ES2235162T3 - Cepas y proteinas plaguicidas. - Google Patents
Cepas y proteinas plaguicidas.Info
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Abstract
EL PRESENTE INVENTO SE REFIERE A PROTEINAS Y FRAGMENTOS NUEVOS. FRAGMENTOS DE BACILLUS, LOS CUALES SON CAPACES DE PRODUCIR PROTEINAS PESTICIDAS Y PROTEINAS AUXILIARES DURANTE EL CRECIMIENTO VEGETATIVO. TAMBIEN SE PROPORCIONAN PROTEINAS PURIFICADAS, SECUENCIAS NUCLEOTIDAS QUE CODIFICAN LAS PROTEINAS Y METODOS PARA UTILIZAR LOS FRAGMENTOS, PROTEINAS Y GENES PARA CONTROLAR PESTES.
Description
Cepas y proteínas plaguicidas.
La presente invención bosqueja los métodos y las
composiciones para controlar las plagas de las plantas y no de
plantas.
Las plagas de insectos son un factor principal de
la pérdida de las cosechas agrícolas importantes comercialmente a
nivel mundial. Se han utilizado extensivamente plaguicidas químicos
de amplio espectro para controlar o erradicar plagas de importancia
agrícola. Sin embargo, hay un interés especial por desarrollar unos
plaguicidas eficaces alternativos.
Los plaguicidas microbianos han desempeñado una
función importante como alternativas al control químico de las
plagas. El producto microbiano utilizado más extensivamente se basa
en la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt). Bt es un
Bacillus grampositivo que forma esporas que produce una
proteína cristalina insecticida (ICP) durante la esporulación.
Se conocen numerosas variedades de Bt que
producen más de 25 ICP diferentes pero relacionadas. Las ICP que
produce Bt son tóxicas para las larvas de determinados insectos de
los órdenes Lepidoptera, Diptera y Coleoptera.
En general, cuando un insecto susceptible ingiere la ICP, se
solubiliza el cristal y, mediante las proteasas del intestino del
insecto, se transforma en un resto tóxico. Ninguna de las ICP
activas contra las larvas de coleópteros han mostrado unos efectos
significativos sobre el género Diabrotica, particularmente
Diabrotica virgifera virgifera, la
Diabrotica occidental o gusano occidental de la raíz del maíz
(WCRW) o Diabrotica longicornis barberi, la
Diabrotica norteña o gusano norteño de la raíz del maíz.
Bt está estrechamente relacionado con
Bacillus cereus (Bc). Una característica principal
diferenciadora es la carencia de un cristal paraesporal en Bc. Bc es
una bacteria ampliamente distribuida que se encuentra comúnmente en
el suelo y que se ha aislado de una variedad de alimentos y
fármacos. El organismo ha estado implicado en el deterioro de los
alimentos.
Aunque Bt ha sido muy útil para controlar las
plagas de insectos, hay una necesidad de ampliar la cantidad de
agentes potenciales de control biológico.
La presente invención describe las composiciones
y los métodos para controlar las plagas de plantas y de no plantas.
Particularmente, se describen nuevas proteínas plaguicidas que se
pueden aislar de la etapa de crecimiento vegetativo de
Bacillus. Se proporcionan las cepas, proteínas y los genes de
Bacillus que codifican las proteínas.
Los métodos y las composiciones de la invención
se pueden usar en una variedad de sistemas para controlar las plagas
de plantas y de no plantas.
Una realización de la invención es una cepa de
Bacillus que se selecciona del grupo que consiste en las
cepas con los números de acceso B-21058, B21060,
NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL
B-21227, NRRL B-21228, NRRL
B-21229 y NRRL B-21230, en la que
dicha cepa produce una proteína plaguicida durante el crecimiento
vegetativo, que se puede aislar del medio de cultivo líquido, en la
que dicha proteína se codifica mediante una secuencia de nucleótidos
que se hibrida a una secuencia de nucleótidos de SEQ ID N.º 1, 4, 6,
9, 17 ó 18, o en la que dicha proteína reacciona cruzadamente con
anticuerpos generados contra las proteínas de SEQ ID N.º 2, 3, 5, 7,
8 ó 10 a 16.
Una realización más de la invención es una
proteína plaguicida que se puede aislar durante la fase de
crecimiento vegetativo de Bacillus spp. o fragmentos activos
de la misma, en la que dicha proteína se puede aislar de un medio de
cultivo líquido y en la que dicha proteína está codificada por una
secuencia de nucleótidos que se hibrida a una secuencia de
nucleótidos de SEQ ID N.º 1, 4, 6, 9, 17 ó 18, o en la que dicha
proteína reacciona cruzadamente con anticuerpos generados contra las
proteínas de SEQ ID N.º 2, 3, 5, 7, 8, ó 10 a 16.
Una realización más de la invención es una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína plaguicida de la
invención.
Una realización más de la invención es una planta
que se ha transformado de manera estable con una secuencia de
nucleótidos de la invención.
Una realización más de la invención es un método
para producir la proteína plaguicida de la invención, que se
caracteriza por las siguientes etapas:
a) cultivar las células de Bacillus en un
medio de cultivo;
b) retirar las células durante el crecimiento
vegetativo; y
c) aislar y purificar la proteína plaguicida del
medio de cultivo líquido.
Se proporcionan las composiciones y los métodos
para controlar las plagas de las plantas. En particular, se
proporcionan nuevas proteínas plaguicidas que se producen durante el
crecimiento vegetativo de las cepas de Bacillus. Las
proteínas son útiles como plaguicidas.
La presente invención reconoce que las proteínas
plaguicidas se producen durante el crecimiento vegetativo de las
cepas de Bacillus. Para el propósito de la presente
invención, el crecimiento vegetativo se define como ese periodo de
tiempo antes del inicio de la esporulación. En el caso de Bt, este
crecimiento vegetativo se produce antes de la producción de las ICP.
Los genes que codifican tales proteínas se pueden aislar, clonar y
transformar en varios vehículos de distribución para utilizarlos en
los programas de gestión de plagas.
Para los propósitos de la presente invención, las
plagas incluyen, pero no se limitan a, insectos, hongos, bacterias,
nematodos, ácaros, garrapatas, patógenos protozoarios, duelas
parasitadoras del hígado de los animales y similares. Las plagas de
insectos incluyen insectos que se seleccionan de los órdenes
Coleoptera, Diptera, Hymenoptera,
Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera,
Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera,
Dermaptera, Isoptera, Anaplura,
Siphonaptera, Trichopera, etc.
Las tablas 1 a 10 ofrecen una lista de plagas
asociadas a las principales plantas de cultivo y plagas de
importancia humana y veterinaria. Tales plagas se incluyen dentro
del alcance de la presente invención.
Maíz
Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica occidental
Diabrotica longicornis barberi, Diabrotica norteña
Diabrotica undecimpunctata howardi, Diabrotica sureña
Melanotus spp., gusanos alambre
Cyclocephala borealis, escarabajo
(larva blanca anual)
Cyclocephala immaculata, escarabajo
(larva blanca anual)
Popillia japonica, escarabajo
japonés
Chaetocnema pulicaria, escarabajo
pulga del maíz
Sphenophorus maidis, escarabajo
picudo del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
Sorgo
Phyllophaga crinita, larva blanca o
escarabajo de Mayo
Eleodes, Conederus y Aeolus
spp., gusanos alambre
Oulema melanopus, babosilla del
trigo
Chaetocnema pulicaria, escarabajo
pulga del maíz
Sphenophorus maidis, escarabajo
picudo del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
Trigo
Oulema melanopus, babosilla del
trigo
Hypera punctata, picudo de la hoja
del trébol
Diabrotica undecimpunctata howardi, Diabrotica sureña
\vskip1.000000\baselineskip
Girasol
Zygogramma exclamationis,
escarabajo del girasol
Bothyrus gibbosus, escarabajo de la
zanahoria
\vskip1.000000\baselineskip
Algodón
Anthonomous grandis, picudo del
algodón
\vskip1.000000\baselineskip
Arroz
Colaspis brunnea, colaspis de la
uva
Lissorhoptrus oryzophilus, picudo
acuático del arroz
Sitophilus oryzae, gorgojo del
arroz
\vskip1.000000\baselineskip
Soja
Epilachna varivestis, conchuela del
frijol
\vskip1.000000\baselineskip
Maíz
Rhopalosiphum maidis, pulgón del
maíz
Anuraphis maidiradicis, pulgón
radicular del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
Sorgo
Rhopalosiphum maidis, pulgón del
maíz
Sipha flava, pulgón amarillo de la
caña de azúcar
\vskip1.000000\baselineskip
Trigo
Áfido ruso del trigo
Schizaphis graminum, pulgón verde
de los cereales
Macrosiphum avenae, pulgón de la
espiga
\vskip1.000000\baselineskip
Algodón
Aphis gossypii, pulgón del
algodonero
Pseudatomoscelis seriatus, pulga
saltona
Trialeurodes abutilonea, mosca
blanca bandeada
\vskip1.000000\baselineskip
Arroz
Nephotettix nigropictus, tragahojas
del arroz
\vskip1.000000\baselineskip
Soja
Myzus persicae, pulgón verde del
duraznero
Empoasca fabae, cotorrita
\vskip1.000000\baselineskip
Cebada
Schizaphis graminum, pulgón verde
de los cereales
\vskip1.000000\baselineskip
Aceite de colza
Brevicoryne brassicae, pulgón de la
col
\vskip1.000000\baselineskip
Maíz
Blissus leucopterus leucopterus, chinche de la raíz
\vskip1.000000\baselineskip
Sorgo
Blissus leucopterus leucopterus, chinche de la raíz
\vskip1.000000\baselineskip
Algodón
Lygus lineolaris, chinche
Lygus
\vskip1.000000\baselineskip
Arroz
Blissus leucopterus leucopterus, chinche de la raíz
Acrosternum hilare, chinche verde
hedionda
\vskip1.000000\baselineskip
Soja
Acrosternum hilare, chinche verde
hedionda
\vskip1.000000\baselineskip
Cebada
Blissus leucopterus leucopterus, chinche de la raíz
Acrosternum hilare, chinche verde
hedionda
Euschistus servus, conchuela café
\vskip1.000000\baselineskip
Maíz
Melanoplus femurrubrum, saltamontes
de patas rojas
Melanoplus sanguinipes, plaga de
chapulines
\vskip1.000000\baselineskip
Trigo
Melanoplus femurrubrum, saltamontes
de patas rojas
Melanoplus differentialis,
saltamontes diferencial
Melanoplus sanguinipes, plaga de
chapulines
\vskip1.000000\baselineskip
Algodón
Melanoplus femurrubrum,saltamontes
de patas rojas
Melanoplus differentialis,
saltamontes diferencial
\vskip1.000000\baselineskip
Soja
Melanoplus femurrubrum, saltamontes
de patas rojas
Melanoplus differentialis,
saltamontes diferencial
\vskip1.000000\baselineskip
Estructural/doméstico
Periplaneta americana, cucaracha
americana
Blattella germanica, cucaracha
alemana
Blatta orientalis, cucaracha
oriental
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Maíz
Hylemya platura, mosca de las
siembras
Agromyza parvicornis, minador
manchahojas del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
Sorgo
Contarinia sorghicola, mosquita del
sorgo
\vskip1.000000\baselineskip
Trigo
Mayetiola destructor, la mosca de
Hess
Sitodiplosis mosellana, mosquito
rojo del trigo
Meromyza americana, larva del tallo
del trigo
Hylemya coarctata, mosca del bulbo
