ES2236688T3 - Variantes transdominantes tat del virus de la inmunodeficiencia humana. - Google Patents
Variantes transdominantes tat del virus de la inmunodeficiencia humana.Info
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Abstract
Variante transdominante de la proteína TAT del virus VIH o de un fragmento funcional de dicha proteína capaz de inducir una transactivación de la expresión de uno o varios gen(es) puesto(s) bajo el control de un promotor que comprende la secuencia TAR, caracterizada porque dicha variante comprende una mutación seleccionada entre las mutaciones que consisten en la presencia en posición 38 de un residuo que tiene una cadena lateral ácida tal como un ácido glutámico o un ácido aspártico.
Description
Variantes transdominantes TAT del virus de la
inmunodeficiencia humana.
La presente invención tiene por objeto nuevas
variantes de la proteína TAT del virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH), así como los fragmentos de ADN que codifican para
dichas variantes, permitiendo los casetes de expresión su expresión
por vía recombinante y las células que contienen dichas casetes de
expresión. Las variantes de la proteína TAT, casetes y células son
en particular útiles para la prevención o el tratamiento de las
infecciones por VIH.
El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA)
se desarrolla a consecuencia de una infección de los linfocitos T4
de un individuo por el virus VIH. La infección puede ser
asintomática durante numerosos años, pero desde que las células son
activadas, el virus VIH se replica rápidamente y las destruye. El
SIDA se caracteriza por un déficit de la inmunidad celular, que
tiene por efecto hacer el individuo particularmente sensible a
cualquier infección oportunista. En julio de 1992, la OMS ha
registrado 501.272 casos de SIDA en el mundo. (AIDS Information
international literature on acquired immunodeficiency syndrom and
related retroviruses, 1992, 8, Leeds University Press. Editor A.W.
Boylston, Ledds). Pero estas cifras son sin embargo inferiores a la
realidad, puesto que esta enfermedad constituye una verdadera
epidemia en ciertos países africanos.
El SIDA es una enfermedad en la que el porcentaje
de mortalidad es siempre muy elevado en 1992. En efecto, el 90% de
las personas mueren en los 2 años que siguen a la aparición del
SIDA. Hasta el presente, ningún tratamiento ha resultado ser
totalmente satisfactorio a pesar de los múltiples esfuerzos
invertidos. El desarrollo de tratamientos eficaces ha topado con la
complejidad particular del virus VIH.
El VIH es un retrovirus que pertenece a la
familia de los lentivirus. Como cualquier retrovirus, el VIH está
formado por una envolvente que rodea una cápsida de naturaleza
proteínica, que contiene el material genético constituido por una
molécula de ARN asociada a diversas proteínas virales necesarias en
las primeras etapas del ciclo replicativo.
Después de la infección de un linfocito T, la
molécula de ARN es copiada por la reversotranscriptasa viral en ADN.
El ADN se integra en el genoma celular y constituye lo que
corrientemente se denomina un provirus. El ADN proviral puede
permanecer allí en estado latente o puede ser transcrito en ARN por
la maquinaria celular para producir por una parte el ARN genómico
viral y por otra parte los ARNs mensajeros (ARNm) que se traducirán
en proteínas virales.
La formación de nuevas partículas virales o
viriones se efectúa por encapsidación del ARN genómico viral en la
cápsida. La partícula así formada se separa de la célula por brote
arrastrando una parte de la membrana celular, en la que está
incorporada la glicoproteína de envolvente viral. Los viriones así
liberados son susceptibles de infectar otras células linfoides
gracias a un reconocimiento específico y recíproco del receptor CD4
expresado en la superficie de los linfocitos T4 y de la proteína de
envolvente del VIH.
De manera general, el genoma del VIH comprende,
como se ha indicado en la figura 1:
3 genes estructurales: gag, pol y
env que codifican respectivamente para las proteínas de la
cápsida, la envolvente y la reversotranscriptasa,
por los menos 6 genes: tat, rev, nef, vif,
vpr y vpu, que codifican para unas proteínas que tienen
verosímilmente unas funciones reguladoras aún mal definidas para
algunas, y
las secuencias cis-reguladoras
indispensables para la transcripción, localizadas en los 2 extremos
5' y 3' del ADN proviral a nivel de los LTRs (Long Terminal
Repeat). El LTR 5' contiene las secuencias promotoras y los
elementos de regulación requeridos para la iniciación de la
transcripción, mientras que el LTR 3' está implicado en la
terminación de la transcripción. Además, la transcripción de los
genes virales está sometida a una regulación compleja controlada en
particular por las proteínas virales TAT y REV.
La proteína TAT es una proteína reguladora
expresada precozmente durante el ciclo viral. Su lugar de acción es
el núcleo. Su función consiste en transactivar la expresión de los
genes que codifican para todas las proteínas del VIH. La proteína
TAT interactúa específicamente con una corta secuencia nucleotídica
del genoma viral: la secuencia TAR (Trans-Activation
Responsive Region) localizada en el extremo 5' del genoma del VIH
entre los nucleótidos (nt) -17 a +80 del LTR5'. Esta secuencia está
por tanto en parte presente en todos los ARNm virales. Se supone
que el complejo TAT-TAR, probablemente en asociación
con otros factores celulares, favorece la transcripción de los
genes virales, estabiliza los ARNm así obtenidos y mejora la
traducción de estos ARNm en proteínas. Así el virus se multiplica
muy rápidamente desde que el gen tat es activado.
El efecto de transactivación inducido por la
proteína TAT ha podido ser evaluado in vitro utilizando un
gen indicador cuya expresión puede ser fácilmente medida, tal como
el gen CAT (Cloramfenicol Acetil Transferasa). El gen CAT, puesto
bajo el control del LTR 5' del virus VIH que incluye la secuencia
TAR, ha sido introducido en unas células animales por transfección.
En las células que no expresan TAT, por ejemplo unas células no
infectadas por el virus VIH, la transcripción del gen CAT a partir
del promotor viral es bloqueada o reducida a un mínimo, de manera
que nada o muy poco producto del gen CAT es puesto en evidencia.
Mientras que en presencia de la proteína TAT, se observa un aumento
de la expresión génica en un factor 100 a 1000 según las células,
que resulta de una aceleración de la transcripción asociada a una
mejor eficacia de la traducción.
