ES2236234T3 - Ciclipostinas, procedimiento para su preparacion y su uso. - Google Patents
Ciclipostinas, procedimiento para su preparacion y su uso.Info
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Abstract
5 Compuesto de fórmula general I **(Fórmula)** en la que R 1 es 1. una cadena de carbono que tiene 10 a 18 átomos de carbono, que puede ser lineal, ramificada, saturada o insaturada, carbocíclica o heterocíclica y en la que la cadena de carbono está opcionalmente monosustituida o disustituida con: 1.1 -OH, 1.2 =O, 1.3 -O-alquilo-C1-C6, en donde el alquilo es lineal o ramificado, 1.4 -O-alquenilo-C2-C6, en donde el alquenilo es lineal o ramificado, 1.5 -alquilo-C1-C6, en donde el alquilo es lineal o ramificado, 1.6 -arilo, 1.7 -alquil-C1-C6-benceno, 1.8 -difenilo, 1.9 -NH-alquilo-C1-C6, en donde el alquilo es lineal o ramificado, 1.10 -NH-alquenilo-C2-C6, en donde el alquenilo es lineal o ramificado, 1.11 -NH2, 1.12 =S, 1.13 -S-alquilo-C1-C6, en donde el alquilo es lineal o ramificado, o 1.14 -S-alquenilo-C2-C6, en donde el alquenilo es lineal o ramificado, 1.15 halógeno, en donde los sustituyentes 1.1 a 1.15 pueden estar adicionalmente sustituidos; R 2 es 1.0 alquilo-C1-C6, en donde el alquilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido como se ha descrito en 1.1 a 1.15, 2.0 alquenilo-C2-C6, en donde el alquenilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido tal y como se ha descrito en 1.1 a 1.15, 3.0 alquinilo-C2-C6, en donde el alquinilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido tal y como se ha descrito en 1.1 a 1.15, E es un átomo de fósforo (P) y X1, X2 y X3 son -O- independientemente uno de otro.
Description
Ciclipostinas, procedimiento para su preparación
y su uso.
La invención se refiere a nuevos compuestos,
denominados ciclipostinas, obtenibles por cultivo de la especie HAG
004107 (DSM 13381) de Streptomyces y a sus sales
fisiológicamente tolerables y sus equivalentes químicos. La
invención se refiere adicionalmente a un procedimiento para la
preparación de las ciclipostinas, al microorganismo HAG 004107 (DSM
13381), al uso de las ciclipostinas y sus sales fisiológicamente
tolerables y sus equivalentes químicos como fármacos, en particular
como inhibidores de lipasas, y a preparaciones farmacéuticas que
contienen ciclipostina o una sal o un equivalente de la misma,
fisiológicamente tolerable.
Una enfermedad que se puede tratar de forma
particularmente ventajosa con los inhibidores de la lipasa es la
enfermedad del azúcar, diabetes mellitus. La diabetes mellitus es
una enfermedad que se caracteriza por concentraciones elevadas de
azúcar en sangre debido a trastornos metabólicos crónicos. Los
trastornos metabólicos se basan en una deficiencia en insulina o en
un efecto reducido de la insulina. La falta de efecto de la
insulina conduce a que las células corporales realicen un uso
defectuoso de la glucosa absorbida en la sangre. Por ello y debido
a la neogénesis de glucosa a partir de proteínas (gluconeogénesis),
se llega a un aumento del nivel de glucosa en sangre. Además, en el
caso de un efecto disminuido de la insulina en el tejido adiposo,
las hormonas antagonistas de la insulina, tales como el glucagón,
conducen a un incremento de la lipolisis y de este modo a
concentraciones elevadas de ácidos grasos en sangre. Tiene lugar
cetoacidosis, es decir, la formación incrementada de cuerpos
cetónicos (ácido acético, ácido
\beta-hidroxibutírico, acetona). Bajo condiciones
agudas, el grado de la mala regulación bioquímica es una amenaza de
muerte y conduce, sin tratamiento, al coma diabético y finalmente a
una muerte rápida. La diabetes pertenece a las enfermedades
metabólicas crónicas más frecuentes en los seres humanos, se estima
que hasta más del 3% de la población tiene una disposición
diabética o prediabética y está por ello fuertemente amenazada.
Por ello existe una gran necesidad de medios para
el tratamiento o la curación de la diabetes mellitus.
La diabetes se trata mediante la administración
de insulina y en la diabetes de adulto, la denominada no
dependiente de insulina (NIDDM) o de tipo II, se administran en
primer lugar sulfonilureas. El principio activo de las
sulfonilureas es una proliferación de la secreción de insulina de
las células \beta en el páncreas para compensar de este modo la
falta de hormona o la resistencia a insulina. Sin embargo, al
avanzar la enfermedad se tiene que emplear insulina. El efecto de
la insulina se puede resumir del modo siguiente. Esta hormona
peptídica reduce la concentración de glucosa en sangre y conduce a
un incremento de los procesos anabólicos y simultáneamente a una
inhibición de los procesos catabólicos:
- \bullet
- Incrementa el transporte de glucosa en las células corporales,
- \bullet
- Incrementa la formación de glucógeno en el hígado y en los músculos,
- \bullet
- Inhibe la lipolisis,
- \bullet
- Incrementa la absorción de ácidos grasos en el tejido graso e
- \bullet
- Incrementa la absorción de aminoácidos en las células corporales y la síntesis de proteínas.
Uno de los efectos más fuertes de la insulina es
la inhibición de la lipolisis. En el caso de diabéticos de tipo II,
esta regulación de la lipolisis ya no es eficaz y tiene lugar un
incremento del nivel de ácidos grasos libres en la sangre. Los
ácidos grasos libres en la sangre estimulan la gluconeogénesis en el
hígado y disminuyen el uso de glucosa en los músculos esqueléticos.
Se controla la lipolisis, es decir, la liberación de ácidos grasos
por la denominada lipasa sensible a hormonas (HSL), que se
encuentra en los adipocitos y se inhibe con insulina mediante una
cascada de fosforilaciones. Por ello serían deseables inhibidores,
es decir, inhibidores de la HSL, que estimulen la acción de la
insulina y sean capaces de disminuir el nivel de lípidos en sangre.
Tales agentes son adecuados para el tratamiento de diabéticos de
tipo II para controlar el metabolismo lipídico, pero también serían
posibles aplicaciones en otras enfermedades del tipo glucogenosis.
Por estas razones, se necesitan urgentemente nuevos inhibidores de
la HSL y de otras lipasas y por ello se buscan.
Se ha encontrado sorprendentemente que la cepa
del microorganismo HAG 004107, DSM 13381 de la especie
Streptomyces, es capaz de formar nuevos inhibidores de
lipasas altamente activos que inhiben la lipasa sensible a hormonas
incluso con concentraciones muy reducidas. Los nuevos compuestos
naturales son organofosfatos que constan de un sistema de anillo
doble (biciclo) y una cadena de carbonos sustituida e inhiben
específicamente las lipasas. La estructura de anillo ha sido
descrita por primera vez -sólo con un grupo metilo en lugar de la
cadena de carbono- como un inhibidor de la esterasa de acetilcolina,
CGA 134 736, por R. Neumann & H. H. Peter en Experientia,
Volumen 43, páginas 1235-1237, 1987 y
después el mismo compuesto, denominado ciclofostina, por T.
Kurokawa y col. en J. Antibiotics, 46,
1315-1318, 1993. Este compuesto relacionado
estructuralmente no tiene propiedades selectivas de inhibición de
lipasas. Las sustancias conocidas previamente tienen desventajas que
se manifiestan en un nivel de acción insatisfactorio, alta
toxicidad y/o efectos colaterales indeseados.
La presente invención se refiere por ello a
compuestos de fórmula I
en la
que
R^{1}
es
- 1.
- una cadena de carbono que tiene 10 a 18 átomos de carbono, que puede ser lineal, ramificada, saturada o insaturada, carbocíclica o heterocíclica y en la que la cadena de carbono está opcionalmente monosustituida o disustituida con:
- 1.1
- -OH,
- 1.2
- =O,
- 1.3
- -O-alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado,
- 1.4
- -O-alquenilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquenilo es lineal o ramificado,
- 1.5
- -alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado,
- 1.6
- -arilo,
- 1.7
- -alquil-C_{1}-C_{6}-benceno,
- 1.8
- -difenilo,
- 1.9
- -NH-alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado,
- 1.10
- -NH-alquenilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquenilo es lineal o ramificado,
- 1.11
- -NH_{2},
- 1.12
- =S,
- 1.13
- -S-alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado, o
- 1.14
- -S-alquenilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquenilo es lineal o ramificado,
- 1.15
- halógeno, en donde los sustituyentes 1.1 a 1.15 pueden estar adicionalmente sustituidos;
R^{2}
es
- 1
- alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido como se ha descrito en 1.1 a 1.15,
- 2
- alquenilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquenilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido tal y como se ha descrito en 1.1 a 1.15, o
- 3
- alquinilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquinilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido tal y como se ha descrito en 1.1 a 1.15,
E es fósforo (P)
y
X_{1}, X_{2} y X_{3}
independientemente uno de otro,
son
- 1
- -O-,
en todas sus formas estereoquímicas
y mezclas de estas formas en cualquier proporción y sus sales
fisiológicamente
tolerables.
