ES2207609T3

ES2207609T3 - Pluraflavinas y sus derivados, procedimiento para su preparacion y su uso de las mismas.

Info

Publication number: ES2207609T3
Application number: ES01915255T
Authority: ES
Inventors: Laszlo Vertesy; Klaus Ehrlich; Martin Knauf; Joachim Wink; Francis P. Barbone; Elaine A. Powers; Elizabeth A. Cashman
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2000-02-18
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2004-06-01
Anticipated expiration: 2021-02-15
Also published as: CZ303810B6; HUP0204393A2; US6500936B2; TR200302180T4; WO2001060832A3; KR100743380B1; MXPA02006919A; CA2400237C; AU4240401A; US20020028921A1; WO2001060832A2; CZ20022826A3; DE60101313T2; EE05137B1; RS49991B; AU2001242404B2; MEP28608A; HRP20020672B1; ME00179B; RU2002124772A

Abstract

Un compuesto de fórmula I en donde R1 es un grupo azúcar; R2 es -COOH o -CH2-O-(R7)m, en donde R7 es un grupo azúcar; R3 se elige a partir de grupos que comprenden un epóxido, grupos alquilo C1-C6 y grupos alquenilo C2-C6, en donde dichos grupos alquilo y grupos alquenilo están sustituidos opcionalmente con al menos un grupo OH; R5 se elige a partir de átomo de hidrógeno, grupos alquilo C1-C6, grupos alquenilo C2-C6 y grupos alquinilo C2-C6; R4, R6, R8 y R10, se eligen cada uno independientemente a partir de átomos de hidrógeno, grupos alquilo C1-C6, grupos alquenilo C2-C6, grupos alquinilo C2-C6, grupos -X2H en donde H se enlaza directamente al primer átomo de X2, y grupos -X2R12 en donde R12 se enlaza directamente al primer átomo de X2, y opcionalmente R4 y R6 juntos son un grupo -X2 con doble enlace, y opcionalmente R8 y R10 juntos son un grupo -X2 con doble enlace, en donde cada X2 se elige independientemente a partir de átomos de oxígeno, grupos -NH, , grupos -N-alquilo C1-C6, grupos -N-alquenilo C2-C6, grupos -N-alquinilo C2-C6 y átomos de azufre, en donde cada R12 se elige independientemente a partir de grupos alquilo C1-C6, grupos alquenilo C2-C6, grupos alquinilo C2-C6, grupos arilo y grupos acilo; y m y n se eligen cada uno independientemente de 1 a 2; en todas sus formas estéreo químicas y mezclas de estas formas en cualquier relación, y sus sales y derivados fisiológicamente aceptables.

Description

Pluraflavinas y sus derivados, procedimiento para su preparación y su uso de las mismas.

El presente invento se refiere a nuevos compuestos de fórmula I

1

en donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{8}, R_{10} y n son como se definen más adelante. Los compuestos de fórmula I inhiben la transcriptasa, tienen una acción citostática y son particularmente adecuados para tratar tumores. Los compuestos de fórmula I pueden obtenerse haciendo crecer Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931, en un medio de cultivo. De acuerdo con esto, el invento se refiere a un procedimiento para preparar los compuestos de fórmula I, el uso de los compuestos para preparar un compuesto farmacéutico para el tratamiento de trastornos malignos y de enfermedades que pueden tratarse inhibiendo la transcriptasa, y a preparados farmacéuticos que comprenden al menos un compuesto de fórmula I.

El cáncer es una enfermedad de seres humanos y animales que en la mayoría de los casos es fatal, y que está causada generalmente por el crecimiento incontrolado de células endógenas. Cáncer es el término usado para la formación de tumores malignos (malignidad), de neoplasmas (tumores o carcinomas), o para la degeneración maligna e inmadurez de glóbulos blancos (leucemia). Las células tumorales o cancerígenas se forman generalmente por transformación de células endógenas. La malignidad de la célula cancerígena se expresa a sí misma en la autonomía de crecimiento, es decir, su capacidad de crecer desinhibidamente y sin integración en el sistema del órgano y de infiltrarse, con destrucción de tejido. Una señal segura de malignidad es la formación de metástasis lejos del tumor después de la extensión hematogénica o linfogénica de células tumorales. El cáncer es una de las causas más frecuentes de muerte en seres humanos, y hay por lo tanto, una gran demanda de métodos y agentes para curar o tratar las degeneraciones malignas.

Además de la estrategia radical de la eliminación quirúrgica del tumor, las opciones para la terapia de tumores malignos incluyen radioterapia con rayos X, rayos \alpha-, \beta-, \gamma-, inmunoterapia y quimioterapia. Hasta ahora, el uso de inmunoterapia está limitado. La quimioterapia de tumores se entiende como administrar toxinas celulares (compuestos citostáticos) para el tratamiento de tumores y eliminar las células tumorales generalmente después de tratamiento quirúrgico o irradiación local. Estas sustancias intervienen específicamente en ciertos procesos de división celular, para que los tejidos que tienen una alta proporción de células dividiéndose, tales como el tejido tumoral de crecimiento rápido, reaccione sensiblemente. Los agentes usados son compuestos alquilantes, tales como, por ejemplo, ciclofosfamida (The Merck Index, 12^{ava} edición, página 463), antimetabolitos, tales como metotrexato (The Merck Index, 12^{ava} edición, página 1025), alcaloides, tales como vincristina (The Merck Index, 12^{ava} edición, página 1704) y antibióticos, tales como daunomicina (The Merck Index, 12^{ava} edición, página 479), y adriamicina (The Merck Index, 12^{ava} edición, páginas 581-582). Sin embargo, teniendo efectos secundarios masivos, todos estos agentes tienen desventajas significativas, ya que la muerte de la persona enferma puede, en muchos casos, sólo retrasarse, pero no prevenirse. Además, las células degeneradas (cáncer), llegan a hacerse resistentes a los agentes usados; en este caso, los compuestos farmacéuticos convencionales ya no tienen ninguna acción citostática, pues son tóxicos, poseyendo los efectos secundarios. Además, se ha encontrado que un uso combinado y/o secuencial de compuestos citostáticos excede la actividad de un compuesto citostático individual (monoterapia), y es por lo tanto posible que los considerables efectos secundarios en poliquimioterapia no sean aditivos. Por todas estas razones, los compuestos quimioterapeúticos nuevos se requieren urgentemente se investigan así de manera mundial.

Los derivados de pluraflavinas con propiedades antibióticas positivas Gram y con potente actividad antitumoral se conocen como altromicinas (Brill, G.M. et al, J. ANTIBIOT. (1994), 47(10), 1160-4, documento WO-A-90 09435).