El gen transactivador tat del VIH
comprende 2 exones codificantes. El primero está situado en la
región central del genoma, entre las secuencias que codifican para
los genes pol y env, y codifica para la parte esencial
de la proteína, a saber los 72 ácidos aminados
N-terminales. El segundo, que codifica solamente
para los 14 ácidos aminados C-terminales no es
indispensable para la actividad biológica.
La estructura de la proteína TAT es sugerida por
su función. La misma debe comprender por lo menos un campo que
permita la activación de la transcripción de los genes virales,
denominado campo de activación, un campo de enlace con la secuencia
nucleotídica TAR, su secuencia diana, y un campo que permite su
localización nuclear.
Numerosos estudios han demostrado que la proteína
TAT está constituida por 5 campos (fig. 2):
un primer campo (ácidos aminados 1 a 37) posee
una secuencia rica en cisteínas, cuya función es aún desconocida.
Algunos estudios sugieren que esta región interviene en el
replegado de la proteína y en la dimerización de las moléculas TAT
y la protegería frente a las proteasas,
el campo constituido por los ácidos aminados 38 a
48 que corresponde al primer campo de activación,
el campo constituido por los ácidos aminados 49 a
57 que posee las secuencias de localización nuclear y de fijación en
el elemento TAR,
el campo constituido por los ácidos aminados 58 a
72 que corresponde al segundo campo de activación TAT,
el campo constituido por los ácidos aminados 73 a
86 no es esencial para la actividad de TAT.
La mayor parte de los retrovirus emparentados con
el VIH poseen unos genes transactivadores que codifican para unas
proteínas capaces de activar la transcripción de los genes virales
a partir de los LTRs. Desde hace algunos años han sido descritas
numerosas variantes de estas proteínas transactivadoras derivadas
de diferentes tipos de virus y de entre ellas unas variantes
negativas y dominantes (Wachsman et al., Science, 1987, 235,
674-677; Friedman et al., Nature, 1988, 335,
452-454), designadas a continuación variantes
transdominantes.
Las variantes transdominantes han sido definidas
como unas variantes que tienen una capacidad reducida para inducir
la activación de la expresión de los genes puestos bajo el control
del promotor viral (actividad transactivadora reducida) pero que
tienen la capacidad de reconocer su secuencia diana situada al nivel
de este mismo promotor, de manera que pueden inhibir de forma
competitiva la función de la proteína transactivadora nativa.
Puesto que estas variantes interfieren de manera
dominante con la función de las proteínas nativas, podrían
constituir una nueva clase de agentes antivirales capaces de
promover la "inmunización intracelular" de las células
infectadas.
De manera general, esta tecnología consiste en
modificar genéticamente unas células a fin de hacerles sintetizar
una proteína o unos ácidos nucleicos que les confieren una ventaja
particular, como por ejemplo según el concepto definido por D.
Baltimore (Nature, 1988, 335, 395-396), una
resistencia contra la infección por un virus dado, tal como el
virus VIH.
Así, Green et al. (Cell, 1989, 58,
215-233) han generado unas variantes transdominantes
modificadas en el primer campo de activación de la proteína TAT del
virus VIH. Estos autores divulgan 4 variantes salidas de un
fragmento peptídico de la proteína TAT: dos de ellas se describen
como unos transdominantes eficaces, a saber las variantes TAT
(Lys^{41}-> Ala) y TAT (Tyr^{47} -> Ala) y las otras dos
unos transdominantes moderados, a saber TAT (Ser^{46} -> Ala) y
la doble variante TAT (Ser^{46}, Tyr^{47}-> Ala, Ala).
Sin embargo, las variantes mencionadas en esta
publicación parecen controvertidas (Frankel et al., Proc.
Natl. Acad. Sci USA, 1989, 86, 7397-7401). El
solicitante ha ensayado también reproducir los resultados obtenidos
con la variante (Lys^{41}-> Ala), pero sin éxito, como se
indica más adelante.
Por otra parte, Pearson et al. (Proc.
Natl. Acad. Sci USA, 1990, 87, 5097-5083) pone en
evidencia la importancia de la región constituida por los ácidos
aminados 48 a 54 en la obtención de un fenotipo transdominante. En
efecto, el reemplazado del codón que codifica para la glutamina
(Gln) en posición 54 por un codón stop genera una variante truncada
\DeltaTAT que presenta dicho fenotipo.
Se han encontrado ahora nuevas variantes de la
proteína TAT del VIH que presentan un fenotipo transdominante y que
han sido modificadas al nivel de algunos residuos de los campos de
activación.
Estas variantes son en particular útiles en el
marco de una terapia anti-SIDA puesto que presentan
una actividad transactivadora reducida y que interfieren de forma
dominante con la función de la proteína TAT nativa. Estas nuevas
variantes podrían constituir unos agentes antivirales eficaces para
inhibir la replicación y la propagación del virus VIH. En efecto,
la acción de estas variantes transdominantes se realizaría desde el
primer ciclo de infección antes incluso de que el virus haya podido
sintetizar las proteínas y el ARN necesarios para la formación de
nuevas partículas virales.
La presente invención tiene por tanto por objeto
una variante transdominante de la proteína TAT del virus VIH o de
un fragmento funcional de dicha proteína que comprende por lo menos
una mutación; estando dicha mutación caracterizada por la presencia
de un residuo ácido aminado diferente del residuo natural en
posición 38.
De manera general, se conviene en describir la
secuencia de una variante de la proteína TAT sobre la base de la
secuencia de la proteína TAT del virus VIH 1 aislado Lai, tal como
el divulgado por Wain-Hobson et al., (Cell,
1985, 40, 9-17).
