JP2000516702A - 好酸球カチオン性タンパク質（イソ―ｅｃｐ）の分子形態検出用診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 少なくとも１種のイソ−ＥＣＰのレベルを選択的に測定することを特徴とする、(ａ)診断対象の個体から得た試料中のＥＣＰレベルを特異的に測定し、(ｂ)実測ＥＣＰレベルと標準ＥＣＰレベルとを比較する行程を含む、診断法。特に、細胞毒性ＥＣＰ変種を測定する。測定原理は、好ましくは、イムノアッセイ技術に基づく。抗体が、他のイソ−ＥＣＰへの結合と比較して、少なくとも１種の細胞毒性イソ−ＥＣＰの方に優先的に結合することを特徴とする、抗ＥＣＰ抗体。

Description

【発明の詳細な説明】 好酸球カチオン性タンパク質(イソ−ＥＣＰ)の分子形態検出用診断法 技術分野 本発明は、好酸球カチオン性タンパク質(ＥＣＰ)の測定を含む新規診断法およ びその方法において採用できる新規抗体に関する。 背景技術 好酸球顆粒タンパク質は、標的細胞に近接すると自らの細胞毒性を媒介するこ とが示唆されている(Hamman et al.，J．Immunol．144（1990）3166-3173;Capto n et al.，Eosinophils in Asthma．London，New York，Tokyo:Academic Press （1989）49-60;Robert et al.，J．Allergy Clin．Immunol．（1991）1105-1115 )。ＥＣＰは、Shistosoma Mansoniの幼虫にとって強力な毒素であり(McLaren et al.，Parasitol．88（1984）491-503)、モルモットの脳またはウサギの脳脊髄 液に注射した場合は強力な神経毒素である(Fredens et al.，J．Allergy Clin． Immunol．70（1982）361-366)。ＥＣＰは膜活性剤であり、膜損傷を引き起こす こともある。これによって、孔形成により人工二重層のイオン通過を誘導する(Y ong et al.，Nature 321（1985）613-616)。 多くの研究者ら(Olsson et al.，Blood 44（1974）235-246;Olsson et al.，B lood 67（1986）498-503;およびGleich et al.，Pro．Natl．Acad．Sci．U.S.A ．83（1986）3146-3150)は、精製ＥＣＰがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより数種の分子量 形態(１８から２１ｋＤａの範囲)に分離されることを示した。Peterson等(Eur． J．Haematol．40（1988）415-423)は、健常ドナーから精製したＥＣＰがＳＤＳ −ＰＡＧＥにより少なくとも３種の分子量形態に分離されたこと、および電荷お よび分子量における相違はこのタンパク質に結合した炭水化物量の相違を表すと 推論されたことを示した。これらの多種のＥＣＰ分子形態(イソ−ＥＣＰ類)の生 物学的活性については何ら知られていない。 好酸球がアレルギー疾患を含む様々な炎症疾患に関連することは昔から知られ ていた。このような疾患では、好酸球およびその有毒産物が炎症病巣、例えば喘 息の組織標本中に見られる(Arm et al.，Acv．Immunol．51（1992）323-382)。 この細胞およびその顆粒産物は、組織破壊、例えば、気道における上皮細胞の落 屑(shedding)の主たる原因とみられている(Filly et al.，Lancet 3（July，198 2）11-16;Venge et al.，Am．Rev．Resp．Dis．138（1988）54-57;およびBousqu et et al.，N．Engl．J．Med 323（1990）1033-1039)。喘息の肺でみられる病態 生理学的変化は、活動亢進状態を導く。低度の炎症でも、患者はアレルゲン暴露 (Bisgaard et al.，J．Allergy Clin．Immlunol．85（1990）891-895)や運動(Ve nge et al.，J．Allergy Clin．Immunol．88（1991）699-704)を含む様々な攻撃 を受けやすくなるようである。これらの症状は、様々な生物体液における活性化 好酸球およびそれらの産物ＥＣＰの監視により確定できる。 急性喘息などの炎症症状は、抗炎症剤で処理される(Sheffer，J．Allergy Cli n．Immunol．88（Suppl）(1991)425-534)。血清や血漿などの血液試料中のＥＣ Ｐレベルにより表される炎症の低下は、治療効果を監視する際に重要であり得る 。 ＥＣＰレベルは、この他にもアトピー性皮膚炎(Kapp et al.，J．Am．Acad．D ermatol．24（1991)555-558)、ある種の感染(Paganelli et al.，J．Allergy （1989）56-64)における自己免疫症状、および寄生虫性疾患(Venge et al.，In ．Eosinophil cationicproteins（ECP and EPX）in health and disease．Eds Y oshida et al.