ES2246563T3 - Proteina placentaria 13. - Google Patents
Proteina placentaria 13.Info
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Abstract
Una proteína o polipéptido recombinante seleccionado entre el grupo compuesto por: (a) proteína placentaria 13 (PP13) de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 2 (SEC ID Nº: 9); y (b) una proteína o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la secuencia de aminoácidos de (a).
Description
Proteína placentaria 13.
La presente invención se refiere a una proteína
placentaria y a sus usos.
La bibliografía a la que se hace referencia en el
texto con un número entre paréntesis se indica al final de la
memoria descriptiva.
El objetivo de un embarazo es el parto de un bebé
sano y maduro sin encontrar complicaciones que puedan afectar
adversamente al bienestar tanto de la madre como del recién nacido.
Un porcentaje significativo de embarazos se ven afectados por
diversos trastornos. Entre estas complicaciones se encuentran el
parto prematuro, retraso del crecimiento intrauterino y
preeclampsia. Estos estados afectan negativamente al resultado de
los embarazos afectados, ocasionando enormes costes tanto para los
pacientes como para el sistema sanitario.
La proteína placentaria 13 (PP13) es una proteína
que se aisló previamente a partir de tejido placentario humano
(documento U.S. 4.500.451 de Bohn, et al., cuyo contenido se
incorpora en este documento como referencia). La proteína se
caracterizó por los siguientes parámetros: movilidad
electroforética, punto isoeléctrico, coeficiente de sedimentación,
peso molecular determinado por ultracentrifugación, peso molecular
determinado por SDS-PAGE, coeficiente de extinción y
contenido de carbohidratos. Se determinó la composición de
aminoácidos (restos por 100 restos), pero no la secuencia de
aminoácidos.
PP13 se usó para desarrollar un ensayo para la
detección precoz de tres trastornos específicos relacionados con el
embarazo: retraso de crecimiento intrauterino, preeclampsia y parto
prematuro (documento U.S. 5.198.366 de Silberman). Se describen
tanto un radioinmunoensayo (RIA) como un inmunoensayo asociado a
enzimas (ELISA) que usan PP13 marcada y antisuero
anti-PP13 respectivamente. En la Patente de
Silberman no se describe ninguna propiedad adicional de PP13.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar una proteína PP13 pura.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar una molécula de ADN que codifique PP13.
Es otro objeto de la invención proporcionar un
método recombinante para producir PP13.
Además, es un objeto de la presente invención
proporcionar un ensayo de diagnóstico basado en PP13 para la
detección precoz de complicaciones del embarazo.
Es otro objeto de la invención proporcionar
péptidos inmunogénicos derivados de PP13 que puedan usarse en tal
ensayo de diagnóstico.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporciona una proteína o polipéptido seleccionado
entre el grupo compuesto por: (a) proteína placentaria 13 (PP13) que
tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 2 (SEC ID Nº:
9) y (b) una proteína o polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos que incluye la secuencia de aminoácidos de (a).
En otro aspecto de la presente invención, se
proporciona una molécula de ADN que codifica la proteína o
polipéptido anterior.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un método para investigar complicaciones
relacionadas con el embarazo, que comprende las etapas de:
- (a)
- proporcionar una muestra de suero de una mujer embarazada; (b) determinar el nivel de PP13 o un péptido derivado de la misma en la muestra de suero y (c) comparar el nivel determinado con niveles normales predeterminados para mujeres a la misma edad gestacional, siendo indicativa una desviación entre los niveles de una complicación relacionada con el embarazo.
En una realización de la invención, la
determinación de la etapa (b) se realiza por medio de anticuerpos,
preferiblemente anticuerpos monoclonales, dirigidos contra dichas
proteínas o polipéptidos.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un método recombinante para la producción
de PP13 que comprende insertar dicha molécula de ADN en un vector de
expresión, insertar el vector de expresión en una célula hospedadora
e incubar la célula hospedadora en condiciones que permitan la
expresión del vector insertado.
