ES2712666T3 - Dispositivo - Google Patents
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Abstract
Un dispositivo para llevar a cabo un ensayo para detectar un ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo dicho dispositivo: (i) un primer pocillo (41) en el que puede efectuarse una reacción de amplificación de ácido nucleico de dicho ácido nucleico diana; (ii) un primer canal (44) que se extiende desde dicho primer pocillo (41); (iii) un dispositivo de ensayo de flujo lateral (45); y (iv) un pocillo de diluyente (48) que contiene diluyente y está conectado al primer pocillo (41), por medio de un segundo canal (46), en el que el pocillo de diluyente (48) comprende una bolsa flexible sellada que contiene diluyente, comprendiendo el pocillo de diluyente medios de perforación dispuestos para abrir la bolsa flexible cuando se aplica presión a la bolsa flexible; en el que el primer pocillo (41) tiene un volumen menor que el volumen del pocillo de diluyente (48); el dispositivo de ensayo de flujo lateral (45) está dispuesto para recibir una muestra desde dicho primer canal (44) en una membrana bibulosa del mismo, en el que dicha membrana contiene elementos que son capaces de detectar dicho ácido nucleico diana; y el segundo canal (46) está dispuesto de tal manera que el diluyente, cuando está contenido en el pocillo de diluyente (48), se puede transferir al primer pocillo (41).
Description
DESCRIPCION
Dispositivo
La presente invencion se refiere a dispositivos para su uso en la deteccion de acidos nucleicos en muestras tales como muestras biologicas.
La deteccion de acidos nucleicos en muestras, en particular muestras biologicas, es bien conocida en los campos de investigacion y diagnostico, en particular de enfermedades y afecciones geneticas, analisis forense y deteccion de microorganismos, por ejemplo, para higiene, vigilancia ambiental o fines militares, en los que se requiere que los microorganismos potencialmente daninos, como las bacterias, se detecten rapidamente.
Los dispositivos de flujo lateral (DFL) han sido utilizados durante mucho tiempo en el campo del diagnostico para detectar analitos diana, tales como proteinas, como hormonas, antigenos, anticuerpos, etc. En estos dispositivos, una muestra liquida que contiene o se sospecha que contiene el analito fluye a lo largo de una membrana, en la que encuentra marcadores, parejas de union marcadas y/o parejas de union inmovilizadas, en una secuencia mediante la cual se desarrolla una senal visible detectable sobre la membrana en funcion de la presencia o ausencia del analito en la muestra.
El volumen de liquido requerido para provocar que una muestra fluya efectivamente a lo largo de un DFL es generalmente bastante significativo. La membrana utilizada como sustrato para el DFL es porosa y generalmente absorbera cantidades significativas de liquido. Ademas, el flujo de liquido debe ser suficiente para garantizar que los restos marcados se transporten a la zona de deteccion en el dispositivo.
Estos tambien pueden usarse para detectar analitos que comprenden acidos nucleicos tales como ARN o ADN. En este caso, las parejas de union para los analitos incluiran oligonucleotidos que se hibridan con la secuencia diana especifica o, como alternativa, parejas de union para agentes de union que se han incorporado al ARN o al ADN, por ejemplo, durante una reaccion de amplificacion preliminar. Por ejemplo, las reacciones de amplificacion de acidos nucleicos tambien se pueden usar para incorporar un agente de union, como la biotina, en la diana para facilitar la captura en la zona de deteccion. Cuando la biotina se ha incorporado a un acido nucleico diana, la presencia de estreptavidina o anticuerpos anti-biotina en la zona de deteccion en el DFL dara lugar a la captura de acidos nucleicos diana marcados con biotina en la zona de captura.
El marcado puede efectuarse utilizando sondas marcadas que tambien se hibridan, por ejemplo, con la secuencia diana para producir una senal visible cuando la diana se inmoviliza en la zona de deteccion, o incorporando un marcador en la secuencia diana, por ejemplo, durante una reaccion de amplificacion en la que los cebadores marcados se utilizan para generar un producto intrinsecamente marcado. Los marcadores adecuados son bien conocidos en la tecnica, marcadores quimicos o bioquimicos tales como marcadores fluorescentes que incluyen, por ejemplo, fluoresceina o derivados de fluoresceina, o tintes de cianina, o marcadores que pueden detectarse enzimaticamente, como la digoxigenina. En otra realizacion, los marcadores pueden comprender marcadores en particulas tales como perlas o particulas de oro, plata y latex, que producen una senal directamente visible. Estos pueden estar dispuestos para interactuar con el acido nucleico diana en la zona de deteccion. Para lograr esto, las propias particulas se marcaran, por ejemplo, se conjugaran con restos que interactuan con el acido nucleico diana (por ejemplo, otros acidos nucleicos que se hibridan con el acido nucleico diana), o se pueden conjugar con un agente de union como la estreptavidina, que interactua con una pareja de union como la biotina, que se ha incorporado en la secuencia de acido nucleico diana.
De hecho, en la mayoria de los casos, la concentracion de acido nucleico diana en una muestra biologica es baja, y ciertamente inferior a la que puede generarse una senal directamente visible en un DFL. Por lo tanto, como una etapa preliminar, generalmente se requiere la amplificacion del acido nucleico.
Las tecnicas de amplificacion de acido nucleico son una herramienta poderosa en esta area. Existen muchas tecnicas, algunas de las cuales se llevan a cabo de forma isotermica, y otras que requieren ciclos termicos, como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingles), que permiten que se amplifiquen cantidades muy pequenas de acido nucleico diana en una muestra hasta niveles detectables.
Sin embargo, la extrema sensibilidad de estas tecnicas significa que son muy propensas a la contaminacion o contaminacion cruzada. Incluso una cantidad muy pequena de acido nucleico contaminante puede estar sujeta a amplificacion en estos procedimientos, lo que conduce a falsos positivos.
Se han realizado muchos intentos para abordar este problema, los cuales se centran principalmente en garantizar que la muestra se trate en un entorno aislado del procedimiento de amplificacion en la medida de lo posible. Por lo tanto, se han desarrollado procedimientos para llevar a cabo una reaccion de amplificacion y detectar el producto de amplificacion en una reaccion homogenea, en la que el recipiente de reaccion no tiene que abrirse.
Sin embargo, con frecuencia es necesario someter una muestra biologica a algunas etapas de pretratamiento para liberar acidos nucleicos, por ejemplo, de celulas eucarioticas y procarioticas o de virus, para permitir que se produzca la amplificacion. Claramente, es deseable que tales procedimientos se lleven a cabo de una manera que minimice cualquier riesgo de contaminacion.
Por ejemplo, la Patente de EE. UU. N° 6,649,378, la Publicacion de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2004/0l 10167 y la Publicacion de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2006/0160078 describen una gama de dispositivos independientes que integran la extraccion, amplificacion y deteccion de acido nucleico en un solo dispositivo.
En general, sin embargo, tales dispositivos requieren manipulaciones fisicas para llevar a cabo el procedimiento. Por ejemplo, los dispositivos de la Patente de EE. UU. N° 6,649,378 y de la Publicacion de Solicitud de Patente de e E. UU. No. 2004/0110167 describen sistemas en los que la extraccion de ADN se lleva a cabo en un primer dispositivo, los contenidos se transfieren a un tubo de amplificacion, tal como un tubo PCR, y finalmente, un dispositivo de flujo lateral ("barra de resultado") se introduce en el tubo. Las manipulaciones de este tipo pueden resultar en la introduccion de contaminantes.
