ES2235534T3 - Deteccion y cuantificacion de vancomicina en fluidos biologicos. - Google Patents
Deteccion y cuantificacion de vancomicina en fluidos biologicos.Info
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Abstract
Un método para la cuantificación de vancomicina en una muestra de ensayo, comprendiendo el método las etapas de: (a) poner en contacto la muestra de ensayo con (i) un anticuerpo reactivo que comprende anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a vancomicina, el anticuerpo producido con un inmunógeno de fórmula: **(Fórmula)** donde P es un material portador inmunogénico, y X es un radical de unión de 0 a 50 carbonos y heteroátomos, incluyendo no más de diez heteroátomos, dispuestos en forma de una cadena lineal o ramificada o un radical cíclico, saturado o insaturado, con las condiciones de que no más de dos heteroátomos pueden estar unidos directamente en serie, que la serie no puede contener enlaces -O-O-, que los radicales cíclicoscon tienen 6 o menos miembros, y que la ramificación se puede producir solamente en átomos de carbono, y (ii) un reactivo marcado que es capaz de desplazar la unión del anticuerpo hacia la vancomicina, para formar una solución de reacción; y (b) medirla cantidad del reactivo marcado en la solución de reacción que está o no está unido a un anticuerpo como una función de la cantidad de vancomicina en la muestra de ensayo, caracterizado porque en dicho método se emplea un calibrador estable que comprende una solución acuosa que contiene una molécula de vancomicina estabilizada con un polipéptido donde dicho polipéptido no interfiere en la unión de un anticuerpo a la molécula de vancomicina.
Description
Detección y cuantificación de vancomicina en
fluidos biológicos.
La presente invención se refiere a la
cuantificación de vancomicina en una muestra de ensayo. En
particular, la presente invención se refiere a métodos que emplean
anticuerpos preparados a partir de inmunógenos y reactivos marcados
para la cuantificación específica de vancomicina en una muestra de
ensayo, preferiblemente para el uso en inmunoanálisis de
polarización de fluorescencia, donde dichos métodos emplean un
calibrador estable.
Durante los últimos 30 años, la vancomicina ha
sido el fármaco de elección para el tratamiento de las infecciones
Gram-positivas causadas por el Staphylococcus
aureus resistente a la meticilina. Es también el tratamiento de
las infecciones bacterianas en pacientes alérgicos a los
antibióticos \beta-lactámicos. La vancomicina es
producida por Amycolatopsis orientalis (anteriormente
denominado Nocardia orientalis y Streptomyces
orientalis). La vancomicina es resistente a los organismos
Gram-negativos. Se desconoce la resistencia cruzada
con otros antibióticos y a pesar de su uso prolongado, ha habido
pocos informes de emergencia de organismos resistentes durante la
terapia. La vancomicina no es absorbida desde el tracto
gastrointestinal, y por tanto el antibiótico se utiliza para tratar
enterocolitis causadas especialmente por Clostridium
difficile en el intestino. Nagarajan, R., J. Antibiotics,
46:1181 (1993). La vancomicina ejerce su acción antibacteriana
uniéndose preferentemente a intermedios peptídicos implicados en la
biosíntesis de peptidoglicanos de la pared celular bacteriana.
La vancomicina es eliminada es eliminada a través
de los riñones. La vida media del fármaco, 5-11
horas en pacientes normales, se prolonga a 2-5 días
en pacientes con insuficiencia renal, e incluso es más larga en
pacientes de diálisis. Si bien la vancomicina es un fármaco
relativamente seguro, entre los efectos adversos que han sido
observados se incluyen la nefrotoxicidad y la autotoxicidad.
Para la administración segura de la vancomicina,
se acostumbra a cuantificar sus niveles en la sangre del paciente.
Se ha sugerido que debido a que el fármaco permanece más tiempo en
el organismo de un paciente renalmente deteriorado, la exposición a
la temperatura corporal interna durante períodos más prolongados
produce la acumulación de los productos de degradación que son
conocidos como Productos de Degradación Cristalinos I y II
(CDP-I y CDP-II en sus siglas en
inglés). CDP-I y CDP-II son isómeros
rotacionales que pueden ser aislados por separado. La vancomicina y
sus dos productos de degradación principales CDP-I y
CDP-II se muestran en las Figuras
1-3, respectivamente.
Se sabe que la vancomicina es inestable en un
entorno acuoso. En la Patente de los Estados Unidos 4.670.258 de
Harris, y col. se describe una composición de vancomicina y un
tripéptido que se dice que estabiliza el fármaco en una solución
acuosa. No obstante, tales tripéptidos pueden interferir en los
mecanismos de inmunoanálisis. Por ejemplo, semejante interferencia
puede ocurrir cuando un anticuerpo compite con un péptido
estabilizador por el mismo sitio de unión del analito.
Históricamente, las concentraciones de
vancomicina en los fluidos biológicos han sido determinadas mediante
inmunoanálisis de fluorescencia (FIA), cromatografía de líquidos de
alta resolución (HPLC), radioinmunoanálisis (RIA), el mecanismo de
inmunoanálisis enzimático multiplicado (EMIT) o mecanismos
microbiológicos. Si bien la HPLC es considerada por los expertos en
la técnica como el más exacto de todos los métodos para la
cuantificación de la vancomicina, es un método lento y de intenso
trabajo que requiere personal altamente cualificado y material
especializado que no siempre es asequible en cada marco clínico.
Más recientemente, se han utilizado mecanismos de
polarización de la fluorescencia para analizar la vancomicina. Los
mecanismos de polarización de la fluorescencia se basan en
principios de inmunoanálisis de unión competitiva. El principio que
está detrás de la polarización de la fluorescencia es que un
compuesto marcado fluorescente, cuando es excitado por una luz
polarizada linealmente, emitirá fluorescencia que tenga un grado de
polarización inversamente proporcional a su velocidad de rotación.
Por lo tanto, cuando un complejo trazador marcado fluorescente -
anticuerpo es excitado por una luz polarizada linealmente, la luz
emitida permanece altamente polarizada debido a que la rotación del
fluoróforo está limitada entre el momento en que la luz es absorbida
y emitida. Cuando un compuesto trazador "libre" (es decir, no
unido a un anticuerpo) es excitado por luz linealmente polarizada,
su rotación es mucho más rápida que la del correspondiente producto
conjugado de trazador-anticuerpo producido en un
inmunoanálisis de unión competitiva.
Los mecanismos de polarización de la
fluorescencia y los compuestos adecuados para su uso como marcas
fluorescentes han sido descritos en la técnica. Por ejemplo, en las
Patentes de los Estados Unidos 4.510.251 y 4.614.823, de Kirkemo y
col., se describe un análisis de polarización de la fluorescencia
para ligandos en el que se utilizan derivados de
aminometilfluoresceína, respectivamente. En la Patentes de los
Estados Unidos Núm. 4.476.229, de Fino y col., se describen
carboxifluoresceínas sustituidas, incluyendo aquellas que contienen
un análogo de vancomicina, para su uso en un inmunoanálisis de
polarización de la fluorescencia. En las Patentes de los Estados
Unidos Núms. 4.420.568 y 5.097.097, de Wang y col., se describe un
inmunoanálisis de polarización de la fluorescencia en el que se
utilizan triazinilaminofluoresceínas sustituidas como trazadores.
Wang en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.420.568 describe la
reacción de vancomicina y diclorotriazinilaminofluoresceína (DTAP).
Sin embargo, en esta patente no se describe la estructura del
producto de semejante reacción o su aplicación en el sistema
heterogéneo. Griffin y col., (JACS 115, 6482 (1993)) describen un
método selectivo para la síntesis de los derivados de vancomicina
que portan grupos funcionales alquilo, imidazol y amino anclados al
extremo C e indican la utilidad de este método para la preparación
de derivados que portan grupos funcionales diferentes. Sin embargo,
no existe descripción de la síntesis del material inmunógeno o los
inmunocomponentes y su uso para la cuantificación de la
vancomicina.
En WO 96/31780 se describen reactivos de
inmunoanálisis de polarización de la fluorescencia (FPIA), métodos y
estuches de ensayo para la cuantificación específica de vancomicina
en una muestra de ensayo. Una solución de pretratamiento separa la
proteína de cualquier proteína unida a vancomicina con el fin de
liberar la vancomicina para el análisis.
Se encuentran disponibles análisis de
polarización de la fluorescencia asequibles comercialmente para la
vancomicina (FPIA). Por ejemplo, entre los análisis asequibles
comercialmente (análisis de Abbott TDX®, TDXFLX® (referidos en
adelante como "análisis de Vancomicina de Abbott asequibles
comercialmente")) se incluyen los reactivos para la medida
cuantitativa de vancomicina en muestras de suero o plasma. Estos
análisis utilizan un derivado de vancomicina marcado con una
diclorotriazinilaminofluoresceína (DTAF) (referida en adelante como
"trazador asequible comercialmente"), y anticuerpos
policlonales de oveja contra la vancomicina (referidos en adelante
como "anticuerpos asequibles comercialmente").
Los FPIAS tienen la ventaja sobre los
radioinmunoanálisis (RIA) de que no hay sustancias radiactivas que
desechar y de que son análisis homogéneos que pueden ser realizados
fácil y rápidamente. Sin embargo, se ha informado que los análisis
de vancomicina asequibles comercialmente muestran un incremento
ocasional de los valores de vancomicina medidos que no coinciden con
las medidas mediante HPLC. Estos incrementos han sido atribuidos a
un aumento de la reactividad cruzada con CDP-I y
CDP-II. Como se ha observado antes, los isómeros
CDP-I y CDP-II pueden ser aislados
por separado. Como se esperaba, cualquier solución compuesta por
CDP-I contendrá siempre una mezcla equilibrada de
ambos isómeros. Así, las medidas de la reactividad cruzada con
CDP-I referidas aquí miden la reactividad cruzada de
la mezcla en equilibrio.
Por tanto existe la continua necesidad de
análisis mejorados que puedan determinar rápida y exactamente la
concentración de vancomicina en presencia de productos de
degradación con reactividad cruzada en los fluidos biológicos.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona métodos de inmunoanálisis que utilizan anticuerpos
reactivos y reactivos marcados para la cuantificación de vancomicina
en una muestra de ensayo. Aquí se describen procedimientos
sintéticos para preparar inmunógenos que se emplean para la
producción de tales anticuerpos reactivos, así como procedimientos
para preparar tales reactivos marcados.
También se describen aquí anticuerpos reactivos
que pueden ser utilizados, y en muchos casos son críticos, para
construir calibradores de vancomicina estables y controles que
pueden ser utilizados en análisis para medir la concentración de
vancomicina.
El método de la presente invención ofrece un
avance en la técnica más allá de los inmunoanálisis conocidos
previamente para la cuantificación de la vancomicina en una muestra
de ensayo. Específicamente, se descubrió que los anticuerpos
reactivos descritos aquí que no tienen esencialmente reactividad
cruzada con los metabolitos CDP-I y
CDP-II pueden ser utilizados en presencia de
polipéptidos que estabilizan la molécula de vancomicina para la
cuantificación de la vancomicina. En la presente invención, la
presencia de tales polipéptidos no interfiere en la cuantificación
de la vancomicina en una muestra.
La presente invención proporciona un método para
la cuantificación de la vancomicina en una muestra de ensayo,
donde:
(a) la muestra de ensayo se pone en contacto con
un anticuerpo reactivo que tiene anticuerpos que son capaces de
unirse específicamente a la vancomicina y son producidos con un
inmunógeno de la Figura 6 donde P es un material portador
inmunógeno, y X es un radical de unión de 0 a 50 carbonos y
heteroátomos, incluyendo no más de diez heteroátomos, ordenados en
forma de una cadena lineal o ramificada o de radical cíclico,
saturado o insaturado, con las condiciones de que no más de dos
heteroátomos pueden estar unidos directamente en serie, que las
series no pueden contener enlaces -O-O-, que los
radicales cíclicos contienen 6 o menos miembros, y que la
ramificación se puede producir solamente en átomos de carbono, y un
reactivo marcado que es capaz de desplazar la unión del anticuerpo
hacia la vancomicina, preferiblemente el reactivo de marcado de la
Figura 8 donde Q es un radical detectable, y X es de 0 a 50 carbonos
y heteróatomos, incluyendo no más de 10 heteroátomos, ordenados en
forma de una cadena lineal o ramificada o de radical cíclico,
saturado o insaturado, con las condiciones de que no más de dos
heteroátomos pueden estar unidos directamente en serie, que la serie
no puede contener enlaces -O-O-, que los radicales
cíclicos contienen 6 o menos miembros, y que la ramificación puede
existir solamente sobre átomos de carbono, para formar una solución
de reacción; y
(b) medir la cantidad del reactivo marcado en la
solución de reacción que está o no está unido a un anticuerpo como
una función de la cantidad de vancomicina en la muestra de ensayo,
caracterizado porque en dicho método se emplea un calibrador estable
que comprende una solución acuosa que contiene una molécula de
vancomicina estabilizada con un polipéptido donde dicho polipéptido
no interfiere en la unión de un anticuerpo a la molécula de
vancomicina.