Sorprendentemente, se ha encontrado que el microorganismo de la cepa Actinomicetales, especie HAG 003959, DSM 12931, es capaz de producir compuestos citostáticos nuevos altamente eficaces que inhiben el crecimiento celular incluso a concentraciones muy bajas. A partir de ahora, los nuevos compuestos se refieren como pluraflavinas, y forman parte, junto con los derivados de pluraflavina, del contenido del invento. Las pluraflavinas son antibióticos que comprenden un esqueleto anular p-quinoide y diversos bloques constructores de azúcar. Inhiben la transcripción mediante el intercalado de cadenas dobles de ácido nucleico y, si es apropiado, de alquilación adicional. El esqueleto anular se describió la primera vez por S. Kondo et al., en Journal of Antibiotics, volumen 30, páginas 1143-1145, 1977, como parte de pluramicina. Después, este esqueleto anular se encontró en una pluralidad de antibióticos; además de pluramicina y neopluramicina, los compuestos saptomicinas (N. Abe et al., J. Antibiotics, 46, 1536-1549, 1993), anquinomicina (Y. Sato et al., J. Antibiotics, 42, 149, 1989), quidamicina (N. Kanda et al., J. Antibiotics, 24, 599, 1971), hedamicina (U. Sequin et al., Tetrahedron, 34, 761, 1978) y las altromicinas (G.M. Brill et al., J. Antibiotics, 43, 229-237, 1990), se han descrito como compuestos relacionados estructuralmente. Las sustancias de la técnica anterior tienen a menudo desventajas que se manifiestan en sí mismas con una eficacia no satisfactoria, alta toxicidad y/o efectos secundarios indeseables.

De acuerdo con esto, el presente invento se refiere a compuestos de fórmula (I)

2

en donde

R_{1} es un grupo azúcar,

R_{2} es -COOH o -CH_{2}-O-(R_{7})m, en donde R_{7} es un grupo azúcar, y,

R_{3} se elige entre grupos que comprenden epóxido, grupos alquilo C_{1}-C_{6}, y grupos alquenilo C_{2}-C_{6}, en donde dichos grupos alquilo y alquenilo se sustituyen opcionalmente con al menos un grupo OH,

R_{5} se elige a partir de H, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6} y alquinilo C_{2}-C_{6},

R_{4}, R_{6}, R_{8} y R_{10}, se eligen cada uno independientemente de H, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, -X_{2}H, y -X_{2}R_{12}, o

R_{4} y R_{6} juntos y/o R_{8} y R_{10} juntos son =X_{2},

X_{2} es O, NH, alquilo N-C_{1}-C_{6}, alquenilo N-C_{2}-C_{6}, alquinilo N-C_{2}-C_{6} o S,

R_{12} es alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, arilo o acilo, y m y n, independientemente uno de otro son 1 ó 2, en todas sus formas estéreo químicas y mezclas de estas formas en cualquier relación, y sus sales fisiológicamente aceptables.

En la fórmula (I)

El alquilo C_{1}-C_{6} es un alquilo de cadena lineal o ramificada de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo y hexilo.

El alquenilo C_{2}-C_{6} es un alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, alilo, crotilo y pentenilo.

El alquinilo C_{2}-C_{6} es un alquinilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, propinilo, butinilo y pentinilo.

El arilo es una estructura anular aromática, por ejemplo, fenilo, bencilo, o 1- o 2-naftilo. El arilo puede estar sustituido opcionalmente, por ejemplo por halógeno, tal como cloro, bromo, flúor, por alquilo que tiene 1-4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, por hidroxilo, por alcoxi que tiene 1-4 átomos de carbono, por ejemplo metoxi, y/o por trifluorometilo.

El acilo puede ser grupos acilo alifáticos o aromáticos. El acilo alifático tiene 1-7 átomos de carbono, preferiblemente 1-4 átomos de carbono, tales como formilo, acetilo, propionilo, butirilo, hexanoilo, acriloilo, crotonoilo, propioloilo, que pueden sustituirse adicionalmente, por ejemplo, por halógeno, tal como cloro, bromo, flúor, por amino, y/o por alquilamino que tiene 1-4 átomos de carbono, tal como grupos metilo o etilamino. El acilo aromático puede ser, por ejemplo, benzoilo o naftoilo, que también pueden sustituirse adicionalmente, por ejemplo, por halógeno, tal como cloro, bromo, flúor, por alquilo que tiene 1-4 átomos de carbono, por ejemplo metilo, por hidroxilo, por grupos amino, tal como por ejemplo etilamino, o por grupos alcoxi que tienen 1-7 átomos de carbono, tal como 1-4 átomos de carbono, por ejemplo metoxi.

El azúcar (R_{1}/R_{7}) es un monosacárido (n=1) o un disacárido (n=2), donde dos monosacáridos se unen glicosídicamente. El monosacárido puede ser una hexosa (C_{6}H_{12}O_{6}), por ejemplo una aldohexosa, tal como, D-(+)-glucosa, D-(+)-manosa o D-(+)-galactosa. El monosacárido puede ser mono-, di- o tri-sustituido, independientemente uno de otro, por H, OH, NH_{2}, NH(alquilo), N(alquilo)_{2}, alquilo y alcoxi, donde el H y/u OH del monosacárido puede sustituirse opcionalmente por sustituyentes. El término "azúcar", como se usa aquí, incluye aminoazúcares. Un aminoazúcar es un monosacárido o disacárido sustituido opcionalmente como lo descrito, en donde al menos un grupo OH- o H- del mono- o disacárido está sustituido por un grupo amino tal como NH_{2}, NH(alquilo) o N(alquilo)_{2}.

En una realización, m es 1.

R_{7} puede ser un grupo aminoazúcar de fórmula (II)

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en donde

R_{13}, R_{14}, R_{16}, R_{18}, R_{20}, R_{22}, R_{24}, R_{26} o R_{28}, se eligen cada uno independientemente a partir de H, OH, NH_{2}, NH(alquilo), N(alquilo)_{2} y alcoxi, donde el alquilo y el alcoxi tienen de 1 a 4 átomos de carbono.

Ejemplos de alquilo C_{1}-C_{4} son, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isobutilo y butilo, en particular metilo, y ejemplos de alcoxi C_{1}-C_{4} son, por ejemplo, metoxi, etoxi, isopropoxi o butoxi, en particular metoxi.

R_{7} puede ser un aminoazúcar de fórmula (IIA):

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R_{1} puede ser también un aminoazúcar. En una realización, n es 2.

R_{1} puede ser un grupo de fórmula (III)

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en donde R_{30} a R_{60}, independientemente uno de otro, son H, OH, NH_{2}, NH(alquilo), N(alquilo)_{2}, u O-alquilo, en donde el alquilo es un grupo C_{1}-C_{4}, tal como, metilo, etilo, propilo, isobutilo y butilo, en particular metilo, y el O-alquilo es alcoxi C_{1}-C_{4}, por ejemplo, metoxi, etoxi, isopropoxi o butoxi, en particular metoxi.

R_{1} en una realización, tiene la fórmula (IIIA)

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R_{3} puede ser un grupo que comprende un epóxido. El grupo que comprende un epóxido puede ser un grupo alquilo o alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 2 a 12 átomos de carbono, tal como de 2 a 6 átomos de carbono, que comprende uno o dos anillos epóxido (oxiranos). Son posibles ejemplos:

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Otro grupo distinto al grupo que comprende un epóxido, R_{3} puede ser un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, tal como 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, isopropilo, terc- butilo, hexilo, y además, por ejemplo, octilo, dodecilo, o un alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 2 a 12 átomos de carbono, tal como 2 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, alilo, crotilo, pentenilo, y además dodecenilo, donde estos grupos alquilo o alquenilo puede estar además mono- o polisustituidos, tal como di- o tri-sustituidos, por ejemplo por hidroxilo.

