ES2234809T3 - Dispositivo para la separacion y deteccion de movilidad de espermatozoides. - Google Patents
Dispositivo para la separacion y deteccion de movilidad de espermatozoides.Info
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Abstract
un aparato para separar y detectar espermatozoides móviles en una muestra líquida, teniendo el aparato: - un recipiente de separación de muestra que comprende: (a) un puerto de entrada de muestra (b) un puerto de salida de muestra, que inicialmente está cerrado; (c) un medio de separación de muestra en el que los espermatozoides móviles de la muestra pueden migrar a través del puerto de entrada de muestra; y (d) un accionador operativo para abrir el puerto de salida de la muestra permitiendo por tanto que el medio de separación fluya fuera del recipiente a través del puerto de salida de muestra - un medio de detección de espermatozoides que comprende: (i) una zona de aplicación en comunicación con el puerto de salida; (ii)una zona de detección, en la que la presencia de espermatozoides se puede detectar; y (iii) una zona reactiva que contiene un reactivo que es capaz de reaccionar con los espermatozoides para facilitar su detección en la zona de detección, estando dispuestas estas zonas para permitir el flujo capilar de espermatozoides de la zona de aplicación a la zona de detección.
Description
Dispositivo para la separación y detección de
movilidad de espermatozoides.
Esta invención se encuadra en el campo de las
pruebas de fertilidad masculinas, más específicamente pruebas para
la separación y detección de movilidad de espermatozoides en una
muestra de semen.
Aproximadamente el 15% de las parejas que
intentan concebir fallan dentro del primer año de relaciones
sexuales sin protección. Los especialistas en fertilidad definen a
estas parejas como no fértiles. El 40% de estos casos se debe a
factores masculinos. En una proporción sustancial de éstos, hay
tratamiento para mejorar o aliviar la condición que lleva a la
infertilidad.
También existen otras condiciones en las que es
deseable probar la presencia o espermatozoides viables en una
muestra. Por ejemplo, ahora se realizan con frecuencia vasectomías
como método anticonceptivo, pero es necesario confirmar que la
eyaculación está libre de espermatozoides viables después de la
operación.
Existen varios métodos para el cálculo de la
movilidad y número de espermatozoides en una muestra. Uno de esos
métodos es el análisis microscópico, que normalmente se realiza en
un hospital o laboratorio comercial. Aunque más recientemente se han
realizado una serie de propuestas para kits de pruebas con intención
de simplificar la detección de espermatozoides.
La WO97/40386 revela un kit basado en la
inmunodetección de la proteína de espermatozoides epididimaria. Los
espermatozoides en una muestra se lavan tres veces mediante
centrifugación en solución salina amortiguada con fosfato -Dulbecco.
Después las muestras se calientan de forma no natural a 95ºC, se
centrifuga a 14000 g y se usan los sobrenadantes para análisis.
La WO95/29188 describe una prueba basada en
anticuerpos al antígeno SALUD PÚBLICA-10 de
espermatozoide humano.
La EP-A-0387873
revela un kit que usa perla sólida a la que se añade un anticuerpo
específico al acrosoma de espermatozoide humano. Las perlas se
mezclan con una muestra, se incuban, separa y lavan y se mide el
número de espermatozoides unidos a la perla, preferiblemente
mediante examen al microscopio.
Una desventaja de estos kits de pruebas es que no
distinguen entre espermatozoides móviles e inmóviles. Esta
distinción es el indicativo más predecible de la infertilidad
masculina. Además, incluyen procedimientos que no permiten su
utilización en casas particulares (p.e. centrifugación, microscopia)
por lo que requieren que su implementación sea realizada por un
profesional cualificado.
A estas desventajas hace referencia el aparato de
WO00/09648 (Genosis Limited) que muestra un aparato para separar los
espermatozoides móviles de los inmóviles en una muestra líquida, el
aparato comprende (i) un recipiente con una entrada de recepción de
muestra una salida de muestra filtrada y un filtro de separación de
muestra montado entre medias, teniendo el filtro de separación de
muestra una superficie de recepción de muestra y una superficie
opuesta, y siendo el filtro de separación de muestra sustancialmente
efectivo para prevenir el flujo de la muestra, pero permitiendo el
paso de espermatozoides móviles cuando dicha superficie opuesta de
dicho filtro de separación de muestra está en contacto con un medio
líquido y (ii) medios para dar un líquido a dicha superficie
opuesta del mencionado filtro.
La patente norteamericana US 5.866.354 muestra un
aparato para medir la movilidad del esperma, que comprende: un
contenedor, un regulador de temperatura para mantener el contenedor
a la temperatura preseleccionada; un volumen de un medio de
separación de líquido (medio barrera) en el contenedor; un volumen
de un medio de espécimen de prueba de líquido sobre el medio de
separación en el contenedor, donde el medio de espécimen de prueba
comprende un espécimen de esperma y un diluyente isotónico
tamponado. La densidad del medio de separación permite que el
esperma con mucha movilidad emigre dentro de manera más rápida que
el resto del esperma. El aparato también tiene un aparato de succión
para eliminar el medio del contenedor después de la separación.