，Immunobiology of the eosinophil．New York:Elsevier Biomed ical（1983）163-179)などの活性化好酸球関連の臨床症状では高いことが分かっ ている。 発明の開示および発明の目的 本発明は、ＥＣＰのイソ形態(イソ−ＥＣＰ)が、異なる生物学的効果を生むい う、例えば、ＥＣＰの細胞毒性は各イソ形態間で変わるという我々の発見に基づ くものである。このことから、発明者らは、生物体液においてイソ−ＥＣＰを測 定することによりヒト診断法の改良が可能になることが分かった。 結果として、本発明の目的は、イソ−ＥＣＰ測定に基づく新規および改良ヒト 診断法およびこれらの方法において採用される試薬を提供するものである。 本発明 Ａ．具体的な方法 本発明の一態様は： (ａ)診断対象の個体から得た試料中のＥＣＰレベルを特異的に測定し、 (ｂ)実測ＥＣＰレベルと標準ＥＣＰレベルとを比較する 各段階を含む、診断法である。 本発明のこの態様の特徴は、少なくとも１種のイソ−ＥＣＰのレベルを選択的 に測定し、同じイソ−ＥＣＰの基準レベルと比較することである。この態様では 、全イソ−ＥＣＰの総量(レベル)測定は無視している。 この基準レベルは、明らかに健常な個体での実測レベルまたは同じ個体で以前 に得られたレベルであり得る。実測レベルが健常個体の正常レベルから離れてい れば、その個体が何らかの異常状態、例えば、上記のような状態を被っているこ とを示す(レベル増大)。実測レベルが、同じ個体で以前に得られたレベルとは異 なっている場合、その偏差は症状が変わったことを示している(異常状態からの 回復または異常状態の悪化)。後者の場合、イソ−ＥＣＰ測定によって上記のよ うな医学的処理の監視が可能になる。正常レベルと比べて低いレベルならば、抗 炎症剤による過剰処理および／または好酸球欠乏を示している。 測定される好ましいイソ−ＥＣＰは細胞毒性のもの、例えば、実施例のところ で定義した細胞毒性変種である。 “少なくとも１種のイソ−ＥＣＰを選択的に測定する”という表現は、様々な ＥＣＰのイソ形態の総数も含むが、ＥＣＰの総量は含まないことを意味する。 測定レベルは、絶対濃度(例えば、μｇ/lまたはnmol/l)または他の試料構成物 に対する値、例えば、ＥＣＰの総量に対する値、ある種のイソ−ＥＣＰ混合物ま たはその他の試料構成物に対する値として表す。 試料は、診断対象のヒト個体から得られ、好酸球および/またはＥＣＰを含有 する。好酸球は全身に存在するため、試料として考えられるのは、気管支肺胞洗 浄液、血液(血清および血漿試料を含む)、尿、脳脊髄液、痰、糞便、涙液および 鼻汁である。血液試料、例えば全血、血清および血漿試料は、優先日時点で好ま しい試料であった。 イソ−ＥＣＰの測定は、原則として、１種以上のイソ−ＥＣＰを他のＥＣＰと 識別でき、十分な感度、精度、および特異性などを提供できる方法ならどれによ っても実施できる。しかしながら、実施例に示したように、免疫アッセイが好ま しいと考えられる。 本発明の免疫アッセイは、基準からはずれたレベルのイソ−ＥＣＰを含有する 疑いのある試料をアッセイ培地中、ＥＣＰと抗ＥＣＰ抗体との免疫複合体を形成 させる条件下で抗ＥＣＰ抗体と接触させるというものである。次いで、測定対象 のイソ−ＥＣＰ含有複合体を、その試料中レベルを定量または定性測定できるそ れ自身知られている方法にて測定する。この種のアッセイでは、複合体は、それ 自体を測定してもよく、また分析的に検出可能な物質(標識)で標識した生物特異 的親和性反応体の補助により測定することもでき、該反応体(およびそのラベル) は、複合体中に特異的に組み込まれる能力がある。標識でき、かつ採用できる適 切な生物特異的親和性反応体は、抗ＥＣＰ抗体、好ましくは、測定対象の１種以 上のイソ−ＥＣＰと特異的に反応するもの、形成された複合体中に存在する抗Ｅ ＣＰ抗体の定常領域と対向する抗−抗体、プロテインＡおよびＧ等である。使用 できる検出可能な物質(標識)の例は、発光体、発色団、蛍光体、酵素、酵素基質 、補因子、補酵素、放射性アイソトープ、粒子(金属または非金属)、ビオチン( アビジン／ストレプトアビジンとの反応により検出される)等である。標識の中 には免疫複合体中に組み込まれるとそのシグナルが変わるものもあり、そうでな いものもある。前者のタイプの標識は、複合体の中に組み込まれた標識と組み込 まれなかった標識とを分離する必要のない均一系免疫アッセイを提供する。後者 のタイプの標識は、例えば、標識が組み込まれている複合体を不溶性化すること により、分離を行う必要がある(非均一系アッセイ)。標識を含有する不溶性化複 合体を得るために、ポリエチレングリコールなどの沈殿化剤および複合体に結合 する不溶性化した、および不溶性化可能な生物特異的親和性反応体を使用できる 。この後者のタイプの試薬は、標識化生物特異的親和性反応体自身を不溶性化し てはいけない。採用される免疫アッセイは、競合的または非競合的であってよい 。後者のタイプは、抗原(本件ではＥＣＰ)に同時に結合できる２つの抗体を利用 するので、サンドイッチアッセイと呼ばれることが多い。 知られている原理を応用して、適切な免疫アッセイプロトコール、例えば、均 一系または非均一系の変形法、添加順序および様式、インキュベーション行程等 を選択する。