del trigo
\vskip1.000000\baselineskip
Girasol
Neolasioptera murtfeldtiana, larva
de las pipas
\vskip1.000000\baselineskip
Soja
Hylemya platura, mosca de las
siembras
\vskip1.000000\baselineskip
Cebada
Hylemya platura, mosca de las
siembras
Mayetiola destructor, mosca de
Hess
\vskip1.000000\baselineskip
Insectos que atacan a los humanos y los animales
y portadores de enfermedades
Aedes aegypti, mosquito de la
fiebre amarilla
Aedes albopictus, mosquito de la
selva
Phlebotomus papatasii,
flebotomo
Musca domestica, mosca casera
Tabanus atratus, tábano del
caballo
Cochliomyia hominivorax, mosca del
gusano taladrador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Maíz
Anaphothrips obscurus, trips del
pasto
\vskip1.000000\baselineskip
Trigo
Frankliniella fusca, trips del
tabaco
\vskip1.000000\baselineskip
Algodón
Thrips tabaci, trips de la
cebolla
Frankliniella fusca, trips del
tabaco
\vskip1.000000\baselineskip
Soja
Sericothrips variabilis, trips de
la soja
Thrips tabaci, trips de la
cebolla
\newpage
Maíz
Solenopsis milesta, hormiga
ladrona
Trigo
Cephus cinctus, mosca de sierra del
tallo del trigo
Dermaptera (tijeretas)
Forficula auricularia, tijereta
europea
\vskip1.000000\baselineskip
Isoptera (termitas)
Reticulitermes flavipes, termita
subterránea del este
\vskip1.000000\baselineskip
Mallophaga (piojos masticadores)
Cuclotogaster heterographa, piojo
de la cabeza de la gallina
Bovicola bovis, piojo picador del
ganado
\vskip1.000000\baselineskip
Anoplura (piojos chupadores)
Pediculus humanus, piojo del
hombre
\vskip1.000000\baselineskip
Siphonaptera (pulgas)
Ctenocephalides felis, pulga del
gato
Maíz
Tetranychus urticae, arañuela
\vskip1.000000\baselineskip
Sorgo
Tetranychus cinnabarinus, araña
roja
Tetranychus urticae, arañuela
\vskip1.000000\baselineskip
Trigo
Aceria tulipae, ácaro rizador del
trigo
\vskip1.000000\baselineskip
Algodón
Tetranychus cinnabarinus, araña
roja
Tetranychus urticae, arañuela
\vskip1.000000\baselineskip
Soja
Tetranychus turkestani, araña
roja
Tetranychus urticae, arañuela
\vskip1.000000\baselineskip
Cebada
Petrobia latens, ácaro de los
ajos
\vskip1.000000\baselineskip
Acari importantes de humanos y de
animales
Dermacentor variabilis, garrapata
americana del perro
Argas persicus, garrapata de las
aves
Dermatophagoides farinae, ácaro
americano del polvo doméstico
Dermatophagoides pteronyssinus,
ácaro europeo del polvo doméstico
Ahora que se ha reconocido que se pueden aislar
las proteínas plaguicidas de la fase de crecimiento vegetativo de
Bacillus, se pueden aislar otras cepas mediante técnicas
estándares y probar su actividad contra las plagas de una planta
determinada y de no plantas. Generalmente, se pueden aislar las
cepas de Bacillus de cualquier muestra medioambiental, que
incluya suelo, planta, insecto, polvo elevador de cereales y otros
materiales de muestra, etc., mediante los métodos conocidos en la
técnica. Véase, por ejemplo, Travers et al., (1987) Appl.
Environ. Microbiol. 53:1263-1266; Saleh et
al., (1969) Can J. Microbiol.
15:1101-1104; DeLucca et al., (1981) Can
J. Microbiol. 27:865-870; y Morris, et
al., (1981) "The genera Bacillus and
Sporolactobacillus" en Starr et al. (eds), The
Prokaryotes: a handbook on habitats, isolation, and identification
of bacteria, Vol. II, Springer-Verlog Berlin
Heidelberg. Tras el aislamiento, se pueden probar la actividad
plaguicida de las cepas durante el crecimiento vegetativo. De este
modo, se pueden identificar nuevas proteínas y cepas
plaguicidas.
Tales microorganismos de Bacillus, que
tienen un uso en la invención, incluyen Bacillus cereus y
Bacillus thuringiensis, así como también las especies de
Bacillus listadas en la tabla 11.
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupo 1 morfológico | Cepas no asignadas |
| B. megaterium | Subgrupo A |
| B. cereus* | B. apiarus* |
| B. cereus var, mycoides | B. filicolonicus |
| B. thuringiensis* | B. thiaminolyticus |
| B. licheniformis | B. alcalophilus |
| B. subtilis* | |
| B. pumilus | Subgrupo B |
| B. firmus* | B. cirroflagellosus |
| B. coagulans | B. chitinosporus |
| B. lentus | |
| Grupo 2 morfológico | |
| B. polymyxa | Subgrupo C |
| B. macerans | B. badius |
| B. circulans | B. aneurinolyticus |
| B. stearothermophilus | B. macroides |
| B. alvei* | B. freundenreichii |
| B. laterosporus* | |
| B. brevis | Subgrupo D |
| B. pulvifaciens | B. pantothenticus |
| B. popilliae* | B. epiphytus |
| B. lentimorbus* |
| B. larvae* | Subgrupo E1 |
| B. aminovorans | |
| Grupo 3 morfológico | B. globisporus |
| B. sphaericus* | B. insolitus |
| B. pasteurii | B. psychrophilus |
| Subgrupo 2 | |
| B. psychrosaccharolyticus | |
| B. macquariensis | |
| *= Aquellas cepas de Bacillus que se encontraron previamente en insectos. |
Clasificación de acuerdo con Parry, J. M. et
al., (1983) Color Atlas of Bacillus species, Wolfe
Medical Publications, London.
De acuerdo con la presente invención, se pueden
aislar de Bacillus las proteínas plaguicidas que se producen
durante el crecimiento vegetativo. En una realización, se pueden
aislar las proteínas insecticidas producidas durante el crecimiento
vegetativo, de aquí en adelante referidas como las VIP (proteína
insecticida vegetativa). Se conocen los métodos para el aislamiento
de la proteína en la técnica. Generalmente, se pueden purificar las
proteínas mediante la cromatografía convencional, que incluye las
cromatografías de filtración en gel/, intercambio iónico e
inmunoafinidad, mediante la cromatografía líquida de alta
resolución, como la cromatografía líquida de alta resolución de fase
inversa, la cromatografía líquida de alta resolución de intercambio
iónico, la cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por
tamaño, el cromatoenfoque de alta resolución y la cromatografía de
interacción hidrofóbica, etc, mediante la separación
electroforética, como la electroforesis en gel unidimensional, la
electroforesis en gel bidimensional, etc. Estos métodos se conocen
en la técnica. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular
Biology, Vols. 1 and 2, Ausebel et al. (eds), John Wiley
& Sons, NY (1988). Adicionalmente, se pueden preparar
anticuerpos contra preparaciones sustancialmente puras de la
proteína. Véase, por ejemplo, Radka et al. (1983) J.
Immunol. 128: 2804; y Radka et al. (1984)
Immunogenetics 19: 63. Se puede utilizar cualquier
combinación de los métodos para purificar una proteína que tenga
propiedades plaguicidas. A medida que se formule el protocolo, la
actividad plaguicida se determina tras cada etapa de
purificación.
Tales etapas de purificación darán lugar a una
fracción de proteína sustancialmente purificada. Con
"sustancialmente purificada" o "sustancialmente pura" se
hace referencia a una proteína que está sustancialmente exenta de
cualquier compuesto asociado normalmente con la proteína en su
estado natural. Se pueden evaluar las preparaciones de proteína
"sustancialmente pura" por la ausencia de cualesquiera otras
bandas de proteína tras un SDS-PAGE, que se
determinan visualmente o mediante un barrido densiométrico.
Alternativamente, la ausencia de otras secuencias aminoterminales o
de residuos N-terminales en una preparación
purificada puede indicar el nivel de pureza. Se puede comprobar la
pureza mediante la recromatografía de preparaciones "puras" que
muestren la ausencia de otros picos mediante intercambio iónico,
fase inversa o electrofóresis capilar.
Los términos "sustancialmente puro" o
"sustancialmente purificado" no pretenden excluir las mezclas
artificiales o sintéticas de las proteínas con otros compuestos. Los
términos tampoco pretenden excluir la presencia de unas impurezas
menores que no interfieren con la actividad biológica de la proteína
y que pueden estar presentes, por ejemplo, debido a una purificación
incompleta.
Algunas proteínas son cadenas de un solo
polipéptido mientras que muchas proteínas consisten en más de una
cadena de polipéptido. Una vez que se ha aislado la proteína
purificada, la proteína, o los polipéptidos que la componen, se
pueden caracterizar y secuenciar mediante los métodos estándares
conocidos en la técnica. Por ejemplo, la proteína purificada, o los
polipéptidos que la componen, se pueden fragmentar con bromuro de
cianógeno, o con proteasas como la papaína, la quimotripsina, la
tripsina, la lisil-C endopeptidasa, etc. (Oike et
al. (1982) J. Biol. Chem 257: 9751-9758;
Liu et al. (1983) Int. J. Pept. Protein Res. 21:
209-215). Los péptidos resultantes se separan,
preferiblemente mediante HPLC, o mediante resolución de geles y
electrotransfiriendo sobre membranas de PVDF, y sometiéndolos a la
secuenciación de aminoácidos. Para realizar esta tarea, se analizan
los péptidos preferiblemente mediante secuenciadores automáticos. Se
reconoce que se pueden determinar secuencias de aminoácidos
N-terminales, C-terminales o
internas. A partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína
purificada se puede sintetizar una secuencia nucleotídica que se
puede utilizar como una sonda para ayudar en el aislamiento del gen
que codifica la proteína plaguicida.
Se reconoce que las proteínas variarán en cuanto
a su peso molecular, péptidos que la componen, actividad contra
determinadas plagas y en otras características. Sin embargo,
mediante los métodos expuestos dentro de la presente memoria, se
pueden aislar y caracterizar proteínas activas contra una variedad
de plagas.
Una vez que la proteína purificada se ha aislado
y caracterizado, se reconoce que se puede alterar de diversos modos,
que incluyen sustituciones, deleciones e inserciones de aminoácidos.
Generalmente, los métodos para estas manipulaciones se conocen en la
técnica. Por ejemplo, se pueden preparar variantes de la secuencia
de aminoácidos de las proteínas plaguicidas mediante mutaciones en
el ADN. Estas variantes poseerán la actividad plaguicida deseada.
Obviamente, las mutaciones que se realizarán en el ADN que codifica
la variante no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura
y, preferiblemente, no crearán regiones complementarias que pudieran
producir una estructura secundaria en el ARNm. Véase, la publicación
de solicitud de patente EP de nº 75 444.
De esta manera, la presente invención abarca las
proteínas plaguicidas así como también los componentes y fragmentos
de las mismas. Es decir, se reconoce que se pueden producir
polipéptidos que la componen o fragmentos de las proteínas que
conservan la actividad plaguicida. Estos fragmentos incluyen las
secuencias truncadas, así como también las secuencias de aminoácidos
de las proteínas con deleciones en su interior o en los extremos
amino o carboxilo.
