ES2234687T3

ES2234687T3 - Metodo automatizado para identificar secuencias biomoleculares relacionadas.

Info

Publication number: ES2234687T3
Application number: ES00973154T
Authority: ES
Inventors: Rob Hooft Van Huijsduijnen; Jacques Colinge
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1999-11-25
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2020-11-16
Also published as: ATE287453T1; EP1232282A2; AU1169701A; PT1232282E; JP2003515148A; EP1232282B8; WO2001038568A3; DE60017586T2; US6996474B1; IL149767A; AU782633B2; EP1232282B1; IL149767A0; CA2386706A1; CA2386706C; SI1232282T1; WO2001038568A2; EP1103911A1; DE60017586D1; DK1232282T3

Abstract

Método para identificar secuencias biomoleculares relacionadas que posean características de interés provenientes de bases de datos, comprendiendo las bases de datos al menos un primer y segundo conjunto de secuencias, procediendo cada conjunto de un tipo diferente de organismo, que comprende las siguientes etapas: a) establecer, a partir de un primer conjunto de secuencias, una lista no redundante de secuencias de interrogación que poseen características comunes de interés (miembros de la primera familia), usando un programa de búsqueda en bases de datos; b) realizar alineamientos de secuencia con los miembros de la primera familia en un segundo conjunto de secuencias procedentes de un segundo tipo de organismo, usando un programa de búsqueda en bases de datos y un umbral de similitud preseleccionado, que de una lista de miembros de la segunda familia; c) establecer una matriz bidimensional que muestra los miembros de la primera y segunda familia y sus respectivos valores de similitud resultantes de la etapa (b), opcionalmente se muestran sólo aquellos miembros de la segunda familia que poseen valores de similitud que exceden el valor de umbral preseleccionado; y d) seleccionar en la matriz los pares de miembros de la primera y segunda familia para los que los valores de similitud son los mejores de entre todos los alineamientos que implican uno de los dos miembros del par (ortólogos).

Description

Método automatizado para identificar secuencias biomoleculares relacionadas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método automatizado para identificar secuencias biomoleculares relacionadas, que tengan características de interés definidas, provenientes de bases de datos, comprendiendo las bases de datos al menos un primer y segundo conjunto de secuencias, procediendo cada conjunto de un tipo diferente de organis-
mo.

Antecedentes de la invención

A lo largo de los últimos años, la cantidad de información biológica disponible en bases de datos y accesible vía la World Wide Web está aumentando a un paso rápido. La mayor parte de esta información está constituida por secuencias de ADN derivadas de métodos de secuenciación de ADN cada vez más eficaces. No obstante, los métodos de secuenciación de ADN sólo proporcionan datos en bruto, de entre los que el científico tiene entonces que encontrar lo que es importante. Las partes importantes pueden ser secuencias de codificación, sitios de unión y empalme, secuencias reguladoras, tales como promotores y terminadores, sitios de poliadenilación, etc. Seleccionar la secuencia de interés para la salud entre la gran cantidad de datos de secuencia es esencial, puesto que los experimentos "reales" en el banco de laboratorio desarrollados para analizar las moléculas que contienen la secuencia y/o sus productos, requieren un gran esfuerzo en términos de tiempo y recursos. Los experimentos basados en moléculas tomadas de bases de datos permiten la elucidación estructural y funcional de estas biomoléculas. Los experimentos pueden conducir entonces a encontrar, por ejemplo, nuevos fármacos o dianas para fármacos.

Por tanto, los datos de secuencia presentes en una base de datos tienen que ser analizados y evaluados cuidadosamente, con el fin de escoger las secuencias de interés para el proyecto de investigación particular.

Si se está interesado en una determinada proteína o familia de proteínas (es decir proteínas relacionadas que comparten restos comunes, que pueden ser dominios o ciertos residuos de aminoácidos o patrones de residuos), el investigador se enfrenta frecuentemente al problema de que sólo ha sido caracterizado un miembro de un tipo específico de organismo. Se sabe que las secuencias de proteínas homólogas pueden diverger enormemente en diferentes organismos, incluso aun cuando cambien poco la estructura o función. Así, se puede inferir mucho sobre una proteína no caracterizada cuando se detecta una significativa similitud de secuencia con una proteína bien estudiada. Por tanto, se lleva a cabo una búsqueda en una base de datos, esto es, una comparación de alineamiento de secuencias, con el fin de encontrar otros miembros de la familia y/o moléculas relacionadas en otros tipos de organismos. A los miembros de una familia homólogos en diferentes organismos se les llama ortólogos.

Bases de datos tales como Swissprot, GenBank o la EMBL (European Molecular Biology Laboratory) Data Library
son grandes archivos de secuencias que contienen grandes cantidades de datos de secuencia. Las bases de datos contienen conjuntos de secuencias provenientes de diferentes organismos. En estas bases de datos las búsquedas de ortólogos se pueden llevar a cabo partiendo de una secuencia de interrogación que se alinea con las secuencias de una base de datos, las secuencias diana. Se calcula para cada alineamiento un resultado, que define la similitud, y los pares interrogación-diana se notifican al usuario. El resultado o valor de similitud se puede ajustar a un determinado umbral o "valor de corte", de manera que sólo aquellos pares que posean una similitud que exceda el umbral se notifican al usuario.