La presente invención proporciona por primera vez
la secuencia de aminoácidos completa de PP13, así como su secuencia
completa de ADNc. Esta información puede utilizarse en varias
aplicaciones. Por ejemplo, pueden producirse homólogos y análogos de
la proteína PP13 modificada en los que se hayan añadido, delecionado
o reemplazado uno o más aminoácidos, reteniendo típicamente la
proteína modificada un 75% de homología con PP13. Los métodos para
modificar la secuencia de aminoácidos de una proteína de la que se
conoce la secuencia completa son bien conocidos en la técnica e
incluyen, por ejemplo, síntesis química, mutagénesis controlada y
métodos recombinantes. Estas proteínas modificadas pueden tener
propiedades superiores a la PP13 natural en diversas aplicaciones,
tales como una mayor inmunogenicidad o inmunoespecificidad (por
ejemplo, la proteína modificada puede carecer de epítopos inmunes
comunes con otras proteínas) para uso en un inmunoensayo para la
detección precoz de trastornos relacionados con el embarazo como se
describen en Silberman.
Además, pueden prepararse fragmentos peptídicos a
partir de PP13 y estos péptidos pueden modificarse como se ha
descrito anteriormente con respecto a la proteína completa. Estos
péptidos también pueden usarse en diversas aplicaciones. Por
ejemplo, es bien conocido que las proteínas inmunogénicas tienen
secuencias de aminoácidos específicas o epítopos que inducen al
sistema inmune para montar una respuesta inmune a la proteína. Los
péptidos anteriores pueden ensayarse con respecto a la presencia de
un epítopo de PP13 para identificar el epítopo o epítopos. Después,
el péptido que contiene un epítopo puede usarse en un inmunoensayo
para trastornos del embarazo. Más adelante se describen varios
péptidos derivados de PP13.
La proteína PP13 pura o un péptido derivado
pueden usarse para preparar anticuerpos contra PP13. Pueden
producirse anticuerpos policlonales o monoclonales por métodos
convencionales bien conocidos para el especialista en la
técnica.
Tanto los anticuerpos como las proteínas y
péptidos pueden usarse para preparar ensayos de diagnóstico o
selección para la detección de complicaciones relacionadas con el
embarazo tales como retraso del crecimiento intrauterino, parto
prematuro y preeclampsia. Se detallan ejemplos de tales ensayos en
Silberman, cuyo contenido se incorpora en este documento como
referencia, e incluyen radioinmunoensayos (RIA) e inmunoensayos
asociados a enzimas (ELISA). En general, tal ensayo incluirá las
etapas de obtener una muestra de suero de una mujer embarazada,
determinar el nivel de PP13 o de un péptido derivado en la muestra
de suero por el inmunoensayo, y comparar el nivel determinado con
niveles normales predeterminados para mujeres a la misma edad
gestacional. Una desviación estadísticamente significativa entre los
niveles será indicativa de una complicación relacionada con el
embarazo.
Como se ha mencionado anteriormente, en este
documento se describe por primera vez el ADNc completo de PP13. Como
también se describe la secuencia de aminoácidos completa de PP13,
pueden prepararse diversas moléculas de ADN que codifican PP13
debido a la degeneración del código genético. Además, también pueden
prepararse moléculas de ADN capaces de hibridar con estas moléculas
de ADN en condiciones rigurosas. Las moléculas de ADN pueden usarse
en un método recombinante para la producción de PP13. Estos métodos
son bien conocidos en la técnica y normalmente implican insertar la
molécula de ADN en un vector de expresión tal como un ADN
plasmídico, de fago o viral. El vector de expresión después se
inserta en una célula hospedadora compatible, tal como células
bacterianas, o en células eucariotas tales como células de levadura,
vegetales, de mamífero o de insecto. La célula hospedadora se incuba
en condiciones que inducen la expresión del vector insertado,
produciendo de esta manera PP13.