El dispositivo de la Publicacion de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2006/0160078 describe un sistema en el que la extraccion, amplificacion y deteccion se lleva a cabo en varias zonas en una membrana de un DFL, en el que cada una de las zonas se separa inicialmente y luego se juntan secuencialmente, por ejemplo, mediante la eliminacion de una lamina plastica intermedia o utilizando un embolo para bajar una zona a la zona posterior. Sin embargo, en este caso, los volumenes de liquido que estan presentes en cada etapa son, en cierta medida, una funcion de los requisitos de la membrana del DFL y de como este absorbe o transmite el liquido. Sin embargo, las reacciones de amplificacion optimizadas pueden llevarse a cabo preferentemente en solucion en pequenos volumenes de liquido "libre", lo que no podria ser posible en circunstancias como la divulgada en la Publicacion de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2006/0160078, en la que se requiere que los volumenes fluyan a traves de un DFL.
La Solicitud WO 2004/065010 divulga un sistema microfluidico para el aislamiento y la amplificacion de ADN y la deteccion en un DFL. La Solicitud WO 2009/080817 divulga un sistema de prueba rapida para el analisis de acidos nucleicos.
Existe la necesidad de un sistema integrado que permita que el analisis se lleve a cabo rapidamente sin la necesidad de operaciones manuales onerosas y con un riesgo minimo de contaminacion y con una eficiencia maxima.
Los solicitantes han desarrollado un aparato que permite que el analisis de acido nucleico se lleve a cabo en una unidad aislada, que puede ser desechable, con un riesgo minimo de contaminacion.
En particular, los solicitantes han disenado un dispositivo en el que se puede llevar a cabo una amplificacion de acido nucleico en la fase liquida en un pocillo de volumen conveniente, y el producto de tal reaccion se transfiere a una membrana de un dispositivo de flujo lateral sin exponerse al medio ambiente.
Como resultado, la presente invencion proporciona un dispositivo para llevar a cabo un ensayo para detectar un acido nucleico diana en una muestra, comprendiendo dicho dispositivo
(i) un primer pocillo en el que puede efectuarse una reaccion de amplificacion de acido nucleico de dicho acido nucleico diana;
(ii) un primer canal que se extiende desde dicho primer pocillo;
(iii) un dispositivo de ensayo de flujo lateral; y
(iv) un diluyente que contiene un diluyente y que esta conectado al primer pocillo, por medio de un segundo canal, comprendiendo el diluyente una bolsa flexible sellada que contiene diluyente, comprendiendo el diluyente medios de perforacion dispuestos para abrir la bolsa flexible cuando se aplica presion a la bolsa flexible;
en el que
el primer pocillo tiene un menor volumen que el volumen del diluyente; el dispositivo de ensayo de flujo lateral esta dispuesto para recibir una muestra de dicho primer canal en una membrana bibulosa del mismo, en el que dicha membrana contiene elementos que pueden detectar dicho acido nucleico diana; y
el segundo canal esta dispuesto de tal manera que el diluyente, cuando esta contenido en el pocillo de diluyente, se puede transferir al primer pocillo.
Dependiendo de los volumenes usados, el liquido que pasa a lo largo del primer canal puede suministrarse directamente a una seccion de recepcion de muestras de un dispositivo de ensayo de flujo lateral. Esto puede
comprender una almohadilla de absorcion. Sin embargo, en una realizacion particular, en la que se suministran volumenes significativos a traves del primer canal, puede ser conveniente proporcionar un segundo pocillo dispuesto para recibir liquido de dicho primer canal. En tales casos, el dispositivo de ensayo de flujo lateral esta dispuesto para recibir la muestra de dicho segundo pocillo. Por ejemplo, una seccion de recepcion del dispositivo de ensayo de flujo lateral puede proyectarse en el segundo pocillo. Esto puede ser conveniente cuando los volumenes que se suministran son mayores de lo que pueden ser absorbidos convenientemente directamente por una seccion de recepcion del dispositivo de flujo lateral.
De este modo, en una realizacion particular, la presente invencion proporciona un dispositivo para llevar a cabo un ensayo para detectar un acido nucleico diana en una muestra, comprendiendo dicho dispositivo:
(i) un primer pocillo en el que se puede efectuar una reaccion de amplificacion de acido nucleico de dicho acido nucleico diana en la fase liquida;
(iia) un segundo pocillo conectado a dicho primer pocillo por medio de un primer canal, en el que el primer canal esta dispuesto de tal manera que los contenidos de dicho primer pocillo se pueden transferir al segundo pocillo;
(iii) un dispositivo de ensayo de flujo lateral dispuesto para recibir una muestra de dicho segundo pocillo y detectar dicho acido nucleico diana en su interior.
El dispositivo de la invencion puede ser un dispositivo unitario que contiene todos los elementos (i), (ii) y (iii), asi como (iia) cuando sea apropiado, en una unidad o entidad integral. Por ejemplo, todos los elementos del dispositivo pueden estar contenidos dentro de una sola carcasa.
Como se usa en la presente memoria, la expresion "dispositivo de ensayo de flujo lateral" se refiere a cualquier dispositivo de ensayo que funcione mediante el flujo de liquido a lo largo de una membrana bibulosa. Por lo tanto, esto incluye "tiras reactivas" convencionales que se pueden usar verticalmente, asi como dispositivos en los que las membranas se fijan en una posicion horizontal, de tal modo que el flujo a lo largo de la membrana se produce horizontal o lateralmente.
El termino "canal" se refiere a una trayectoria definida en un cuerpo solido a traves del cual el liquido puede fluir libremente, por ejemplo, bajo la influencia de la presion diferencial y/o la gravedad, y en particular no se basa necesariamente en la accion capilar.
Mediante la combinacion de secciones en las que el liquido se transfiere por flujo bibuloso con secciones en las que se permite el flujo normal de liquido dentro del mismo dispositivo, el dispositivo de la invencion permite que cada etapa del ensayo (amplificacion y deteccion) se lleve a cabo bajo las condiciones preferentes. Por lo tanto, el volumen de cualquier mezcla de reaccion de amplificacion en el primer pocillo se puede seleccionar para proporcionar condiciones de amplificacion optimas. Sin embargo, ese volumen puede aumentarse mediante la adicion de diluyente, en la transferencia al segundo pocillo, y posteriormente al dispositivo de flujo lateral para proporcionar los volumenes preferentes para su uso en el dispositivo de ensayo de flujo lateral. La transferencia de liquido entre las secciones de flujo de liquido bibuloso y normal se facilita por el hecho de que las secciones estan contenidas dentro del mismo dispositivo. Ademas, el dispositivo es susceptible de operacion automatica o semiautomatica del ensayo.
En una realizacion particular, el segundo pocillo esta cerrado. El primer canal que conecta el primer pocillo con el segundo pocillo esta encerrado adecuadamente dentro del dispositivo, por ejemplo, dentro de una carcasa que contiene al menos el primer y el segundo pocillos.
En otra realizacion, el primer pocillo se puede cerrar.
Como se usa en la presente memoria, el termino "cerrado" significa que los pocillos estan aislados de la atmosfera, aunque pueden estar en comunicacion entre si. De manera similar, el termino "que se puede cerrar" se refiere a un pocillo que puede estar aislado de la atmosfera, por ejemplo, mediante una cubierta, tapa, tapon o sello.
Cuando el segundo pocillo esta cerrado y el primer canal tambien esta cerrado, se pueden llevar a cabo reacciones de amplificacion y el producto de amplificacion resultante se transfiere a un dispositivo de flujo lateral para su deteccion sin exposicion a la atmosfera, minimizando asi el riesgo de contaminacion.