Se han desarrollado diferentes programas y algoritmos para llevar a cabo búsquedas en bases de datos. El algoritmo de Smith-Waterman (1) compara rigurosamente la secuencia de interrogación con cada secuencia diana en las bases de datos. Este algoritmo requiere un tiempo proporcional al producto de las longitudes de las secuencias comparadas. Sin hardware específico especial o máquinas masivamente paralelas el tiempo requerido por el algoritmo de Smith-Waterman es usualmente demasiado lento para la mayoría de los usuarios. Programas de búsquedas en bases de datos mucho más rápidos usan métodos heurísticos para acelerar el proceso de alineamiento. Los programas de este tipo más comúnmente usados se llaman BLAST y FASTA, concentrando ambos el alineamiento en las regiones de las secuencias con las mayores probabilidades de estar relacionadas. Procedimientos rápidos de emparejamiento exacto identifican primero regiones prometedoras, y sólo entonces se aplica el método de Smith-Waterman.

Secuencias de ADN recientemente identificadas se pueden clasificar utilizando motivos de secuencia conocidos de ácidos nucleicos o aminoácidos que indiquen elementos estructurales o funcionales particulares. Los motivos se pueden usar entonces para predecir la función de una secuencia recientemente identificada.

Se pueden llevar a cabo comparaciones más sensibles de secuencias usando familias de secuencias, preferentemente que conserven ciertos residuos y motivos críticos. Se usan para la búsqueda todos los miembros de la familia o supuestos miembros de la familia. Usando comparaciones de secuencia múltiples, se pueden revelar funciones de los genes que no resultan claras por simples homologías de secuencia.

Con el fin de encontrar proteínas ortólogas, Chervitz et al. (2) llevaron a cabo una comparación exhaustiva de conjuntos completos de proteínas del gusano nemátodo Caenorhabditis elegans y la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae. Ambos genomas, el de la levadura y el del nemátodo C. elegans, habían sido secuenciados anteriormente en su totalidad (3, 4).

Con el fin de encontrar relaciones ortólogas, Chervitz et al. llevaron a cabo un análisis recíproco Washington University (WU)-BLAST (descrito en 5, 6 y 7). Compararon las proteínas predichas para la levadura (6 217 QRFs) con todas las proteínas predichas del gusano (19 099 ORFs) y viceversa, es decir, realizaron una comparación de secuencias recíprocas. Se detectaron buenos alineamientos y se agruparon. Los grupos se ordenaron luego de acuerdo con su similitud y se presentaron como alineamientos de secuencia múltiples, dendrogramas de agrupación arraigada y árboles no arraigados.

Este análisis mostró que para una fracción sustancial de genes de la levadura y del gusano, fueron identificables relaciones ortólogas. Este método de identificar relaciones ortólogas en especies diferentes sirve para encontrar funciones y actividades de proteínas en genomas recién secuenciados.

Comparaciones de secuencias recíprocas son, por tanto, una poderosa herramienta para ayudar a los investigadores a identificar su diana potencial en las bases de datos, y diseñar entonces experimentos para la molécula específica identificada.

Una de las dificultades del análisis de los resultados de las búsquedas en bases de datos como se apuntó más arriba, es la cantidad de datos de salida obtenidos en la búsqueda. La salida tiene que ser evaluada cuidadosamente con el fin de seleccionar los datos significativos de "los de fondo".

Otra dificultad es la ambigüedad de los resultados presentados en dendrogramas o árboles. Los pares de ortólogos no son evidentes, si son mínimamente detectables.

Otro aspecto crítico adicional es la fiabilidad del análisis. Los investigadores tienen que estar seguros de que las secuencias que han encontrado son inequívoca y verdaderamente pares ortólogos, es decir, que han encontrado verdaderamente o al menos con mucha probabilidad secuencias que codifican proteínas o dominios que presentan una cierta actividad. El éxito en encontrar ortólogos usando esta clase de búsquedas en bases de datos es más probable cuánto más cerca estén relacionados evolutivamente los organismos comparados.

No obstante, la mayoría de la información de secuencias disponible actualmente procede bien de especies mamíferas o de formas de vida muy sencilla. Esta situación será incluso más desequilibrada cuando se conozca la secuencia completa del genoma humano.

La explicación para esta situación es que los organismos sencillos poseen genomas relativamente pequeños que son accesibles a la manipulación, mientras que los datos genéticos de mamíferos (seres humanos) son esenciales como punto de partida inmediato para el desarrollo de derivados farmacéuticos. Pero con el fin de inferir la función de un gen de mamífero del análisis de un gen relacionado (un ortólogo) de gusano o mosca, por ejemplo, delecionando el gen ortólogo, uno tiene que estar razonablemente seguro de la relación evolutiva entre esos dos ge-
nes.