主要点は、複合体中に組み込まれるまたは組み込まれない標識の量 が試料中の測定対象イソ−ＥＣＰのレベルを表すような量で反応体を添加しなけ ればならないことである。 通常のアッセイ条件は、水混和性共溶媒を含むかまたは含まない水性培地、０ −４０℃の範囲の温度および４−１０の範囲のｐＨ値である。 抗ＥＣＰ抗体(抗イソ−ＥＣＰ抗体を含む)という用語は、目的のイソ−ＥＣＰ と特異的に反応する抗体調製物を意味する。本発明の診断法で使用される抗ＥＣ Ｐ抗体は、試料またはアッセイ培地中に存在し得る他の成分と実質的に反応しな い。“実質的に反応しない”という用語は、抗体が意図する目的を損なう、本件 では、使用した免疫アッセイの結果を無効にするような反応を持たないことを意 味する。 特記しない限り、上記の抗体概念、特に、抗ＥＣＰ／抗イソ−ＥＣＰ抗体概念 は、Ｆab、Ｆ(ab)₂、Ｆv、一本鎖抗体等を含む抗体活性フラグメントおよび誘導 体や、ＥＣＰまたは選択されたイソ−ＥＣＰに特異的に結合するその他の生物特 異的親和性反応体も含む。 好ましい免疫アッセイ変形法では、抗ＥＣＰ抗体は測定対象のイソ−ＥＣＰに 対してのみ、更に好ましくはモノクローナル抗体調製物に対してのみ特異的であ る。 全てのイソＥＣＰと反応する抗ＥＣＰ抗体を使用する場合、サンドイッチアッ セイにおいて、測定対象のイソ−ＥＣＰに対して特異的な抗イソ−ＥＣＰ抗体と 組合せるのが好ましい。その他の場合では、関連するイソ−ＥＣＰ複合体の測定 は、形成された複合体中に保持される分子イソ−ＥＣＰの相違に基づくものでな ければならない。EP-A-535,162(Axis)に示されたアッセイ変形法を比較。 優先日時点で、非均一系変形法に重点を置くサンドイッチ形式が好まれていた 。よって、この好ましいアッセイ変形法は、二種の抗ＥＣＰ抗体を使うものであ り、少なくともその１つは、測定対象のイソ−ＥＣＰと他のイソ−ＥＣＰとを識 別できる。非均一系アッセイ変形法では、抗ＥＣＰ抗体の１種は、アッセイ中、 使用したアッセイ培地において不溶性の固相(支持体)に結合するようになる。 本発明の優れた抗イソ−ＥＣＰ抗体 本発明の第二の態様は、ＥＣＰの細胞毒性イソ形態の天然形態に特有のエピト ープに特異的に結合する抗イソ−ＥＣＰ抗体である。よって、ＥＣＰに結合する 本発明の抗体は、少なくとも１種の細胞毒性イソ−ＥＣＰ形態と他のイソ−ＥＣ Ｐとを識別でき、および／または抗体が結合するイソ−ＥＣＰの細胞毒性活性を 少なくとも部分的に阻害できる。実施例参照。優先日時点で、好ましい抗体調製 物は、赤白血病Ｋ５６２細胞系列に対して細胞毒性を発揮できるイソ−ＥＣＰに 関するものであった。 本発明の抗イソ−ＥＣＰ抗体は、他の抗体についてよく知られた標準技術によ り調製でき、上記と同じ一般型の抗体変種を含む。実施例参照。 実施例１−イソ−ＥＣＰおよびモノクローナル抗体の単離および特性化 方法 顆粒の単離 顆粒は、Peterson et al(Eur．J．Haematl．40（1988）415-423)に記載されて いる方法の変法を用いて健常血液ドナーから得られた軟膜の顆粒球から調製した 。軟膜およそ４Ｌをメスシリンダー中で等用量のＮａＣｌ／ＰＢＳ(ホスフェー ト緩衝化塩水)中２％デキストランＴ−５００と混合した。白血球豊富血漿を収 集する前に赤血球を室温で１時間沈殿させた。白血球をＰＢＳ中で２回、０.３ ４Ｍショ糖で１回、４００×gで１０分間遠心することにより洗浄した。洗浄後 、白血球ペレットを５容量の０.３４Ｍショ糖に懸濁した。等容量の０.３４Ｍシ ョ糖と混合した細胞懸濁液３００mlを窒素ボンベ(Parr Instrument Company，Mo line，IL，U.S.A.)中一定撹拌しながら＋４℃、７５０psiで３０分間Ｎ₂加圧し た(Klemper et al.，J．Cell．Biol．86（1986）21-28;andBorregard et al.，J ．Cell．Biol．97（1983）52-61)。次いで、気泡を等容量の０.３４Ｍショ糖、 ０.３４ＭＮａＣｌ中に集め、４℃、４５０×gで２０分間遠心した。上清を４℃ 、１０,０００×gで２０分間遠心して、顆粒を沈殿させた。−７０℃での凍結お よび解凍を一巡した後、顆粒ペレットを５０ｍＭ酢酸５容量で１時間４℃で抽出 した。等容量の０.４Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４を加え、抽出操作を ４℃で４時間磁気撹拌しながら続けた。次いで、顆粒抽出物を、ＹＭ−３フィル ター(Amicon Corporation，Lexington，U.S.A.)を用いておよそ５mlまで濃縮し た。 クロマトグラフィー法 カラム(Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)にて実施した。カラムを０.２ ＭＮａＡｃ、ｐＨ４.５で平衡化した。試料容量はおよそ５mlであり、３mlのフ ラクションを流速７ml/ｈで集めた。タンパク質は２８０nmでのその吸光度によ り測定した。 イオン交換クロマトグラフィーは、ＦＰＬＣおよび強カチオン性交換Mono−Ｓ プレパックカラム(Pharmacia Biotech AB)を用いて実施した。