ES2229232T3 - Composicion de variantes transdominantes de proteinas viricas para un efecto antivirico. - Google Patents

Composicion de variantes transdominantes de proteinas viricas para un efecto antivirico.

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Abstract

Composición que comprende al menos: (a) una primera variante transdominante de la proteína TAT del virus del VIH; y (b) una segunda variante transdominante de la proteína REV del virus del VIH, caracterizada porque la variante transdominante de la proteína REV tiene la secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº: 2, que empieza en el aminoácido +1 y termina en el aminoácido +116, en la que el resto glutamina en posición +74 se sustituye por un resto glicina, y el resto leucina en posición +75 se sustituye por un resto serina.

Description

Composición de variantes transdominantes de proteínas víricas para un efecto antivírico.
La presente invención se refiere a una composición que resulta de la asociación de variantes transdominantes de dos proteínas víricas que provienen del mismo virus. La asociación de estas dos variantes permite conferir una resistencia a la infección o a la propagación del virus en cuestión. La presente invención encuentra una aplicación interesante en el tratamiento o la prevención de infecciones por VIH (virus de inmunodeficiencia humana) responsable del SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida).
En el ámbito de la investigación y de la elaboración de medicamentos inhibidores de las infecciones víricas, la terapia génica somática por inmunización intracelular constituye uno de los enfoques prometedores para el futuro. Este concepto, definido por Baltimore (1988, Nature, 335, 395-396), consiste en modificar genéticamente células a fin de que sinteticen un ácido nucleico o una proteína heteróloga que les confiere una resistencia contra la infección vírica. Una de las posibles vías para adquirir esta resistencia es hacer sintetizar a la célula hospedante genes inhibidores de una etapa del ciclo vírico. Aunque todas las etapas del ciclo vírico pueden ser seleccionadas como dianas para realizar tal terapia, los genes que intervienen en una etapa precoz constituyen una diana potencialmente interesante. Tal es el caso de los genes tat y rev del virus del VIH que juegan un papel esencial en la iniciación de la replicación vírica.
El gen tat codifica una proteína TAT transactivadora de la expresión del conjunto de los genes del VIH (Arya et al., 1985, Science, 229, 69-73). Parece que la TAT interviene tanto en un nivel transcripcional como postranscripcional. Interacciona específicamente con una secuencia corta de nucleótidos, localizada en el extremo 5' del genoma y de los transcritos víricos, y denominada secuencia TAR (del inglés Región Sensible a la Transactivación) (Rosen et al., 1985, Cell, 41, 813-823).
La proteína REV, producto de la expresión del gen rev, favorece el transporte de ARN mensajeros (ARNm) de gran tamaño hacia el citoplasma, para ser traducidos. Por su parte, la REV reconoce específicamente una secuencia RRE (del inglés Elemento Sensible a REV) sobre los ARNm. Ésta se localiza próxima a otra secuencia llamada CRS (del inglés Secuencia de Represión que Actúa en Cis), implicada en la retención nuclear de los ARNm que la contienen. Se supone que la fijación de la proteína REV al nivel de su secuencia diana RRE tiene por efecto contrarrestar el efecto inhibidor de CRS en el paso de los grandes ARNm víricos hacia el citoplasma.
Aunque sus productos de expresión sean muy diferentes desde un punto de vista de masa molecular, de secuencia y de mecanismo de acción, los genes reguladores que ejercen una función similar a la TAT y/o a la REV han sido identificados en el genoma de otros virus infecciosos, tales como los retrovirus HTLV I y II (virus de leucemia de células T humana) responsables de formas graves de leucemias, y los virus del herpes (virus de la varicela, de la zona y de Epstein Barr).
Desde hace algunos años, se han descrito en la bibliografía mutantes negativos y dominantes (transdominantes) de estas diversas proteínas víricas. Particularmente, varios equipos han generado variantes transdominantes de las proteínas TAT y REV capaces de fijarse en su secuencia diana pero incapaces de ejercer la función de la proteína nativa. Si se han demostrado sus efectos inhibidores frente a la acción de la proteína nativa, queda sin embargo por determinar su eficacia en las células infectadas por el VIH.
Ahora se ha encontrado que la expresión, en una célula infectada por el VIH, de al menos dos genes que codifican variantes transdominantes, respectivamente proteínas TAT y REV del virus del VIH, permite bloquear la propagación del virus. Se ha demostrado que la inhibición de la infección vírica, que resulta de la expresión conjunta de los dos genes, es claramente mayor a la observada durante la expresión de uno cualquiera de estos genes. Este efecto de sinergia constituye una ventaja inesperada.
El objetivo de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica particularmente eficaz y, por lo tanto, más segura en vista de su uso en el ser humano, que permita inhibir la replicación de un virus en niveles diferentes del ciclo vírico.
Por ello, la presente invención tiene por objeto una composición que comprende al menos:
(a)
una primera variante transdominante de la proteína TAT del virus del VIH; y
(b)