La invención proporciona adicionalmente el método
anterior donde se emplea la polarización de la fluorescencia.
Los anticuerpos utilizados en el método son
específicos para la vancomicina y no tienen esencialmente
reactividad cruzada con CDP-I y
CDP-II y son capaces de unirse a cualquier sitio no
peptídico de la vancomicina. Más específicamente, los anticuerpos no
compiten con los péptidos estabilizadores, específicamente
polipéptidos utilizados para estabilizar la vancomicina, por la
unión al sitio de unión del péptido de la vancomicina.
Los anticuerpos monoclonales producidos por la
línea celular de hibridoma denominada HB 11834 son los más
preferidos para la cuantificación de la vancomicina, muy
preferiblemente mediante polarización de la fluorescencia.
El método de la invención utiliza calibradores
estables para la cuantificación de la vancomicina. Los calibradores
están en solución acuosa y contienen una molécula de vancomicina
estabilizada con polipéptido. El polipéptido no interfiere en la
unión de un anticuerpo a la molécula de vancomicina.
Asimismo se proporcionan estuches útiles para la
cuantificación de la vancomicina en una muestra de ensayo que tiene
anticuerpos reactivos, reactivos marcados y calibradores estables
como se ha definido antes. Los estuches preferidos tienen
anticuerpos IgG monoclonales producidos a partir de un inmunógeno de
la Figura 5.
El archivo de esta patente contiene al menos un
dibujo ejecutado en color. Las copias de esta patente con el dibujo
o los dibujos en color serán proporcionadas por la Oficina de
Patentes y Marcas a petición y pago de la tasa correspondiente.
La Figura 1 muestra la estructura de la
vancomicina.
La Figura 2 muestra la estructura de uno de los
metabolitos principales de la vancomicina,
CDP-I.
La Figura 3 muestra la estructura de otro de los
metabolitos principales de la vancomicina,
CDP-II.
Las Figuras 4a a 4c ilustran una ruta sintética
representativa del acoplamiento de la vancomicina a la proteína
portadora.
Las Figuras 5a a 5d ilustran una ruta sintética
del acoplamiento de la vancomicina a tiroglobulina.
La Figura 6 muestra la estructura del inmunógeno
utilizado en la invención.
La Figura 7 muestra la estructura del inmunógeno
más preferido utilizado en la invención.
La Figura 8 muestra la estructura del reactivo
marcado preferido utilizado en la invención.
La Figura 9 muestra la estructura general del
reactivo marcado más preferido utilizado en la invención.
Las Figuras 10a y 10b ilustran la ruta sintética
para el acoplamiento de la vancomicina a la fluoresceína.
La Figura 11 muestra los resultados de una
correlación de un análisis comercial existente con un análisis en el
que se utiliza el anticuerpo más preferido descrito aquí.
La Figura 12 muestra la correlación de un
análisis descrito aquí con HPLC.
La Figura 13 muestra los resultados de un
inmunoanálisis de polarización de la fluorescencia descrito
aquí.
La Figura 14 muestra esquemas químicos para
sintetizar trazadores derivados de N-vancosaminilo,
derivados de N-metil leucilo y derivados de
carboxil-HDA.
La Figura 15 muestra un éster activo de biotina
(2), un éster activo de 6-carboxifluoresceína (3),
y una marca quimioluminiscente de acridinio (4). Estos compuestos se
utilizan en los diversos esquemas químicos mostrados en la Figura 14
para sintetizar trazadores derivados de
N-vancosamininilo y trazadores derivados de
carboxil-HDA.
La Figura 16 muestra las estructuras de análogos
de vancomicina y trazadores.
La Figura 17 muestra curvas competitivas de
disolución para la determinación de las constantes de disociación en
equilibrio para un trazador de descloro-vancomicina
del anillo 2 (representado por ^{*}) y de
carboxil-HDA-vancomicina biotinilado
(representado por º).
La Figura 18 muestra un modelo de la interacción
de unión entre la vancomicina y un análogo peptídico de la pared
celular, (N^{\alpha},
N^{\varepsilon}-diacetil)KAA. Las líneas
discontinuas representan enlaces de hidrógeno.
La Figura 19 muestra la unión de vancomicina,
fragmento Fab anti-vancomicina, y del complejo
vancomicina/fragmento Fab anti-vancomicina a la
superficie del biosensor tripeptídico
(N^{\varepsilon}-acetil)KAA transformado
con aminocaproato.
La Figura 20 muestra las regiones de la
vancomicina en las que se unen los anticuerpos descritos aquí.
Específicamente, los anticuerpos se unen a las regiones mostradas en
negro, rojo y verde. No obstante, los anticuerpos no se unen a la
región de unión del péptido que se muestra en azul.
La Figura 21 muestra los marcadores
quimioluminiscentes,
vancomicinil-N-metil leucil
acridinio.
Según se utiliza en esta memoria y en las
reivindicaciones adjuntas, las siguientes palabras tendrán estos
significados respectivos:
"Heteroátomo" representa nitrógeno, oxígeno,
azufre y fósforo.
"CHCl_{3}" representa cloroformo,
"CDCl_{3}" representa deuterocloroformo, "MeOH"
representa metanol, "DMF" representa dimetilformamida,
"CH_{2}Cl_{2}" representa cloruro de metileno,
"Et_{2}O" representa éter dietílico y "DMSO" representa
dimetilsulfóxido.
"Radical de unión", "traba",
"espaciador", "brazo espaciador", y "ligador" se
utilizan indistintamente y se pretende que definan cualquier entidad
química unida covalentemente que separe una sustancia definida (tal
como un hapteno) de una segunda sustancia definida (tal como un
portador inmunogénico o un radical detectable).
"Estable" hace referencia a la
transformación de vancomicina en sus productos de degradación,
CDP-I y CDP-II en un entorno acuoso
como una función del tiempo. Como se describe aquí, los calibradores
utilizados en los métodos de la presente invención son estables
durante no menos de dos (2) meses.
"Esencialmente sin reactividad cruzada con
CDP-I y CDP-II" representa que la
reactividad cruzada de los anticuerpos descritos aquí con los
metabolitos, CDP-I y CDP-II está por
debajo de la sensibilidad de un análisis para la vancomicina, como
se ilustra aquí en la Tabla 3.
"Sitio no peptídico" hace referencia a
cualquier sitio de la molécula de vancomicina distinto del sitio de
unión al péptido.
La presente invención proporciona métodos que
emplean anticuerpos preparados a partir de inmunógenos, reactivos
marcados y calibradores estables que son adecuados para su uso en la
cuantificación de la vancomicina. La cuantificación específica de la
vancomicina se logra poniendo en contacto primero una muestra de
ensayo con un reactivo marcado (también referido aquí como trazador)
y un anticuerpo reactivo o bien simultáneamente o bien sucesivamente
en cualquier orden, y midiendo después la cantidad de reactivo
marcado que ha participado o no en la reacción de unión con el
anticuerpo reactivo como una función de la cantidad de vancomicina
en la muestra de ensayo. Los anticuerpos y los reactivos marcados
descritos aquí son especialmente útiles en los inmunoanálisis de
polarización de la fluorescencia (FPIA) para la cuantificación
específica de la vancomicina.
Según una realización preferida de la presente
invención, el reactivo marcado y los anticuerpos reactivos se
utilizan en un inmunoanálisis de polarización de la fluorescencia
que combina la especificidad con la velocidad y la conveniencia de
los métodos homogéneos para proporcionar una cuantificación fiable
de la vancomicina y la evitación de interferencias de los
metabolitos principales de la vancomicina, CDP-I y
CDP-II.
La muestra de ensayo puede ser cualquier líquido
corporal natural, o un extracto o dilución del mismo, y entre ellos
se incluyen, pero no se pretende que estén limitados a, sangre
completa, suero, plasma, orina, heces, saliva, fluido
cerebroespinal, tejido cerebral, y similares.
Como es sabido por los expertos normales en la
técnica, cuando se preparan anticuerpos específicos y haptenos
marcados complementarios se necesita tener en cuenta la estructura
química tanto del inmunógeno utilizado para lograr la respuesta del
anticuerpo como del hapteno marcado. Tradicionalmente, se ancla el
hapteno a la proteína portadora a través de un sitio del hapteno que
está lejos de los rasgos únicos del hapteno que son críticos para
lograr anticuerpos selectivos. Del mismo modo, cuando se prepara un
hapteno marcado capaz de unirse a tales anticuerpos, se acostumbra a
anclar la marca a través del mismo sitio del hapteno empleado para
conectar la proteína portadora al hapteno. Una razón que apoya
semejante enfoque es que la proteína portadora puede bloquear
estéricamente el acceso del sistema inmune a esa parte del hapteno.
El hapteno marcado complementario es sintetizado anclando su marca
al mismo sitio del hapteno que utiliza el inmunógeno para el anclaje
de su proteína portadora, de manera que no interfiera en la unión
del anticuerpo a los rasgos críticos del hapteno.
Por lo tanto, se descubrió sorprendente e
inesperadamente que los inmunógenos de vancomicina que derivan de
diferentes sitios de anclaje en la vancomicina, conducen al
desarrollo de anticuerpos específicos para la vancomicina y de un
análisis que muestra un excelente perfil de reactividad cruzada para
los principales metabolitos de la vancomicina. Entre los
descubrimientos más sorprendentes se encuentra que, basándose en los
límites de la sensibilidad del análisis, el anticuerpo monoclonal
secretado por HB 11834 no muestra esencialmente reactividad cruzada
con CDP, específicamente, CDP-I y
CDP-II. Además, también fue sorprendente descubrir
que este anticuerpo monoclonal no se une al sitio de unión
peptídico. Esto da como resultado un análisis mejorado para la
cuantificación de vancomicina y permite el uso de calibradores y
controles estables.
Los anticuerpos utilizados en la presente
invención, tanto policlonales como monoclonales, son producidos con
inmunógenos preparados a partir de una molécula de vancomicina que
está conjugada con la proteína portadora por medio del ácido
carboxílico terminal de la vancomicina como se muestra en la fórmula
general de la Figura 6 donde P es un material portador inmunogénico
y X es un radical de unión.
En los inmunógenos, X es un radical de unión que
consta de 0 a 50 carbonos y heteroátomos, incluyendo no más de diez
heteroátomos, dispuestos en una cadena lineal o ramificada o un
radical cíclico, saturado o insaturado, con las condiciones de que
no más de dos heteroátomos pueden estar unidos directamente, que los
radicales cíclicos contienen seis o menos miembros, y que la
ramificación se produce solamente en los átomos de carbono.
Como podría entender un experto en la técnica, el
material portador inmunogénico P, puede ser seleccionado entre
cualquiera de los conocidos convencionalmente. En la mayoría de los
casos, P será una proteína o polipéptido, aunque también se pueden
emplear otros materiales tales como carbohidratos, polisacáridos,
lipopolisacáridos, poli(amino)ácidos, ácidos nucleicos, y
similares, de tamaño e inmunogenicidad suficientes. Preferiblemente,
el material portador inmunogénico es una proteína tal como
seralbúmina bovina (BSA), hemocianina de lapa ojo de cerradura
(KLH), tiroglobulina, y similares.
En el inmunógeno preferido, P es tiroglobulina y
X es -NH(CH_{2})_{3}C(=O)-. El inmunógeno más
preferido se muestra en la Figura 7. Sin embargo, el compuesto de la
Figura 7 no está limitado a un único producto conjugado de
vancomicina y el portador inmunogénico, como observará un experto en
la técnica. En vez de eso, la proporción de derivado de vancomicina
a portador inmunogénico se define por el número de grupos
funcionales asequibles químicamente del portador inmunogénico P y
está controlada por la proporción de los dos materiales en la
síntesis. El grado de sustitución de P por el derivado de
vancomicina puede variar entre el 1 y el 100% de los grupos
funcionales asequibles del portador inmunogénico. El nivel de
sustitución está preferiblemente entre el 10% y el 95%, y muy
preferiblemente entre el 15% y el 85%.
