ES2235235T3 - Procedimiento de diagnostico que permite detectar las formas moleculares de proteinas cationicas eosinofilicas (iso-ecps). - Google Patents
Procedimiento de diagnostico que permite detectar las formas moleculares de proteinas cationicas eosinofilicas (iso-ecps).Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE DIAGNOSTICO QUE COMPRENDE LOS SIGUIENTES PASOS: (A) MEDICION ESPECIFICA DEL NIVEL DE ECP EN UNA MUESTRA DERIVADA DE UN INDIVIDUO AL QUE HAY QUE DIAGNOSTICAR Y A CONTINUACION, (B) COMPARACION DEL NIVEL ENCONTRADO CON UN NIVEL ESTANDAR PARA ECP, CARACTERIZADO PORQUE SE DETERMINA SELECTIVAMENTE EL NIVEL DE AL MENOS UNA ISO ECP. EN PARTICULAR SE MIDEN LAS VARIANTES DE ECP CITOTOXICAS. EL PRINCIPIO DE MEDICION ESTA EN LOS CASOS PREFERIDOS BASADO EN TECNICAS DE INMUNOENSAYO. ANTICUERPO DE ANTI- ECP, CARACTERIZADO PORQUE EL ANTICUERPO SE ENLAZA PREFERENTEMENTE A AL MENOS UNA ISO - ECP(S) CITOTOXICA COMPARADA CON LA ADHESION A OTRA ISO - ECP(S).
Description
Procedimiento de diagnóstico que permite detectar
las formas moleculares de proteínas catiónicas eosinofílicas
(iso-ECPs).
La presente invención tiene que ver con métodos
de diagnóstico novedosos que implican la determinación de la
proteína catiónica eosinófila ("ECP en sus siglas en Inglés")
y anticuerpos novedosos que pueden ser empleados en tales
métodos.
Se ha sugerido que las proteínas del gránulo del
eosinófilo median su citotoxicidad cuando entran en contacto íntimo
con las células diana (Hamman y col., J. Immunol. 144 (1990)
3166-3173; Capron y col., Eosinophils in Asthma.
London, Mew York, Tokyo: Academic Press (1989)
49-60; Robert y col., J. Allergy Clin. Immunol
(1991) 1105-1115). La ECP es una potente toxina para
las larvas de Shistosoma mansoni (McLaren y col., Parasitol.
88 (1984) 491-503 y una potente neurotoxina cuando
se inyecta en cerebros de cobayas o en el fluido cerebroespinal de
conejos (Fredens y col, J. Allergy Clin. Immunol. 70 (1982)
361-366). La ECP es un agente activo de membrana y
puede ocasionar el deterioro de la membrana. Induce el flujo iónico
a través de bicapas artificiales mediante la formación de poros
(Yong y col., Nature 321 (1985) 613-616).
Muchos investigadores (Olsson y col., Blood 44
(1974) 235-246; Olsson y col., Blood 67 (1986)
498-503; y Gleich y col., Pro. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 83 (1986) 3146-3150) han demostrado que la
ECP purificada se separa mediante SDS-PAGE en formas
de peso molecular diferente (variando entre 18 y 21 kDa). Peterson y
col. (Eur. J. Haematol. 40 (1988) 415-423)
demostraron que la ECP purificada de donantes sanos era separada
mediante SDS-PAGE en al menos tres formas de peso
molecular y sus diferencias de carga y de pesos moleculares fueron
deducidas para reflejar las diferentes cantidades de carbohidratos
unidos a la proteína. No se sabe nada acerca de las actividades
biológicas de estas diferentes formas moleculares de ECP
(iso-ECP).
Se sabe desde hace tiempo que la eosinofilia está
asociada con una variedad de trastornos inflamatorios incluyendo las
enfermedades alérgicas. En tales enfermedades se observan
eosinófilos y sus productos tóxicos en especímenes de tejido de los
focos de inflamación, por ejemplo en el asma (Arm y col. Adv.
Immunol. 51 (1992) 323-382). Las células y sus
productos del gránulo parecen ser la causa principal de la
destrucción del tejido, por ejemplo vertiendo las células
epiteliales a las vías respiratorias (Filley y col., Lancet 3
(Julio, 1982) 11-16; Venge y col., Am. Rev. Resp.
Dis. 138 (1988) 54-57; y Bousquet y col., N. Engl.
J. Med. 323 (1990) 1033-1039). Los cambios
patofisiológicos observados en el pulmón asmático conducen a
hiperactividad. Incluso un bajo grado de inflamación parece volver
a los pacientes susceptibles a una variedad de sensibilizaciones
incluyendo la exposición al alérgeno (Bisgaard y col., J. Allergy
Clin. Immunol. 85 (1990) 891-895) y el ejercicio
(Venge y col., J. Allergy Clin. Immunol 88 (1991)
699-704). Estas afecciones pueden ser identificadas
controlando los eosinófilos activados y su ECP producto en
diferentes fluidos biológicos.
La afecciones inflamatorias como el asma aguda
son tratadas mediante fármacos anti-inflamatorios
(Sheffer, J. Allergy Clin. Immunol. 88 (Suppl) (1991)
425-534). La disminución de la inflamación,
reflejada en el nivel de ECP en muestras de sangre, por ejemplo de
suero y plasma, puede tener valor en el control del efecto de la
terapia.
Se han encontrado niveles de ECP elevados en
otras afecciones clínicas relacionadas con los eosinófilos
activados como en la dermatitis atópica (Kapp y col., J. Am. Acad.
Dermatol. 24 (1991) 555-558), ciertas infecciones
(Paganelli y col., J. Allergy Clin. Immunol. 88 (1991)
416-418), las afecciones autoinmunes de las
articulaciones (Hällgreen y col., Ann. Rheum. Dis. 43 (1984)
556-562), el intestino (Hällgreen y col., Am. J.