カラムを、５０ｍ Ｍ ＭＥＳ(２−[Ｎ−モルホリノ]エタンスルホン酸)ベタイン２％０.１ＭＬｉＣ ｌ、ｐＨ６.０(出発緩衝液)で平衡化した。出発緩衝液中の試料(プール８(図１ 参照)の２ml)をカラムにのせ、０.１Ｍから１.０ＭＬｉＣｌ、ｐＨ６.０の直線 勾配を用いて溶出した。 過ヨウ素酸塩処理 ル８(図１参照)を０.１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４.５中メタ過ヨウ素酸ナ トリウム(Peterson et al.，Eur．J．Haematol．40（1988）415-423;and Stewar t et al.，proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．74（1977）4200-4204)と共にモル比 率１：１６００で＋４℃で１７時間インキュベーションした。 タンパク質測定およびタンパク質溶液の濃縮 クロマトグラム中のタンパク質を２８０nmでのその吸光度により測定した。特 定のタンパク質はラジオイムノアッセイ(下記参照)で測定した。プールしたフラ クションをＹＭ−２フィルター(Amicon Corporation，Lexington，U.S.A.)にて 超ろ過した。緩衝液交換は、ＰＤ−１０カラム(Pharmacia Biotech AB)を用いて 実施した。タンパク質プールを０.２Ｍ酢酸ナトリウム中、ｐＨ５.５、−７０℃ で貯蔵した。 電気泳動法 不連続ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ)は、PhastSystem(Pharmacia Biotech AB)、PhastGel勾配１０−１５％を 用いて実施した。分子量マーカーはホスホリラーゼｂ(９４ｋＤａ)、アルブミン (６７ｋＤａ)、オバルブミン(４３ｋＤａ)、トリプシン阻害剤(２０ｋＤａ)およ びラクトアルブミン(１４.４ｋＤａ)である。電気泳動後、PhastSystemを用いて ゲルをクマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。 顆粒タンパク質のイムノブロッティングは、PhastTransferSemi-ドライ電気泳 動転写システム(dry Electrophoretic Transfer System)(Pharmacia Biotech AB )を用いて実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、２０Ｖおよび２５ｍＡで３０分間、 タンパク質をニトロセルロース紙へ電気泳動的に転写した。転写緩衝液は、２５ ｍＭトリス、０.１９２Ｍグリシン、２０％メタノールであった。転写したタン パク質は、１：２,０００希釈した精製顆粒タンパク質に対するマウス抗体と共 にインキュベーションし、次いで、免疫複合体を、マウスＩｇＧに対するアルカ リホスファターゼコンジュゲート化抗体(Sigma Immunochemicals，CO，U.S.A.) により同定し、α−ナフチルホスフェート２５mgにより染色した。ｏ−ジアニシ ジン２５mg、テトラゾタイズド(tetrazotized)(Sigma)は０.０６Ｍホウ酸緩衝液 、ｐＨ９.７、５０mlに希釈した。 ＥＣＰおよびＥＰＯに対する抗体 ＥＣＰおよびＥＰＯに対するモノクローナル抗体(ｍＡｂ)は、ハイブリドーマ 技術を用いて作った。要約すると、Ｂａｌｂ/ｃマウスをアジュバント中精製抗 原５０μｇで免疫化し、次いで、３日続けて抗原２５μｇで追加免疫した。脾臓 細胞とＳｐ２/０骨髄腫細胞とを融合させた後、ＥＬＩＳＡ分析により、ＥＣＰ およびＥＰＯそれぞれに対する抗体について上清をスクリーニングした。ＥＣＰ に対する Sweden)によりそのエピトープ特異性について特性化した。ＥＣＰに対する多様 なエピトープ特異性の４つのクローンとＥＰＯに対して反応性の１つのクローン を、展開(expansion)および精製のために選定した。抗体は全てＩｇＧ１サブタ イプのものであった。 ＥＣＰのラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ) 個々のカラムフラクション中のＥＣＰ濃度は、Pharmacia ＥＣＰ ＲＩＡ(Phar macia Diagnostics，Uppsala，Sweden)の使用により測定した。 細胞毒性および毒性アッセイの阻害 ＦＭＣＡ法。Larsonら(Int．J．Cancer 50（1992）177-185)によって報告された 蛍光測定ミクロ培養細胞毒性アッセイ(ＦＭＣＡ)の変法を使用した。赤白血病Ｋ ５６２細胞系列を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、ペニシリン５，０ ００Ｕ/mlおよびストレプトマイシン５,０００g/mlを補足したＲＰＭＩ１６４０ にて培養した。アッセイ日までに、ペニシリン５,０００Ｕ/mlおよびストレプト マイシン５,０００g/mlは補足したがＦＣＳは含まないＲＰＭＩ１６４０中で細 胞を３回洗浄した。Ｋ５６２細胞、２０,０００細胞/ウェルをＶ型９６ウェルマ イクロタイタープレート(Nunc，Roskilde，Denmark)の各ウェルに接種し、同じ ものを３通り用意し、最終濃度２０μｇ/ml/ウェルで０.