría en forma homogénea, esto es, en forma apta para la secuenciación de proteínas en un secuenciador en fase gas, que está disponible de fabricantes tales como Applied Biosystems, Inc. Las técnicas para obtener esta homogeneidad después de la producción recombinante incluyen SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico, electroforesis cromatográfica, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión en gel, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación y combinaciones de las mismas.

"Purificar" indica un grado de separación que es superior al del aislamiento. Una proteína "purificada" está suficientemente libre de otros materiales de forma que cualquier posible impureza no afecte indebidamente a las propiedades biológicas de la proteína ni produzca otras condiciones adversas.

La proteína pura o parcialmente purificada de la invención puede ser usada con muchas finalidades investigadoras y clínicas. Un uso preferido es para pruebas de fertilidad. En este caso, la rhZP3 se combina con una muestra de espermatozoides. La hZP3 recombinante se une entonces a los espermatozoides para producir una reacción del acrosoma y se detecta la reacción. Una diferencia detectable en la proporción de espermatozoides que reaccionan indica fertilidad o infertilidad masculina. Los espermatozoides de un varón fértil experimentarán con éxito reacciones del acrosoma a mayor velocidad que los espermatozoides de un varón infértil.

En un procedimiento preferido, el semen de un paciente y el semen testigo de un donante del que se sabe que posee espermatozoides adecuadamente funcionales, se dejan licuar a temperatura ambiente. Los espermatozoides móviles de cada muestra líquida se seleccionan mezclando el líquido con solución de proteína tamponada y después centrifugando, un periodo de incubación de algunos minutos para permitir nadar a los espermatozoides, y retirando la porción liquida superior. Los espermatozoides activos son expuestos preferentemente a 1-100 ng/ml de rhZP3 y más preferentemente a 5-10 ng/ml de rhZP3 durante al menos 5 minutos. Después de este tiempo, se determina el estatus del acrosoma comparando el esperma testigo con el del paciente por una cualquiera entre una serie de técnicas conocidas por los expertos en este campo.

Tanto la unión como la reacción del acrosoma pueden ensayarse detectando la actividad biológica de la rhZP3. Para los ensayos de unión, la rhZP3 se usa para detectar el estado inicial de la unión del espermatozoide a la zona pelúcida. En otras realizaciones, el reconocimiento y unión del una muestra de espermatozoides a la rhZP3 se ensaya directamente, bien sea en solución o después de inmovilizar la rhZP3 en un soporte sólido tal como Sephadex (TM) o una resina de agarosa. Estos ensayos funcionales evalúan la capacidad de unión de los espermatozoides y pueden usar (a) esferas conjugadas con rhZP3 (fase sólida) o (b) como parte de un ensayo de tipo ELISA, rhZP3 libre en solución (fase líquida). En este último caso, la zhZP3 se conjuga preferentemente con otro resto que puede formar una señal en el ensayo. Los espermatozoides de individuos masculinos infértiles, y que carecen de la actividad de unión de ZP3, no se unirán a rhZP3 y de esta forma pueden ser diagnosticados e identificados.

Los ensayos de la reacción del acrosoma enlazan típicamente uno de los factores de infertilidad masculina con una incapacidad de los espermatozoides para experimentar la reacción del acrosoma, una fase importante que contribuye a la penetración del espermatozoide en el huevo. Una realización preferida en este contexto es la tinción diferencial y recuento visual de las células totales y células empobrecidas en acrosoma después del tratamiento con hrZP3. La etiología de un paciente puede ser determinada si los espermatozoides del paciente responden al tratamiento con rhZP3. Esta respuesta puede detectarse, por ejemplo, mediante técnicas de inmunofluorescencia que son conocidas por los expertos en este campo.

En otra realización, la presente invención se refiere a líneas de células ováricas humanas, cuyas células contienen DNA que codifica ZP3 transfectada. Los tipos de células adecuadas incluyen, pero sin limitarse a ellas, células de los siguientes tipos: EB_{2} (células ováricas humanas, ATCC), CaoV-3, CaoV-4, OVCAR-3, SZ-OV-3, SW 626 (ovario humano, carcinoma, ATCC). Tales células se describen, por ejemplo, en el Cell Line Catalog (catálogo de líneas celulares) de la American Type Culture Collection (ATCC). La transferencia de genes a células de mamífero para producir una línea celular "transfectada", ha sido bien descrita en la técnica. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., Introduction of DNA into Mammalian Cells, en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, secciones 9.5.1 a 9.5.6 (John Wiley and Sons, Inc. 1995).