Por ejemplo, el ADN que codifica PP13 puede
insertarse en un vector de expresión bajo el control de un promotor
inducible tal como el promotor LacZ, el promotor de la polimerasa de
T7 o T4, promotores de choque térmico, etc. Un ejemplo de un vector
de expresión es el vector de expresión pQE (QIAGEN). El vector pQE
proporciona un alto nivel de expresión de proteínas que contienen
una señal de afinidad 6*His en E. coli. El vector pQE
contiene un promotor regulable que consta del promotor T5 del fago
de E. coli y dos secuencias operadoras lac. El vector
después se inserta en una cepa E. coli M15 [PREP4] competente
(Villarejo y Zabin. 1974). La célula hospedadora M15 contiene
múltiples copias del plásmido pREPA que lleva el gen lacI que
codifica el represor de lac. La célula hospedadora se incuba con
IPTG que rápidamente induce la expresión del vector insertado,
produciendo de esta manera PP13. También pueden usarse muchos otros
sistemas para la expresión de PP13, como es bien conocido para el
especialista en la técnica.
Puede producirse un kit para diagnosticar
complicaciones relacionadas con el embarazo basándose en la presente
invención. Tal kit, por ejemplo, puede comprender los siguientes
componentes: (1) anticuerpos capaces de unirse específicamente a
PP-13; (2) PP-13 marcada, por
ejemplo, por un marcador radiactivo, fluorescente o enzimático; (3)
soluciones patrón de PP13 a concentraciones conocidas; y (4) medios
para detectar la señal producida en el ensayo. Estos medios podrían
ser, por ejemplo, antisuero inducido contra anticuerpos de unión a
PP13.
La presente invención se entenderá mejor tras la
siguiente descripción detallada de realizaciones preferidas,
consideradas junto con los siguientes dibujos en los que:
la Fig. 1 muestra una secuencia parcial de
nucleótidos y de aminoácidos deducida de un ADNc de la base de datos
Expressed Sequence Tag (EST) (acceso R24614). Las regiones que son
similares a los péptidos secuenciados están subrayadas. Se descubrió
que el péptido nº 3 derivado de PP13 (Fig. 1) compartía una
identidad parcial con este ADNc (letras rojas subrayadas), y los
péptidos nº 4, 5 y 6 presentaban una identidad del 100% con la
secuencia de la base de datos EST. Se muestra la secuencia de
nucleótidos del ADNc de 390 pb con una traducción de la fase de
lectura abierta (118 aminoácidos). Una secuencia de iniciación de la
traducción de tipo Kozak que contiene un supuesto codón de
iniciación (ATG) en el nucleótido 33 está marcada con un asterisco.
Los números de los nucleótidos se muestran a la izquierda.
La Fig. 2 muestra la secuencia completa de
nucleótidos y de aminoácidos deducida del clon de ADNc de PP13
obtenido a partir del análisis RACE. Se muestra la secuencia de
nucleótidos del ADNc de 611 pb con la traducción de la fase de
lectura abierta (139 aminoácidos). Las regiones que son idénticas al
péptido digerido están numeradas y subrayadas. Una secuencia de
iniciación de la traducción de tipo Kozak que contiene un supuesto
codón de iniciación (ATG) en el nucleótido 41 está marcada con un
asterisco. Los números de nucleótidos se muestran a la
izquierda.
La Fig. 3 muestra la alineación de la secuencia
de aminoácidos de PP13 y la lisofosfolipasa de eosinófilos (SEC ID
Nº 11).
Los aminoácidos idénticos de la proteína PP13 y
la lisofosfolipasa de eosinófilos (EPL) se designan en negritas. Hay
aproximadamente una identidad del 54% entre las dos proteínas.
La tripsina modificada y LysC (de calidad de
secuenciación) se adquirieron en Promega. El ácido trifluoroacético
(TFA) y el Triton X 100 hidrogenado (RTX) se adquirieron en Sigma.
El carbonato amónico (AC) se adquirió en
Riedel-Haen. El acetonitrilo (ACN) se adquirió en
BioLab. Los sistemas RACE 5' y 3' se adquirieron en Gibco BRL. El
vector de clonación pUC57 (T-Cloning kit) se
adquirió en MBI Fermentas.