２Ｍ酢酸Ｎａ緩衝液、 ｐＨ５.５中ＥＣＰ１０μｌを加えた。対照として、細胞と緩衝液のウェルを用 意した。次いで、９５％空気および５％ＣＯ₂を含む加湿雰囲気下で７２時間、 培養プレートを３７℃でインキュベーションし、続いて遠心した(２００×g、７ 分)。培地を除去し、ＰＢＳ２００μｌ/ウェルで１回洗浄後、ＦＤＡ(１０μｇ/ ml；二酢酸フルオレセイン(Sigma，St Louis，Mo．U.S.A.))含有ＰＢＳ１００μ ｌ/ウェルを加えた。続いて、プレートを３７℃で１時間インキュベーションし 、その後４８５nm(Fluorescan 2，Labsystems Oy，Helsinki，Finland)での蛍光 を読み取った。この蛍光測定では、ＦＤＡ染料を含有するが細胞は含まないＰＢ Ｓ含有ウェルをブランクとした。この蛍光データを、マイクロソフト社のExcel およびマッキントッシュ社のＳＥ/３０パーソナルコンピューターを用いる自動 データ計算用のカスタムメードソフトウェアに移した。指示剤ＦＤＡにより得ら れた結果は、対照ウェルパーセントにおける試験ウェルの蛍光として定義した生 存指標(ＳＩ)として表す。個々のカラムフラクションをＫ５６２細胞に対する細 胞毒性について試験した。 ＤｉＳＣ法。短期間色素排除試験と平行して、分染細胞毒性(ＤｉＳＣ)アッセ イ(Weisenthal et al.，Cancer Res.43（1983）749-757;and Nygren et al.，Le ukemia 11（1992）1121-1128)を実施した。蛍光測定後直ちに、選定したウェ ルをファーストグリーン(１％、Sigma)、ニグロシン(０.5％、Sigma)および２５ ,０００ホルムアルデヒド−固定化ニワトリ赤血球／ウェルの混合物に室温で１ ０分間暴露した。ウェルの細胞内容物を続いてスライド上で細胞遠心し、メイ− グルンワルト−ギームザ染色で対比染色した。細胞生存は、光学顕微鏡で評価し た。生存可能細胞は正常なギームザ形態に染まるのに対し、死滅細胞およびニワ トリ赤血球は、緑がかった黒色に染まる。この変形ＤｉＳＣ法(Nygren et al.， Leukemia 11（1992）1121-1128)を用いる腫瘍細胞生存は、実験ウェルでは固定 化ニワトリ赤血球に対する生存可能Ｋ５６２細胞の比率として、対照ウェルでは 得られた比率のパーセンテージとして生存指標(ＳＩ)を表すことにより、算出し た。 阻害Ｋ５６２細胞は、上記のように１８０μｌ/ウェル調製した。ＥＣＰに対 する抗体１０μｌを最終濃度１００μｇ/ml/ウェルで加え、ＥＣＰ１０μｌを最 終濃度２０μｇ/mlで加えた。 統計 各グループ間の差異の統計学的評価については、一対の試料に対してマンーホ ワイトニー(Mann-Whitney)Ｕ−試験とウィルソン(Wilcxon)試験を用いた。統計 学的パッケージStatistica/W(StatSoft，Tulsa，OK，U.S.A.)を用いてパーソナ ルコンピューターにより算出した。 結果 性および細胞毒性活性 のゲルろ過にかけ(図１)、０.２ＭＮａＡｃ，ｐＨ４.５で溶出した。各フラクシ ョン中のＥＣＰは、特定のＲＩＡ(Peterson C.G.B．et al.，Clin．Exp．Allerg y 21（1991）561-566)により測定した。各フラクションを指示通りにプールし、 プール７および８中のＥＣＰを超ろ過により濃縮した。図１中の挿入図は、プー ル７およびプール８中のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。プール７では、 分子量およそ２１および２４ｋＤａの２つのバンドが見られた。還元後、２つの バンドは分子量２０および２２ｋＤａ辺りであった。プール８では、１つの主要 バ ンドが２２ｋＤａで見られた。還元後、分子量１８および１５ｋＤａの２つのバ ンドが見られた。バンドは全て、還元前、ＥＣＰに対する多種のモノクローナル 抗体を用いてウェスタン・イロノブロットによりＥＣＰとして同定したものであ った。 図２には、ゲルろ過後のプール７(ｎ＝１０)およびプール８(ｎ＝１２)の細胞 毒性活性を示す。ＥＣＰの細胞毒性活性は、プール８(ｐ＜０.０１)の方が顕著 に高く、プール７では弱い活性があるのみであった。 Ｍono−ＳカラムでのＦＰＬＣクロマトグラフィーから得たプールの分子特性お よび細胞毒性活性 上記ゲルろ過から得たプール８中のタンパク質(分子量２０ｋＤａ)は、Mono− Ｓカラムで分離した(図３)。指示通り各フラクションをプールして濃縮し、各プ ール中のＥＣＰの量は、図に示したように測定した。３つの主要なＥＣＰ含有プ ール、プールＶ、VIおよびVIIが得られた。これらのプール中のタンパク質のＳ ＤＳ−ＰＡＧＥは、還元せずとも、プールＶにおいてそれぞれ分子量２０および ２２ｋＤａの二重バンドを示した。プールVIでは、単一だが、非常に幅広の分子 量１９−２１ｋＤａのバンドが見られた。プールVIIは分子量２０ｋＤａの単一 バンド１本を含有した。還元後、同様のパターンが得られたが、全てのバンドが より低い分子量へと僅かにシフト(１−２ｋＤａ)し、更に約１５ｋＤａの低分子 量タンパク質があった(図４)。