En otra realización, la invención proporciona usos terapéuticos de rhZP3 como "estimulante del espermatozoide de cebado" en la terapia de inseminación intrauterina ("IUI"). En este procedimiento, se emplea un procedimiento de flotado para preparar los espermatozoides. Los presente inventores han descubierto que incubando estos espermatozoides con rhZP3 antes de este procedimiento de flotado se estimula la reacción del acrosoma en algunos de los espermatozoides y con ello se ejerce un efecto de cebado en la muestra de esperma. Este efecto de cebado permite que el esperma tratado responda más eficazmente a los reguladores de la movilidad y de la reacción del acrosoma dentro del aparato reproductor femenino.

En esta realización terapéutica, los espermatozoides se incuban con una dosis de rhZP3 que previamente ha demostrado que produce un estimulación moderada de la reacción del acrosoma. Estimulación moderada, en este contexto, significa que la reacción es estimulada en aproximadamente un 10-15 por ciento de los espermatozoides en una muestra dada. La etapa de incubación preferentemente es durante al menos 30 minutos y viene seguida por una etapa de lavado y el procedimiento de flotado.

En otra aplicación terapéutica, la rhZP3 se usa para estimular la reacción del acrosoma antes de la terapia de inyección intracitoplásmica de los espermatozoides (ICSI: IntraCytoplasmic Sperm Injection). El uso de rhZP3 en este caso puede beneficiar a la fertilización, por ejemplo, incrementando la velocidad de fertilización exitosa. Preferentemente, la rhZP3 se añade a una suspensión de espermatozoides y después es lavada de esta suspensión antes de poner un espermatozoide en un ovocito. En este caso, la rhZP3 se usa en concentración elevada para asegurar que una proporción máxima del esperma tratado experimenta una reacción del acrosoma.

La presente invención se describe con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos, que no limitan el alcance de la invención reivindicada.

Ejemplo 1 Transcriptasa inversa-Reacción en cadena de polimerasa de cDNA de hZP3

Se diseñaron un par de cebadores (cebadores A y B) a partir de la secuencia publicada de hZP3. Chamberlin y Dean, supra. El cebador A se sitúa en el extremo 5' del cDNA de hZP3 a partir de las bases 8 a 29 como 5' ACCATG
GAGCTGAGCTATAGG 3' (SEQ ID NO: 3). El cebador B se sitúa en el extremo 3' del cDNA de hZP3 a partir de las bases 1256 a 1282 como 5' TTCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGATGATCGGAAGCAGACACAGGGTG GGAGGCAGT 3'(SEQ ID NO: 4). Una secuencia en un sitio de restricción XhoI (CTCGAG) y una secuencia que codifica 6 restos de histidina se añadieron al extremo 3' del cebador B con el propósito de subclonar el cDNA en el vector de expresión así como para la purificación de la hZP3 del medio.

Se aisló un extracto de RNA total a partir de tejido de ovario humano. Se llevó a cabo la RT-PCR y se usó RT-PCR como "método estándar" descrito por Perkin Elmer Cetus (Foster City, CA). Se obtuvo un fragmento de DNA de 1315 pares de bases que comprende la longitud completa del cDNA de hZP3 con un cola de 6 histidinas y un sitio de restricción XhoI mediante amplificación por PCR del cDNA de la primera hebra a partir del mRNA ovárico.

Ejemplo 2 Subclonación de cDNA de hZP3 en vector de expresión pcDNA 3.1(+)

El producto de la RT-PCR del Ejemplo 1 fue separado mediante electroforesis en gel de agarosa y purificado con un kit Geneclean II (BLO 101, Vista, CA) después de recortar el producto de DNA de 1315 pb. El fragmento de RT-PCT purificado fue insertado en un vector de expresión de mamífero, pcDNA 3.1(+) (Invitrogen, San Diego, CA) que puede expresar niveles elevados de proteína recombinante en células de mamífero y también contiene un gen resistente a la neomicina para la selección. El vector pcDNA 3.1 (+) con cDNA de hZP3 fue transformado en células de E. coli. Los clones positivos se identificaron por cartografiado de restricción, análisis de transferencia southern y secuenciación de DNA.