La proteína PP13 se purificó por inmunoafinidad
usando anticuerpos policlonales de conejo inducidos contra proteínas
placentarias y se purificó por afinidad en la proteína PP13. Para
purificar adicionalmente la proteína PP13 y digerirla con enzimas
proteolíticas, se usó el método de Rosenfeld et al. (1992)
como se indica a continuación. La proteína PP13 se separó de otras
proteínas contaminantes por medio de su resolución en
SDS-PAGE en un formato de mini gel (10x10 cm)
seguido de fijación del gel y tinción del gel con azul brillante de
Coomassie. El gel se destiño en etanol al 40% + ácido acético al
10%. La banda de gel teñida que contenía la proteína PP13 se cortó
con una hoja de afeitar limpia y se lavó con acetonitrilo (ACN) al
50% + carbonato amónico (AC) 200 mM en agua. Este tratamiento se
realizó para retirar la máxima cantidad posible de SDS, azul
brillante de Coomassie y ácido acético. La pieza de gel lavada se
secó al aire durante 30 minutos y se rehidrató añadiéndola
50-100 \mul de AC 200 mM + tampón RTX al 1% que
contenía 0,5 \mug de tripsina modificada o 0,5 \mug de LysC.
Después de la incubación con agitación suave a 37ºC durante 12
horas, los péptidos proteolíticos liberados de la proteína PP13 se
eluyeron de la pieza de gel por agitación dos veces en 100 \mul de
TFA al 0,1% + ACN al 60% a temperatura ambiente durante 60 minutos.
La solución se separó de la pieza de gel por centrifugación y se
secó en un Speed-Vac para retirar el exceso de ACN.
Los péptidos proteolíticos se resolvieron por HPLC de fase inversa
en una columna Vydac 1 x 150 mm, C18, 300 con un gradiente lineal de
ACN al 4% + TFA al 0,1% a ACN al 60% + TFA al 0,085% a temperatura
ambiente con un caudal de 40 \mul/min. El patrón de elución de los
péptidos se determinó por absorbancia UV a 214 nm y se recogieron
las fracciones que contenían los péptidos manualmente en un tubo de
microcentrífuga y se almacenaron a -80ºC. Algunas de las fracciones
que contenían los péptidos se secuenciaron en un Secuenciador de
Proteínas-Péptidos (modelos 476A y 494A, Perkin
Elmer) usando la química y los ciclos de Edman convencionales del
fabricante.
Para aislar la secuencia de ADNc completa del gen
PP13, se usó un método convencional denominado amplificación rápida
de extremos de ADNc (RACE) (2) para extender tanto el extremo 5'
como el extremo 3' de las partes conocidas del ADNc en sus extremos.
Generalmente, el método RACE genera ADNc usando una reacción de
cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar copias de la región
entre segmentos conocidos del ADNc en puntos específicos en el
transcrito y sus extremos 3' o 5'. Esto se realizó obteniendo copias
del ADNc entre cebadores de ADN sintéticos complementarios a
segmentos conocidos del mensajero y cebadores que hibridan con los
extremos del ADNc.
Para la determinación del extremo cebado 3', se
realizó una reacción de transcriptasa inversa (RT) usando 4 \mug
de ARN placentario total (preparado por el reactivo TRI de Molecular
Research Center, Inc.) y el cebador del extremo 3': (106ras) 5' -
ggc cac gcg tcg act agt act ttt ttt ttt ttt tt - 3'. Esto se
continuó por una reacción de PCR entre los cebadores: (107ras para
la reacción de avance) 5' - ggc cac gcg tcg act agt ac - 3' y el
cebador inverso (100rs, homólogo al péptido nº 4) fue 5' ggg ata ttg
gag gag ac - 3'. La reacción de PCR incluía MgCl_{2} 2,5 mM,
desnaturalización a 94ºC durante 45 minutos, hibridación de
cebadores a 60ºC durante 45 minutos y extensión de cebadores a 72ºC
durante 2 minutos en 35 ciclos.
Para la determinación del extremo 5', la reacción
RT se realizó con 4 \mug de ARN placentario total y un cebador 3'
específico (101ras): 5'-gtc tcc tcc aac atc cat atc
- 3'. El extremo 5' del ADNc se extendió añadiendo
poli-dC usando el protocolo y reactivos de RACE
(Gibco BRL). Esto se continuó con una reacción de PCR usando las
condiciones anteriores y los siguientes cebadores: un cebador
inverso con cebador de anclaje acortado (AAP) suministrado por Gibco
BRL y el cebador de reacción de avance 101 rs descrito
anteriormente.
