JPH10507633A - 組換え蛋白質生産用発現ベクターの改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、真核宿主細胞のゲノム中に組み込まれた、所望の蛋白質またはポリペプチドの構造遺伝子とその構造遺伝子の上流の遺伝子プロモーターとを含むＤＮＡ構築物内の遺伝子の転写を増進する方法に関する。この本発明は、このプロモーターの上流にヌクレオチド配列 ＴＴＣ ＴＧＡ ＧＡＡを含む少なくとも１つのエンハンサー要素を提供し、ＤＮＡ構築物を乳汁分泌刺激にさらすことにある。また、この発明は、発現ベクター、このベクターを含む宿主細胞、およびこの哺乳動物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 組換え蛋白質生産用発現ベクターの改良 発明の分野 本発明は、組換え蛋白質の生産に用いられるＤＮＡプラスミドに関する。更に 具体的に、本発明は、転写促進因子(enhancing element)としての機能をもつ発 現プラスミドへの特定のＤＮＡ要素の付加に関する。これによって、組換え蛋白 質生産の収率が向上する。発明の背景 例えば製薬産業で用いられる組換え蛋白質の大規模生産には多数の異なる戦略 がある。ある場合には、組換え蛋白質を真核宿主内で生産するのが望ましい。こ れらの宿主は、目的の遺伝子が移入された（すなわちトランスジェニック）動物 または培養細胞であり得る。トランスジェニック動物においては、乳腺で活性で ある移入遺伝子（又はトランスジーン）が記載されており、また乳汁は容易に入 手可能な体液であることから、乳汁におけるトランスジェニック発現は価値のあ る方法である。 本発明は、乳汁中に組換え蛋白質を産生するために用いられる発現ベクターの 改良に関するものであり、その改良法は非制 限的である。これらの改良された発現ベクターは、後続の処理や精製工程を容易 にする価値がある貴重な組換え蛋白質の収率を増加させる。 移入遺伝子の構築は、特定の基本成分を必要とし、その一つは目的の蛋白質の コード情報を含む構造遺伝子である。基本的真核遺伝子発現プロモーターもやは り必要とする。更に、組織特異性を付与するか又は刺激に対する応答で発現を増 進する他の配列を用いることができる。本発明は、特定のタイプのエンハンサー 、即ち、ホルモン刺激に応答するエンハンサーに関する。問題の特定のエンハン サーは、プロラクチン（Ｐｒｌ）および胎盤ラクトゲン（ＰＬ）のような乳汁分 泌ホルモンならびに成長ホルモン（ＧＨ）のような体形成ホルモンの群に属する 下垂体ホルモンにより誘起されるシグナルに対する応答を付与するＤＮＡ配列で ある。これら両方の群のホルモンは、乳腺の発達と機能の刺激において中心的役 割を占める。本発明は、乳汁分泌ホルモンおよび体形成ホルモンの両方に応答す るエンハンサーを規定すると共に、乳汁分泌ホルモンおよび体形成ホルモンの両 方に応答する能力において乳汁中への組換え蛋白質産生用の移入遺伝子として改 良された方法で機能する発現ベク ターの構築に関する。 従来の研究は、ＧＨに応答する遺伝子、すなわちセリン・プロテアーゼインヒ ビター２．１（ＳＰＩ）遺伝子を定義付けたが、この遺伝子の５′フランクにお いて、ＧＨに依存して遺伝子発現を増進するＤＮＡ要素が同定された。問題のこ のＧＨ応答要素（ＳＰＩ Ｈ−ＲＥ）の配列は： ＧＡＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＴＡＣＴＡＡＴＣＣＡＴＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＣ ＡＴＣＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＡＴＧ(Yoon等，J．Biol．Chem．265; 19947(1991) )である。この配列内で、本発明者等は、ＧＨによって制御される中心的な配列 を構成するより短い″ＳＰＩ−ＧＡＳ様要素″すなわちＴＴＣＴＧＡＧＡＡを開 示する。下記に例示するように、ＳＰＩ−ＧＡＳ要素は、ルシフェラーゼ遺伝子 のようなレポーター遺伝子に導入した場合も機能的である(Sliva D.等 J．Biol ．Chem.印刷中)。また、本発明者等は、上記のＧＨ制御配列が、やはりプロラク チンにより制御されること、及びこれを用いて、乳汁中に組換え蛋白質を産生す るのに用いられる既存ベクターを改良する新規な発現ベクターを設計することが できることを以下に開示する。