De acuerdo con esto el invento se refiere a la pluraflavina A de fórmula (IA)

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a la pluraflavina B de fórmula (IB)

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y a la pluraflavina E de fórmula (IE)

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en donde la hexosa I es una 2,6-didesoxialdohexosa;

la hexosa II es una 2,3,6-tridesoxi-3-dimetilaminohexosa y

la hexosa III es una 2,3,6-tridesoxi-3-amino-3-metilaldohexosa, en todas sus formas estéreo químicas y mezclas de estas formas en cualquier relación, y sus sales fisiológicamente aceptables.

En una realización, los compuestos se eligen a partir de las fórmulas (IA), (IB) y (IE), en donde

la hexosa I es oliosa,

la hexosa II es rodosamina y

la hexosa III es 3-epi-vancosamina.

Según el invento, los compuestos de fórmula I son obtenibles por cultivo, por ejemplo por fermentación, de Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931, o sus variantes o mutantes, en condiciones adecuadas en un medio de cultivo, hasta que al menos una de las pluraflavinas de fórmula (IA), (IB) y/o (IE) esté presente en el medio de cultivo. Las pluraflavinas pueden aislarse posteriormente del medio de cultivo y purificarse y, si es apropiado, convertirse en derivados químicos y/o en sus sales fisiológicamente aceptables.

El invento se refiere además a un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula I que comprende cultivar, por ejemplo por fermentación, del microorganismo Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931, o sus variantes o mutantes, en condiciones adecuadas en un medio de cultivo, hasta que al menos una de las pluraflavinas de fórmula (IA), (IB) y/o (IE) esté presente en el medio de cultivo, aislar al menos una de las pluraflavinas del medio de cultivo y, si es apropiado, convertir en derivados químicos y/o sales fisiológicamente aceptables.

La cepa HAG 003959, DSM 12931, sus mutantes y/o variantes se cultivan en una realización, en una disolución nutriente (también referida como medio de cultivo) que comprende al menos una fuente de átomos de carbono y al menos una fuentes de átomos de nitrógeno y las sales inorgánicas acostumbradas, hasta que al menos una nueva pluraflavina esté presente en el medio de cultivo; las pluraflavinas pueden aislarse posteriormente del medio de cultivo y, si es apropiado, separarse en los componentes activos individuales.

El cultivo puede llevarse a cabo en condiciones aeróbicas. El cultivo puede llevarse a cabo a una temperatura que oscila de 18 a 35ºC, y a un pH que oscila de 6 a 8.

En la literatura se han descrito un gran número de reacciones para la derivación química de quinonas. De acuerdo con esto, la derivación de las formas quinona de los presentes compuestos puede llevarse a cabo usando reacciones químicas que son conocidas per se. Una reducción a las formas hidroquinona de los compuestos puede alcanzarse, por ejemplo, catalíticamente con hidrógeno, o con hidruros metálicos, tales como hidruros de aluminio o hidruros de boro. Un ejemplo adicional adecuado es la conversión de quinonas con hidroxilamina o con sus derivados en oximas, que por su parte pueden convertirse químicamente adicionalmente.

De acuerdo con esto, el invento se refiere a un compuesto de fórmula (IV):

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en donde R_{1}, R_{2}, R_{3} y n son como se define anteriormente, en todas sus formas estéreo químicas y mezclas de estas formas en cualquier relación, y sus sales fisiológicamente aceptables.

Los derivados de pluraflavina de fórmulas (IVA), (IVB) y (IVE) (debajo), se derivan de las pluraflavinas de fórmulas (IA), (IB) y (IE), respectivamente, y además forman parte de este invento.

El invento se refiere además a: un compuesto de fórmula (IVA)

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un compuesto de fórmula (IVB):

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y un compuesto de fórmula (IVE):

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en todas sus formas estéreo químicas y mezclas de estas formas en cualquier relación, y sus sales fisiológicamente aceptables.

En adelante, el invento se describe en detalle, por ejemplo en al menos una realización.

Las pluraflavinas según el invento, se producen por la especie Actinomicetales, en una realización por Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931. Los Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931, tienen una micela beige-roja y pueden identificarse por conidióforos que son típicos para actinomicetas.

Un examen taxonómico del microorganismo Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931, dio el siguiente resultado de la determinación de la cepa: el análisis de ácidos grasos diagnósticamente importantes por cromatografía de gases mostró altas proporciones de:

Ácido graso anteiso 15:0,

Ácido graso iso 16:0 (ácido isopalmítico),

Ácido graso iso 17:0 (ácido isomargárico),

Ácido graso anteiso 17:0 (ácido anteisomargárico) y

Ácido graso cis[9] 18:1 (ácido oleico), además de bajas concentraciones de otros ácidos grasos.

Este perfil de la composición de ácidos grasos permite asignar taxonómicamente los Actinomicetales HAG 003959 (DSM 12931) al género Sacarotrix.

Un aislamiento del microorganismo se depositó en el Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D 38124 Braunschweig, Alemania, según las reglas de la Convención de Budapest del 16 de Julio de 1999 con el siguiente número: Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931.

En vez de la cepa Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931, también es posible usar sus mutantes y variantes que sintetizan al menos un compuesto de las pluraflavinas según el invento. Dichos mutantes pueden producirse de una manera conocida per se por medios físicos, por ejemplo irradiación, por ejemplo, con rayos X o ultravioletas, o mutágenos químicos, tales como, por ejemplo, metanosulfonato de etilo (EMS), 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona (MOB) o N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG).

El procedimiento según el invento, puede usarse por fermentación a escala de laboratorio (intervalo de mililitro a litro) o a escala industrial (escala de metro cúbico). A menos que se indique otra cosa, todos los porcentajes se basan en peso. En el caso de líquidos, las relaciones de mezcla se basan en el volumen, a menos que se afirme otra cosa.

En una realización, las fuentes de átomos de carbono para la fermentación aeróbica son carbohidratos asimilables y alcoholes de azúcar, tales como glucosa, lactosa, sacarosa o D-manitol, y productos naturales que comprenden hidrocarburos, tales como, por ejemplo, extracto de malta. Fuentes adecuadas de átomos de nitrógeno para cultivo son: aminoácidos, péptidos y proteínas y sus productos de degradación, tales como peptonas o triptonas, además de extractos de carne, extractos de levadura, semillas de siembra, por ejemplo de maíz, trigo, judías, soja o algodón, residuos de destilación de la producción de alcohol, harinas de carne o extractos de levadura, pero también sales de amonio y nitratos. Las sales inorgánicas contenidas en la disolución nutriente pueden ser, por ejemplo, cloruros, carbonatos, sulfatos o fosfatos de los metales alcalinos o los metales alcalinotérreos, hierro, zinc, cobalto y manganeso.

La formación de las pluraflavinas según el invento sigue en un medio de cultivo que comprende aproximadamente 0,1 a 5%, tal como 0,3 a 2%, de glucosa y 0,2 a 5%, tal como 0,5 a 3%, de harina de soja y 0,05 a 2%, tal como 0,2 a 1,0 g/l de aguas de infusión de maíz y 0,05 a 1,0 g/l, tal como 0,1 a 0,5%, de carbonato de calcio y 0,05 a 1,0 g/l, tal como 0,1 a 1,0 g/l, de cloruro sódico. Los porcentajes se basan en cada caso en el peso de medio de cultivo entero.