Med. 86 (1989) 56-64) y en enfermedades por
parásitos (Venge y col., In. Eosinophil cationic proteins (ECP and
EPX) in Health and disease. Eds. Yoshida y col., Immunobiology of
the eosinophil. New York: Elsevier Biomedical (1983) 163-
179).
179).
H.F. Rosenberg y col. (J. Leucocyte Biol. 56
(1994) 502-506) presentan datos sobre la unión de
los anticuerpos monoclonales EG1 y EG2 a diferentes formas
moleculares de ECP, que están caracterizadas por diferencias en la
glicosilación. Las capacidades citotóxicas de la ECP eran conocidas
previamente, no obstante, no se incluyen datos o argumentos en los
que diferentes formas moleculares de ECP tengan diferentes
propiedades citotóxicas o que los epítopos unidos mediante EG1 y
EG2 estén relacionados con la citotoxicidad.
La invención está basada en el descubrimiento de
los autores de la presente invención de que las isoformas de ECP
(las iso-ECP) pueden crear diferentes efectos
biológicos, v.g. la citotoxicidad de la ECP varía entre las
isoformas. Esto ha revelado a los autores de la presente invención
que son factibles métodos de diagnóstico en humanos mejorados
midiendo las iso-ECP en fluidos biológicos.
Por consiguiente, los objetivos de la invención
son para proporcionar métodos de diagnóstico en humanos mejorados
basados en mediciones de iso-ECP, y los
reaccionantes que se van a emplear en estos métodos. Las
iso-ECP que se van a medir son citotóxicas, tales
como las variantes citotóxicas definidas en la sección
experimental.
Un aspecto de la invención es un método de
diagnóstico para la determinación de afecciones inflamatorias tales
como la alergia, el asma, el síndrome de Sjögren y las infecciones
virales/bacterianas que comprende las etapas de:
- (a)
- medir específicamente el nivel de al menos una iso-ECP citotóxica en una muestra derivada de un individuo que vaya a ser diagnosticado, y después
- (b)
- comparar el nivel de ECP encontrado con el nivel normal de la misma iso-ECP.
El rasgo característico de este aspecto de la
invención es que el nivel de al menos una iso-ECP
es determinado y comparado selectivamente con un nivel de
referencia de la misma iso-ECP. La mínima
iso-ECP es citotóxica. Este aspecto excluye la
determinación de la cantidad total (nivel) de todas las
iso-ECP.
El nivel de referencia puede ser el nivel
encontrado para individuos aparentemente sanos o un nivel obtenido
en una ocasión anterior para el mismo individuo. Si el nivel
encontrado se desvía del nivel normal de los individuos sanos, esto
es una indicación de que el individuo padece de algún estado
anormal, por ejemplo, los estados descritos antes (niveles
incrementados). En caso de que el nivel difiera del nivel obtenido
en una ocasión anterior para el mismo individuo, la desviación
indica un cambio de estado (recuperación o empeoramiento del estado
anormal). En el último caso las mediciones de
iso-ECP permitirán el control del tratamiento
médico como se ha comentado antes. Niveles reducidos en comparación
con el nivel normal pueden indicar sobretratamiento con
anti-inflamatorios y/o deficiencia de
eosinófilos.
La expresión "al menos una
iso-ECP es determinada selectivamente" pretende
incluir también la suma de las diferentes isoformas de ECP, pero no
la cantidad total de ECP. El nivel medido puede ser expresado como
una concentración absoluta (por ejemplo \mug/L o nmoles/L) o como
un valor relativo a algún otro constituyente muestra, por ejemplo
relativo a la cantidad total de ECP, relativo a cierta combinación
de iso-ECP o relativo a algún otro constituyente
muestra.
La muestra está derivada del individuo humano que
vaya a ser diagnosticado y contiene eosinófilos y/o ECP. Debido a
la presencia generalizada de eosinófilos, las muestras potenciales
son fluido de lavado broncoalveolar, sangre (incluyendo muestras de
suero y plasma), orina, fluido cerebroespinal, esputo, heces, fluido
lacrimal y fluido nasal. Las muestras de sangre, por ejemplo sangre
completa, muestras de suero y plasma, fueron hasta la fecha de
prioridad las muestras preferidas.
La medición de las iso-ECP puede
ser realizada en principio mediante cualquier método que sea capaz
de discriminar una o más iso-ECP de otras ECP y de
proporcionar la suficiente sensibilidad, precisión y especificidad
etc. No obstante, como se ha indicado en la sección experimental, se
cree que se prefieren los análisis de inmunidad.
Un análisis de inmunidad según la invención
significa que la muestra sospechosa de contener un nivel desviado
de iso-ECP se pone en contacto con un anticuerpo
anti-ECP en un medio de análisis en condiciones que
permitan la formación de complejos inmunes que incorporen las ECP y
el anticuerpo anti-ECP. Los complejos que contienen
las iso-ECP que van a ser determinadas son
determinados después mediante métodos conocidos per se para
dar una medida cuantitativa o cualitativa de su nivel en la
muestra. En este tipo de análisis se puede medir el complejo tal
cual, o se puede medir mediante la ayuda de un reaccionante de
afinidad bioespecífico marcado con una sustancia analíticamente
detectable (marca), siendo dicho reactivo (y su marca) susceptible
de ser incorporado específicamente al complejo. Los reaccionantes
de afinidad bioespecíficos adecuados que pueden ser marcados y
empleados son los anticuerpos anti-ECP, con
preferencia por aquellos que reaccionan específicamente con una o
más de las iso-ECP que se vayan a medir,
anti-anticuerpos dirigidos contra las regiones
constantes del anticuerpo anti-ECP presente en el
complejo formado, Proteínas A y G etc. Los ejemplos de las
sustancias detectables (marcas) que pueden ser utilizadas son las
sustancias luminiscentes, los cromóforos, los fluoróforos, las
enzimas, los sustratos enzimáticos, los cofactores, las coenzimas,
los isótopos radiactivos, las partículas (metálicas o no
metálicas), la biotina (detectada por su reacción con
avidina/estreptavidina) etc. Algunas marcas cambian su señal cuando
comienzan a incorporarse al complejo inmune mientras que otras no.