El dispositivo proporciona que la reaccion de amplificacion se pueda llevar a cabo en un pequeno volumen de liquido, que es preferible o incluso optimo para la reaccion de amplificacion, y el producto de amplificacion se puede diluir lo suficiente antes de que ingrese en el segundo pocillo para permitirle que fluya libremente a lo largo del dispositivo de flujo lateral, mediante la adicion del diluyente. El diluyente contiene diluyentes precargados. El diluyente se suministra dentro de un recipiente sellado, que se puede abrir dentro del tercer pocillo solo cuando se requieren diluyentes para su uso. Esto evita que el diluyente liquido entre en contacto prematuramente con la
membrana del dispositivo de flujo lateral antes de su uso, lo que puede causar que el dispositivo se deteriore. El primer pocillo esta adaptado para permitir especificamente que se lleve a cabo una reaccion de amplificacion de acido nucleico en el mismo. Dichas reacciones generalmente se llevan a cabo en volumenes relativamente pequenos y, por lo tanto, el volumen del primer pocillo sera relativamente pequeno, tal como sera explicado mas adelante.
En particular, sin embargo, el primer pocillo se adapta adecuadamente para que este disponible para calentarse a las temperaturas deseadas generalmente implicadas en una amplificacion de acido nucleico. Por lo tanto, el pocillo esta construido adecuadamente de un material que es resistente a tales temperaturas y/o fluctuaciones y cambios de temperaturas que estan involucrados en una reaccion tipica de amplificacion de acido nucleico. En realizaciones particulares, el primer pocillo esta dispuesto en un saliente o extremidad del dispositivo de tal modo que este facilmente disponible para calentamiento y/o refrigeracion para efectuar una amplificacion de acido nucleico, por ejemplo, utilizando dispositivos de calentamiento externos o, cuando sea apropiado, termocicladores.
En una realizacion particular, el primer pocillo tiene un menor volumen que el segundo pocillo, en el que estan presentes terceros pocillos. Por ejemplo, el primer pocillo puede tener una capacidad de 10-250 pl, como por ejemplo de 15-50 pl, por ejemplo, aproximadamente 25 pl, mientras que el segundo pocillo y los pocillos diluyentes tienen capacidades adecuadas en el intervalo de 40-4000 pl, por ejemplo de 40 2500pl. En una realizacion particular, el segundo pocillo y el pocillo de diluyente pueden tener capacidades de aproximadamente 2500 pl. En otras realizaciones, las capacidades de los pocillos pueden ser de 40-1000 pl, tales como de 50-250 pl, por ejemplo, aproximadamente 100 pl. Por ejemplo, el diametro del primer pocillo puede estar en el intervalo de 2-3 mm con una profundidad de aproximadamente 4-10 mm, por ejemplo, aproximadamente 5 mm, mientras que el diametro del segundo pocillo y los pocillos diluyentes pueden estar en el intervalo de 7-20 mm, por ejemplo, de unos 10 mm con una profundidad similar.
Esta disposicion significa que el dispositivo es adecuado para llevar a cabo un intervalo de reacciones quimicas o bioquimicas en las que la propia reaccion se efectua de manera optima en un volumen relativamente pequeno de liquido, y ese volumen es generalmente mas pequeno que el requerido para proporcionar una senal de manera efectiva en un dispositivo de flujo lateral convencional.
Adecuadamente, el dispositivo de ensayo de flujo lateral esta completamente encerrado dentro del dispositivo, por ejemplo, esta encerrado dentro de una carcasa del dispositivo, tambien para minimizar el riesgo de contaminacion. En este caso, se proporciona adecuadamente una ventana de visualizacion en el dispositivo o carcasa para permitir la lectura de los resultados del ensayo, o cualquier carcasa en si misma esta hecha de un material transparente.
El dispositivo de ensayo de flujo lateral puede disponerse de tal modo que la membrana se proyecte en el segundo pocillo y, por lo tanto, absorba la muestra directamente del segundo pocillo. Sin embargo, en una realizacion particular, un elemento de flujo de liquido, en particular un elemento de absorcion esta dispuesto para recibir la muestra del segundo pocillo y transferirla a una seccion de recepcion de muestras de la membrana del dispositivo de flujo lateral. Los elementos de absorcion adecuados incluyen una almohadilla de fibra de absorcion, por ejemplo, construida a partir de un material fibroso denso e hidrofilo tal como celulosa o similares. El elemento de absorcion al menos se proyecta en el segundo pocillo en un extremo, y entra en contacto con una region final de la membrana del dispositivo de ensayo de flujo lateral en el otro extremo, con el fin de garantizar que el liquido se transfiera desde el segundo pocillo a la membrana con un flujo aceptable y controlado. En una realizacion particular, el elemento de absorcion alinea la base del segundo pocillo de modo que el liquido suministrado en el pocillo se aplica directamente al elemento de absorcion.
El elemento de absorcion puede actuar por si mismo como un deposito para los reactivos utilizados en el dispositivo de ensayo de flujo lateral para desarrollar una senal. Por ejemplo, las parejas de union para el acido nucleico diana amplificado, que estan adecuadamente marcadas como se describe anteriormente, pueden almacenarse dentro del elemento de absorcion. Posteriormente, se transfieren con la muestra a lo largo de la membrana del dispositivo de ensayo de flujo lateral a la zona de deteccion apropiada sobre la membrana.
El dispositivo es adecuadamente una unidad desechable destinada para un solo uso. Al menos una parte del dispositivo y preferentemente todo el dispositivo esta adecuadamente contenido dentro de una carcasa que esta hecha adecuadamente de un material plastico rigido.
El primer pocillo puede calentarse o enfriarse de manera controlable. Aunque los elementos de calentamiento, tales como los elementos de calentamiento resistivos, elementos de refrigeracion o elementos de termostato, asi como elementos de control de temperatura o de medicion de temperatura, como termistores o termopares, se pueden incluir dentro del propio dispositivo, en una realizacion particular, el primer pocillo esta dispuesto para ser
adyacente para, en contacto con o de otro modo abarcado por tales elementos dentro de un aparato, adaptarse para acomodar el dispositivo para los fines del ensayo. El dispositivo esta adecuadamente adaptado para acoplarse en el aparato de tal modo que el primer pocillo pueda someterse a un calentamiento que sea un calentamiento adecuadamente controlado.
De este modo, por ejemplo, el primer pocillo puede extenderse hacia afuera de la carcasa, por ejemplo, en un saliente como se describio anteriormente, de tal modo que puede acomodarse dentro de un pocillo correspondiente dentro de un elemento de calentamiento o termociclado tal como un calentador de bloque que opcionalmente forma parte del aparato. Alternativamente, el pocillo saliente puede estar dispuesto para acoplarse dentro de una camara de refrigeracion o calentamiento por aire de, por ejemplo, un calentador de aire forzado, un termociclador o un termostato.
Alternativamente, el dispositivo puede incluir ranuras, canales u otro tipo de acanaladuras, dispuestos de modo que los elementos de calentamiento o termostato dentro del aparato se proyecten dentro del dispositivo alrededor o cerca del primer pocillo cuando el dispositivo se coloca dentro del aparato, con el fin de permitir el calentamiento controlado de los contenidos del primer pocillo.