La avalancha de datos de secuenciación ha aumentado el número de genes de mamíferos cuya función se puede estudiar potencialmente en organismos inferiores, pero debido a la carencia de secuencias de especies "intermedias" evolutivamente, es generalmente imposible seguir la pista a genes a lo largo de todo el camino en los árboles evolutivos. Este problema es especialmente destacado en familias de genes con numerosos genes, tales como las de quinasas, fosfatasas y receptores.

Como se mencionó más arriba, entre los organismos multicelulares, el genoma del gusano nemátodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) ha sido secuenciado en su totalidad (4). Aunque el interés médico y farmacológico tiende a enfocarse en genes de mamíferos, sólo las formas sencillas de vida como el nemátodo permiten una rápida manipulación genética y un rápido análisis funcional. Un requisito previo para la extrapolación significativa de estudios funcionales de genes de invertebrados al hombre, es que los pares de genes relacionados, los ortólogos, bajo estudio estén realmente relacionados, es decir asociados sin ambigüedad.

D. Botstein et al., 1997, "Yeast as a Model Organism", Science, 277, pp. 1259-1260, describe una comparación usando un análisis BLASTP entre todas las secuencias de traducción ORF de levaduras y todas las secuencias de proteínas únicas en el ser humano, ratón, rata, vaca y oveja de GenBank.

La publicación W. R. Pearson et al., 1988, "Improved tools for biological sequence comparison" Proc. Ntl. Acad. Sci: USA, 85, pp. 2444-2448 de dos programas de ordenador relacionados para comparar secuencias de proteínas y ADN, a saber FASTA para calcular los resultados de similitud inicial y óptimo entre dos secuencias, y LFASTA, que consiste en una modificación de FASTA para identificar alineamientos múltiples entre porciones pequeñas de dos secuencias.

La publicación de S. F. Atschul et al., 1994, "Issues in searching Molecular Sequence Databases", Nature Genetics, 6, pp. 119-129, es una revisión de programas de ordenador para la búsqueda de similitudes en secuencias, que aborda las principales cuestiones encontradas en ese campo, en especial algoritmos de búsqueda en bases de datos, sistemas de resultados, en especial matrices de resultados, estadísticas de alineamiento, en especial estadísticas de alineamiento local, redundancia de bases de datos y acceso a bases de datos.

Descripción de la invención

Por tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un método fiable para identificar secuencias biomoleculares relacionadas que tienen definidas características de interés, es decir ortólogos, en bases de datos. Es un objeto adicional de la invención simplificar la evaluación de los resultados obtenidos en búsquedas en una base de datos destinadas a la identificación de secuencias biomoleculares relacionadas. El método debe ser aplicable incluso al alineamiento de secuencias derivadas de especies distantes evolutivamente.

La invención resuelve este problema como se define en las reivindicaciones adjuntas.

El método de la invención representa una importante mejora de los métodos de alineamiento múltiple conocidos en la técnica.

Etapa (a)

En primer lugar, se compila de una base de datos una lista de secuencias que representa una familia de secuencias como, por ejemplo, una familia de un gen. Las secuencias extraídas de la base de datos pueden ser adicionalmente modificadas, por ejemplo seleccionando sólo un cierto fragmento de la secuencia. Tal fragmento de la secuencia puede contener un exón, que codifica, por ejemplo, un dominio específico para una cierta familia de proteínas. La lista de los miembros de la primera familia no debe ser redundante. Esto es esencial con el fin de minimizar la cantidad total de alineamientos, por consiguiente se acelera sustancialmente el método según la invención comparado con métodos de alineamiento conocidos en la técnica. La no redundancia se puede obtener primeramente mediante un ensamblaje inicial de las secuencias y comparándolas luego entre sí, eliminando cualesquiera secuencias idénticas. La lista de los miembros de la primera familia procede de un organismo específico, es decir, se toma de un conjunto de secuencias que comprenden las secuencias derivadas de un cierto organismo. El conjunto de secuencias puede estar contenido en una o más bases de datos. Los miembros de la familia se identifican por sus características de interés comunes, tales como motivos de secuencia que representan dominios de polipéptidos, por ejemplo. Los miembros de la familia se pueden extraer de la(s) base(s) de datos por métodos conocidos en la técnica (8). Además de esto, ya están disponibles bases de datos que contienen familias de genes, tales como, por ejemplo, Prosite.

Etapa (b)

Luego, con cada uno de estos miembros de la familia, llamados miembros de la primera familia, se lleva a cabo una comparación en un conjunto de secuencias procedentes de otro organismo. El conjunto de secuencias puede estar contenido en una o más bases de datos. Esta comparación es simétrica. La etapa (b) conduce a una lista de secuencias similar a los miembros de la primera familia, llamada miembros de la segunda familia. El grado de similitud se puede ajustar eligiendo un valor umbral adecuado. El establecimiento del valor umbral adecuado resulta fácil para la pericia del experto.

