ES2235372T3 - Metodo para sintetizar oligonucleotidos sulfurados. - Google Patents
Metodo para sintetizar oligonucleotidos sulfurados.Info
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Abstract
Un método para la preparación de oligonucleótidos de fosforotioato, cuyo método consiste en: fosfitilar el 5¿-hidroxilo de un resto de ácido nucleico en acetonitrilo para formar un intermediario fosfito, estando unido dicho resto de ácido nucleico a un soporte sólido, y oxidar dicho intermediario fosfito con un disulfuro de acetilo en un sistema solvente consistente en acetonitrilo y piridina, piridina estéricamente bloqueada o una mezcla de éstos, durante un tiempo suficiente para efectuar la conversión de dicho intermediario fosfito a dicho fosforotioato.
Description
Método para sintetizar oligonucleótidos
sulfurados.
La presente invención se dirige a métodos para
sintetizar oligonucleótidos sulfurados y análogos de los mismos. Los
métodos emplean un reactivo de disulfuro de fenilacetilo en un
sistema solvente simplificado y producen oligonucleótidos que tienen
grupos fosforotioato con gran eficiencia y mejores rendimientos.
Los oligonucleótidos modificados son de gran
valor en la investigación biológica molecular y en aplicaciones
tales como la terapia antivírica. Los oligonucleótidos modificados
que pueden bloquear la traducción de ARN y que son resistentes a las
nucleasas son útiles como reactivos antisentido. Los
oligonucleótidos sulfurados, que contienen uniones fosforotioato
(P-S), tienen interés en estas áreas. Los
oligonucleótidos que contienen fosforotioato son también útiles en
la determinación de las rutas estereoquímicas de ciertas enzimas que
reconocen ácidos nucleicos.
Se han aplicado técnicas estándar para la
sulfurización de compuestos que contienen fósforo a la síntesis de
oligonucleótidos sulfurados. Como ejemplos de reactivos
sulfurizantes que han sido utilizados para sintetizar
oligonucleótidos que contiene enlaces fosoforotioato, se incluyen
azufre elemental, tetrasulfuro de dibenzoílo,
1,1-dióxido de
3-H-1,2-benziditiol-3-ona
(también conocido como reactivo de Beaucage), disulfuro de
tetraetiltiouramilo ("TETD") y disulfuro de
bis(O,O-diisopropoxifosfinotioílo) (conocido
como reactivo de Stec). La mayoría de los reactivos sulfurizantes,
sin embargo, presentan uno o más inconvenientes significativos.
El azufre elemental presenta problemas y no es
adecuado para automatización debido a su insolubilidad en la mayoría
de los solventes orgánicos. Más aún, el disulfuro de carbono, una
fuente preferida de azufre, tiene una volatilidad indeseable y un
punto de inflamación indeseablemente bajo. Con frecuencia, se
observan productos colaterales indeseados con el uso del
tetrasulfuro de dibenzoílo. El reactivo de Beaucage, aun siendo un
reactivo de sulfurización relativamente eficiente, es difícil de
sintetizar y no es particularmente estable. Más aún, el reactivo de
Beaucage forma un producto de reacción secundario que es un potente
agente oxidante. (R.P. Iyer y col., J. Am. Chem. Soc. 112,
pp. 1253-1254 (1990); R.P. Iyer y col., J. Org.
Chem. 55, 4693-4699 (1990)). Éste puede además
dar lugar a productos colaterales no deseados que pueden ser
difíciles de separar del producto de reacción deseado. El disulfuro
de tetraetiltiouramilo, aun siendo relativamente barato y estable,
tiene una velocidad de reacción de sulfurización que puede ser
indeseablemente lenta.