Sin embargo, la proteína TAT y el fragmento de
ADN que codifica para la proteína TAT han sido originariamente
descritos a partir de la cepa viral VIH 1, aislado Lai. Ahora bien,
las cepas virales y los aislados virales descritos en el interior
de una misma cepa existen en gran número. Además, un virus
particular es susceptible de variabilidad cuando tiene lugar su
propagación. Por consiguiente, el fragmento de ADN que codifica
para la proteína TAT puede tener una secuencia nucleotídica
diferente de un virus al otro. Así mismo, la proteína TAT puede
tener una secuencia de ácidos aminados diferente de un virus al
otro. Pero el denominador común es la función de la proteína que es
transactivar la expresión de los genes puestos bajo el control de un
promotor que contiene una secuencia diana TAR, tal como el promotor
del virus VIH incluido en el LTR 5' del genoma viral. Por proteína
TAT del VIH, se entiende cualquier proteína que dé un resultado de
transactivación sustancialmente idéntico al presentado por la
proteína TAT del virus VIH 1 aislado Lai.
En la práctica, la secuencia de una variante de
la proteína TAT está alineada sobre la de la proteína TAT del virus
VIH1. El recuento de los ácidos aminados en la secuencia de una
variante de la proteína TAT será por tanto calcado sobre el
establecido para la proteína TAT del virus VIH1. Así un residuo
ácido aminado en posición, por ejemplo, 41 en la secuencia de una
variante de la proteína TAT es de hecho un residuo ácido aminado
que corresponde después de la alineación con el ácido aminado en
posición 41 en la secuencia de la proteína TAT nativa del virus
VIH1.
De manera más particular, una variante de la
proteína TAT según la invención presenta en particular un fenotipo
transdominante caracterizado por una actividad transactivadora
inferior en aproximadamente 50% con respecto a la de la proteína
TAT nativa, de manera ventajosa inferior en 20% y preferentemente
inferior en 10% y una actividad inhibidora de la función TAT nativa,
tal como la determinada en una relación de concentración
variante/TAT nativa de 10/1, superior a 50%, de manera ventajosa
superior a 75% y preferentemente superior a 90%. Diferentes
procedimientos de medición de la actividad transactivadora son
conocidos actualmente. Los mismos varían según el gen reporter
utilizado. A título de ejemplo se cita el procedimiento que utiliza
el gen CAT puesto bajo el control del LTR5' del virus VIH, descrito
en los ejemplos siguientes.
Una variante de la proteína TAT según la
invención puede ser derivada de un fragmento funcional de dicha
proteína y ser mutado al nivel de un residuo como se ha indicado
anteriormente, estando el recuento de los ácidos aminados también
alineado con el establecido para la proteína TAT nativa del virus
VIH1 de referencia. Por fragmento funcional de la proteína TAT, se
entiende todo fragmento de dicha proteína que es capaz de inducir
una transactivación de la expresión de los genes puestos bajo el
control de un promotor que comprende la secuencia TAR, tal como el
promotor del virus VIH. Por ejemplo, una variante de la proteína
TAT según la invención puede ser generada después de mutación de un
fragmento de la proteína TAT, tal como un fragmento que se inicia
con el ácido aminado 1 y que se para en el ácido aminado 72.
Una variante de la proteína TAT según la
invención puede presentar varias mutaciones con respecto a la
proteína TAT nativa del VIH. Puede comprender una combinación de por
lo menos 2 mutaciones tales como las descritas anteriormente.
De manera más particular, una variante de la
proteína TAT según la invención tiene en particular una secuencia
cuyo grado de homología con la secuencia TAT nativa del VIH1 es
superior al 75%, de manera ventajosa superior a 90% y
preferentemente superior a 95%.
Evidentemente, los residuos a mutar pueden ser
reemplazados por cualquier ácido aminado distinto que el residuo
natural, salvo el residuo en posición 41 que puede ser reemplazado
por una arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glicina,
ácido glutámico, glutamina, histidina, isoleucina, leucina,
metionina, fenilalanina, prolina, serina, trictofano, tirosina y
valina; y el residuo en posición 47 que puede ser reemplazado por
una arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glicina, ácido
glutámico, glutamina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,
fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano y valina.
Según un aspecto particularmente ventajoso de la
invención, una variante TAT que comprende en posición 38 un ácido
aminado que tiene una cadena lateral ácida tal como un ácido
glutámico, un ácido aspártico o preferentemente, un ácido
aspártico.
La invención se refiere también a un fragmento de
ADN que codifica para dicha variante de la proteína TAT. La
secuencia que codifica para una variante de la proteína TAT puede
ser obtenida según las técnicas clásicas de la ingeniería genética,
por ejemplo por mutagénesis dirigida. Así, el fragmento de ADN que
comprende el gen que codifica para la proteína TAT nativa del VIH o
una porción de dicha secuencia es clonado en un fago de tipo M13.
La secuencia es modificada utilizando un oligonucleótido apropiado,
de manera que se obtenga la o las mutación(es)
deseada(s).
La invención incluye también un casete de
expresión que comprende un fragmento de ADN que codifica para una
variante de la proteína TAT según la invención, puesto bajo el
control de elementos apropiados que permiten su expresión. Un
casete de expresión es en particular útil para permitir sintetizar
una variante de la proteína TAT en un sistema de expresión
heterólogo o bien como elemento de un vector destinado a la terapia
génica tal como un vector retroviral o adenoviral. Por elementos
apropiados que permitan la expresión del fragmento de ADN que
codifican para una variante de la proteína TAT, se entiende el
conjunto de los elementos que permiten la transcripción de dicho
fragmento de ADN en ARNm y la traducción del ARNm en proteína.
Estos elementos comprenden en particular un
promotor apropiado. En el contexto de la invención, el término
"promotor" significa cualquier elemento de control de
transcripción implicado en la expresión de un fragmento de ADN en
función de la célula huésped que ha sido considerada. Dichos
elementos de control son bien conocidos por el experto en la
materia y son insertados en el casete de expresión por las técnicas
convencionales de la ingeniería genética.
El promotor considerado puede ser de origen
celular o viral. El promotor puede ser de tipo ubicuitario que
permite una expresión permanente del fragmento de ADN. Tal es el
caso del promotor PGK (fosfogliceratoquinasa) funcional en la
levadura o del promotor tardío del virus SV40 (Simian Virus 40), del
promotor del gen HMG
(Hidroxi-Metil-Glutaril coencima A
reductasa), del promotor del gen de la timidinaquinasa (TK) del
virus Herpes Simplex de tipo 1 (HSV1), del promotor EIII y MLP
(Major Late Promoter) del adenovirus y del LTR del virus MoMuLV
(Moloney Murine Leukemia Virus) funcionales en las células
animales.