El análisis de secuencia de DNA de cDNA de hZP3 reveló que la secuencia de cDNA de hZP3 es idéntica a la publicada por Chamberlin y Dean, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 6014-6018 (1990). Para determinar si el cDNA de hZP3 podía ser traducido en un hZP3 recombinante de longitud completa, se llevó a cabo la traducción in vitro (Promega, Madison, WI). El análisis por SDS PAGE de los productos de la traducción in vitro reveló que el cDNA de hZP3 producía solamente una proteína de 47 kd. Se determinó que esta proteína de 47 kd representa la forma de longitud completa de la hZP3 recombinante.

Ejemplo 3 Introducción estable de rhZP3 en células PA-1

La construcción hZP3/pcDNA3.1 (+) fue introducida en células de una línea celular ovárica "PA-1" por el método del fosfato cálcico. La selección de las células que tienen un gen exógeno integrado establemente se llevó a cabo con neomicina 200 uM (Sigma, St. Louis, MO). La integración de hZP3 en el DNA genómico de la célula hospedadora fue identificada por PCR y transferencia southern. En el análisis por PCR, la integración de la construcción hZP3/pcDNA3.1 (+) fue identificada usando un cebador específico que está situado en el vector pcDNA3.1 (+) (cebador T7, Invitrogen) con el cebador B, que está situado en el extremo 3' de hZP3. Se obtuvo un producto esperado solamente en células transfectadas establemente pero no en células PA-1 no transfectadas, indicando el éxito de la integración en el cromosoma de la célula PA-1.

La expresión de hZP3 recombinante fue detectada mediante análisis RT-PCR y de transferencia western. El análisis RT-PCR del mRNA de células PA-1 transfectadas establemente y células PA-1 no transfectadas con cebador A y B, reveló que se observaba un producto de amplificación por PCR solamente en las células transfectadas establemente. El medio de cultivo fue recolectado de ambos grupos de células, se concentró mediante vacío rápido y se analizó mediante SDS-PAGE. Las muestras se transfirieron a la nitrocelulosa y se hibridaron con un anticuerpo policlonal de conejo (Ab5a) que puede reconocer la región conservada de hZP3. Se observó una señal hibridada solamente a partir de células PA-1 transfectadas y la proteína testigo solubilizada, indicando la expresión de rhZP3 a partir de las células transformadas establemente. Las células se almacenaron en nitrógeno líquido.

Experimento 4

Cultivo de las células PA-1 transfectadas establemente

Una muestra de células de 1 ml almacenada se sacó del nitrógeno líquido y se descongeló en un baño de agua a 37ºC durante dos minutos. Las células se suspendieron en 5 ml de MEM con 10% de FBS y se centrifugaron a 1000 x g durante 5 minutos. El sedimento celular se resuspendió en 10 ml de MEM con 10% de FBS y neomicina 200 uM, y después se cultivó en una placa de cultivo de 100 mm. Después de alcanzar un 90% de confluencia, las células se retiraron de la placa usando tripsina-EDTA (Sigma, St. Louis, MO) y se lavaron con medio MEM libre de suero. El sedimento celular se resuspendió en 60 ml de MEM con 10% de FBS y neomicina 200 uM y se cultivó en tres placas de cultivo de 150 mm. Después de alcanzar un 50% de confluencia, el medio de cambió de MEM/10% de FBS a medio de hibridoma libre de proteína. El medio se recogió cada 24 horas y se añadieron inhibidores de proteinasa (EDTA, leupeptina, pepstatina, PMSF) para proteger a las proteínas de la digestión proteolítica. Los medios recogidos se almacenaron a -20ºC hasta su uso.

Experimento 5

Purificación de hZP3 recombinante mediante cromatografía de afinidad

El medio recogido se descongeló a 37ºC y los glicopéptidos se purificaron mediante el paso a través de una columna de afinidad de WGA (2 x 4 cm). Después de aplicar el medio a la columna dos veces a una velocidad de flujo de 3 volúmenes de la columna por hora, la columna de WGA se lavó con PBS 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,2-7,5, hasta que la absorbancia a 280 nm del efluente descendió por debajo de 0,01. Los glicopolipéptidos se eluyeron con fosfato 40 mM y NaCl 0,15M a pH 3,0-3,1, que contenía N-acetil-D-glucosamina 0,5 M.