No se espera que la mayoría de las deleciones,
inserciones y sustituciones de la secuencia de la proteína produzcan
unos cambios radicales en las características de la proteína
plaguicida. Sin embargo, cuando sea difícil predecir el efecto
exacto de la sustitución, la deleción o la inserción por adelantado,
la persona experta en la técnica agradecerá que el efecto se evalúe
mediante ensayos de detección rutinarios.
Las proteínas u otros polipéptidos que la
componen descritos en la presente memoria se pueden usar solos o en
combinación. Es decir, se pueden usar varias proteínas para
controlar diferentes plagas de insectos. Adicionalmente, algunas de
las proteínas potencian la actividad de las proteínas plaguicidas.
En la presente memoria, estas proteínas se mencionan como
"proteínas auxiliares". Mientras que el mecanismo de la acción
no se conoce completamente, cuando la proteína auxiliar y la
proteína plaguicida de interés se encuentran juntas, las propiedades
insecticidas de la proteína plaguicida se aumentan varias veces.
Las proteínas plaguicidas de la presente
invención pueden variar en su masa molecular al tener los
polipéptidos componentes una masa molecular de al menos 30 kDa o
más, preferiblemente de en torno a 50 kDa o más.
Las proteínas auxiliares pueden variar en su masa
molecular, al tener una masa molecular de al menos en torno a 15 kDa
o más, preferiblemente en torno a 20 kDa o más. Las propias
proteínas auxiliares pueden estar compuestas por varios
polipéptidos.
Es posible que la proteína plaguicida y la
proteína auxiliar sean componentes de una proteína plaguicida
multimérica. Tal proteína plaguicida, que incluye las proteínas
auxiliares como uno o más de sus polipéptidos componentes, puede
variar su masa molecular, al tener una masa molecular desde 50 kDa
hasta al menos 200 kDa, preferiblemente entre unos 100 kDa y 150
kDa.
Se puede utilizar una proteína auxiliar en
combinación con las proteínas plaguicidas de la invención para
aumentar la actividad. Para determinar si la proteína auxiliar
afectará la actividad, la proteína plaguicida se puede expresar sola
o en combinación con la proteína auxiliar y las actividades
respectivas se comparan en los ensayos de alimentación para detectar
el aumento de la actividad plaguicida.
Puede ser beneficioso detectar cepas en busca de
actividad plaguicida potencial, probando la actividad de la cepa
sola y en combinación con la proteína auxiliar. En algunos casos, la
proteína auxiliar con las proteínas nativas de las cepas produce una
actividad plaguicida que no se observa en ausencia de la proteína
auxiliar.
Se puede modificar la proteína auxiliar, tal como
se describe arriba, mediante varios métodos conocidos en la técnica.
Por lo tanto, para los propósitos de la invención, el término
"proteína insecticida vegetativa" (VIP) abarca las proteínas
que se producen durante el crecimiento vegetativo, que se pueden
usar solas o en combinación para detectar su actividad plaguicida.
Esto incluye las proteínas plaguicidas, las proteínas auxiliares y
aquellas proteínas que muestran actividad sólo en presencia de la
proteína auxiliar o de los polipéptidos que componen estas
proteínas.
Se reconoce que hay métodos alternativos
disponibles para obtener las secuencias de nucleótidos y de
aminoácidos de las presentes proteínas. Por ejemplo, para obtener la
secuencia nucleotídica que codifica la proteína plaguicida, se
pueden aislar de una genoteca genómica los clones de cósmidos que
expresen la proteína plaguicida. A partir de clones de cósmidos
activos mayores se pueden producir subclones menores y probar su
actividad. De esta manera, se pueden secuenciar los clones que
expresen una proteína plaguicida activa para determinar la secuencia
nucleotídica del gen. Luego, se puede deducir una secuencia de
aminoácidos para la proteína. Para los métodos moleculares
generales, véase, por ejemplo, Molecular Cloning, A Laboratoty
Manual, Second Edition, Vols 1-3, Sambrook et
al. (eds) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY (1989) y las referencias citadas en él.
Una vez que se han aislado las secuencias
nucleotídicas que codifican las proteínas plaguicidas de la
invención, se las pueden manipular y usar para expresar la proteína
en una variedad de huéspedes, que incluyen otros organismos, entre
ellos microorganismos y plantas.
Se pueden optimizar los genes plaguicidas de la
invención para aumentar la expresión en las plantas. Véase, por
ejemplo, WO 93/07278; EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak
et al. (1991) Proc, Natl, Acad, Sci, USA 88:
3324-3328; y Murray et al. (1989) Nucleic
Acids Research 17: 477-498. De esta manera, se
pueden sintetizar los genes utilizando los codones preferidos en
plantas. El codón preferido de un huésped particular es aquel codón
único que codifica más frecuentemente ese aminoácido en ese huésped.
Por ejemplo, el codón preferido del maíz para un aminoácido
particular se puede deducir de las secuencias génicas conocidas del
maíz. El uso de codones del maíz para 28 genes de plantas de maíz se
encuentra en Murray et al. (1989) Nucleic Acids
Research 17: 477-498, cuya descripción se
incorpora en la presente memoria mediante la referencia. También se
podrían fabricar genes sintéticos basándose en la distribución de
los codones que un huésped particular usa para un aminoácido
particular.
De esta manera, se pueden optimizar las
secuencias nucleotídicas para expresarlas en cualquier planta. Se
reconoce que toda o una parte de la secuencia de un gen puede ser
optimizada o sintética. Es decir, se pueden usar también las
secuencias sintéticas o parcialmente optimizadas.
Asimismo, se pueden optimizar las secuencias
nucleotídicas para expresarlas en cualquier microorganismo. En
cuanto al uso de codones preferido de Bacillus, véase, por
ejemplo, la patentes de los EEUU nº 5 024 837 y Johansen et
al. (1988) Gene 65: 293-304.
En la técnica, se describen las metodologías para
construir los casetes de expresión para plantas así como también
para introducir ADN foráneo en las plantas. Estos casetes de
expresión pueden incluir promotores, terminadores, potenciadores,
secuencias líderes, intrones y otras secuencias reguladoras unidas
operativamente a la secuencia codificante de la proteína
plaguicida.
Generalmente, para introducir el ADN foráneo en
las plantas se han utilizado los vectores plasmídicos Ti para
transportar el ADN foráneo así como también la toma directa del ADN,
los liposomas, la electroporación, la microinyección y el uso de
microproyectiles. Tales métodos se han publicado en la técnica.
Véase, por ejemplo, Guerche et al., (1987) Plant
Science 52: 111-116; Neuhause et al.,
(1987) Theor. Appl. Genet. 75: 30-36; Klein
et al., (1987) Nature 327: 70-73;
Howell et al., (1980) Science 208: 1265; Horsch et
al., (1985) Science 227: 1229-1231;
DeBlock et al., (1989) Plant Physiology 91:
694-701; Methods for Plant Molecular Biology
(Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press, Inc (1988); y
Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski,
eds.) Academic Press, Inc. (1989). Véase también la solicitud de la
patente de EEUU con número de serie 08/008 374, incorporada en la
presente memoria mediante referencia. También véase EPA 0193259 y
EPA 0451878A1. Se entiende que el método de transformación dependerá
de la célula vegetal que se transforme.
Además, se reconoce que se pueden modificar los
componentes del casete de expresión para aumentar la expresión. Por
ejemplo, se pueden utilizar secuencias truncadas, sustituciones
nucleotídicas u otras modificaciones. Véase, por ejemplo, Perlak
et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
3324-3328; Murray et al. (1989) Nucleic
Acids Research 17: 477-498; y WO 91/16432.
La construcción también puede incluir cualquier
otro regulador necesario tales como terminadores, (Guerinau et
al., (1991), Mol. Gen. Genet., 226:
141-144; Proudfoot, (1991), Cell, 64:
671-674; Sanfacon et al., (1991), Genes
Dev., 5: 141-149; Mogen et al., (1990),
Plant Cell, 2: 1261-1272; Munroe et
al., (1990), Gene, 91: 151-158; Ballas
et al., (1989), Nucleic Acids Res., 17:
7891-7903; Joshi et al., (1987), Nucleic
Acid Res., 15: 9627-9639); secuencias consenso
de la traducción en plantas (Joshi, C. P., (1987), Nucleic Acids
Research, 15: 6643-6653), intrones (Luehrsen y
Walbot, (1991), Mol. Gen. Genet., 225: 81-93)
y similares, unidos operativamente a la secuencia nucleotídica.
Puede ser beneficioso incluir secuencias líderes 5' en la
construcción del casete de expresión. Tales secuencias líderes
pueden actuar para aumentar la traducción. En la técnica se conocen
líderes para la traducción e incluyen:
Líderes de picornavirus, por ejemplo, el líder
del EMCV (región 5' no codificante de la encefalomiocarditis)
(Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R., y Moss, B (1989)
PNAS USA 86: 6126-6130);
Líderes de los potivirus, por ejemplo, el líder
del TEV (virus del grabado del tabaco) (Allison et al.,
(1986); el líder del MDMV (virus del mosaico enano del maíz);
Virology, 154: 9-20), y
La proteína de unión a la cadena pesada de
inmunoglobulina humana (BiP), (Macejak, D. G., and Sarnow, O.,
(1991), Nature, 353: 90-94;
El líder no traducido del ARMm de la proteína de
la cubierta del virus mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4), (Jobling,
S.A., y Gehrke, L., (1987), Nature, 325:
622-625;
El líder del virus del mosaico del tabaco (TMV),
(Gallie, D. R. et al., (1989), Molecular Biology of
RNA, pp. 237-256; y
El líder del virus del moteado clorótico del maíz
(MCMV) (Lommel, S.A. et al., (1991), Virology, 81:
382-385. Véase también, Della-Cioppa
et al., (1987), Plant Physiology, 84:
965-968).
Se puede utilizar un terminador de plantas en el
casete de expresión. Véase, Rosenberg et al., (1987),
Gene, 56:125; Guerinau et al., (1991), Mol. Gen.
Genet., 226: 141-144; Proudfoot, (1991),
Cell, 64: 671-674; Sanfacon et al.,
(1991), Genes Dev., 5: 141-149; Mogen et
al., (1990), Plant Cell, 2:1261-1272;
Munroe et al., (1990), Gene, 91:
151-158; Ballas et al., (1989), Nucleic
Acid Res., 17: 7891-7903; Joshi et al.,
(1987), Nucleic Acid Res., 15: 9627-9639.
Para la expresión específica de tejido, las
secuencias nucleotídicas de la invención se pueden unir
operativamente a promotores específicos del tejido. Véase, por
ejemplo, la solicitud de EEUU de número de serie 07/951 715
incorporada en la presente memoria mediante la referencia.
Se reconoce que se pueden utilizar los genes que
codifican las proteínas plaguicidas para transformar los organismos
patógenos de los insectos. Tales organismos incluyen Baculovirus,
hongos, protozoos, bacterias y nematodos.
Se pueden utilizar las cepas de Bacillus
de la invención para proteger de las plagas los cultivos agrícolas y
los productos. Alternativamente, se puede introducir un gen que
codifique el plaguicida mediante un vector adecuado en un huésped
microbiano, y aplicar dicho huésped al medio ambiente o a las
plantas o a los animales. Se pueden seleccionar microorganismos
huéspedes que se sabe que ocupan la "fitosfera" (filoplano,
filosfera, rizosfera y/o rizoplana) de uno o más cultivos de
interés. Se seleccionan estos microorganismos de manera que sean
capaces de competir con éxito en el medio ambiente particular con
los microorganismos salvajes, de asegurar el mantenimiento estable y
la expresión del gen que expresa el plaguicida polipeptídico y, a
ser posible, de asegurar la mejora de la protección del plaguicida
de la degradación medioambiental y de la inactivación.