El término "promotor" incluye también un
promotor de tipo regulable, por ejemplo un promotor
tejido-específico como el promotor de los genes de
inmunoglobulinas específico de las células linfocitarias.
Además, el casete de expresión puede
contener:
- (1)
- unas UAS (Upstream Activating Sequence) tales como las UAS del gen GAL4 (Galactosa) de levadura,
- (2)
- unos potenciadores que pueden ser colocados o bien corriente arriba del promotor o corriente abajo del fragmento de ADN y que permiten aumentar los niveles de expresión, tal como el potenciador del gen CD2 humano. Además, este último comprende unos elementos que permiten dirigir selectivamente la expresión del fragmento de ADN en las células linfocitarias de tipo T,
- (3)
- unas secuencias intrónicas conocidas para mejorar la expresión génica en los eucariotas superiores, del intrón del virus SV40,
- (4)
- unas señales de engarzado como por ejemplo las del virus SV40 que permiten la eliminación de las secuencias intrónicas en los ARNm destinados a ser traducidos en proteínas,
- (5)
- los elementos implicados en la terminación de la transcripción, tales como las señales de poliadenilación del virus SV40.
De manera general, el casete de expresión puede
permitir la expresión de una variante de la proteína TAT en el
interior de una célula huésped, y preferentemente en el interior de
un linfocito.
El casete de expresión puede también permitir la
producción de la variante de la proteína TAT en el medio de cultivo
del cual puede ser fácilmente recolectada. En este caso, el
fragmento de ADN codifica para un precursor de la variante de la
proteína TAT que comprende, corriente arriba de la secuencia madura,
un péptido señal que permite la secreción de dicha variante de la
célula huésped. Dichos péptidos señal son bien conocidos por el
experto en la materia, por ejemplo la secuencia señal del factor
Mat alfa de la levadura.
El casete de expresión es insertado en un vector
de expresión que sirve para transformar una célula huésped en la que
el promotor y los elementos apropiados son funcionales. Un vector
de este tipo puede estar en forma de un plásmido o de un vector
viral, por ejemplo un vector retroviral derivado del MoMuLV o un
vector adenoviral derivado del adenovirus de tipo 5.
La presente invención se extiende a las células
que comprenden un casete de expresión según la invención, pudiendo
ser las células de origen eucariota o procariota. La célula huésped
puede ser una bacteria, un hongo, por ejemplo una levadura o una
célula de mamífero. Preferentemente, la célula huésped será una
célula humana de la progenie hematopoyética.
La invención se refiere también a un
procedimiento de preparación de una variante de la proteína TAT
según la invención, según el cual:
- (1)
- se cultiva una célula eucariota o procariota según la invención, que comprende un fragmento de ADN que codifica para dicha variante, en un medio de cultivo apropiado, y
- (2)
- se recolecta la variante a partir del medio de cultivo o de dicha célula.
La invención cubre también una variante de la
proteína TAT obtenida por la aplicación de dicho procedimiento.
La invención se extiende también a la utilización
terapéutica de una variante de la proteína TAT según la invención
de un casete de expresión o de una célula que produce dicha
variante para inhibir la replicación del virus VIH. De manera
preferida, la presente invención se refiere a la utilización de una
variante de la proteína TAT o de un casete de expresión o de una
célula que produce dicha variante para la preparación de un
medicamento destinado al tratamiento o a la prevención del SIDA en
los mamíferos, preferentemente los humanos.
De manera ventajosa, un casete de expresión o una
célula según la invención, pueden ser utilizados con fines de
terapia génica anti-SIDA. El casete de expresión es
insertado en un vector de tipo retroviral que es introducido en las
células cepas de la progenie hematopoyética extraídas de la médula
ósea de un individuo (preferentemente infectado por el VIH). Las
células cepas así transfectadas son reinyectadas al donante. Son
capaces de dividirse y diferenciarse entre otros en linfocitos. Los
linfocitos que comprenden el vector retroviral expresan de forma
prolongada en el tiempo el gen que codifica para una variante
transdominante de la proteína TAT que hace a dichas células
resistentes a la infección por el VIH.
La invención se refiere también a una composición
farmacéutica que comprende a título de agente terapéutico o
profiláctico una variante según la invención, un casete de
expresión o una célula que producen dicha variante. Una composición
farmacéutica según la invención puede ser preparada según las
técnicas comúnmente en uso. Por ejemplo, se asocia al agente
terapéutico o profiláctico en cantidad terapéuticamente eficaz, un
soporte, un diluyente o un adyuvante aceptable.
Finalmente, la invención se refiere a un
procedimiento de tratamiento según la cual se administra a un
paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una variante de la
proteína TAT según la invención, un casete de expresión o una
célula que produce dicha variante.
La invención se ilustra a continuación con
referencia a las figuras siguientes:
La figura 1 es una representación esquemática del
genoma el virus VIH, estando los genes que codifican para las
proteínas representados según el cuadro de lectura utilizado; LTR:
cajas negras; genes que codifican para las proteínas de estructura:
cajas grises; genes que codifican para las proteínas de regulación:
cajas blancas.
La figura 2 es una representación esquemática de
los diferentes campos que constituyen la proteína TAT al nivel del
virus VIH, estando los ácidos aminados que constituyen cada campo
indicados encima de cada uno de los campos.
La figura 3 es una representación esquemática del
vector de expresión eucariota pSG5 que comprende en secuencia: el
promotor SV40 (SV40 pro; caja negra), el fragmento 3' del exón 1
que no codifica del gen de la \beta globina de conejo (caja
blanca), el intrón del gen de la \beta globina de conejo (trazo
continuo), el inicio no codificante del exón 2 del gen de la \beta
globina de conejo (caja blanca), el promotor del bacteriófago T7
(T7 pro; caja negra), unos sitios únicos EcoRI, BamHI, BgIII que
permiten el clonado de un gen de interés y la señal de
poliadenilación del virus SV40 (pA SV40; caja gris).