La proteína parcialmente purificada de la columna de cromatografía de afinidad de WGA se dializó con fosfato Na 50 mM, imidazol 10 mM y NaCl 300 mM durante la noche a pH 8,0 y a 4ºC, y después se cargó en una columna de Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA) a 3-4 volúmenes de la columna por hora. La columna se lavó con fosfato de Na 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10% a pH 7,8-8,0 hasta que la absorbancia del eluyente a 280 nm bajó por debajo de 0,01. Después la hZP3 se eluyó con fosfato de Na 200 mM, NaCl 300 mM, a pH 6,6. La proteína eluida se dializó con fosfato de Na 10 mM a pH 7,5 durante la noche a 4ºC. La proteína dializada se estudió mediante SDS PAGE transferencia western con un anticuerpo de hZP3. Se observaron bandas desde 65 kd a 100 kd, indicando la presencia de isoformas de hZP3.

Experimento 6

Purificación de rhZP3 hasta el 80% de pureza

Se usó cromatografía de agarosa-aglutinina de germen de trigo (WGA: Wheat Germ Agglutinin) (Vectoe Laboratories, Inc. Burlingame, CA) como primera etapa para aislar las glicoproteínas del medio de las células cultivadas. La agarosa-aglutinina de germen de trigo fue equilibrada con 10 veces el volumen de la resina de tampón para unión de WGA (PBS 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M). Los sobrenadantes recolectados se pasaron por la resina de WGA a una velocidad de flujo de 3 veces el volumen de la resina por hora en una sala fría a 4ºC. La resina se lavó con tampón para unión de WGA hasta que la absorbancia en línea a 280 nm fue inferior a 0,01. Las glicoproteínas que se unen a la resina de WGA se separaron en dos picos de elución con tampón para elución A (PBS 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, N-acetil-D-glucosamina 500 mM (Sigma)) y tampón para elución B (PBS 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, N-acetil-D-glucosamina 500 mM). Después de eluir las glicoproteínas de la resina, la resina se lavó con tampón para unión de WGA hasta que la absorbancia en línea a 280 nm fue inferior a 0,01, y después se siguió lavando con 5 veces el volumen de resina de tampón para almecenamiento de WGA [PBS 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, N-acetil-D-glucosamina 20 mM, 0,08% de azida sódica (Sigma)]. Las muestras de glicoproteína eluida se dializaron frente al tampón de unión de Ni-NTA (PBS 50 mM, pH 8,0; NaCl 300 mM) para la purificación por afinidad con Ni-NTA.

La glicoproteína señalada con histidina (rhZP3) fue purificada de la fracción de glicoproteína y aislada del medio de células cultivadas mediante cromatografía de afinidad de WGA, con resina de Ni-NTA (resina de ácido nitrilo-tri-acético) (Qiagen). Las proteínas que contienen una o más marcas de afinidad 6xHis, situadas en uno cualquiera de los terminales amino o carboxilo de la proteína, se unen a la resina de Ni-NTA con una afinidad (Kd = 10 13 a pH 8,0) mucho mayor que la afinidad entre la mayoría de los anticuerpos y antígenos, o suspensión al 50% de enzimas sustratos de resina Ni-NTA se transfirieron a la columna. Dos mililitros de resina se suspendieron completamente y después se lavaron con 5 veces el volumen de resina de H_{2}O. La resina se equilibró con 10 veces el volumen de la resina de tampón para unión de Ni-NTA. Las muestras de glicoproteína aislada con WGA que habían sido dializadas con tampón para unión de Ni-NTA se hicieron pasar a través de una columna de Ni-NTA equilibrada que contenía 1 ml de resina. La velocidad de flujo se ajustó en 3-4 veces el volumen de la resina por hora. Después de pasar la muestra de glicoproteína a través de la columna de Ni-NTA, la resina se lavó con 10 veces el volumen de la resina de tampón de unión de Ni-NTA que contenía Tween 20 (Fischer) y 2-mercaptoetanol, seguido por un lavado con tampón para lavado de Ni-NTA (PBS 50 mM, pH 6,6, NaCl 300 mM) hasta que la absorbancia en línea a 280 nm fue inferior a 0,01. Las glicoproteínas señaladas con histidina se eluyeron de la resina con tampón para lavado de Ni-NTA que contenía 40 mM de imidazol (Sigma).