Tales microorganismos incluyen bacterias, algas y
hongos. De interés particular son los microorganismos, tales como
las bacterias, p. ej., Pseudomonas, Erwinia, Serratia,
Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas,
Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter,
Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; hongos,
particularmente las levaduras, p, ej., Saccharomyces,
Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces,
Rhodotorula y Aureobasidium. De interés particular son
tales especies bacterianas de la fitosfera, como Pseudomonas
syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter
xylinium, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas
campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter
xyli, y Azotobacter vinlandii; y especies de levaduras de
la fitoesfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R.
marina, R. aurantiaca, Cruptococcus albidus, C. diffluens, C.
laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae,
Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y
Aureobasidium pollulans. De interés particular son los
microorganismos pigmentados.
Se dispone de numerosas vías para introducir un
gen que exprese la proteína plaguicida en el microorganismo
hospedador en unas condiciones que permitan el mantenimiento estable
y la expresión del gen. Por ejemplo, se pueden construir unos
casetes de expresión que incluyan las construcciones del ADN de
interés unidos operativamente con las señales reguladoras
transcripcionales y traduccionales para expresar las construcciones
del ADN, y una secuencia de ADN homóloga con una secuencia en el
organismo del huésped, mediante la cual se producirá la integración,
y/o un sistema de replicación que es funcional en el huésped,
mediante el cual se producirán la integración o el mantenimiento
estable.
Las señales reguladoras transcripcionales y
traduccionales incluyen, pero no se limitan a, un promotor, un sitio
de inicio de la transcripción, operadores, activadores,
potenciadores, otros elementos reguladores, sitios de unión al
ribosoma, un codón de iniciación, señales de terminación y
similares. Véase, por ejemplo, la patente de los EEUU nº 5 039 523;
la patente de los EEUU nº 4 853 331; la EPO 0480762A2; Sambrook
et al. supra; Molecular Cloning, a Laboratory
Manual, Maniatis et al. (eds) Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor; NY (1982); Advanced Bacterial
Genetics, Davis et al. (eds) Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); y las referencias citadas
en ellos.
Las células huéspedes adecuadas, en las que las
células que contienen el plaguicida se tratarán para prolongar la
actividad de la toxina en la célula cuando la célula entonces
tratada se aplique al entorno de la plaga (o plagas) diana, pueden
incluir procariotas o eucariotas, limitándose normalmente a aquellas
células que no producen sustancias tóxicas en organismos superiores,
como los mamíferos. Sin embargo, se podrían utilizar organismos que
produzcan sustancias tóxicas para los organismos superiores, donde
la toxina sea inestable o el nivel de la aplicación sea lo
suficientemente bajo como para permitir cualquier posibilidad de
toxicidad en un huésped mamífero. Como huéspedes, de interés
particular serán los procariotas y los eucariotas inferiores, como
los hongos. A modo de procariotas ilustrativos, tanto gramnegativos
como grampositivos, se incluyen Enterobacteriaceae, tales
como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella y
Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tales como
Rhizobium; Spirillaceae, tales como
Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas,
Vibrio, Desulfobivrio, Spirillum, Lactobacillaceae;
Pseudomonadaceae; tales como Pseudomonas y
Acetobacter; Azotobacteraceae y
Nitrobacteraceae. Entre las eucariotas están los hongos,
tales como Phycomycetes y Ascomycetes, que incluye las
levaduras, tales como Saccharomyces y
Schizosaccharomyces; y las levaduras Basidiomycetes,
tales como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces y
similares.
Las características de interés particular al
seleccionar una célula huésped para los propósitos de producción
incluyen la facilidad de introducir el gen de la proteína en el
huésped, la disponibilidad de sistemas de expresión, la eficacia de
expresión, la estabilidad de la proteína en el huésped y la
presencia de las capacidades genéticas auxiliares. Las
características de interés para el uso como una microcápsula
plaguicida incluyen las cualidades protectoras del plaguicida, tales
como las paredes celulares gruesas, la pigmentación y el
empaquetamiento intracelular o la formación de cuerpos de inclusión;
la afinidad por la hoja; la ausencia de toxicidad en los mamíferos;
que a la plagas les apetezca ingerirlo; la facilidad de matar o de
reparar sin dañar la toxina; y similares. Otras consideraciones
incluyen la facilidad de formulación y manejo, la economía, la
capacidad de almacenamiento y similares.
Los organismos huéspedes de interés particular
incluyen las levaduras, tales como Rhodotorula sp.,
Aurfeobasidium sp., Saccharomyces sp., y
Sporobolomyces sp.; organismos del filoplano tales como
Pseudomonas sp., Erwinia sp y Flavobacterium
sp. y Flavobacterium sp.; u otros organismos tales como
Escherichia, Lactobacillus sp, Bacillus sp y
similares. Los organismos específicos incluyen Pseudomonas
aeurginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces
cerevisae, Bacillus thurigiensis, Escherichia
coli, Bacillus subtilis y similares.
En la técnica se conocen los métodos generales
para utilizar las cepas de la invención para el control con
plaguicidas o para modificar genéticamente otros organismos como
agentes plaguicidas. Véase, por ejemplo, la patente de los EEUU nº 5
039 523 y la EP 0480762A2.
Se pueden utilizar las cepas Bacillus de
la invención o los microorganismos que se han alterado genéticamente
para que contengan el gen y la proteína plaguicidas para proteger de
la plagas los cultivos agrícolas y los productos. En un aspecto de
la invención, las células enteras, es decir, no lisadas, de un
organismo que produce una toxina (plaguicida) se tratan con
reactivos que prolongan la actividad de la toxina que se produce en
la célula cuando se aplica la célula en el entorno de la(s)
plaga(s) diana.
De manera alternativa, se producen los
plaguicidas introduciendo un gen heterólogo en un huésped celular.
La expresión del gen heterólogo da lugar, directa o indirectamente,
a la producción intracelular y al mantenimiento del plaguicida. A
continuación, se tratan estas células con condiciones que prolonguen
la actividad de la toxina producida en la célula cuando se aplique
la célula en el entorno de la(s) plaga(s) diana. El
producto resultante conserva la toxicidad de la toxina. A
continuación, se pueden formular estos plaguicidas encapsulados
naturalmente de acuerdo con las técnicas convencionales para aplicar
en el entorno que hospeda una plaga diana, p. ej., suelo, agua y
follaje de plantas. Véase, por ejemplo, EPA 0192319 y las
referencias citadas dentro.
Normalmente, los componentes activos de la
presente invención se aplican en la forma de las composiciones y se
pueden aplicar en el área de cultivo o en la planta a tratar,
simultáneamente o en sucesión, con otros compuestos. Estos
compuestos pueden ser tanto fertilizantes como donantes de
micronutrientes u otras preparaciones que afectan el crecimiento de
la planta. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas,
fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas o mezclas de
varias de estas preparaciones, si se desea, junto con excipientes
adicionales aceptables agrícolamente, tensioactivos o potenciadores
que favorecen la aplicación utilizada usualmente en la técnica de la
formulación. Los excipientes adecuados y los potenciadores pueden
ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias que se
emplean habitualmente en la tecnología de la formulación, p. ej.,
sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes,
emulgentes, humectantes, aglomerantes, aglutinantes o
fertilizantes.
Los métodos preferidos para aplicar un
ingrediente activo de la presente invención o una composición
agroquímica de la presente invención que contenga al menos una de
las proteínas plaguicidas que producen las cepas bacterianas de la
presente invención son la aplicación en las hojas, el recubrimiento
de la semilla y la aplicación en el suelo. El número de aplicaciones
y el ritmo de la aplicación dependen de la intensidad de la
infestación por la plaga correspondiente.
En una realización de la invención, se ha aislado
un microorganismo Bacillus cereus que es capaz de matar a
Diabrotica virgifera virgifera y Diabrotica longicornis
barberi. Se ha despositado la nueva cepa AB78 de B.
cereus en el Agricultural Research Service, Patent Culture
Collection (NRRL), Northern Regional Research Center,
1815 North University Street, Peoria, IL 61604, USA y se le
ha dado el nº de acceso NRLL B-21058.
Se ha purificado sustancialmente una proteína de
la cepa de B. cereus. Se ha verificado la purificación de la
proteína mediante SDS-PAGE y la actividad
biológica. La proteína tiene una masa molecular de de torno a 60 kDa
hasta en torno a 100 kDa, particularmente de en torno 70 hasta en
torno a 90 kDa, más particularmente de 80 kDa aproximadamente.
La secuenciación aminoterminal ha revelado que la
secuencia de aminoácidos N-terminal es:
NH_{2}-Lys-Arg-Glu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-Ile-Pro-
(SEQ ID nº 8), en la que Asx representa Asp o Asn. En la SEQ ID nº 7
se ofrece la secuencia de aminoácidos completa.
Se ha generado una sonda oligonucleotídica de la
región del gen que codifica los aminoácidos 3 al 9 del extremo
NH_{2}. Se sintetizó la sonda basándose en el uso de codones de un
gen de la \partial-endotoxina de Bacillus
thringensis (Bt). La secuencia de nucleótidos de la sonda
oligonucleotídica utilizada en la hibridaciones Southern fue como
sigue:
5'-GAA ATT GAT CAA GAT ACN
GAT-3' (SEQ ID nº 9)
donde N representa cualquier base.
Además, la sonda de ADN del gen
VIP-1 de Bc AB78 descrito en la presente
memoria, permite detectar cualquier cepa de Bacillus u otros
organismos para determinar si el gen VIP-1 (o
un gen relacionado) está presente de forma natural o si un
determinado organismo transformado incluye el gen
VIP-1.
La misma invención que ahora se está describiendo
de manera general, se comprenderá mejor mediante la referencia a los
siguientes ejemplos detallados que se proporcionan con el propósito
de ilustrar y que no han de considerarse limitantes de la invención
si no se especifica.
Se aisló la cepa AB78 de Bacillus cereus
en el laboratorio como contaminante sobre una placa de medio T3 [por
litro: 3 g de triptona, 2 g de triptosa, 1,5 g de extracto de
levadura, fosfato sódico a 0,05 M (pH 6,8) y 0,005 g de MnCl_{2};
Travers, R.S. 1983]. AB78 proporcionó una actividad significativa
contra la Diabrotica occidental. También se demostró la actividad
antibiótica contra Bacillus spp. grampositivos (tabla
12).
Las características morfológicas de AB78 son las
siguientes:
Tallos vegetativos rectos de 3,1 a 5,0 mm de
largo y entre 0,5 y 2,0 mm de ancho. Células con extremos
redondeados, individuales en cadenas cortas. Se forma una única
endoespora subterminal, cilíndrica-ovoide por
célula. No se forma ningún cristal paraesporal. Colonias opacas,
erosionadas, lobuladas y planas. No se producen pigmentos. Células
móviles. Flagelos presentes.
Las características de crecimiento de AB78 son
las siguientes:
Anaerobio facultativo con una temperatura de
crecimiento óptimo entre 21 y 30ºC. Crecerá a 15, 20, 25, 30 y 37ºC.
No crecerá por encima de los 40ºC. Crece en NaCl entre el 5 y el
7%.
La tabla 13 proporciona el perfil bioquímico de
AB78.