El primer tipo de marcas proporciona análisis inmunológicos
homogéneos en los que no se necesita separar la marca incorporada
al complejo de la marca no incorporada. El último tipo de marcas
demanda llevar a cabo la separación, por ejemplo insolubilizando el
complejo al que se incorpora la marca (análisis heterogéneos). Con
el fin de obtener un complejo insolubilizado que contenga la marca,
se pueden utilizar agentes precipitadores, tales como
polietilenglicol y reaccionantes de afinidad bioespecíficos
insolubilizados e insolubilizables unidos al complejo. Este último
tipo de reaccionantes no debe volver insoluble el reaccionante de
afinidad bioespecífico marcado como tal. Los análisis inmunes que
se van a emplear pueden ser también de tipo competitivo o no
competitivo. El último tipo se denomina a menudo análisis sándwich
debido a que se utilizan dos anticuerpos que son susceptibles de
unirse simultáneamente al antígeno (en el caso de los autores de la
presente invención la ECP).
Se aplican principios conocidos para seleccionar
el protocolo de análisis inmune apropiado, por ejemplo las
variantes homogéneas o heterogéneas, el orden y el tipo de
adiciones y las etapas de incubación etc. El punto principal es que
la cantidad de reaccionantes añadidos debe ser tal que la cantidad
de marca incorporada al complejo o no incorporada al complejo
reflejará el nivel de las iso-ECP a medir en la
muestra.
Las condiciones de análisis normales son medios
acuosos con o sin co-disolventes miscibles con
agua, temperaturas entre 0 y 40ºC y valores de pH entre 4 y 10.
El término anticuerpo anti-ECP
(incluyendo un anticuerpo
anti-iso-ECP) significa una
preparación de anticuerpo que reacciona específicamente con las
iso-ECP pretendidas. Un anticuerpo
anti-ECP que se va a utilizar en el método de
diagnóstico de la invención no presenta reacción sustancial con
otros componentes que puedan estar presentes en la muestra o medio
de análisis. Por el término "sustancialmente sin reacción" se
quiere significar que el anticuerpo no tiene reacciones que
destruyan el propósito pretendido, en este caso el resultado del
análisis inmune utilizado.
A no ser que se especifique de otro modo, el
concepto de anticuerpo anterior, en concreto el concepto de
anticuerpo
anti-ECP/anti-iso-ECP,
también comprende fragmentos y derivados activos de anticuerpos,
incluyendo Fab, F(ab)_{2}, Fv, anticuerpo de cadena
sencilla etc., y cualquier otro reaccionante de afinidad
bioespecífico que se una específicamente a ECP o a
iso-ECP seleccionadas.
En una variante de análisis inmune preferida el
anticuerpo anti-ECP es únicamente específico para
las iso-ECP que se vayan a medir, con preferencia
adicional por las preparaciones de anticuerpos monoclonales.
En caso de utilizar un anticuerpo
anti-ECP que reaccione con todas las
iso-ECP es preferible combinarlo en un análisis
sándwich con un anticuerpo
anti-iso-ECP que sea específico
para las iso-ECP que se vayan a medir. En otro caso,
la medición de los complejos de iso-ECP relevantes
tiene que estar basada en las diferencias moleculares entre las
iso-ECP que son retenidas en los complejos
formados. Comparar las variantes de análisis presentadas en
EP-A-535.162 (Axis).
En la fecha de prioridad se prefiere el formato
sándwich dando importancia a las variantes heterogéneas. De este
modo, las variantes de análisis preferidas hacen uso de dos
anticuerpos anti-ECP, siendo capaz al menos uno de
ellos de discriminar entre las iso-ECP que se vayan
a medir y las otras iso-ECP. En las variantes de
análisis heterogéneas, uno de los anticuerpos
anti-ECP está o estará, durante el análisis, unido
a una fase sólida (soporte) insoluble en el medio de análisis
utilizado.
Parte experimental
1
Los gránulos fueron preparados a partir de
granulocitos de capas leucocitarias obtenidas de donantes de sangre
sanos utilizando una modificación del procedimiento descrito por
Peterson y col. (Eur. J. Haematol. 40 (1988)
415-423). Las capas leucocitarias aproximadamente 4
L, fueron mezcladas encilindros de medición con un volumen igual de
Dextrano T-500 al 2% en NaCl/PBS (Solución Salina
Tamponada con Fosfato). Se dejó que los hematíes sedimentaran
durante 1 hora a la temperatura ambiente antes de la recogida del
plasma rico en leucocitos. Los leucocitos se lavaron dos veces en
PBS y una vez en sacarosa 0,34 M mediante centrifugación a 400 x g
durante 10 minutos. Tras el lavado, el sedimento de leucocitos se
suspendió en 5 volúmenes de sacarosa 0,34 M. Se presurizaron con
N_{2} 300 ml de una suspensión celular mezclada con un volumen
igual de sacarosa 0,34 M durante 30 minutos a 52,7 Kg\cdotcm^{2}
con agitación constante en una bomba de nitrógeno (Parr Instrument
Company, Moline, IL, U.S.A.) a +4ºC (Klemper y col., J. Cell. Biol.
86 (1986) 21-28; y Borregard y col., J. Cell. Biol.
97 (1983) 52-61). El producto cavitado se recogió
después en un volumen igual de sacarosa 0,34 M, NaCl 0,34 M y se
centrifugó durante 20 minutos a 450 x g a +4ºC. El sobrenadante se
centrifugó durante 20 minutos a 10.000 x g a +4ºC para sedimentar
los gránulos. Tras un ciclo de congelación a 70ºC y descongelación,
el sedimento con los gránulos se extrajo con 5 volúmenes de ácido
acético 50 mM durante 1 hora a +4ºC. Se añadió un volumen igual de
acetato de sodio 0,4 M, pH 4 y el procedimiento de extracción
continuó con agitación magnética durante 4 horas a +4ºC. El extracto
con los gránulos se concentró después hasta aproximadamente 5 ml
utilizando filtros YM-3 (Amicon Corporation,
Lexington, U.S.A.).