これら３つのプールの還元前(図５ａ)のタンパク 質がＥＣＰであるかどうかの同定は、ウェスタン・イムノブロットにより確立さ れており、図５ｂに示している。ＥＣＰに対してｍＡｂ６１４を用いた場合の結 果が示されており、同一の結果がｍＡｂ６１１およびｍＡｂ６１２でも得られた (図示せず)。よって、上記のバンドは全てＥＣＰであると同定された。更に、高 分子量タンパク質、約３０ｋＤａもまた同定された(図５ｂ)が、これはゲルのタ ンパク質染色では見えなかった。ｍＡｂ６５２では、分子量１９−２２ｋＤａの 範囲のバンドのみが同定された(図５ｃ)。 ５種の異なるMono−Ｓ調製物由来のプールＶ、VIおよびVIIの細胞毒性活性は 、図６に示されている。Ｋ６５２に対する細胞毒性は、プールＶにおいて、細胞 毒性活性をもつ他のプールの調製物の１つのみで主に見出された。 細胞毒性活性の抗体阻害 毒性活性の阻害が、図７に示されている。ポリクローナルウサギＥＣＰ−抗体、 但し、ＥＰＯ−抗体ではない、は約９８％まで細胞毒性活性を中和した。ＥＣＰ に対するｍＡｂ６１１、ｍＡｂ６１２、ｍＡｂ６１４およびｍＡｂ６５２の阻害 作用を試験すると、ｍＡｂ６５２は９０−９８％の阻害を引き起こしたのに対し 、他のモノクローナル抗体は阻害作用を持たなかった。ＥＣＰに対する市販のモ ノクローナル抗体、即ち、ＥＧＩおよびＥＧ２もまた、ＥＣＰの細胞毒性活性を 阻害できなかった。一実験では、Mono−ＳでのＦＰＬＣクロマトグラフィーから 得られたプールＶの細胞毒性活性もまた、ｍＡｂ６５２により中和されるが、他 のｍＡｂでは中和されない(図示せず)。 タンパク質脱グリコシル化 ゲルろ過により得られた細胞毒性ＥＣＰ(プール８)を、Mono−Ｓカラムで分離 する前にモル比率１：１６００で過ヨウ素酸ナトリウムと共にインキュベーショ ンした(図８ａ)。指示通りフラクションをプールし、濃縮して、各プール中のＥ ＣＰ量を図８ａに示すように測定した。３つの主たるＥＣＰ含有ピークの電荷は 、過ヨウ素酸酸化後、より塩基性の分子へと変わった。しかしながら、タンパク 質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ(図８ｂ)は、実質的に変わらない分子サイズを示した。 一単一個体からのＥＣＰの調製 ＥＣＰもまた過剰好酸球増加症の一単一個体から調製した。また、この単一個 体では、ある程度の分子不均一性が見られたが、Mono−Ｓで精製したＥＣＰの細 胞毒性活性は見られなかった。上記と同じイオン強度で溶出したMono−Ｓプール のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＥＣＰのバンドが２０ｋＤａで現れたが、２２ｋＤ ａのタンパク質バンドはなかった(図９)。 プロテアーゼ阻害剤での処理 サイズに関する不均一性は、ＥＣＰ精製中のプロテアーゼによる分解に起因す ることもあるため、全行程において、精製はプロテアーゼ阻害剤であるフェニル メチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)、濃度１００μｇ/mlの存在下で実施し た。この操作は、ＥＣＰの分子不均一性を変化させず、またＥＣＰの細胞毒性活 性に も影響を与えなかった。 考察 提示したデータは、好酸球カチオン性タンパク質(ＥＣＰ)には生物学的活性の 異なる数種の分子変種(イソ形態)が存在することを示す。これらのデータはまた 、分子不均一性がグリコシル化の相違に部分的に依存するが、細胞毒性活性を持 つ分子変種は他の変種とは共有しない独特な構造を持つことも示唆している。更 に、この分子変種の細胞毒性活性を特異的に中和するモノクローナル抗体を製造 することが可能である。 ＥＣＰの精製は、ゲルろ過とMono-Ｓでのカチオン交換クロマトグラフィーの 二段階であった。ゲルろ過では、ＥＣＰは不規則なピークで溶出し、既にこの段 階で不均一性を示した。このように大まかに分離した後、細胞毒性活性はより低 分子量のＥＣＰ種と関連することが明らかになった。そこで、この低分子量領域 の細胞毒性分子の解明にこの研究の焦点をしぼった。Mono−Ｓで更に精製すると 、ＥＣＰを含有する３つのピークが基本的に見つかり、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥ と一致するパターンを示した。よって、塩基性最大のＥＣＰ種がＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ上に分子量およそ２０ｋＤａの単一バンドとして現れたのに対し、塩基性最少 のＥＣＰ種は、一貫して、それぞれ分子量およそ２２および２０ｋＤａの別個の 二重バンドとして現れた。真中のＥＣＰ分子種は、常に、同じ分子量領域に幅広 のバンドとして現れた。還元によりピークＶおよびVIにおいて１５ｋＤａバンド が出現したのに対し、過ヨウ素酸酸化により脱グリコシル化してもゲル上の様相 は有意には変わらなかった。しかしながら、全ての変種の電荷は、過ヨウ素酸酸 化後、より塩基性の分子へと変化した。これらの結果は、これら３種のMono−Ｓ ピーク由来のＥＣＰの不均一性がグリコシル化の主たる相違によっては説明でき ないこと、および第四級構造を決定し得る−Ｓ−Ｓ−架橋が分子中に存在するこ とを示す。