Se utilizó un subcultivo de la cepa AB78 de Bc
para inocular el siguiente medio, conocido como caldo TB:
| Triptona | 12 g/l |
| Extracto de levadura | 24 g/l |
| Glicerol | 4 ml/l |
| KH_{2}PO_{4} | 2,1 g/l |
| K_{2}HPO_{4} | 14,7 gl |
| pH 7,4 |
Se añadió fosfato de potasio al caldo
esterilizado tras haberlo enfriado. Se incubaron matraces a 30ºC en
un agitador giratorio a 250 rpm entre 24 h y 36 h.
El procedimiento anterior se puede escalar
rápidamente a mayores fermentadores mediante procedimientos que se
conocen bien en la técnica.
Durante el crecimiento vegetativo, normalmente
entre 24 y 36 h tras el comienzo del cultivo, se centrifugaron las
bacterias de AB78 del sobrenadante del cultivo. Se utilizó el
sobrenadante del cultivo que contenía la proteína activa en los
bioensayos.
Se probó la cepa AB78 de B. cereus contra
varios insectos tal como se describe a continuación.
Diabroticas occidental, norteña y sureña,
Diabrotica virgifera virgifera, D. longcornis barberi y D.
undecempunctata howardi, respectivamente: se hicieron
diluciones del sobrenadante del cultivo de AB78 crecido entre 24 y
36 h, se mezclaron con alimento artificial fundido (Marrone et
al. (1985) J. of Economic Entomology 78:
290-293) y se dejó solidificar. Se cortó el alimento
solidificado y se colocó en placas. Se colocaron larvas neonatas
sobre el alimento y se mantuvieron a 30ºC. Se registró la mortalidad
tras 6 días.
Bioensayo con el clon de E. coli:
se hizo crecer E. coli durante la noche en
L-Amp100 a 37ºC. A continuación, se sonicaron 10 ml
de cultivo 3 veces durante 20 s cada uno. Se añadieron 500 ml de
cultivo sonicado al alimento fundido de la Diabrotica
occidental.
Escarabajo de la patata Leptinotarsa
decemlineata: se realizaron diluciones en Triton
X-100 (para obtener una concentración final de
TX-100 al 0,1%) del sobrenadante del cultivo de AB78
crecido entre 24 y 36 h. Se sumergieron trozos de hoja de la patata
de 5 cm^{2} en estas diluciones, se secaron al aire y se colocaron
en un papel de filtro humedecido en placas de plástico. Se colocaron
las larvas neonatas sobre los trozos de hojas y se mantuvieron a
30ºC. Se registró la mortalidad entre 3 y 5 días después.
Escarabajo de la harina, Tenebrio
molitor: se realizaron diluciones del sobrenadante de
cultivo de AB78 cultivado entre 24 y 36 h, se mezclaron con el
alimento artificial fundido (Bioserv nº F9240) y se le permitió
solidificar. Se cortó el alimento solidificado y se colocó en placas
de plástico. Las larvas neonatas se colocaron sobre el alimento y se
mantuvieron a 30ºC. Se registró la mortalidad entre 6 y 8 días
después.
Taladro del maíz europeo, cuncunilla
grasienta, gusano tabacalero, cachudo del tabaco y gusano soldado;
Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Heliothis virescens, Manduca
sexta y Spodoptera exigua, respectivamente: se
realizaron diluciones en TX-100 (para obtener una
concentración final de TX-100 al 0,1%) del
sobrenadante del cultivo de AB78 cultivado entre 24 y 36 h. Se
pipetearon 100 ml sobre la superficie del alimento artificial
solidificado de 18 cm^{2} (Bioserv nº F9240) y se permitió secar
al aire. Luego, se colocaron las larvas neonatas sobre la superficie
del alimento y se mantuvieron a 30ºC. Se registró la mortalidad
entre 3 y 6 días después.
Mosquito doméstico norteño, Culex
pipiens: se realizaron diluciones del sobrenadante de
cultivo de AB78 cultivado entre 24 y 36 h. Se pipetearon 100 ml en
10 ml de agua en un vaso de plástico de 30 ml. Se añadieron larvas
del tercer instar en el agua y se mantuvieron a temperatura
ambiente. Se registró la mortalidad entre 24 y 48 h después. En la
tabla 14 se proporciona el espectro de la actividad entomocida de
AB78.
La recién descubierta cepa AB78 de B.
cereus mostró un espectro significativamente diferente de
actividad insecticida, cuando se comparó con las conocidas
\partial-endotoxinas activas contra los
coleópteros de Bt. En particular, AB78 mostró una actividad más
selectiva contra los escarabajos que las cepas de Bt conocidas
activas contra los coleópteros, en la que ésta fue específicamente
activa contra Diabrotica spp. Más específicamente, fue más
activa contra D. virgifera virgifera y D. longicornis
barberi pero no contra D. undecimpunctata howardi.
Se bioensayó la actividad durante el crecimiento
vegetativo (tabla 15) contra la Diabrotica occidental de una serie
de cepas de Bacillus. Los resultados demuestran que AB78 es
única ya que la actividad contra la Diabrotica occidental no es un
fenómeno general.
En la tabla 16 se proporciona la actividad
específica de AB78 contra la Diabrotica occidental.
Se calculó que LC_{50} sería 6,2 \mul de
sobrenadante de cultivo por ml de alimento para Diabrotica
occidental.
El medio de cultivo sin células y los residuos se
llevaron a una saturación del 70% mediante la adición de sulfato de
amonio sólido, a saber 472 g/l. La disolución estuvo a temperatura
ambiente y luego se enfrió en un baño con hielo y se centrifugó a
10000 x g durante 30 minutos para sedimentar las proteínas
precipitadas
Se descartó el sobrenadante y el sedimento se
disolvió en 1/10 del volumen original con TRIS-HCl a
20 mM a pH 7,5.
Se desaló el sedimento disuelto bien mediante
diálisis en TRIS-HCl 20 mM a pH 7,5 o bien por medio
de una columna de desalado.
Se tituló de la sustancia desalada a pH de 3,5
con citrato sódico a 20 mM y pH 2,5. Después de la incubación a
temperatura ambiente durante treinta minutos, se centrifugó la
disolución a 3000 X g durante diez minutos. En esta etapa, el
sobrenadante contenía la mayor cantidad de proteína activa.
Después de la neutralización del pH a 7,0, se
aplicó el sobrenadante a una columna de intercambio aniónico
Mono-Q equilibrada con TRIS a 20 mM, pH de 7,5, a
una velocidad de flujo de 300 ml/min. La columna se desarrolló con
un gradiente progresivo y lineal que utilizó NaCl a 400 mM en TRIS a
20 mM, pH 7,5.
Se utilizaron un bioensayo de las fracciones de
columna y un análisis de SDS-PAGE para confirmar las
fracciones activas. El análisis con SDS-PAGE
identificó que la proteína biológicamente activa tenía una masa
molecular del orden de 80 kDa.
La proteína de 80 kDa aislada mediante
SDS-PAGE se transfirió a la membrana de PVDF y se
sometió a la secuenciación del extremo amino, que se realizó
mediante ciclos de Edman repetitivos en el secuenciador líquido
pulsado ABI 470. La transferencia se realizó en el tampón CAPS a 10
mM con metanol al 10% y un pH de 11,0, de la siguiente manera:
Tras la electroforesis, se incubó el gel en un
tampón de transferencia durante cinco minutos.
Se humedeció brevemente la membrana de PVDF
ProBlott en metanol al 100%, y luego se equilibró en el tampón de
transferencia.
Se dispuso el sandwich entre esponjas de espuma y
cuadrados de papel de filtro con la configuración de
cátodo-gel-membrana-ánodo.
Se realizó la transferencia a un voltaje
constante de 70 V durante 1 hora.
Tras la transferencia, se enjuagó la membrana en
agua y se tiñó durante dos minutos con azul de Coomassie
R-250 al 0,25% en metanol al 50%.
Se realizó la destinción con varios enjuagues con
metanol al 50%, agua al 40% y ácido acético al 10%.
Tras la destinción, se secó la membrana antes de
la extraer de las bandas para analizar la secuencia. Se utilizaron
un cartucho BlottCartridge y unos ciclos apropiados para
conseguir la eficacia y producción máximas. El análisis de los datos
se realizó utilizando el programa Sequence Analysis
del modelo 610 para identificar y cuantificar los derivados
PTH-aminoácido en cada ciclo secuencial.
Se determinó la secuencia
N-terminal como:
NH_{2}-Lys-Arg-GLu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-Ile-Pro-
(SEQ ID nº 8) en la que Asx representa Asp o Asn.
Se generó una sonda oligonucleotídica de la
región del gen que codifica los aminoácidos 3 a 9 de la secuencia
N-terminal (ejemplo 5). Se sintetizó la sonda
basándose en el uso de codones del gen de la
\partial-endotoxina de Bacillus
thuringensis (Bt). Se usó la secuencia nucleotídica
5'-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-3'
(SEQ ID nº 9) como una sonda en la hibridaciones Southern. Se
sintetizó el oligonucleótido utilizando los procedimientos y el
equipo estándares.
Se analizó la proteína purificada de la etapa 5
del procedimiento de purificación en un gel de isoelectroenfoque
entre pI 3 y 9 usando el sistema de electroforesis Phastgel
(Pharmacia). Seguidamente se realizaron los procedimientos
estándares de operación de la unidad tanto para los procedimientos
de desarrollo de separación como de tinción de plata. El pI fue
aproximadamente de 4,9.
Se utilizó el análisis por PCR [véase, por
ejemplo, la solicitud de la patente de los EEUU con número de serie
08/008 006; y Carozzi et al. (1991) Appl. Environ.
Microbiol, 57 (11): 3057-3061; que se incorpora
en la presente memoria mediante la referencia] para verificar que la
cepa AB78 de B. cereus no contenía ningún gen de la proteína
cristalina insecticida de B. thuringensis o B.
sphaericus (tabla 17).
Se clonó el gen VIP-1 del
ADN total de la cepa AB78 de la siguiente manera:
- 1.
- Hacer crecer las bacterias en 10 ml de LB durante la noche. (utilícese un tubo de centrifugación estéril de 50 ml).
- 2.
- Añadir 25 ml de LB nuevo y de ampicilina (30 mg/ml).
- 3.
- Hacer crecer las células entre 2 y 6 horas a 30ºC con agitación.
- 4.
- Centrifugar las células en un tubo de tapón naranja de 50 ml de polipropileno en una centrifugadora clínica de sobremesa IEC a 3/4 de la velocidad máxima.
- 5.
- Resuspender el sedimento de células en 10 ml de TES.
- 6.
- Añadir 30 mg de lisozima e incubar durante 2 horas a 37ºC.
- 7.
- Añadir 200 ml de SDS al 20 y 400 ml de proteinasa K (20 mg/ml). Incubar a 37ºC.
- 8.
- Añadir 200 ml de proteinasa K nueva. Incubar durante 1 hora a 55ºC. Añadir 5 ml de TES (TES = TRIS a 50 mM pH 8,0; EDTA a 100 mM; NaCl a 15 mM) para obtener un volumen final de 15 ml.
- 9.
- Extraer dos veces con fenol (10 ml de fenol, centrifugar a temperatura ambiente a ¾ de la velocidad máxima en una centrifugadora clínica de sobremesa IEC). Transferir el sobrenadante (arriba) a un tubo limpio con una pipeta de calibre ancho.
- 10.
- Extraer una vez con un volumen 1:1 con fenol:cloroformo/alcohol isoamílico (proporción: 24:1).
- 11.