Como se ha establecido antes, el producto
conjugado inmunogénico se preparar acoplando la vancomicina a un
material portador por medio del ácido carboxílico terminal de la
vancomicina. Como se muestra en las Figuras 4a a 4c, la vancomicina
es acoplada según los métodos conocidos por los expertos en la
técnica con un compuesto bifuncional denominado
V-X-Y donde X es un radical de unión
y V- e Y- son grupos funcionales uno de los cuales puede reaccionar
con el carboxilato de vancomicina (I) y el otro con grupos
funcionales asequibles comercialmente de P. Se conocen en la técnica
muchos ligadores bifuncionales. Por ejemplo, se describen ligadores
heterobifuncionales v.g. en la Patente de los Estados Unidos
5.003.883 de Bieniarz, y col. Los ligadores heterobifuncionales
pueden ser preferidos en algunos casos debido a la especificidad de
sus extremos por un grupo funcional u otro. Del mismo modo, por
conveniencia en la síntesis del inmunógeno, los grupos funcionales
V- e Y- pueden ser protegidos, y desprotegidos en el momento
deseado, siguiendo mecanismos bien conocidos, o fácilmente
adquiridos por los expertos en la técnica (ver, v.g., T.W. Greene y
P.G.M. Wutts, "Protective Groups in Organic Synthesis 2ª Ed."
1991, John Wiley and Sons).
Generalmente, en la preparación de los
inmunógenos, V se selecciona del grupo formado por -OH, -halo (-Cl,
-Br, -I), -SH, o -NHR'-, donde R' se selecciona entre H, alquilo,
arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido. Y puede ser
seleccionado del grupo formado por carboxi (-C(=O)OH), amino
(-NH_{2}), aldehído (-CH(=O)), o azido (-N_{3}). Como se ha
establecido antes, X es un radical conector de 0 a 50 carbonos y
heteroátomos, incluyendo no más de diez heteroátomos, dispuestos en
una cadena lineal o ramificada o un radical cíclico, saturado o
insaturado, con las condiciones de que no más de dos heteroátomos
pueden estar unidos directamente, que la secuencia
V-X-Y no puede contener enlaces
-O-O-, los radicales cíclicos contienen seis o menos
miembros, y la ramificación se produce solamente en los átomos de
carbono.
Haciendo referencia ahora al esquema sintético
representativo mostrado en las Figuras 4a a 4c, la reacción de la
vancomicina (ver Figura 4a) con
V-X-Y produce un compuesto
intermedio trabado (Figura 4b) que tiene un radical conector X con
un grupo funcional Y. El grupo funcional -Y, se puede hacer
reaccionar de cualquiera de las muchas maneras conocidas por los
expertos en la técnica, con los grupos funcionales de un portador
inmunogénico. Es preferible formar enlaces amida, que típicamente
son bastante estables. Los enlaces amida se forman activando primero
el radical ácido carboxílico [Y=(-C(=O)OH)] del brazo
espaciador mediante reacción con un reactivo activador tal como
1,3-diciclohexilcarbodiimida y un aditivo tal como
N-hidroxisuccinimida. La forma activada (ver la
Figura 4b) se hace reaccionar después con una solución tamponada
conteniendo los materiales portadores inmunogénicos.
Alternativamente, el grupo ácido carboxílico puede ser convertido,
con o sin aislamiento, en un anhídrido mixto altamente reactivo, un
haluro de acilo, una acilimidazolida, o un carbonato mixto y después
combinado con los materiales portadores inmunogénicos. Como resulta
fácilmente evidente para un experto normal en la técnica, existen
muchos reactivos que pueden ser utilizados para formar enlaces amida
distintos de los enumerados antes y tales reactivos no necesitan una
mención especial.
Alternativamente, un brazo espaciador con una
funcionalidad amina terminal (Y=-NH_{2}) puede ser transformado en
un N-hidroxisuccinimido-uretano
altamente reactivo por reacción con carbonato de
N,N'-disuccinimidilo en un disolvente adecuado, tal
como acetonitrilo o dimetilformamida. El uretano resultante se hace
reaccionar después con los materiales portadores inmunogénicos en
una solución acuosa, tamponada para proporcionar un inmunógeno.
Adicionalmente, se puede acoplar un brazo
espaciador con una funcionalidad aldehído terminal [Y = -CH(=O)] a
los materiales portadores inmunogénicos en una solución acuosa,
tamponada y en presencia de cianoborohidruro de sodio, mediante
aminación reductiva según los métodos conocidos por los expertos en
la técnica.
Alternativamente, los brazos espaciadores que
contienen un grupo alcohol [Y = -OH] pueden ser acoplados a los
materiales portadores inmunogénicos haciéndolos reaccionar primero
con fosgeno o un equivalente a fosgeno, tal como di- o trifosgeno o
carbonildiimidazol, dando como resultado la formación de un
cloroformiato altamente reactivo o un derivado formiato de imidazol
(normalmente sin aislamiento). El éster formiato activo resultante
se hace reaccionar después con los materiales portadores
inmunogénicos en una solución acuosa, tamponada.
Alternativamente, cuando Y = -N_{3}, el
intermedio trabado puede ser acoplado al portador inmunogénico
mediante fotolisis en solución acuosa tamponada.
El inmunógeno preferido de la Figura 6 es
preparado de ese modo según el esquema de las Figuras 5a a 5d. El
grupo carboxilo de la vancomicina (ver la Figura 5a) es activado con
diciclohexilcarbodiimida y N-hidroxibenzotriazol
(HOBT). La reacción adicional con el ligador, éster metílico de
ácido 4-aminobutírico [V = -NH_{2}, X =
-(CH_{2})_{3}-, Y = -CO_{2}H] que tras la hidrólisis da
el intermedio trabado [X = -(CH_{2})_{3}-, Y =
-CO_{2}H]. Y es activado después con
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(EDAC) y acoplado a P. Los expertos en la técnica reconocerán que se
podrían emplear otros métodos para la formación de enlaces
peptídicos con el mismo éxito.
Así, de la manera recién descrita, la vancomicina
puede ser acoplada, por medio de este y otros sitios reactivos de la
molécula tales como aminas y alcoholes, a materiales portadores
inmunogénicos mediante diversos mecanismos convencionales conocidos
en la técnica donde P es un material portador inmunogénico como se
ha descrito previamente.
Además, de una manera análoga a la conexión de
los haptenos a los materiales portadores, los brazos espaciadores
pueden ser conjugados con soportes sólidos que tengan grupos
funcionales tales como grupos amino, hidroxilo o carboxilo que sean
reactivos en un sentido complementario con los grupos reactivos del
brazo espaciador. El resultado es una fase sólida que puede ser
utilizada para separar o purificar anticuerpos frente al hapteno.
Tales mecanismos de acoplamiento también son bien conocidos en la
técnica.
Los inmunógenos descritos aquí pueden ser
utilizados para preparar anticuerpos, tanto policlonales como
monoclonales, según los métodos bien conocidos en la técnica.
Generalmente, se inyecta a un animal huésped, tal como un conejo,
cabra, ratón, cobaya, o caballo el inmunógeno en uno o más de una
variedad de sitios, normalmente mezclado con un coadyuvante. Se
realizan inyecciones adicionales en los mismos sitios o sitios
diferentes a intervalos regulares o irregulares después de eso
realizándose extracciones de sangre para evaluar el título de
anticuerpo hasta que se determine que se ha alcanzado el título
óptimo. Los anticuerpos son obtenidos o bien extrayendo sangre del
animal huésped para rendir un volumen de antisuero, o mediante
mecanismos de hibridación celular somática u otros mecanismos
conocidos en la técnica para obtener anticuerpos monoclonales, y
pueden ser almacenados, por ejemplo, a -20ºC. Además de
inmunoglobulinas intactas, el término anticuerpo utilizado aquí,
incluye fragmentos de inmunoglobulinas de unión a antígenos que
pueden ser producidos mediante métodos conocidos, v.g., Fab,
F(ab')_{2} y
Fv.
Fv.
Se debe observar que la reposición del anticuerpo
asequible comercialmente por el anticuerpo preferido descrito aquí
solo mejora el funcionamiento del análisis de vancomicina.
Asimismo se debe observar que en el método
preferido de la invención se utilizan anticuerpos que no se unen a
metabolitos que no se pretende que sean detectados, hasta el punto
de que tal unión interfiera en la exactitud del análisis,
específicamente, los metabolitos, CDP-I y
CDP-II.
Los anticuerpos producidos por el inmunógeno
descrito aquí son específicos para la vancomicina y no muestran
esencialmente reactividad cruzada con los metabolitos,
CDP-I y CDP-II.
Además, los anticuerpos descritos aquí se unen a
cualquier sitio no específico de la molécula de vancomicina. El
sitio de unión peptídico de la vancomicina, donde no se unen los
anticuerpos descritos aquí, se muestra en azul en la Figura 20. Los
sitios no peptídicos de la molécula de vancomicina donde se unen los
anticuerpos descritos aquí se muestran en negro, rojo y verde en la
Figura 20. Preferiblemente, los anticuerpos descritos aquí se unen a
los dos radicales azúcar (mostrados en rojo) en la Figura 20 y al
fenilo clorado (mostrado en verde) en la Figura 20.
Debido a que los anticuerpos descritos aquí no se
unen al sitio de unión peptídico de la vancomicina, el sitio de
unión peptídico de la vancomicina se reserva para la unión de los
péptidos estabilizadores. La unión de péptidos al sitio de unión
peptídico permite la estabilización de la vancomicina en soluciones
acuosas. Los péptidos que pueden ser utilizados para estabilizar la
vancomicina son aquellos polipéptidos que son conocidos por tener
afinidad de unión para la vancomicina. Los polipéptidos preferidos
son aquellos que contienen al menos 3 restos aminoácido y contienen
el siguiente fragmento en su estructura: \alpha,
\varepsilon-DiAc.L-lys.D-ala.D-ala.
Los anticuerpos descritos aquí, debido a su
afinidad de unión a sitios distintos del sitio de unión peptídico de
la molécula de vancomicina, pueden ser utilizados para construir
calibradores de vancomicina y controles que se utilizan en análisis
de la presente invención para medir la concentración de vancomicina.
Los calibradores y controles utilizados en la presente invención
están en solución acuosa y contienen una molécula de vancomicina
estabilizada con polipéptido. Uno o más de los polipéptidos
descritos antes pueden ser utilizados para estabilizar la molécula
de vancomicina. Los polipéptidos utilizados para estabilizar la
molécula de vancomicina no interfieren en la unión de un anticuerpo
a la molécula de vancomicina. Los calibradores utilizados en la
presente invención son estables durante al menos dos meses,
preferiblemente seis meses, y muy preferiblemente durante más de un
año.
Como se ha observado antes, el reactivo de
vancomicina descrito aquí se prepara por anclaje de la marca al
amino secundario terminal de la vancomicina, esto es, una posición
que difiere de la posición a la cual se ancla la proteína
portadora.
Los reactivos marcados descritos aquí para la
vancomicina tienen la fórmula general mostrada en la Figura 8 donde
Q es un radical detectable, tal como un radical quimioluminiscente o
fluorescente; y X es un radical de unión. En el reactivo marcado
preferido, Q es un derivado de fluoresceína seleccionado del grupo
formado por 4'-aminometilfluoresceína,
5-aminometilfluoresceína,
6-aminometilfluoresceína,
6-carboxifluoresceína,
5-carboxifluoresceína, 5- y
6-aminofluoresceína, tioureafluoresceína, y
metoxitriazinilaminofluoresceína, o un radical quimioluminiscente
tal como vancomicin-N-metil
leucil-acridinio; y X es preferiblemente un radical
de unión que consta de 0 a 50 carbonos y heteroátomos, incluyendo no
más de diez heteroátomos, dispuestos en una cadena lineal o
ramificada o un radical cíclico, saturado o insaturado, con las
condiciones de que no más de dos heteroátomos pueden estar unidos
directamente, que los radicales cíclicos contienen 6 o menos
miembros, y que la ramificación se puede producir solamente en los
átomos de carbono. En el reactivo marcado más preferido, Q es
clorotriazinilaminofluoresceína y X=0, es decir, el derivado de
vancomicina se ancla directamente al derivado de fluoresceína. El
reactivo marcado preferido para su uso en la invención tiene la
estructura mostrada en la Figura 9.
De una manera análoga a la síntesis del producto
conjugado inmunogénico, los reactivos marcados descritos aquí son
sintetizados a partir de vancomicina protegiendo primero
diferencialmente el grupo amino primario (ver, T.W. Greene y P.G.M.
Wutts, "Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª Ed." 1991,
John Wiley and Sons) seguido de la reacción selectiva del grupo
amino secundario con el radical detectable.
Más específicamente, el reactivo marcado
preferido puede ser sintetizado como se muestra en las Figuras 10a y
10b (i) haciendo reaccionar la base de vancomicina con HCl diluido a
pH 6,0 para proteger el grupo amino primario en forma de nitrógeno
cuaternarizado (ii) haciéndolo reaccionar después con
diclorotriazinilamino-fluoresceína (DTAF) para dar
el reactivo marcado.
En su aspecto más preferido, los métodos
sintéticos anteriores se utilizan para producir los reactivos
marcados de la Figura 9.