Etapa (c)

Con la finalidad de poder seleccionar los más significativos, es decir ortólogos "inequívocos", se establece una matriz de similitud bidimensional. El tamaño de la matriz se puede ajustar a las necesidades individuales mediante la elección de ciertos umbrales o valores de corte para la similitud. Cuanto más restrictivo se seleccione el valor umbral para la similitud, menor será la matriz. El valor umbral opcional preseleccionado también determina el tiempo de cálculo. La matriz no requiere ser mostrada visualmente, pero puede ser establecida virtualmente por el ordenador. Entonces, puede ser muy grande. Si se muestra visualmente, sólo se muestran en la matriz aquellos miembros de la familia cuyos valores de similitud son mejores que, es decir que exceden, un valor umbral o valor de corte preseleccionado. El valor umbral se elige para indicar una similitud altamente significativa. Como se mencionó más arriba, éste puede ser preseleccionado por el investigador de acuerdo a sus necesidades. Cuanto más restrictivo sea el valor umbral, menos "aciertos" o miembros de la familia serán mostrados. El establecimiento del valor umbral adecuado resulta fácil para el experto. Seleccionar un valor umbral restrictivo permitirá construir una matriz de similitud claramente mostrada. Se usa una presentación especial de los resultados según la invención. La matriz de similitud muestra los resultados de tal manera que los miembros inequívocos de la familia se pueden detectar y seleccionar fácil y automáticamente (véase la etapa (d)). La matriz de similitud muestra simultáneamente los miembros de la primera familia y sus correspondientes miembros de la segunda familia, así como sus respectivos valores de similitud resultantes de los alineamientos de secuencia realizados en la etapa de comparación llevada a cabo con anterioridad, esto es en la etapa (b).

Etapa (d)

La última etapa del método según la invención consiste en la selección real de los pares de ortólogos. Estos pares se seleccionan tomando los valores de similitud que representan la mayor similitud entre todos los alineamientos que implican uno de los dos miembros de los pares. Los ortólogos no ambiguos son fácilmente detectables mediante la simple elección del valor de similitud máximo en las direcciones horizontal y vertical. En primer lugar, se escogen los valores en una fila específica que contiene los alineamientos de un miembro de una primera familia. Se elige el más alto. Con el fin de estar seguro en cuanto a la ortología, este valor también tiene que ser el mejor en la respectiva columna. Si el valor de similitud es el mejor tanto en la fila como en la columna, éste define un par de ortólogos. En la etapa (d), no sólo se puede seleccionar el "mejor" o el "mayor" valor, sino también más de un valor, en el caso de que no sólo un valor refleje un alto grado de similitud. Por ejemplo, si hay tres valores que reflejan un grado muy alto de similitud se han identificado tres pares de ortólogos muy probables. Los resultados se pueden compilar entonces en una lista de pares ortólogos.

Así, el proceso según la invención combina un máximo de fiabilidad de los resultados con una alta velocidad de la búsqueda. La velocidad resulta acelerada comparada con los métodos convencionales debido a que las secuencias de partida ya han sido cuidadosamente seleccionadas. La lista de miembros de la primera familia es reducida, ya que contiene de forma no redundante, es decir sólo una vez, las secuencias que se sabe que comparten características específicas de interés. Puesto que la mayoría de las bases de datos tienen entradas duplicadas o incluso múltiples para la misma secuencia, las redundancias tienen que ser eliminadas. Esto se puede hacer por comparación de todas las secuencias de la familia que fueron encontradas, comparándolas entonces y eliminando las idénticas.

Otra ventaja del método según la invención se debe a la presentación de los resultados en una matriz como se apuntó más arriba. Esto no se basa en la inspección visual de los árboles evolutivos, sino que selecciona automáticamente y muestra opcionalmente de forma visual la mejor correspondencia de par de ortólogos, esto es, el o los que presentan la mayor similitud entre sí.

Por tanto, mediante el uso del método según la invención, se pueden identificar uno-a-uno pares de ortólogos no ambiguos, incluso si los grupos de secuencias sobre las que se realiza la búsqueda derivan de tipos de organismos distantes evolutivamente. Todo el proceso se puede automatizar y llevar a cabo en un ordenador. Los parámetros básicos tales como las características que definen las secuencias de interés y los valores umbral para las búsquedas en la base de datos se fijan antes, de acuerdo al respectivo objetivo o necesidad del investigador.

Usando esta novedosa aproximación, ha sido posible identificar pares ortólogos inequívocos uno a uno que no pudieron ser identificados como tales con anterioridad en las bases de datos conocidas, usando métodos convencionales tales como dendrogramas de agrupamientos arraigados y árboles no arraigados. La facilidad y fiabilidad del método de la invención será apreciada por todos los interesados en secuencias relacionadas u homólogas y que se sirven de métodos bioinformáticos para seleccionar las moléculas que serán después analizadas adicionalmente en el
laboratorio.

La expresión "tipo de organismo" debe ser entendida como especies o cualquier otro organismo o agente/entidad auto-replicante que sea distinguible de otro organismo o agente/entidad auto-replicante.

Como ya se mencionó más arriba, la expresión "mejor valor" se debe entender que también significa los mejores valores, es decir, que se puede elegir más de uno.

Las bases de datos usadas según la invención pueden ser, por ejemplo, la base de datos EMBL, Swissprot, GenBank, las bases de datos NCBI, etc. La expresión base de datos puede comprender cualquier colección de datos que contenga uno o más grupos de secuencias derivados de uno o más tipos diferentes de organismos.