Se realizó una cromatografía de filtración en gel
en una columna superfina Sephadex® G-75 (Pharmacia
Biotech AB, Uppsala, Suecia). La columna fue equilibrada con NaAc
0,2 M a pH 4,5. El volumen de la mezcla fue de aproximadamente 5 ml
y se recogieron fracciones de 3 ml a una velocidad de flujo de 7
ml/h. La proteína fue determinada mediante su absorción a 280
nm.
Se llevó a cabo una cromatografía de intercambio
iónico utilizando la FPLC y una columna precargada con un
intercambiador catiónico fuerte Mono-S (Pharmacia
Biotech AB). La columna fue equilibrada con MES 50 mM (ácido
2-[N-morfolino]etanosulfónico) LiCl 0,1 M en
betaína al 2%, pH 6,0 (tampón de partida). La muestra (2 ml de la
reserva 8 (ver la Figura 1)) en tampón de partida se cargó y se
hizo eluir utilizando un gradiente lineal de LiCl de 0,1 M a 1,0 M,
pH 6.
La reserva 8 de las preparaciones de ECP tras la
cromatografía en gel en Sephadex® G-75 (ver la
Figura 1) fue incubada con metaperyodato de sodio en tampón acetato
de sodio 0,1 M a pH 4,5 (Peterson y col., Eur. J. Haematol. 40
(1988) 415-423; y Stewart y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 74 (1977) 4200-4204) a una razón molar
de 1:1.600 durante 17 horas a +4ºC.
Las proteínas de los cromatogramas fueron medidas
por a su absorbancia a 280 nm. Las proteínas específicas se
midieron con un radioinmunoanálisis (ver más abajo). La
ultrafiltración de las fracciones reunidas se realizó en un filtro
YM-2 (Amicon Corporation, Lexington, U.S.A.). El
cambio de tampón se realizó utilizando columnas
PD-10 (Pharmacia Biotech AB). Las reservas de
proteínas se almacenaron en acetato de sodio 0,2 M, pH 5,5,
-70ºC.
La electroforesis en gel de
poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio
(SDS-PAGE) discontinua se realizó utilizando
PhastSystem (Pharmacia Biotech AB), Gradiente de PhastGel del 10 al
15%. Los marcadores de peso molecular fueron la fosforilasa b (94
kDa), la albúmina (67 kDa), la ovalbúmina (43 kDa), el inhibidor de
tripsina (20 kDa) y la lactalbúmina (14,4 kDa). Tras la
electroforesis, los geles se tiñeron con Azul Brillante de Coomasie
R-250 utilizando el PhastSystem.
La inmunotransferencia de las proteínas del
gránulo se realizó utilizando el Sistema de Transferencia
Electroforético PhastTransferSemi-dry (Pharmacia
Biotech AB). Tras la SDS-PAGE, las proteínas fueron
transferidas electroforéticamente a papel de nitrocelulosa durante
30 minutos a 20 V y 25 mA. El tampón de transferencia fue Tris 25
mM, glicina 0,192 M, metanol al 20%. Las proteínas transferidas
fueron incubadas con anticuerpos de ratón para proteínas del
gránulo purificadas diluidas 1:2.000 y los complejos inmunes fueron
identificados después mediante anticuerpos conjugados con fosfatasa
alcalina para IgG de ratón (Sigma Immunochemicals, Co., U.S.A.) y
se tiñeron con 25 mg de fosfato de
\alpha-naftilo. 25 mg de
o-dianisidina, tetraazotada (Sigma) diluida en 50
ml de tampón borato 0,06 M, pH 9,7.
Los anticuerpos monoclonales (mAb) contra ECP y
EPO fueron producidos utilizando la técnica del hibridoma (Shulman
y col., Nature 276 (1978) 269-270). En resumen, los
ratones Balb/c fueron inmunizados con 50 \mug de antígeno
purificado en coadyuvantes seguido de refuerzos de 25 \mug de
antígeno durante 3 días consecutivos. Tras la fusión de las células
de bazo con las células de mieloma Sp2/0, se rastrearon en los
sobrenadantes los anticuerpos contra ECP y EPO, respectivamente,
mediante análisis ELISA. Los anticuerpos monoclonales contra ECP
fueron caracterizados adicionalmente mediante BIAcore® (Pharmacia,
Biosensor, Uppsala, Suecia) para su especificidad hacia el epítopo.
Se seleccionaron cuatro clones con diversa especificidad hacia el
epítopo de ECP (cl 611, 612, 614 y 652) y un reactivo contra EPO
para la expansión y la purificación. Todos los anticuerpos fueron
del subtipo IgG1.
Las concentraciones de ECP en las fracciones
individuales de la columna fueron determinadas mediante el uso de
RIA para ECP de Pharmacia (Pharmacia Diagnostics, Uppsala,
Suecia).