Los fragmentos de PCR resultantes se insertaron
en el vector de clonación pUC57-T
(T-Cloning Kit # K1212 MBI Fermentas), se
seleccionaron los clones que contenían el inserto y se secuenciaron
por ADN automático en Biological Services en el Weizmann Institute,
Rehovot, Israel.
Para clonar el gen que codifica la proteína
PP-13 o identificar su gen en uno de los bancos de
datos, fue necesario obtener la secuencia de aminoácidos primaria de
la proteína PP13. Como la proteína PP13 se bloqueó en su extremo
amino, se obtuvieron secuencias de aminoácidos internas después de
la digestión proteolítica de la proteína en fragmentos peptídicos.
Estos péptidos se separaron y purificaron por cromatografía usando
HPLC de fase inversa y se secuenciaron algunos de los péptidos
resueltos. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos que se
secuenciaron satisfactoriamente se indican en la Tabla 1.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Número de Péptido \+ \hskip4cm \+ Secuencia de
aminoácidos \cr \+\+\cr 1. (SEC ID Nº: 1) \+ \+ L P V S L S V
G\cr 2. (SEC ID Nº: 2) \+ \+ V I I K\cr 3. (SEC ID Nº: 3) \+ \+ G
T P I H S F I N D P Q L Q V D F\cr 4. (SEC ID Nº: 4) \+ \+ E F G I
W M L E E T T D Y V P F E\cr 5. (SEC ID Nº: 5) \+ \+ Q F E L C I
Y\cr 6. (SEC ID Nº: 6) \+ \+ V H Y N E Y\cr 7. (SEC ID Nº: 7) \+
\+ G F V H
R\cr}
Se investigaron bancos de datos de ADN y
proteínas disponibles en Internet para comprobar la homología con
las secuencias peptídicas de PP13 obtenidas. Se identificó una
secuencia de ADNc (SEC ID Nº: 8) que codificaba cuatro de los
fragmentos peptídicos (Fig. 2) (acceso EST R24614). El hecho de que
en el ADNc identificado estuviera presente homología con más de una
secuencia peptídica indica que este ADNc probablemente es un
producto del gen que codifica la proteína, que es el constituyente
principal de la preparación de PP13.
La secuencia se encontró en un banco de datos EST
creado en la Universidad de Washington e investigado a través del
Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) usando el
programa de búsqueda BLAST. El ADNc de R24614 contiene una secuencia
de iniciación de la traducción de tipo Kozak y una fase de lectura
abierta (ORF) de 358 pares de bases que codifica un polipéptido de
118 aminoácidos. El peso molecular calculado del polipéptido
codificado por la fase de lectura abierta de R24614 es de 13,9 Kda.
Cuatro de los péptidos secuenciados tienen homología con partes de
la secuencia deducida de la fase de lectura abierta grande del ADNc
de R24614 (Fig. 1). Se descubrió que la secuencia de aminoácidos
obtenida del péptido nº 3 compartía una identidad parcial con el
ADNc de EST y los péptidos número 4, 5 y 6 eran idénticos a
diferentes segmentos de la ORF en la secuencia de R24614.
Como la secuencia de la fase de lectura abierta
de R24614 obtenida a partir del banco de datos no contenía la región
codificante entera de la proteína PP13, fue necesario obtener la
secuencia completa de ADNc.
Para obtener la secuencia de ADNc completa se usó
la amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE). Usando el método
RACE con cebadores internos específicos homólogos a la secuencia de
la región del péptido 4 encontrada previamente (Fig. 1), se
descubrieron los extremos 3' y 5' del mensajero de PP13. La
secuencia de aminoácidos completa de PP 13 (SEC ID Nº: 9) y su ADNc
(SEC ID Nº: 10) se muestran la figura 2.