Se describe un método para producir un éster de
fosforotioato por reacción de un éster de fosfito con un disulfuro
de acilo en la solicitud de patente Holandesa Nº 8902521. El método
descrito es aplicado a un dímero de fosfotriéster purificado
utilizando química de fase de solución. El método es intensivo en
cuanto a tiempo y en cuanto a trabajo, en el sentido de que sólo
mostró funcionar en un esquema complejo que conllevaba realizar la
primera etapa de síntesis (formación de un fosfito) en acetonitrilo,
eliminar el acetonitrilo, purificar el fosfotriéster intermedio y
proceder con la sulfurización en una mezcla de solventes de
dicloroetano (DCE) y 2,4,6-colidina. Más aún, el
método fue sólo demostrado con un nucleótido. No se hizo sugerencia
alguna de que el método Holandés pudiera ser empleado con
estructuras de ácido nucleico mayores, de que el mismo pudiera
emplear un solvente común a través de todas las etapas de síntesis,
de que se pudieran obtener mejores resultados o de que el método
pudiera ser adaptado para la síntesis automatizada convencional sin
grandes modificaciones del esquema de automatización. Aunque se cita
el acetonitrilo como uno de los diversos solventes posibles, no se
demostró la utilidad del método para llevar a cabo todas las etapas
de la síntesis en acetonitrilo como solvente común. Aunque otras
publicaciones (Kamer y col., Tetrahedron Letters
30(48), pp. 6757-6760 (1989); Roelen y col.,
Rech. Trav. Chim. Pays-Bas 110, pp.
325-331 (1991)) muestran la sulfurización de
oligómeros que tienen hasta 6 nucleótidos, los inconvenientes
anteriores no son resueltos por los métodos descritos en estas
referencias.
Por lo tanto, sigue habiendo necesidad de métodos
y reactivos mejorados para preparar grupos fosforosos que contienen
azufre, tales como uniones fosforotioato, en oligonucleótidos y
otros compuestos orgánicos. La presente invención se dirige a estos,
así como a otros, fines importantes.
La presente invención proporciona métodos para la
síntesis de oligonucleótidos de fosforotioato con mejores
rendimientos en comparación con los obtenidos con los métodos
anteriores. Más aún, los presentes métodos son útiles para la
síntesis no sólo de oligonucleótidos de fosforotioato que tienen
números relativamente grandes de unidades
nucleotídicas/nucleosídicas en los mismos, por ejemplo de
aproximadamente 6 a aproximadamente 50 y, lo que es más,
particularmente de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 unidades
nucleotídicas/nucleosídicas. Los métodos de la presente invención
emplean un sistema solvente muy simplificado, uno que es compatible
con esquemas de reacción sintéticos automatizados y sintetizadores
comerciales. El perfeccionamiento resultante en las oportunidades
sintéticas permite una amplia aplicación de los presentes métodos en
toda la química de los ácidos
nucleicos.
nucleicos.
Un aspecto de la presente invención describe un
método para la preparación de oligonucleótidos de fosforotioato,
cuyo método consiste en:
fosfitilar el 5'-hidroxilo de un
resto de ácido nucleico en acetonitrilo para formar un intermediario
fosfito, estando unido dicho resto de ácido nucleico a un soporte
sólido, y
oxidar dicho intermediario fosfito con un
disulfuro de acetilo en un sistema solvente consistente en
acetonitrilo y piridina, piridina estéricamente bloqueada o una
mezcla de éstos, durante un tiempo suficiente para efectuar la
conversión de dicho intermediario fosfito a dicho fosforotioato. Se
pueden preparar oligonucleótidos de fosforotioato que tienen una
longitud y una secuencia predeterminadas repitiendo las etapas de
fosfitilación y oxidación.
En otros aspectos de la presente invención, se
describen métodos para la síntesis de análogos de oligonucleótidos
de fosforotioato, consistentes en la substitución con nucleótidos,
nucleósidos, oligonucleótidos y oligonucleósidos modificados de
nucleótidos, nucleósidos, oligonucleótidos u oligonucleósidos. Las
modificaciones de nucleótidos, nucleósidos, oligonucleótidos y
oligonucleósidos son bien conocidas en la técnica. Tal como se usa
aquí, el término "oligonucleótido de fosforotioato" pretende
incluir análogos según se ha definido anteriormente.