R^{1} tiene una longitud de cadena de 10 a 18
átomos de C. La cadena puede estar saturada, p. ej., -alquilo, en
donde el alquilo puede ser lineal o ramificado, o insaturada, p.
ej., -alquenilo o -alquinilo, en donde el alquenilo o el alquinilo
es lineal o ramificado. R_{1} puede estar no sustituido o estar
de forma idéntica o diferente, monosustituido o disustituido con los
grupos 1.1 a 1.15, tal y como se han descrito anteriormente. Se
prefieren los sustituyentes en los átomos de carbono 8' a 16', y
las posiciones 10' a 14' son especialmente preferidas. Los
sustituyentes 1.1 a 1.15 también pueden estar adicionalmente
sustituidos por uno o varios grupos seleccionados entre: alcohol,
aldehído, acetal, cetal, éter, carboxilo, éster, amino, nitrilo,
nitro, oxima, éter de oxima y halógeno.
Una cadena de carbonos carbocíclicos con 10 a 18
átomos de C es una cadena que consta de 10 a 18 átomos de C, con
uno o con varios sistemas de anillos, preferentemente con uno, dos
o tres sistemas de anillos que, en cada caso, constan
preferentemente de 4, 5, 6 o 7 átomos de carbono. Los anillos pueden
ser monocíclicos, dicíclicos o tricíclicos, preferentemente
monocíclicos y estar situados en el comienzo, en el centro y/o al
final de la cadena de carbono. Los carbociclos pueden ser de
naturaleza alifática o aromática. Ejemplos son: difenilos o
alquilbencenos sustituidos.
Una cadena de carbonos heterocíclica con 10 a 18
átomos de carbono es una cadena que consta de 10 a 18 átomos de
carbono que tiene uno o varios, preferentemente uno a tres sistemas
de anillos en los que al menos un átomo de carbono está sustituido
por heteroátomos, tales como O, S o N. Los anillos pueden ser mono,
di o tricíclicos, preferentemente monocíclicos y estar situados en
el comienzo, en el centro y/o al final de la cadena de carbonos.
Pueden ser preferentemente anillos de 4-, 5-, 6- o
7-miembros de naturaleza alifática o aromática.
Ejemplos son: alquilpiperidinas que están sustituidas o no
sustituidas.
Halógeno es cloruro, bromuro, fluoruro o
seudohaluros, tales como cianuro (nitrilo).
Alquilo-C_{1}-C_{6}
es un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1, 2, 3, 4, 5
o 6 átomos de C, como por ejemplo, metilo, etilo,
i-propilo, terc-butilo y
hexilo.
Alquenilo-C_{2}-C_{6}
es un alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene 2, 3, 4, 5
o 6 átomos de C, tales como por ejemplo, alilo, crotilo y
pentenilo.
Alquinilo-C_{2}-C_{6}
es un alquinilo de cadena lineal o ramificada que tiene 2, 3, 4, 5
o 6 átomos de C, como por ejemplo, propinilo, butinilo y
pentinilo.
R^{1} es
preferentemente
- 1
- -(CH_{2})_{15}CH_{3},
- 2
- -(CH_{2})_{13}CH(CH_{3})_{2},
- 3
- -(CH_{2})_{11}CH(OH)(CH_{2})_{3}CH_{3},
- 4
- -(CH_{2})_{11}CH(OH)CH_{2}CH(CH_{3})_{2},
- 5
- -(CH_{2})_{12}CH(OH)(CH_{2})_{2}CH_{3},
- 6
- -(CH_{2})_{13}CH(OH)CH_{2}CH_{3},
- 7
- -(CH_{2})_{14}CH(OH)CH_{3},
- 8
- -(CH_{2})_{15}CH_{2}(OH),
- 9
- -(CH_{2})_{16}CH_{3}, o
- 10.0
- -(CH_{2})_{13}C=OCH_{2}CH_{3}
- 11.0
- -(CH_{2})_{12}C=OCH_{2}CH_{2}CH_{3}
- 12.0
- -(CH_{2})_{11}C=OCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}
- 13.0
- -(CH_{2})_{13}CH_{3}
- 14.0
- -(CH_{2})_{11}CH(CH_{3})_{2}
- 15.0
- -(CH_{2})_{14}CH_{3} o
- 16.0
- -(CH_{2})_{12}CH(CH_{3})_{2}
R^{2} es preferentemente
alquilo-C_{1}-C_{6}, en
particular, metilo, etilo o propilo.
Compuestos preferidos de la invención se indican
a continuación:
Ciclipostina A de fórmula II:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ciclipostina A 2 de fórmula II A:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ciclipostina B de fórmula III:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ciclipostina C de fórmula IV:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ciclipostina D de fórmula V:
\newpage
Ciclipostina E de fórmula VI:
Ciclipostina F de fórmula VII:
Ciclipostina G de fórmula VIII:
Ciclipostina H de fórmula IX:
Ciclipostina N de fórmula X:
Ciclipostina P de fórmula XI:
Ciclipostina P 2 de fórmula XI A:
Ciclipostina Q de fórmula XII:
Ciclipostina R de fórmula XIII:
Ciclipostina R2 de fórmula XIIIA:
Ciclipostina S de fórmula XIV:
Ciclipostina T de fórmula XV:
Ciclipostina T2 de fórmula XV A:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en todas sus formas estereoquímicas
y mezclas de estas formas en cualquier proporción, así como sus
sales fisiológicamente
tolerables.
La forma de contar los átomos de carbono para los
espectros de RMN en las fórmulas mencionadas anteriormente es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Sólo el sistema de anillo ya contiene dos átomos
asimétricamente sustituidos, los átomos de carbono 3 y el átomo de
fósforo. Ambos átomos pueden estar presentes en la configuración R
o la S. Se ha encontrado sorprendentemente que la cepa HAG 004107,
DSM 13381 de la especie Streptomyces es capaz en cada caso
de formar una cantidad de estereoisómeros de los compuestos de
fórmula general I, es decir, la cepa sintetiza compuestos en los
que los átomos C3 y P pueden asumir, independientemente uno de
otro, la configuración R o la S. Los isómeros que tienen la forma
espacial sobre el carbono(3) en la configuración R y sobre
el fósforo en la configuración S, aparecen en menor cantidad en
cultivos de la especie HAG 004107, DSM 13381 de
Streptomyces. Fórmula I A:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Además, sin embargo, las ciclipostinas que tienen
otras configuraciones, tales como (R,R), (S,S) o (S,R) también se
forman, lo que también tiene sorprendentemente unos efectos
considerables de inhibición de lipasas.
El compuesto de fórmula I o una sal o un
equivalente químico fisiológicamente tolerable del mismo, se puede
preparar por fermentación del microorganismo HAG 004107, DSM 13381
de la especie Streptomyces o una de sus variantes o mutantes
bajo condiciones adecuadas, en un medio de cultivo, hasta que uno o
varios compuestos de fórmula general I se acumulan en el medio de
cultivo y a continuación se pueden aislar del medio de cultivo y
convertir opcionalmente en equivalentes químicos y sales
fisiológicamente tolerables.
Las ciclipostinas de acuerdo con la invención se
pueden producir a través de la especie Actinomycetales,
preferentemente con la especie de Streptomyces HAG 004107,
DSM 13381. HAG 004107, DSM 13381 de la especie Streptomyces
tiene un micelio de color marfil (RAL 1014) y se caracteriza por los
conidióforos característicos de los estreptomicetos.
Se depositó un aislado en la Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D
38124 Braunschweig, Alemania, según las normas del Tratado de
Budapest, el 16 de marzo, 2000, con el siguiente número: especie
Streptomyces HAG 004107, DSM 13381.