una segunda variante transdominante de la proteína REV del virus del VIH, caracterizada porque la variante transdominante de la proteína REV tiene la secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº: 2, que empieza en el aminoácido +1 y termina en el aminoácido +116, en la que se sustituye el resto glutamina en posición +74 por un resto glicina, y se sustituye el resto leucina en posición +75 por un resto serina; denominada en lo sucesivo REV (Gln^{74}, Leu^{75} -> Gly, Ser).
En el ámbito de la invención, una primera y una segunda variante transdominante derivan del VIH. Bajo la denominación "VIH" se agrupan las diferentes cepas y aislados víricos del virus agente etiológico del SIDA.
Por la expresión "mutante transdominante" se entiende un mutante negativo y dominante, es decir, un mutante no funcional (incapaz de ejercer la función de la proteína nativa de la que deriva) pero capaz de inhibir de manera competitiva y dominante la función de esta última. En la práctica, una variante transdominante se puede obtener por eliminación, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos de la proteína nativa o de un fragmento funcional de ésta. El experto en la técnica conoce las técnicas que permiten efectuar estas modificaciones así como las regiones que deben ser modificadas según las proteínas víricas consideradas.
Sin embargo, y según un modo ventajoso, las variantes transdominantes primera y segunda, utilizadas en el ámbito de la presente invención, derivan de proteínas víricas que intervienen en un estado precoz de la infección y, especialmente, de proteínas capaces de interaccionar de manera específica con una secuencia de nucleótidos determinada (denominada secuencia diana) presente en el genoma y/o los transcritos del virus de los que resultan.
Se utiliza una primera variante transdominante derivada de la proteína TAT del VIH (véase a continuación). Como segunda variante transdominante, se usará una variante derivada de una proteína vírica que interviene en otra etapa, preferentemente precoz, de la replicación vírica, por ejemplo a nivel del transporte de los ARNm víricos hacia el citoplasma de la célula hospedante.
La elección de una variante transdominante de la proteína TAT es muy amplia. Se puede elegir de las descritas en la técnica anterior y especialmente en Green et al. (1989, Cell, 58, 215-233) y Pearson et al. (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5079-5083). Pero se pueden elegir otras variantes transdominantes, especialmente una variante que tiene la secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº: 1, que empieza en el aminoácido +1 y termina en el aminoácido +86, en la que:
(1)
el resto fenilalanina en posición +38 se sustituye por un resto ácido aspártico;
(2)
el resto treonina en posición +40 se sustituye por un resto alanina;
(3)
el resto lisina en posición +41 se sustituye por un resto ácido glutámico;
(4)
el resto isoleucina en posición +45 se sustituye por un resto serina; y/o
(5)
el resto tirosina en posición +47 se sustituye por un resto arginina.
Se entiende que una variante transdominante TAT puede combinar varias mutaciones.
A título de ejemplos de variantes transdominantes de la proteína REV, se pueden citar las mencionadas en Malim et al. (1989, Cell, 58, 205-214) y Venkatesh y Chinnadurai (1990, Virology, 178, 327-330). Por otra parte, puede resultar ventajoso el uso de variantes modificadas a nivel de tres aminoácidos y más, en particular a nivel de los restos Leu en posiciones 75, 78 y 81. Para ilustrar este modo de realización, se puede mencionar una variante REV mutada en 5 posiciones, en la que los codones que codifican los restos Gln^{74}, Leu^{75}, Leu^{78}, Glu^{79} y Leu^{81} han sido sustituidos por codones que codifican los restos Gly, Ser, Glu, Phe y Asp respectivamente.
La presente invención se refiere igualmente a una composición según la invención como producto de combinación, para una utilización simultánea, separada o espaciada en el tiempo, para el tratamiento o la prevención de las infecciones debidas al virus del cual resultan las proteínas víricas pertinentes. El uso de tal composición está más particularmente destinado a la terapia anti-SIDA.
Conforme a los objetivos perseguidos por la presente invención, se pueden producir una primera y una segunda variante transdominante por vía recombinante en una composición según la invención, a partir de vectores de expresión apropiados. Se recurre ventajosamente a vectores víricos derivados de los retrovirus, adenovirus o virus asociado al adenovirus, en los que se inserta al menos una secuencia de ADN que codifica una variante transdominante en uso en la presente invención. El genoma de estos vectores víricos es, preferentemente, defectuoso para la replicación. Se indica que, en el ámbito de la presente invención, se prefieren particularmente los vectores retrovíricos, y especialmente los derivados del MoMuLV (virus de la leucemia murina de Moloney). Tales vectores, así como sus técnicas de preparación, son conocidos por el experto en la técnica.
Las secuencias de ADN que codifican una variante transdominante de una proteína vírica se pueden obtener según las técnicas clásicas de biología molecular. Una de las estrategias posibles consiste, primeramente, en aislar del genoma vírico la secuencia que codifica dicha proteína vírica, mediante clonación o PCR (reacción en cadena de polimerasa), y después modificarla por mutagénesis dirigida para generar una variante transdominante deseada. Como alternativa, la secuencia de ADN de interés se puede producir mediante síntesis química.