La filtración con centricon 50 fue aplicada para eliminar proteínas co-purificadas que tienen pesos moleculares menores que 50 kD de las muestras de glicoproteína purificada con Ni-NTA. Se encontró que la glicoproteína rhZP3 era pura en un 80%, a juzgar por el barrido densitométrico de un gel de electroforesis de proteína teñida con azul Coomassie.

Experimento 7

Ensayo de la hemizona ("HZA") de la actividad biológica de los espermatozoides

Preparación de los ovocitos. Los ovocitos humanos inmaduros (profase I) se almacenaron en una solución hiperosmótica que contiene MgCl_{2} 1,5 M suplementada con tampón Hepes 40 mM a pH 7,3 y 0,1% de polivinilpirrolidona. Los ovocitos pudieron almacenarse hasta 90 días a 4ºC sin afectar al comportamiento del ensayo HZA. Antes de cortar, los ovocitos se lavaron en un medio de cultivo de Ham F-10 (Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y.). Se utilizaron micromanipuladores Narishige (Tokio, Japón) montados en un microscopio invertido con contraste de fases (Nikon Diaphot, Garden City, N.Y.) para cortar cada ovocito en dos mitades llamadas hemizonas.

Preparación de los espermatozoides y exposición a 30 ng/ml de rhZP3. Una parte alícuota de semen se lavó con 2 volúmenes de Ham F-10 suplementado con 5% de albúmina de suero humano ("HSA"). La suspensión de espermatozoides se centrifugó durante 8 minutos a 400 x g. Este lavado se repitió. El sedimento final se cubrió con 500 ul de HAM F-10/5% de HSA y se incubó durante una hora en presencia de 5% de CO_{2} a 37ºC. La suspensión de espermatozoides en HSA se retiró después y se dividió en dos porciones. Una porción se usó como testigo (4 horas a 5% de CO_{2}, 37ºC). La segunda porción se incubó bajo idénticas condiciones pero en presencia de 30 ng/ml de rhZP3. Los sobrenadantes que contienen espermatozoides móviles se retiraron y una gotita de 100 ul de cada uno se puso por separado en una placa petri sumergida en aceite mineral.

Incubación de los espermatozoides con las hemizonas. Una hemizona se pasó a la gotita testigo y su correspondiente hemizona se puso en la gotícula tratada con rhZP3. Los gametos se incubaron durante 4 horas a 5% de CO_{2}, 37%ºC. Después las hemizonas se aclararon en medio de cultivo, usando una pipeta de vidrio estirada fina para desalojar los espermatozoides fijados de forma precaria.

Resultados. El número de espermatozoides unidos firmemente a la superficie convexa de cada hemizona se determinó visualmente con un microscopio de contraste de fases a 200 aumentos. Para cada muestra se calculó un "índice de hemizona" como la relación percentil del número de espermatozoides unidos tratados con rhZP3 al número de espermatozoides testigo unidos y no tratados. El esperma defectuoso procedente de pacientes infértiles generará un índice de hemizona más bajo que el esperma normal, y puede ser detectado clínicamente de esta forma.

Experimento 8

Ensayo de inmunofluorescencia de la reacción del acrosoma

Se obtuvo semen de donantes normales y se dejó licuar durante 30-60 minutos a temperatura ambiente. El semen se dividió en partes alícuotas de 0,5 ml que se pusieron en el fondo de tubos de plástico de 15 ml. Cada parte alícuota se lavó con 2 volúmenes de HAM F-10 (Sigma) suplementado con 5% de albúmina de suero humano. La suspensión de espermatozoides se centrifugó durante 8 minutos a 400 x g. Este lavado se repitió una vez. El sedimento final se cubrió con 500 ml de Ham F10 con 5% de albúmina de suero humano. Los tubos se taparon sin apretar y se incubaron a un ángulo de 30º durante una hora a 37ºC en 5% de dióxido de carbono, dejando nadar a los espermatozoides desde el semen al medio.