En lugar de la cepa HAG 004107, DSM 13381 de la
especie Streptomyces, también se pueden emplear sus mutantes
y variantes que sintetizan uno o varios compuestos de las
ciclipostinas de acuerdo con la invención. Tales mutantes se pueden
producir de forma conocida por sí misma mediante medios físicos, por
ejemplo radiación, tal como ultravioleta o rayos X, o mutágenos
químicos, tales como metanosulfonato de etilo (EMS),
2-hidroxi-4-metoxi-benzofenona
(MOB) o
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG).
La invención se refiere, por tanto, a un
procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I o
una sal fisiológicamente tolerable del mismo, caracterizado porque
comprende fermentar el microorganismo HAG 004107, DSM 13381 de la
especie Streptomyces o una de sus variantes o mutantes bajo
condiciones adecuadas en un medio de cultivo, hasta que se acumulen
uno o varios compuestos de fórmula general I en el medio de cultivo
y a continuación aislarlos del medio de cultivo y convertirlos
opcionalmente en equivalentes químicos y sales fisiológicamente
tolerables.
Preferentemente, la cepa HAG 004107, DSM 13381 de
la especie Streptomyces, sus mutantes y/o variantes se
fermentan en una solución nutritiva (también denominada medio de
cultivo) con una fuente de carbono y de nitrógeno y las sales
inorgánicas acostumbradas, hasta que las nuevas ciclipostinas se
acumulan en el medio de cultivo, a continuación se aislan las
ciclipostinas del medio de cultivo y opcionalmente se separan en
los componentes activos individuales.
La fermentación tiene lugar preferentemente bajo
condiciones aerobias, se desarrolla particularmente bien a una
temperatura entre 18 y 35ºC y a un pH entre 6 y 8.
El procedimiento de acuerdo con la invención se
puede emplear para la fermentación a escala de laboratorio
(intervalo de mililitros hasta litros) y para la escala industrial
(escala de metros cúbicos). Todos los porcentajes se refieren, si
no se indica de otro modo, al peso. Las proporciones de mezcla en
el caso de líquidos se refieren al volumen, si no se proporcionan
otros datos.
Se prefieren como fuentes de carbono adecuadas
para la fermentación aerobia, los carbohidratos asimilables y los
polioles, tales como glucosa, lactosa, sacarosa o
D-manitol, y los productos naturales que contienen
carbohidratos, tales como copos de avena, harina de soja y extracto
de malta. Como posibles nutrientes que contienen nitrógeno se
consideran: los aminoácidos, los péptidos y las proteínas, y sus
productos de degradación, tales como peptonas o triptonas, además,
extractos de carne, extractos de levadura, semillas molidas, por
ejemplo de maíz, trigo, judías, soja o la planta del algodón,
residuos de la destilación de la producción de alcohol, harinas de
carne o extractos de levadura, pero también sales de amonio y
nitratos. Las sales inorgánicas que puede contener la solución
nutritiva son, por ejemplo, cloruros, carbonatos, sulfatos o
fosfatos de metales alcalinos o alcalinotérreos, hierro, zinc,
cobalto y manganeso.
La formación de las ciclipostinas de fórmula II a
XV A de acuerdo con la invención, tiene lugar particularmente bien
en un medio de cultivo que contiene aproximadamente 0,1 a 5%,
preferentemente 0,3 a 3% de copos de avena y elementos traza. Los
datos en tantos por ciento se refieren en cada caso al peso de todo
el medio de cultivo.
La formación preferida de ciclipostinas de
fórmula VIII a XV A se puede realizar particularmente bien en
soluciones nutritivas que contienen aproximadamente 0,1 a 5%,
preferentemente 0,3 a 2% de glicerol y 0,2 a 5%, preferentemente 0,5
a 3% de harina de soja y 0,05 a 1,0 g/l, preferentemente 0,1 a 1,0
g/l de cloruro sódico.
En el medio de cultivo, la especie de
Streptomyces HAG 004107, DSM 13381 forma una mezcla de
ciclipostinas. Dependiendo de la composición del medio de cultivo,
puede variar la proporción cuantitativa de una o de varias de las
ciclipostinas de acuerdo con la invención. Además, es posible
mediante la composición de los medios, controlar la síntesis de las
ciclipostinas individuales de modo que una o también varias
ciclipostinas no se preparen en absoluto o se preparen en una
cantidad inferior al límite de detección del microorganismo.
Preferentemente, el cultivo contiene una
ciclipostina detectable. Se forman preferentemente las
ciclipostinas A o P o P 2.
Además de las ciclipostinas A hasta T2
(compuestos de fórmula II a XV A) se forman otros compuestos
relacionados en el medio de cultivo de la especie de
Streptomyces HAG 004107, DSM 13381 que difieren de los
compuestos mostrados en las fórmulas II a XV A en los restos
modificados R^{1} y R^{2}. Se han encontrado en cantidades
menores ciclipostinas que tienen restos R^{1} truncados y
ramificados adicionalmente. También son detectables productos de
oxidación (hidroxilación) de estos componentes secundarios, en
cultivos de Streptomyces HAG 004107, DSM 13381.
El cultivo del microorganismo se realiza de forma
aerobia, es decir, por ejemplo, sumergido con sacudidas o en
frascos de agitación o fermentadores, si es adecuado, con
introducción de aire o de oxígeno. Se puede realizar en un
intervalo de temperatura desde aproximadamente 18 hasta 35ºC,
preferentemente a aproximadamente 25 a 32ºC, especialmente de 26
hasta 30ºC. El intervalo de pH debe estar entre 6 y 8,
preferentemente entre 6,5 y 7,8. Los microorganismos se cultivan
con estas condiciones en general durante un periodo de 24 a 300
horas, preferentemente 30 a 90 horas.
De forma ventajosa el cultivo se realiza en una
variedad de etapas, es decir, primero se preparan uno o varios
precultivos en un medio de cultivo líquido, que a continuación se
inoculan en el medio de producción real, el cultivo principal, por
ejemplo, en una proporción en volumen de 1:10. El precultivo se
obtiene, por ejemplo, inoculando un micelio en una solución
nutritiva y permitiéndole crecer durante aproximadamente 36 a 120
horas, preferentemente 48 a 96 horas. El micelio se puede obtener
por ejemplo, dejando crecer la cepa durante aproximadamente 3 a 40
días, preferentemente 4 a 10 días, sobre un medio nutritivo sólido
o líquido, por ejemplo,
maíz-levadura-agar o copos de
avena-agar.
El curso de la fermentación se puede vigilar
mediante el valor del pH de los cultivos o el volumen de micelio y
por métodos cromatográficos, tales como cromatografía en capa fina
o cromatografía de líquidos a alta presión o sometiendo a ensayo la
actividad biológica. Las ciclipostinas de acuerdo con la invención
están presentes en el micelio y en una parte menor también en el
material filtrado del cultivo. El procedimiento de aislamiento
descrito a continuación sirve para la purificación de las
ciclipostinas de acuerdo con la invención, preferentemente para la
purificación de las ciclipostinas A y P.
El aislamiento y/o la purificación de las
ciclipostinas de acuerdo con la invención, a partir del medio de
cultivo se realiza según métodos conocidos, teniendo en cuenta las
propiedades químicas, físicas y biológicas de las sustancias
naturales. Para someter a ensayo la concentración de ciclipostina en
el medio de cultivo o en las etapas individuales del aislamiento,
se puede utilizar la cromatografía en capa fina, por ejemplo, sobre
gel de sílice empleando cloruro de metileno/acetato de etilo o
cloroformo/mezclas de metanol (p. ej., en la proporción relativa
98:1) como eluyente o HPLC. La detección en el caso de la
separación por cromatografía en capa fina se puede realizar, por
ejemplo, mediante reactivos de color, tales como molibdato de ácido
fosfórico o vapor de I_{2}, comparándose la cantidad de sustancia
formada convenientemente con una solución de calibración.
Para aislar las ciclipostinas de acuerdo con la
invención, se separa en primer lugar el micelio del medio de
cultivo, de acuerdo con los procedimientos convencionales y a
continuación se extraen las ciclipostinas de la masa celular
empleando un disolvente orgánico que es opcionalmente miscible en
agua. La fase del disolvente orgánico contiene las ciclipostinas de
acuerdo con la invención, opcionalmente se concentran a vacío y se
purifican adicionalmente tal y como se describe a continuación.
El material filtrado del cultivo se combina
opcionalmente con el material concentrado del extracto de micelio y
con un disolvente orgánico adecuado, no miscible en agua, por
ejemplo, con n-butanol o acetato de etilo. La fase
orgánica separada a continuación se concentra opcionalmente a vacío
y se disuelve en 1/30 del volumen original de agua/metanol.