La FR-A-2539628
muestra un aparato que tiene un contenedor, especialmente de forma
tubular, dividido en dos compartimientos. El contenedor se llena con
un medio tamponado acuoso, se deposita el esperma al fondo del
compartimiento de entrega, y se deja reposar la preparación para dar
tiempo a los espermatozoides móviles a migrar al nivel separador
medio hacia el compartimiento de prueba.
La patente US 5.908.380 muestra una columna de
natación compartimentada Zavos para separar los espermatozoides
según su movilidad.
La SU-A-1486163
muestra un aparato para separar los espermatozoides móviles en el
que los espermatozoides son introducidos directamente en una
partición hecha de un material poroso que divide la parte interna
del aparato en dos depósitos separados.
La presente invención facilita un aparato para la
separación de espermatozoides móviles de una muestra de líquido,
teniendo el aparato un recipiente de separación de muestra que
comprende:
- (a)
- un puerto de entrada de muestra
- (b)
- un puerto de salida de muestra, que inicialmente está cerrado;
- (c)
- un medio de separación de muestra en el que los espermatozoides móviles de la muestra pueden migrar a través del puerto de entrada de muestra; y
- (d)
- un accionador operativo para abrir el puerto de salida de la muestra permitiendo por tanto que el medio de separación fluya fuera del recipiente a través del puerto de salida de muestra.
En este aparato, se evita inicialmente el flujo
hacia el puerto exterior del medio de separación en el recipiente.
Esto permite un periodo de incubación que da suficiente tiempo al
esperma móvil para pasar de la muestra al medio de separación de
muestra antes de salir del recipiente. Cuando actúa el accionador,
el puerto de salida se abre y el medio de separación (incluyendo
espermatozoides móviles) pueden migrar a través del puerto de salida
y abandonar el recipiente, p.e. para análisis.
Para que los espermatozoides móviles de la
muestra pasen al medio separador, el puerto de entrada y el medio de
separación deben estar comunicados con líquido. Aunque
preferiblemente dicha comunicación se evita al
principio,previniendo por tanto la contaminación con el medio a
través del puerto de entrada antes de que se use el aparato. Esto
también puede evitar que el medio salga del recipiente a través del
puerto de entrada, aunque esto también se puede conseguir debido a,
por ejemplo, viscosidad o tensión de superficie del medio.
En esta incorporación, por tanto, el recipiente
comprende (e) un segundo accionador, que se utiliza para que el
medio de separación entre en comunicación con la muestra a través
del puerto de entrada. Esto se puede conseguir almacenando el medio
remotamente del puerto de entrada hasta que el segundo operador es
accionado o, de forma alternativa, teniendo un puerto de entrada que
al principio está cerrado o sellado y que se abre por medio del
accionador.
Por tanto, durante el uso del aparato, es segundo
accionador se acciona, haciendo que el medio de separación y el
puerto de entrada se comuniquen. Esto permite que los
espermatozoides móviles en la muestra migren de la muestra al medio
de separación. Después del periodo de incubación el (primer)
accionador se acciona, permitiendo por lo tanto que el medio de
separación (que ahora contiene espermatozoides móviles) abandone el
recipiente. Es preferible que el primer accionador no sea accionado
hasta que el segundo accionador lo haya sido.
Se puede apreciar que la característica (e) puede
ser accionada independientemente de la característica (d).
El recipiente puede ser de sección circular, p.e.
cónica o cilíndrica.
Los puertos de entrada y salida pueden tener
varias formas. Por ejemplo, el puerto de entrada puede ser la parte
abierta de un cilindro o un cono. Esta parte abierta puede ser
situada en una muestra y, cuando el medio de separación y la
muestra estén en comunicación, los espermatozoides pueden entrar en
el recipiente mediante la parte abierta. Puede ser deseable cubrir
la parte abierta con una malla o rejilla para ayudar a retener el
medio de separación de la muestra dentro del recipiente (mediante
tensión de superficie) sin evitar la entrada de espermatozoides de
la
muestra.
muestra.
El puerto de salida es preferiblemente una
entrada, agujero o apertura en la pared del recipiente que puede
seguir por un tubo o conducto fuera del recipiente.
Los puertos de entrada y salida estarán
preferiblemente dispuestos de tal forma que, durante el uso, el
puerto de salida esté sobre el puerto de entrada. De esa forma los
espermatozoides tendrán que nadar en contra de la gravedad para
salir del recipiente, aumentando la migración preferente de esperma
móvil vs. inmóvil.
Cualquier accionador adecuado se puede usar en el
aparato, p.e. botones, interruptores, etc. Cuando el recipiente sea
circular, el (primer) accionador debería ser un anillo giratorio
que contenga una abertura. El giro del anillo de posición cerrado
alinea la abertura con el anillo y la pared del recipiente,
permitiendo por tanto que el medio de separación de la muestra deje
el recipiente a través del puerto de salida.
Otra forma preferida es que el (primer) actuador
sirva para retirar fluido a un barrilete o tubo, p.e. retira el
émbolo de una jeringa. El émbolo bloqueará inicialmente el puerto
de salida pero, al retirar el émbolo, el medio de separación de la
muestra puede fluir a través del puerto de salida al espacio
interno de la jeringa. Un actuador adecuado para la retirada
efectiva del émbolo de la jeringa es una manilla giratoria adaptada
al émbolo, p.e. con un mecanismo de bastidor y piñón.