El término "resto de fosfito", tal como se
usa aquí, pretende incluir restos de fosfito en nucleósidos,
nucleótidos, oligonucleósidos y oligonucleótidos. En una realización
preferida, los restos de fosfito están en un estado activado, tal
como una dimetoxitritilfosforamidita. Los términos "nucleótido,
nucleósido, oligonucleótido u oligonucleósido", tal como se
utilizan aquí, pretenden incluir tanto especies naturales como
especies no naturales o modificadas, como es sabido para los
expertos en la técnica. Las modificaciones comunes incluyen
modificaciones de los azúcares, tales como modificaciones 2', y
modificaciones de las bases o el uso de bases substitutas. Cuando se
usa un oligonucleótido o un oligonucleótido modificado como resto de
fosfito, también pueden estar presentes uniones modificadas, como es
comúnmente sabido en la técnica.
Los presentes métodos tienen niveles inferiores
demostrados de impurezas y mayores rendimientos en comparación con
cuando se usa DCE como solvente para la etapa de oxidación. Los
presentes métodos han mostrado también, de forma inesperada, que se
pueden obtener rendimientos de aproximadamente el 99% en
acetonitrilo/picolina. El acetonitrilo/picolina es totalmente
compatible con la síntesis automatizada sin gran modificación de la
rutina sintética, de tal forma que los presentes métodos pueden ser
ventajosamente usados en un sintetizador automatizado. Por ejemplo,
no se requieren grandes lavados, ya que se usa un solo solvente o
mezcla que tiene un solvente común en todas las etapas sintéticas
automatizadas. De este modo, se pueden eliminar las etapas de
eliminación del solvente y de lavado. También se ha descubierto,
sorprendentemente, que se pueden alcanzar altos rendimientos cuando
se sintetizan oligonucleótidos o análogos de oligonucleótidos de
fosforotioato que tienen de aproximadamente 8 nucleótidos a
aproximadamente 30 nucleótidos.
Como sistemas solventes adecuados para uso en la
oxidación del intermediario fosfito de la presente invención, se
incluyen mezclas de dos o más solventes. Preferiblemente, una mezcla
de un solvente aprótico con un solvente prótico o básico. Como
mezclas solventes preferidas, se incluyen acetonitrilo/picolina y
acetonitrilo/lutidina. Como solventes apróticos adecuados, se
incluyen piridina y piridinas bloqueadas, tales como lutidina,
colidina y picolina. Las mezclas solventes pueden incluir, por
ejemplo, dos solventes tales como acetonitrilo y picolina o
acetonitrilo y lutidina en una razón de volúmenes de aproximadamente
1:1,5 a aproximadamente 1,5:1, preferiblemente de aproximadamente
1:1.
La sulfurización (oxidación utilizando un
reactivo sulfurizante) según los métodos de la presente invención es
llevada a cabo por contacto de un oligonucleótido o análogo con un
disulfuro de acetilo durante un tiempo suficiente para efectuar la
formación de un grupo funcional fosforotioato. Como reactivos
preferidos, se incluyen disulfuro de fenilacetilo, disulfuro de
arilacetilo y disulfuros de fenilacetilo
aril-substituidos.
Se puede hacer el contacto del resto de fosfito
con disulfuro de acetilo usando procedimientos y equipos conocidos
para los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede emplear
adecuadamente un reactor de vidrio, tal como un matraz.
Preferiblemente, se emplean procedimientos de síntesis en fase
sólida y un soporte sólido tal como vidrio de poro controlado.
Incluso más preferiblemente, los métodos de la presente invención
pueden ser llevados a cabo usando sintetizadores de ADN
automatizados. Se describen técnicas adecuadas de fase sólida,
incluyendo técnicas de síntesis automatizada, en F. Eckstein (ed.),
Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Oxford
University Press, New York (1991).