La purificación adicional de una o de varias de
las ciclipostinas de acuerdo con la invención, se realiza por
cromatografía sobre materiales adecuados, preferentemente, por
ejemplo, sobre tamices moleculares, soportes de fase normal, tales
como gel de sílice, alúmina, sobre intercambiadores iónicos o sobre
resinas de adsorción o sobre fases inversas (fase inversa, RP). Con
ayuda de estos procedimientos cromatográficos se separan las
ciclipostinas. La cromatografía de las ciclipostinas tiene lugar
empleando disolventes orgánicos o empleando mezclas de soluciones
acuosas y orgánicas.
Mezclas de soluciones acuosas u orgánicas
significan todos los disolventes orgánicos miscibles en agua,
preferentemente metanol, propanol y acetonitrilo, en una
concentración de 10 a 100% de disolvente, preferentemente 60 a 90%
de disolvente o, alternativamente, todas las soluciones acuosas
tamponadas que son miscibles con disolventes orgánicos. Los
tampones que se pueden utilizar son los mismos que se han indicado
anteriormente.
La separación de las ciclipostinas basándose en
su diferente polaridad se realiza con ayuda de la cromatografía en
fase inversa, por ejemplo sobre una MCI® (resina adsorbente de
Mitsubishi, Japón) o Amberlite XAD® (TOSOHAAS), sobre otros
materiales hidrófobos, tales como fases de RP-8- o
RP-18. Además, la separación puede realizarse con
ayuda de cromatografía en fase normal, por ejemplo, sobre gel de
sílice, alúmina y similares.
La cromatografía de las ciclipostinas tiene lugar
empleando soluciones acuosas tamponadas o acidificadas o mezclas de
soluciones acuosas con alcoholes u otros disolventes orgánicos
miscibles con agua. El disolvente orgánico empleado es
preferentemente propanol y acetonitrilo.
Soluciones acuosas tamponadas o acidificadas
significan, por ejemplo, agua, tampón fosfato, acetato de amonio,
tampón citrato en una concentración de 1 mM a 0,5 M y ácido
fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético o todos los ácidos
disponibles comercialmente conocidos por la persona experta en la
técnica, preferentemente en una concentración de 0,01 a 3%, en
particular 0,1%.
La cromatografía se realiza empleando un
gradiente que comienza con 100% de tampón acuoso y termina con 100%
de disolvente, preferentemente se usa un gradiente lineal de 50 a
100% de 2-propanol o acetonitrilo.
Alternativamente, se puede utilizar también
cromatografía en gel o cromatografía sobre fases hidrófobas.
La cromatografía en gel se realiza sobre geles de
poliacrilamida o de polímeros mezclados, tales como p. ej.,
Biogel-P 2® (de Biorad), Fractogel TSK HW 40® (de
Merck, Alemania o Toso Haas, EE.UU.) o sobre Sephadex® (de
Pharmacia, Uppsala, Suecia).
La secuencia de las cromatografías mencionadas
anteriormente es reversible.
Otra etapa de purificación muy eficaz para las
ciclipostinas es la cristalización. Las ciclipostinas cristalizan
en soluciones de disolventes orgánicos y en mezclas de agua con
disolventes orgánicos. La cristalización tiene lugar de una forma
conocida por sí misma, por ejemplo por concentración o enfriamiento
de soluciones de ciclipostinas saturadas.
Las ciclipostinas de acuerdo con la invención son
estables en estado sólido o líquido y en soluciones con un
intervalo de pH entre 4 y 8, en particular 5 y 7 y se pueden
incorporar de este modo en preparaciones farmacéuticas
ordinarias.
Los ésteres, los derivados de ésteres, los
productos de la oxidación, la hidrogenación y la reducción se
pueden preparar de acuerdo con los procedimientos descritos en la
bibliografía, p. ej., en Advanced Organic Synthesis, 4ª Edición, J.
March, John Wiley & Sons., 1992.
La presente invención incluye todas las formas
estereoisómeras de los compuestos de fórmula I a XV A. Los centros
asimétricos contenidos en los compuestos de fórmula I a XV A pueden
tener todos, independientemente unos de otros, la configuración S o
la configuración R. La invención incluye todos los enantiómeros y
diastereómeros posibles, así como las mezclas de dos o más formas
estereoisómeras, por ejemplo, mezclas de enantiómeros y/o
diastereómeros, en todas las proporciones. La invención se refiere,
además, a enantiómeros en forma enantioméricamente pura, tanto las
antípodas levogiratorias como dextrogiratorias, las configuraciones
R y S, en forma de racematos y en forma de mezclas de los dos
enantiómeros en todas las proporciones que son objeto de la
invención. En presencia de isomerismo cis/trans, la invención se
refiere a la forma cis y a la forma trans y a mezclas de estas
formas en todas las proporciones.
Basándose en sus valiosas propiedades
farmacológicas, los compuestos de acuerdo con la invención son
adecuados para uso como fármacos en la medicina humana y
veterinaria. Inhiben lipasas y tienen propiedades favorables para el
tratamiento de alteraciones metabólicas que tienen su causa en la
alteración del metabolismo lipídico. Los compuestos de fórmula
general I de acuerdo con la invención tienen una acción inhibidora
sorprendente sobre la lipasa sensible a hormonas, HSL, una enzima
alostérica en adipocitos que se inhibe con insulina y que es
responsable de la destrucción de grasas en los adipocitos y, por
tanto, de la transferencia de constituyentes grasos a la corriente
sanguínea. Una inhibición de esta enzima se corresponde, por tanto,
con una acción similar a la insulina de los compuestos de acuerdo
con la invención, que conduce finalmente a una disminución de los
ácidos grasos libres en la sangre y del azúcar en la sangre. Por
ello, se pueden emplear también en disfunciones del metabolismo,
tales como diabetes mellitus no dependiente de insulina, el
síndrome diabético y en lesiones directas del páncreas.
La invención se refiere, por tanto, a
preparaciones farmacéuticas que contienen una o varias
ciclipostinas de acuerdo con la invención y/o sus equivalentes
químicos. Se prefiere el uso de una mezcla con excipientes o
material de soporte adecuados. Los materiales de soporte que se
pueden emplear en los seres humanos son todos los materiales de
soporte y/o excipientes farmacológicamente tolerables.
La invención se refiere adicionalmente a un
procedimiento para la preparación de un fármaco de acuerdo con la
invención, que se caracteriza porque comprende proporcionar al
menos uno de los compuestos de acuerdo con la invención con una
forma de administración adecuada, empleando un vehículo
farmacéuticamente adecuado y fisiológicamente tolerable, si es
adecuado, otros compuestos activos, aditivos o excipientes
adecuados.
Los fármacos de acuerdo con la invención se
administran generalmente por vía oral, local o parenteral, pero
también es posible en principio una administración por vía rectal.
Las formas de preparación farmacéutica sólidas o líquidas son, por
ejemplo, gránulos, polvos, comprimidos, grageas, (micro-)cápsulas,
supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, aerosoles, gotas o
soluciones inyectables en forma de ampolla, así como preparaciones
que tiene liberación retardada del compuesto activo, en cuya
preparación se emplean normalmente vehículos y aditivos y/o
excipientes tales como agentes disgregantes, agentes aglutinantes,
agentes de revestimiento, agentes de hinchamiento, agentes
lubricantes, agentes saboreantes, edulcorantes o solubilizantes.
Los vehículos o excipientes empleados frecuentemente que se pueden
mencionar son, por ejemplo, carbonato de magnesio, dióxido de
titanio, lactosa, manitol y otros azúcares, talco, lactoproteína,
gelatina, almidón, vitaminas, celulosa y sus derivados, aceites
animales o vegetales, polietilenglicoles y disolventes, tales como
agua esterilizada, alcoholes, glicerol y alcoholes
polihídricos.
Si es adecuado, las unidades de dosificación se
pueden microencapsular para la administración oral, para retardar
la liberación o para extenderla durante un periodo de tiempo más
largo, tal como revistiendo o embebiendo el compuesto activo en
forma de partículas en polímeros adecuados, ceras o similares.
Preferentemente, las preparaciones farmacéuticas
se preparan y se administran en dosis unitarias, conteniendo cada
unidad una dosis específica de uno o varios compuestos de las
ciclipostinas de acuerdo con la invención y/o derivados químicos de
las mismas. En el caso de unidades de dosificación sólidas, tales
como comprimidos, cápsulas y supositorios, esta dosis puede ser de
hasta aproximadamente 200 mg, pero con preferencia aproximadamente
0,1 a 100 mg, y en el caso de soluciones inyectables en forma de
ampolla hasta aproximadamente 200 mg, pero con preferencia
aproximadamente hasta 0,1 a 100 mg, al día.