Una muestra de aglutinina de Pisum satvum conjugada con isocianato de fluoresceína (PSA, Vector Lab., Burlingame, CA) fue usada para evaluar el estatus acrosomal de los espermatozoides en portaobjetos de mancha. Los mismos portaobjetos se tiñeron por contraste con colorante Hoechst, un colorante específico del DNA que entra en la membrana nuclear de los espermatozoides muertos, dando una tinción de contraste fluorescente. Se usó un microscopio epifluorescente para leer los portaobjetos de mancha a una potencia de 400 aumentos. Para el ensayo se hicieron portaobjetos por triplicado. Se evaluaron al menos 100 células por cada portaobjetos de mancha dentro de la rejilla del ocular del microscopio a partir de 10 campos elegidos al azar. Se asignaron dos investigadores experimentados para la lectura de los resultados, que se promediaron. Los resultados se expresaron como percentiles de espermatozoides con reacción del acrosoma en la población total recontada. Los espermatozoides que habían sido tratados con medio de cultivo de células del Experimento 4 que contenía hZP3 formaron significativamente más reacciones del acrosoma en comparación con los espermatozoides que habían sido tratados con un medio testigo (sin proteína hZP3).

Todas las publicaciones (incluyendo sitios web de internet) y patentes expedidas citadas en el presente texto se incorporan explícitamente al presente texto en su totalidad, como referencia.

<110> DONG, Ke-Wen

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OEHNINGER, Sergio

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GIBBONS, William, E.

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EASTERN VIRGINIA MEDICAL SCHOOL

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<120> RECOMBINANT, BIOLOGICALLY ACTIVE HUMAN ZONA PELLUCIDA PROTEIN 3 (Hzp3) TO TEST MALE INFERTILITY (Proteína 3 de la zona pelúcida humana (hZP3) recombinante biológicamente activa, para ensayar la fertilidad masculina)

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<130> 024754/0124

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<140> PCT/US99/03273

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<141> 19-02-1999

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<150> US 60/075.079

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<151> 19.02.1998

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<160> 4

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 41

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\sa{Ser Trp Phe Pro Val Glu Gly Pro Ala Asp Ile Cys Gln Cys Cys Asn}

\sac{Lys Gly Asp Cys Gly Thr Pro Ser His Ser Arg Arg Gln Pro His Val}

\sac{Met Ser Gln Trp Ser Arg Ser Ala Ser}

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<210> 2

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<211> 41

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<212> PRT

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<213> Ratón

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<400> 2

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\sa{Ser Trp Leu Pro Val Gln Gly Asp Ala Asp Ile Cys Asp Cys Cys Ser}

\sac{His Gly Asn Cys Ser Asn Ser Ser Ser Ser Gln Phe Gln Ile His Gly}

\sac{Pro Arg Gln Trp Ser Lys Leu Val Ser}

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<210> 3

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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accatggagc tgagctatag g

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21

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<210> 4

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<211> 62

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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ttctcgagtt aatgatgatg atgatgatga tgatcggaag cagacacagg gtgggaggca

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60

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gt

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62

Claims (21)

1. Un glicopolipéptido recombinante purificado, de 65 kDa 100 kD, que comprende aproximadamente 40% a 60% de hidrato de carbono en peso, y que puede unirse a espermatozoides humanos a una concentración de glicopolipéptido inferior a 1 \mug/ml e inducir una reacción del acrosoma en una hora desde la unión, en el que dicho glicopolipéptido es expresado por una línea de células ováricas humanas o una célula que tiene una maquinaria de glicosilación similar a la de un ovocito, y comprende una secuencia de aminoácidos que es más del 54% homóloga de la siguiente secuencia:

Ser Trp Phe Pro Val Glu Gly Pro Ala Asp Ile Cys Gln Cys Cys

Asn Lys Gly Asp Cys Gly Thr Pro Ser His Ser Arg Arg Gln Pro

His Val Met Ser Gln Trp Ser Arg Ser Ala Ser.

2. El glicopolipéptido según la reivindicación 1ª, en el que el glicopolipéptido es producido por una línea de células ováricas humanas.

3. Un procedimiento para producir el glicopolipéptido según la reivindicación 1ª, que comprende las etapas de:

(a) transducir una célula de una línea celular ovárica humana con un polinucleótido que codifica el glicopolipéptido según la reivindicación 1ª;

(b) establecer un cultivo celular transfectado estable para producir el glicopolipéptido; y

(c) aislar el glicopolipéptido del cultivo de células.

4. El procedimiento según la reivindicación 3ª, en el que la línea de células ováricas es PA-1.

5. Un procedimiento según la reivindicación 3ª, en el que el polinucleótido codifica un polipéptido que comprende un secuencia de ZP3 humana.