ＥＣＰに対する全てのモノクローナル抗体は、イムノブロットでは、 還元前の異なるバンドがエピトープを共有したことを示し、このことは、これら が全てＥＣＰ分子であったことを確認するものである。しかしながら、モノクロ ーナル抗体、ｍＡｂ６１１、６１２および６１４はまた、６５２を除き、特に、 ピークVIおよびVIIの調製物、即ち、最も塩基性かつ非細胞毒性の２種 のＥＣＰ変種において、分子量およそ３０ｋＤａでタンパク質染色後に僅かに目 に見える１つのバンドを同定した。これらのデータは、ＥＣＰの細胞毒性変種は 幾つかの独特な分子特性を持ち、これがその細胞毒性を決定することを示してい る。この細胞毒性調製物において見出された両方の分子種が細胞毒性活性にとっ て必要であるという仮定は、現在のところ知られていないが、好酸球増加症の一 患者由来の調製物中に高分子量バンドがなければ、このＥＣＰ調製物は非細胞毒 性になるという事実は、この２２ｋＤａ種が必須部分であることを示唆している 。 この研究では、一貫して、５〜６種のＥＣＰ変種の存在を示してきたが、問題 は、これらの変種が精製操作の結果であるのか、または遺伝的に決定されている のかということである。前者の原因は、不均一性がプロテアーゼ阻害剤の存在下 ではＥＣＰ調製物と相違なかったことから非常に考えにくい。また、これらの変 種は、殆どの調製物中に非常に一貫してみられる。しかしながら、後者の問いは 、別の可能性であり、これを除外することはできない。従って、我々は、ＥＣＰ 調製物の出発物質として常に正常白血球のプールを使用した。これらのプールは 、一般に、無作為に選択した、それぞれ別個のＥＣＰ変種を持ち得るおよそ１０ ０人の血液ドナーから入手した。これは、好酸球が得られた患者の一人について は少なくとも真実であった。なぜなら、この患者から得られたＥＣＰの不均一性 はかなり低かったからである。その他の可能性は、もちろん、これらの変種が、 そのグリコシル化度の相違に起因する分子の翻訳後変化を部分的に表すことやこ れらの変化が非遺伝的決定要因によることである。 ＥＣＰの細胞毒性活性を独特に中和するｍＡｂ６５２により全てのＥＣＰ種に おいてその細胞毒性活性にかかわりなくエピトープが同定されたという事実は、 細胞毒性エピトープが全てのＥＣＰ変種中に存在することを示す。そのため、Ｅ ＣＰにおける細胞毒性部位は、その分子の幾つかの独特な構造的特性に関連し得 る。しかしながら、ｍＡｂ６５２が３０ｋＤａバンドを同定しなかったことは興 味深く、これは僅かに細胞毒性ＥＣＰの調製物で見られた。これらの結果に基づ き、本願発明者らは、ＥＣＰの細胞毒性能がMono−Ｓで分離後にピークＶに見ら れた２２ｋＤａ変種に関連することを提唱する。この分子は、ある程度のグリコ シル化度と内部Ｓ−Ｓ架橋を持つ。この分子はまた、ＥＣＰの一部が１５およ び７ｋＤａバンドに還元されるため、不安定なタンパク質分解部位を含有するこ ともある。この１５ｋＤａ鎖は、３０ｋＤａタンパク質から二量体化によりイム ノブロット上で明らかにすることもできる。この３０ｋＤａタンパク質は、ｍＡ ｂ６５２と反応しないが、他のモノクローナル抗体とは反応するので、ＥＣＰの 細胞毒性部位を損失することもあり、従って、７ｋＤａ鎖に関連している。これ らの分子変種の頂部で、グリコシル化度の相違によりその他多くの変種が形成さ れる。これらの結果から、１種以上のＥＣＰ産物が存在し得ることも推論される 。 初期の研究で、本願発明者らは、２種のモノクローナル抗体、ＥＧ１およびＥ Ｇ２がそれぞれ非活性化好酸球および活性化好酸球中のＥＣＰに結合することを 示した。この相違は、イロノブロットにおいてＥＧ２のみが低分子量で脱グリコ シル化されたＥＣＰを検出したことから、異なるグリコシル化度での抗体のＥＣ Ｐ認識能に関連することを示していた。しかしながら、今回の結果は、これらの モノクローナル抗体はどれもＥＣＰの細胞毒性活性を中和できないことを示し、 これは、細胞毒性部位が、提案されたＥＣＰのマトリクス結合部位とは異なるこ と、およびその細胞毒性は脱グルコシル化ＥＣＰ分子に単純に関連しているので はないことを意味する。 実施例II−臨床物質におけるイソ−ＥＣＰアッセイ 試験キット アッセイは、ＥＣＰ抗原が固相抗ＥＣＰ抗体と標識化抗ＥＣＰ抗体との間で複 合体形成するサンドイッチＥＣＰアッセイにより様々な臨床物質にて実施した。 確立された方法Pharmacia CAP System ECPFEIA(Pharmacia Diagnostics，Uppsal a，Sweden)と、固相結合抗体およびｍａｂ６１４とｍａｂ６５２それぞれで置換 した標識化抗体を用いる以外は同じキットとで比較を行った。 結果：図面の説明参照 図面の説明 図１〜９は実施例Ｉに相当し、図１０〜１３は実施例IIに相当する。 図１ ろ過クロマトグラフィー。ＥＣＰのラジオイムノアッセイは、クロマトグラム中 に含まれる。クロマトグラムの底部に示したとおりピークでのタンパク質をプー ルした。挿入図は、クロマトグラム由来のプール７および８(還元済みおよび未 還元)のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す。Ｒ＝分子量マーカーは、ホスホリラ ーゼｂ(９４ｋＤａ)、アルブミン(６７ｋＤａ)、オバルブミン(４３ｋＤａ)、無 水カルボン酸(３０ｋＤａ)、トリプシン阻害剤(２０.