En el medio de cultivo, los Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931, produce una mezcla de pluraflavinas. Dependiendo de la composición del medio de cultivo, la proporción de al menos una de las pluraflavinas según el invento puede variar. Además, por medio de la composición del medio, es posible controlar la síntesis de pluraflavinas individuales, ya que una o incluso más de las pluraflavinas no se producen en absoluto por el microorganismo, o en una cantidad por debajo del límite de detección.

En una realización, el cultivo comprende una pluraflavina detectable. En realizaciones adicionales se forman las pluraflavinas A, B o E.

Además de las pluraflavinas A, B y E (compuestos de fórmula (IA), (IB) y (IE), respectivamente), se forman también otros compuestos, que difieren de los compuestos representados en las fórmulas (IA), (IB) y (IE) en que están glicosilados de manera diferente, en el medio de cultivo de Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931. Así, como subproducto, se detectaron una pluraflavina adicional (pluraflavina C) con un peso molecular de 974 Da y un producto de degradación de pluraflavina A, peso molecular 692,77, C_{37}H_{44}N_{2}O_{11}. En el último compuesto, la hexosa I se pierde; en condiciones ácidas, la 2,3-didesoxialdohexosa puede dividirse hidrolíticamente de la pluraflavina A.

El microorganismo se cultiva aeróbicamente, es decir, por ejemplo, se sumerge con sacudidas o agitación en matraces de agitación o fermentadores, si es apropiado con introducción de aire u oxígeno. Puede llevarse a cabo en un intervalo de temperatura de aproximadamente 18 a 35ºC, tal como de aproximadamente 25 a 32ºC, incluyendo de 27 a 30ºC. El pH oscilaría generalmente de 6 a 8, tal como de 6,5 a 7,5. En estas condiciones, el microorganismo se cultiva generalmente durante un periodo que oscila de 24 a 300 horas, tal como de 36 a 140 horas.

El cultivo se lleva a cabo ventajosamente en diversas etapas, es decir, al menos se prepara primero un precultivo en un medio nutriente líquido, que se inocula luego en el medio de producción actual, el cultivo principal, por ejemplo en la relación de volumen 1:10. Se obtiene el precultivo, por ejemplo, inoculando una micela en una disolución nutriente y dejándola crecer durante aproximadamente 36 a 120 horas, tal como durante 48 a 96 horas. La micela puede obtenerse, por ejemplo, dejando crecer la cepa durante aproximadamente 3 a 40 días, tal como durante 4 a 10 días, en un medio nutriente sólido o líquido, por ejemplo agar de levadura de malta o agar de levadura de avena.

El desarrollo de la fermentación puede monitorizarse mediante el pH de los cultivos o el volumen de la micela, y además por métodos cromatográficos, tales como, por ejemplo, cromatografía de capa fina o cromatografía líquida de alta presión o probando la actividad biológica. Las pluraflavinas según el invento pueden encontrarse tanto en la micela como en el filtrado del cultivo. El procedimiento de aislamiento descrito después sirve generalmente para purificar las pluraflavinas según el invento, tal como para purificar las pluraflavinas A, B y E.

El aislamiento y/o purificación de las pluraflavinas según el invento del medio de cultivo, se lleva a cabo por métodos conocidos, teniendo en cuenta las propiedades químicas, físicas y biológicas de los productos naturales. Para probar la concentración de pluraflavina en el medio de cultivo o en las etapas individuales de aislamiento, es posible usar cromatografía de capa fina, por ejemplo en gel de sílice usando mezclas cloroformo/metanol/ácido acético glacial/agua (por ejemplo en la relación 8:1:1:0,2) como fase móvil, o HPLC. En la separación cromatográfica de capa fina, la detección puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando reactivos colorantes, tales como \alpha-naftol/ácido sulfúrico, donde la cantidad de sustancia formada se compara convenientemente con una disolución de calibrado.

Según el invento, las pluraflavinas pueden aislarse de cualquier micela o medio de cultivo. Generalmente, la micela se separa inicialmente del medio de cultivo por los métodos acostumbrados, y las pluraflavinas se extraen posteriormente del material celular usando un disolvente orgánico opcionalmente miscible en agua. La fase de disolvente orgánico contiene pluraflavinas según el invento; si es apropiado, se concentran a presión reducida y se purifican adicionalmente como se describe después.

Si es apropiado, el filtrado del cultivo se combina con el concentrado del extracto de micela y se extrae con un disolvente orgánico inmiscible en agua adecuado, por ejemplo con n-butanol. La fase orgánica se separa entonces y, si es apropiado, se concentra a presión reducida. Para desengrasar el producto de valor, el concentrado puede diluirse con un disolvente no polar, en donde las pluraflavinas según el invento son solubles sólo con moderación, tal como, por ejemplo, con hexano, éter de petróleo, dietiléter. Esto causa que las pluraflavinas precipiten, y las impurezas lipofílicas permanezcan disueltas y se eliminen por separación de fase sólida-líquida acostumbrada. El precipitado, que contiene todas las pluraflavinas a aislar, se disuelve en 1/30 del volumen original de agua/metanol. El precipitado se disuelve completamente y se liofiliza. El liofilizado, al que se refiere como producto en bruto en adelante, comprende 0,5 a 50% de pluraflavinas y se usa para aislamiento adicional.

La purificación adicional de una o más de las pluraflavinas según el invento, se lleva a cabo por cromatografía en materiales adecuados, tales como en cribas moleculares, en vehículos de fase normal, tales como, por ejemplo, gel de sílice, alúmina, en intercambiadores de iones o en resinas adsorbentes y/o en medios de fase inversa (RP). Con la ayuda de esta cromatografía, se separan las pluraflavinas. La cromatografía de las pluraflavinas se lleva a cabo usando disoluciones acuosas tamponadas o mezclas de disoluciones acuosas y orgánicas.

Se entienden mezclas de disoluciones acuosas u orgánicas como significando todos los disolventes orgánicos miscibles en agua, tales como metanol, propanol y acetonitrilo, en una concentración que oscila del 10 al 80% del disolvente, por ejemplo del 40 al 60% del disolvente, o todas las otras disoluciones acuosas tamponadas que son miscibles con disolventes orgánicos. Los tampones a usar pueden ser los mismos que los indicados anteriormente.

La separación de las pluraflavinas basada en su diferente polaridad, puede llevarse a cabo con la ayuda de cromatografía de fase inversa, por ejemplo en MCI® (resina adsorbente de Mitsubishi, Japón) o Amberlita XAD® (TOSOHAAS), en materiales hidrófobos adicionales, tales como, por ejemplo, en fases RP-8 o RP- 18. Además, la separación puede llevarse a cabo con la ayuda de cromatografía de fase normal, por ejemplo en gel de sílice, alúmina o similares.

La cromatografía de las pluraflavinas puede llevarse a cabo usando disoluciones acuosas tamponadas o aciduladas o mezclas de disoluciones acuosas con alcoholes u otros disolventes orgánicos miscibles en agua. El disolvente orgánico usado puede ser propanol y acetonitrilo.