Preferentemente, el primer conjunto de secuencias, del que se establece en la etapa (a) la lista de miembros de la primera familia, comprende diferentes bases de datos, todas derivadas del mismo tipo de organismo. Mediante el ensamblaje de la información disponible de diferentes bases de datos, se puede estar seguro de comenzar con una familia de secuencias lo más completa posible.

Las diferentes bases de datos usadas para los alineamientos de las secuencias en la etapa (a), se pueden seleccionar del grupo consistente en bases de datos de aminoácidos, bases de datos de ácidos nucleicos, bases de datos de secuencias genómicas y bases de datos de marcadores de secuencias expresadas (abreviadamente EST por la expresión inglesa expressed sequence tags).

En una forma de realización preferida de la invención, el método según la invención comprende adicionalmente, o en lugar de las etapas (c) y (d), las etapas de:

e): realizar alineamientos de secuencia con los miembros de la segunda familia identificados en la etapa (b), en una o más bases de datos que contengan secuencias derivadas del tipo de organismo del que se tomaron los miembros de la primera familia;

f): comparar las secuencias resultantes de los alineamientos de la etapa (e) con la lista de miembros de la primera familia establecida en la etapa (a), y seleccionar las secuencias adicionalmente encontradas en la etapa (e);

g): añadir a la lista de miembros de la primera familia las secuencias seleccionadas en la etapa (f).

Si se llevan a cabo las etapas (e), (f) y (g) en lugar de las etapas (c) y (d), es posible identificar miembros adicionales de la primera familia relacionados con miembros de la segunda familia, que no se identificaron anteriormente en la etapa (a).

Si se llevan a acabo las etapas (e) a (f) además de las etapas (a) a (d), éstas se deben considerar como etapas de confirmación o terminación que aumentan adicionalmente la fiabilidad del método según la invención. Se lleva a cabo una búsqueda adicional en una base de datos o varias bases de datos que contienen secuencias de las que fue tomada la primera familia. En estas series de alineamientos, los miembros de la segunda familia se usan como secuencias de interrogación. Se usan o bien todos los miembros de la segunda familia o sólo aquellos pertenecientes a un par identificado en la etapa (d).

Las bases de datos usadas para los alineamientos de secuencia de la etapa (e) se pueden seleccionar del grupo consistente en bases de datos de aminoácidos, bases de datos de ácidos nucleicos, bases de datos de secuencias genómicas y bases de datos de marcadores de secuencias expresadas (EST). El uso de diferentes bases de datos sirve de nuevo para ensamblar tanta información como sea posible, dando como resultado análisis altamente fiables.

Ventajosamente, las etapas del método según la invención, se reiteran una o más veces. Esto conduce a listas más y más completas de miembros de la primera y segunda familia, así como a listas más y más completas de ortólogos uno-a-uno.

En una ventajosa realización adicional las celdas de la tabla están codificadas por colores de acuerdo con sus valores de similitud. Esto hace la inspección visual de la matriz especialmente fácil. De esta forma la matriz gana un trazado muy claro, que permite una rápida evaluación de los resultados. Por ejemplo, los valores de similitud que representan una baja similitud se pueden diseñar en colores oscuros, tales como azul o negro, volviéndose el color más claro cuanto mayor sea la similitud. Los valores mayores se pueden disponer en celdas que tienen colores de señalización tales como rojo o amarillo.

Para tablas de gran tamaño inapropiadas para la inspección visual, los códigos de color no son necesarios. En este caso, el ordenador puede mostrar automáticamente los pares de ortólogos en una lista simple o similar.

En una realización especialmente preferida la matriz se presenta en un formato capaz de asociar cada celda de la matriz a información relacionada con el contenido de la celda. Un formato adecuado para esto es, por ejemplo, el formato HTML. Se prefiere adicionalmente que las celdas de la matriz contengan designaciones de los miembros de la familia, y las designaciones de los miembros de la familia estén hiperasociados a sus respectivas secuencias presentes en la base de datos. Las celdas de la matriz que contienen los valores de similitud pueden estar adicionalmente hiperasociados a sus respectivos alineamientos de secuencia.

Esto permite a la matriz estar muy claramente trazada. Los miembros de la familia se pueden representar fácilmente mediante ciertas designaciones, tales como nombres, números, códigos de letras o sus combinaciones, y haciendo click en ellos las secuencias son recuperadas automáticamente de la base de datos. Cuando los valores de similitud están hiperasociados a las búsquedas llevadas a cabo anteriormente, haciendo click sobre los valores, la búsqueda puede ser recuperada y analizada sin que los datos interfieran con la claridad de la propia matriz de similitud. Esta clase de presentación asociativa hace la evaluación de los resultados más rápida y fácil, liberando al científico de tener que analizar grandes cantidades de conjuntos de datos. Mediante la reducción de la cantidad de datos, es decir mostrando sólo la información esencial, se disminuye adicionalmente el riesgo de pasar por alto resultados importantes.

Otra ventaja de esto es que los datos pueden ser analizados sin estar conectado, economizando tiempo y costes de conexión.