La figura 4 es una representación esquemática del
vector de expresión de la proteína TAT nativa
pHMG-Tat que comprende en secuencia: el promotor del
gen HMG (HMGpro), el exón I no codificante del gen HMG (caja
rayada), el intrón I y el sitio aceptor para el engarzado del gen
HMG, el ADN-copia que codifica para los 86 ácidos
aminados de la proteína TAT (caja negra) y la señal de
poliadenilación de SV40 (pA, caja blanca).
La figura 5 es una representación esquemática del
vector retroviral pLXSP que comprende en secuencia el LTR5' del
virus MSV (Murine Sarcoma virus) que incluye la región promotora
viral, una región de encapsidación (psi), la parte 5' del gen gag
viral (gagº), unos sitios múltiples de clonado que permiten la
inserción de genes heterólogos (gen x), el promotor del virus SV40
que dirige la expresión del gen de resistencia a la puromicina
(PAC) y el LTR3' del virus MPSV (Myelo Proliferative Sarcoma Virus)
que incluye las señales de poliadenilación.
Un fragmento de ADN que comprende el
ADN-copia correspondiente a los 2 exones del gen
tat del genoma VIH-aislado Lai
(Wain-Hobson et al., Cell, 1985, 40,
9-17; Sodroski et al., Science, 1985, 229,
74-77) ha sido modificado a fin de crear un sitio
BamHI en 5' del ATG iniciador. Además, un sitio BamHI existe
naturalmente 53pb después del codón stop del gen tat. El
fragmento BamHI de 300pb que comprende el gen tat no mutado
ha sido purificado por el kit Gene Clean (Bio 101, Inc, P.O. Box
2284, La Jolla) e insertado en un vector M13TG130 (Kieny et
al., Gene, 1983, 26, 91-99) a fin de dar el
vector M13TG2306, sobre el cual son efectuadas las mutagénesis.
La mutación del codón que codifica para el
residuo 38 está sobre M13TG2306 utilizando el kit Amersham
(Oligonucleotide-directed in vitro
mutagenesis system, version 2.1 RPN 1523) y utilizando el
oligonucleótido descrito en el identificador de la secuencia SEC ID
nº: 1.
El oligonucleótido ha sido ideado de manera que
reemplace el codón que codifica para el residuo fenilalanina (Phe)
en posición 38 por un ácido aspártico (Asp) y para crear también un
sitio de restricción HindIII al nivel del codón que codifica para
el residuo en posición 42 de la secuencia TAT sin modificar el
ácido aminado para el cual codifica. La presencia de un sitio de
restricción permite identificar fácilmente los vectores mutados de
los emparentados cuando tiene lugar el análisis de los ADNs del
bacteriófago por la técnica de minipreparación descrita por
Maniatis et al. (Molecular cloning: a laboratory manual,
1989, Cold Spring Harbor Laboratory).
Después de mutagénesis, el fragmento BamHI que
comprende el gen tat mutado es entonces transferido al
vector de expresión eucariota pSG5 (Green et al., Nucleic
Acids Res, 1988, 16, 369) ilustrado en la figura 3. El plásmido
resultante, pTG2332, permite la expresión de la variante TAT
(Phe^{38}-> Asp).
Las variantes transdominantes TAT de la técnica
anterior, respectivamente la variante TAT (Lys^{41}-> Ala) y
\DeltaTAT (Gln^{54}-> stop) han sido creadas por mutagénesis
dirigida del vector M13TG2306, utilizando los oligonucleótidos
respectivamente descritos en la SEC ID nº:2 que permiten modificar
el codón que codifica para el residuo lisina en posición 41 por una
alanina y, en la SEC ID nº:3 que permite crear un codón stop en el
lugar del codón que codifica para el residuo glutamina en posición
54.
Después de mutagénesis, el gen tat mutado
es insertado en el vector de expresión eucariótico pSG5, que da
respectivamente pTG2351 que permite la producción del mutante TAT
(Lys^{41}-> Ala) y pTG2352 que permite la producción de
\DeltaTAT. Estos mutantes de la técnica anterior son utilizados
como testigo positivo de transdominancia. Su actividad
transactivadora así como su capacidad para inhibir la proteína TAT
nativa, es evaluada según condiciones estrictamente idénticas a las
utilizadas para las variantes TAT según la invención y que se
describen a continuación.
Se evalúa la actividad transactivadora de la
variante TAT (Phe^{38}->Asp) por transfección transitoria en
células He La del vector de expresión pTG2332 con el vector
reporter LTR-CAT (Emerman et al., EMBO J.,
1987, 6, 37-55). Las células son transfectadas
según la técnica al fosfato de calcio (Maniatis et al.,
Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor
Laboratory). Otros protocolos que permiten introducir un ácido
nucleico en una célula pueden también ser empleados, tales como la
técnica al sulfato de dextrano, la electroelución, los
procedimientos basados en los choques osmóticos o la microinyección
de una célula seleccionada.
Se cultivan las células humanas HeLa a 37ºC en
presencia de 5% de CO_{2} en un medio MEM (Eagle's minimum
essential medium) completado con 10% de suero fetal de ternera, 1%
de ácidos aminados no esenciales, 1% de glutamina y 1% de
gentamicina.
Se purifican los ADNs plasmídicos sobre gradiente
de cloruro de cesio. Se cotransfecta 1 \mug de pTG2332 y 0,5
\mug del plásmido LTR-CAT en las células HeLa en
cultivo, extendidas a razón de 4 x 10^{5} células por caja. La
transfección de 1 \mug de pHMG-Tat (figura 4) y
0,5 \mug de LTR-CAT constituye el testigo
positivo de transactivación. El vector pHMG-tat sale
del clonado del fragmento BamHI que comprende el
ADN-copia del gen tat que codifica para los
86 ácidos aminados de la proteína TAT, en el sitio BamHI del vector
pHMG (Mehtali et al., Gene, 1990, 91,
179-184). Los ADNs plasmídicos que deben ser
transfectados, son tomados de nuevo en 420 \mul de TE
(Tris-HCI 10 mM, pH 7,5; EDTA 1 mM) y mezclados con
60 \mul de CaCl_{2} 2M. Se añade la mezcla a 480 \mul de
HBSx2 (NaCI 280 mM; HEPES 50 mM;
Na_{2}HPO_{4}-2H_{2}O 1,5 mM ajustado a pH
7,12 con NaOH) agitando ligeramente el tubo. Después de 15 mn, el
precipitado es vertido gota a gota sobre las células. Se cambia el
medio 24 h después de la transfección a fin de eliminar el exceso
de precipitado. Se analizan los extractos celulares 48 h después de
las transformaciones a fin de evaluar la expresión del gen CAT.