Si se desea, se puede lograr una mezcla mas eficiente de los contenidos del primer pocillo con el diluyente proporcionando uno o mas diluyentes adicionales que contengan pocillos dentro del dispositivo. Estos se disponen de manera adecuada para que las corrientes separadas de diluyente se introduzcan en el segundo pocillo junto con el contenido del primer pocillo. Adecuadamente, las corrientes convergeran antes de entrar en el segundo pocillo para inducir un flujo turbulento que proporcione una mejor mezcla de los contenidos del primer pocillo con el diluyente, antes de que se aplique al dispositivo de flujo lateral.
El flujo de los multiples pocillos de diluyente se coordina y controla adecuadamente para asegurar una mezcla beneficiosa.
Los propios canales tendran una disposicion tal que puedan facilitar la transferencia necesaria. De este modo, por ejemplo, el primer canal puede conectarse a la base del primer pocillo para que todo el material pueda ser eliminado del mismo. El primer canal puede entrar en el segundo pocillo en una region superior del mismo. De manera similar, el segundo canal puede enlazarse a la base del tercer pocillo y conectarse a una region superior del primer pocillo.
El segundo pocillo tiene una mayor capacidad que el primer pocillo, por lo que el diluyente administrado en el primer pocillo desbordara efectivamente el primer pocillo, en el segundo pocillo. Por lo tanto, el producto de cualquier amplificacion en el primer pocillo se puede suministrar en forma diluida al segundo pocillo.
En general, una region de extremo que comprende la zona de recepcion de muestras de la membrana del DFL se ubicara dentro del segundo pocillo, de tal modo que el liquido que contiene cualquier acido nucleico amplificado se absorba en la membrana y se extienda a lo largo de su longitud. Una o mas zonas de deteccion o control, en las que estan inmovilizadas las parejas de union adecuadas para los restos diana, se proporcionan en la membrana aguas abajo de dicho extremo de la manera convencional, de tal modo que los acidos nucleicos diana se capturan (o de lo contrario, en el caso de un formato de ensayo competitivo) en dicha zona. Los acidos nucleicos se marcan adecuadamente ya sea directamente durante la reaccion de amplificacion o por contacto con una sonda marcada, que se introduce en la reaccion de amplificacion o se localiza de manera movil en el DFL. Por lo tanto, la acumulacion de material marcado, por ejemplo, asociado con marcadores en particulas (por ejemplo, cuentas de latex) como se describe anteriormente en una zona de deteccion, da lugar a una senal visible en el DFL. Ejemplos de tales dispositivos se ilustran, por ejemplo, en la Solicitud US2004/0110167.
Las membranas adecuadas pueden comprender materiales a base de celulosa tales como celulosa, nitrocelulosa o carboximetilcelulosa, polimeros hidrofilos que incluyen polimeros sinteticos hidrofilos tales como poliesteres, poliamidas, polimeros de carbohidratos, polimeros hidrofobos tales como polimeros halogenados tales como politetrafluoroetileno, fibra de vidrio o polimeros porosos.
Las membranas particularmente adecuadas incluyen membranas de celulosa y en particular membranas de nitrocelulosa que pueden laminarse, tales como las disponibles de Millipore. Estas pueden apoyarse sobre un material de refuerzo, como una membrana con refuerzo de plastico, como un poliester (Mylar®) o una membrana de celulosa con refuerzo de PET. El refuerzo de tales membranas es naturalmente hidrofobo, mientras que la celulosa en si misma es hidrofila, lo que da lugar al efecto de absorcion necesario. Sin embargo, la hidrofilicidad puede dar lugar a problemas cuando las membranas se utilizan en el contexto de un procedimiento de inmunoensayo. Las membranas utilizadas en estos dispositivos pueden, si es necesario, bloquearse utilizando agentes bloqueadores convencionales. Los agentes bloqueadores son aquellos que pueden reducir las interacciones no especificas entre cualquier proteina en la muestra y la membrana o aumentar la velocidad de absorcion de la muestra. Generalmente se aplican despues de la aplicacion de agentes de union inmovilizados y generalmente se seleccionan entre tres tipos de agentes que incluyen proteinas, tensioactivos y polimeros
sinteticos. Los ejemplos particulares de proteinas que se pueden usar como agentes bloqueadores incluyen albumina de suero bovino (ASB), de componentes de leche en polvo sin grasa, como la caseina.
Ejemplos de tensioactivos que se pueden usar como agentes bloqueadores incluyen tensioactivos no ionicos tales como el monolaureato de polioxietilen sorbitan que se vende con el nombre comercial de Tween™ 20, y los etoxilatos de octilfenol, por ejemplo, como los vende Dow como la serie Triton X™. por ejemplo, Triton X-100. Los polimeros sinteticos adecuados para usar como reactivos bloqueadores incluyen alcohol polivinilico (APV), polivinilpirrolina (PVP), polietilenglicol (PEG) y eteres grasos de polioxietileno, tales como los derivados de los alcoholes de laurilo, cetilo, estearilo y oleilo y que se venden bajo el nombre comercial de Brij™.
En general, se reconoce que pueden emplearse particularmente mezclas de dos o mas de estos tipos o clases de reactivos bloqueadores, por ejemplo, una mezcla que comprende un tensioactivo y un polimero sintetico, tal como se describio anteriormente.
En una realizacion preferente, sin embargo, no se usa ningun agente bloqueador en la membrana.
Los reactivos para llevar a cabo la amplificacion, tales como cebadores, enzimas, sondas, etc. pueden precargarse en el primer pocillo para que este listo para recibir la muestra directamente para la amplificacion. En particular, dichos reactivos pueden estar presentes en forma seca y, en particular, liofilizada, para asegurar que no se descompongan o reaccionen prematuramente. Sin embargo, en una realizacion particular, dichos reactivos se introducen en el dispositivo mediante el uso de un dispensador de reactivos que esta adecuadamente en forma de un "tapon", varita o tapa, con los reactivos liofilizados en una superficie exterior de los mismos. Por lo tanto, el dispensador de reactivos tambien actua para cerrar el primer pocillo una vez que se hayan agregado los reactivos.
Dichos dispensadores de reactivos pueden suministrarse por separado a los dispositivos, ya que estos seran especificos para un ensayo de acido nucleico particular, mientras que los dispositivos en si mismos se pueden usar en general en una gama de ensayos. Sin embargo, pueden suministrarse en combinacion con los dispositivos y, por lo tanto, la invencion proporciona ademas una combinacion de un dispositivo como se describio anteriormente y un dispensador de reactivos (o un tapon, varita o tapa). Los dispensadores de reactivos, como los tapones, las varitas o las tapas, se suministran adecuadamente en un recipiente sellado, que se empaqueta por separado de otros elementos de la combinacion, como el dispositivo, para garantizar que permanezcan libres de humedad.
En cualquier caso, se prefiere que los componentes liquidos de la reaccion de amplificacion, como el tampon de amplificacion, se introduzcan en el primer pocillo solo al comienzo de la reaccion de amplificacion. Esto minimiza los riesgos de contaminacion y tambien evita que ocurran reacciones prematuras.