La dosis diaria que se va a administrar depende
del peso corporal, de la edad, del sexo y del estado del mamífero.
En ciertas circunstancias, sin embargo, pueden ser adecuadas dosis
diarias mayores o menores. La administración de la dosis diaria se
puede realizar mediante una administración aislada en forma de una
unidad de dosificación individual o en forma de diversas unidades de
dosificación menores o por la administración repetida de dosis
subdivididas a intervalos específicos. La invención se refiere
también a preparaciones farmacéuticas que contienen una o varias de
las ciclipostinas de acuerdo con la invención y/o sus derivados
químicos. Se prefiere el uso de una mezcla con excipientes o
material de soporte adecuados. Como material de soporte en humanos
se puede utilizar todos los materiales de soporte o excipientes
farmacológicamente aceptables.
El efecto de los compuestos de fórmula I de
acuerdo con la invención se sometió a ensayo con el siguiente
sistema de ensayo enzimático:
Lipocitos aislados de rata se obtienen a partir
de tejido graso del epidídimo de ratas macho no tratadas (Wistar,
220-250 g) mediante tratamiento con colagenasa,
según los procedimientos publicados (p. ej., S. Nilsson y col.,
Anal. Biochem. 158, 1986, 399 - 407; G. Fredrikson y col., J. Biol.
Chem. 256, 1981, 6311 - 6320; H. Tomquist y col., J. Biol. Chem.
251, 1976, 813 - 819). Los lipocitos de 10 ratas se lavan tres
veces por flotación con 50 ml de tampón de homogeneización en cada
lavado (25 ml de Tris/HCI, pH 7,4, sacarosa 0,25 M, EDTA 1 mM, DTT
1 mM, 10 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de antipaína, 20
\mug/ml de pepstatina) y finalmente se toman en 10 ml de tampón de
homogeneización. Los lipocitos se homogeneizan en un homogeneizador
de Teflón-en-vidrio
(Braun-Melsungen) mediante 10 recorridos a 1500 rpm
y 15ºC. El material homogeneizado se centrifuga (Sorvall tubos
SM24, 5000 rpm, 10 min, 4ºC). La capa inferior entre la capa grasa
superior y el sedimento se retira y se repite la centrifugación. La
capa inferior resultante de esto, se centrifuga de nuevo (Sorvall
tubos SM24, 20000 rpm, 45 min, 4ºC). La capa inferior se retira y
se trata con 1 g de heparina-Sepharosa
(Pharmacia-Bíotech, CL-6B, se lava
5 x con Tris/HCl 25 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM). Después de incubar
durante 60 min a 4ºC (sacudir a intervalos de 15 min), se
centrifuga la carga (Sorvall tubos SM24, 3000 rpm, 10 min, 4ºC). El
material sobrenadante se lleva a pH 5,2 añadiendo ácido acético y
se incuba a 4ºC durante 30 min. El material precipitado se recoge
por centrifugación (Sorvall SS34, 12000 rpm, 10 min, 4ºC) y se
suspende en 2,5 ml de Tris/HCl 20 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM, NaCl 65 mM,
13% de sacarosa, DTT 1 mM, 10 \mug/ml de
leupeptina/pepstatina/antipaína. La suspensión se dializa durante
una noche a 4ºC contra Tris/HCl 25 mM, pH 7,4, 50% de glicerol, DTT
1 mM, 10 \mug/ml de leupeptina, pepstatina, antipaína y a
continuación se aplica a una columna de hidroxiapatito (0,1 g por 1
ml de suspensión, equilibrada con fosfato potásico 10 mM, pH 7,0,
30% de glicerol, DTT 1 mM). La columna se lava con cuatro volúmenes
de tampón de equilibrio con un caudal de 20 a 30 ml/h. La HSL se
eluye con un volumen de tampón de equilibrio que contiene fosfato
potásico 0,5 M, a continuación se dializa (véase arriba) y se
concentra 5 a 10 veces por ultrafiltración (Amicon Diaflo filtro PM
10) a 4ºC. La HSL parcialmente purificada se puede almacenar a
-70ºC durante 4 a 6 semanas.
Para la preparación del sustrato, se mezclaron
25-50 \muCi de [^{3}H]trioleoilglicerol
(en tolueno), 6,8 \muMol de trioleoilglicerol sin marcar y 0,6 mg
de fosfolípidos (fosfatidilcolina/fosfatidilinositol 3:1 p/v), se
secó sobre N_{2} y después se aplicó a 2 ml de KP_{i} 0,1 M; (pH
7,0) mediante tratamiento con ultrasonidos (Branson 250,
micropuntas, ajustada a 1-2, 2 x 1 min en
intervalos de 1 minuto). Después de añadir 1 ml de KP_{i} y un
nuevo tratamiento con ultrasonidos (4 x 30 s sobre hielo en
intervalos de 30 s), se añade 1 ml de 20% de BSA (seroalbúmina de
ternera) (en KP_{i}) (concentración final de trioleoilglicerol
1,7 mM). Para la reacción se pipetean 100 \mul de solución del
sustrato a 100 \mul de solución de HSL (HSL preparada como
arriba, diluida en KP_{i} 20 mM, pH 7,0, EDTA 0, 1 mM, DTT 1 mM,
0,02% de BSA, 20 \mug/ml de pepstatina, 10 \mug/ml de
leupeptina) y se incuba durante 30 min a 37ºC. Después de añadir
3,25 ml de metanol/cloroformo/heptano (10:9:7) y de 1,05 ml de
K_{2}CO_{3} 0,1 M, ácido bórico 0,1 M (pH 10.5), se mezcla a
fondo la carga y finalmente se centrifuga (800 x g, 20 min).
Después de la separación de fases, se retira un equivalente de la
fase superior (1 ml) y se determina la radiactividad por medición
del centelleo líqui-
do.
do.
Las sustancias se someten a ensayo normalmente en
cuatro cargas independientes. La inhibición de la actividad
enzimática de la HSL con una sustancia del ensayo se determina por
comparación con una reacción testigo no inhibida. El cálculo del
valor de la IC_{50} tiene lugar mediante una curva de inhibición,
empleando al menos 10 concentraciones de la sustancia del ensayo.
Para el análisis de los datos se emplea el paquete de programas
GRAPHIT, Elsevier-BIOSOFT. En este ensayo, los
compuestos mostraban el siguiente efecto: Las ciclipostinas A, P,
P2 y R inhiben la lipolisis en adipocitos de ratas con IC_{50} =
\sim 0,2 \muM, inhiben la lipasa humana sensible a hormonas
(HSL) con trioleilglicerol como sustrato: IC_{50} = \sim 0,07
hasta 0,5 \muM. Con NBD
(4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol)
como sustrato, se inhibe la HSL de ratas en concentraciones de 4 nM
a 10 nM.
Las ciclipostinas inhiben tanto la lipasa
sensible a hormonas (HSL) como la
monoacilglicerol-lipasa del extracto de ratas en
concentraciones submicromolares.
La invención se ilustra adicionalmente en los
siguientes ejemplos. Los porcentajes se refieren al peso. Las
proporciones de las mezclas en el caso de líquidos se refieren al
volumen, si no se indican otros datos.
100 ml de solución nutritiva (2% de extracto de
malta, 0,2% de extracto de levadura, 1,0% de glucosa, 0,05% de
(NH_{4})_{2}HPO_{4}, pH 6,0) en un matraz Erlenmeyer
estéril de 300 ml se inoculan con la cepa de la especie de
Streptomyces HAG 004107, DSM 13381 y se incuba en un agitador
giratorio a 28ºC y 180 rpm durante 7 días. A continuación se
diluyen 1,5 ml de este cultivo con 1,5 ml de glicerol al 99% y se
almacena a -20ºC.
Un matraz Erlenmeyer estéril de 300 ml que
contiene 100 ml de la siguiente solución nutritiva: 15 g/l de
glucosa, 15 g/l de harina de soja, 5 g/l de líquido de maceración
de maíz, 2 g/l de CaCO_{3} y 5 g/l de NaCl se inocula con un
cultivo que ha crecido en un tubo inclinado (misma solución
nutritiva, pero con 2% de agar) o con 1 ml de un cultivo de
glicerol (véase Ejemplo 1) y se incuba a 180 rpm y 28ºC en un
agitador. Un cultivo sumergido de 48 a 96 horas (cantidad de
inoculación aproximadamente 10%) de la misma solución nutritiva es
suficiente para inocular fermentadores de 10 y 200 l.