Siguiendo un formato de inmunoanálisis por
polarización de la fluorescencia (FPIA) empleando los reactivos
descritos aquí, la concentración, o nivel, de vancomicina en una
muestra de ensayo puede ser cuantificada exactamente. Para realizar
un FPIA para la cuantificación específica de la vancomicina, se
generan las curvas de calibración a partir de los calibradores que
tienen una concentración de vancomicina conocida.
Generalmente, los mecanismos de polarización de
la fluorescencia se basan en el principio de que un trazador
fluorescente, cuando es excitado por luz polarizada plana de una
longitud de onda característica, emitirá luz de otra longitud de
onda característica (es decir, fluorescencia) que conserva un grado
de polarización relativo con respecto a la luz estimulante incidente
que está inversamente relacionada con la velocidad de rotación del
trazador en un medio dado. Como consecuencia de esta propiedad, una
sustancia trazadora con una rotación limitada, por ejemplo en una
fase en solución viscosa o cuando se une a otro componente de la
solución con una velocidad de rotación relativamente más baja,
conservará un grado relativamente mayor de polarización de la luz
emitida que si estuviera en una solución libre. Por lo tanto, en el
marco temporal en el que el ligando y el trazador compiten por la
unión al anticuerpo, la velocidad de unión al trazador y el ligando
deben rendir una proporción apropiada de trazador libre y unido
conservando importantes parámetros de funcionamiento tales como la
selectividad, la sensibilidad, y la precisión.
Cuando se realiza un inmunoanálisis de
polarización de la fluorescencia para la cuantificación específica
de la vancomicina según la presente invención, se pone en contacto
una muestra que se sospecha que contiene vancomicina con un
antisuero o anticuerpos monoclonales preparados con los inmunógenos
descritos aquí, en presencia del reactivo marcado descrito aquí. La
luz polarizada plana se hace pasar después a través de la solución
para obtener una respuesta de polarización de la fluorescencia y la
respuesta es detectada como una medida de la cantidad de vancomicina
presente en la muestra de ensayo.
Los análisis de polarización de la fluorescencia
pueden ser realizados en aparatos automatizados asequibles
comercialmente (v.g., AxSYM®, TDX®, y TDXFLX®, Abbott
Laboratories).
Según la presente invención, en el método de
análisis se emplea un calibrador estable que comprende una solución
acuosa que contiene una molécula de vancomicina estabilizada con
polipéptido donde dicho polipéptido no interfiere en la unión de un
anticuerpo a la molécula de vancomicina.
Según la presente invención, se ha descubierto
inesperada y sorprendentemente que se obtienen resultados del
inmunoanálisis de polarización de la fluorescencia superiores para
la cuantificación de la vancomicina cuando se emplea un anticuerpo
derivado del inmunógeno mostrado en la Figura 6 con el reactivo
marcado con fluorescencia mostrado en la Figura 8.
En particular, se encontró inesperada y
sorprendentemente que el uso del reactivo marcado de la Figura 9
combinado con un anticuerpo monoclonal producido en respuesta al
inmunógeno de la Figura 7, daba como resultado un análisis que
muestra una reactividad cruzada muy baja (esencialmente nula, por
debajo de los límites de la sensibilidad del análisis) con los
metabolitos principales de la vancomicina, CDP-I y
CDP-II. Es muy preferido el método de polarización
de la fluorescencia que emplea un anticuerpo IgG monoclonal
producido por el hibridoma denominado ATCC HB 11834.
La cantidad de trazador unido al anticuerpo varía
inversamente a la cantidad de vancomicina presente en la muestra de
análisis. Por consiguiente, las afinidades de unión relativas de la
vancomicina y el trazador al sitio de unión del anticuerpo, son
parámetros importantes del sistema de análisis.
Además de los inmunoanálisis de polarización de
la fluorescencia, se pueden seguir otros formatos de inmunoanálisis
diferentes según la presente invención. Generalmente, tales sistemas
de inmunoanálisis dependen de la capacidad de una inmunoglobulina,
es decir, un anticuerpo completo o un fragmento del mismo, para
unirse a un analito específico de una muestra de ensayo donde se
emplea un reactivo marcado o detectable para determinar el grado de
unión. Entre tales marcas detectables se incluyen, pero no están
limitadas a, enzimas, radiomarcas, biotina, toxinas, fármacos,
haptenos, ADN, ARN, liposomas, cromóforos, agentes
quimioluminiscentes tales como, pero no limitados a aquellos
mostrados en la Figura 21, partículas coloreadas y micropartículas
coloreadas, y compuestos fluorescentes tales como los descritos
antes.
Típicamente, el grado de unión en semejantes
formatos del sistema de inmunoanálisis se determina mediante la
cantidad de radical detectable en el reactivo marcado que ha
participado o no en una reacción de unión con el analito y requiere
que la cantidad del radical detectada y medida se puede
correlacionar con la cantidad de analito presente en la muestra de
ensayo. Por ejemplo, en un sistema de inmunoanálisis competitivo, la
sustancia que está siendo medida (a menudo referida como ligando)
compite con una sustancia de íntima similitud estructural con la del
ligando y que está acoplada a un radical detectable (a menudo
referido como trazador) para un número limitado de sitios de unión
de anticuerpos específicos para la porción o porciones del ligando y
el trazador con similitud estructural.
En un estuche de ensayo según la presente
invención se incluyen los reactivos necesarios para realizar un
inmunoanálisis deseado para la cuantificación de la vancomicina de
una muestra de ensayo. El estuche de ensayo puede ser presentado en
una forma empaquetada comercialmente como una combinación de uno o
más recipientes que contienen los reactivos necesarios, y/o como una
composición o mezcla donde se permitirá la compatibilidad de los
reactivos. Preferiblemente, en un estuche de ensayo se incluyen
todos los reactivos, patrones, tampones, diluyentes, etc. que son
necesarios para realizar el análisis.
Es particularmente preferido un estuche de ensayo
para la cuantificación mediante inmunoanálisis de polarización de la
fluorescencia de la vancomicina de una muestra de ensayo, que
incluye compuestos trazadores fluorescentes, anticuerpos y
calibradores estables como se ha descrito antes para la
cuantificación de la vancomicina. Se debe entender que el estuche de
ensayo puede incluir, por supuesto, otros materiales conocidos en la
técnica y que puedan ser deseables desde el punto de vista del
usuario, tales como soluciones de pretratamiento de la muestra,
tampones, diluyentes, patrones, y similares.
Se recoge en un matraz de fondo redondo de 200 ml
ácido 4-aminobutírico (5,00 g, 48,5 mmoles). Se
añade al matraz dimetoxipropano (80 ml, 65 mmoles) con agitación. Se
añade ácido clorhídrico concentrado (15 ml) a la reacción y se agita
a la temperatura ambiente durante la noche. Los disolventes se
separan a presión reducida en un evaporador giratorio sin
calentamiento. El sólido de disuelve en una cantidad mínima de MeOH
y se vuelve a precipitar con éter. El sólido precipitado se filtra
mediante succión y se lava con Et2O (2 x 50 ml). El sólido
(rendimiento: 6,9 g (96%)) se seca después a vacío.
RMN H^{1} de la amina libre (CDCl_{3}): 2,1
(quintete, 2H), 2,5 (triplete, 2H), 3,2 (triplete ancho, 2H), 3,7
(singlete, 3H), 8,1 (singlete, 2H).
Se recoge la base de vancomicina (500 mg, 0,34
mmoles) en un matraz de fondo redondo de 25 ml. Se añade DMSO (4 ml)
y se agita con calentamiento según se necesite, hasta que resulte
una solución clara. Se añade
metil-4-aminobutirato\cdotHCl del
Ejemplo 1(a) (506 mg, 3,4 mmoles) a la reacción seguido de
hidroxibenzotriazol (105 mg, 0,69 mmoles) y trietilamina (0,0976 ml,
0,69 mmoles). La reacción se agita a la temperatura ambiente durante
3 a 7 días en N_{2}. La reacción se sigue mediante HPLC. Una vez
que el material de partida se ha consumido, el sólido precipitado se
separa por filtración y el producto filtrado se purifica mediante
HPLC en fase reversa utilizando una columna C-18
como se describe más abajo. Las fracciones recogidas se liofilizan
(rendimiento: 310 mg).
Las condiciones de la HPLC analítica son las
siguientes: la columna es C-18 de 7,8 x 300 mm
(Bondapak C-18, Waters, Melborough, MA) con una fase
móvil en gradiente continuo de acetonitrilo:acetato de amonio (50
mM) (acetonitrilo al 10% a acetonitrilo al 50% desarrollado a lo
largo de 15 minutos) a una velocidad de flujo de 3,0 ml/minuto. La
detección es a 254 nm.
Las condiciones de la HPLC preparativa son las
siguientes: la columna es C-18 de 19 x 250 mm
(Dynamax 60A C-18, Rainin, Woburn, MA) con una fase
móvil en gradiente continuo de acetonitrilo:acetato de amonio (50
mM) (acetonitrilo al 10% a acetonitrilo al 50% desarrollado a lo
largo de 15 minutos) a una velocidad de flujo de 8,0 ml/minuto. La
detección es a 254 nm.
Espectrometría de masas (MS): Ionización por
Rociado de Electrones (ESI) MH^{+} 1547, (MH_{2})^{2+}
774.
Se disuelve el derivado de
vancomicina-aminobutirato del Ejemplo 1(b)
(165 mg, 0,1 mmoles) en DMF/Agua (2 ml:3 ml) en un matraz de fondo
redondo de 25 ml. El matraz se enfría a 0ºC y se añade LiOH y se
agita durante 2 horas y se templa a la temperatura ambiente y se
sigue mediante HPLC. Una vez que el material de partida se ha
consumido la reacción se purifica directamente mediante HPLC
utilizando una columna en fase reversa. El disolvente se liofiliza
para dar el producto (rendimiento: 160 mg). Tanto la HPLC analítica
como preparativa son como se ha establecido antes.
Espectrometría de Masas (MS): ESI MS da
(MH^{+}) a 1533 indicando el peso molecular correcto del ligador
hidrolizado anclado a la vancomicina.
Se disuelve tiroglobulina (100 mg, 0,0002 mmoles)
en tampón fosfato de sodio monobásico (5 ml, pH ajustado a 6,7 con
NaOH diluido). Se añade el hapteno de vancomicina del Ejemplo
1(c) (50 mg, 0,0321 mmoles) seguido de EDAC (9,2 mg, 0,0482
mmoles). La reacción resultante se agita durante 2 días a la
temperatura ambiente. Los contenidos se transfieren a una membrana y
se someten a diálisis con tampón Na_{2}HPO_{4} 0,1 M (monobásico
pH 7,8 ajustado con NaOH) durante 2 días cambiando el disolvente
cada 4 horas. Los contenidos de la bolsa de diálisis son
liofilizados para rendir 130 mg del inmunógeno deseado.
Un ratón hembra RBF/DnJ, de 6-8
semanas de edad, hembra (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) se
inmuniza con el inmunógeno de vancomicina del Ejemplo 1 emulsionado
con coadyuvante de Freund (Difco, Detroit, MI). La inmunización
primaria se administra con Coadyuvante de Freund Completo y
posteriores refuerzos con Coadyuvante de Freund Incompleto. El
intervalo de refuerzo del animal para este animal inmunizado a largo
plazo es a las 1, 3, 5, 12, 17 y 24 semanas con niveles de
dosificación respectivos de 25, 12,5, 12,5, 10, 10 y 10 \mug por
animal en un sitio subcutáneo y un sitio intraperitoneal para los
tres primeros refuerzos y en dos sitios subcutáneos para cada uno de
los tres últimos refuerzos. Periódicamente, se toman muestras de
sangre para confirmar que se está desarrollando una respuesta de
anticuerpos. Se deja que el animal descanse un período de 7 semanas
antes de administrar un refuerzo de 10 \mug en el bazo 3 días
antes de la fusión.
El día de la fusión, el ratón es sometido a
eutanasia mediante una rápida dislocación cervical y el bazo es
separado. Los esplenocitos se lavan una vez en Medio de Dulbecco
Modificado de Iscove (IMDM) (Gibco, Grand Island, Nueva York) y se
centrifugan a 1.000 rpm durante 10 minutos. Los esplenocitos
sedimentados se combinan con células de mieloma SP2/0 (Dr. Milstein,
Cambridge, UK) a una razón 1:1, se lavan en IMDM, y se centrifugan.
El sobrenadante se separa y se añade 1 ml de polietilenglicol al 50%
(PEG; American Type Tissue Culture Collection, Rockville, MD) al
sedimento durante 1 minuto a medida que el sedimento es resuspendido
en IMDM conteniendo hipoxantina, aminopterina, timidina (HAT Gibco)
y Suero Bovino Fetal al 15% (FBS; Hyclone Labs, Logan, Utah). Para
intensificar la frecuencia de fusión, se añaden mitógeno de
Salmonella typhimurium al 0,5% v/v (STM; RIBI Immunochem
Research, Inc., Hamilton, Montana) y ORIGEN al 1% v/v (Igen,
Rockville, MD) a la suspensión de células en fusión y se cultivan en
placa en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos.