Se entienden disoluciones acuosas tamponadas o aciduladas como significando, por ejemplo, agua, tampón fosfato, acetato amónico, tampón citrato en una concentración de 1 mM a 0,5 M, y además ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético o todos los ácidos comerciales conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, en una concentración que oscila de 0,01 a 3%, tal como de 0,1%.

La cromatografía puede llevarse a cabo usando un gradiente empezando con 100% de tampón acuoso y terminando con 100% de disolvente; por ejemplo un gradiente lineal que oscila de 10 a 50% usando 2-propanol o acetonitrilo.

Alternativamente, también es posible llevar a cabo cromatografía en gel o cromatografía en fases hidrófobas.

La cromatografía en gel puede llevarse a cabo en poliacrilamida o geles de poliméricos mezclados, tales como, por ejemplo, Biogel-P 2® (Biorad), Fractogel TSK HW 40® (Merck, Alemania o Toso Haas, EE.UU.) o en Sephadex® (Pharmacia, Uppsala, Suecia).

El orden de las cromatografías mencionadas anteriormente puede invertirse.

Una etapa de purificación adicional, altamente eficaz para pluraflavinas es la cristalización. Las pluraflavinas cristalizan de disoluciones en disolventes orgánicos y de mezclas de agua con disolventes orgánicos. La cristalización puede llevarse a cabo de una manera conocida per se, por ejemplo, por concentración o enfriamiento de disoluciones saturadas de pluraflavinas.

Las pluraflavinas según el invento son estables en el estado sólido y en disoluciones que tienen un pH que oscila de 3 a 8, por ejemplo de pH 4 a 6, y pueden incorporarse por lo tanto a preparaciones farmacéuticas acostumbradas.

Las pluraflavinas de fórmula (I) y los derivados químicos derivados de ellas pueden convertirse por métodos conocidos por el experto en la técnica, en las correspondientes sales fisiológicamente aceptables.

Se entienden sales fisiológicamente aceptables de compuestos de fórmula (I) como significando tanto sus sales orgánicas como inorgánicas, tales como se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (17^{ava} edición, página 1418 (1985)). Basado en la estabilidad física y química y la solubilidad, las sales de sodio, potasio, calcio y amonio, inter alia, son realizaciones posibles de grupos ácidos; las sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico o de ácidos carboxílicos o ácidos sulfónicos, tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico y ácido p-toluensulfónico, inter alia, son realizaciones posibles de grupos básicos.

El invento abarca además equivalentes químicos obvios (referidos aquí también como "derivados") de los compuestos de fórmula (I) que tienen una ligera diferencia química, es decir, que tienen la misma actividad o que pueden convertirse en el compuesto según el invento en condiciones suaves. Los equivalentes mencionados incluyen, por ejemplo, ésteres y éteres, complejos y también productos de reducción de los compuestos según el invento.

Los derivados de ésteres y éteres y los productos de reducción pueden prepararse por procedimientos descritos en la literatura, por ejemplo en "Advanced Organic Synthesis", 4ª edición, J. March, John Wiley & Sons, 1992. El grupo carboxi (fórmula IE, IVE) y grupos hidroxi de los compuestos de la fórmula (I) pueden convertirse a un grupo éster o grupo éter, por ejemplo. Dichos ésteres incluyen, por ejemplo, ésteres de alquilo (C_{1}-C_{4}). Dichos éteres incluyen, por ejemplo, acetales y cetales de los grupos hidroxi.

Los complejos estables de los compuestos de fórmula (I) pueden formarse con cationes inorgánicos fisiológicamente aceptables, tales como calcio o magnesio.

El presente invento abarca todas las formas estereoisómeras de los compuestos de fórmula (I). Los centros de asimetría de los compuestos de fórmulas (IA), (IB) y (IE) pueden tener en cada caso, independientemente uno de otro, la configuración S o la configuración R. Los oxiranos del grupo que comprende un epóxido pueden estar en cualquier posición; por ejemplo, los oxiranos que incorporan los átomos de carbono 2' y 3'. El invento incluye todos los enantiómeros y diastereómeros posibles, y además mezclas de al menos dos formas estereoisómeras, por ejemplo, mezclas de enantiómeros y/o diastereómeros, en cualquier relación. Así, el invento proporciona enantiómeros en forma enantioméricamente pura, o bien como antípodas levorotatorias o dextrorotatorias, configuraciones R y S, en forma de racematos y en forma de mezclas de los dos enantiómeros en cualquier relación. Si hay una isomería cis/trans, el invento proporciona o bien la forma cis o la forma trans y mezclas de estas formas en cualquier relación.

A cuenta de sus útiles propiedades farmacológicas, los compuestos según el invento son adecuados para usar como productos farmacéuticos en medicina humana y/o veterinaria. Tienen actividad antibiótica y, además de la acción antibacteriana, propiedades antimicótica, es decir, inhibidora de hongos, incluyendo hongos fitopatógenos, antiprotozóica y antiparasitaria.

Los compuestos según el invento pueden usarse para enfermedades cancerosas, por ejemplo como productos quimioterapéuticos para tratar tumores de colon, pecho, próstata, pulmón o leucemia. Teniendo sus propiedades citostáticas, tales como su potente actividad antitumoral, y una acción antimicrobiana, pueden usarse, por ejemplo, como compuestos citostáticos para degeneraciones malignas en animales y seres humanos.

En el caso de células tumorales que han desarrollado resistencias a los agentes convencionales, sólo los nuevos agentes tienen un efecto terapéuticamente adecuado. Así, las pluraflavinas según el invento y derivados de las mismas de fórmula (I), tienen una actividad potencialmente excelente incluso frente a estos tipos de células problema.

El invento se refiere además a preparados farmacéuticos que comprenden al menos una de las pluraflavinas según el invento y/o derivados de la misma. Las pluraflavinas pueden usarse en una mezcla con al menos un auxiliar o excipiente adecuado. Los excipientes usados para seres humanos pueden ser todos excipientes y/o auxiliares farmacológicamente aceptables.

El invento se refiere también a un procedimiento para preparar un producto farmacéutico según el invento que comprende llevar un compuesto según el invento a una forma de administración adecuada usando un excipiente farmacéuticamente adecuado y fisiológicamente aceptable y, si es apropiado, compuestos activos, aditivos o auxiliares adicionales adecuados.

Los productos farmacéuticos según el invento generalmente se administran oralmente, tópicamente o parenteralmente, pero también es posible la administración rectal. Formas de preparado farmacéutico sólido o líquido adecuadas son, por ejemplo, gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos revestidos, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, aerosoles, gotas o disoluciones inyectables en forma de ampolla, y preparados que tienen una liberación prolongada del compuesto activo, en cuya preparación se usan acostumbradamente excipientes y aditivos y/o auxiliares, tales como desintegrantes, ligantes, agentes de revestimiento, agentes de hinchado, agentes deslizantes o lubricantes, aromatizantes, edulcorantes o solubilizadores. Los excipientes o auxiliares usados frecuentemente que pueden mencionarse son, por ejemplo, carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manitol y otros azúcares, talco, lactoproteína, gelatina, almidón, vitaminas, celulosa y sus derivados, aceites animales o vegetales, polietilenglicoles y disolventes tales como, por ejemplo, agua esterilizada, alcoholes, glicerol y alcoholes polihidratados.