Los métodos de la presente invención pueden ser
adecuadamente llevados a cabo a temperatura ambiente. "Temperatura
ambiente" incluye temperaturas ambiente de desde aproximadamente
20ºC hasta aproximadamente 30ºC. Los tiempos de reacción son del
orden de minutos, tal como, por ejemplo, 2, 3, 4 ó 5 minutos, o
incluso de tan sólo aproximadamente 100 segundos.
En general, los métodos de la presente invención
incluyen la fosfitilación del grupo 5'-hidroxilo de
un resto de ácido nucleico para formar un intermediario fosfito y la
oxidación del intermediario fosfito con un disulfuro de acetilo
durante un tiempo suficiente para efectuar la conversión del
intermediario fosfito en un fosforotioato. El intermediario fosfito
puede ser, por ejemplo, un dinucleótido unido a fosfito, o un
oligonucleótido u oligonucleósido que tenga al menos una unión
fosfito en el mismo. Las etapas de fosfitilación y de oxidación del
método son ambas realizadas en un sistema que incluye acetonitrilo.
La repetición de las etapas de fosfitilación y oxidación dará el
oligonucleótido de fosforotioato con una longitud predeterminada. El
progreso de la reacción puede ser monitorizado por técnicas bien
conocidas, tales como la RMN de protones o de ^{31}P. El producto
de reacción puede ser tratado con una base, tal como, por ejemplo,
una solución de hidróxido de amonio a una concentración de
aproximadamente el 30 por ciento. Se puede aislar fácilmente el
producto deseado, por ejemplo, por técnicas de filtración
estándar.
Los siguientes ejemplos son meramente
ilustrativos de la presente invención y no deberían ser considerados
como limitantes del alcance de la invención en modo alguno. Estos
ejemplos y sus equivalentes serán más evidentes para los expertos en
la técnica a la luz de la presente descripción y de las
reivindicaciones adjuntas.
Se recogen 50 milígramos (2 \mumoles) de
5'-O-dimetoxitritiltimidina unida a
"CPG" (vidrio de poro controlado) a través de una unión éster
en un reactor de vidrio y se añade una solución en diclorometano de
ácido dicloroacético al 2% (volumen/volumen) para desproteger el
grupo 5'-hidroxilo. Se lava el producto con
acetonitrilo. Se añaden entonces una solución 0,2 M de
5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidina-3'-O-(2-cianoetil-N,N-di-isopropilfosforamidita)
en acetonitrilo y una solución 0,4 M de 1H-tetrazol
en acetonitrilo y se deja reaccionar a temperatura ambiente durante
5 minutos. Se lava el producto con acetonitrilo y se añade luego una
solución 0,2 M de disulfuro de fenilacetilo en
acetonitrilo:3-picolina (1:1 v/v) y se deja
reaccionar a temperatura ambiente durante 3 minutos. Se repite esta
etapa de sulfurización una vez más durante 3 minutos. Se lava el
soporte con acetonitrilo y se añade luego una solución de anhídrido
acético/lutidina/THF (1:1:8) y N-metilimidazol/THF
para rematar cualquier grupo 5'-hidroxilo no
reaccionado. Se lava el producto con acetonitrilo.
Se repite este ciclo completo cinco veces más
para producir el heptámero de timidina completamente protegido. Se
trata el vehículo que contiene el compuesto con una solución acuosa
al 30% de hidróxido de amonio durante 90 minutos a temperatura
ambiente. Se filtra la solución acuosa y se concentra a presión
reducida, para obtener un heptámero de fosforotioato, TTTTTTT.
Se recogen 50 milígramos (2 X 10^{-6} moles (2
\mumoles)) de
5'-O-dimetoxitritiltimidina unida a
CPG (vidrio de poro controlado) a través de una unión éster en un
reactor de vidrio y se añade una solución en diclorometano de ácido
dicloroacético al 2% (volumen/volumen) para desproteger el grupo
5'-hidroxilo. Se lava el producto con acetonitrilo.