El rastreo primario de la fusión se produjo en
cultivos confluyentes el día 10. Se utiliza un análisis comercial
(TDX®; Abbott Laboratories) para detectar la reactividad
anti-vancomicina en las muestras de sobrenadante. El
sobrenadante del cultivo de tejidos se carga por duplicado en el
pocillo de la muestra y se cargan 10 \mul de calibrador A (0
\mug/ml de vancomicina) o de calibrador F (100 \mug/ml de
vancomicina) del estuche de calibradores comercial en el pocillo
antes de diluir. El tampón diluyente se coloca en los tarros S y P
del envase comercial y el trazador comercial se utiliza en el tarros
T. Debido a que los sobrenadantes del cultivo de hibridoma están muy
diluidos, el volumen de la muestra se incrementa a 90 \mul. La
polarización de las muestras se mide y sólo un híbrido
15-109, es identificado como específico para la
vancomicina como se mide mediante el descenso de la polarización en
presencia del calibrador H (Ver la Tabla 1). Esto es debido a la
vancomicina que se une al anticuerpo y bloquea la unión del
trazador, ocasionando de ese modo un descenso de la señal.
El híbrido 15-109 es clonado
mediante diluciones limitantes de 1-100 a
1-100.000. El medio de clonación es IMDA con FBS al
10% v/v y HT Supplement al 1% v/v (Gibco). Se añade una suspensión
celular de 200 \mul a cada pocillo de una placa de cultivo de
tejidos de 96 pocillos.
El híbrido, denominado ahora
15-109-133, se selecciona para la
evaluación adicional basada en el rastreo adicional del sobrenadante
de clones de los cultivos confluyentes.
El híbrido del anticuerpo monoclonal
15-109-133 se concentra primero 10
veces utilizando un sistema de filtración Amicon. Después, el
anticuerpo materia prima (el anticuerpo todavía está en el suero
bovino fetal) se corta utilizando sulfato de amonio saturado (50%).
Luego la solución se centrifuga a 4.000 rpm (revoluciones por
minuto) y se descarta el sobrenadante. El sedimento se resuspende en
PBS (pH 7,4) a un volumen de 1/10 el volumen original después de la
concentración. La solución de anticuerpo se somete después a
diálisis en PBS (pH 7,4) y tras la diálisis se diluye utilizando el
tampón comercial (tampón fosfato, azida, y gammaglobulina bovina)
como sigue: puro, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, y 1:32. Las muestras se hacen
circular por duplicado en el pocillo de la muestra utilizando un
volumen de muestra de 10 (100 \mul) en lugar de 2 (20 \mul)
utilizando el mismo análisis de vancomicina Modo 1 comentado antes.
El aparato calcula los mP (valores de milipolarización) como se ha
descrito antes y la dilución de anticuerpo que genera el mP más
elevado se elige como la dilución de anticuerpo a utilizar en el
tarro S (tarro de anticuerpo) del estuche de reactivos. El
anticuerpo se diluye en tampón fosfato incluyendo glicerol al 10% y
BSA al 5%. El tarro de trazador contiene el trazador existente en el
mercado re-purificado mediante HPLC y diluido en un
tampón Tris (Más SDS al 0,7% y LDS al 0,5%). Este trazador
purificado se diluye a 1,7 \mug/ml en el tarro de trazador. El
"popper" consta de sulfato de cobre 20 mM y
5-SSA al 2,5%. Este envase de reactivo se carga en
el aparato con la vancomicina (analito) a 0, 5, 10, 25, 50 y 100
\mug/ml a medida que los calibradores circulan por duplicado junto
con los controles a 7, 35, y 75 \mug/ml. Se utiliza el análisis 16
con un pipeteo en Modo 1 sobre el aparato y se calibra una curva
patrón y se almacena. Se hacen circular las muestras de
CDP-I a diversas concentraciones para asegurarse de
que no existe reactividad cruzada con CDP-I.
Basándose en rastreos adicionales, se selecciona
para la consigna un clon, ahora denominado
15-109-592.
El isotipo del anticuerpo monoclonal secretado a
partir la línea celular identificada como
15-109-592 fue determinado en un
estuche para el isotipaje de anticuerpos (Mouse Monoclonal, Southern
Biotech, #5080-05, Birmingham, Alabama). El análisis
se realiza según las recomendaciones del vendedor y los resultados
indican un isotipo de IgG1, cadena ligera kappa.
Según el Tratado de Budapest, la línea celular de
hibridoma, denominada híbrido
15-109-592, es consignada en la
American Type Culture Collection (ATCC), 12301Parklawn Drive,
Rockville, Maryland, 20852, Estados Unidos de América. La fecha de
la consigna es el 16 de Febrero de 1995 y el número ATCC asignado a
la línea celular es HB 11834. La consigna se mantendrá en el almacén
de la ATCC, que es un almacén público, durante un período de 30
años, o 5 años después del último requerimiento reciente, o durante
la vida ejecutable de la patente, el que sea más largo, y será
remplazado si se volviera no viable durante ese período.
Adicionalmente, los Solicitantes han satisfecho todos los
requerimientos de 37 C.F.R. \NAK1.801-1.809,
incluido el aporte de una indicación de la viabilidad de la
muestra.
Se disuelve una base de vancomicina (576 mg, 0,4
mmoles, 1,5 eq.) en DMF (8 ml) (calentando si fuera necesario a
40ºC) en un matraz de fondo redondo de 50 ml con la boca ancha. Se
inserta un pequeño electrodo para el pH para controlar el pH de la
reacción. Se añade una solución de HCl de
diclorotriazinilaminofluoresceína (DTAF; 132 mg., 0,26 mmoles, 1
eq.) en DMF (2 ml) al matraz. La solución se vuelve de color
naranja-amarillo y el pH cae a 6,0\pm0,5 y se
agita durante la noche mientras se mantiene este pH. Los productos
de reacción se controlan mediante HPLC analítica. Una vez que todo
el DTAF ha siso consumido se separa la DMF a vacío a aproximadamente
2-3 ml. El resto se purifica mediante HPLC. Las
fracciones apropiadas se recogen y el disolvente se liofiliza para
dar un polvo de color naranja-amarillo (rendimiento:
350 mg).
Las condiciones de la HPLC analítica son las
siguientes: La columna es C-18 de 3,9 mm x 300 mm
(DYNAMAX C-18, Rainin) con una fase móvil en
gradiente continuo (A = acetato de amonio; B = acetonitrilo (50 mM);
% B = 10, % B = 50 desarrollada a lo largo de 15 minutos) a una
velocidad de flujo de 1,5 ml/minuto. La detección es a 254 o a 486
nm.
En la HPLC preparativa se utilizan las mismas
condiciones que antes con una columna de 19 mm x 250 mm (DYNAMAX
C-18, Rainin).
MS: ESMS da MH^{+} a 1908,
(MH_{2})^{2+} a 953.
El trazador (Ejemplo 3) y el anticuerpo
monoclonal #15-109-592 (Ejemplo 2)
se optimizan para que funcionen de un modo similar o mejor que el
análisis TDX®/TDXFLX® Abbott Vancomycin con la ventaja de que no
haya reactividad cruzada con CDP-I en presencia de
vancomicina. Como se ha comentado previamente, añadiendo una
concentración constante de anticuerpo y trazador a la muestra de
ensayo, la proporción de complejos de
vancomicina-anticuerpo con respecto a complejos de
trazador-anticuerpo que se forman es directamente
proporcional a la cantidad de vancomicina de la muestra. Cuando la
mezcla es excitada con luz polarizada linealmente y se mide la
polarización de la fluorescencia emitida por el trazador y los
complejos de trazador-anticuerpo, se puede
cuantificar o cualificar la presencia de vancomicina en una muestra
de ensayo. Los resultados pueden ser cuantificados mediante unidades
de polarización neta (mP) y el intervalo. La milipolarización neta
indica la polarización detectada cuando se une una cantidad máxima
de trazador al anticuerpo (es decir, en ausencia de vancomicina). A
más unidades de mP neta, mejor unión del trazador al anticuerpo. El
intervalo de análisis es la diferencia entre los valores de
milipolarización neta obtenidos cuando el trazador máximo se une en
ausencia de vancomicina y la milipolarización neta obtenida cuando
se encuentra presente una cantidad específica de vancomicina en una
muestra de ensayo. Las unidades de milipolarización son interpoladas
automáticamente desde una curva patrón almacenada y expresadas como
la cantidad de vancomicina (microgramos) por ml de muestra.
El anticuerpo de vancomicina purificado (corte
con sulfato de amonio) 15-109-133 se
diluye en tampón fosfato con Seralbúmina Bovina al 2,5% y glicerol
al 10% hasta una concentración de 20 \mug/ml que compone el tarro
S. El tarro de trazador (tarro T) es
Vancomicina-trazador DTAF diluido en tampón Tris con
laurilsulfato de sodio al 0,7% y laurilsulfato de litio al 0,5%
hasta una concentración de 0,275 \mug/ml. Estos dos componentes
junto con el tarro de pretratamiento (tarro P) rinden un intervalo
de 96,94 mP con valores de intensidad que oscilan entre 3.500 y
4.500 unidades. (Los valores de intensidad son una medida del efecto
del anticuerpo y el trazador que reaccionan juntos. A medida que se
incrementa la concentración o bien de anticuerpo o bien de trazador
en el análisis, el valor de la intensidad se vuelve mayor).
La exactitud del análisis de vancomicina del
presente ejemplo se muestra comparándolo con el análisis de
vancomicina asequible comercialmente en el que se utilizan muestras
de 56 pacientes. Ambos análisis tienen correlación dando R = 0,996 e
y = 0,92x-0,008 (Figura 11). Además, el análisis del
presente ejemplo fue comparado en cuanto a la cuantificación
mediante HPLC. La correlación del nuevo análisis frente a la HPLC
daba un R = 0,998 e y = 1,007+1,053 (Figura 12), mientras la
correlación del análisis de vancomicina asequible comercialmente
frente a la HPLC daba R = 0,996 e y = 1,088x+1,252 (Datos no
mostrados). Tanto el análisis del presente ejemplo como los análisis
de vancomicina asequibles comercialmente tienen una sensibilidad de
menos de 2,00 \mug/ml y pueden detectar entre 0 y 100 \mug/ml de
vancomicina en una muestra. Las muestras que contienen más de 100
\mug/ml de vancomicina pueden ser diluidas automáticamente a la
mitad o a la cuarta parte reduciendo el volumen de la muestra a 1,0
o 0,5 como se instruye en el manual del análisis. La precisión tanto
del análisis del presente ejemplo como del análisis de vancomicina
asequible comercialmente es la misma. Los coeficientes de variación
(CV) entre series, dentro de las series y totales son todos menores
del 6% (Ver la Tabla 2).
Para las reactividades cruzadas, se somete a
ensayo la vancomicina a niveles de 0, 40, y 80 \mug/ml con
diversos reaccionantes cruzados presentes a niveles de 0, 1, 10, 50
y 100 \mug/ml. Sorprendentemente, todos los reaccionantes
cruzados, incluyendo CDP-I, muestran una reactividad
cruzada de menos del 2% con la vancomicina lo que significa que
todas las lecturas están por debajo de la sensibilidad del análisis
(2 \mug/ml). En contraste, el análisis de vancomicina asequible
comercialmente tiene elevados niveles de reactividad cruzada con
CDP-I oscilando entre el 39,58% y el 65% con o sin
vancomicina presente. Sorprendentemente, el anticuerpo descrito aquí
no muestra reactividad cruzada detectable con CDP-I
a las concentraciones más elevadas sometidas a ensayo. Estos
resultados representan una mejora significativa sobre el análisis
comercial existente. (Referencia a la Tabla 3 para los datos de
reactividad cruzada con CDP-I).
La Figura 13 es representativa de los datos que
muestran una mP a 0-100 \mug/ml de vancomicina
utilizando el método del Ejemplo 4.