Cuando el aparato incluye un segundo actuador, es
preferible que éste sea un botón. Cuando se presiona el medio de
separación de prueba almacenado en el aparato se libera de forma
que alcance (p.e. mediante gravedad) el puerto de entrada. Esto se
puede conseguir mediante, por ejemplo, la inclusión de un depósito
de medio dentro del recipiente, sellado mediante una delgada pared,
junto con un fino cutter. La operación del segundo actuador hace que
el cutter perfore la pared liberando el medio.
Un sistema de depósito preferido es el que se
indica en WO02/20713, en el que el medio de separación se mantiene
dentro de un depósito herméticamente sellado. El aparato incluye
una aguja de ventilación para ventilar el medio del depósito, la
aguja de ventilación comprende una parte de entrega de fluido y una
parte de ventilación de depósito, siendo la parte de ventilación
del depósito distal a lo largo de la aguja de parte de entrega,
definiendo la parte de entrega y la parte de ventilación cada una
un canal desde la respectiva pared a través de la pared lateral de
la aguja. Los canales permiten que la parte de entrega, en uso,
entregue fluido del depósito, por ejemplo introduciendo aire en uno
de los lados y dispensando el fluido en el otro. En este caso, la
aguja de ventilación sería, preferiblemente, por lo menos en parte,
una cánula teniendo un punto canulado en la parte de entrega para
la entrega tipo pipeta. En una aguja con una parte proximal y una
distal, la parte distal puede comprender tanto la parte de
ventilación como la de entrega. La aguja tendrá preferiblemente una
sección en forma C en la parte de ventilación y la parte de
entrega. Los dos canales son preferiblemente unitarios,
extendiéndose el canal de la parte de ventilación a la parte de
entrega.
En una parte de ventilación, la aguja de
ventilación preferiblemente se extiende a través de dos partes de
pared del depósito de forma que la parte de ventilación forme un
pasaje a través de la primera pared para permitir que el contenedor
se ventile con aire y la parte de entrega forma un pasaje a través
de la segunda parte de pared, permitiendo que el fluido salga del
depósito.
Usando este tipo de sistema, la aguja funciona
mediante el segundo actuador (p.e. está unida a un botón o a un
mecanismo de avance de tornillo).
El medio de separación permite a los
espermatozoides móviles, en preferencia con el esperma inmóvil, a
migrar por este medio. Esto se puede conseguir utilizando cualquier
nivel separador adecuado (p.e. HEPES, EBSS, etc.), ya que los
espermatozoides móviles serán capaces de migrar activamente a través
del medio mientras que en una escala de tiempo relevante, los
espermatozoides inmóviles entrarán en el mejor de los casos
pasivamente por difusión. De todas formas se prefiere utilizar un
medio que aumente la migración de los espermatozoides móviles de la
muestra. Los medios adecuados incluyen mocus cervical (p.e. Keel
& Webster (1988) Fértil. Estéril. 49:138-143]
gel poliacrilamida [p.e. Lorton et al (1981) Fértil. Estéril.
35:222-225], ácido hialurónico [p.e. Aitken et
al. (1992) J. Androl. 13:44-54] o un derivado de
celulosa [p.e. WO01/12783 (Genosis Limited) como una
metilcelulosa.
El medio puede ser en forma de solución o de
gel.
Convenientemente, el medio de separación también
sirve para "lavar" la muestra, de forma que retira componentes
como plasma seminal.
Además de separar los espermatozoides móviles de
los inmóviles, se prefiere que el aparato pueda detectar los
espermatozoides móviles después de la separación. Así pues, el
aparato de la invención comprende preferiblemente medios de
detección de espermatozoides en comunicación con el recipiente del
puerto de salida. Los medios de detección pueden estar integrados
con el aparato o se pueden dar como componente separado para
insertar en el aparato antes, durante o después de la separación de
la muestra.
Así pues, la invención indica un aparato para
separar y detectar espermatozoides móviles en una muestra líquida,
teniendo el aparato:
- un recipiente de separación de muestra que
comprende:
- (a)
- un puerto de entrada de muestra
- (b)
- un puerto de salida de muestra, que inicialmente está cerrado;
- (c)
- un medio de separación de muestra en el que los espermatozoides móviles de la muestra pueden migrar a través del puerto de entrada de muestra; y
- (d)
- un accionador operativo para abrir el puerto de salida de la muestra permitiendo por tanto que el medio de separación fluya fuera del recipiente a través del puerto de salida de muestra
- un medio de detección de espermatozoides que
comprende:
- (i)
- una zona de aplicación en comunicación con el puerto de salida;
- (ii)
- una zona de detección, en la que la presencia de espermatozoides se puede detectar; y
- (iii)
- una zona reactiva que contiene un reactivo que es capaz de reaccionar con los espermatozoides para facilitar su detección en la zona de detección,
estando dispuestas estas zonas para
permitir el flujo capilar de espermatozoides de la zona de
aplicación a la zona de
detección.