En una realización preferida adicional, los conjuntos de secuencias proceden de diferentes tipos de organismos que poseen una elevada distancia evolutiva entre sí. La distancia evolutiva se puede calcular por métodos estadísticos. Una forma conocida de calcular distancias evolutivas es la basada en la matriz de resultados PAM.

Los conjuntos de secuencias pueden derivar de mamíferos e invertebrados, respectivamente. Incluso pueden derivar de especies tan alejadas como los seres humanos y Caenorhabditis elegans.

El método que los inventores de la presente invención han desarrollado es especialmente adecuado para búsquedas de pares homólogos entre especies que poseen una elevada distancia evolutiva. La secuencia especial de búsquedas llevadas a cabo en las etapas según la invención junto con la selección de valores de máxima similitud, proporciona una probabilidad de encontrar verdaderos ortólogos lo suficientemente alta como para estar seguro acerca de la homología, incluso cuando la similitud es débil o cuando una familia de genes está "diseminada". Como se puede deducir de los ejemplos anexos, el sistema inventivo permite la identificación de pares ortólogos que no pudieron ser encontrados por comparaciones tradicionales, como árboles evolutivos y similares.

En realizaciones preferidas adicionales, las secuencias biomoleculares se seleccionan del grupo consistente en secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos. Las bases de datos pueden contener secuencias de ácido nucleico genómico o expresado, de acuerdo con las necesidades o el interés del respectivo proyecto de investigación y/o la disponibilidad.

Los aspectos de interés pueden definir una clase específica de proteína o un dominio o motivo especifico de una proteína. Las secuencias que codifican proteínas definen productos que pueden servir potencialmente como fármacos o dianas de fármacos y son, por tanto, de un elevado interés para los investigadores que tienen como objetivo encontrar nuevos fármacos.

Si la búsqueda se ha llevado a cabo con un dominio específico de una proteína, por ejemplo un dominio catalítico de una enzima, que es probable que se conserve entre diferentes especies, la velocidad de la búsqueda se puede aumentar adicionalmente, puesto que la velocidad depende de la longitud de las secuencias de interrogación usada para las búsquedas en la base de datos.

Los aspectos de interés contenidos en las secuencias de interrogación pueden definir la familia de genes de la proteína tirosina-fosfatasa (PTF). Las proteínas tirosina-fosfatasas son enzimas de elevado interés, puesto que la fosforilación y desfosforilación de la proteína tirosina es un conmutador clave en muchas vías de señalización celular eucarióticos importantes.

Los programas de búsqueda en bases de datos conocidos que se usan en el método según la invención pueden ser cualquiera de los programas adecuados conocidos. Son especialmente preferidos programas basados en métodos heurísticos, como FASTA o el algoritmo BLAST. El programa BLAST se usa de forma especialmente preferida, ya que es muy rápido y ampliamente usado entre la comunidad científica.

En programas tales como, por ejemplo, en el programa BLAST, las similitudes se puntúan como valores p o valores de probabilidad. Cuanto más bajo es el valor p, mayor es la similitud, y viceversa. El umbral del valor p puede ser definido por el usuario. Éste se preselecciona antes de iniciar el método automatizado, de manera que sólo se muestran al usuario los pares que puntúen con un valor p que exceda un cierto umbral, esto es, menor que el valor de corte preseleccionado.

Los valores umbral dependen de la familia de genes analizada. Los valores de umbral típicamente están en el intervalo de 10^{-10} a 0.

La invención de describe adicionalmente en los siguientes ejemplos en combinación con la figura anexa. Los ejemplos no están destinados a limitar el alcance de la invención, pero ilustran adicionalmente el método según la invención.

Leyendas de la figura y tablas Figura 1a

Análisis BLAST según la invención entre dominios catalíticos de proteínas Tirosina-fosfatasas (PTF) humanas y ORF conceptuales de C.elegans. Sólo se muestran valores BLAST p<10^{-30} de ORF con PTF. Los círculos indican intersecciones de los pares de "mejores ortólogos".

Figura 1b

Porción ampliada de la Fig. 1a.

Tabla I

Ortólogos PTF humano-gusano.

La lista se compiló de datos mostrados en la Fig. 1, y tomados de pares de genes con la mayor similitud en ambos ejes (excepto para Meg-2 y YVH-1; véase ejemplo 1). Se nombran ortólogos PTF C. elegans previamente identificados.

Tabla II

Otros ortólogos PTF (no C. elegans) identificados por un análisis BLAST según la invención en la base de datos EMBL. Usando el mismo enfoque que se muestra en la Fig. 1 y la Tabla I, se compiló una lista de ortólogos humanos PTF en otras especies, basados en datos de EMBL. Se dan sinónimos para los ortólogos que no son humanos. Mm: Mus musculus; Rn: Rattus norvegicus; Rr: Rattus rattus; Hf: Heterodontus francisi; Gg: Gallus gallus; Oc: Oryctolagus cuniculus; Xl: Xenopus laevis; Ps: Pisum sativum.