El anticuerpo de vancomicina (el tarro S)
15-109-592 del presente ejemplo
puede ser almacenado a 45ºC durante 14 días y se descubrió
inesperadamente que el monoclonal es altamente resistente a los
cambios debidos a los ciclos de congelación/descongelación. El
anticuerpo monoclonal puede experimentar tres ciclos de
congelación/descongelación con cambios mínimos en el intervalo y los
valores de intensidad. Adicionalmente, puesto que el anticuerpo es
monoclonal, los parámetros del análisis tales como el intervalo, la
reactividad cruzada, y la estabilidad son esencialmente de la misma
forma entre lote y lote. Además, mejora la capacidad de fabricación
ya que el hibridoma puede ser cultivado utilizando sistemas de
cultivo de tejidos de fibra hueca. El anticuerpo también puede
sobrevivir a dos fluctuaciones de ajuste de aire (aproximadamente
1,5ºC) en un analizador clínico; así las cinéticas del análisis
también son estables en el entorno del analizador (aproximadamente
34\pm0,5ºC). Finalmente, el uso de una solución de pretratamiento
(5-sulfosalicilato al 10%, Tris 0,1M, sulfato de
cobre 20 mM) permite que la interferencia de la bilirrubina (hasta
30 mg/dl) sea menor del 5%, y esto reduce el remanente (de una
muestra de 250 \mug/ml de vancomicina) a menos de la sensibilidad
del análisis, es decir el 2%. La solución de pretratamiento separa
la proteína de cualquier vancomicina unida a proteína con el fin de
liberar la vancomicina para el análisis.
Análisis de vancomicina
asequible
comercialmente
\vskip1.000000\baselineskip
Las columnas Protein A
Affinity-Pak y los estuches de preparación
ImmunoPure Fab, los envases de solución salina tamponada con fosfato
DupH, los casetes de diálisis
Slide-A-Lyzer 10 K MWCO, el estuche
para el análisis de proteínas Micro BCA, y el fragmento
F(ab')_{2} de IgG de ratón Immunopure fueron obtenidos de
Pierce (Rockford, IL). Los microconcentradores fueron obtenidos de
Millipore Corp. (Bedford, MA). La vancomicina fue obtenida se
Chemical and Agricultural Products Division, Abbott Laboratories
(Abbott Park, IL). El mAb anti-vancomicina fue
obtenido de las instalaciones para el cultivo de tejidos de Abbott
(Abbott Park, IL) (Ver Adamczyk, M., y col., Therapeutic Drug
Monitoring, 20:191-201 (1998). El tripéptido
(N^{\alpha},N^{\varepsilon}-diacetil) KDADA fue
obtenido de Penisula Laboratories (Belmont, CA). El Tripéptido
(N^{\varepsilon}-acetil) KDADA transformado con
aminocaproato fue obtenido de Research Genetics (Huntsville, Al). Se
preparó un éster activo de biotina, que es el compuesto (2) mostrado
en la Figura 15 (en adelante referido como "compuesto 2")
mediante el método de Wilchek, como se describe en Wilchek, M., y
col., "Biotin-containing reagents". En
Avidin-Biotin Technology (M. Wilchek, Ed.) págs.
123-138, Academic Press, Nueva York.
El éster activo de
6-carboxifluoresceína que es el compuesto (3)
mostrado en la Figura 15, (referido en adelante como "compuesto
3") fue preparado mediante el método de Adamczyk y col. como se
describe en Adamczyk, M., y col., Bioconjugate Chem.,
8:253-255 (1997).
La marca quimioluminiscente de acridinio, que es
el compuesto (4) mostrado en la Figura 15, (referido en adelante
como "compuesto 4") fue preparado según el procedimiento
general descrito en Mattingly, P.G., J. Biolumin. Chemilumin.
6:107-114 (1991) y en la Patente de los Estados
Unidos 5.468.646.
La desvancosaminilvancomicina, que es el
compuesto (5) mostrado en la Figura 16, (referido en adelante como
"compuesto 5"), la aglucovancomicina, que es el compuesto (6)
mostrado en la Figura 16, (referido en adelante como "compuesto
6") y la N-acetilvancosaminilvancomicina, que es
el compuesto (7) mostrado en la Figura 16, (referido en adelante
como "compuesto 7") se prepararon según el método descrito en
Kannan, R., y col., J. Am. Chem. Soc.,
110:2946-2953 (1988).
La desclorovancomicina de anillo 2 que es el
compuesto (8) mostrado en la Figura 16, (referido en adelante como
"compuesto 8") fue preparado mediante el método descrito en
Harris, C.M., y col., J. Am. Chem. Soc.,
107:6652-6658 (1985).
El producto de degradación cristalino (CDP), que
es el compuesto (10) mostrado en la Figura 16, (referido en adelante
como "compuesto 10") fue preparado según el método descrito en
Marshall, F.J., J. Med. Chem. 8:18-22
(1965).
El descloro CDP de anillo 2, que es el compuesto
(12) mostrado en la Figura 16, (referido en adelante como
"compuesto 12") fue preparado según el método descrito en
Harris, C.M., y col., J. Am. Chem. Soc.,
107:6652-6658 (1985).
Todos los demás reactivos utilizados en la
síntesis fueron obtenidos de Aldrich Chemical Co., (Milwaukee, WI) y
utilizados sin purificación adicional. Los compuestos sintetizados
fueron purificados mediante HPLC (Waters (Millford, MA) Delta Prep
3000 Preparative Chromatography system equipado con un detector
Lambda-Max 281 UV, un módulo de datos modelo 740, y
una columna \muBondapak C18 de 40 x 100 mm). La HPLC analítica se
realizó con el mismo sistema utilizando una columna \muBondapak
C18 de 8 x 100 mm. Las columnas de la HPLC se hicieron eluir con un
gradiente lineal de CH_{3}CN al 5-50% en formiato
de amonio 50 mM (en adelante referido como "Disolvente A") o
isocráticamente en ácido trifluoroacético conteniendo CH_{3}CN
acuoso (v:v:v, CH_{3}CN/H_{2}O/TFA; referido en adelante como
"Disolvente B") como se ha indicado. Los perfiles de elución se
registraron a 254 nm. La espectrometría de masas por ionización por
rociado de electrones (ESI/MS) se llevó a cabo en un sistema
Perkin-Elmer (Norwalk, CT) Sciex API 100 Benchtop
empleando la fuente de iones Turbo IonSpray®. La proteína fue
analizada mediante SDS-PAGE en un sistema BioRad
Minigel (Hercules, CA) utilizando geles de poliacrilamida al 12,5%
(7 cm x 10 cm x 1 mm), seguido de tinción con Azul de Coomassie. Las
medidas de la resonancia del plasmón superficial se llevaron a cabo
en un sistema automatizado BIAcore 100 (BIAcore, Inc., Piscataway,
NJ) utilizando chips sensores de cuatro canales
CM-5. Los reactivos para el aparato de BIAcore
consistían en tampón HBS (Hepes 10 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA
3,4 mM, y tensioactivo P-20 al 0,05%), un estuche de
acoplamiento conteniendo N-hidroxisuccinimida (NHS),
N-etil-N-(3-dietilaminopropil)carbodiimida
(EDAC), e hidrocloruro de etanolamina 1 M (pH 8,5), todos de BIAcore
Inc.
El compuesto 10, que es CDP (Ver Marshall, F.J.,
J. Med. Chem. 8:18-22 (1965) (100 mg, 0,069
mmoles), se calentó en un baño de agua durante 1 hora en HCl 1N (3
ml). La mezcla se enfrió a la temperatura ambiente, y el sólido se
separó por filtración. El producto bruto se disolvió en NaHCO_{3}
saturado, se purificó mediante HPLC preparativa (Disolvente A a lo
largo de 20 minutos; velocidad de flujo, 45 ml/minuto), y se
liofilizó (45 mg, 57%). La HPLC analítica (Disolvente A a lo largo
de 20 minutos; velocidad de flujo, 2 ml/minuto): tiempo de retención
9,4 minutos, 99%. ESI MS m/z: 1145 (MH^{+}).
A una solución de vancomicina (482 mg, 0,33
mmoles) en DMF seco (6 ml) se añadieron los compuestos 2, 3, o 4
(0,36 mmoles) y trietilamina (0,91 ml, 6,6 mmoles). Después de
agitar durante 24 horas a la temperatura ambiente en N_{2}, las
mezclas de reacción brutas se purificaron mediante HPLC preparativa
y se liofilizaron.
El compuesto (13), mostrado en la Figura 16
(referido en adelante como "compuesto 13"), fue obtenido a
partir de vancomicina y un éster activo de biotina (405 mg, 81%). La
HPLC preparativa (Disolvente A a lo largo de 20 minutos; velocidad
de flujo, 45 ml/minuto).
HPLC analítica (Disolvente A a lo largo de 15
minutos; velocidad de flujo, 2 ml/minuto): tiempo de retención, 9,4
minutos, 99%. ESI/MS m/z: 1674 (MH^{+}), 1305
(MH^{-}-vancosaminilbiotina), 1143
(MH^{+}-disacárido-biotina), 554
disacárido + biotina + Na^{+}.
El compuesto (14), mostrado en la Figura 16
(referido en adelante como "compuesto 14"), fue obtenido a
partir de éster activo de 6-carboxifluoresceína (20
mg, 11%).
HPLC preparativa (Disolvente B, 30:70:0,1;
velocidad de flujo, 45 ml/minuto): HPLC analítica (Disolvente B,
30:70:0,1; velocidad de flujo, 2 ml/minuto): tiempo de retención,
4,0 minutos, 99%. ESI/MS m/z: 1809 (MH^{+}), 904
(MH_{2}^{2+}), 1305
(MH^{+}-vancosaminilfluoresceína), 1143
(MH^{+}-disacárido-fluoresceína),
1143 (MH^{+}-disacárido -fluoresceína), 665
(disacárido + fluoresceína).
El compuesto (15), mostrado en la Figura 16
(referido en adelante como "compuesto 15"), fue obtenido a
partir de vancomicina y éster activo de acridinio (409 mg, 70%).
HPLC preparativa (Disolvente A a lo largo de 20
minutos; velocidad de flujo, 45 ml/minuto). HPLC analítica
(Disolvente A a lo largo de 20 minutos; velocidad de flujo, 2
ml/minuto): tiempo de retención, 10,4 minutos, 99%. ESI/MS m/z: 2016
(MH^{+}), 1305 (MH^{+}-vancosaminilacridinio),
1143
(MH^{+}-disacárido-acridinio), 710
(disacárido-acridinio).
A una solución de vancomicina (296 mg, 0,20
mmoles) en DMSO (10 ml) se añadieron biotina o
10-(3-sulfopropil)-N-tosil-N-(3-carboxipropil)acridinio-9-carboxamida
(0,20 mmoles) y N-hidroxibenzotriazol (33 mg, 0,24
mmoles). Se añadió diciclohexilcarbodiimida (206 mg, 1,0 mmoles), y
las mezclas se agitaron durante 72 horas a la temperatura ambiente
en N_{2}. Las mezclas de reacción brutas se purificaron mediante
HPLC preparativa y se liofilizaron.
El compuesto (16), mostrado en la Figura 16
(referido en adelante como "compuesto 16"), fue obtenido a
partir de vancomicina y biotina (136 mg, 40%). HPLC preparativa
(Disolvente A a lo largo de 20 minutos; velocidad de flujo, 2
ml/minuto): tiempo de retención, 9,4 minutos, 99%. ESI/MS m/z: 1675
(MH^{+}), 1531 (MH^{+}-vancosamina), 1372
(MH^{+}-disacárido), 838 (MH_{2}^{2+}).
El compuesto (17), mostrado en la Figura 16
(referido en adelante como "compuesto 17"), fue obtenido a
partir de vancomicina y
10-(3-sulfopropil)-N-tosil-N-(3-carboxipropil)acridinio-9-carboxamida
(190 mg, 35%). HPLC preparativa (Disolvente A a lo largo de 20
minutos; velocidad de flujo, 45 ml/minuto). HPLC analítica
(Disolvente A a lo largo de 15 minutos; velocidad de flujo 2
ml/minuto); tiempo de retención, 12,1 minutos, 99%. ESI/MS m/z: 2016
(MH^{+}), 1874 (MH^{+}-vancosamina), 1711
(MH^{+}-disacárido), 694 (N-metil
leucilacridinio).
(i) Se preparó el compuesto 9 según el método
descrito en Sundram, U.N., y col., J. Org. Chem.
60:1102-1103 (1995). Se añadieron solución de
vancomicina (500 mg, 0,35 mmoles) e hidrocloruro de hexanodiamina
(196 mg, 1,04 mmoles) en DMSO anhidro/DMF (v:v, 1:1, 8 ml) a 0ºC a
HBTU (262 mg, 0,69 mmoles) y diisopropiletilemina (480 \mul, 2,76
mmoles). Después de agitar durante 72 horas a la temperatura
ambiente, la mezcla de reacción bruta se purificó mediante HPLC
preparativa (Disolvente B, 17:83:0,0; velocidad de flujo, 40
ml/minuto) y se liofilizó (228 mg, 43%). HPLC analítica (Disolvente
B, 17:83:0,0, velocidad de flujo, 2 ml/minuto; tiempo de retención,
7,9 minutos, 99%, ESI/MS m/z: 1548 (MH^{+}).