Si es apropiado, las unidades de dosis pueden microencapsularse para administración oral para retrasar la liberación o para extender la liberación durante un periodo de tiempo relativamente largo, tal como, por ejemplo, revistiendo o empotrando el compuesto activo particulado en polímeros, ceras o similares adecuados.

Los preparados farmacéuticos pueden producirse y administrarse en unidades de dosis, comprendiendo cada unidad como ingrediente activo una cierta dosis de al menos un compuesto de las pluraflavinas según el invento, y/o derivados químicos de las mismas. En el caso de unidades sólidas de dosis tales como comprimidos, cápsulas y supositorios, esta dosis puede ser hasta de aproximadamente 200 mg, pero puede ser aproximadamente 0,1 a 100 mg, y en el caso de disoluciones para inyección en forma de ampollas, hasta de aproximadamente 200 mg, pero puede ser aproximadamente 0,1 a 100 mg, por día.

La dosis diaria a administrar depende del peso corporal, edad, sexo y enfermedad del sujeto mamífero. Sin embargo, pueden pedirse también dosis diarias mayores o menores. La dosis diaria puede administrarse o bien dándose en una ocasión en forma de una sola unidad de dosis o en forma de varias unidades de dosis menores, o también dándose en varias ocasiones, a intervalos predeterminados, en forma de dosis subdivididas.

El invento se ilustra adicionalmente en los ejemplos que siguen. Los porcentajes se basan en peso. En el caso de líquidos, las relaciones de mezcla se basan en volumen, a menos que se afirme otra cosa.

Los siguientes ejemplos del presente invento son ilustrativos pero no limitantes del alcance del mismo.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de un cultivo de glicerol de Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931

Se inocularon 100 ml de una disolución nutriente (2,0% de extracto de malta, 0,2% de extracto de levadura, 1,0% de glucosa, 0,05% de (NH_{4})_{2}HPO_{4}, pH 6,0) en un matraz Erlenmeyer estéril de 300 ml con la cepa Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931, y se incubó en un agitador rotatorio a 28ºC y 180 rpm durante 7 días. Después se diluyeron 1,5 ml de este cultivo con 1,5 ml de glicerol al 99% de resistencia y se almacenó a -20ºC.

Ejemplo 2 Preparación de un cultivo o un precultivo en un matraz Erlenmeyer de Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931

Un matraz Erlenmeyer estéril de 300 ml que contenía 100 ml de la siguiente disolución nutriente: 15 g de glucosa/l, 15 g de harina de soja/l, 5 g de aguas de infusión de maíz/l, 2 g de CaCO_{3}/l y 5 g de NaCl/l, se inoculó con un cultivo desarrollado en un tubo oblicuo (igual disolución nutriente, pero con agar al 2%) o con 1 ml de un cultivo de glicerol (véase Ejemplo 1) y se incubó en un agitador a 180 rpm y 30ºC. La máxima producción de al menos un compuesto de las pluraflavinas según el invento, se alcanzó después de aproximadamente 120 horas. Para inocular fermentadores de 10 y 200 l, fue suficiente un cultivo sumergido de 48 a 96 horas de edad (cantidad para la inoculación de aproximadamente 10%) procedente de la misma disolución nutriente.

Ejemplo 3 Preparación de las pluraflavinas

Un fermentador de 9 l se operó en las siguientes condiciones:

Medio nutriente	15 g de glucosa/l;
	15 g de harina de soja/l;
	5 g de aguas de infusión de maíz, sólido/l;
	2 g de CaCO_{3}/l;
	5 g de NaCl/l;
	pH 7,0 (antes de la esterilización)
Duración del procedimiento	92 horas
Temperatura de incubación	28ºC
Velocidad del agitador	300 rpm
Aireación	5 l min^{-1}

Mediante adición repetida de disolución de poliol etanólico, fue posible suprimir opcionalmente la formación de espuma. La máxima producción se alcanzó después de aproximadamente 70 a 96 horas.

Ejemplo 4 Aislamiento de la mezcla de pluraflavinas de la disolución del cultivo de Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 13931

Después de que acabara la fermentación de Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931, el caldo de cultivo del fermentador, obtenido según el Ejemplo 3 (90 litros), se filtró con la adición de aproximadamente 2% de agente auxiliar de filtro (por ejemplo Celite®), y el material celular (0,6 litros) se extrajo con 3 litros de metanol. La disolución metanólica que contenía el compuesto activo se liberó de la micela por filtración y se concentró a presión reducida. El concentrado se aplicó, junto con el filtrado del cultivo (7 litros) a una columna CHP20P ®MCI GEL de 0,4 litros preparada. La elución se llevó a cabo usando un gradiente de ácido acético al 0,1% en agua a ácido acético al 0,1% en 2-propanol. El flujo de la columna (1,2 litros por hora) se recogió en fracciones (de 0,25 litros cada una), y las fracciones que contenían pluraflavina (20 a 23) se juntaron. La concentración a presión reducida y el secado por congelación dio 1,4 g de un polvo marrón.

Ejemplo 5 Enriquecimiento de los componentes de pluraflavina por cromatografía en gel

Se aplicaron 1,4 g del producto obtenido según el Ejemplo 4 a una columna con una capacidad de 3,9 litros (anchura x altura = 10 cm x 50 cm) rellena con Fractogel® TSK HW-40 s. La fase móvil agua/acetonitrilo (1:1) se bombeó a través de la columna con un caudal de 50 ml por minuto, y el flujo de la columna se recogió en fracciones (65 ml). Las pluraflavinas estuvieron principalmente en las fracciones 13 a 16. Estas se juntaron y liberaron del disolvente a presión reducida. Dieron 130 mg de mezcla de pluraflavinas.

Ejemplo 6 Separación de los componentes de pluraflavinas en fase inversa RP-18

Se rellenó una columna HPLC preparativa con una capacidad de 122 ml (1,25 cm (ID) x 25 cm H) con ®Nucleosil 100-7 C18 HD, y se aplicaron los 130 mg de la mezcla de pluraflavinas obtenida según el Ejemplo 5. La elución se llevó a cabo usando acetonitrilo al 10% y disolución de acetato amónico acuoso 0,1M. El flujo de la columna fue 50 ml/minuto, y se recogieron fracciones de en cada caso, 50 ml de contenido. La fracción 6 comprendió la pluraflavina E, la pluraflavina C estuvo en las fracciones 12-17, la pluraflavina B estuvo en las fracciones 25 a 27 y la pluraflavina A estuvo en las fracciones 35 a 37. Después de la concentración a presión reducida y el secado por congelación, se obtuvieron las siguientes cantidades:

Pluraflavina A: 22 mg, ESI+MS: 823 Da (M+H)^{+},

Pluraflavina B: 18 mg, ESI+MS: 841 Da (M+H)^{+},

Pluraflavina C: 11 mg, ESI+MS; 974 Da (M+H)^{+},

Pluraflavina E: 5 mg, ESI+MS: 712 Da (M+H)^{+}.

Ejemplo 7 Purificación final de la pluraflavina A y conversión en forma de sal de trifluoroacetato

Las fracciones 35 a 37, obtenidas según el Ejemplo 6, se disolvieron después de secado por congelación (22 mg), en acetonitrilo al 10% en agua, se ajustó a pH 2,8 con ácido trifluoroacético y se aplicó a una columna 250/10 LiChrospher RP-18e (5 \mum)®. La elución se llevó a cabo usando ácido trifluoroacético acuoso al 0,05% en acetonitrilo al 11 22%. La concentración a presión reducida y el secado por congelación dio 18 mg de la sal de trifluoroacetato de pluraflavina A.