Para lograr lo anterior, el dispositivo comprende adecuadamente un cuarto pocillo cerrado, precargado con reactivos liquidos, tales como tampones de ensayo. Asi este cuarto pocillo actua como deposito para los reactivos. Tambien esta vinculado al primer pocillo por medio de un canal, de tal modo que los contenidos pueden suministrarse en el primer pocillo cuando sea necesario para llevar a cabo una reaccion de amplificacion. En general, es preferible que la reaccion de amplificacion llevada a cabo sea una de las muchas reacciones de amplificacion isotermica conocidas en la tecnica, tales como la amplificacion basada en la secuencia de acido nucleico (NASBA), la amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA), la amplificacion mediada por transcripcion (TMA), la amplificacion isotermica mediada por bucle (LAMP), la amplificacion de circulo rodante y Q-beta replicasa, 3SR, la amplificacion por ramificacion (segun lo descrito por Zhang et al., Diagnostico Molecular (2001) 6 N° 2, p141-150), la amplificacion de polimerasa recombinasa (disponible de TwistDx) y otras. La muestra puede, si se requiere, y si una muestra esta disponible en una forma adecuada, agregase directamente al primer pocillo. Sin embargo, en general, como se menciono anteriormente, es necesario extraer y purificar acidos nucleicos de muestras, en particular muestras biologicas.
El dispositivo puede incluir ademas un sistema de purificacion y/o extraccion de acido nucleico. Si bien esto puede tomar varias formas, un medio particularmente preferible para extraer acidos nucleicos purificados de una muestra implica el uso de una membrana bibulosa, como se describe en la solicitud WO2007/104962. Al permitir que una muestra liquida fluya a lo largo de una membrana bibulosa del tipo descrito anteriormente en relacion con los DFL, se ha encontrado que los acidos nucleicos se unen a la superficie de la membrana, lo que proporciona un medio para separar el acido nucleico del resto del material en la muestra. Se puede incorporar una membrana bibulosa para fines de extraccion y purificacion de acido nucleico en el dispositivo.
La membrana puede estar sustancialmente encerrada dentro del dispositivo para minimizar el riesgo de contaminacion. La membrana esta dispuesta para extenderse entre un quinto pocillo, que actua como un pocillo de retencion o recepcion de muestras y el primer pocillo, de tal modo que la muestra en el quinto pocillo puede
dirigirse a lo largo de la membrana hasta el primer pocillo. Adecuadamente, la membrana se extiende al menos parcialmente sobre la abertura del primer pocillo. Con esta disposicion, se puede cortar una pequena seccion de la membrana de la misma, por ejemplo, utilizando un cortador provisto en el tapon, la varita o la tapa descritas anteriormente. Esta accion hace que la seccion de membrana caiga en el primer pocillo, con lo cual puede mezclarse con otros reactivos en el tapon, la varita o la tapa, y el tampon del cuarto pocillo pueda formar una mezcla de reaccion de amplificacion. Cualquier acido nucleico presente en la seccion de membrana puede amplificarse acordemente.
Aunque en algunos casos el quinto pocillo puede actuar como el pocillo de recepcion de muestras, generalmente es preferible que una muestra se someta a un procesamiento previo, por ejemplo, para lisar celulas o microorganismos presentes en la muestra para liberar contenidos celulares antes de que se extraiga el acido nucleico. Para este fin, el quinto pocillo se puede cerrar como se describio anteriormente, pero se puede conectar a un sexto pocillo abierto provisto en el dispositivo, por medio de un canal apropiado. En este caso, la muestra liquida se puede agregar al sexto pocillo para una etapa de lisis preliminar, antes de transferirla al quinto pocillo y la region final de la membrana bibulosa. La transferencia en este caso se efectuara adecuadamente utilizando una fuente de energia cinetica tal como una fuente de presion hidraulica o neumatica o una fuente de vacio, y de este modo el quinto y sexto pocillos estaran provistos de puertos dispuestos adecuadamente para la conexion al sistema de energia cinetica del aparato. En el caso de que exista un sistema neumatico, tambien pueden requerirse puertos de ventilacion adecuados conectados al quinto pocillo.
La lisis celular se puede efectuar de varias maneras. Por ejemplo, se puede agregar un agente caotropico como el clorhidrato de guanidina o un detergente al pocillo de recepcion de muestras, o se puede dispensar previamente en el mismo. Sin embargo, los procedimientos adecuados mediante los cuales se logra la lisis celular en el pocillo de recepcion de muestras pueden ser esencialmente por medios fisicos, como la aplicacion de calor o sonicacion, y en particular calentando el pocillo a temperaturas de aproximadamente 100 0C en el pocillo de recepcion de muestras. El aparato en el que se coloca el dispositivo para el ensayo esta provisto de medios de calentamiento capaces de efectuar este procedimiento o un dispositivo de sonicacion.
El pocillo de recepcion de muestras (ya sea el quinto o sexto pocillo) se puede cerrar adecuadamente, por ejemplo, mediante un tapon o tapa una vez que se le haya agregado la muestra, y antes o despues de que el dispositivo haya sido colocado dentro del aparatos con el fin de llevar a cabo un ensayo.
Cuando se obtienen muestras liquidas, estas pueden agregarse al pocillo de recepcion de muestras (ya sea el quinto o sexto pocillo) antes de la realizacion de la operacion de lisis. Sin embargo, si la muestra esta en una forma solida como una muestra de hisopo, entonces es posible que sea necesario lavar el hisopo para liberar el material de prueba. En este caso, el dispositivo puede estar provisto de un septimo pocillo que esta adecuadamente cerrado y que contiene un fluido de lavado.
De este modo, en uso, el dispositivo descrito anteriormente se carga en un aparato adaptado para recibirlo. Los elementos de calentamiento controlables provistos en el aparato pueden interactuar con el primer pocillo con el proposito de llevar a cabo una reaccion de amplificacion de acido nucleico en el mismo, y opcionalmente tambien con un pocillo de recepcion de muestras para instigar la lisis celular por calor si es necesario. El aparato esta programado adecuadamente para realizar varias etapas del procedimiento, incluyendo la transferencia de liquidos de un pocillo a otro y el calentamiento de los pocillos apropiados automaticamente, en una secuencia que garantiza que el acido nucleico se extrae de una muestra, se purifica, se amplifica y se detecta en una sola operacion.
En la presente memoria se describe un sistema para llevar a cabo un ensayo para detectar un acido nucleico en una muestra, comprendiendo dicho sistema un dispositivo de acuerdo con las reivindicaciones.
El dispositivo da lugar a un medio util y facil de operar para llevar a cabo la amplificacion y deteccion de acidos nucleicos. Al almacenar los reactivos necesarios en el procedimiento en pocillos cerrados en el dispositivo y hacer que el dispositivo sea desechable, se minimizan los riesgos de contaminacion.
La Figura 1 es una ilustracion esquematica de un dispositivo desechable, dispuesto para la extraccion de acido nucleico de una muestra, asi como la amplificacion del acido nucleico extraido y la deteccion del producto de amplificacion.
La invencion se describira ahora particularmente a modo de ejemplo con referencia a las Figuras 2-8 acompanantes.
La Figura 2 es una ilustracion esquematica de una forma alternativa de dispositivo desechable para la amplificacion y deteccion de acido nucleico en una muestra.
La Figura 3 es una vista en planta esquematica de una forma alternativa de un dispositivo.
La Figura 4 es una vista lateral esquematica del dispositivo de la Figura 3.
La Figura 5 es una vista en planta esquematica de otra forma alternativa de un dispositivo.
La Figura 6 es una vista esquematica de la parte inferior del dispositivo de la Figura 5.
La Figura 7 es una vista esquematica de la parte inferior de una parte de un dispositivo, pero con una disposicion alternativa del primer pocillo, en comparacion con la mostrada en la Figura 5.
La Figura 8 es una ilustracion de un dispositivo despues de su uso en un ensayo modelo.