(ii) A una solución del compuesto 9 (19 mg, 12
\mumoles) en DMF seca (0,5 ml) se añadieron los compuestos 2, 3 o
4 (12 \mumoles), y trietilamina (2 \mul, 12 \mumoles). Después
de agitar durante 24 horas a la temperatura ambiente en N_{2}, las
mezclas de reacción brutas se purificaron mediante HPLC preparativa
y se liofilizaron.
El compuesto (18), mostrado en la Figura 16
(referido en adelante como "compuesto 18"), fue obtenido a
partir del compuesto 9 y éster activo de biotina (9 mg, 31%
basándose en la sustancia de partida recuperada. HPLC preparativa
(Disolvente B, 20:80:0,05; velocidad de flujo, 2 ml/minuto): tiempo
de retención, 6,1 minutos, 99%. ESI/MS m/z: 1797 (M + Na^{+}),
1775 (MH^{+}), 1632 (MH^{+}-vancosamina), 1469
(MH^{+}-disacárido).
El compuesto (19), mostrado en la Figura 16
(referido en adelante como "compuesto 19"), fue obtenido a
partir del compuesto 9 y éster activo de
6-carboxifluoresceína (4 mg, 26% basándose en la
sustancia de partida recuperada). HPLC preparativa (Disolvente B,
27:73:0,05; velocidad de flujo, 40 ml/minuto).
HPLC analítica (Disolvente B, 27:73:0,05;
velocidad de flujo, 2 ml/minuto): tiempo de retención, 7,5 minutos,
99%. ESI/MS m/z: 1929 (M + Na^{+}), 1907 (MH^{+}), 1764
(MH^{+}-vancosamina), 1600
(MH^{+}-disacárido).
El compuesto (20), mostrado en la Figura 16
(referido en adelante como "compuesto 20"), fue obtenido a
partir del compuesto 9 y éster activo de acridinio (3 mg, 35%
basándose en la sustancia de partida recuperada. HPLC preparativa
(Disolvente B, 27:73:0,05; velocidad de flujo, 40 ml/minuto). HPLC
analítica (Disolvente B, 27:73:0,05; velocidad de flujo, 2
ml/minuto): tiempo de retención, 5,8 minutos, 99%. ESI/MS m/z: 2137
(M + Na^{+}), 2115 (MH^{+}), 1972
(MH^{+}-vancosamina), 1810
(MH^{+}-disacárido).
El mAb anti-vancomicina que se
había originado contra la vancomicina acoplada a tiroglobulina a
través de un ligador de aminobutirato terminal fue purificado en una
columna Affinity-Pak Protein A según el protocolo
del fabricante. En resumen, el cultivo celular que contiene el mAb
(25,4 mg) fue aclarado mediante centrifugación (3.500 g, 30
minutos), filtrado a través de un filtro de 0,2 \mum, y el
sobrenadante fue aplicado a la columna Affinity-Pak
Protein que había sido equilibrada con 12 ml de tampón de unión a
IgG. Tras lavar con tampón de unión a IgG, el anticuerpo se hizo
eluir con 6 ml de tampón de elución de IgG a un vial que contenía
1,0 ml de tampón Tris 1,5 M, pH 9,0. La IgG purificada fue sometida
a diálisis frente a tampón PBS (fosfato 20 mM, NaCl 30 mM, pH 7,2)
durante 12 horas a 4ºC y después concentrada a aproximadamente 10
mg/ml en un dispositivo de microconcentración Amicon
Microcon-50. La concentración del mAb era de 12,4
mg/ml como se determina mediante el análisis de la proteína
micro-BCA como describen Smith, P.K., y col.,
Anal. Biochem. 150:76-85 (1985). La
recuperación total del mAb purificado era de 18,6 mg.
La digestión de mAb
anti-vancomicina se llevó a cabo con el estuche de
preparación ImmunoPure Fab siguiendo el protocolo del fabricante. El
mAb anti-vancomicina purificado (aproximadamente 12
mg) en el tampón de digestión (0,5 ml; fosfato de sodio 20 mM, EDTA
10 mM, y cisteína 30 mM, pH 7,0) fue incubado durante 5 horas en un
aparato de sacudimiento-incubadora a 37ºC con
papaína inmovilizada en el tampón de digestión (0,5 ml). El mAb
anti-vancomicina digerido con papaína se hizo pasar
después a través de una columna de proteína A inmovilizada
pre-equilibrada (2 ml) suministrada con el estuche
para separar el mAb no digerido y el fragmento Fc. La columna de
proteína A se lavó con 13 ml más de tampón de unión ImmunoPure. El
flujo a través de la columna y los lavados de la columna que
contenían el fragmento Fab fueron reunidos y sometidos a diálisis
frente a tampón PBS durante 12 horas a 4ºC y concentrados en un
dispositivo de concentración Centriprep-10. La
concentración del fragmento Fab anti-vancomicina era
d 2,0 mg/ml como se determinó mediante el método
micro-BCA utilizando IgG de ratón (F_{ab}') como
patrón. El fragmento Fab anti-vancomicina purificado
fue caracterizado mediante SDS-PAGE y espectrometría
de masas LC/ESI. Los pesos moleculares de las cadenas pesada y
ligera del fragmento Fab eran 23.986 y 24.033 Da, respectivamente.
Todos los estudios se llevaron a cabo con el fragmento Fab del mAb
anti-vancomicina para eliminar la complejidad
asociada con la bivalencia del anticuerpo monoclonal.
La inmovilización del compuesto 9 o el tripéptido
(N^{\varepsilon}-acetil) KDADA transformado con
aminocaproato por medio del acoplamiento de una amina al chip sensor
CM-5 se realizó según el método descrito en
Adamczyk, M., y col., Bioconjugate Chem.,
9:23-32 (1998).
En resumen, se inició un flujo continuo de tampón
BHS a 10 \mul/minuto sobre la superficie del biosensor. La matriz
de dextrano carboximetilada de la superficie del sensor fue activada
mediante una inyección durante 3,5 minutos de una solución de HNS
0,05 M y EDAC 0,2 M. Después se inyectó una solución del compuesto 9
o el tripéptido (N^{\varepsilon}-acetil) KDADA
transformado con aminocaproato (10 \muM) y etanolamina (990
\muM; amina total 1 mM en tampón HBS) (7 minutos), seguido de una
inyección durante 7 minutos de hidrocloruro de etanolamina 1,0 M
para bloquear los grupos éster activo que no han reaccionado
restantes. Las superficies blanco fueron generadas en condiciones
idénticas omitiendo la etapa de inmovilización del ligando.
Los estudios competitivos en solución se llevaron
a cabo en un BIAcore 2000 siguiendo el procedimiento descrito en
Adamczyk, M., y col., Bioconjugate Chem.,
9:23-32 (1998).
Las superficies del biosensor fueron regeneradas
después de cada inyección con pulsos sucesivos de 1 minuto de
hidrocloruro de guanidina 6 M, 6 M, y 1,5 M. Las velocidades
iniciales de unión del fragmento Fab
anti-vancomicina a la superficie del biosensor
fueron medidas a lo largo de una ventana de 15 segundos comenzando a
los 20 segundos de la inyección. Los datos fueron evaluados mediante
un análisis de regresión no lineal utilizando el modelo de afinidad
en solución construido en el soporte lógico BIAevaluation 3.0
(BIAcore, Inc.)
Los análogos de vancomicina que carecen de los
azúcares o el cloro del anillo 2 fueron preparados como se describe
en Kannan, R., y col., J. Am. Chem. Soc.,
110:2946-2953 (1988) y Harris, C.M., y col., J.
Am. Chem. Soc., 107:6652-6658 (1985). Los
compuestos trazadores 13-15, conteniendo un radical
carbohidrato de N-vancosaminilo transformado, fueron
preparados con un rendimiento del 11-81% acoplando
la vancomicina con los ésteres activos de NHS de biotina (compuesto
2), 6-carboxifluoresceína (compuesto 3), o
10-(3-sulfopropil)-N-tosil-N-(3-carboxipropil)acridinio-9-carboxamida
(compuesto 4) y purificación mediante HPLC preparativa (Ver el
Esquema 1 de la Figura 14). Los compuestos trazadores de
vancomicina, 16 y 17, que portaban un radical
N-metil leucilo transformado, fueron preparados con
un rendimiento del 40 y el 35%, respectivamente, mediante
acoplamiento de la vancomicina con biotina o ácido de acridinio
libre en presencia de N,N'-diciclohexilcarbodiimida
y N-hidroxibenzotriazol (Ver el Esquema 1 de la
Figura 14). El compuesto 9, que contenía un ligador aminoalquílico
de la funcionalidad carboxilo libre de la vancomicina, fue preparado
mediante el método descrito en Sundram, U.N., y col., J. Org.
Chem., 60:1102-1103 (1995). El acoplamiento del
compuesto 9 con los ésteres activos de NHS de biotina (compuesto 2),
6-carboxifluoresceína (compuesto 3), o
10-(3-sulfopropil)-N-tosil-N-(3-carboxipropil)acridinio-9-carboxamida
(compuesto 4) como antes, proporcionó mezclas de los trazadores de
vancomicina transformados con carboxilo y carbohidrato de
N-vancosaminilo. Las purificaciones repetidas
mediante HPLC preparativa proporcionaron compuestos trazadores
modificados con carboxilo puros 18-20, con un
rendimiento del 26-35% (Ver el esquema 1 de la
Figura 14). Los análogos de los productos de degradación cristalinos
fueron preparados siguiendo los procedimientos de la literatura o la
metodología general descritos para la preparación de análogos de
vancomicina (ver Marshall F.J. Structure Studies on Vancomycin,
J. Med. Chem., 8:18 (1965)).
Se disolvió HCl de vancomicina (100 mg) en agua
(2 ml) y el pH se ajustó a 4,2 con NaOH 1N. La solución se calentó
durante 40 horas en un baño de aceite a una temperatura interna de
60-70ºC. Se recuperó CDP-I mediante
filtración y se lavó con agua fría y se secó. El rendimiento fue de
aproximadamente el 60%.
Los intentos iniciales para generar una
superficie biosensora implicaron la inmovilización de la vancomicina
a la superficie de carboximetildextrano activado de un chip sensor
CM-5 a través de la amina primaria del radical
azúcar vancosamina. Posteriores estudios de unión con cantidades
saturantes de fragmento Fab anti-vancomicina
mostraron que estas superficies tenían una capacidad de unión mínima
para el fragmento de anticuerpo. En contraste, la inmovilización del
compuesto 9, conteniendo el ligador aminoalquílico de la
funcionalidad carboxilo libre, en condiciones idénticas
proporcionaba biosensores con una capacidad de unión relativamente
elevada (RU_{max} = 4.000) y una elevada afinidad por el fragmento
Fab anti-vancomicina. Estudios de unión adicionales
del fragmento Fab anti-vancomicina a la superficie
de vancomicina modificada con aminoalquilo inmovilizada demostraron
que la unión estaba limitada por la transferencia en masa y era
adecuada para el uso en los estudios de unión en solución descritos
más abajo.
Las afinidades de unión de numerosos análogos de
vancomicina y trazadores por el fragmento Fab de vancomicina fueron
determinadas a partir de experimentos de competición en solución
llevados a cabo en un BIAcore 2000. Inicialmente, se inyectaron
concentraciones conocidas de fragmento Fab
anti-vancomicina (0-22 nM) sobre la
superficie del biosensor de vancomicina aminoalquilada. La velocidad
de unión inicial para cada concentración de fragmento Fab
anti-vancomicina fue obtenida promediando la
velocidad de unión observada a lo largo de una ventana de 145
segundos comenzando 20 segundos después de la inyección. Los datos
de los primeros 20 segundos de cada sensograma fueron omitidos
debido a los efectos de dispersión de la muestra al inicio de las
inyecciones. Se ajustó un gráfico de la velocidad de unión inicial
versus la concentración de fragmento Fab
anti-vancomicina utilizando una ecuación logística
de 4 parámetros (modelo general en BIAevaluation 3.0) proporcionando
una curva patrón. Se generaron numerosas curvas patrón durante el
transcurso de estos estudios y todas fueron idénticas en el error
experimental. Después se mezcló una concentración fija con doce
concentraciones de cada análogo de vancomicina o trazador y se dejó
que alcanzaran el equilibrio. Las muestras en equilibrio fueron
inyectadas individualmente sobre la superficie del biosensor de
vancomicina aminoalquilada, y la concentración del fragmento Fab
anti-vancomicina libre fue cuantificada mediante la
determinación de la velocidad inicial de unión a la superficie del
biosensor como se ha descrito antes. Un gráfico del fragmento Fab
anti-vancomicina libre versus la concentración total
de análogo o trazador añadido proporciona una curva competitiva. En
la Figura 17 se muestran curvas competitivas típicas generadas
conforme a este ejemplo. Los puntos de datos representan las
concentraciones determinadas experimentalmente del fragmento Fab
anti-vancomicina libre en las soluciones en
equilibrio a una concentración dada de análogo o trazador soluble.