Procedimiento FMCA. Se utilizó una
modificación del análisis citotóxico de microcultivo fluorométrico
(FMCA) descrito por Larson y col., (Int. J. Cancer 50 (1992)
177-185). La línea celular eritroleucémica K562 fue
cultivada en RPMI 1640 suplementado con suero fetal de ternera (FCS)
inactivado con calor al 10%, 5.000 U/ml de penicilina y 5.000 g/ml
de estreptomicina. El día del análisis las células se lavaron tres
veces en RPMI 1640 suplementado con 5.000 U/ml de penicilina y
5.000 g/ml de estreptomicina y sin FCS. Se sembraron las células
K562, 20.000 células/pocillo en pocillos de placas de microtítulo de
96 pocillos en forma de V (Nunc, Roskilde, Dinamarca) por
triplicado, y se añadieron 10 \mul de ECP en tampón acetato de
sodio 0,2 M de pH 5,5 a una concentración final de 20
\mug/ml/pocillo. Como controles sirvieron los pocillos con
células y tampón. Las placas de cultivo se incubaron después a 37ºC
en una atmósfera humidificada conteniendo el 95% de aire y el 5% de
CO_{2} durante 72 horas, seguido de centrifugación (200 x g, 7
minutos). Tras la eliminación del medio y un lavado con 200
\mug/pocillo de PBS, se añadieron 100 \mul/pocillo de PBS
conteniendo FDA (10 \mug/ml; diacetato de fluoresceína (Sigma,
St. Louis, Mo., U.S.A.)). Con posterioridad, las placas fueron
incubadas durante 1 hora a 37ºC antes de la lectura de la
fluorescencia a 485 nm (Fluorescan 2, Labsystems Oy, Helsinki,
Finland). Se formó el blanco en el fluorómetro contra los pocillos
que contenían PBS incluyendo el colorante de FDA pero sin células.
Los datos de fluorescencia fueron transferidos a un soporte lógico
a medida del usuario para el cálculo de datos automatizado
utilizando un ordenador personal con Microsoft Excel y MacIntosh
SE/30. Los resultados obtenidos mediante la FDA indicadora se
presentan como el índice de supervivencia (IS) definido como la
fluorescencia en los pocillos de ensayo en porcentaje con respecto
a los pocillos de control. Se sometieron a ensayo las fracciones de
la columna individuales en cuanto a la toxicidad contra las células
K562.
Procedimiento DiSC. En paralelo se realizó
un ensayo de exclusión del colorante a corto plazo, análisis de
Coloración Diferencial y Citotoxicidad ("DiSC" en sus siglas
en Inglés) (Weisenthal y col., Cancer Res. 43 (1983)
749-757; y Nygren y col., Leukemia 11 (1992)
1121-1128). Inmediatamente después de la medición de
la fluorescencia, los pocillos seleccionados se expusieron a una
mezcla de Fast green (1%, Sigma), Nigrosina (0,5%, Sigma), y 25.000
eritrocitos de pollo fijados con formaldehído/pocillo durante 10
minutos a la temperatura ambiente. El contenido celular de los
pocillos se centrifugó con posterioridad sobre portas y se
contratiñó con colorante May-Grunewald Giemsa. La
supervivencia de las células fue evaluada mediante microscopia
óptica. Las células viables se teñían con la morfología con Giemsa
normal, mientras que las células muertas y los eritrocitos de pollo
se teñían de color negro verdoso. La supervivencia de las células
tumorales utilizando este procedimiento DiSC modificado (Nygren y
col., Leukemia 11 (1992) 1121-1128) fue calculada
expresando el índice de supervivencia (IS) como la razón de células
K562 viables frente a eritrocitos de pollo fijados en los pocillos
experimentales como el porcentaje de la razón obtenida en los
pocillos de control.
Se prepararon las células K562 para la
inhibición, ver lo anterior, 180 \mul/pocillo. Se añadieron
anticuerpos contra ECP, 10 \mul, a una concentración final de 100
\mug/ml/pocillo y 10 \mul de ECP a una concentración final de
20 \mug/ml/pocillo.
Para la evaluación estadística de las diferencias
entre los grupos, se utilizaron el test de la U de
Mann-Whitney y el test de Wilcoxon para pares de
muestra. Los cálculos se realizaron en un ordenador personal
utilizando un paquete estadístico, Statistica/W(StatSoft,
Tulsa, OK, U.S.A.).
Los sobrenadantes de los gránulos extraídos de
donantes de sangre sanos fueron sometidos a filtración en gel en
una columna Sephadex® G-75 (Figura 1) y se hicieron
eluir con NaAc 0,2 M, pH 4,5. La ECP de las fracciones se midió por
medio de un RIA específico (Peterson C.G.B. y col., Clin. Exp.
Allergy 21 (1991) 561-566). Las fracciones se
recogieron como se ha indicado y la ECP de las reservas 7 y 8 se
concentraron mediante ultrafiltración. El inserto de la Figura 1,
muestra una SDS-PAGE de las proteínas de la reserva
7 y de la reserva 8. En la reserva 7 se observaron dos bandas
aproximadamente en los peso moleculares de 21 y 24 kDa. Tras la
reducción las dos bandas tenían pesos moleculares en torno a 20 y
22 kDa. En la reserva 8 se encontró una banda principal a 22 kDa.
Tras la reducción se encontraron dos bandas que tenían pesos
moleculares de 18 y 15 kDa. Todas las bandas, antes de la reducción,
fueron identificadas como ECP por medio de Inmunotransferencias
Western utilizando diferentes anticuerpos monoclonales contra
ECP.
En la Figura 2, se muestra la actividad
citotóxica de la reserva 7 (n=10) y de la reserva 8 (n=12) tras la
filtración en gel. La actividad citotóxica de la ECP fue
significativamente superior en la reserva 8 (p<0,01) únicamente
con una pequeña actividad en la reserva 7.
La proteína de la reserva 8 (Pm 20 kDa) de la
filtración en gel anterior fue separada en una columna
Mono-S (Figura 3). Las fracciones se recogieron
según se ha indicado y se concentraron, y se midió la cantidad de
ECP de cada reserva como se indica en la figura. Se obtuvieron tres
reservas que contenían ECP principales, las reservas V, VI y VII.
La SDS-PAGE de las proteínas de estas reservas
mostraron sin reducción una doble banda en la reserva V con unos Pm
de 20 y 22 kDa, respectivamente. En la reserva VI se observó una
sola banda, pero muy ancha con un Pm de 19-21 kDa.