Se recogen las células HeLa por rascado en un
tampón CAT (Tris-HCI 150 mM pH8; KCI 60 mM; NaCI 15
nM; EDTA 2 mM; espermina 0,15 mM; ditiotreitol (DTT) 1 mM;
fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) 0,4 mM). Se realizan 3 ciclos de
congelación-descongelación en nitrógeno líquido
seguido de una incubación a 37ºC durante 4 mn. Se incuba el lisado
así obtenido a 65ºC durante 10 mn y se centrifuga a 10000 rpm
durante 10 mn de manera que se eliminen los desechos celulares. Se
recupera el sobrenadante en el cual se determina la concentración
proteínica por test colorimétrico Biorad.
Se incuban 15 \mul de extracto celular
eventualmente diluido y completado a 800 \mul con H_{2}O y 200
\mul de reactivo Biorad en H_{2}O a temperatura ambiente durante
10 a 60 mn. Se determina la concentración proteínica por medición de
la densidad óptica a 595 nm con respecto a una gama patrón de
sueroalbúmina bovina.
Se determina la expresión del gen CAT sobre una
alícuota de extracto correspondiente de 10 a 20 \mug de proteínas.
Se incuba el volumen adecuado de extracto celular previamente
completado a 300 \mul con el tampón Tris-HCI 0,25
M pH 7,8 con 32 \mul de acetilcoenzima A 5 mM y 20 \mul (0,5
\muCi) de ^{14}C cloramfenicol a 37ºC durante 1h30. Después de
extracción con acetato de etilo y centrifugación a 10000 rpm
durante 5 mn, se liofiliza la fase superior. Ésta es tomada de
nuevo en 15 \mul de acetato de etilo, depositada sobre una placa
de gel de sílice 60F_{234} (Merck) y analizada por cromatografía
en capa delgada (emigración en un tampón cloroformo/metanol 19/1
durante 1h30). La cromatografía es revelada por autorradiografía y
las bandas correspondientes al cloramfenicol acetilado son
recortadas. El porcentaje de radioactividad es evaluado por contado
en escintilación. El porcentaje de actividad transactivadora del
mutante es calculado con respecto al porcentaje medido con el
testigo positivo (pHMG-Tat +
LTR-CAT), representando éste 100% de actividad
transactivadora.
Se evalúa la actividad transdominante de la
variante TAT (Phe^{38} -> Asp) midiendo su capacidad para
inhibir la función transactivadora de la proteína TAT nativa. La
actividad transdominante es determinada por transfección transitoria
en células HeLa del vector de expresión pTG2332 con el vector
reporter LTR-CAT y el vector de expresión de la
proteína TAT nativa pHMG-Tat. Se contransfectan 10
\mug de pTG2332, 1 \mug de pHMG-Tat y 0,5 \mug
de LTR-CAT según el protocolo descrito
anteriormente.
48 h después de la transfección, se preparan los
extractos celulares y se determina su concentración de proteínas.
Una alícuota de extracto que corresponde a 10 a 20 \mug de
proteínas está sometido al ensayo CAT. Las condiciones técnicas
utilizadas han sido descritas en detalle anteriormente. El
porcentaje de inhibición de la proteína TAT nativa para la variante
TAT (Phe^{38} -> Asp) es calculado con respecto al testigo
positivo de activación que resulta de la cotransfección de
pHMG-Tat y de LTR-CAT que representa
0%. Los resultados obtenidos están referidos en la
\hbox{tabla
1.}
| (1): Actividad transactivadora. |
| (2): Actividad inhibidora de la proteína TAT nativa o actividad transdominante. |
La variante TAT (Phe^{38} -> Asp) es un
mutante transdominante eficaz puesto que la actividad
transactivadora que presenta es ínfima (expresión del gen CAT
evaluada al 1,4% con respecto a la medida con la proteína TAT
nativa) puesto que inhibe en gran manera la actividad de la
proteína TAT nativa (98% de inhibición en presencia de
pTG2332).
Se puede constatar que la variante TAT
(Lys^{41} -> Ala) descrita por Green et al. y que
poseería un fenotipo transdominante según los autores, da unos
resultados totalmente contradictorios en estas experiencias. En
efecto, presenta una actividad transactivadora particularmente
elevada (172%) y parece por tanto actuar en cooperación con la
proteína TAT nativa. Además, esta variante no ejerce ningún efecto
dominante sobre la función TAT nativa (0% de actividad
transdominante).
La variante de la técnica anterior \DeltaTAT
producida por pTG2352 constituye bien un testigo de
transdominancia, lo que confirma la validez de estas experiencias.
Inhibe la actividad transactivadora de la proteína TAT nativa al
92%. Sin embargo, esta variante es capaz de inducir una expresión
del gen CAT puesto bajo el control del LTR del VIH (28%), siendo la
transactivación sin embargo inferior a la medida con el testigo
positivo pHMG-Tat.
El vector M13TG2306 es sometido a una mutagénesis
dirigida a fin de reemplazar el codón que codifica para el residuo
treonina (Thr) en posición 40 de la proteína TAT del VIH por un
codón que codifica para el residuo alanina (Ala) y de introducir
unas mutaciones silenciosas de manera que se cree un sitio de
restricción HindIII al nivel del codón que codifica para el residuo
42 que permite una identificación rápida de los vectores mutados.
El oligonucleótido utilizado es el descrito en la SEC ID nº: 4. El
gen tat mutado es transferido al vector pSG5 dando lugar a
pTG2333 que permite producir la variante TAT (Thr^{40} ->
Ala).
El vector pTG2333 es cotransfectado
transitoriamente en las células HeLa con el vector
LTR-CAT a fin de determinar la actividad
transactivadora de la variante TAT (Thr^{40} \rightarrow Ala)
según el protocolo descrito anteriormente. Paralelamente, su
actividad transdominante es determinada por cotransfección de
pTG2333, pHMG-Tat y LTR-CAT en una
relación de concentración de 10:1:0,5.