実施例 実施例１ ＧＨによって制御される中心的配列の同定 ５０塩基対のＳＰＩ−ＧＨＲＥ： （ＧＡＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＴＡＣＴＡＡＴＣＣＡＴＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴ ＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＡＴＧ）を用いて、ゲル電気泳動移動度シフトア ッセイ（ＧＥＭＳＡ）により、ＧＨにより制御される中心的配列を同定した。核 抽出物を調製し、³²Ｐで標識した５０塩基対（bp）のＳＰＩ−ＧＨＲＥと共にイ ンキュベートした。次いで、抽出物をポリアクリルアミドゲル上で分析した。結 果は、核蛋白質が、ＧＨに依存して、上記ＤＮＡ配列に結合したことを示した。 ＳＰＩ−ＧＨＲＥから誘導されるより短いオリゴヌクレオチドとの競合により、 中心的ＧＨ配列を同定した。インターフェロン応答性要素に対する特定の配列の 相同性に基づいて、本発明者等は、この配列をＳＰＩ−ＧＡＳと称し、また、Ｓ ＰＩ−ＧＡＳが、レポーターベクター中に入れた場合、ＧＨによって制御される ＤＮＡ要素として機能することを実証した。この中心的ＳＰＩ−ＧＡＳは、配列 ＴＴＣＴＧＡＧＡＡを有する。実施例２ プロラクチンおよび成長ホルモンはともにＳＰＩ− ＴＫ−レポーター遺伝子を活性化する チミジン・キナーゼ（ＴＫ）プロモーターに融合したセリン・プロテアーゼイ ンヒビター（ＳＰＩ）２．１プロモーター由来の５０ｂｐ成長ホルモン応答性要 素（ＧＨ−ＲＥ）の６反復体から成る組換えホルモン応答性レポーターを含む発 現プラスミドを構築した。対応する構築物をＳＰＩ−ＧＡＳ要素を用いて作製し 、次いで細菌性蛋白質クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ Ｔ）またはホタルルシフェラーゼ（それぞれ、ＳＰＩ−ＣＡＴまたはＳＰＩ−Ｌ ｕｃ）ｃＤＮＡのいずれかを発現する変異体を構築した。これらのベクターを作 製する方法は、当業者に周知されている。プラスミドＤＮＡ構築物を、ラット成 長ホルモン受容体またはマウスプロラクチン受容体のいずれかをコードするプラ スミド発現ベクターと共に、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ 、またはバッファロー・ラット肝臓（ＢＲＬ）細胞中に、ＤＯＴＡＰリポソーム を用い製造元の指示に従ってトランスフェクションした。細胞を、無血清培地中 でＤＮＡおよびＤＯＴＡＰと共に一晩インキュベートし、放置し、次いで、成長 ホルモンまたはプロラク チンに１２時間さらした。細胞溶解物を、次いで、調製し、ＣＡＴまたはルシフ ェラーゼ酵素活性を測定した。成長ホルモンおよびプロラクチン処理の両方が、 トランスフェクションしたがホルモン処理しなかった細胞に比較して約５倍の刺 激レポーター酵素発現をもたらした。これらの結果は、成長ホルモンおよびプロ ラクチンの両方が、レポーター構築物を制御することができること、このための 要件は、ＳＰＩエレメントの存在であることを示す。ＧＨ制御を付与するＳＰＩ −ＴＫ−レポーター遺伝子内の中心的要素はＴＴＣＴＧＡＧＡＡであるようであ り、同様の結果は、ＳＰＩ−ＧＬＥと呼ぶこの要素を用いても、ＳＰＩ−ＧＨＲ Ｅと呼ぶより長い５０ｂｐ要素を用いても得ることができる。実施例３ ＴＫプロモーターの前のマルチマーのＳＰＩ要素は より良好な応答を与える ＴＫプロモーターに融合した１〜６コピーの５０ｂｐ ＳＰＩ要素を含有する レポータープラスミドを構築した。これらの構築物の成長ホルモン応答性を、ラ ット成長ホルモン受容体ＤＮＡを安定に発現するＣＨＯ細胞系中にトランスフェ クションすることにより調べた。これらの細胞の成長ホルモン刺激は、 ＳＰＩ要素の多量化の結果、より大きな成長ホルモン応答が生じたことを示した 。実施例４ 安定な組み込まれたＳＰＩ−ＴＫ−ルシフェラーゼ の発現は、成長ホルモンによって制御される ゲノムに組み込まれたときにＳＰＩ要素が成長ホルモン応答性機能を保持する ことを実証するために、ＣＨＯ細胞を、以下の３つのプラスミド、すなわちＳＰ Ｉ−ＬＵＣ（実施例１で述べた）、ＣＭＶプロモーターおよびラット成長ホルモ ン受容体ｃＤＮＡを含有する発現ベタター、ならびにネオマイシン発現ベクター でトランスフェクションした。無血清条件下で１２時間成長ホルモンに細胞をさ らし、次いで、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を測定することにより、ネオ マイシン耐性クローンを成長ホルモン応答についてテストした。その結果は、安 定に組み込まれたレポーター遺伝子の発現の３倍高い成長ホルモン制御誘導を示 した。実施例５ 強力なプロモーター（ＳＶ４０）の前のＳＰＩ要素 は、ＧＨにより更に増進される蛋白質産生を起こす ６コピーのＳＰＩ要素を、プラスミド構築物中のＣＡＴ ｃＤＮＡの発現を推 進する強力なＣＭＶプロモーターの上流に導入 した。