La reserva VII contenía una sola banda en el Pm de 20 kDa. Tras la
reducción se obtuvo un patrón similar, pero con un ligero
desplazamiento (1-2 kDa) de todas las bandas hacia
Pm inferiores y además una proteína de bajo Pm de aproximadamente
15 kDa (Figura 4). La identificación de las proteínas de estas tres
reservas antes de la reducción (Figura 5a) como ECP fue establecida
por medio de Inmunotransferencias Western y se muestran en la
Figura 5b. Se muestran los resultados con mAb614 contra ECP y se
obtuvieron resultados idénticos con mAb611 y mAb612 (no mostrados).
De este modo, todas las bandas presentadas antes fueron
identificadas como ECP. Por añadidura, se identificó también una
proteína de alto Pm, de aproximadamente 30 kDa (Figura 5b), que no
fue visible en la tinción de las proteínas del gel. Con mAb652 sólo
se identificaron las bandas de Pm en el intervalo de
19-22 kDa (Fig. 5c).
La actividad citotóxica de las reservas V, VI y
VII de cinco preparaciones de Mono-S diferentes se
muestra en la Figura 6. La toxicidad citotóxica contra K652 se
encontró predominantemente en la reserva V teniendo actividad
citotóxica sólo una de las preparaciones de las otras reservas.
La inhibición de la actividad citotóxica de la
reserva 8 tras la filtración en gel sobre Sephadex®
G-75 mediante diferentes anticuerpos se muestra en
la Figura 7. El anticuerpo ECP policlonal de conejo, pero no el
anticuerpo EPO, neutralizó la actividad tóxica en aproximadamente
un 98%. Cuando se sometía a ensayo el efecto inhibidor de mAb611,
mAb612, mAb614 y mAB652 contra ECP, mAb652 ocasionaba una
inhibición del 90-98%, mientras que otros anticuerpo
monoclonales no tuvieron efecto. Asimismo los anticuerpos
monoclonales asequibles comercialmente contra ECP, es decir EG1 y
EG2, fueron incapaces de inhibir la actividad citotóxica de ECP. En
un experimento la actividad citotóxica de la reserva V de la
cromatografía FPLC en Mono-S, también fue
neutralizada con mAb652 pero no mediante los otros mAbs (no
mostrado).
La ECP citotóxica (reserva 8) de la filtración en
gel se incubó con peryodato de sodio a una razón molar de 1:1.600
antes de la separación en una columna Mono-S
(Figura 8a). Las fracciones se reunieron como se ha indicado y se
concentraron y se midieron las cantidades de ECP de cada reserva
como se indica en la Figura 8a. La carga de los tres picos que
contenían ECP principales cambió a moléculas más alcalinas tras la
oxidación con peryodato. La SDS-PAGE de las
proteínas (Figura 8b), no obstante, mostró tamaños moleculares
virtualmente inalterados.
La ECP fue preparada también a partir de un único
individuo con hipereosinofilia. En este único individuo los autores
de la presente invención encontraron también un cierto grado de
heterogeneidad molecular, pero no actividad citotóxica de ECP
purificada en Mono-S. La SDS-PAGE de
las reservas de la Mono-S eluyeron a la misma
fuerza iónica que las bandas reveladas anteriormente de ECP a 20
kDa, pero no la banda de la proteína de 22 kDa (Figura 9).
Puesto que la heterogeneidad con respecto al
tamaño podría estar debida a la degradación por proteasa durante la
purificación de la ECP, se llevó a cabo la purificación en todas
las etapas en presencia del inhibidor de la proteasa fluoruro de
fenilmetilsulfonilo (PMSF) a una concentración de 100 \mug/ml.
Este procedimiento no cambió la heterogeneidad molecular de la ECP
ni afectó a la actividad citotóxica de la ECP.
Los datos presentados han demostrado la
existencia de diversas variantes moleculares (isoformas) de la
proteína catiónica eosinófila (ECP) con diferencias en la actividad
biológica. Los datos de los autores de la presente invención
sugieren también que la heterogeneidad molecular es parcialmente
dependiente de diferencias en la glicosilación, pero que la variante
molecular con actividad citotóxica tiene una única estructura no
compartida por las otras variantes. Además, ha sido posible
producir anticuerpos monoclonales neutralizando específicamente la
actividad citotóxica de esta variante.
La purificación de la ECP incluía dos etapas, la
filtración en gel y la cromatografía de intercambio catiónico en
Mono-S. Durante la filtración en gel la ECP eluyó
en un pico irregular, que ya sugirió en esta etapa una
heterogeneidad. Tras esta separación bruta se hizo obvio que la
actividad citotóxica estaba asociada a especies de peso molecular
inferior de ECP. Los autores de la presente invención se
concentraron por consiguiente en este estudio en la definición de
las moléculas citotóxicas en esta región de peso molecular inferior.
Tras la purificación adicional en Mono-S, los
autores de la presente invención encontraron básicamente tres picos
que contenían ECP, que en la SDS-PAGE mostraron un
patrón coherente. De este modo, la variante de ECP más alcalina
apareció como una sola banda con un peso molecular de
aproximadamente 20 kDa, mientras que la menos alcalina apareció
coherentemente como una clara doble banda con pesos moleculares de
aproximadamente 22 y 20 kDa, respectivamente. Las especies
moleculares de ECP entretanto aparecían siempre como una banda
ancha en la misma región de peso molecular. La reducción mostró la
aparición de una banda de 15 kDa en los picos V y VI, mientras que
la desglicosilación con oxidación con peryodato no cambió la
apariencia de los geles significativamente. La carga de todas las
variantes, no obstante, cambió tras la oxidación con peryodato a
moléculas más alcalinas. Estos resultados indican que la
heterogeneidad de la ECP de estos tres picos de
Mono-S no puede ser explicada por las diferencias
principales en la glicosilación y que existen puentes
-S-S en la molécula que pueden determinar la
estructura terciaria. Todos los anticuerpos monoclonales contra ECP
mostraron en la inmunotransferencia que las diferentes bandas antes
de la reducción compartían epítopos, lo que confirma que todas eran
moléculas de ECP. Los anticuerpos monoclonales mAb611, 612 y 614,
pero no 652, no obstante, también identificaron una banda,
escasamente visible tras la tinción de proteínas a un peso molecular
de aproximadamente 30 kDa, en preparaciones concretas de los picos
VI y VII, esto es los picos que contenían las dos variantes más
alcalinas y no citotóxicas de ECP. Los datos de los autores de la
presente invención indican que la variante citotóxica de ECP tiene
algunas propiedades moleculares únicas, lo que determina su
actividad citotóxica. En la actualidad no se sabe si ambas especies
moleculares encontradas en esta preparación citotóxica son
necesarias para la actividad citotóxica, pero el hecho de que la
ausencia de la banda de alto peso molecular en una preparación de
un paciente con eosinofilia también haga esta preparación de ECP no
citotóxica sugiere que esta especie de 22 kDa es una parte
necesaria.