Ejemplo comparativo
El dispositivo de la Figura 1 comprende una carcasa de plastico (1) que esencialmente tiene una construccion laminar que comprende un bloque central (2) intercalado entre una placa de cubierta superior (3) y una placa de base inferior (4). El bloque central (2) incluye una pluralidad de pocillos (5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11) en su interior junto con canales (12, 13, 14, 15 y 16) que enlazan los pocillos tal como se muestra. Los canales adicionales (17, 18, 19, 20, 21 y 22) conectan la mayoria de los pocillos a los puertos neumaticos (23, 24, 25, 26, 27 y 28 respectivamente) provistos en la cubierta superior (3) de la carcasa (1). La cubierta (3) incluye ademas una abertura (29) alineada con uno de los pocillos (6) para permitir que actue como un pocillo de recepcion de muestras, y una abertura adicional (30) alineada con otro de los pocillos (8) que actua como una camara de amplificacion. Sin embargo, todos los pocillos restantes estan efectivamente sellados por la cubierta (3).
Una membrana bibulosa (31) esta dispuesta dentro de un conducto horizontal en el cuerpo (2) y se extiende entre pocillo (7) y pocillo (8) y la camara de amplificacion. Los extremos opuestos de la membrana (31) estan ubicados en cada uno de los pocillos (7) y (8), de tal modo que el liquido dentro del pocillo (7) se desplazara a lo largo de la membrana hacia el pocillo (8). Adecuadamente, al menos una porcion de la membrana (31) se extiende a traves de la abertura (30) en la cubierta (3).
Un conducto similar dentro del cuerpo (2) se extiende lejos del pocillo (16) y en este conducto se aloja un dispositivo de flujo lateral (32).
Se proporciona un tapon (33) para cerrar el pocillo (6) despues de haber recibido una muestra en el mismo. Se proporciona otro tapon (34) para cerrar la camara de amplificacion del pocillo (8). Sin embargo, de forma adecuada, el tapon (34) transporta al menos algunos de los reactivos necesarios para efectuar una reaccion de amplificacion en la forma liofilizada en la superficie. Tambien puede comprender un cortador (no mostrado) adaptado para cortar una muestra de la membrana (31) que se extiende a traves de la abertura (30) del pocillo (8) cuando el tapon (34) se empuja hacia el pocillo. La muestra cortada cae luego en el pocillo (8) lista para amplificacion.
Ciertos reactivos utilizados en el procedimiento de extraccion/amplificacion/deteccion se cargan previamente en algunos de los pocillos cerrados. En particular, un liquido de lavado de muestra se carga en el pocillo (5) y actua como un deposito de lavado de muestra. De manera similar, el tampon para uso en la reaccion de amplificacion se carga en el pocillo (9), que adecuadamente tiene dimensiones similares a la del primer pocillo (8). Por ultimo, se carga un diluyente de elucion en el pocillo (10).
Antes de su uso, una cubierta desechable, como una cinta adhesiva de plastico, una pelicula o una lamina, se aplica sobre la cubierta (3) de modo que las aberturas (30, 31) y los puertos (23, 24, 25, 26, 27 y 28 ) queden sellados para dos propositos; primero, para evitar la contaminacion atmosferica (por lo tanto, los pocillos dentro del dispositivo y donde sea apropiado sus contenidos permanecen puros) y segundo, para evitar cualquier flujo de aire a traves de los puertos y, por lo tanto, retener los liquidos en sus respectivos pocillos.
En uso, se aplica la siguiente secuencia de operacion:
• El usuario desempaqueta el dispositivo (1), retira la cinta de la cubierta (3) para exponer los puertos neumaticos (23, 24, 25, 26, 27 y 28) y los pocillos de muestra y amplificacion (30, 31). El dispositivo (1) puede entonces cargarse en un aparato adaptado para acomodar el dispositivo de modo que los puertos neumaticos (23, 24, 25, 26, 27 y 28) se conecten a un suministro neumatico. Ademas, los pocillos (6, 8) estan alineados con dispositivos adecuados de calentamiento o termostato en el aparato.
• Si se va a utilizar una muestra liquida, el usuario la carga en el pocillo (6) que actua como puerto de muestra y se inserta el tapon de muestra.
• Si la muestra se deriva de un hisopo, el aparato activa (a traves del puerto neumatico 23 y el canal 17) el reactivo de lavado de muestra desde el deposito de lavado de muestras del pocillo (5) a lo largo del canal (12) hasta el pocillo de muestra (6) y el usuario inserta el hisopo para lavar su contenido. El tapon de muestra (33) se inserta en el pocillo de muestra (6).
• El pocillo de muestra (6) se calienta con el aparato (a aproximadamente 100 0C) para extraer el ADN de la matriz de la muestra.
• Luego, el aparato activa (a traves del puerto neumatico 23 o 24 y los canales 17 y 12 o 18 respectivamente) el producto de extraccion en el pocillo adyacente (7) a traves del canal (13) para entrar en contacto con la
membrana 31 (ventilacion a traves del canal 19 y el puerto neumatico 25).
• El aparato permanece inactivo durante un perfodo de tiempo suficiente para permitir que la muestra transite por accion capilar a lo largo de la membrana (31).
• El tapon (34), que lleva reactivos tales como cebadores especfficos de amplificacion, enzimas, etc., necesarios para llevar a cabo una reaccion de amplificacion secada sobre una superficie exterior del mismo, se inserta en el pocillo (8) que actua como camara de amplificacion. El tapon (34) lleva un cortador dispuesto de tal modo que cuando se inserta en el pocillo (8) (ya sea manualmente por el usuario, o automaticamente por el aparato) perfora la punta de la membrana (31) que cae en el fondo del pocillo (8).
• El aparato activa (a traves del puerto neumatico 26 y los canales 14 y 20) los reactivos de ensayo lfquidos, como soluciones de solucion salina y tampon al pocillo (8) (ventilacion a traves de los canales 16 y 22 al puerto neumatico 28).
• Luego, el pocillo (8) se somete a condiciones de calentamiento adecuadas para llevar a cabo una reaccion de amplificacion de acido nucleico. Por ejemplo, el instrumento calienta el pocillo (8) a una temperatura adecuada para realizar la amplificacion isotermica, que, en la mayorfa de los casos, estara en el intervalo de 15-85 0C, mas particularmente entre 20-80 0C, por ejemplo aproximadamente a 65 0C.
• Al finalizar la reaccion de amplificacion, el aparato expulsa el diluyente (a traves del puerto neumatico 27 y los canales 21 y 15) desde el pocillo (10), de tal modo que pase a traves del pocillo (8) recolectando los productos de amplificacion y transfiriendo la mezcla al pocillo adyacente (11) (ventilacion a traves de los canales 16 y 22 al puerto neumatico 28) para entrar en contacto con una zona de recepcion de muestra del dispositivo de flujo lateral (32). El dispositivo de flujo lateral (32) esta configurado para producir una o mas senales detectables, como una diana visible y lfneas de control, en respuesta a la presencia o ausencia del acido nucleico o acidos diana en la muestra.
• El instrumento brinda tiempo antes de solicitar al usuario que lea el resultado del dispositivo de flujo lateral (32) y retire el dispositivo (1) del aparato.
El procedimiento esta adecuadamente automatizado, por lo que la presion se aplica a los puertos neumaticos relevantes en una secuencia apropiada. Cuando no se usan, las valvulas dentro del aparato pueden cerrar efectivamente los puertos (23, 24, 25, 26, 27 y 28).
Ejemplo 1
En la Figura 2, se muestra un dispositivo alternativo. En este caso, una carcasa (40) comprende un primer pocillo (41), que se puede cerrar por medio de una tapa (42). El primer pocillo (41) esta vinculado a un segundo pocillo (43) por medio de un canal (44). El canal (44) esta vinculado al pocillo (43) en una region superior del mismo. Tanto el canal (44) como el segundo pocillo (43) estan incrustados dentro de la carcasa (40).