- Precipitar el ADN con un volumen igual de isopropanol frío; centrifugar para sedimentar el ADN.
- 12.
- Resuspender el sedimento en 5 ml de TE.
- 13.
- Precipitar el ADN con 0,5 ml de NaOAc 3 M a pH 5,2 y 11 ml de etanol al 95%. Colocar a -20ºC durante 2 horas.
- 14.
- "Enganchar"el ADN del tubo con un lazo de plástico, transferirlo a un tubo de microfugas, centrifugarlo, eliminar con la pipeta el etanol en exceso, y secar al vacío.
- 15.
- Resuspender en 0,5 ml de TE. Incubar durante 90 minutos a 65ºC para ayudar a que el ADN se vuelva a disolver.
- 16.
- Determinar la concentración utilizando los procedimientos estándares.
Todos los procedimientos, salvo que se indiquen
de otro modo, se realizaron de acuerdo con el protocolo del manual
de instrucciones de Stratagene para Supercos 1, nº de catálogo
251301.
Generalmente, las etapas fueron como sigue:
A. Digestión parcial del ADN de AB78 con
Sau3A.
B. Preparación del ADN del vector
C. Ligación y empaquetamiento del ADN.
D. Titulación de la genoteca en cósmido
- 1.
- Lanzar un cultivo de células de HB101 colocando 50 ml de un cultivo durante la noche en 5 ml de TB con maltosa al 0,2%. Incubar durante 3,5 horas a 37ºC.
- 2.
- Centrifugar las células y resuspenderlas en 0,5 ml de de MgSO_{4} a 10 mM.
- 3.
- Añadir juntos:
- 100 ml de células
- 100 ml de una mezcla de empaquetamiento diluida
- 100 ml de MgSO_{4} a 10 mM
- 30 ml de TB
- 4.
- Adsorber a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitación.
- 5.
- Añadir 1 ml de TB y mezclar suavemente. Incubar durante 30 minutos a 37ºC.
- 6.
- Sembrar 200 ml en placas L-amp. Incubar a 37ºC durante la noche.
Se detectaron al menos 400 clones de cósmidos con
una actividad contra la Diabrotica occidental, como se describió en
el ejemplo 3. Se utilizó el ADN de 5 clones activos y de 5 clones no
activos en la hibridaciones Southern. Los resultados demostraron que
la hibridación que usa la sonda oligonucleotídica descrita arriba se
correlacionaba con la actividad de la Diabrotica occidental (tabla
18).
Los clones de cósmido P3-12 y
P5-4 se depositaron en la Agricultural Research
Service Patent Culture Collection (NRRL) y se les dio los
números de acceso B-21061 y B-21059,
respectivamente.
Se digirió parcialmente el ADN de
P3-12 con la enzima de restricción Sau3A, se
ligó en el vector pUC19 de E. coli y se transformó en E.
coli. Se sintetizó una sonda de ADN específica de la proteína de
80 kDa mediante amplificación por PCR de una porción del ADN de
P3-12. Los oligonucleótidos MK113 y MK117, que se
hibridan a porciones de VIP-1, se
sintetizaron utilizando la secuencia de aminoácidos parcial de la
proteína de 80 kDa. Se identificaron los subclones plasmídicos
mediante una hibridación de colonias con la sonda de la PCR y se
probó su actividad contra la Diabrotica occidental. Uno de estos
clones, el PL2, se hibrida con el fragmento de la PCR y es activo
contra la Diabrotica occidental mediante el ensayo previamente
descrito.
Se clonó un fragmento de restricción ClaI
de 6 kb de PL2 en el sitio de SmaI del vector lanzadera pHT
3101 de Bacillus y E. coli (Lereclus, D. et
al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 60:
211-218) para producir el pCIB6201. Esta
construcción confiere actividad contra la Diabrotica occidental en
las cepas de Bacillus y E. coli, en cualquier
orientación. pCIB6022 contiene este mismo fragmento ClaI de
6kb en pBluescript SK(+) (Stratagene), produce una proteína
VIP-1 equivalente (mediante
inmunotransferencia) y también es activo contra la Diabrotica
occidental.
Se determinó la secuencia nucleotídica de
pCIP6022 mediante el método de terminación didesoxi de Sanger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 74:
5463-5467 (1977), utilizando PRISM Ready Reaction
Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kits y PRISM Sequenase®
Terminator Double-Stranded DNA Sequencing Kit, y
se analizó en un secuenciador automático AB1 373. Se proporciona la
secuencia en la SEQ ID n.º 1. Se depositó pCI6022 en el
Agricultural Research Service, Patent Culture Collection
(NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North
University Street, Peoria, Illinois 61604, USA y se le
dio el n.º de acceso de NRRLL B-2122.
Para confirmar que el marco de lectura abierto
(ORF) de VIP-1 es necesario para la actividad
insecticida, se creó en el gen una mutación traduccional de cambio
del marco de lectura. La enzima de restricción BglII reconoce
un único sitio localizado 1758 pb en la región codificante de
VIP-1. Se digirió pCIB62 01 con BglII
y los extremos monocatenarios se rellenaron con la ADN polimerasa
(fragmento de Klenow) y dNTP. Se religó el plásmido y se transformó
en E. coli. El plásmido resultante, el pCIB6203, contiene una
inserción de cuatro nucleótidos en la región codificante de
VIP-1. pCIB6203 no confiere una actividad
insecticida, lo que confirma que VIP-1 es un
componente esencial de la actividad contra la Diabrotica
occidental.
Para definir más la región necesaria para
codificar VIP-1, se construyeron los subclones de la
región VIP-1 y VIP-2 (proteína
auxiliar) y se probó su capacidad para complementar la mutación en
pCIB6203. pCIB6203 contiene el fragmento XbaI-EcoRV de
3,7kb en pBluescript SK(+) (Stratagene). El análisis de
inmunotransferencia indica que pCIB6023 produce una proteína
VIP-1 de igual tamaño y cantidad que los clones PL2
y pCIB6022. pCIB6023 contiene todo el gen de la proteína de 80 kDa.
Se depositó pCIB6023 en el Agricultural Research Service, Patent
Culture Collection, (NRRL), Northern Resgional Research
Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604,
USA y se le dió el nº de acceso de NRRL
B-21223.
pCIB6023 muestra alguna actividad contra
Diabrotica occidental. Sin embargo, el nivel de actividad es menor
que la actividad de pCIB6022. Una mezcla de células que contienen
pCIB6203 (VIP-1 mutada y VIP-2) y de
células que contienen pCIB6023 (sólo VIP-1) muestra
una elevada actividad contra Diabrotica occidental. Así, pCIB6023
debe producir un producto génico funcional de VIP-1
y pCIB6203 debe producir un producto génico funcional de
VIP-2. Estos resultados sugieren que para conferir
una actividad máxima contra Diabrotica occidental se requiere la
combinación de VIP-1 con uno o más
producto(s) génico(s) adicional(es) de la
región de VIP-2. Véase la tabla 19.
Las regiones recuadradas representan lo
correspondiente a VIP-1. El sombreo claro señala las
regiones que codifican el péptido de 80 kDa observado en
Bacillus. El sombreo oscuro representa los aminoácidos
amino-terminales predichos por la secuencia de ADN
de VIP-1. La "X" grande representa la
ubicación de la mutación de cambio del marco de lectura introducida
en VIP-1. Las flechas representan las
construcciones transcritas por el promotor de la
beta-galactosidasa. Sitios de restricción: C:
ClaI; X: XbaI; S: ScaI; ir: EcoRI; B:
BglII; RV: EcoRV.
La producción del anticuerpo se empezó en dos
ratas Lewis para permitir la posibilidad de promover la producción
de estirpes celulares de hibridoma y también de producir suficiente
suero para la detección limitada de la genoteca del ADNc. Otro
factor fue la cantidad muy limitada de antígeno disponible y el
hecho de que éste sólo se podía producir puro mediante PAGE y la
electrotransferencia posterior sobre nitrocelulosa.
Debido a la disponibilidad limitada del antígeno
en la nitrocelulosa, se emulsionó la nitrocelulosa en DMSO y se
inyectó en las almohadillas de las patas traseras de los animales
para desencadenar la producción de linfocitos B en los ganglios
linfáticos poplíteos justo encima. Se produjo un suero muy reactivo
en las inmunotransferencias con la sangre de la primera producción.
Varias inyecciones y sangrados posteriores produjeron suficiente
suero para realizar toda la detección necesaria.
Luego se inició la producción de hibridomas con
una de las ratas. Se extirpó y se maceró el ganglio linfático
poplíteo y las células resultantes se fusionaron con el mieloma del
ratón P3x63Ag8.653. Se realizó la posterior detección celular tal
como se describe abajo. Para promover la clonación por dilución
limitada se seleccionaron los cuatro pocillos iniciales que dieron
la mayor reacción de antígeno emulsionado. Se eligieron 10 pocillos
más para expandir y crioconservar.
Tras la electrotransferencia de las muestras de
AB78 migradas en un PAGE sobre nitrocelulosa, se usa la tinción
reversible de Ponceaus para visualizar todas las proteínas
transferidas. La banda correspondiente a la toxina de AB78,
previamente identificada y secuenciado su extremo amino, se
identifica y se escinde de la nitrocelulosa. Cada banda tiene
aproximadamente un tamaño de 1 mm x 5 mm para minimizar la cantidad
de nitrocelulosa emulsionada. Se coloca una sola banda en un tubo de
microfuga con 250 \mul de DMSO y se macera utilizando un mortero
de plástico (Kontes, Vineland, NJ). Para favorecer la emulsión, se
calienta la mezcla de DMSO durante 2 o 3 minutos entre 37ºC y 45ºC.
Se puede necesitar más maceración tras el calentamiento; sin
embargo, se debe emulsionar toda la nitrocelulosa. Una vez que se ha
emulsionado el AB78, se coloca la muestra en hielo. Para preparar el
antígeno emulsionado para recubrir una placa multipocillo se debe
diluir la muestra en un tampón salina de borato (BBS) de la manera
siguiente:1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30, 1:50, 1:100 y 0. El antígeno
para recubrimiento se debe preparar nuevo inmediatamente antes del
uso.
Protocolo del ELISA:
- 1.
- Cubrir con AB78/DMSO en BBS. Incubar durante la noche a 4ºC.
- 2.
- Lavar la placa 3 veces con el tampón de lavado de ELISA a 1X.
- 3.
- Bloquear (BSA al 1% y Tween 20 en PBS al 0,05%) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- 4.
- Lavar la placa 3 veces con el tampón de lavado de ELISA a 1X.
- 5.
- Añadir suero de rata. Incubar durante 1,5 horas a 37ºC.
- 6.
- Lavar la placa 3 veces con el tampón de lavado de ELISA a 1X.
- 7.
- Añadir anticuerpos de cabra antirrata a una concentración de 2 \mug/ml en el diluyente de ELISA. Incubar durante 1 hora a 37ºC.
- 8.
- Lavar la placa 3 veces con el tampón de lavado de ELISA a 1X.
- 9.
- Añadir fosfatasa alcalina conjugada con anticuerpos de conejo anticabra a 2 \mug/ml en el diluyente de ELISA. Incubar durante 1 hora a 37ºC.
- 10.
- Lavar 3 veces con el tampón de lavado de ELISA a 1X.
- 11.
- Añadir el sustrato. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- 12.
- Detener con NaOH a 3N tras 30 minutos.