En este estudio, los autores de la presente
invención han mostrado consecuentemente la presencia de
5-6 variantes de ECP, y las cuestiones que se han
formulado fueron si estas variantes eran una consecuencia del
procedimiento de purificación o si estaban determinadas
genéticamente. La primera causa es muy improbable, puesto que la
heterogeneidad no fue diferente de las preparaciones de ECP en
presencia de inhibidores de proteasa. Asimismo las variantes fueron
encontradas muy coherentemente en la mayoría de las preparaciones.
La última cuestión, no obstante, es una clara probabilidad, que no
puede ser descartada. Así, el material de partida de los autores de
la presente invención para la preparación de ECP fue siempre de
reservas de leucocitos normales. Estas reservas se obtuvieron en
general a partir de aproximadamente 100 donantes de sangre
seleccionados al azar cada uno de los cuales podía tener su variante
de ECP distinta. Esto se verificaba para al menos uno de los
pacientes de los que se obtenían los eosinófilos, puesto que la
heterogeneidad de la ECP obtenida de este paciente era
considerablemente menor. Otra posibilidad es por supuesto que estas
variantes representen parcialmente cambios
post-traduccionales de la molécula debidos a
diferencias en su grado de glicosilación y que estos cambios sean
consecuencia de factores no determinados genéticamente.
El descubrimiento de que mAb652, que neutralizaba
únicamente la actividad citotóxica de ECP, identificaba epítopos en
todas las especies de ECP con independencia de su actividad
citotóxica, indica que el epítopo citotóxico está presente en todas
las variantes de ECP. El sitio citotóxico en ECP puede estar
relacionado por consiguiente con una única propiedad estructural de
la molécula. No obstante, es curioso que mAb652 no identificara la
banda de 30 kDa, que apenas se observaba en las preparaciones de
las ECP citotóxicas. Basándose en los resultados de los autores de
la presente invención, estos proponen que la capacidad citotóxica
de la ECP está relacionada con la variante de 22 kDa encontrada en
el pico V tras la separación en Mono-S. Esta
molécula tiene un cierto grado de glicosilación y un puente
S-S interno. La molécula puede contener también un
sitio proteolítico lábil, puesto que parte de la ECP es reducida a
una banda de 15 y 7 kDa. Esta cadena de 15 kDa podría a través de
dimerización formar la proteína de 30 kDa revelada en la
inmunotransferencia. Esta proteína de 30 kDa no reacciona con
mAb652, sino con los otros anticuerpos monoclonales, y puede por lo
tanto haber perdido el sitio citotóxico de la ECP, que está
relacionado por consiguiente con la cadena de 7 kDa. Además de
estas variantes moleculares, se forman muchas otras variantes
debido a las diferencias en el grado de glicosilación. De los
resultados de los autores de la presente invención también se
deduce que puede existir más de un producto génico de ECP.
En estudios anteriores, los autores de la
presente invención mostraron otros dos anticuerpos monoclonales,
EG1 y EG2, unidos a ECP en eosinófilos no activados y activados,
respectivamente. Se demostró que estas diferencias estaban
relacionadas con la capacidad de los anticuerpos para reconocer la
ECP con diferentes grados de glicosilación, puesto que EG2 en la
inmunotransferencia sólo detectaba ECP de bajo peso molecular y
desglicosilada. Los resultados actuales de los autores de la
presente invención, no obstante, muestran que ninguno de estos
anticuerpos monoclonales es capaz de neutralizar la actividad
citotóxica de la ECP, lo que significa que el sitio citotóxico es
distinto del sitio de unión a la matriz propuesto de ECP y que la
citotoxicidad no está relacionada sencillamente con la molécula de
ECP desglicosilada.
Parte experimental
II
Los análisis se realizaron en diferentes
materiales clínicos con análisis sándwich de ECP en los que en
antígeno ECP formaba complejo entre un anticuerpo
anti-ECP en fase sólida y un anticuerpo
anti-ECP marcado. Se hizo una comparación entre el
método establecido, Pharmacia CAP System ECP FEIA (Pharmacia
Diagnostics, Uppsala, Suecia) y el mismo estuche pero reemplazando
el anticuerpo unido en fase sólida y el anticuerpo marcado por
mab614 y mab652, respectivamente.
Resultados: Ver las leyendas de las
Figuras.
Las Figuras 1-9 corresponden a la
parte experimental I y las Figuras 10 a 13 corresponden a la parte
experimental II.
Figura
1
Cromatografía de filtración en gel en Sephadex®
G-75 de extractos de gránulo obtenidos de donantes
de sangre sanos. El radioinmunoanálisis de ECP está incluido en el
cromatograma. La proteína de los picos fue reunida como se indica en
la parte superior del cromatograma. El inserto muestra el patrón de
SDS-PAGE de las reservas 7 y 8 (reducidas y no
reducidas) del cromatograma. R = los marcadores de peso molecular
fueron la fosforilasa b (94 kDa), la albúmina (67 kDa), la
ovalbúmina (43 kDa), la anhidrasa carbónica (30 kDa), el inhibidor
de tripsina (20,1 kDa) y la \alpha-lactalbúmina
(14,4 kDa). Las muestras se tiñeron con Azul Brillante de Coomasie
R-250.