Ejemplos Materiales y métodos

Se escribió un script Perl para realizar automáticamente una serie de búsquedas Blast (Washington University BLAST2, que es una implementación específica del algoritmo BLAST original (5)). Los algoritmos blasts se ejecutaron contra las bases de datos EMBL, Swissprot o "WormPep" (revisión 16; http://www.sanger.ac.uk/Projects/C elegans/wormpep/). Los blasts se ejecutaron localmente en una estación de trabajo Silicon Graphics Inc. Origin 200 (4 procesadores) con un sistema operativo IRIX. El tiempo requerido para los blasts antes mencionados fue de aproximadamente 4-5 h, 15 min, y 5 min respectivamente. La salida se clasificó en un conjunto de archivos indexados. Se generó una interfaz web mediante otro script Perl (CGI) que reprodujo los datos de los blasts en forma de tabla basada en un valor de probabilidad de corte definido por el usuario. Los encabezamientos de fila y columna en la Tabla están hiperasociados a las entradas de la base de datos, los valores p en la propia Tabla están hiperasociados al alineamiento de secuencia BLAST.

Ejemplo 1

En primer lugar, se estableció una lista completa, no redundante de todos los miembros humanos de la familia de genes (PTF) (8). De forma concisa, el conjunto completo de entradas de la base de datos con similitudes al dominio catalítico PTF-PEST fueron identificadas en una búsqueda BLAST y sus secuencias descargadas. Estas secuencias se compararon entonces una a una a las otras en el conjunto para obtener dominios catalíticos idénticos. Así, se eliminaron redundancias en forma de entradas duplicadas en la base de datos y formas alternativas de unión y empalme.

Los miembros de esta lista fueron entonces "blasteados" secuencialmente contra el grupo completo de ORF conceptuales de C. elegans. El resultado de estas BLAST se muestra en la Fig. 1. La salida para esta Figura se generó de acuerdo a un umbral BLAST (p<10^{-30}) definido por el usuario. Los datos se muestran en formato HTML de tal manera que los nombres de genes y ORF están hiperasociados a sus secuencias y las celdas de resultados a sus alineamientos de secuencia BLAST. Una ventaja práctica de este método es que todos los resultados BLAST se almacenan localmente de forma que los datos pueden ser analizados sin conexión. De mayor importancia, los datos son analizados por celdas de localización que representan los mejores valores de similitud tanto horizontalmente como verticalmente (marcado mediante círculos en la Fig. 1). El resaltado de las mejores correspondencias puede, naturalmente, ser llevado a cabo de forma automática por el ordenador.

Se pueden identificar pares potenciales de genes ortólogos que no serían obvios para comparaciones tradicionales. Por ejemplo, para muchos PTF humanos, ORF C09D8.1 (cuarta columna en la Fig. 1) presenta la mejor similitud de secuencia entre todos los PTF de gusano, todavía la BLAST inversa con C09D8.1 indica que sólo PTP-delta N (p=9x10^{-128}) es el mejor candidato a ortólogo. Se han encontrado once ejemplos de tales "más probables ortólogos de gusano". También fueron listados en la Tabla I. Sólo cuatro de ellos han sido descritos previamente, y estos cuatro fueron también identificados por el método según la invención, llamados PTP-A24, SHP1/24, MMAC-15 y PTP-alfa 6. YVH1 sólo fue descrito recientemente (9), y no se incluyó en nuestra lista original de PTF humanos (8).

Este análisis según la invención resulta especialmente útil cuando la similitud entre el gen humano y su ortólogo es débil, o cuando una familia de genes está "diseminada", como parece ser el caso para C09D8.

Un árbol filogenético de todos los genes mostrados en la Fig. 1, calculados con software Pileup (GCG versión 10.0) fracasó en la identificación de estas relaciones (datos no mostrados).

Este resultado muestra que el método según la invención revela nuevas posibilidades en la selección de familias de secuencias relacionadas en bases de datos.

Ejemplo 2

Se llevó a cabo otro análisis según la invención, en el que el grupo de PTF humanos se comparó con toda la base de datos EMBL. Aunque el conjunto resultante de datos fue mucho mayor que el reproducido en la Fig. 1, fue posible extraer de él la lista de ortólogos PTF mostrada en la Tabla II.

No hay ningún obstáculo fundamental que impida analizar genomas completos usando el método según la invención. Conjuntos de datos más grandes conducen a un incremento lineal en los tiempos de cálculo, en contraste con algoritmos combinatorios, tales como los requeridos para resolver completamente un problema del tipo "vendedor ambulante". Dada una configuración de hardware corriente y 150.000 ORF humanos, estimamos que una comparación completa del genoma hombre-gusano requeriría aproximadamente nueve días de cálculo para producir una lista completa de los pares ortólogos más probables.

TABLA I

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TABLA II

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Referencias

1. Smith, T. F. y Waterman, M. S. Identification of common molecular subsequences. M. S. J. Mol. Biol. 147, 195-1971 (1981).

2. Chervitz S. A., Aravind, L., Sherlock, G., Ball, C. A., Koonin, E. V., Dwight, S. S., Harris, M. A., Dolinski, K., Mohr, S., Smith, T., Weng, S., Cherry, J. M. y Botstein, D. Comparison of the Complete Protein Sets of Worm and Yeast: Orthology and Divergence. Science 282, pp. 2022-2028 (1998).