Matraces Erlenmeyer estériles de 300 ml que
contienen la siguiente solución nutritiva:
| 20 g/l de copos de avena para perros | |
| 2,5 ml de solución de elementos traza |
se inoculan con una cantidad de 10%
de inoculación del precultivo (Ejemplo 2) y se incuban a 180 rpm y
28ºC en un agitador. El cultivo se puede utilizar después de dos
días para obtener las ciclipostinas o para inocular fermentadores.
La solución de elementos traza tiene la siguiente
composición:
| 3 g/l de CaCl_{2} x 2H_{2}O | |
| 1 g/l de citrato de Fe(III); | |
| 0,2 g/l de MnSO_{4} x H_{2}O; | |
| 0,1 g/l de ZnCl_{2}; | |
| 0,025 g/l de CuSO_{4} x 5H_{2}O, | |
| 0,02 g/l de tetraborato sódico | |
| 0,004 g/l de CoCl_{2} x 6H_{2}O | |
| 0,01 g/l de molibdato sódico. |
Un fermentador de 200 l funciona con 90 litros de
solución nutritiva bajo las siguientes condiciones:
| Medio nutritivo: | 20 g/l de copos de avena en agua; |
| 2,5 ml/l de elementos traza. | |
| pH 7,8 (antes de la esterilización) |
La solución nutritiva se esteriliza con calor
durante 30 minutos y, después de enfriar, se inocula 5% del volumen
con material de inoculación obtenido según el Ejemplo 3.
\newpage
| Solución de elementos traza: | 3 g/l de CaCl_{2} x 2H_{2}O |
| 1 g/l de citrato de Fe(III); | |
| 0,2 g/l de MnSO_{4} x H_{2}O; | |
| 0,1 g/l de ZnCl_{2}; | |
| 0,025 g/l de CuSO_{4} X 5H_{2}O, | |
| 0,02 g/l de tetraborato sódico | |
| 0,004 g/l de CoCl_{2} x 6H_{2}O | |
| 0,01 g/l de molibdato sódico. | |
| Duración del proceso: | 72 horas |
| Temperatura de incubación: | 28ºC |
| Velocidad de agitación: | 90 rpm |
| Aireación: | 6 m^{3} de aire por hora. |
La fermentación se realiza sin añadir
antiespumante. La producción máxima se alcanza después de
aproximadamente 40 a 76 horas.
Un fermentador de 200 l funciona con las
siguientes condiciones con un llenado de 100 l:
| Medio nutritivo: | 5 g/l de glucosa; |
| 20 g/l de glicerol; | |
| 20 g/l de harina de soja; | |
| 5 g/l de extracto de levadura; | |
| 3 g/l de NaCl; | |
| 2,5 ml/l de solución de elementos traza | |
| pH 7,0 (antes de la esterilización) | |
| Duración del proceso: | 72 horas, |
| Temperatura de incubación: | 27ºC, |
| Velocidad de agitación: | 65 rpm, |
| Aireación: | 6 m^{3} de aire por hora, |
La fermentación se realiza sin añadir agentes que
eviten la formación de espuma. La producción máxima se alcanza
después de aproximadamente 48 horas.
Después de completar la fermentación de la
especie de Streptomyces HAG 004107, DSM 13381, se filtran
100 litros de caldo de cultivo del fermentador, obtenido según el
Ejemplo 4, con adición de aproximadamente 2% de materias filtrantes
(p. ej. Celite®) y la masa celular (10 litros) se extrae con 40
litros de metanol. La solución que contiene el compuesto activo,
solución metanólica, se libera del micelio por filtración y
concentración a vacío. El material concentrado se aplica a una
columna preparada ®MCI GEL, CHP20P de 7 litros. La elución se
realiza empleando un gradiente de agua a propanol-2.
El caudal de la columna (20 litros por hora) se recoge en
fracciones (10 litros cada una) y las fracciones que contienen
ciclipostinas (19 a 21) se concentran en cada caso a vacío. Las
fracciones se analizan mediante HPLC (véase el Ejemplo 7). La
fracción 19 comprende las ciclipostinas A hasta E y sus isómeros, la
fracción 20 la ciclipostina F y sus isómeros, la fracción 21 los
inhibidores ciclipostina N, P, P 2, Q, R, S y T así como sus
isómeros.
El análisis por cromatografía líquida de alta
densidad (HPLC) de las ciclipostinas se realiza en una unidad HP
1100® con columnas YMC-Pack Pro C18®
[AS-303, 250 x 4,6 mm, S-5 \mum,
120 Aº]. El caudal es 1 ml/minuto, la temperatura de la columna es
40ºC. Se emplea un gradiente de 0,05% de ácido trifluoroacético a
acetonitrilo. Se consigue 100% de acetonitrilo como eluyente
después de 11 minutos y a continuación se continúa eluyendo
(isocráticamente) con este disolvente. La detección tiene lugar por
medición de la absorción ultravioleta a 210 nm. Con este
procedimiento, las ciclipostinas tienen los siguientes tiempos de
retención:
\newpage
| Ciclipostina A | 12,7 minutos, |
| Ciclipostina A 2 | 12,6 minutos, |
| Ciclipostina F | 13,2 minutos, |
| Ciclipostina N | 15,9 minutos, |
| Ciclipostina P | 17,7 minutos, |
| Ciclipostina P 2 | 17,3 minutos, |
| Ciclipostina Q | 18,3 minutos, |
| Ciclipostina R | 16,7 minutos, |
| Ciclipostina R2 | 16,4 minutos, |
| Ciclipostina S | 18,5 minutos, |
| Ciclipostina T | 19,1 minutos y |
| Ciclipostina T2 | 18,7 minutos. |
La fracción 19, obtenida según el Ejemplo 6, se
concentra a vacío y 1 g del material concentrado, disuelto en
agua/metanol (1:1), se aplica a una columna Nucleoprep
100-5 C_{18} AB® (21 x 250 mm). La elución tiene
lugar con un gradiente de 50% de acetonitrilo en 0,01% de ácido
trifluoroacético hasta 100% de acetonitrilo. El caudal es de 50
ml/minuto. El caudal de la columna se comprueba por medición de la
absorción de luz a 210 nm y sometiendo a ensayo las propiedades de
inhibición de lipasas. Se toman fracciones de 60 ml cada una. En
las fracciones 34 y 35 se encuentra la ciclipostina A, en las
fracciones 41 a 44 la ciclipostina A 2. Estas fracciones se
combinan en cada caso, se concentran a vacío y se separan
sucesivamente sobre una columna SP 250/10 Nucleosil
100-5 C18 HD®. El gradiente escogido era 50% a 66%
de acetonitrilo en 0,01% ácido trilfluoroacético y el valor del pH
de las soluciones se ajustó a 4,0 con una gota de solución de
hidróxido de amonio. Las fracciones que contenían compuestos puros
se combinaban en cada caso y se liofilizaron. Aportaron 5,4 mg de
ciclipostina A pura como una sustancia cérea y 3 mg de ciclipostina
A 2 como un aceite.
Apariencia: sustancia neutra, incolora, cérea,
soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo
ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.
Máximo de UV: 228 nm en
metanol.
Bandas IR: 1752 y 1671
cm^{-1}.
Con espectrometría de masas FAB de alta
resolución empleando una matriz de alcohol bencílico/LiCl, se
encuentra el siguiente peso molecular: 467,2757 amu, que se
corresponde con la fórmula empírica de la ciclipostinina
A-Li de C_{23}H_{41}O_{7}PLi. A partir de
esto, se encuentra una fórmula empírica para la ciclipostina A de
C_{23}H_{41}O_{7}P, peso molecular: 460. Mediante
espectrometría de masas por electropulverización, en el modo de
ionización positivo (ESI, positivo), se encuentra un pico en 461
amu, que se corresponde con (M + H)^{+}; además, el pico
característico en 221 amu, se corresponde con
C_{7}H_{10}O_{6}P. En el modo negativo ESI, se encuentra 459
amu (M - H)^{-}, 337 amu (C_{16}H_{34}O_{5}P) y 219
amu (C_{7}H_{8}O_{6}P). Para determinar la posición del grupo
alcohol, se realiza una derivatización con
N-metil-N-trimetilsililfluoroacetamida
y la muestra se analiza empleando espectrometría de masas con
electroionización. Se obtiene el derivado de trimetilsililo:
de la masa 554 amu. La posición del
grupo hidroxilo sililado se indica por los iones intensos en 497
amu (corte \alpha) y 159 amu (corte
\alpha).