Figura
2
Actividad citotóxica en las reservas 7 y 8 tras
la filtración en gel Sephadex® G-75. La células de
la línea celular K562 fueron sembradas en los pocillos de placas de
microtítulo de 96 pocillos, 20.000/pocillo. Se utilizó la ECP de
diferentes preparaciones a una concentración final de 20
\mug/ml/pocillo seguido de incubación y medición de la
fluorescencia por medio del procedimiento FMCA como se ha descrito
en Materiales y Métodos. Para el cálculo del Indice de
Supervivencia (IS) y de los valores de P, ver los Métodos
anteriores.
Figura
3
Cromatografía de intercambio iónico en una
columna Mono-S de la reserva 8 de la filtración en
gel en Sephadex® G-75. La muestra (2 ml de la
reserva 8) se cargó en el tampón de partida y se hizo eluir como se
indica en Materiales y Métodos. Las fracciones se reunieron como se
indica en la parte inferior de cromatograma (1-7).
Las barras indican la cantidad de ECP en las reservas como se
determinó por medio de RIA.
Figura
4
Reducción de las proteínas de las reservas V, VII
y VII de la Figura 3 (columna Mono-S). Los
marcadores de Pm se encuentran en la calle R. + indica proteínas
reducidas y - indica proteínas no reducidas.
Figura
5a-c
Las reservas V, VI y VII de la Figura 3 (columna
Mono-S) fueron identificadas en una (a)
SDS-PAGE y (b, c) por medio de inmunotransferencia.
(a) Marcadores de Pm en la calle R. Las calles V, VI y VII (no
reducidas) corresponden a ECP purificada de la reserva respectiva
según la Figura 3. (b) Proteínas identificadas por mAb 614. (c)
Proteínas identificadas por mAb 652. Las muestras no reducidas
fueron desarrolladas en SDS-PAGE seguido de
transferencia a papel de nitrocelulosa.
Figura
6
Comparación de los efectos citotóxicos para las
células K562 de ECP tras la cromatografía en Mono-S
(las reservas V, VI y VII, cinco preparaciones individuales). Los
resultados se expresan como el índice de supervivencia (%)
utilizando el procedimiento FMCA.
Figura
7
Inhibición por anticuerpos de la actividad
citotóxica. Los puntos muestran la media de tres mediciones por
duplicado. Las barras son valores medios de tres duplicados.
Figura
8a-b
- a.
- Cromatograma para la separación de la reserva 8 (como se define en la Figura 1) en una columna Mono-S, antes y después de la oxidación con peryodato de las proteínas. Las líneas continuas indican la cromatografía del material tratado con peryodato y la línea discontinua la cromatografía del material no tratado. Las barras indican la concentración de ECP medida mediante RIA tras el tratamiento con peryodato. La línea discontinua indica el gradiente de LiCl.
- b.
- SDS-PAGE de las proteínas del cromatograma de la Figura 8a antes y después de la oxidación con peryodato. Los marcadores de Pm se indican en la calle R y las calles V, VI y VII corresponden a la ECP purificada de las respectivas reservas como se muestra en la Figura 8a. + = material tratado con peryodato, y - = material no tratado.
Figura
9
SDS-PAGE de la ECP purificada
mediante cromatografía en una columna Mono-S de un
individuo con hipereosinofilia. Los marcadores de Pm se encuentran
en la calle R y las muestras para las calles V, VI y VII
corresponden a las reservas V, VI y VII de eosinófilos normales como
se muestra en la Figura 3.
Figuras 10 y
11
Estas muestran los niveles en suero de ECP,
medidos mediante el método establecido y medidos con el método de la
invención para la detección de iso-ECP.
- r =
- grupo de referencia, 99 sujetos no alérgicos sanos.
- aa =
- asma aguda, algunos tratados y algunos no tratados, n = 17.
- Ka =
- niños alérgicos a los gatos al cabo de tres años de hiposensibilización, n = 24.
- e =
- Estudio Europeo sobre el asma y la alergia, mezcla entre pacientes tratados y no tratados, n = 42.
- sj =
- Pacientes con síndrome de Sjögren, la mayoría tratados, n = 9.
- bl =
- un grupo mixto de pacientes remitidos al hospital con dolencias de alergia y asma, n = 22.
- i =
- un grupo de pacientes con infecciones virales y bacterianas agudas, n = 113.
- p =
- pacientes alérgicos antes y durante una época de polen, n = 57.
- g =
- pacientes con asma crónica, no tratados, n = 15.
Figura
12
Muestra las proporciones entre los niveles medios
de ECP en el grupo de pacientes respectivos y del grupo de
referencia.
Figura
13
Muestra los niveles en suero de ECP en las
referencias sanas.
Claims (3)
1. Un método de diagnóstico para la determinación
de afecciones inflamatorias tales como la alergia, el asma, el
síndrome de Sjögren e infecciones virales/bacterianas que comprende
las etapas de:
- (a)
- medir específicamente el nivel de al menos una iso-ECP (proteína catiónica eosinófila) citotóxica en una muestra derivada de un individuo que vaya a ser diagnosticado, y después
- (b)
- comparar el nivel encontrado con un nivel normalizado de la misma iso-ECP, caracterizado porque se determina selectivamente el nivel de al menos una iso-ECP citotóxica.
2. Un método de diagnóstico según la
reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de dicha
iso-ECP como mínimo es determinado mediante un
análisis inmune.
3. Un método de diagnóstico según una cualquiera
de las reivindicaciones 1-2, caracterizado
porque se utiliza un anticuerpo
anti-iso-ECP para determinar dicha
iso-ECP como mínimo.
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