Los resultados se presentan en la tabla 1. Se
puede constatar que la variante TAT (Thr^{40} -> Ala) presenta
un fenotipo transdominante tal como el definido según la invención.
Inhibe la función de la proteína TAT nativa al 83% y conserva una
baja actividad transactivadora de 15,6%.
El vector M13TG2306 es sometido a una mutagénesis
dirigida a fin de reemplazar el codón que codifica para el residuo
lisina (Lis) en posición 41 de la proteína TAT del VIH por un codón
que codifica para un residuo ácido glutámico (Glu) e introducir
unas mutaciones silenciosas de manera que se cree un sitio de
restricción HindIII al nivel del codón que codifica para el residuo
42 que permite una identificación rápida de los vectores mutados.
El oligonucleótido utilizado se describe en la SEC ID nº 5. El gen
tat mutado es transferido al vector pSG5 dando lugar a
pTG2340 que permite producir la variante TAT (Lis^{41} ->
Glu).
El vector pTG2340 es cotransfectado
transitoriamente a las células HeLa con el vector
LTR-CAT a fin de determinar la actividad
transactivadora de la variante TAT (Lis^{41}-> Glu) según el
protocolo descrito anteriormente. Paralelamente, su actividad
transdominante es determinada por cotransfección de pTG2340,
pHMG-Tat y LTR-CAT en una relación
de concentración de 10:1:0,5.
Los resultados se presentan en la tabla 1. Se
puede constatar que la variante TAT (Lis^{41}-> Glu) presenta
un fenotipo transdominante tal como el definido según la invención.
La actividad transactivadora de la variante es baja (3% de la
actividad conferida por la proteína TAT nativa) y es capaz de
inhibir eficazmente la función transactivadora de la proteína TAT
nativa (97% de inhibición).
Se puede observar que la variante TAT
(Lis^{41}-> Glu) producida por pTG2340 y la variante de la
técnica anterior TAT (Lis^{41}-> Ala) que se comporta como la
proteína TAT nativa, son mutados sobre el mismo residuo. Según la
modificación realizada, el fenotipo de la variante obtenida puede
por tanto ser totalmente diferente. Así, el reemplazado de la
Lis^{41} por un Glu, tal como el divulgado por el solicitante,
confiere a la variante generada un fenotipo transdominante.
El vector M13TG2306 es sometido a una mutagénesis
dirigida a fin de reemplazar el codón que codifica para el residuo
isoleucina (Ile) en posición 45 de la proteína TAT del VIH por un
codón que codifica para un residuo serina (Ser) y crear un sitio de
restricción BamHI al nivel del codón que codifica para el residuo
45 permitiendo una identificación rápida de los vectores mutados. El
oligonucleótido utilizado se describe en la SEC ID nº:6. El gen
tat mutado es transferido al vector pSG5 dando lugar a
pTG2358 que permite producir la variante TAT (Ile^{45}->
Ser).
Ser).
El vector pTG2358 es cotransfectado
transitoriamente a las células HeLa con el vector
LTR-CAT a fin de determinar la actividad
transactivadora de la variante TAT (Ile^{45} -> Ser) según el
protocolo descrito anteriormente. Paralelamente, su actividad
transdominante es determinada por cotransfección de pTG2358,
pHMG-Tat y LTR-CAT en una relación
de concentración 10:1:0,5.
Los resultados se presentan en la tabla 1. Se
puede constatar que la variante TAT (Ile^{45}-> Ser) presenta
un fenotipo transdominante tal como el definido según la invención.
Inhibe parcialmente la función de la proteína TAT nativa al 62,5% y
conserva una actividad transactivadora moderada de 47%.
El vector M13TG2306 es sometido a una mutagénesis
dirigida a fin de remplazar el codón que codifica para el residuo
tirosina (Tir) en posición 47 de la proteína TAT del VIH por un
codón que codifica para un residuo arginina (Arg) y crear un sitio
de restricción XbaI al nivel del codón que codifica para el residuo
47 permitiendo una identificación rápida de los vectores mutados. El
oligonucleótido utilizado se describe en la SEC ID nº:7. El gen
tat mutado es transferido al vector pSG5 dando lugar a
pTG2348 que permite producir la variante TAT (Tir^{47} ->
Arg).
El vector pTG2348 es cotransfectado
transitoriamente a las células HeLa con el vector
LTR-CAT a fin de determinar la actividad
transactivadora de la variante TAT (Tir^{47}-> Arg) según el
protocolo descrito anteriormente. Paralelamente, su actividad
transdominante es determinada por cotransfección de pTG2348,
pHMG-Tat y LTR-CAT en una relación
de concentración de 10:1:0,5.
Los resultados se presentan en la tabla 1. Se
puede constatar que la variante TAT (Tir^{47}-> Arg) presenta
un fenotipo transdominante moderado tal como el definido según la
invención. Inhibe la función de la proteína TAT nativa al 78% y
conserva una actividad transactivadora de 56%.
Han sido establecidas unas progenies celulares
estables que producen la variante transdominante TAT (Phe^{38}-
> Asp) a fin de validar la eficacia de las variantes para una
eventual utilización in vivo, por ejemplo en un protocolo de
terapia génica. Para evaluar la resistencia de las células a una
infección por el VIH, es necesario que estas sean infectables por
el virus, es decir que expresen el receptor CD_{4} humano en su
superficie.
Se han establecido dos tipos de progenies
celulares:
- -
- Las células CEM-A3 (ATCC CCL119) derivadas de las células T humanas, poseen el receptor CD_{4} y son por tanto naturalmente infectables por el VIH.
- -
- Las células HeLa (ATCC CCL2) que son cotransfectadas con un vector de expresión ubicuitario del receptor CD_{4} humano pTG620 a fin de conferirles susceptibilidad a la infección por el VIH. El vector pTG620 proviene de la introducción en el sitio EcoRV del vector pHMG de un fragmento EcoRI tratado por el fragmento klenow de la ADN-polimerasa de E. coli que comprende el ADN-copia del receptor CD_{4} humano (Maddon et al., Cell, 1986, 47, 333-348).