Preferiblemente la zona de detección es una zona
después de la cual los espermatozoides no pueden fluir (una `zona
trampa'). Durante la operación el flujo de espermatozoides se debe
evitar más allá de la zona trampa, y el esperma se inmoviliza para
la detección. Preferiblemente la zona trampa utiliza los principios
indicados en WO00/20866 -la zona es porosa con un tamaño de poro tal
que los espermatozoides no pueden entrar. Durante el flujo en la
zona trampa, por lo tanto, el esperma es capturado en la entrada;
según aumenta la concentración de esperma, también aumenta la
cantidad ahí retenida.
La zona trampa se puede realizar de cualquier
material poroso adecuado (p.e. HDPR, nitrocelulosa) a través del
cual el esperma no pueda migrar. Este requisito se refleja en el
tamaño del poro de la zona trampa. La cabeza de un espermatozoide
humano es típicamente de 3-5 \mum de diámetro, y
la longitud de la cola suele ser de aproximadamente
50-60 \mum. El tamaño del poro se debe seleccionar
de acuerdo con estos datos (p.e. nitrocelulosa, con un tamaño de
poro nominal entre 5-8 \mum) y un tamaño de poro
apropiado se puede determinar empíricamente simplemente mediante
experimentación.
Debería ser obvio que cualquier material poroso
que encontremos antes de la zona trampa debe, en contraste con la
zona trampa, tener un tamaño de poro lo suficientemente grande para
permitir que los espermatozoides se muevan de forma relativamente
libre.
Como es bien sabido por los que conocen la
técnica, el tamaño nominal del poro de un material poroso se puede
determina por prueba de comprobación de partículas duras, es decir,
determinando el diámetro máximo de partículas esféricas que pueden
pasar a través del material. De forma alternativa, el tamaño del
poro de un material se puede determinar midiendo su "punto
burbuja". El punto burbuja es la presión requerida para forzar
aire a través de una membrana húmeda (con agua), y tiene
correlación con el tamaño del poro según se mide en la retención de
partícula (aunque en extremos de presión y tamaño de poro la
correlación puede ser menor). El punto burbuja es generalmente más
fácil de medir que la retención de partícula y es, por lo tanto, la
prueba preferida cuando se calcula el tamaño del poro.
La entrada a la zona trampa es preferiblemente
estrecha, de forma que el esperma esté centrado para dar una señal
más marcada.
Como zona de detección menos indicada, se pueden
utilizar anticuerpos antiesperma inmovilizado.
En una incorporación de la zona de detección la
detección se basa en acrosin. La zona de detección contendrá un
reactivo para detectar acrosin (p.e. ver Mortimer, practical
Laboratory Andrology (1994), página 90) y la zona de reactivo
incluirá un reactivo como proteasa K o el ionóforos calcio A23187
[Perry et al. (1997) J. Exp.Zool 279:284-290;
Perry et al. (1997) J. Exp.Zool 279:297-300
(1997); Perry et al. (1996) Reprod. Humana
11:1055-1062; Perry et al. (1995) Fértil.
Estéril. 64:150-159] que hace que los acrosomas se
abran. Un reactivo preferido para acrosomas de lisis es un nivel
separador de lisis que comprenda un 2% de SDS, 100 \mug/ml de
proteasa K en 10 mM Tris-HCl y 0.1 M EDTA. Durante
la migración, por lo tanto, el acrosin es liberado del esperma y
detectado más abajo en la zona de detección.
Normalmente, la zona reactiva contendrá un
reactivo que se une a espermatozoides intactos o a uno o más de sus
componentes, y esta reacción de unión se usa para generar una señal
visual. Por lo tanto, preferiblemente, la zona reactiva es la
"zona etiquetado", que contiene una etiqueta capaz de unir
espermatozoides. Ésta se usará preferiblemente en unión con la zona
trampa.
Típicamente, la etiqueta es un anticuerpo que se
puede unir a los espermatozoides y que ha sido cuidadosamente
etiquetada. Es preferible usar una etiqueta visible, como un oro
coloidal (que es visible como color rosa), aunque también se pueden
usar etiquetas fluorescentes, luminiscentes o radioactivas. Se
apreciaría que el término `anticuerpo' pueda incluir anticuerpos
policlonales o monoclonales así como fragmentos de anticuerpo (p.e.
F(ab)_{2}, Fc, etc.) en tanto en cuanto se mantenga
la reacción antiesperma.
Las etiquetas preferidas reconocen un antígeno de
superficie que está presente en la mayoría de una población de
espermatozoides más que en un subconjunto. Mientras que se puede
usar cualquier antígeno (p.e. P34H (WO97/40836), SALUD
PÚBLICA-10 (WO95/29188), ver también
EP-A-0387873), los antígenos
`universales' como el CD59 también se pueden utilizar. De forma
alternativa también se puede usar una solución colorante como la
eosina.
Se prefiere que la etiqueta no se active (p.e.
rehidratación de etiqueta de deshidratación) hasta que el medio de
separación de la muestra abandone el recipiente. Esto se puede
conseguir disponiendo la zona de etiqueta de forma que la etiqueta
allí contenida no se active hasta que se haya accionado el (primer)
accionador. Por lo tanto la etiqueta permanece quieta hasta que los
espermatozoides móviles han abandonado la muestra y entrado en el
medio de separación de muestra.