Las curvas representan el mejor ajuste no lineal de los datos
utilizando la siguiente ecuación 1 (modelo de afinidad en solución
en el soporte lógico BIAevaluation):
Fab_{\tau}=\frac{Fab_{\tau}-A-KD}{2}+\sqrt{\frac{(Fab_{\tau}-A-KD}{4}-A*Fab_{\tau}}
donde Fab_{\tau} es la
concentración del fragmento Fab anti-vancomicina
libre en las soluciones en equilibrio, Fab_{\tau} es la
concentración total de fragmento Fab
anti-vancomicina en solución (20 nM), A es la
concentración total de análogo de vancomicina o trazador añadido, y
KD es la constante de disociación en equilibrio para la unión del
análogo de vancomicina o trazador al fragmento Fab
anti-vancomicina en
solución.
Las relaciones estructura-unión
para la interacción entre los análogos de vancomicina y el fragmento
Fab anti-vancomicina, medidas mediante los cambios
en las constantes de disociación en equilibrio (KD) se muestran en
la Tabla 4, más abajo:
| ^{1} KD era muy pequeña para ser medida de forma fidedigna por los experimentos de afinidad en solución. | |
| ^{2} KD era demasiado grande para ser medida de forma fidedigna por los experimentos de afinidad en solución. |
En la Tabla 4 se muestra que la vancomicina y el
análogo transformado con N-acetilvancosaminilo
(compuesto 7) se unen excesivamente ajustados estando los valores de
KD fuera del intervalo para el cual el aparato BIAcore puede
proporcionar exactamente valores de los estudios competitivos en
solución. La incorporación del ligador aminoalquílico a la
funcionalidad carboxilo libre de la vancomicina, proporcionando el
compuesto 9, que fue utilizado para la preparación de la superficie
del biosensor de vancomicina inmovilizada, tiene un efecto mínimo
sobre el reconocimiento del fragmento Fab
anti-vancomicina en solución. La separación del
átomo de cloro del anillo 2 de la vancomicina da como resultado una
pérdida significativa de reconocimiento de la unión por el fragmento
de anticuerpo (ver los resultados para el compuesto 8 en la Tabla 4,
anterior). La escisión de uno o ambos anillos carbohidratados de la
vancomicina mediante hidrólisis ácida que proporciona los compuestos
5 y 6, respectivamente, da como resultado la pérdida sucesiva
adicional del reconocimiento de la unión por el fragmento de
anticuerpo con la pérdida de cada monosacárido. Las interacciones de
la unión del fragmento Fab anti-vancomicina con los
productos de degradación de la vancomicina eran extremadamente
débiles en relación a la interacción de la unión al antibiótico
nativo. El producto de degradación cristalino (compuesto 10) se une
con una KD de 488 \pm 34 nM. La separación del átomo de cloro de
la posición 2 da como resultado una pérdida significativa del
reconocimiento de la unión por el fragmento Fab
anti-vancomicina y, la hidrólisis completa de los
anillos carbohidratados, proporcionando el compuesto 11, da como
resultado una interacción de unión con el fragmento Fab
anti-vancomicina demasiado débil para ser
determinada por los estudios competitivos en solución.
Las relaciones estructura-unión
para la interacción de unión entre los trazadores de vancomicina y
el fragmento Fab anti-vancomicina, medidas mediante
los cambios en las constantes de disociación en equilibrio (KD), se
resumen en la Tabla 5.
| \begin{minipage}[t]{140mm} ^{1} KD era demasiado pequeña para ser medida de forma fidedigna por los experimentos de afinidad en solución.\end{minipage} | |
| ^{2} No determinado |
En la Tabla 5 se muestra que las interacciones de
unión variaban dependiendo de la marca contenida en el trazador. No
obstante, los trazadores transformados con N-metil
leucil- (compuestos 16 y 17) y carboxil-HDA-
(compuestos 18-20) que contenían la misma marca se
unen al fragmento de anticuerpo con afinidades similares. En
contraste, los trazadores transformados con
N-vancosaminilo (compuestos 13-15)
que contienen la marca equivalente se unen al fragmento de
anticuerpo de forma sustancialmente más débil.
Para evaluar adicionalmente la topología de la
vancomicina que es crítica para el reconocimiento por el fragmento
Fab anti-vancomicina, se investigó el papel de los
restos localizados en el bolsillo de unión al péptido del
antibiótico (ver la Figura 18). Para estos estudios, se inmovilizó
un tripéptido (N^{\varepsilon}-acetil)KDADA
conteniendo un ligador de aminocaproato del extremo amino por medio
del acoplamiento de la amina a una superficie de
carboximetildextrano activado de un chip sensor
CM-5. La vancomicina (0,5 \muM) se une a esta
superficie (ver la Figura 19). No obstante, puesto que la masa del
antibiótico es pequeña, la respuesta del aparato es relativamente
pequeña (aproximadamente 50 Rus en equilibrio). En contraste, la
inyección de un complejo de vancomicina (0,5 \muM/fragmento Fab
anti-vancomicina (1 \muM), en el cual \geq 99%
de la vancomicina está unida por el fragmento de anticuerpo, da como
resultado un incremento de aproximadamente 10 veces en la respuesta
debido al incremento de masa del complejo (ver la Figura 19). El
fragmento Fab anti-vancomicina no tiene afinidad por
la superficie del tripéptido inmovilizado (Figura 19). Para
verificar adicionalmente que los bolsillos de unión de la
vancomicina del péptido y el anticuerpo eran mutuamente excluyentes,
se volvió a investigar la interacción de unión en solución
vancomicina/fragmento Fab anti-vancomicina en las
condiciones descritas antes en presencia del tripéptido
(N^{\alpha},N^{\varepsilon}-diacetil)KDADA
(500 \muM). El valor de KD obtenido para la interacción de unión
vancominina/fragmento Fab anti-vancomicina en
solución en presencia del tripéptido
(N^{\alpha},N^{\varepsilon}-diacetil)KDADA
era idéntica al valor obtenido en ausencia del tripéptido (\leq
0,2 nM).
Claims (18)
1. Un método para la cuantificación de
vancomicina en una muestra de ensayo, comprendiendo el método las
etapas de:
(a) poner en contacto la muestra de ensayo
con
- (i)
- un anticuerpo reactivo que comprende anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a vancomicina, el anticuerpo producido con un inmunógeno de fórmula:
- donde P es un material portador inmunogénico, y X es un radical de unión de 0 a 50 carbonos y heteroátomos, incluyendo no más de diez heteroátomos, dispuestos en forma de una cadena lineal o ramificada o un radical cíclico, saturado o insaturado, con las condiciones de que no más de dos heteroátomos pueden estar unidos directamente en serie, que la serie no puede contener enlaces -O-O-, que los radicales cíclicos contienen 6 o menos miembros, y que la ramificación se puede producir solamente en átomos de carbono, y
- (ii)
- un reactivo marcado que es capaz de desplazar la unión del anticuerpo hacia la vancomicina,
- para formar una solución de reacción; y
(b) medir la cantidad del reactivo marcado en la
solución de reacción que está o no está unido a un anticuerpo como
una función de la cantidad de vancomicina en la muestra de
ensayo,
caracterizado porque en dicho método se
emplea un calibrador estable que comprende una solución acuosa que
contiene una molécula de vancomicina estabilizada con un polipéptido
donde dicho polipéptido no interfiere en la unión de un anticuerpo a
la molécula de vancomicina.
2. El método de la Reivindicación 1, donde el
reactivo marcado tiene la fórmula:
donde Q es un radical detectable, y
X es de 0 a 50 carbonos y heteróatomos, incluyendo no más de diez
heteroátomos, ordenados en forma de una cadena lineal o ramificada o
de radical cíclico, saturado o insaturado, con las condiciones de
que no más de dos heteroátomos pueden estar unidos directamente en
serie, que la serie no puede contener enlaces -O-O-,
que los radicales cíclicos contienen 6 o menos miembros, y que la
ramificación puede existir solamente sobre los átomos de
carbono.
3. El método de la Reivindicación 2, donde el
radical detectable se selecciona del grupo formado por enzimas,
cromóforos, moléculas fluorescentes, moléculas quimioluminiscentes,
moléculas fosforescentes, y moléculas quimioluminiscentes.
4. El método de la Reivindicación 2, donde el
material portador inmunogénico se selecciona del grupo formado por
seralbúmina bovina, hemocianina de lapa ojo de cerradura, y
tiroglobulina.
5. El método de la Reivindicación 2, donde el
método de inmunoanálisis es un inmunoanálisis de polarización de la
fluorescencia donde el radical detectable del reactivo marcado es
una molécula fluorescente y el material portador inmunogénico se
selecciona del grupo formado por seralbúmina bovina, hemocianina de
lapa ojo de cerradura, y tiroglobulina.
6. El método de la Reivindicación 5, donde la
medida de la etapa (b) se realiza (a) haciendo pasar luz polarizada
plana a través de la solución de reacción para obtener una respuesta
de polarización de la fluorescencia y (b) detectando la respuesta de
polarización de la fluorescencia de la solución de reacción como una
medida de la cantidad de vancomicina en la muestra de ensayo.
7. El método de la Reivindicación 6, donde la
molécula fluorescente se selecciona del grupo formado por
aminometilfluoresceína, aminofluoresceína,
5-carboxifluoresceína,
6-carboxifluoresceína,
tiourea-fluoresceína, y
diclorotriazinilaminofluoresceína.
8. El método de la Reivindicación 7, donde el
reactivo marcado es
y el anticuerpo es producido con un
inmunógeno de
fórmula
9. El método de la Reivindicación 8, donde el
anticuerpo es secretado por una línea celular de hibridoma
denominada A.T.C.C. HB 11834.
10. Un estuche de ensayo para la cuantificación
de vancomicina en una muestra de ensayo, comprendiendo el estuche de
ensayo:
(a) un anticuerpo reactivo que comprende
anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a la
vancomicina de una muestra de ensayo, el anticuerpo producido con un
inmunógeno de fórmula:
donde P es un material portador
inmunogénico, y X es un radical de unión de 0 a 50 carbonos y
heteroátomos, incluyendo no más de diez heteroátomos, dispuestos en
forma de una cadena lineal o ramificada o un radical cíclico,
saturado o insaturado, con las condiciones de que no más de dos
heteroátomos pueden estar unidos directamente en serie, que la serie
no puede contener enlaces -O-O-, que los radicales
cíclicos contienen 6 o menos miembros, y que la ramificación se
puede producir solamente en los átomos de
carbono;
(b) un reactivo marcado que es capaz de desplazar
la unión del anticuerpo a la vancomicina; y
(c) un calibrador estable que comprende una
solución acuosa que contiene una molécula de vancomicina
estabilizada con un polipéptido donde dicho polipéptido no
interfiere en la unión de un anticuerpo a la molécula de
vancomicina.
11. El estuche de ensayo de la Reivindicación 10,
donde el reactivo marcado tiene la fórmula:
donde Q es un radical detectable, y
X es de 0 a 50 carbonos y heteróatomos, incluyendo no más de diez
heteroátomos, ordenados en forma de una cadena lineal o ramificada o
de radical cíclico, saturado o insaturado, con las condiciones de
que no más de dos heteroátomos pueden estar unidos directamente en
serie, que la serie no puede contener enlaces -O-O-,
que los radicales cíclicos contienen 6 o menos miembros, y que la
ramificación puede existir solamente sobre los átomos de
carbono.
12. El estuche de ensayo de la Reivindicación 10,
donde el material portador inmunogénico se selecciona del grupo
formado por seralbúmina bovina, hemocianina de lapa ojo de
cerradura, y tiroglobulina.
13. El estuche de ensayo de la Reivindicación 10,
donde el material inmunogénico es tiroglobulina.
14. El estuche de ensayo de la Reivindicación 10,
donde el anticuerpo es secretado por una línea celular de hibridoma
denominada A.T.C.C. HB 11834.
15. El uso de un calibrador estable para el
propósito de cuantificar la vancomicina, donde dicho calibrador
estable comprende una solución acuosa que contiene una molécula de
vancomicina estabilizada con un polipéptido donde dicho polipéptido
no interfiere en la unión del anticuerpo a la molécula de
vancomicina.
16. El uso según la Reivindicación 15 de un
calibrador estable, donde el calibrador es estable durante al menos
dos meses.
17. El uso según la Reivindicación 15 de un
calibrador estable, donde el calibrador es estable durante al menos
seis meses.
18. El uso según la Reivindicación 15 de un
calibrador estable, donde el calibrador es estable durante al menos
un año.
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