El fragmento BamHI que comprende el gen que
codifica para la variante transdominante TAT (Phe^{38} -> Asp)
es insertado en el sitio BamHI del vector retroviral pLXSP (figura
5) generando pTG2350. El vector pLXSP deriva del pLXSN (Miller y
Rossman, Biotechniques, 7, 1989, 980-988) y proviene
del reemplazado del gen neomicina por un gen que confiere una
resistencia a la puromicina y del LTR3' del MSV por el del
MPSV.
El ADN plasmídico de pTG2350 es introducido en
las células CEM-A3 por eletroporación. Se toman de
nuevo 20 \mug de ADN purificado sobre gradiente de cloruro de
cesio en 20 \mul de tampón PBS (KH_{2} PO_{4} 1mM; KCI 2 mM;
NaCI 136mM, Na_{2}HPO_{4} 3mM). Se mezcla la preparación de ADN
con 2 x 10^{7} células resuspendidas en 180 \mul de PBS en una
cubeta de electroporación (Biorad). Se preincuban a temperatura
ambiente durante 10 minutos. Después de electroporación (Gene
pulser Biorad, voltaje 210 V, capacitancia 960 \muF), se mantienen
las células a temperatura ambiente durante 10 minutos y se incuban
a 37ºC en 6 ml de RPMI (GibcoBRL) en presencia de 5% de CO_{2}.
Se aíslan los clones CEM-A3 resistentes a la
puromicina por dilución límite (puromicina 0,5 \mug/ml).
El ADN plasmídico pTG2350 es cotransfectado en
las células HeLa con el pTG620 por la técnica de transfección al
fosfato de calcio anteriormente descrita. Se aíslan los clones de
las células HeLa resistentes a la puromicina por repicados
sucesivos (puromicina 2 \mug/ml). Se analiza la expresión del
receptor CD_{4} humano en la superficie de las células por
fluorocitometría (FACS: Fluorescence Activated Cell Sorter, scan
Becton Dickinson) con la ayuda del anticuerpo Leu3A marcado con la
ficoeritrina (Becton Dickinson) dirigido contra este receptor.
Se detecta la expresión de la proteína TAT en la
progenie celular CEM-A3 realizando unas
transfecciones transitorias de los vectores LTR-CAT
y pHMG-Tat según la técnica descrita
anteriormente.
Tres clones salidos de la progenie celular
CEM-A3 resistentes a la puromicina y que expresan
la variante TAT transdominante y para la cual se han observado
diferentes grados de inhibición de la proteína TAT nativa, son
infectados por el virus VIH. La propagación del virus puede ser
evaluada por medición de la actividad
reverso-transcriptasa en los sobrenadantes de
cultivo. Se ha podido así detectar un desplazamiento de 2 días de
la multiplicación viral en uno de los clones de la progenie celular
CEM-A3 que expresa la variante transdominante con
respecto al resultado obtenido en las células CEM-A3
que no expresan una variante transdominante. Además, la actividad
reverso-transcriptasa está reducida al 90% en dicho
clon.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Transgene S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11 rue de Molsheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Estrasburgo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: 67082
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TELÉFONO: (33) 88 27 91 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELEFAX: (33) 88 58 07
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevas variantes transdominantes TAT del virus de la inmunodeficiencia humana.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- LÓGICA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de mutagénesis (38Phe en Asp)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAAAGCTTTT GTTGTGTCAC AAACTT
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de mutagénesis (TAT 41Lis en Ala)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCTAAGGCT GCTGTTGTGA A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de mutagénesis (TAT 54Gln en Stop)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTTCGTCGT TATCTCCGCT T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de mutagénesis (TAT 40Thr en Ala)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAAAGCTTTT GCTGTGAAAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de mutagénesis (TAT 41Lis en Glu)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCTAAAGCT TCTGTTGTGA A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de mutagénesis (TAT 45Ile en Ser)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCATAGGAG GATCCTAAGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de mutagénesis (TAT 47 Tir en Arg)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCTGCCTCT AGAGATGC
\hfill18
Claims (11)
1. Variante transdominante de la proteína TAT del
virus VIH o de un fragmento funcional de dicha proteína capaz de
inducir una transactivación de la expresión de uno o varios
gen(es) puesto(s) bajo el control de un promotor que
comprende la secuencia TAR, caracterizada porque dicha
variante comprende una mutación seleccionada entre las mutaciones
que consisten en la presencia en posición 38 de un residuo que tiene
una cadena lateral ácida tal como un ácido glutámico o un ácido
aspártico.
2. Variante según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicha variante es derivada de la
proteína TAT de VIHI.
3. Variante según las reivindicaciones 1 a 2 que
comprende un ácido aspártico en posición 38.
4. Fragmento de ADN que codifica para una
variante de la proteína TAT según una de las reivindicaciones 1 a
3.
5. Casete de expresión que comprende un fragmento
de ADN según la reivindicación 4, puesto bajo el control de
elementos apropiados que permiten su expresión.
6. Célula eucariota o procariota que comprende un
casete de expresión según la reivindicación 5.
7. Procedimiento de preparación de una variante
según una de las reivindicaciones 1 a 3, según el cual:
- -
- se cultiva una célula eucariota o procariota según la reivindicación 6 en un medio de cultivo apropiado, y
- -
- se recolecta la variante producida a partir del medio de cultivo o de dicha célula.
8. Variante de la proteína TAT obtenida por la
aplicación de un procedimiento según la reivindicación 7.
9. Variante según una de las reivindicaciones 1 a
3, casete de expresión según la reivindicación 5, o célula según la
reivindicación 6, para su utilización a título de medicamento.
10. Composición farmacéutica destinada al
tratamiento o la prevención de una infección por VIH que comprende a
título de agente terapéutico o profiláctico una variante según una
de las reivindicaciones 1 a 3, un casete de expresión según la
reivindicación 5 o una célula según la reivindicación 6.
11. Utilización de una variante según una de las
reivindicaciones 1 a 3, de un casete de expresión según la
reivindicación 5 o de una célula según la reivindicación 6, para la
obtención de un medicamento destinado a inhibir la replicación del
virus VIH.
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