La zona de etiquetado se puede disponer en una
posición adecuada de tal forma que su etiqueta pueda contactar los
espermatozoides en la zona de detección (p.e. esperma retenido en la
zona trampa). Puede estar más arriba o más abajo de la zona de
aplicación o integrado en la misma. Si estás más arriba, el medio de
separación de ¡muestra que abandone el recipiente debe ser capaz de
contactar con la zona de etiquetado de forma separada de su contacto
con la zona de aplicación, para activar la etiqueta; si está más
abajo o integrado, el flujo activará la etiqueta
automáticamente.
Cuando los medios de detección incluyen tanto una
`zona trampa' como una `zona de etiquetado', el tamaño del poro de
la zona trampa será tal que la etiqueta libre (no unida a los
espermatozoides) pueda fluir a través, mientras que la etiqueta
unida a espermatozoides no pueda fluir. Por lo tanto, durante el
flujo en la zona trampa, la etiqueta unida es capturada en la
entrada. Según aumenta la concentración de esperma, también aumenta
la cantidad de etiquetas capturadas. Será obvio que la etiqueta debe
ser menor que los espermatozoides, de forma que la etiqueta libre no
sea retenida por la zona trampa.
Donde los medios de detección usen una etiqueta,
preferiblemente más abajo que la zona de detección que retiene las
etiquetas que no están unidas (la zona de `control de etiquetas').
Esto comprende típicamente anticuerpos inmovilizados que no se
pueden unir a etiquetas libres (p.e. si la etiqueta es un anticuerpo
de murino monoclonal, la zona de control de etiqueta puede utilizar
anticuerpo anti-mouse). La etiqueta que pasa por la
zona de detección (p.e. que no es capturada en la entrada a la zona
trampa) es retenida dentro de la zona de control de etiqueta, donde
se puede medir. Una comparación de la cantidad de etiquetas en la
zona de detección y la zona de control de etiqueta permite una
medición semi cuantitativa de la cantidad de espermatozoides en la
muestra.
La zona de aplicación es donde el medio de
separación de muestra que abandona el recipiente entra en contracto
con los medios de detección de espermatozoides. Se puede formar con
cualquier material adecuado para permitir el flujo capilar de
espermatozoides a través p.e. material fibroso, como un relleno de
material HDPE, fibra de poliéster unida, fibra de vidrio o
similar.
Aunque se ha descubierto que los espermatozoides
tienden a ser retenidos dentro de materiales fibrosos, reduciendo
por tanto la sensibilidad. Por lo tanto se prefiere el uso de no
fibrosos en la zona de aplicación. Ejemplos adecuados incluyen tubos
capilares, el espacio entre dos o más hojas de material yuxtapuesto
de forma tan próxima que el flujo capilar pueda ocurrir entre ellas,
o una serie de estrías o canales capilares paralelos. En dichas
disposiciones si la zona de etiquetado y la zona de aplicación
están integradas esto está preferiblemente formado por más de un
trozo de material de forma que la etiqueta se pueda aplicar desde el
montaje. Donde se utilizan hojas yuxtapuestas, por ejemplo, la
etiqueta se puede aplicar a una o más hojas, y después éstas se
pueden aproximar para permitir el flujo capilar. De forma similar,
donde se usan ranuras o canales paralelos la etiqueta se puede
aplicar al material acanalado y, opcionalmente, cubierta por otra
hoja.
En una disposición similar, el flujo capilar se
realiza después del material fibroso en vez de a través del mismo.
Al tiempo que fluye el líquido puede entrar en el material fibroso
(p.e. para re-hidratar una etiqueta ahí impregnada)
pero el flujo capilar principal a través de la zona de aplicación de
esperma no esta dentro del material fibroso.
La zona de aplicación y el puerto de salida de
muestra pueden ser esencialmente unitarios.
En incorporaciones preferidas, el flujo de una
muestra en la zona de detección es asistida por una mecha hacia
abajo, para ayudar el movimiento capilar.
Por lo tanto, durante el uso de aparatos
preferidos, el camino de migración de esperma móvil en la muestra
es: entrada en el medio de separación a través del puerto de entrada
del recipiente, salida del medio de separación a través del puerto
de salida del recipiente (después de accionar el accionador después
del periodo de incubación) entrada en la zona de aplicación, y flujo
capilar a la zona trampa, en la que se evitar más migración. Una
señal visible en la zona trampa indica la presencia de
espermatozoides en la muestra.
La señal visible dada por los medios de detección
es preferiblemente externa al recipiente, y todavía mejor una que
sea también visible desde el exterior del aparato.
Los medios de detección son preferiblemente en la
forma de línea de prueba de flujo lateral montada en la parte
exterior del recipiente.
Sería bueno que el recipiente pudiera incluir más
de un puerto de salida de muestra, cada uno de los cuales que pueda
llevar a diferentes medios de detección. Esto permite pruebas
independientes en la misma muestra p.e. una muestra por ensayo para
esperma móvil en una tira y una muestra por ensayo para reacción
acrosoma en otra tira. Esto también se puede conseguir utilizando un
único puerto de salida que baje a diferentes medios de detección
separados.