Se añaden entonces una solución 0,2 M de
5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidina-3'-O-(2-cia-noetil-N,N-diisopropilfosforamidita)
en acetonitrilo y una solución 0,4 M de 1H-tetrazol
en acetonitrilo y se deja reaccionar a temperatura ambiente durante
5 minutos. Se lava el producto con acetonitrilo y se añade luego una
solución 0,2 M de disulfuro de fenilacetilo en
acetonitrilo:3-picolina (1:1 v/v) y se deja
reaccionar a temperatura ambiente durante 3 minutos. Se repite esta
etapa de sulfurización una vez más durante 3 minutos. Se lava el
soporte con acetonitrilo y se añade luego una solución de anhídrido
acético/lutidina/THF (1:1:8) y N-metilimidazol/THF
para rematar el grupo 5'-hidroxilo no reaccionado.
Se lava el producto con acetonitrilo.
Se añade una solución de ácido dicloroacético al
2% (volumen/volumen) para desproteger el grupo
5'-hidroxilo. Se lava el producto con acetonitrilo.
Se añaden entonces una solución 0,2 M de
N^{4}-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxicitidina-3'-O-(2-cianoetil-N,N'-diisopropilfosforamidita)
en acetonitrilo y una solución 0,4 M de 1H-tetrazol
en acetonitrilo y se deja reaccionar a temperatura ambiente durante
5 minutos. Se lava el producto con acetonitrilo y se añade entonces
una solución 0,2 M de disulfuro de fenilacetilo en
acetonitrilo:3-picolina (1:1 v/v) y se deja
reaccionar a temperatura ambiente durante 3 minutos. Se repite esta
etapa de sulfurización una vez más durante 3 minutos. Se lava el
soporte con acetonitrilo y se añade luego una solución de anhídrido
acético/lutidina/THF (1:1:8) y
N-metilimida-zol/THF para rematar
cualquier grupo 5'-hidroxilo no reaccionado. Se lava
el producto con acetonitrilo.
Se añade una solución de ácido dicloroacético al
2% (volumen/volumen) para desproteger el grupo
5'-hidroxilo. Se lava el producto con acetonitrilo.
Se añaden entonces una solución 0,2 M de
N6-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina-3'-O-(2-cianoetil-N,N'-diisopropilfosforamidita)
en acetonitrilo anhidro y una solución 0,4 M de
1H-tetrazol en acetonitrilo y se deja reaccionar a
temperatura ambiente durante 5 minutos. Se lava el producto con
acetonitrilo y se añade entonces una solución 0,2 M de disulfuro de
fenilacetilo en acetonitrilo:3-picolina (1:1 v/v) y
se deja reaccionar a temperatura ambiente durante 3 minutos. Se
repite esta etapa de sulfurización una vez más durante 3 minutos. Se
lava el soporte con acetonitrilo y se añade luego una solución de
anhídrido acético/lutidina/THF (1:1:8) y
N-metilimidazol/THF para rematar cualquier grupo
5'-hidroxilo no reaccionado. Se lava el producto con
acetonitrilo.
Se añade una solución de ácido dicloroacético al
2% (volumen/volumen) para desproteger el grupo
5'-hidroxilo. Se lava el producto con acetonitrilo.
Se añaden entonces una solución 0,2 M de
N2-isobutiril-5'-O-4,4'-dimetoxitritildesoxiguanosina-3'-O-(2-cianoetil-N,N'-diisopropilfosforamidita)
en acetonitrilo y una solución 0,4 M de 1H-tetrazol
en acetonitrilo y se deja reaccionar a temperatura ambiente durante
5 minutos. Se lava el producto con acetonitrilo y se añade entonces
una solución 0,2 M de disulfuro de fenilacetilo en
acetonitrilo:3-picolina (1:1 v/v) y se deja
reaccionar a temperatura ambiente durante 3 minutos. Se repite esta
etapa de sulfurización una vez más durante 3 minutos. Se lava el
soporte con acetonitrilo y se añade luego una solución de anhídrido
acético/lutidina/THF (1:1:8) y N-metilimidazol/THF
para rematar cualquier grupo 5'-hidroxilo no
reaccionado. Se lava el producto con acetonitrilo.