3. The C. elegans sequencing consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. The C. elegans Sequencing Consortium. Science 282, 2012-8 (1998).

4. A. Goffeau. Life with 6000 genes. Science 274, 546 (1996).

5. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipmah, D.J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215, 403-10 (1990).

6. Karlin, S. y Altschul, S. F., Applications and statistics for multiple high scoring segments in molecular sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873 (1993).

7. Altschul, S. F. y Gish W. Local alignment statistics. Methods Enzymol. 266, 460 (1996).

8. Hooft van Huijsduijnen, R. Protein Tyrosine Phosphatases: Counting the Trees in the Forest. Gene 225, 1-8 (1998).

9. Muda, M., Manning, E. R., Orth, K. & Dixon, J.E. Identification of the human YVH1 protein-tyrosine phosphatase orthologue reveals a novel zinc binding domain essential for in vivo function. J Biol Chem 274, 23991-5 (1999).

Claims

1. Método para identificar secuencias biomoleculares relacionadas que posean características de interés provenientes de bases de datos, comprendiendo las bases de datos al menos un primer y segundo conjunto de secuencias, procediendo cada conjunto de un tipo diferente de organismo, que comprende las siguientes etapas:

a): establecer, a partir de un primer conjunto de secuencias, una lista no redundante de secuencias de interrogación que poseen características comunes de interés (miembros de la primera familia), usando un programa de búsqueda en bases de datos;

b): realizar alineamientos de secuencia con los miembros de la primera familia en un segundo conjunto de secuencias procedentes de un segundo tipo de organismo, usando un programa de búsqueda en bases de datos y un umbral de similitud preseleccionado, que de una lista de miembros de la segunda familia;

c): establecer una matriz bidimensional que muestra los miembros de la primera y segunda familia y sus respectivos valores de similitud resultantes de la etapa (b), opcionalmente se muestran sólo aquellos miembros de la segunda familia que poseen valores de similitud que exceden el valor de umbral preseleccionado; y

d): seleccionar en la matriz los pares de miembros de la primera y segunda familia para los que los valores de similitud son los mejores de entre todos los alineamientos que implican uno de los dos miembros del par (ortólogos).

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (a) el primer conjunto de secuencias, del que se estableció la lista de miembros de la primera familia, comprende secuencias de diferentes bases de datos, todas procedentes del mismo tipo de organismo.

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque las diferentes bases de datos usadas para los alineamientos de secuencias en la etapa (a) se seleccionan del grupo consistente en bases de datos de aminoácidos, bases de datos de ácidos nucleicos, bases de datos de secuencias genómicas y bases de datos de marcadores de secuencias expresadas (EST).

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende adicionalmente o en lugar de las etapas (c) y (d) las etapas de:

e): realizar alineamientos de secuencia con los miembros de la segunda familia en una o más bases de datos que contienen secuencias procedentes del tipo de organismo del que fueron tomados los miembros de la primera familia;

f): comparar las secuencias resultantes de los alineamientos de la etapa (e) con la lista de miembros de la primera familia establecida en la etapa (a) y seleccionar las secuencias adicionalmente encontradas en la etapa (e);

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque el método es reiterado una o más veces.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque las bases de datos usadas para los alineamientos de secuencias de la etapa (e) se seleccionan del grupo consistente en bases de datos de aminoácidos, bases de datos de ácidos nucleicos, bases de datos de secuencias genómicas y bases de datos de marcadores de secuencias expresadas (EST).

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las celdas de la matriz están codificadas por colores de acuerdo a sus valores de similitud.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la matriz se muestra en un formato en el que se puede vincular cada celda de la matriz a información relacionada con el contenido de la celda.

9. El método según la reivindicación 8, caracterizado porque las celdas de la matriz contienen designaciones de los miembros de la familia, y las designaciones de los miembros de la familia están hiperasociadas a sus respectivas secuencias presentes en la base de datos.

10. El método según las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizado porque las celdas de la matriz que contienen los valores de similitud están hiperasociadas a sus respectivos alineamientos de secuencia.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los conjuntos de secuencias de los miembros de la primera y segunda familia proceden de diferentes tipos de organismos que tienen una gran distancia evolutiva entre ellos.

12. El método según la reivindicación 11, caracterizado porque los conjuntos de secuencias de los miembros de la primera y segunda familia proceden de mamíferos e invertebrados, respectivamente.

13. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque los conjuntos de secuencias de los miembros de la primera y segunda familia proceden de seres humanos y Caenorhabditis elegans, respectivamente.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las secuencias biomoleculares se seleccionan del grupo consistente en secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos.

15. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las características comunes de interés definen una proteína específica.

16. El método según la reivindicación 15, caracterizado porque las características comunes de interés definen un dominio específico de una proteína.

17. El método según las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado porque las características comunes de interés definen la familia de genes de la proteína tirosina-fosfatasa (PTF).

18. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el programa de búsqueda en bases de datos es el programa BLAST.