El ADNc completo contiene una secuencia de
iniciación de la traducción de tipo Kozak y una fase de lectura
abierta de 417 pb que codifica un polipéptido de 139 aminoácidos,
con una masa prevista de 15,1 KDa que tiene aproximadamente el mismo
tamaño de peso molecular de la proteína PP13 calculado a partir de
su migración en SDS-PAGE. La fase de lectura abierta
principal de la secuencia de ADNc completa contiene todas las
secuencias peptídicas encontradas previamente por secuenciación de
Edman de péptidos proteolíticos purificados por fase inversa (Fig.
1).
Se deduce que el nuevo gen contiene similitud de
secuencia con la lisofosfolipasa de eosinófilos (3), una proteína de
significado conocido en trastornos de inmunidad y del embarazo (Fig.
3). La PP13 y la lisofosfolipasa de eosinófilos tienen una identidad
de aminoácidos de aproximadamente un 54% y una identidad de ácido
nucleico del 56%. La identidad de las dos proteínas en las regiones
de los péptidos, especialmente los péptidos número 4 y 6, es baja,
de forma que es evidente que estas proteínas son diferentes, pero la
homología e identidad podría sugerir que pertenecen a la misma
familia de proteínas.
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tejido placentario humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derivado de PP-13
(Página 8)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\sa{Leu Pro Val Ser Leu Ser Val Gly}
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<210> 2
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Tejido placentario humano
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<220>
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(4)
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<223> Derivado de PP-13
(Página 8)
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<400> 2
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\sa{Val Ile Ile Lys}
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<210> 3
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Tejido placentario humano
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<220>
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(17)
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<223> Derivado de PP-13
(Página 8)
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<400> 3
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\sa{Gly Thr Pro Ile His Ser Phe Ile Asn Asp Pro
Gln Leu Gln Val Asp}
\sac{Phe}
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<210> 4
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Tejido placentario humano
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<220>
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(17)
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<223> Derivado de PP-13
(Página 8)
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<400> 4
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\sa{Glu Phe Gly Ile Trp Met Leu Glu Glu Thr Thr
Asp Tyr Val Pro Phe}
\sac{Glu}
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<210> 5
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Tejido placentario humano
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<220>
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(7)
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<223> Derivado de PP-13
(Página 8)
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<400> 5
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\sa{Gln Phe Glu Leu Cys Ile Tyr}
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<210> 6
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Tejido placentario humano
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<220>
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(6)
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<223> Derivado de PP-13
(Página 8)
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<400> 6
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\sa{Val His Tyr Asn Glu Tyr}
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<210> 7
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Tejido placentario humano
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(5)
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<223> Derivado de PP-13
(Página 8)
\newpage
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<400> 7
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\sa{Gly Phe Val His Arg}
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<210> 8
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<211> 611
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<212> ADN
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<213> Tejido placentario humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(611)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon de PP-13 R24614
(Fig. 2)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tejido placentario humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(139)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PP-13 (Fig. 2)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 417
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tejido placentario humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(417)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PP-13 (Fig. 2)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glóbulos blancos humanos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(142)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lisofosfolipasa de eosinófilos (Fig.
3)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
Claims (5)
1. Una proteína o polipéptido recombinante
seleccionado entre el grupo compuesto por:
(a) proteína placentaria 13 (PP13) de la
secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 2 (SEC ID Nº: 9); y
(b) una proteína o polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos que incluye la secuencia de aminoácidos
de (a).
2. Una molécula de ADN que codifica la proteína o
polipéptido de la reivindicación 1.
3. La molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 2, que tiene la secuencia de nucleótidos que aparece
en la Fig. 2 (SEC ID Nº: 10).
4. Un método recombinante para la producción de
PP13 que comprende:
(a) insertar una molécula de ADN de acuerdo con
la reivindicación 2 en un vector de expresión;
(b) insertar dicho vector de expresión en una
célula hospedadora; e
(c) incubar dicha célula hospedadora en
condiciones que permitan la expresión del vector insertado,
produciendo de esta manera PP13.
5. Un kit para diagnosticar complicaciones
relacionadas con el embarazo, que comprende:
(a) anticuerpos capaces de unirse específicamente
a la proteína o polipéptido de la reivindicación 1;
(b) PP13 marcada de la reivindicación 1; y
(c) solución patrón de PP13 recombinante a
concentraciones conocidas.
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