Se trata el vehículo que contiene el compuesto
con una solución acuosa de hidróxido de amonio al 30% durante 90
minutos a temperatura ambiente y se incuba después a 55ºC durante 24
horas. Se filtra la solución acuosa y se concentra a presión
reducida, para obtener un tetrámero de fosforotioato de
5'-dG-dA-dC-T-3'.
Se realizó la síntesis de la secuencia anterior
en un sintetizador OligoPilot II de Pharmacia a una escala de 620
\mumoles usando las cianoetilfosforamiditas y el soporte cebador
de Pharmacia. Se realizó la sulfurización usando una solución 0,2 M
de disulfuro de fenilacetilo en
acetonitrilo:3-picolina (1:1 v/v) durante 2 minutos.
Al final de la síntesis, se lavó el soporte con acetonitrilo, se
escindió, se desprotegió y se purificó como se ha ilustrado
previamente.
Se realizó la síntesis de la secuencia anterior
en un sintetizador OligoPilot II de Pharmacia a una escala de 620
\mumoles usando las cianoetilfosforamiditas y el soporte cebador
de Pharmacia. Se realizó la sulfurización usando una solución 0,2 M
de disulfuro de fenilacetilo en
acetonitrilo:3-picolina (1:1 v/v) durante 2 minutos.
Al final de la síntesis, se lavó el soporte con acetonitrilo, se
escindió, se desprotegió y se purificó como se ha ilustrado
previamente.
Se realizó la síntesis de la secuencia anterior
en un sintetizador OligoPilot II de Pharmacia a una escala de 620
\mumoles usando las cianoetilfosforamiditas y el soporte cebador
de Pharmacia. Se realizó la sulfurización usando una solución 0,2 M
de disulfuro de fenilacetilo en
acetonitrilo:3-picolina (1:1 v/v) durante 2 minutos.
Al final de la síntesis, se lavó el soporte con acetonitrilo, se
escindió, se desprotegió y se purificó como se ha ilustrado
previamente.
Se realizó la síntesis de la secuencia anterior
en un sintetizador OligoPilot II de Pharmacia a una escala de 620
\mumoles usando las cianoetilfosforamiditas y el soporte cebador
de Pharmacia. Se realizó la sulfurización usando una solución 0,2 M
de disulfuro de fenilacetilo en
acetonitrilo:3-picolina (1:1 v/v) durante 2 minutos.
Al final de la síntesis, se lavó el soporte con acetonitrilo, se
escindió, se desprotegió y se purificó como se ha ilustrado
previamente.
Se realizó la síntesis de la secuencia anterior
en un sintetizador Milligen 8800 a una escala de 282 \mumoles
usando las cianoetilfosforamiditas y el soporte cebador de
Pharmacia. Se realizó la sulfurización usando una solución 0,4 M de
disulfuro de fenilacetilo en acetonitrilo:3-picolina
(1:1 v/v) durante 6 minutos. Al final de la síntesis, se lavó el
soporte con acetonitrilo, se escindió, se desprotegió y se purificó
como se ha ilustrado previamente.
Se realizó la síntesis de la secuencia anterior
en un sintetizador OligoPilot II de Pharmacia a una escala de 250
\mumoles usando las cianoetilfosforamiditas y el soporte cebador
de Pharmacia. Se realizó la sulfurización usando una solución 0,4 M
de disulfuro de fenilacetilo en
acetonitrilo:3-picolina (1:1 v/v) durante 10
minutos. Al final de la síntesis, se lavó el soporte con
acetonitrilo, se escindió, se desprotegió y se purificó como se ha
ilustrado previamente.