Señales RMN: véase la Tabla
1.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
a) excepto para n y n \pm 1.\cr b) las constantes de acoplamiento
^{13} C/ ^{31} P se indican entre
paréntesis.\cr}
La ciclipostina B se aisla tal y como se ha
descrito en el Ejemplo 8 para la ciclipostina A, mediante
repetición múltiple de las etapas cromatográficas y se caracteriza
como en el Ejemplo 9.
Apariencia: sustancia neutra, incolora, cérea,
soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo
ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.
Máximo de UV: 228 nm en metanol.
Mediante espectrometría de masas por
electropulverización, en el modo de ionización positivo (ESI,
positivo), se encuentra un pico en 461 amu, que se corresponde con
(M + H)^{+}; además, el pico característico en 221 amu, se
corresponde con C_{7}H_{10}O_{6}P. En el modo negativo ESI, se
encuentra 459 amu (M - H)^{-}, 337 amu
(C_{16}H_{34}O_{5}P) y 219 amu (C_{7}H_{8}O_{6}P). Para
determinar la posición del grupo alcohol, se realiza una
derivatización con
N-metil-N-trimetilsililfluoroacetamida
y la muestra se analiza empleando espectrometría de masas con
electroionización. Resulta el derivado de trimetilsililo de masa
554 amu:
\vskip1.000000\baselineskip
La posición del grupo hidroxi sililado se indica
por los iones intensos en 511 amu (corte \alpha) y 145 amu (corte
\alpha).
Fórmula empírica de la ciclipostina B:
C_{23}H_{41}O_{7}P, peso molecular: 460.
La ciclipostina C se aisla tal y como se ha
descrito en el Ejemplo 8 para la ciclipostina A mediante repetición
múltiple de las etapas cromatográficas y se caracteriza como en el
Ejemplo 9.
Apariencia: sustancia neutra, incolora, cérea,
soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo
ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.
Máximo de UV: 228 nm en metanol.
Mediante espectrometría de masas por
electropulverización, en el modo de ionización positivo (ESI,
positivo), se encuentra un pico en 461 amu, que se corresponde con
(M + H)^{+}; además, el pico característico en 221 amu, se
corresponde con C_{7}H_{10}O_{6}P. En el modo negativo ESI, se
encuentra 459 amu (M - H)^{-}, 337 amu
(C_{16}H_{34}O_{5}P) y 219 amu (C_{7}H_{6}O_{6}P). Para
determinar la posición del grupo alcohol, se realiza una
derivatización con
N-metil-N-trimetilsililfluoroacetamida
y la muestra se analiza empleando espectrometría de masas con
electroionización. Resulta el derivado de trimetilsililo de masa
554 amu:
La posición del grupo hidroxi sililado se indica
por los iones intensos en 525 amu (corte \alpha) y 131 amu (corte
\alpha).
Fórmula empírica de la ciclipostina C:
C_{23}H_{41}O_{7}P, peso molecular: 460.
La fracción 20, obtenida según el Ejemplo 6, se
separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la ciclipostina F
se aisla por repetición múltiple de las etapas cromatográficas y se
caracteriza como en el Ejemplo 9.
Tiempo de retención: 13,2 minutos.
Apariencia: sustancia neutra, incolora, cérea,
soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo
ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.
Máximo de UV: 228 nm en metanol.
Mediante espectrometría de masas por
electropulverización, en el modo de ionización positivo (ESI,
positivo), se encuentra un pico en 459 amu, que se corresponde con
(M + H)^{+}; además, el pico característico en 221 amu, se
corresponde con C_{7}H_{10}O_{6}P. En el modo negativo ESI, se
encuentra 457,6 amu (M - H)^{-}, 336 amu
(C_{16}H_{32}O_{5}P_{)} y 219 amu
(C_{7}H_{8}O_{6}P).
Fórmula empírica de la ciclipostina F:
C_{23}H_{39}O_{7}P, Peso molecular: 458.
La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y
6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la
ciclipostina P se aisla (210 mg) por repetición múltiple de las
etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9. La
ciclipostina P cristaliza disolviendo los 210 mg en 3 ml de
propanol-2 y 13 ml de acetonitrilo y la adición de
8 ml de agua. Después de separar por filtración y lavar con
acetonitrilo frío, se obtuvo un peso final de 135 mg de
ciclipostina. P.f. 58-59ºC.
Tiempo de retención: 17,7 minutos.
Apariencia: sustancia neutra, incolora, cérea,
soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo
ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.
Máximo de UV: 228 nm en metanol.
Bandas IR: 2917, 2852, 1753, 1671, 1471, 1214,
996 y 832 cm^{-1}.
Con espectrometría de masas FAB de alta
resolución empleando una matriz de alcohol nitrobencílico, se
encuentra el siguiente peso molecular: 445,2717 amu, que se
corresponden con (M + H)^{+} para la ciclipostina P de
C_{23}H_{42}O_{6}P. A partir de esto, se encuentra una fórmula
empírica para la ciclipostina P de C_{23}H_{41}O_{6}P, peso
molecular: 444. Mediante espectrometría de masas por
electropulverización, en el modo de ionización positivo (ESI,
positivo), se encuentra un pico en 445 amu, que se corresponde con
(M + H)^{+}; además, el pico característico en 221 amu, se
corresponde con C_{7}H_{10}O_{6}P. En el modo negativo ESI, se
encuentra 443 amu (M - H)^{-}, 321 amu
(C_{16}H_{34}O_{4}P) y 219 amu (C_{7}H_{8}O_{6}P).
Los datos de la RMN se muestran en la Tabla
2.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
a) las constantes de acoplamiento ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}
La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y
6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la
ciclipostina P 2 se aisla (130 mg) por repetición múltiple de las
etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.
Tiempo de retención: 17,1 minutos.
Apariencia: sustancia neutra, incolora, aceitosa,
soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo
ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.
Máximo de UV: 228 nm en metanol.
Con espectrometría de masas FAB de alta
resolución empleando una matriz de alcohol nitrobencílico, se
encuentra el siguiente peso molecular: 445,2721 amu, se
corresponden con (M + H)^{+} para la ciclipostina P de
C_{23}H_{42}O_{6}P. A partir de esto, se encuentra una fórmula
empírica para la ciclipostina P 2 de C_{23}H_{41}O_{6}P, peso
molecular: 444. Mediante espectrometría de masas por
electropulverización, en el modo de ionización positivo (ESI,
positivo), se encuentra un pico en 445 amu, que se corresponde con
(M + H)^{+}; además, el pico característico en 221 amu, se
corresponde con C_{7}H_{10}O_{6}P. En el modo negativo ESI, se
encuentra 443 amu (M - H)^{-}, 321 amu
(C_{16}H_{34}O_{4}P) y 219 amu (C_{7}H_{8}O_{6}P).
Los datos de la RMN de la ciclipostina P 2 se
muestran en la Tabla 3.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
a) las constantes de acoplamiento ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}
La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y
6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la
ciclipostina N se aisla (2 mg) por repetición múltiple de las
etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.
Tiempo de retención: 15,9 minutos.
Apariencia: Sustancia neutra, incolora, aceitosa
soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo
ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.
Máximo de UV: 228 nm en metanol.
Con condiciones FAB de la espectrometría de masas
de alta resolución, se observó un ión
casi-molecular (M + H) en 417,2405 que se
corresponde con la fórmula empírica de C_{21}H_{38}O_{6}P
(teoría: 417,2406). Fragmento característico en el modo ESI^{+}:
221 amu.
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
a) las constantes de acoplamiento ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}
La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y
6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la
ciclipostina R se aisla (8 mg) por repetición múltiple de las
etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.
Tiempo de retención: 16,7 minutos.
Apariencia: sustancia neutra, incolora,
cristalina, soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno,
pero sólo ligeramente soluble en agua y éter de petróleo. Máximo de
UV: 228 nm en metanol.
Con condiciones FAB de la espectrometría de masas
de alta resolución, se observó un ión
casi-molecular (M + H) en 431,2561 que se
corresponde con la fórmula empírica de C_{22}H_{40}O_{6}P
(teoría: 431,2562). Fragmento característico en el modo ESI^{+}:
221 amu.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
a) las constantes de acoplamiento ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}
La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y
6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la
ciclipostina R2 se aisla (8 mg) por repetición múltiple de las
etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.
Tiempo de retención: 16,4 minutos.
Apariencia: sustancia neutra, incolora y
aceitosa, soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno
pero sólo ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.
Máximo de UV: 228 nm en metanol.
Con condiciones FAB de espectrometría de masas de
alta resolución, se observó un ión casi-molecular
(M + H) en 431,2564 que se corresponde con la fórmula empírica de
C_{22}H_{40}O_{6}P (teoría: 431,2562). Fragmento
característico en el modo ESI^{+}: 221 amu.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
a) las constantes de acoplamiento ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}
La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y
6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la
ciclipostina S se aisla (0,7 mg) por repetición múltiple de las
etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.