Un dispositivo de flujo lateral (45) que comprende una membrana bibulosa provista de reactivos necesarios para detectar un acido nucleico diana, se proyecta en el pocillo (43) en una region inferior del mismo.
Un canal adicional (46) se extiende entre una region inferior del primer pocillo (41) y un deposito de diluyente (47), tambien ubicado dentro de la carcasa (40). El deposito de diluyente (47) se llena con diluyente (48) y se sella del medio ambiente mediante un embolo (49).
En uso, una muestra que contiene o que se sospecha que contiene un acido nucleico diana y reactivos necesarios para llevar a cabo una reaccion de amplificacion se carga en el primer pocillo (41). Posteriormente, el pocillo se cierra con la tapa (42) y el dispositivo se expone a ciertas condiciones, por ejemplo, condiciones de temperatura, por lo que cualquier secuencia de acido nucleico diana presente en el pocillo (41) se amplifica y cualquier agente de union o marca requerido para permitir que el producto de amplificacion pueda ser detectado en el dispositivo de flujo lateral, se incorpora o se une al producto, por ejemplo, por hibridacion.
Una vez que se completa la reaccion de amplificacion, el embolo (49) se acciona, por ejemplo, manualmente, aunque puede disponerse de tal modo que se lleve a cabo automaticamente, si el dispositivo esta dispuesto dentro de un aparato adecuado. En algunos casos, puede ser preferible levantar primero el embolo (49) para provocar que el contenido del pocillo (41), incluido el producto de amplificacion, se retraiga en la direccion del pocillo (48) donde se mezcla con el diluyente. El embolo (49) se presiona entonces y cuando esto ocurre, el diluyente (48) sale del deposito (47) a lo largo del canal (46) e inunda el pocillo (41). Como resultado, los contenidos del pocillo (41) que incluyen el producto de la reaccion de amplificacion son forzados a traves del canal (44) en el segundo pocillo (43). El lfquido que llega al pocillo (43) encuentra una primera region de extremo de la almohadilla de absorcion (50) y se absorbe en la almohadilla (50). La otra region de extremo de la almohadilla de absorcion (50) esta en contacto con una porcion de recepcion de muestras de la membrana del dispositivo de flujo lateral (45). Por lo tanto, el lfquido se desplaza a lo largo de la almohadilla (50) y se envfa al dispositivo de flujo lateral de manera confiable y controlada. Como resultado de los reactivos presentes en el dispositivo de flujo lateral (45) y la inclusion de cualquier reactivo de union o marcado en la reaccion de amplificacion, se desarrollara una senal indicativa de la presencia o ausencia de muestra de acido nucleico diana en el dispositivo de flujo lateral (45).
De este modo, este dispositivo proporciona un medio simple, facil de usar y confiable para llevar a cabo una reaccion de amplificacion y deteccion, con el minimo riesgo de contaminacion.
Ejemplo 2
En el dispositivo que se muestra en la Figura 3, el primer pocillo (51) en el que se puede llevar a cabo una reaccion de amplificacion de acido nucleico se proporciona dentro de una carcasa (52) junto con un segundo pocillo (53) y un pocillo de diluyente (54) unidos entre si por medio de canales (55,56), como en ciertas realizaciones anteriores. Sin embargo, en este caso, se proporciona un pocillo de diluyente adicional (57) ademas de un primer pocillo de diluyente (52) que se conecta con el canal (56) por medio de un canal (58). Estos canales (56,58) se intersecan en una union "T" ubicada aguas arriba del segundo pocillo (53). Como en casos anteriores, los contenidos liquidos del segundo pocillo (53) se pueden transferir a un DFL (59) por medio de una almohadilla de fibra absorbente (60).
Despues de que una muestra haya sido sometida a una reaccion de amplificacion de acido nucleico en el primer pocillo (51), el pocillo (51) se inunda con diluyente del pocillo (54). De manera adecuada, cada uno de los pocillos de diluyente (54,57) se opera mediante un embolo (62, 63 respectivamente) y estos estan unidos entre si por medio de una palanca (61), como se ilustra en la Figura 4. El abatimiento de la palanca (61) en la direccion mostrada por la flecha conduce a la expulsion diferencial, pero controlada, del diluyente de ambos pocillos (52, 57) a diferentes velocidades. La disposicion de la palanca (61) es tal que proporciona una mezcla en las proporciones requeridas en la union T. Esto asegurara que los contenidos del primer pocillo se mezclen bien con el diluyente a medida que llegan al segundo pocillo (53).
A continuacion, la mezcla pasara a lo largo de la almohadilla de fibra absorbente (60) y sobre la seccion de recepcion de muestras del DFL (59). Por lo tanto, se desarrollara una senal en el dFl dependiendo de la presencia o ausencia de acido nucleico diana amplificado.
Ejemplo 3
En la Figura 5 se muestra un dispositivo adicional. En esta Figura, el dispositivo comprende un cuerpo (70). Para facilitar la fabricacion, el cuerpo (70) comprende capas superiores e inferiores (70a y 70b respectivamente) entre las cuales se encuentra un separador (83) en el que se definen varias estructuras, como se detalla a continuacion. El cuerpo (70) esta provisto de una proyeccion lateral (71) en la que se aloja un primer pocillo de reaccion (72) (Figura 6) que se puede cerrar por medio de una tapa (73).
Un canal (74) que esta encerrado dentro del cuerpo (70) se extiende entre el pocillo de reaccion (72) y un segundo pocillo (75), que es mas grande que el primer pocillo (72) y esta incrustado dentro de la estructura del cuerpo (70). Una almohadilla de absorcion (76) se proyecta en el segundo pocillo (75). Un extremo de la almohadilla de absorcion (76) alejada del pocillo (75) entra en contacto con el primer extremo de una membrana bibulosa alargada (77) de un elemento de ensayo de flujo lateral. La membrana tiene en su interior, inmovilizados o libres, como es convencional en la tecnica, agentes de union y agentes de union marcados que son especificos para un acido nucleico diana particular. Estos estan dispuestos de forma tal que el liquido que contiene el acido nucleico diana se desplace a lo largo de este por un flujo capilar desde la almohadilla de absorcion (76) hasta el extremo remoto de la membrana (77), por lo que se desarrollara una senal visible dependiendo de la presencia o ausencia de la diana dentro del liquido. De forma adecuada, el cuerpo (70) es transparente para que se pueda ver cualquier senal. Sin embargo, seria posible proporcionar una ventana de visualizacion dentro del cuerpo (70) para permitir que se pueda apreciar el desarrollo de la senal si es necesario.
La membrana (77) esta dispuesta de modo que atraviesa una abertura (78) dentro del cuerpo (70) y esta soportada a lo largo de su longitud por una serie de puntales transversales (79), tambien incrustados dentro de la estructura del cuerpo (70).
Tambien se proporciona un tercer pocillo (80) para el diluyente dentro del cuerpo (70) y se puede cerrar por medio de un embolo (81). El pocillo (80) tambien tiene mayor volumen que el pocillo de reaccion (72) y esta conectado al pocillo (72) por medio de un segundo canal (82).