この構築物をＣＨＯ−４細胞中にトランスフェクションし、ＧＨ制御を、 上記の通りにテストした。ＧＨがＣＡＴの産生を刺激することが分かった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 スリバ，ダニエル スウエーデン国、エス−113 46・ストツ クホルム、スベアベーゲン・164、ウエン ネルグレン・センテル・アー・24 (72)発明者 エンベルイ，ベルテイル スウエーデン国、エス−147 92・グレデ インゲ、シブレ・ストランド・12 (72)発明者 ロビー，ペーテル スウエーデン国、エス−124 72・バンド ハーゲン、ヒユーゲスタグレーンド・２ (72)発明者 ハルドーセン，ラルス−アルネ スウエーデン国、エス−144 44・レニン ゲ、ウルステイゲン・７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 真核宿主細胞のゲノム内に組み込まれたＤＮＡ構築物中の遺伝子の転写を 増進する方法であって、該ＤＮＡ構築物は所望の蛋白質またはポリペプチドの構 造遺伝子と該構造遺伝子の上流の遺伝子プロモーターとを含んでおり、該方法は 、ヌクレオチド配列ＴＴＣ ＴＧＡ ＧＡＡを含む少なくとも１つのエンハンサー 要素を該プロモーターの上流に提供し、該ＤＮＡ構築物を乳汁分泌刺激にさらす ことにより特徴づけられる方法。 ２． 該エンハンサー要素が、ＳＰＩ−成長ホルモン応答性要素（ＳＰＩ−ＧＨ ＲＥ）またはその誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３． 乳汁中に組換え蛋白質またはポリペプチドを産生するための、非ヒト哺乳 動物用の発現ベクター内にヌクレオチド配列ＴＴＣ ＴＧＡ ＧＡＡを含むエンハ ンサー要素の使用。 ４． 該エンハンサー要素が、単一またはマルチマーのコピーのＳＰＩ−成長ホ ルモン応答性要素（ＳＰＩ−ＧＨＲＥ）又はその誘導体からなる請求項３に記載 の使用。 ５． 真核宿主細胞のトランスフェクション用のＤＮＡ構築物 中で用いられるときにホルモン刺激に対し応答性であるエンハンサー要素であっ て、該エンハンサー要素が、ヌクレオチド配列ＴＴＣ ＴＧＡ ＧＡＡを含むこと 、但し、該ヌクレオチド配列は、ＳＰＩ−成長ホルモン応答性要素（ＳＰＩ−Ｇ ＨＲＥ）のＤＮＡ配列ではないことを特徴とするエンハンサー要素。 ６． 体形成および乳汁分泌刺激の両方に応答性であることを特徴とする請求項 ５に記載のエンハンサー要素。 ７． 成長ホルモン受容体およびプロラクチン受容体の両方から生じるシグナル に対し応答性であることを特徴とする請求項５または６に記載のエンハンサー要 素。 ８． 所望の蛋白質またはポリペプチドをコードする構造遺伝子とプロモーター とを含む発現ベクターであって、ベクターが、ＳＰＩ−成長ホルモン応答性要素 （ＳＰＩ−ＧＨＲＥ）を除く、ヌクレオチド配列ＴＴＣ ＴＧＡ ＧＡＡを含む少 なくとも１つのエンハンサー要素を更に含むことを特徴とする発現ベクター。 ９． 所望の蛋白質をコードする構造遺伝子と哺乳動物組織に特異的なプロモー ターとを含む発現ベクターであって、ヌクレオチド配列ＴＴＣ ＴＧＡ ＧＡＡを 含む少なくとも１つのエンハンサー要素を更に含むことを特徴とする発現ベクタ ー。 １０． 該エンハンサー要素が、単一またはマルチマーのコピーのＳＰＩ−成長 ホルモン応答性要素（ＳＰＩ−ＧＨＲＥ）又はその誘導体を含むことを特徴とす る請求項９に記載の発現ベクター。 １１． 請求項８、９または１０に記載の発現ベクターを含む真核宿主細胞。 １２． 所望の蛋白質またはポリペプチドを乳汁中に分泌するように、乳汁を分 泌する乳腺の上皮細胞内での発現のための調節配列に結合した該蛋白質またはポ リペプチドをコードする構造遺伝子を含むＤＮＡ構築物がゲノム中に組み込まれ たトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該ＤＮＡ構築物が、ヌクレオチ ド配列 ＴＴＣ ＴＧＡ ＧＡＡを含み、且つプロラクチン受容体から生じたシグナ ルに対し応答性である少なくとも１つのエンハンサー要素を更に含むことを特徴 とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 １３． マウス、ブタ、ヤギ、ヒツジおよびウシから選ばれることを特徴とする 請求項１２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 １４． 組換え蛋白質またはポリペプチドを製造する方法であ って、請求項１２または１３に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を準備 し、該哺乳動物により産生された乳汁から該蛋白質またはポリペプチドを回収す ることにより特徴づけられる方法。