Tiempo de retención: 18,5 minutos.
Apariencia: sustancia neutra, incolora, sólida,
soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo
ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.
Máximo de UV: 228 nm en metanol.
Con condiciones FAB de la espectrometría de masas
de alta resolución, se observó un ión
casi-molecular (M + H) en 459,2883 que se
corresponde con la fórmula empírica de C_{24}H_{44}O_{6}P
(teoría: 459,2575). Fragmento característico en el modo ESI^{+}:
235 amu.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
a) las constantes de acoplamiento ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}
La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y
6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la
ciclipostina T se aisla (5 mg) por repetición múltiple de las
etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.
Tiempo de retención: 19,1 minutos.
Apariencia: sustancia neutra, incolora, sólida,
soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo
ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.
Máximo de UV: 228 nm en metanol.
Con condiciones FAB de la espectrometría de masas
de alta resolución, se observó un ión
casi-molecular (M + H) en 473,3030 que se
corresponde con la fórmula empírica de C_{25}H_{46}O_{6}P
(teoría: 473,3032). Fragmento característico en el modo ESI^{+}:
249 amu.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
a) las constantes de acoplamiento ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}
La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y
6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la
ciclipostina T2 se aisla (4 mg) por repetición múltiple de las
etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.
Tiempo de retención: 18,7 minutos.
Apariencia: sustancia neutra, incolora, sólida,
soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo
ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.
Máximo de UV: 228 nm en metanol.
Con condiciones FAB de la espectrometría de masas
de alta resolución, se observó unión casi-molecular
(M + H) en 473,3035 que se corresponde con la fórmula empírica de
C_{25}H_{46}O_{6}P (teoría: 473,3032). Fragmento
característico en el modo ESI^{+}: 249 amu.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
a) las constantes de acoplamiento ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}
La lipasa sensible a hormonas de ratas se inhibe
con las siguientes concentraciones (IC_{50}) empleando
trioleilglicerol como sustrato:
| Ciclipostina A: | 20 nM, |
| Ciclipostina N: | 450 nM, |
| Ciclipostina P: | 30 nM, |
| Ciclipostina P2: | 40 nM, |
| Ciclipostina R: | 10 nM, |
| Ciclipostina R2: | 220 nM, |
| Ciclipostina S: | 20 nM, |
| Ciclipostina T: | 200 nM, |
| Ciclipostina T2: | 60 nM. |
Claims (30)
1. Compuesto de fórmula general I
en la
que
R^{1}
es
- 1.
- una cadena de carbono que tiene 10 a 18 átomos de carbono, que puede ser lineal, ramificada, saturada o insaturada, carbocíclica o heterocíclica y en la que la cadena de carbono está opcionalmente monosustituida o disustituida con:
- 1.1
- -OH,
- 1.2
- =O,
- 1.3
- -O-alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado,
- 1.4
- -O-alquenilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquenilo es lineal o ramificado,
- 1.5
- -alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado,
- 1.6
- -arilo,
- 1.7
- -alquil-C_{1}-C_{6}-benceno,
- 1.8
- -difenilo,
- 1.9
- -NH-alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado,
- 1.10
- -NH-alquenilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquenilo es lineal o ramificado,
- 1.11
- -NH_{2},
- 1.12
- =S,
- 1.13
- -S-alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado, o
- 1.14
- -S-alquenilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquenilo es lineal o ramificado,
- 1.15
- halógeno,
en donde los sustituyentes 1.1 a
1.15 pueden estar adicionalmente
sustituidos;
R^{2}
es
- 1.0
- alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido como se ha descrito en 1.1 a 1.15,
- 2.0
- alquenilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquenilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido tal y como se ha descrito en 1.1 a 1.15,
- 3.0
- alquinilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquinilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido tal y como se ha descrito en 1.1 a 1.15,
E es un átomo de fósforo (P)
y
X_{1}, X_{2} y X_{3} son -O-
independientemente uno de
otro,
en todas sus formas estereoquímicas
y mezclas de estas formas en cualquier proporción y sus sales
fisiológicamente
tolerables.
2. Compuesto de fórmula I o una sal del mismo
fisiológicamente tolerable según la reivindicación 1,
caracterizado porque
R^{1}
es
- 1.0
- -(CH_{2})_{15}CH_{3},
- 2.0
- -(CH_{2})_{13}CH(CH_{3})_{2},
- 3.0
- -(CH_{2})_{11}CH(OH)(CH_{2})_{3}CH_{3},
- 4.0
- -(CH_{2})_{11}CH(OH)CH_{2}CH(CH_{3})_{2},
- 5.0
- -(CH_{2})_{12}CH(OH)(CH_{2})_{2}CH_{3},
- 6.0
- -(CH_{2})_{13}CH(OH)CH_{2}CH_{3},
- 7.0
- -(CH_{2})_{14}CH(OH)CH_{3},
- 8.0
- -(CH_{2})_{15}CH_{2}(OH),
- 9.0
- -(CH_{2})_{16}CH_{3}
- 10.0
- -(CH_{2})_{13}C=OCH_{2}CH_{3}
- 11.0
- -(CH_{2})_{12}C=OCH_{2}CH_{2}CH_{3}
- 12.0
- -(CH_{2})_{11}C=OCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}
- 13.0
- -(CH_{2})_{13}CH_{3}
- 14.0
- -(CH_{2})_{11}CH(CH_{3})_{2}
- 15.0
- -(CH_{2})_{14}CH_{3} o
- 16.0
- -(CH_{2})_{12}CH(CH_{3})_{2}.
3. Compuesto de fórmula I o una sal
fisiológicamente tolerable del mismo según la reivindicación 1 o 2,
caracterizado porque R^{2} es
alquilo-C_{1}-C_{6}.
4. Compuesto de fórmula I o una sal
fisiológicamente tolerable del mismo según la reivindicación 3,
caracterizado porque R^{2} es -CH_{3}, -CH_{2}CH_{3}
o -CH_{2}CH_{2}CH_{3}.
5. Compuesto de fórmula I o una sal
fisiológicamente tolerable del mismo según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 4, preparable por fermentación de la especie
de microorganismo HAG 004107, DSM 13381 de Streptomyces o una
de sus variantes o mutantes bajo condiciones adecuadas, en un medio
de cultivo, hasta que uno o varios compuestos de fórmula I se
acumulan en el medio de cultivo y a continuación se pueden aislar
del medio de cultivo y convertir opcionalmente en equivalentes
químicos o sales fisiológicamente tolerables.
6. Procedimiento para la preparación de un
compuesto de fórmula I o una sal fisiológicamente tolerable del
mismo según una o varias de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque se fermenta el microorganismo HAG
004107, DSM 13381 de la especie Streptomyces o una de sus
variantes o mutantes bajo condiciones adecuadas, en un medio de
cultivo, hasta que uno o varios compuestos de fórmula general I se
acumulan en el medio de cultivo y a continuación se aislan del
medio de cultivo y se convierten opcionalmente en equivalentes
químicos o sales fisiológicamente
tolerables.
tolerables.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque la fermentación bajo condiciones
aerobias se realiza a una temperatura entre 18 y 35ºC y a un pH
entre 6 y 8.
8. Compuesto de fórmula I o una sal
fisiológicamente tolerable del mismo según una o varias de las
reivindicaciones 1-5, para uso como fármaco.
9. Compuesto de fórmula I o una sal
fisiológicamente tolerable del mismo según una o varias de las
reivindicaciones 1-5, para uso como fármaco para la
inhibición de lipasas.
10. Compuesto de fórmula I o una sal
fisiológicamente tolerable del mismo según una o varias de las
reivindicaciones 1-5, para uso como
antidiabético.
11. Preparación farmacéutica con un contenido en
al menos un compuesto de fórmula I o una sal fisiológicamente
tolerable del mismo, según una o varias de las reivindicaciones
1-5.
12. Procedimiento para la preparación de
preparaciones farmacéuticas según la reivindicación 11,
caracterizado porque al menos un compuesto de fórmula I o
una sal tolerable del mismo según una o varias de las
reivindicaciones 1-5, se produce en una forma de
administración adecuada empleando excipientes y/o vehículos
adecuados.
13. Especie de Streptomyces HAG 004107,
DSM 13381.
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|---|---|---|---|
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| DE10021731A DE10021731B4 (de) | 2000-05-04 | 2000-05-04 | Cyclipostine, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Zubereitung derselben |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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