6. Un glicopolipéptido que comprende entre 41 y 400 aminoácidos que puede unirse a espermatozoides humanos a una concentración de glicopolipéptido inferior a 1 \mug/ml e inducir una reacción del acrosoma en una hora desde la unión, en el que dicho glicopolipéptido es expresado por una líneas de células ováricas humanas o una célula que tiene una maquinaria de glicosilación similar a la de un ovocito y comprende una secuencia de aminoácidos que es más del 54% homóloga de la secuencia siguiente:

Ser Trp Phe Pro Val Glu Gly Pro Ala Asp Ile Cys Gln Cys Cys

Asn Lys Gly Asp Cys Gly Thr Pro Ser His Ser Arg Arg Gln Pro

His Val Met Ser Gln Trp Ser Arg Ser Ala Ser.

y en la que el quinto resto de aminoácidos a partir del término carboxilo de dicha secuencia de aminoácidos de dicho glicopolipéptido está O-glicosilado.

7. El glicopolipéptido según la reivindicación 6ª, en el que dicho glicopolipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75% homóloga de la secuencia siguiente:

Ser Trp Phe Pro Val Glu Gly Pro Ala Asp Ile Cys Gln Cys Cys

Asn Lys Gly Asp Cys Gly Thr Pro Ser His Ser Arg Arg Gln Pro

His Val Met Ser Gln Trp Ser Arg Ser Ala Ser.

8. El glicopolipéptido según la reivindicación 6ª, que tiene entre 41 y 300 aminoácidos.

9. El glicopolipéptido según la reivindicación 6ª, que tiene entre 41 y 200 aminoácidos.

10. El glicopolipéptido según la reivindicación 6ª, que tiene entre 41 y 100 aminoácidos.

11. El glicopolipéptido según la reivindicación 6ª, que tiene entre 41 y 65 aminoácidos.

12. Un método para detectar la infertilidad masculina a partir de una muestra de espermatozoides humanos, que comprende las etapas de:

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(a) poner en contacto el glicopolipéptido según la reivindicación 1ª con espermatozoides de la muestra, para formar una mezcla;

(b) detectar la actividad biológica de los espermatozoides en la mezcla; y

(c) comparar la actividad biológica con un valor de referencia.

13. El método según la reivindicación 12ª, en el que la etapa (b) comprende además añadir aglutinina de Pisum satvum a la mezcla.

14. El método según la reivindicación 12ª, en el que el glicopolipéptido recombinante está inmovilizado sobre una fase sólida.

15. El método según la reivindicación 12ª, en el que el glicopolipéptido recombinante se hace mediante expresión en una línea de células ováricas humanas.

16. El método según la reivindicación 12ª, en el que la línea de células ováricas humanas es PA-1.

17. Una célula ovárica humana que contiene un vector de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1ª, y útil para producir el glicopolipéptido según la reivindicación 1ª, en la que la célula es capaz de producir el glicopolipéptido según la reivindicación 1ª.

18. El glicopolipéptido según la reivindicación 1ª, en el que el glicopolipéptido comprende la secuencia de aminoácidos siguiente:

Ser Trp Phe Pro Val Glu Gly Pro Ala Asp Ile Cys Gln Cys Cys

Asn Lys Gly Asp Cys Gly Thr Pro Ser His Ser Arg Arg Gln Pro

His Val Met Ser Gln Trp Ser Arg Ser Ala Ser.

19. Un procedimiento para preparar el glicopolipéptido según la reivindicación 18ª, que comprende las etapas de:

(a) transducir una célula de una línea de células ováricas humanas con un polinucleótido que codifica el glicopolipéptido según la reivindicación 18ª;

(b) establecer un cultivo de células transfectadas estables para producir el glicopolipéptido; y

(c) aislar el glicopolipéptido a partir del cultivo de células.

20. Un método para detectar la infertilidad masculina a partir de una muestra de espermatozoides humanos, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto el glicopolipéptido según la reivindicación 18ª con espermatozoides de la muestra, para formar una mezcla;

(b) detectar la actividad biológica de los espermatozoides en la mezcla; y

(c) comparar la actividad biológica con un valor de referencia.

21. Una célula ovárica humana que contiene un vector de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos según la reivindicación 18ª, y que es útil para producir el glicopolipéptido según la reivindicación 18ª.