Para mejorar la separación de espermatozoides
móviles e inmóviles (p.e.
EP-A-0437508) se prefiere que el
aparato sea operado esencialmente a una temperatura fija.
Normalmente entre 30ºC y 44ºC, preferiblemente entre 35ºC y 39ºC y
todavía mejor a 37ºC. Por lo tanto, preferiblemente el aparato
incluye un sensor de temperatura.
El sensor de temperatura puede dar una señal
simple para indicar cuando se ha alcanzado la temperatura operativa.
El aparato podría ser sujetado en la mano del usuario o insertado
en un baño de agua caliente hasta que se da la señal.
Aunque sería mejor que el aparato incluyera su
propia fuente de calor, preferiblemente regulada, p.e. usando un
control mediante termostato. La fuente de calor daría calor
principalmente a la zona del recipiente que contiene el medio de
separación de muestra. Los circuitos de control y energía de la
fuente de calor pueden ser convenientemente disimulados dentro de
un botón actuador o dentro del cuerpo del aparato.
Sería positivo que la inclusión de regulación de
temperatura en el aparato pudiese funcionar independientemente de
las otras características del aparato.
El aparato de la invención puede ser utilizado
con cualquier muestra de líquido adecuada, que sería preferiblemente
una muestra de semen. El aparato puede incluir un receptáculo para
la muestra. Preferiblemente éste sería en forma de taza o superficie
deslizante en la que se pudiera depositar la muestra, después de lo
cual se recoge en la base (p.e. en un agujero). La entrada de
muestra se puede poner entonces en contacto con la muestra recogida.
El receptáculo también puede incluir un recipiente de desbordamiento
cerca de su base. El receptáculo puede estar integrado con el
aparato o puede ser facilitado como componente separado al que el
aparato deberá ser conectado antes, durante o después de la
deposición y/o recolección de la muestra.
Convenientemente, la interfaz entre el
receptáculo y el puerto de entrada del recipiente (p.e. donde el
recipiente se une al agujero) es de un área definida, ayudando por
lo tanto la reproducción de la muestra por ensayo.
El aparato de la invención puede ser producido de
forma simple y barata. Además, puede ser utilizado muy fácilmente
por ejemplo por el usuario particular. Por lo que la invención
facilita un aparato de muestra por ensayo que puede ser utilizado
en casa como prueba básica, por ejemplo, de fertilidad
masculina.
El aparato de la invención puede ser utilizado en
un proceso de separación de espermatozoides móviles de una muestra
de líquido, el proceso comprende los pasos de:
- (a)
- facilitar un recipiente con un puerto de entrada de muestra, un puerto de salida de muestra cerrado y un medio de separación de muestra;
- (b)
- permitir a los espermatozoides en la muestra la migración en el medio de separación de muestra en un periodo entre 5 y 60 minutos (preferiblemente unos 30); y
- (c)
- permitir que el medio de separación de muestra abandone el recipiente abriendo el puerto de salida de muestra.
Este proceso puede comprender inicialmente el
paso de la apertura el puerto de entrada.
Preferiblemente el proceso también comprende los
pasos para detectar los espermatozoides en el medio una vez que ha
salido del recipiente y por lo tanto pueden comprender los pasos
de:
- (i)
- permitir que el medio de separación de muestra que abandona el puerto de salida fluya por acción capilar a material capaz de inmovilizar los espermatozoides;
- (ii)
- contactar los espermatozoides con una etiqueta; y
- (iii)
- etiqueta de detección que es retenida a la entrada de dicho material.
La Figura 1 muestra un aparato de acuerdo con la
invención. La Figura 2 muestra este aparato después de su inserción
en un receptáculo. Las Figuras 3 a 6 muestran el funcionamiento de
este aparato. La Figura 7 muestra una visión general de la
utilización de este aparato.
La Figura 8 muestra un segundo aparato según la
invención, antes del uso. La Figura 9 muestra el mismo aparato
separado en dos partes constitutivas, con la Figura 10 mostrando una
visión de la pieza superior desmontada. La Figura 11 muestra la
construcción de la unión de la tira de prueba usada en el aparato.
Las Figuras 12 a 16 muestran una visión general del uso de este
aparato.
El aparato (10) mostrado en la Figura 1
comprende: un recipiente plástico cilíndrico (15); un puerto de
entrada de muestra (20), cubierto por una malla de nylon (21)
formada por hebras de 0.15 mm con espacios de 0.25 mm; un agujero
(30) en el lado, mostrado en su posición de abierto; una solución
(40) de EBSS suplementada con 0.88 mg/ml de ácido hialurónico y
0.45% BSA; un anillo giratorio de plástico (50) que incluye un
agujero (51) que es mostrado alineado con el agujero (30) para
formar un puerto de salida (35); un botón (60, mostrado apretado)
que alberga una batería y los circuitos para dar energía a una
fuente de calor en forma de circunferencia (70) y junto a la que
está el depósito de la solución (65, mostrado vacío), una hoja
sello (66, mostrada rota) y una hoja de cutter hueca (68); y una
tira de muestra montada externamente (80).
La Figura 2 muestra el aparato de la Figura 1
(10) junto a un receptáculo de semen (90) con paredes inclinadas.
