ES2235175T3 - Mejora de un vestor de expresion para la produccion de proteinas recombinantes. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA MEJORAR LA TRANSCRIPCION DE UN GEN EN UN PRODUCTO DE ENSAMBLAJE DE ADN, INCORPORADO EN EL GENOMA DE UNA CELULA HUESPED EUCARIOTICA, COMPRENDIENDO DICHO PRODUCTO DE ENSAMBLAJE UN GEN ESTRUCTURAL PARA UNA PROTEINA O POLIPEPTIDO REQUERIDO, Y UN PROMOTOR GENICO, AGUAS ARRIBA RESPECTO DEL GEN ESTRUCTURAL. LA INVENCION CONSISTE EN PROPORCIONAR AL MENOS UN ELEMENTO DE REFUERZO, QUE COMPRENDE LA SECUENCIA NUCLEOTIDICA TTC TGA GAA, AGUAS ARRIBA RESPECTO DE DICHO PROMOTOR, Y EN EXPONER DICHO PRODUCTO DE ENSAMBLAJE DE ADN A ESTIMULOS LACTOGENICOS. LA INVENCION SE RELACIONA ASIMISMO CON UN VECTOR DE EXPRESION, UNA CELULA HUESPED, Y UN MAMIFERO TRANSGENICO QUE CONTIENE DICHO VECTOR.

Description

Mejora de un vector de expresión para la producción de proteínas recombinantes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos que utilizan plásmidos de DNA que han de usarse para la producción de proteínas recombinantes. Más específicamente, la presente invención trata de la adición de elementos de DNA específicos a plásmidos de expresión que realizan una función como elementos potenciadores. El resultado es mejorar los rendimientos de producción de proteínas recombinantes.

Antecedentes de la invención

Existe un número de estrategias diferentes para la producción a gran escala de proteínas recombinantes que han de usarse, por ejemplo, en la industria farmacéutica. En ciertos casos, es deseable que la proteína recombinante se elabore en huéspedes eucarióticos. Estos huéspedes pueden ser células cultivadas o animales no humanos convertidos en transgénicos con respecto al gen de interés. En la última situación, la expresión transgénica en leche es una técnica valiosa ya que se han descrito transgenes, activos en la glándula mamaria, y la leche es un fluido corporal fácilmente disponible.

La presente invención se refiere a una mejora en vectores de expresión usados para producir proteínas recombinantes en leche. Estos vectores de expresión mejorados incrementarán el rendimiento de proteínas recombinantes valiosas que tendrán valor para facilitar etapas de manejo y purificación subsiguientes.

La construcción de un transgén requiere ciertos ingredientes básicos, siendo uno el gen estructural que contiene la información de codificación para la proteína de interés. También se requiere un promotor de la expresión génica ecuariótico basal. Además, pueden usarse otras secuencias que confieren especificidad para tejidos o aumentan la expresión en respuesta a un estímulo. La presente invención se refiere a un tipo específico de potenciadores, a saber potenciadores que responden a estímulos hormonales. El potenciador particular en cuestión es una secuencia de DNA que confiere una respuesta a señales provocadas por hormonas pituitarias pertenecientes al grupo de hormonas lactogénicas, tales como prolactina (Prl) y lactógeno de placenta (PL), y hormonas somatogénicas tales como hormona del crecimiento (GH). Ambos de estos grupos de hormonas ocupan papeles principales en la estimulación del desarrollo y la función de las glándulas mamarias. La presente invención trata de la definición de potenciadores que responden a hormonas tanto lactogénicas como somatogénicas y a la construcción de vectores de expresión que, en su capacidad para responder a hormonas tanto lactogénicas como somatogénicas, funcionarán de una manera mejorada como transgenes para la producción de proteínas recombinantes en leche.

Estudios previos han definido un gen, el gen inhibidor de serina proteasa 2:1 (SPI), que responde a GH. En el flanco 5' de este gen se ha identificado un elemento de DNA que potencia la expresión génica de un modo dependiente de GH. La secuencia de este elemento de respuesta a GH (SPI GH-RE) en cuestión es: GATCTACGCTTCTACTAATC
CATGTTCTGAGAAATCATC CAGTCTGCCC-ATG (Yoon y otros, J. Biol. Chem. 265; 19947 (1991)). Dentro de esta secuencia se describe ahora un "elemento similar a SPI-GAS" más corto, TTCTGAGAA, que constituye la secuencia regulada por GH central. Como se ejemplifica más adelante, el elemento SPI-GAS también es funcional cuando se transfiere a un gen informador tal como el gen de luciferasa (Silva D. y otros, J. Biol. Chem., en prensa). En lo siguiente también se describe que las secuencias reguladas por GH descritas previamente también son reguladas por prolactina y que esto puede usarse para diseñar nuevos vectores de expresión que mejoran vectores existentes usados para producir proteínas recombinantes en leche.

Ejemplos

Ejemplo 1 para comparación

Identificación de una secuencia regulada por GH central

El SPI-GHRE de 52 pb; (GATCTACGCTTCTACTAATCCATGTTCTGAGAAATCATC CAGTCTGCCCATG) se usó para identificar una secuencia regulada por GH central usando un ensayo de cambio de movilidad por electroforesis en gel (GEMSA). Se prepararon extractos nucleares y se incubaron con un SPI-GHRE de 50 pb marcado con 32 P. Subsiguientemente, los extractos se analizaron sobre geles de poliacrilamida. Los resultados mostraban que las proteínas nucleares, dependientes de GH, se unían a esta secuencia de DNA. Por competición con oligonucleótidos más cortos derivados de SPI-GHRE, se identificó una secuencia de GH central. Basándose en ciertas homologías de secuencia con elementos de respuesta a interferones, se llamó a esta secuencia SPI-GAS y también se demostró que SPI-GAS funciona como un elemento de DNA regulado por GH cuando se introduce en un vector informador. El SPI-GAS central tiene la siguiente secuencia; TTCTGAGAA.