Ejemplo 8 Identificación de pluraflavina A

Apariencia: una sustancia amarilla intensa que era soluble en disolventes orgánicos polares pero sólo soluble con moderación en agua. Las sales de adición de ácidos son solubles en agua. El compuesto era estable en medio neutro y ligeramente ácido, pero inestable en el intervalo alcalino y fuertemente ácido.

UV-máxima: 214, 243, 270 (Sh), 290 (Sh), 426 nm en agua/acetonitrilo (8:2), pH 2 y 214, 243, 270 (Sh), 290 (Sh) y 426 nm en agua/acetonitrilo (6:4), pH 7.

Bandas IR: 3424, 1680, 1600, 1464, 1427, 1300, 1203, 1131, 1066, 1009, 801, 721 cm^{-1}.

Por espectrometría de masas de alta resolución, se encontró el siguiente peso molecular para (M+H)^{+}: 823,370631 Da, que corresponde a la fórmula empírica para la pluraflavina A de C_{43}H_{54}N_{2}O_{14}. La ionización por pulverizado de electrones (ESI, positivo) da, por medio de fragmentación MS/MS, los siguientes iones: 823, 693, 680, 550, 480, 390, 320, 144 y 131 Da.

Señales RMN: véase Tabla 1.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Cambios químicos de ^{1}H y ^{13}C de la pluraflavina A en metanol-d_{4} y DMSO-d_{6} a 300ºK

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Para la aldohexosa III, los NOE observados fueron coherentes con una estéreoquímica relativa SRSS o RSRR en los centros quirales 1', 3', 4', 5' (véase H-III). Esto corresponde al epímero C-3 de la vancosamina.

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H-III Estéreoquímica relativa de la hexosa III

Los efectos NOE observados para la hexosa II favorecen la estéreoquímica relativa RSSS o SRRR para los centros quirales 1'', 3'', 4'', 5'' (véase H-II).

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H-II Estéreoquímica relativa de la hexosa II

La misma estéreoquímica relativa (RSSS, SRRR) para los átomos de carbono asimétricos 1''', 3''', 4''', 5''' fue coherente con los NOE detectados de la hexosa I (véase H-I).

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H-I Estéreoquímica relativa de la hexosa I Ejemplo 9 Identificación de la pluraflavina B

Apariencia: una sustancia amarilla intensa que era soluble en disolventes orgánicos polares, pero sólo soluble con moderación en agua. Las sales de adición de ácido son solubles en agua. El compuesto era estable en medio neutro y ligeramente ácido, pero inestable en el intervalo alcalino.

UV máxima: 214, 243, 270 (Sh), 290 (Sh), 426 nm en agua/acetonitrilo (8:2), pH 2 y 214, 243, 270 (Sh), 290 (Sh) y 426 nm en agua/acetonitrilo (6:4), pH 7.

La pluraflavina B tiene la fórmula empírica C_{43}H_{56}N_{2}O_{15}, el peso molecular fue 840,9 Da.

Señales RMN: véase Tabla 2.

TABLA 2 Cambios químicos de ^{1}H y ^{13}C de la pluraflavina B en metanol-d_{4} y comparación con la pluraflavina A a 300ºK

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Ejemplo 10 Purificación final de la pluraflavina E

La fracción 6, obtenida según el Ejemplo 6, se disolvió, después de secado por congelación (5 mg), en acetonitrilo al 10% en agua, se ajustó a pH 2,8 con ácido trifluoroacético y se aplicó a una columna 250/10 LiChrospher RP-18e (5 \mum)®. La elución se llevó a cabo usando ácido trifluoroacético acuoso al 0,05% en modo de gradiente de 11 a 22% de acetonitrilo. La concentración a presión reducida y secado por congelación dio 2,7 mg de la sal de trifluoroacetato de pluraflavina E.

Ejemplo 11 Identificación de la pluraflavina E

Apariencia: una sustancia amarilla intensa que es soluble en disolventes orgánicos polares pero solo soluble con moderación en agua. Las sales de adición de ácido son solubles en agua. El compuesto era estable en medio neutro y ligeramente ácido, pero inestable en el intervalo alcalino y fuertemente ácido.

UV-máxima: 213, 244, 270 (Sh), 290 (Sh), 426 nm en agua/acetonitrilo (8:2), pH 2, y 213, 244, 270 (Sh), 290 (Sh) y 426 nm en agua/acetonitrilo (6:4), pH 7. Se encontró el siguiente peso molecular por espectrometría de masas para (M+H)^{+}: 712 Da, correspondiente a la fórmula empírica C_{36}H_{41}NO_{14} para la pluraflavina E.

Señales RMN: véase Tabla 3.

TABLA 3 Cambios químicos de ^{1}H y ^{13}C de la pluraflavina E en metanol-d_{4} a 300ºK

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Ejemplo 12 (a) Examen de la actividad citostática

Para determinar la actividad citostática, se usaron células de hepatoma de rata que se obtuvieron de la colección de cepas American Type Culture Collection con el número ATCC CRL-1548, Jo No. 223 y 228. La cepa se puso en el medio "MEM (EAGLE) con Glutamax" [GIBCO BRL No. 4109-028] con suero fetal de ternero al 10% [GIBCO BRL No. 10270-106] y 10 \mul de penicilina-estreptomicina [GIBCO BRL No. 15140-114]/ml. Se usaron placas de microtítulo de 96 pocillos [Greiner, No. 15140-114]. Cada pocillo se cargó inicialmente con 140 \mul de disolución nutriente de cultivo, y en cada caso se inoculó con 215.000 células. Las placas se incubaron después a 37ºC y 5% de CO_{2} durante 20-24 horas. Una serie de diluciones de pluraflavinas con concentraciones de 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625, 0,7813, 0,3906, 0,195, 0,094, 0,047 y 0 \muM, que se habían preparado anteriormente, se pipetearon luego en el correspondiente orden. Después de un tiempo de incubación adicional de 22 horas a 37ºC en una atmósfera del 5% de CO_{2}, se aspiró después el medio líquido. Las células que permanecieron se tintaron con 100 \mul de RPMI 1640 [GIBCO BRL No. 32404-014]/pocillo y 20 \mul de Cell Titer 96 Aqueous [PROMEGA No. G5430]/pocillo. La absorción de luz a 590 nm se midió directamente después de la adición y después de 2 horas de incubación, como anteriormente. El efecto citostático se calculó a partir del cambio en la absorción de luz.

IC_{50} para pluraflavina A = <50 nM;

IC_{50} para pluraflavina B = <50 nM.

(b) Efectos de antiproliferación de la pluraflavina A y el flavopiridol en líneas celulares tumorales seleccionadas

MTT, una sal de tetrazolio soluble en agua, se convierte a un formazan púrpura insoluble cuando se disuelve por división del anillo de tetrazolio por enzimas deshidrogenasa en la mitocondria activa. Las células muertas no causan este cambio. Este método se usó para cuantificar la proliferación para determinar la actividad de compuestos quimioterapéuticos potenciales.