Una muestra de semen (100) se ha recogido en el agujero (99) en la
base del receptáculo (90), pero parte del mismo se ha salido al
receptáculo de desbordamiento (95).
La Figura 3 muestra el aparato (10) justo antes
de ser utilizado. Una muestra de semen (100) se ha recogido en el
agujero (99) y está en contacto con el puerto de entrada (20). El
puerto de salida (35) está cerrado porque el agujero (51) en el
anillo (50) no está alineado con el agujero (30) en la pared del
recipiente. La solución (40) se mantiene en el depósito (65)
mediante hoja sello (66) apartada del puerto de entrada (20).
Para empezar la prueba, se aprieta el botón (60),
como se indica en la Figura 4ª. La hoja cutter (68) perfora el
sello (66) liberando la solución (40). El esperma móvil en la
muestra (100) está ahora en comunicación líquida con la solución
(40) y es capaz de migrar a la misma a través de la entrada (20)
como se muestra en la Figura 4B, mientras que el esperma inmóvil y
plasma seminal permanecen en la muestra (100). El botón (60)
también activa la fuente de calor (70) llevando la temperatura de
la solución (40) a 37ºC.
Después de un periodo de unos 30 minutos, durante
el cual el esperma móvil ha migrado a la solución (40), el anillo
(50) se gira, como se muestra en la Figura 5, de forma que su
agujero (51) quede alineado con el agujero (30), abriendo el puerto
de salida (35). La solución (40) que ahora contiene esperma móvil,
es libre para salir del recipiente y entrar en contacto con la tira
de prueba montada externamente (80).
Como muestra la Figura 6, la solución fluye por
acción capilar a través de las tiras de plástico yuxtapuestas muy
cerca (81 a&b) en la base de la tira de prueba (80). Entre las
cintas (81 a&b) hay un área (82) de murina
anti-CD59 etiqueta oro deshidratada. Según pasa la
solución por el are (82) entre las tiras (81 a&b), el
anticuerpo se re-hidrata y es capaz de unir los
espermatozoides en la solución. Más abajo la solución alcanza la
tira de nitrocelulosa (83). El tamaño del poro de la tira (83) es
demasiado pequeño para permitir que os espermatozoides entren, por
lo que son capturados en la entrada (84). Las etiquetas libres
siguen fluyendo hasta que son capturadas más abajo en la línea (85)
de anticuerpos inmovilizados anti-mouse.
Como se muestra en la Figura 7, la entrada (84) y
la línea (85) son visibles a través de ventanas. En la Figura 7E,
hay dos líneas visibles, indicando la presencia del espermatozoides
móviles en la muestra original. En contraste, sólo la línea de
control (85) es visible en la Figura 7F, indicando la ausencia de
esperma móvil en la muestra original.
El aparato (110) mostrado en las Figuras 8 y 9
comprende una pieza superior (191) y una inferior (190) que se
encajan. La base de la pieza inferior (190) contiene un agujero
(199) en el que se deposita la muestra de semen (200). La pieza
superior (191) incluye una ventana encastrada (113), un botón (160)
una manilla giratoria (150). La manilla (150) y el botón (160)
tienen una forma tal que la manilla (150) no puede girar hasta que
el botón (160) ha sido apretado.
En la Figura 10, se muestran los componentes
internos de la pieza superior (191) en una visión desmontada. La
pieza superior (1919) esta formada por una pieza superior (192) que
endenta en un asiento (193) en la parte inferior del botón (160)
hay una aguja (168) y, cuando se acciona el botón (160), la aguja
(168) perfora el depósito (165) que, antes de la operación contiene
la solución (140) de EBSS suplementada con 0.88 mg/ml de ácido
hialurónico y 0.45% BSA. El depósito (165) está en un soporte
plástico (166) con una parte de cuello (115) y una parte de cabeza
(120). El lado del cuello (115) contiene un agujero (130) que
endenta la parte del tubo (186) del ensamblado de tira de prueba
(180). La base de la parte de la cabeza (120) está cubierta con una
malla de nylon circular (121) formada por hebras de 0.15 mm con
espacios de 0.25 mm. En el aparato montado (110), la malla (121)
está en contacto con la muestra (200) dentro del agujero (199). La
manilla (150) está unida con un mecanismo de bastidor y piñón a un
émbolo (155) que, antes de usar, pasa a través del tubo (186) y
hacia el agujero (130). La base (193) contiene la batería (194) que
da energía a la fuente de calor (170). Cuando está montado, la
fuente de calor (170) está alrededor del cuello (115)
circunferencialmente, excepto en la zona del agujero (130).