Añadir pCIB6203 junto con el sobrenadante de
cultivo de la cepa GC91 de Bt produce una mortalidad del 100% en
Diabrotica virgifera virgifera. Ni pCIB6203 ni CG91 son
activas en Diabrotica virgifera virgifera por si mismas. Se
muestran los datos a continuación:
Se aisló una segunda cepa de B. cereus,
designada AB81, del muestras de polvo de granero de cereales
mediante metodologías estándares. Se hizo crecer un subcultivo de
AB81 y se preparó para bioensayo tal como se describe en el ejemplo
2. Se evaluó la actividad biológica tal como se describe en el
ejemplo 3. Los resultados son los siguientes:
Se aisló una cepa de B. thuringiensis,
designada como AB6, de muestras de polvo de granero de cereales
mediante los métodos estándares conocidos en la técnica. Se hizo
crecer un subcultivo de AB6 y se preparó para bioensayo como se
describe en el ejemplo 2. Se esterilizó la mitad de la muestra
durante 15 minutos para probar la presencia de la
\beta-exotoxina.
Se evaluó la actividad biológica tal como se
describe en el ejemplo 3. Los resultados son los siguientes:
La cepa AB6 se ha depositado en el
Agricultural Research Service, Patent Culture Collection
(NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North
University Street, Peoria, Ilinois 61604, USA, y se le
dio en n.º de acceso NRRL B-21060.
Se aisló una cepa de Bt, designada como AB88, de
muestras de polvo de granero de cereales mediante las metodologías
estándares. Se hizo crecer un subcultivo de AB88 y se preparó para
bioensayo tal como se describe en el ejemplo 2. Se esterilizó la
mitad de la muestra durante 15 minutos para probar la presencia de
la \beta-exotoxina. La actividad biológica se
evaluó frente al número de especies de insectos como se describe en
el ejemplo 3. Los resultados son los siguientes:
Se purificaron cristales de la
\partial-endotoxina de la cepa AB88 mediante las
metodologías estándares. No se observó ninguna actividad de los
cristales puros cuando se bioensayaron frente a Agrotis
ipsilon.
Se hizo crecer el cultivo en líquido bacteriano
durante la noche a 30ºC en el medio TB. Las células se retiraron por
centrifugaron y se conservó el sobrenadante. Se precipitaron las
proteínas con sulfato de amonio (saturación al 70%), se
centrifugaron y se conservó el sedimento. Se resuspender el
sedimento en el volumen original de TRIS a 20 mM y pH 7,5, y se
dializó frente el mismo tampón. El dializado de AB88 fue más turbio
que el material comparable de AB78. Se separaron las proteínas de
AB88 mediante varios métodos siguiendo diferentes tras la
clarificación que incluyen isoelectroenfoque (IEF) (Rotofor, BioRad,
Hercules, CA), la precipitación a pH 4,5, la cromatografía de
intercambio iónico, la cromatografía de exclusión por tamaño y la
ultrafiltración.
Se obtuvo en el sedimento la proteína activa
contra el taladro del maíz europeo mediante la precipitación del
dializado a pH 4,5. Cuando se realizó el IEF preparativo del
dializado utilizando anfolitos de pH entre 3 y 10, se encontró una
actividad insecticida del taladro del maíz europeo (TME) en todas
las fracciones con pH 7 o superior. La SDS-PAGE de
estas fracciones mostraron bandas de proteínas de masa molecular de
aproximadamente 60 kDa y aproximadamente 80 kDa. Las bandas de 60
kDa y 80 kDa se separaron mediante HPLC de intercambio aniónico en
una columna Poros-Q (PerSeptive BioSystems,
Cambridge, MA). Se obtuvo la secuencia de N-terminal
de dos fracciones que contenían proteínas de masas moleculares
ligeramente diferentes, pero ambas de un tamaño de aproximadamente
60 kDa. Las secuencias que se obtuvieron fueron similares unas a
otras y a algunas \partial-endotoxinas.
Fracción 23 de intercambio aniónico (menor):
xEPFVSAxxxQxxx (SEQ ID n.º 10)
Fracción 28 de intercambio aniónico (mayor):
xEYENVEPFVSAx (SEQ ID n.º 11)
Cuando además se separó el sedimento (activo) de
pH 4,5 mediante intercambio aniónico en una columna
Poros-Q, se encontró actividad sólo en las
fracciones con una banda mayor de aproximadamente 60 kDa.
También permaneció en el sedimento la proteína
activa contra la cuncunilla grasienta cuando el dializado de AB88 se
hizo descender hasta un pH de 4,5. En el IEF preparativo utilizando
anfolitos de pH entre 3 y 10, no se encontró ninguna actividad en
las fracciones del IEF del TME activo; en cambio, fue mayor en una
fracción con pH entre 4,5 y 5,0. Sus componentes principales tienen
unas masas moleculares de aproximadamente 35 kDa y 80 kDa.
Se separó el sedimento de pH 4,5 mediante HPLC de
intercambio aniónico para producir fracciones que contuvieran
solamente la sustancia de 35 kDa y las fracciones que contenían las
bandas de 35 kDa y de 80 kDa.
Se generaron fracciones que contenían las
diferentes proteínas vegetativas activas contra lepidópteros, tal
como se describió en el ejemplo 17. El análisis de las fracciones
activas demuestra que las diferentes VIP son responsables de la
actividad contra diferentes especies de lepidópteros.
La actividad contra Agrotis ipsilon se
debe a una proteína de 80 kDa y/o de 35 kDa que se transportan solas
o en combinación. Estas proteínas no están relacionadas con ninguna
de las \partial-endotoxinas de Bt, como prueba la
falta de homología de secuencia de las secuencias conocidas de la
\partial-endotoxina de Bt. Tampoco se encuentran
estas proteínas en el cristal de la
\partial-endotoxina de AB88. Se compararon las
secuencias N-terminales de las principales proteínas
\partial-endotoxina con las secuencias
N-terminales de las VIP de 80 kDa y de 35 kDa y no
revelaron ninguna homología de secuencia. A continuación se muestra
un compendio de los resultados:
La actividad contra Ostrinia nubilalis se
debe a la VIP de 60 kDa y la actividad contra Spodoptera
frugiperda se debe a una VIP de tamaño desconocido.
Se depositó la cepa AB88 de Bacillus
thuringiensis en el Agricultural Research Service, Patent
Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research
Center, 1815 North University Street, Peoria, Ilinois
61604, USA y se le dio el nº de acceso de NRRL
B-21225.
Se han aislado otras especies de Bacillus
que producen proteínas con una actividad insecticida durante el
crecimiento vegetativo. Se aislaron estas cepas de muestras
medioambientales mediante las metodologías estándares. Las cepas
aisladas se prepararon para bioensayo y se ensayaron tal como se
describe en los ejemplos 2 y 3, respectivamente. A continuación,
abajo, se exponen en forma de tabla las cepas aisladas que
produjeron proteínas insecticidas durante el crecimiento vegetativo
con actividad contra Agrotis ipsilon en el bioensayo.
Se depositaron las cepas AB289, AB294 y AB359 en
el Agricultural Research Service, Patent Culture Collection
(NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North
University Street, Peoria Ilinois, 61604, USA, y se les
dio los números de acceso NRRL B-21227, NRRL
B-21229 y NRRL B-21226,
respectivamente.
A continuación se exponen en forma de tabla las
cepas de Bacillus que producen unas proteínas insecticidas
durante el crecimiento vegetativo con actividad contra Diabrotica
virgifera virgifera.
Se depositaron las cepas AB59 y AB256 en el
Agricultural Research Service, Patent Culture
Collection (NRRL), Northern Regional Research Center,
1815 North University Street, Peoria Illinois 61604,
USA y se les dio los números de acceso NRRL
B-21228 y NRRL B-21230,
respectivamente.
Se han depositado las siguientes cepas en el
Agricultural Research Service, Patent Culture
Collection (NRRL), Northern Regional Research Center,
1815, North University Street, Peoria, Illinois 61604,
USA:
| 1. PL2 de E. coli | Nº de acceso del NRRL B-21221 |
| 2. pCIB 6022 de E. coli | Nº de acceso del NRRL B-21222 |
| 3. pCIB 6023 de E.coli | Nº de acceso del NRRL B-21223 |
| 4. HD73-78VIP de Bacillus thuringiensis | Nº de acceso del NRRL B-21224 |
| 5. AB88 de Bacillus thuringiensis | Nº de acceso del NRRL B-21225 |
| 6. AB359 de Bacillus thuringiensis | Nº de acceso del NRRL B-21226 |
| 7. AB289 de Bacillus thuringiensis | Nº de acceso del NRRL B-2122z |
| 8. AB59 de Bacillus sp. | Nº de acceso del NRRL B-2122u |
| 9. AB294 de Bacillus sp. | Nº de acceso del NRRL B-2122i |
| 10. AB256 de Bacillus sp. | Nº de acceso del NRRL B-21230 |
| 11. P5-4 de E. coli | Nº de acceso del NRRL B-21059 |
| 12. P3-12 de E. coli | Nº de acceso del NRRL B-21061 |
| 13. AB78 de Bacillus cereus | Nº de acceso del NRRL B-21058 |
| 14. AB6 de Bacillus thuringiensis | Nº de acceso del NRRL B-21060 |
1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE: CIBA-GEIGY AG
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CALLE: Klybeckstrasse 141
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CIUDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
- E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH-4002
\vskip0.500000\baselineskip
- G)
- TELÉFONO: (061) 696 11 11
\vskip0.500000\baselineskip
- H)
- TELEFAX: (061) 696 79 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE: Gregory W. Warren
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CALLE: 324 Bond Lake Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CIUDAD: Cary
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- ESTADO: NC
\vskip0.500000\baselineskip
- E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 27513
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE: Michael G. Koziel
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CALLE: 509 Carolyn Court
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CIUDAD: Cary
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- ESTADO: NC
\vskip0.500000\baselineskip
- E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 27511
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE: Martha A. Mullins
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CALLE: 104 Countrybrook Lane
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CIUDAD: Youngsville
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- ESTADO: NC
\vskip0.500000\baselineskip
- E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 27596
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE: Gordon J. Nye
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CALLE: 1001 Bray Court
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CIUDAD: Apex
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- ESTADO: NC
\vskip0.500000\baselineskip
- E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 27502
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE: Nalini Manaj Desai
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CALLE: 107 Silverwood Lane
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CIUDAD: Cary
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- ESTADO: NC
\vskip0.500000\baselineskip
- E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 27511
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE: N. Kristy Kostichka
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CALLE: 5017 Wineberry Dr.