Todas las células se mantuvieron en RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) que contenía Suero Fetal Bovino inactivado por calor al 10%, penicilina/estreptomicina y se suplementó con L-glutamina. Las células se chaparon en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos a las siguientes densidades:

Pecho	2500 células/pocillo
Próstata	2500 células/pocillo
Colon	1000 células/pocillo
Pulmón	1000 células/pocillo

Las células se dejaron adherirse toda la noche a 37ºC, 5% de CO_{2} la pluraflavina A se diluyó en medio de cultivo con la concentración final de compuesto como sigue: 50,0, 16,67, 5,56, 1,85, 0,617, 0,206, 0,069, 0,023 \muM. El flavopiridol se diluyó a: 2,0, 0,667, 0,222, 0,074, 0,025, 0,008, 0,003, 0,001 \muM.

Ambos compuestos se probaron por triplicado a todas las concentraciones. Las células se lavaron con medio fresco, y los compuestos se añadieron a las células en un volumen final de 100 \mul. Las células más el compuesto se dejó incubar a 37ºC, 5% de CO_{2} durante aproximadamente 72 horas. Al tiempo deseado, se añadieron 25 \mul de MTT (10 mg/ml en HBSS) a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37ºC durante 2-4 horas. El MTT y el medio se eliminaron y se añadieron 200 \mul de DMSO por pocillo. Las lecturas se tomaron a 570 nm. Los resultados se dan después:

Células	Pluraflavina A IC_{50}	Flavopiridol IC_{50}
Pecho	<23 nM	90 nM
Próstata	10 nM	80 nM
Colon	0,35 nM	30 nM
Pulmón	3,0 nM	90 nM

En un ensayo suave de agar, se probaron la pluraflavina A y el flavopiridol frente a células de leucemia. Los resultados IC_{50} fueron: 60 nM (pluraflavina A) y 0,5, 0,6 \muM (flavopiridol).

Claims

1. Un compuesto de fórmula I

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en donde

R_{1} es un grupo azúcar;

R_{2} es -COOH o -CH_{2}-O-(R_{7})m, en donde R_{7} es un grupo azúcar;

R_{3} se elige a partir de grupos que comprenden un epóxido, grupos alquilo C_{1}-C_{6} y grupos alquenilo C_{2}-C_{6}, en donde dichos grupos alquilo y grupos alquenilo están sustituidos opcionalmente con al menos un grupo OH;

R_{5} se elige a partir de átomo de hidrógeno, grupos alquilo C_{1}-C_{6}, grupos alquenilo C_{2}-C_{6} y grupos alquinilo C_{2}-C_{6};

R_{4}, R_{6}, R_{8} y R_{10}, se eligen cada uno independientemente a partir de átomos de hidrógeno, grupos alquilo C_{1}-C_{6}, grupos alquenilo C_{2}-C_{6}, grupos alquinilo C_{2}-C_{6}, grupos -X_{2}H en donde H se enlaza directamente al primer átomo de X_{2}, y grupos -X_{2}R_{12} en donde R_{12} se enlaza directamente al primer átomo de X_{2}, y opcionalmente R_{4} y R_{6} juntos son un grupo -X_{2} con doble enlace, y opcionalmente R_{8} y R_{10} juntos son un grupo -X_{2} con doble enlace, en donde cada X_{2} se elige independientemente a partir de átomos de oxígeno, grupos -NH, grupos -N-alquilo C_{1}-C_{6}, grupos -N-alquenilo C_{2}-C_{6}, grupos -N-alquinilo C_{2}-C_{6} y átomos de azufre, en donde cada R_{12} se elige independientemente a partir de grupos alquilo C_{1}-C_{6}, grupos alquenilo C_{2}-C_{6}, grupos alquinilo C_{2}-C_{6}, grupos arilo y grupos acilo; y m y n se eligen cada uno independientemente de 1 a 2; en todas sus formas estéreo químicas y mezclas de estas formas en cualquier relación, y sus sales y derivados fisiológicamente aceptables.

2. Un compuesto según la reivindicación 1, en donde R_{7} es un aminoazúcar.

3. Un compuesto según las reivindicaciones 1 ó 2, en donde R_{7} tiene la fórmula

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4. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde n es 2.

5. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde R_{1} es un aminoazúcar.

6. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde R_{1} tiene la fórmula

28

7. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde R_{3} se elige a partir de grupos

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8. Un compuesto según la reivindicación 1, de fórmula (IA)

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en todas sus formas estereoquímicas y mezclas de estas formas en cualquier relación, y sus sales y derivados fisiológicamente aceptables.

9. Un compuesto según la reivindicación 1, de fórmula (IB)

31

10. Un compuesto según la reivindicación 1, de fórmula (IE)

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en todas sus formas estéreo químicas y mezclas de estas formas en cualquier relación, y sus sales y derivados fisiológicamente aceptables.

11. Un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, obtenible cultivando Actinomicetales de especie HAG 003959, DSM 12931, o una de sus variantes o mutantes en condiciones adecuadas en un medio de cultivo hasta que esté presente al menos un compuesto de fórmula (I) en el medio de cultivo, seguido por aislamiento del compuesto.

12. Un compuesto según la reivindicación 11, en donde dicho compuesto aislado se convierte adicionalmente en al menos un compuesto elegido a partir de derivados y sales fisiológicamente aceptables.

13. Una composición que comprende al menos un compuesto de fórmula (I), según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal o derivado fisiológicamente aceptable, y un vehículo aceptable.

14. Una composición según la reivindicación 13, en donde dicho vehículo aceptable es un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Un procedimiento para hacer al menos un compuesto de fórmula (I) o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende cultivar el microorganismo Actinomicetales de la especie HAG 003959, DSM 12931, o una de sus variantes o mutantes, en condiciones adecuadas en un medio de cultivo, hasta que esté presente al menos un compuesto de fórmula (I) en el medio de cultivo, seguido por aislamiento del compuesto.

16. Un procedimiento según la reivindicación 15, en donde dicho compuesto aislado se convierte adicionalmente en al menos un compuesto elegido a partir de derivados y sales fisiológicamente aceptables.

17. Un procedimiento según las reivindicaciones 15 ó 16, en donde el cultivo se lleva a cabo en condiciones aeróbicas a una temperatura entre 18 a 35ºC y a un pH entre 6 y 8.

18. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde el compuesto de fórmula (I) se convierte en un derivado usando un agente reductor.

19. Un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o una sal o derivado fisiológicamente aceptable del mismo, para usar en la inhibición de la transcripción de al menos un ácido nucleico de cadena doble.

20. El uso de un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal o derivado fisiológicamente aceptable del mismo, para la fabricación de un compuesto citostático.

21. El uso de un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal o derivado fisiológicamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores de colon.

22. El uso de un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal o derivado fisiológicamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores de mama (pecho).

23. El uso de un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal o derivado fisiológicamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores pulmonares.

24. El uso de un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal o derivado fisiológicamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores de próstata.

25. El uso de un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal o derivado fisiológicamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la leucemia.

26. El uso de un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal o derivado fisiológicamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones microbianas.

27. Cepa de microorganismos Actinomicetales de la especie HAG 003959 (DSM 12931).