Ejemplo 2

Tanto la prolactina como la hormona del crecimiento activan el gen informador SPI-TK.

Se construyó un plásmido de expresión que contenía un informador sensible a hormona recombinante que consistía en seis repeticiones de un elemento sensible a hormona del crecimiento (GH-RE) de 50 pb a partir del promotor de inhibidor de serina proteasa (SPI) 2.1 fusionado al promotor de timidina quinasa (TK). Se elaboraron constructos correspondientes usando el elemento SPI-GAS. Se construyeron a continuación variantes que expresaban cDNAs de la proteína bacteriana cloranfenicol acetil transferasa (CAT) o luciferasa de luciérnaga (SPI-CAT o SPI-Luc, respectivamente). Las técnicas para elaborar estos vectores son bien conocidas por los expertos en la especialidad. Las construcciones de DNA plasmídicas se transfirieron, junto con vectores de expresión plasmídicos que codifican receptores de hormona de crecimiento de rata o receptores de prolactina de ratón, en células de ovario de hámster chino (CHO), COS e hígado de rata de Buffalo (BRL), usando liposomas de DOTAP y de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se incubaron durante la noche con DNA y DOTAP en medio libre de suero, se dejaron y a continuación se expusieron a hormona de crecimiento o prolactina durante 12 horas. Se prepararon a continuación lisados celulares y se midió la actividad de la enzima CAT o luciferasa. El tratamiento tanto con hormona de crecimiento como con prolactina conduce a una estimulación de aproximadamente 5 veces de la expresión de la enzima informadora con relación a células transfectadas pero no tratadas con hormona. Estos resultados muestran que tanto la hormona de crecimiento como la prolactina pueden regular el constructo informador y que un requisito para esto es la presencia de elementos SPI. Es probable que el elemento central en el gen informador SPI-TK que confiere regulación de GH sea TTCTGAGAA, y pueden obtenerse resultados similares con este elemento denominado SRI-GLE que con el elemento más largo de 50 pb denominado SPI-GHRE.

Ejemplo 3

Elementos de SPI multímeros frente a un promotor de TK dan una mejor respuesta.

Se construyeron plásmidos informadores que contenían de una a seis copias del elemento SPI de 50 pb fusionado al promotor de TK. La sensibilidad a la hormona del crecimiento de estos constructos se probó mediante transfección en una línea de células CHO que expresa establemente el DNA de receptor de hormona de crecimiento de rata. La estimulación con hormona del crecimiento de estas células mostraba que la multimerización de elementos SPI daba como resultado una mayor respuesta a la hormona del crecimiento.

Ejemplo 4 para comparación

La expresión de SPI-TK-luciferasa incorporada estable es regulada por hormona del crecimiento.

Para demostrar que los elementos SPI retienen función de sensibilidad a la hormona del crecimiento cuando células CHO genómicamente integradas se transfectan con los tres plásmidos siguientes: SPI-LUC (descrito en el ejemplo 1), un vector de expresión que contiene el promotor de CMV y cDNA de hormona de crecimiento de rata y un vector de expresión de neomicina. Los clones resistentes a la neomicina se probaron con respecto a la respuesta frente a hormona del crecimiento exponiendo las células a hormona del crecimiento durante 12 horas bajo condiciones libres de suero y a continuación midiendo la actividad de luciferasa en lisados celulares. Los resultados indicaban una inducción regulada por hormona del crecimiento de tres veces de la expresión del gen informador integrado establemente.

Ejemplo 5 para comparación

Elementos SPI frente a un promotor fuerte (SV40) dan como resultado una producción de proteínas que es potenciada adicionalmente por GH.

Seis copias del elemento SPI se introdujeron aguas arriba de un promotor de CMV fuerte que conduce la expresión del cDNA de CAT en un constructo plasmídico. Este constructo se transfirió a células CHO-4 y la regulación por GH se probó como se describe previamente. Se encontró que la GH estimulaba la producción de CAT.

Claims (3)

1. Un método para potenciar la transcripción de un gen en un constructo de DNA incorporado en el genoma de una célula huésped eucariótica no humana, comprendiendo dicho constructo de DNA un gen estructural para una proteína o un polipéptido deseado y un promotor génico aguas arriba del gen estructural, comprendiendo dicho método las etapas de: (i) proporcionar, fusionado aguas arriba de dicho promotor, al menos un elemento de respuesta a GH Spi 2.1 que comprende la secuencia nucleotídica GATCTACGCTTCTACTAATCCATGTTCTGAGAAAT CATC
CAGTCTGCCCATG, o una parte del mismo que comprende la secuencia nucleotídica TTCTGAGAA, y (ii) exponer dicho constructo de DNA a señales provocadas por prolactina.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha parte del elemento de respuesta a GH Spi 2.1 consiste esencialmente en la secuencia nucleotídica TTCTGAGAA.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicha parte del elemento de respuesta a GH Spi 2.1 consiste en la secuencia nucleotídica TTCTGAGAA.