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CIUDAD: Durham
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- ESTADO: NC
\vskip0.500000\baselineskip
- E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 27713
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevas cepas y proteínas plaguicidas
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 18
\vskip0.800000\baselineskip
- iv)
- FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- SOFTWARE: Patente en liberación n.º 1.0, versión n.º 1,25 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/037 057
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- FECHA DEL ARCHIVO: 25 de marzo de 1993
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 6106 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- ORGANISMO: Bacillus cereus
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CEPA: AB78
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CEPA AISLADA: NRRL B-21058
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- UBICACIÓN: 1082..1810
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto= "VIP-2" /etiqueta=ORF-1
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- UBICACIÓN: 1925..2470
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto= "VIP-2" /etiqueta= ORF-2
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 1:
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 243 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECCUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 182 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 2655 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- ORGANISMO: Bacillus cereus
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CEPA: AB78
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CEPA AISLADA: NRRL B-21058
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- UBICACIÓN: 1.. 2652
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto= "proteína VIP-1 de 100 kDa" /prueba= EXPERIMENTAL
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 4:
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 884 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 5:
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 2004 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- ORGANISMO: Bacillus cereus
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CEPA: AB78
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CEPA AISLADA: NRRL B-21058
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- UBICACIÓN: 1..2001
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto= "proteína VIP-1 de 80 kDa" /prueba= EXPERIMENTAL
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 6:
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 667 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 7:
\newpage
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- ORGANISMO: Bacillus cereus
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CEPA: AB78
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CEPA AISLADA: NRRL B-21058
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- UBICACIÓN: 1..16
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- OTRA INFORMACIÓN: /anotación= "secuencia N-terminal de la proteína purificada de la cepa AB78"
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Arg Glu Ile Asp Glu Asp Thr Asp Thr Asx
Gly Asp Ser Ile Pro}
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: característica miscelánea
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- UBICACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- E)
- OTRA INFORMACIÓN: /anotación="sonda oligonucleotídica basada en los aminoácidos 3 a 9 de la SEQ ID N.º 8, empleando el uso de codones de Bacillus thuringiensis"
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAATTGATC AAGATACNGA T
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- ORGANISMO: Bacillus thuringiensis
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CEPA: AB88
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- UBICACIÓN: 1..14
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- OTRA INFORMACIÓN: /anotación="secuencia de aminoácidos N-terminal de la proteína conocida como fracción 23 (menor) de intercambio aniónico"
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa Xaa Xaa Gln
Xaa Xaa Xaa}
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- ORGANISMO: Bacillus thuringiensis
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CEPA: AB88
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- UBICACIÓN: 1..13
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- OTRA INFORMACIÓN: /Anotación="secuencia de aminoácidos N-terminal de la proteína conocida como fracción 23 (mayor) de intercambio aniónico"
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Tyr Glu Asn Val Glu Pro Phe Val Ser
Ala Xaa}
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- ORGANISMO: Bacillus thuringiensis
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CEPA: AB88
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- UBICACIÓN: 1..14
\vskip0.500000\baselineskip
- E)
- OTRA INFORMACIÓN: /anotación="secuencia N-terminal de la VIP de 80 kDa activa contra Agrotis ipsilon"
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Pro Thr Arg
Ala Leu Pro}
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- ORGANISMO: Bacillus thuringiensis
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- CEPA: AB88
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- UBICACIÓN: 1..15
\vskip0.500000\baselineskip
- E)
- OTRA INFORMACIÓN: /anotación="secuencia de aminoácidos N-terminal de la VIP de 35 kDa activa contra Agrotis ipsilon"
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Leu Ser Glu Asn Thr Gly Lys Asp Gly Gly
Tyr Ile Val Pro}
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- ORGANISMO: Bacillus thuringiensis
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- UBICACIÓN: 1..9
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- OTRA INFORMACIÓN: /anotación="secuencia N-terminal de una delta-endotoxina de 130 kDa"
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu}
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- UBICACIÓN: 1..9
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- OTRA INFORMACIÓN: /anotación= "secuencia N-terminal de una delta-endotoxina de 80 kDa"
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu}
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- ORGANISMO: Bacillus thuringiensis
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- UBICACIÓN: 1..11
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- OTRA INFORMACIÓN: /anotación="secuencia N-terminal de una delta-endotoxina de 60 kDa"
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr
Ile}
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 2655 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 17:
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 2010 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 18:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (52)
1. Una cepa de Bacillus seleccionada del
grupo que consiste en las cepas con los números de acceso
B-21058, B21060, NRRL B-21225, NRRL
B-21226, NRRL B-21227, NRRL
B-21228, NRRL B-21229 y NRRL
B-21230, en la que dicha cepa produce una proteína
plaguicida durante el crecimiento vegetativo que se puede aislar de
un medio de cultivo líquido, en el que dicha proteína está
codificada por una secuencia nucleotídica que se hibrida con una
secuencia nucleotídica de las SEQ ID n.º 1, 4, 6, 9, 17 ó 18, en la
que dicha proteína reacciona cruzadamente con anticuerpos que se
fabrican contra las proteínas de las SEQ ID n.º 2, 3, 5, 7, 8, ó 10
a 16.
2. Una cepa de Bacillus de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que dicha proteína es capaz de matar plagas
que se seleccionan de insectos, hongos, bacterias, nematodos,
ácaros, garrapatas, patógenos protozoarios y parásitos de
animales.
3. Una cepa de Bacillus de acuerdo con la
reivindicación 2, en la que dicha proteína es capaz matar insectos
que se seleccionan de los órdenes Coleoptera, Diptera,
Hymenoptera, Lepidoptera, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera,
Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Mallophaga, Anoplura,
Siphonaptera o Trichoptera.
4. Una cepa de Bacillus de acuerdo con la
reivindicación 3, en la que dicha especie de coleóptero es
Diabrotica.
5. Una cepa de Bacillus de acuerdo con la
reivindicación 4, en la que dicha Diabrotica es Diabrotica
virgifera virgifera o Diabrotica longicornis barberi.
6. Una cepa de Bacillus de acuerdo con la
reivindicación 3, en la que dicha especie de lepidóptero es
Agrotis.
7. Una cepa de Bacillus de acuerdo con la
reivindicación 6, en la que dicha Agrotis es Agrotis
ipsilon.
8. Una cepa de Bacillus de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que dicha proteína tiene una masa molecular
de 30 kDa o mayor.
9. Una cepa de Bacillus de acuerdo con la
reivindicación 8, en la que dicha proteína tiene un peso molecular
de alrededor de 60 kDa a alrededor de 100 kDa.
10. Una cepa de Bacillus de acuerdo con
la reivindicación 9, en la que dicha proteína tiene una masa
molecular de alrededor de 80 kDa.
11. Una cepa de Bacillus de acuerdo con
la reivindicación 10, en la que dicha proteína tiene la secuencia
dada en la SEQ ID n.º 7.
12. Una cepa de Bacillus de acuerdo con
la reivindicación 9, en la que dicha proteína tiene una masa
molecular de alrededor de 100 kDa.
13. Una cepa de Bacillus de acuerdo con
la reivindicación 12, en la que dicha proteína tiene la secuencia
dada en la SEQ ID n.º 5.
14. Una proteína plaguicida que se puede aislar
durante la fase de crecimiento vegetativo de Bacillus spp. o
fragmentos activos de la misma, en la que se puede aislar dicha
proteína de un medio de cultivo líquido, y en la que dicha proteína
está codificada por una secuencia nucleotídica que se hibrida con
una secuencia nucleotídica de las SEQ ID n.º 1, 4, 6, 9, 17 ó 18, o
en la que dicha proteína reacciona cruzadamente con los anticuerpos
que se generan contra las proteínas de las SEQ ID n.º 2, 3, 5, 7, 8,
ó 10 a 16.
15. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 14, que es una proteína multimérica.
16. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 14, que es capaz de matar plagas que se seleccionan
de insectos, hongos, bacterias, nematodos, ácaros, garrapatas,
patógenos protozoarios y parásitos de animales.
17. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 16, en la que se seleccionan dichos insectos de los
órdenes Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Homoptera,
Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera,
Mallophaga, Anoplura, Siphonaptera o Trichoptera.
18. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 17, en la que dicha especie de coleóptero es
Diabrotica.
19. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 18, en la que dicha Diabrotica es
Diabrotica virgifera virgifera o Diabrotica longicornis
barberi.
20. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 17, en la que dicha especie de lepidóptero es
Agrotis.
21. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 20, en la que dicha Agrotis es Agrotis
ipsilon.
22. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 14, en la que dicho Bacillus es Bacillus
cereus.
23. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 22, en la que dicho Bacillus cereus es
Bacillus cereus que tiene el n.º de acceso
B-21058.
24. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 14, en la que dicho Bacillus es Bacillus
thuringensis.
25. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 24, en la que dicho Bacillus thuringensis es
Bacillus thuringensis que se selecciona de los números de
acceso NRRL B-21060, NRRL B-21224,
NRRL B-21225, NRRL B-21226 y NRRL
B-21227.
26. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 14, en la que dicha proteína tiene una masa molecular
de 30 kDa o mayor.
27. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 26, en la que dicha proteína tiene una masa molecular
de alrededor de 60 kDa a alrededor de 100 kDa.
28. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 27, en la que dicha proteína tiene una masa molecular
de alrededor de 80 kDa.
29. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 28, en la que dicha proteína tiene la secuencia dada
en la SEQ ID n.º 7.
30. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 27, en la que dicha proteína tiene la secuencia dada
en la SEQ ID n.º 5.
31. Una proteína plaguicida de acuerdo con la
reivindicación 14, en la que dicha proteína comprende una secuencia
N-terminal como se expone en la SEQ ID n.º 10 la SEQ
ID n.º 11.
32. Una secuencia nucleotídica que codifica la
proteína de la reivindicación 14.
33. Una secuencia nucleotídica que codifica la
proteína de la reivindicación 29.
34. Una secuencia nucleotídica que codifica la
proteína de la reivindicación 30.
35. Una secuencia nucleotídica que codifica la
proteína de la reivindicación 31.
36. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 32, en la que se ha optimizado dicha secuencia para
expresarla en una planta.
37. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 36, en la que selecciona dicha planta de maíz, soja,
algodón, trigo, girasol, tomate, patata y colza.
38. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 33, en la que se ha optimizado dicha secuencia para
expresarla en una planta.
39. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 38, en la que selecciona dicha planta de maíz, soja,
algodón, trigo, girasol, tomate, patata y colza.
40. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 34, en la se ha optimizado dicha secuencia para
expresarla en un microorganismo.
41. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 40, en la que dicha secuencia se expone en la SEQ ID
n.º 18.
42. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 35, en la se ha optimizado dicha secuencia para
expresarla en un microorganismo.
43. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 42, en la que dicha secuencia se expone en la SEQ ID
n.º 17.
44. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 32, en la se ha optimizado dicha secuencia para
expresarla en un microorganismo.
45. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 44, en la que se selecciona dicho microorganismo de
Bacillus, Pseudomonas, Sacharomyces, Clavibacter,
Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces,
Agrobacterium, virus patógenos de insectos, hongos, protozoos y
nematodos.
46. Una planta que se ha transformado
establemente con la secuencia nucleotídica de cualesquiera de las
reivindicaciones 32 a 39.
47. Una planta de acuerdo con la reivindicación
46, en la que dicha planta es una planta de maíz.
48. Una secuencia nucleotídica que codifica una
proteína plaguicida de acuerdo con la reivindicación 14, en la que
dicha secuencia está contenida en el clon P5-4 de
E. coli que tiene el n.º de acceso
B-21059.
49. Una secuencia nucleotídica que codifica una
proteína plaguicida de acuerdo con la reivindicación 14, en la que
dicha secuencia está contenida en el clon P3-12 de
E. coli que tiene el n.º de acceso
B-21061.
50. Una secuencia nucleotídica que codifica una
proteína plaguicida de acuerdo con la reivindicación 14, en la que
dicha secuencia está contenida en un clon pCIB 6022 de E.
coli que tiene el n.º de acceso NRRL
B-21222.
51. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 50, en la que dicha secuencia se ofrece como
VIP-1 en la SEQ ID n.º 1.
52. Un método para producir la proteína
plaguicida de la reivindicación 14, que se caracteriza por
las siguientes etapas:
a) hacer crecer las células de Bacillus en
un medio de cultivo;
b) retirar las células durante el crecimiento
vegetativo; y
c) aislar y purificar la proteína plaguicida del
medio de cultivo líquido.
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