１ｋＤａ)およびα−ラト クアルブミン(１４.４ｋＤａ)であった。試料は、クマシーブリリアントブルー Ｒ−２５０で染色した。 図２ 性。細胞系列Ｋ５６２由来の細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウ ェルに２０,０００/ウェルずつ接種した。別の調製物由来のＥＣＰは、最終濃度 ２０μｇ/ml/ウェルで使用し、続いて、インキュベーションし、材料および方法 のところで記載したＦＭＣＡ法により蛍光測定した。生存指標(ＳＩ)とＰ値の計 算については、上記参照。 図３ン交換クロマトグラフィー。試料(２mlのプール８)を出発緩衝液に充填し、材料 および方法のところ示したようにして溶出した。クロマトグラムの底部に示した とおりにフラクションをプールした(１〜７)。棒グラフはＲＩＡにより測定した 各プール中のＥＣＰ量を示す。 図４ 図３(Mono−Ｓカラム)のプールＶ、VIおよびVII由来のタンパク質の還元。分 子量マーカーは、レーンＲに見られる。＋は、還元されたタンパク質を示し、− は、未還元タンパク質を示す。 図５ａ−ｃ 図３(Mono−Ｓカラム)のプールＶ、VIおよびVIIを(ａ)ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ び(ｂ、ｃ)イムノブロットにて同定した。(ａ)レーンＲが分子量マーカー。レー ンＶ、VIおよびVII(未還元)は、図３のそれぞれのプールから精製したＥＣＰに 相当する。(ｂ)ｍＡｂ６１４により同定されたタンパク質。(ｃ)ｍＡｂ６５ ２により同定されたタンパク質。未還元試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロ セルロース紙に移した。 図６ Mono−Ｓでクロマトグラフィー後(プールＶ、VIおよびVII、５種の個々の調製 物)のＫ５６２細胞に対するＥＣＰの細胞毒性作用の比較。結果は、ＦＭＣＡ法 を用いる生存指標(％)で表す。 図７ 細胞毒性活性の抗体阻害。黒点は、３回繰り返し測定した平均を示す。棒グラ フは、その３回の測定の中央値である。 図８ａ−ｂ ａ．タンパク質の過ヨウ素酸酸化前後のMono−Ｓカラムでのプール８(図１に示 した)分離についてのクロマトグラム。実線は過ヨウ素酸処理物のクロマト グラフィーを示し、点線は非処理物のクロマトグラフィーを示す。棒グラフ は、過ヨウ素酸処理後にＲＩＡで測定したＥＣＰ濃度を示す。破線はＬｉＣ ｌ勾配を示す。 ｂ．過ヨウ素酸酸化前後の図８ａにおけるクロマトグラム由来のタンパク質のＳ ＤＳ−ＰＡＧＥ。分子量マーカーはレーンＲに示し、レーンＶ、VIおよびVI Iは図８ａに示したそれぞれのプールから精製したＥＣＰに相当する。＋＝ 過ヨウ素酸処理物。−＝非処理物。 図９ Mono−Ｓカラムでのクロマトグラフィーにより精製した、過剰好酸球増加症の 一個体山来のＥＣＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。分子量マーカーはレーンＲに示し、レ ーンＶ、VIおよびVIIの試料は図３に示した正常好酸球のプールＶ、VI、ＶIIに 相当する。 図１０および１１ これらは、確立された方法と本発明のイソＥＣＰ検出法により測定したＥＣＰ の血清レベルを示す。 ｒ＝参考グループ。健常非アレルギー性被験者９９人。 aa＝急性喘息、一部は処理し、一部は処理しない。ｎ＝１７。 ka＝除感作後３年のネコアレルギー幼児。ｎ＝２４。 ｅ＝喘息およびアレルギーに対するヨーロッパ人の研究。処理および非処理患 者混合。ｎ＝４２。 sj＝シェーグレン症候群の患者。ほとんど非処理。ｎ＝９。 bl＝病院にアレルギーおよび喘息の病気について問い合わせた患者の混合グル ープ。 ｉ＝急性ウイルス性および細菌性疾患の患者グループ。ｎ＝１１３。 ｐ＝花粉の季節の前およびその最中のアレルギー患者。ｎ＝５７。 ｇ＝慢性喘息の患者。非処理。ｎ＝１５。 図１２は、それぞれの患者グループと参考グループとのＥＣＰ平均レベルの比率 を示す。 図１３は、健常参考グループにおけるＥＣＰの血清レベルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１種のイソ−ＥＣＰのレベルを選択的に測定することを特徴とす る、 (ａ)診断対象の個体から得た試料中のＥＣＰレベルを特異的に測定し、 (ｂ)実測ＥＣＰレベルと標準ＥＣＰレベルとを比較する 各段階を含む、診断法。 ２．該少なくとも１種のイソ−ＥＣＰのレベルを免疫アッセイによって測定する 、請求の範囲第１項に記載の診断法。 ３．該少なくとも１種のイソ−ＥＣＰに特異的な抗イソ−ＥＣＰ抗体を該少なく とも１種のイソ−ＥＣＰの測定のために使用する、請求の範囲第１〜２項のいず れか１項に記載の診断法。 ４．該少なくとも１種のイソ−ＥＣＰが細胞毒性である、請求の範囲第１〜３項 のいずれか１項に記載の診断法。 ５．抗体が、他のイソ−ＥＣＰへの結合と比較して、少なくとも１種の細胞毒性 イソ−ＥＣＰの方に優先的に結合することを特徴とする、抗ＥＣＰ抗体。 ６．抗体が、それが優先的に結合するイソ−ＥＣＰの細胞毒性を少なくとも部分 的に阻害するものである、請求の範囲第５項に記載の抗ＥＣＰ抗体。