Se realizó la síntesis de la secuencia anterior
en un sintetizador OligoPilot II de Pharmacia a una escala de 250
\mumoles usando las cianoetilfosforamiditas y el soporte cebador
de Pharmacia. Se realizó la sulfurización usando una solución 0,4 M
de disulfuro de fenilacetilo en
acetonitrilo:3-picolina (1:1 v/v) durante 6 minutos.
Al final de la síntesis, se lavó el soporte con acetonitrilo, se
escindió, se desprotegió y se purificó como se ha ilustrado
previamente.
Se realizó la síntesis de la secuencia anterior
en un sintetizador Milligen 8800 a una escala de 565 \mumoles
usando las cianoetilfosforamiditas y el soporte cebador de
Pharmacia. Se realizó la sulfurización usando una solución 0,4 M de
disulfuro de fenilacetilo en acetonitrilo:3-picolina
(1:1 v/v) durante 6 minutos. Al final de la síntesis, se lavó el
soporte con acetonitrilo, se escindió, se desprotegió y se purificó
como se ha ilustrado previamente.
Se realizó la síntesis de la secuencia anterior
en un sintetizador OligoPilot II de Pharmacia a una escala de 680
\mumoles usando las cianoetilfosforamiditas y el soporte cebador
de Pharmacia. Se realizó la sulfurización usando una solución 0,4 M
de disulfuro de fenilacetilo en
acetonitrilo:3-picolina (1:1 v/v) durante 6 minutos.
Al final de la síntesis, se lavó el soporte con acetonitrilo, se
escindió, se desprotegió y se purificó como se ha ilustrado
previamente.
Los expertos en la técnica apreciarán que se
pueden hacer numerosos cambios y modificaciones en las realizaciones
preferidas de la invención y que se pueden realizar dichos cambios y
modificaciones sin desviarse del espíritu de la invención. Se
pretende, por lo tanto, que las reivindicaciones adjuntas cubran
todas esas variaciones equivalentes en la medida en que queden
dentro del verdadero espíritu y alcance de la invención.
Diversas modificaciones de la invención, además
de las aquí descritas, serán evidentes para los expertos en la
técnica gracias a la descripción que antecede. Dichas modificaciones
pretenden quedar incluidas dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
Claims (11)
1. Un método para la preparación de
oligonucleótidos de fosforotioato, cuyo método consiste en:
fosfitilar el 5'-hidroxilo de un
resto de ácido nucleico en acetonitrilo para formar un intermediario
fosfito, estando unido dicho resto de ácido nucleico a un soporte
sólido, y
oxidar dicho intermediario fosfito con un
disulfuro de acetilo en un sistema solvente consistente en
acetonitrilo y piridina, piridina estéricamente bloqueada o una
mezcla de éstos, durante un tiempo suficiente para efectuar la
conversión de dicho intermediario fosfito a dicho fosforotioato.
2. El método de la reivindicación 1, donde dicha
oxidación se hace en presencia de acetonitrilo:lutidina en una
proporción de 1:1 en base al volumen.
3. El método de la reivindicación 1, donde dicha
piridina estéricamente bloqueada es colidina, lutidina o
picolina.
4. El método de la reivindicación 1, que incluye
la repetición de dicha fosfitilación y dicha oxidación para obtener
dicho oligonucleótido de fosforotioato con una longitud
predeterminada.
5. El método de la reivindicación 1, donde dicho
intermediario fosfito es un dinucleótido.
6. El método de la reivindicación 1, donde dicho
intermediario fosfito es un oligonucleótido.
7. El método de la reivindicación 1, donde dicha
fosfitilación es realizada usando un resto de fosfito.
8. El método de la reivindicación 7, donde dicho
resto de fosfito es una fosforamidita.
9. El método de cualquier reivindicación
precedente, donde dicho disulfuro de acetilo es un disulfuro de
arilacetilo.
10. El método de la reivindicación 9, donde dicho
disulfuro de arilacetilo es un disulfuro de fenil- acetilo
aril-substituido.
11. El método de la reivindicación 9, donde dicho
disulfuro de arilacetilo es disulfuro de fenilacetilo.
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