En uso, una mezcla de reaccion quimica o bioquimica tal como una mezcla de reaccion de amplificacion de acido nucleico se agrega al pocillo (72) y se somete a las condiciones apropiadas, por ejemplo, de temperatura, para efectuar la reaccion requerida en el mismo. La proyeccion (71) puede estar encerrada en un aparato de calentamiento adecuado para realizar esta actividad. De este modo, las condiciones aplicadas en el pocillo de reaccion (72) no se aplican al resto del dispositivo donde puedan danar o deteriorar, por ejemplo, la membrana (77). Las condiciones aplicadas dependeran de la reaccion particular que se realice, que puede comprender la incubacion a una temperatura relativamente constante, por ejemplo, en el caso de reacciones de amplificacion de acido nucleico isotermicas, o ciclos termicos entre un intervalo de temperaturas como los son las reacciones
convencionales, como la reaccion en cadena de la polimerasa.
A continuacion, se administra diluyente al pocillo (80), por ejemplo, dispensandose desde un recipiente sellado. Si es necesario, el recipiente sellado puede precargarse dentro del pocillo (80) que tambien contiene un medio de perforacion (no se muestra) y el diluyente se puede suministrar presionando el recipiente contra el medio de perforacion usando el embolo (81).
Una vez suministrado, el embolo (81) se presiona para forzar mas diluyentes a lo largo del canal (82) en el pocillo (72) donde se mezcla con la mezcla de reaccion y se desborda en el canal (74) y luego en la almohadilla de absorcion (76). Este absorbera el liquido que fluye y lo pasara a la primera region final de la membrana (77). El liquido viaja a lo largo de la longitud de la membrana (77) por medio de un flujo bibuloso o capilar, durante el cual se mezclara con reactivos como los reactivos de marcado y los elementos diana, como los acidos nucleicos diana, desarrollaran una senal como las lineas de senal en las areas diana y/o de control como es convencional en un ensayo de flujo lateral. Estas senales pueden leerse a traves del cuerpo (70).
El dispositivo de las Figuras 5 y 6 puede entonces desecharse. Por lo tanto, la invencion proporciona un dispositivo simple que puede ser operado facilmente para una variedad de propositos, ademas de que es facil de operar y minimiza las oportunidades de contaminacion de las muestras y, por lo tanto, evita resultados inexactos. En una forma modificada de este dispositivo (Figura 7), la proyeccion (71) es solida, pero incluye un saliente que se proyecta hacia abajo (83) que es capaz de formar un ajuste perfecto con un primer pocillo desmontable (72). Los canales (74 y 82) pasan a traves de este saliente 83 que se abre en su superficie inferior. El primer pocillo separado (72) que esta adecuadamente precargado con reactivos de amplificacion en forma seca, esta provisto de un reborde anular (84) para facilitar su manejo. En esta realizacion, no hay necesidad de una tapa separada (73) . En uso, se aplica una muestra al primer pocillo (72) y el saliente (83) se inserta comodamente en la abertura del pocillo (72) sellandolo de este modo. A partir de esto, el dispositivo se puede usar de la misma manera que se describio anteriormente en relacion con la realizacion de la Figura 5.
Ejemplo 4
El dispositivo sustancialmente como se ilustra en las Figuras 5 y 6 fue utilizado en un ensayo isotermico LAMP para detectar la presencia de una enfermedad venerea de caballo en una muestra. El ADN de las bacterias diana lisado por ebullicion en agua durante 10 minutos se amplifico utilizando cebadores LAMP dirigidos contra el gen del ARN ribosomal 16S de Taylorella equigenitalis. Los cebadores de la reaccion se marcaron con biotina o fluoresceina y, a traves de estos restos, los productos asociados con las cuentas de latex o las areas de reaccion positiva en los DFL respectivamente. La amplificacion se realizo en el pocillo de reaccion (72) (volumen total de 25 pl) utilizando LAMP mastermix de GeneSys (Camberley, Reino Unido) que se incubo a 65 0C durante 20 minutos antes de la dilucion de la reaccion, cargada en el dispositivo, en el tampon apropiado (225 pl de PBS). El tampon se cargo en el pocillo (80) y se forzo en el pocillo de reaccion (72) presionando el embolo (81). Los productos de amplificacion diluidos fueron, junto con la dilucion, forzados por presion positiva a traves del canal (74) y sobre el material absorbente del DFL (76). Los productos de la reaccion luego viajaron a lo largo de la longitud del DFL por accion capilar con cuentas de latex asociadas que se acumularon (y por lo tanto se hicieron visibles) en el area de reaccion, tanto en la linea de prueba como en la de control. Las lineas fueron evidentes para la reaccion positiva tanto en la prueba (linea superior) como en el control (linea inferior), lo que indica que el material de prueba se habia amplificado y era positivo.
Los resultados, mostrados en la Figura 8, ilustran que el dispositivo y el procedimiento de la invencion son efectivos y proporcionan resultados utiles.
Claims (8)
1. Un dispositivo para llevar a cabo un ensayo para detectar un acido nucleico diana en una muestra, comprendiendo dicho dispositivo:
(i) un primer pocillo (41) en el que puede efectuarse una reaccion de amplificacion de acido nucleico de dicho acido nucleico diana;
(ii) un primer canal (44) que se extiende desde dicho primer pocillo (41);
(iii) un dispositivo de ensayo de flujo lateral (45); y
(iv) un pocillo de diluyente (48) que contiene diluyente y esta conectado al primer pocillo (41), por medio de un segundo canal (46), en el que el pocillo de diluyente (48) comprende una bolsa flexible sellada que contiene diluyente, comprendiendo el pocillo de diluyente medios de perforacion dispuestos para abrir la bolsa flexible cuando se aplica presion a la bolsa flexible;
en el que
el primer pocillo (41) tiene un volumen menor que el volumen del pocillo de diluyente (48); el dispositivo de ensayo de flujo lateral (45) esta dispuesto para recibir una muestra desde dicho primer canal (44) en una membrana bibulosa del mismo, en el que dicha membrana contiene elementos que son capaces de detectar dicho acido nucleico diana; y
el segundo canal (46) esta dispuesto de tal manera que el diluyente, cuando esta contenido en el pocillo de diluyente (48), se puede transferir al primer pocillo (41).
2. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el volumen del primer pocillo (41) es de 15-50 pl y el volumen del pocillo de diluyente (48) es de 50-250 pl.
3. Un dispositivo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, que comprende ademas (iia) un segundo pocillo (43) conectado a dicho primer pocillo (41) por medio del primer canal (44), en el que el primer canal (44) esta dispuesto de tal modo que los contenidos liquidos de dicho primer pocillo (41) pueden transferirse al segundo pocillo (43) y en el que el dispositivo de ensayo de flujo lateral (45) esta dispuesto para recibir contenidos liquidos de dicho segundo pocillo (43) en dicha membrana bibulosa del mismo.
4. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el primer pocillo (41) esta precargado con reactivos adecuados para llevar a cabo una reaccion de amplificacion de acido nucleico.
5. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el primer pocillo (41), el segundo pocillo (43), los canales (44, 46) y el dispositivo de ensayo de flujo lateral (45) estan contenidos dentro de una carcasa.
6. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas un cuarto pocillo cerrado, precargado con reactivos liquidos y conectado al primer pocillo (41) por medio de un canal, de tal modo que los contenidos del cuarto pocillo se puedan suministrar al primer pocillo (41).
7. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que se proporciona un elemento de absorcion entre el segundo pocillo (43) y una seccion de recepcion de muestras (50) del dispositivo de ensayo de flujo lateral (45), y que esta dispuesto para permitir que el liquido del segundo pocillo (43) se pueda suministrar a dicha seccion de recepcion de muestras (50).
8. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas un sistema de purificacion y/o extraccion de acido nucleico.
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