En la Figura 11 se muestran vistas montada y
desmontada de la tira de prueba unida (180). En el aparato montado
(119), la parte tubular (186) comunica directamente con el agujero
(130) y antes del uso, el émbolo (155) endenta y llena el tubo
(186) previniendo por tanto el fluido del líquido por aquí. Según
se retira el émbolo (155) mediante el accionamiento de la manilla
(150) en dirección de la flecha de la Figura 11, el tubo (186) se
abre para formar, junto con el agujero (130) un puerto de salida
(135) a través del cual puede fluir el líquido. Por lo tanto el tubo
(186) y el émbolo (155) funcionan como una jeringa. El líquido
fluye a través del tubo (186) en el espacio capilar entre el
albergue del plástico (181a; 181b) y pasa bajo una almohadilla (182)
que contiene murina anti-CD59 etiqueta oro
deshidratada. Según pasa el líquido por la almohadilla (182) el
anticuerpo se re-hidrata y puede pasar al líquido,
donde se puede unir a los espermatozoides. El líquido sigue fluyendo
hacia y dentro de una tira de nitrocelulosa (183), ayudado por una
mecha (188): El tamaño del poro de la tira (183) es demasiado
pequeño para que los espermatozoides puedan entrar, de forma que son
capturados a su entrada (184). El anticuerpo se puede unir a los
espermatozoides a la entrada (184) y forma una línea rosa.
Cualquier anticuerpo libre continua fluyendo hasta que es capturado
en la línea más abajo (185) de anticuerpos
anti-mouse inmovilizados.
El aparato es utilizado como se ilustra en las
figuras 12 a 16:
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- En la Figura 12, una muestra de semen (200; p.e. obtenida mediante masturbación) es situada en la parte inferior (190) y recogida en el agujero (199) mientras que la parte inferior (190) permanece en una superficie plana.
- -
- Después de 30 minutos, la pieza superior (191) es unida a la pieza inferior (190) como se indica en la figura 13 para formar un aparato (110).
- -
- Se aprieta el botón (160) como se indica en la figura 14. Esto libera la solución (140) y activa la fuente de calor (170) llevando la temperatura de la solución (140) a 37ºC.
- -
- Después de unos 30 minutos, para permitir la entrada del esperma en la solución (140) y también el equilibrio de la temperatura, un LED (116) indica que la manilla (150) debe ser girada, como en la figura 15.
- -
- Esto retira el émbolo (155) y permite que los espermatozoides móviles de la muestra (200) que han nadado en el medio (140) pasen a la parte del tubo (186) de tira de prueba (180). La solución (140) fluye a través de la tira de prueba (180) mediante acción capilar hacia la mecha (188). El esperma en la solución es retenido en la entrada (184) de tira de nitrocelulosa (183). Los anticuerpos de etiqueta oro libres siguen fluyendo hasta que son capturados en la línea más abajo (185) de anticuerpos anti-mouse inmovilizados. La línea en (184) en la figura 16 indica un resultado positivo. La línea en (185) indica que la prueba ha funcionado correctamente.
Se entiende que la invención ha sido descrita
únicamente mediante ejemplos y se pueden hacer modificaciones
mientras se permanezca dentro del ámbito de las
reivindicaciones.
Claims (9)
1. un aparato para separar y detectar
espermatozoides móviles en una muestra líquida, teniendo el
aparato:
- un recipiente de separación de muestra que
comprende:
- (a)
- un puerto de entrada de muestra
- (b)
- un puerto de salida de muestra, que inicialmente está cerrado;
- (c)
- un medio de separación de muestra en el que los espermatozoides móviles de la muestra pueden migrar a través del puerto de entrada de muestra; y
- (d)
- un accionador operativo para abrir el puerto de salida de la muestra permitiendo por tanto que el medio de separación fluya fuera del recipiente a través del puerto de salida de muestra
- un medio de detección de espermatozoides que
comprende:
- (i)
- una zona de aplicación en comunicación con el puerto de salida;
- (ii)
- una zona de detección, en la que la presencia de espermatozoides se puede detectar; y
- (iii)
- una zona reactiva que contiene un reactivo que es capaz de reaccionar con los espermatozoides para facilitar su detección en la zona de detección,
estando dispuestas estas zonas para
permitir el flujo capilar de espermatozoides de la zona de
aplicación a la zona de
detección.
2. El aparato de la reivindicación 1 donde las
zonas están dispuestas para permitir el flujo capilar de
espermatozoides de la zona de aplicación a la zona de detección
mediante la zona reactiva.
3. El aparato de las reivindicaciones 1 ó 2 donde
en la zona de detección hay una zona trampa de espermatozoides capaz
de inmovilizar espermatozoides y la zona reactiva es una zona de
etiquetado que contiene una etiqueta capaz de unirse con los
espermatozoides.
4. El aparato de la reivindicación precedente,
donde el recipiente además comprende (e) un segundo accionador, que
se acciona para permitir que el medio de separación entre en
comunicación con la muestra mediante el puerto de entrada.
5. El aparato de la reivindicación 3 ó 4 donde la
zona trampa es porosa con un tamaño de poro tal que la etiqueta
libre puede fluir por el mismo, mientras que la etiqueta unida a los
espermatozoides no puede fluir por el mismo.
6. El aparato de la reivindicación 3 ó 4 donde
los medios de detección incluyen una zona posterior a la zona de
detección que retiene las etiquetas no unidas a espermatozoides.
7. El aparato de cualquier reivindicación
precedente donde la zona de aplicación no es fibrosa.
8. El aparato de cualquier reivindicación
precedente donde el aparato incluye un sensor de temperatura.
9. El aparato de la reivindicación 8 que incluye
su propia fuente de calor y, opcionalmente, medios de
regulación.
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