Evidentemente, las secuencias de ADN, que codifican respectivamente una primera y una segunda variante transdominante de uso en la presente invención, se pueden insertar en un mismo vector recombinante o en dos vectores diferentes. Además, estas pueden tener un gen de selección que facilite el aislamiento de los clones transfectados por dichos vectores.
La presente invención se refiere asimismo a un vector recombinante que comprende:
(a)
una primera secuencia de ADN que codifica una variante transdominante de la proteína TAT del virus del VIH, puesta bajo control de los elementos necesarios para su expresión constitutiva; y
(b)
una segunda secuencia de ADN que codifica una variante transdominante de la proteína REV del virus del VIH, que tiene la secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº: 2, que empieza en el aminoácido +1 y termina en el aminoácido +116, en la que el resto glutamina en posición +74 se sustituye por un resto glicina, y el resto leucina en posición +75 se sustituye por un resto serina, puesta bajo control de los elementos necesarios para su expresión constitutiva.
Se entiende que las secuencias primera y segunda de ADN se ponen bajo control de los elementos necesarios para su expresión. Estos elementos comprenden especialmente los elementos de regulación de la transcripción de una secuencia de ADN en ARNm, así como las señales de iniciación y de terminación de la traducción del ARNm en proteína. Entre estos elementos, la región promotora reviste una importancia particular.
De manera general, se usa una región promotora funcional en las células eucariotas que se quieren tratar, y preferentemente en las células humanas. Una región promotora puede resultar de genes eucariotas o víricos, puede ser constitutiva o regulable, especialmente en respuesta a ciertas señales celulares específicas de tejidos, y, en particular, específicas de linfocitos. A título de ejemplo, se puede considerar el uso de las regiones promotoras del virus SV40 (virus del simio 40), del gen PGK (fosfoglicerato quinasa), del gen HMG (hidroximetilglutaril-coenzima A), del gen TK (timidina quinasa) del HSV-1, las LTR (terminales repetidas largas) del RSV (virus del sarcoma de Rous), del MoMuLV y del VIH, y los promotores de los genes E1A, E3 y MLP (promotor tardío principal) del adenovirus. Se indica que estos ejemplos no son limitativos.
La presente invención se extiende a las células eucariotas en el genoma de las cuales se insertan una primera y una segunda secuencia utilizada en el ámbito de la invención. El o los vectores que contienen dichas secuencias pueden ser introducidos in vitro en una célula tomada del paciente, o bien directamente in vivo. Preferentemente, dicha célula es una célula humana, y de manera muy preferida una célula cepa de la línea hematopoyética o un linfocito.
La invención se refiere asimismo al uso de una composición, de un vector o de una célula según la invención, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o la prevención de infecciones víricas por terapia génica, y especialmente infecciones debidas al VIH.
La invención se refiere igualmente a una composición farmacéutica caracterizada porque comprende como agente terapéutico o profiláctico una composición, un vector o una célula según la invención, en asociación con un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
Tal composición farmacéutica según la invención se puede preparar según las técnicas comúnmente usadas, y se puede administrar según todas las vías de administración conocidas. Por ejemplo, el agente terapéutico o profiláctico se asocia, en una cantidad terapéuticamente eficaz, a un soporte, un diluyente o un adyuvante aceptable. La cantidad a administrar se elige en función de diferentes criterios, en particular de la vía de administración elegida, de la patología implicada, de las secuencias primera y segunda de ADN a expresar, o también del paciente y de la duración del tratamiento deseado.
Por otra parte, la invención se refiere a un kit que contiene:
(a)
una primera variante transdominante de la proteína TAT del virus del VIH; y
(b)
una segunda variante transdominante de la proteína REV del virus del VIH, caracterizada porque la variante transdominante de la proteína REV tiene la secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº: 2, que empieza en el aminoácido +1 y que termina en el aminoácido +116, en la que el resto glutamina en posición +74 se sustituye por un resto glicina, y el resto leucina en posición +75 se sustituye por un resto serina;
con instrucciones para su administración concomitante o secuencial.
Finalmente, la invención se refiere a un método de tratamiento de las infecciones víricas, y particularmente debidas al VIH, según la cual se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición, de un vector o de una célula según la invención a un paciente que necesita de tal tratamiento.
A título indicativo, las etapas esenciales, para el tratamiento anti-vírico mediante terapia génica, son las siguientes:
-
se efectúa una toma de muestra de médula ósea o muestra sanguínea de un paciente que necesita de tal tratamiento;
-
las células tomadas (células cepas o linfocitos) se cultivan según las técnicas de la técnica anterior;
-
se transfecta un vector según la invención, en el que se insertan las secuencias que codifican una primera y una segunda variante transdominante. Sin embargo, es posible igualmente co-transfectar o, como alternativa, transfectar de manera separada y espaciada en el tiempo, cada uno de los vectores que permiten la expresión de una u otra de las variantes transdominantes. Se efectúa eventualmente una etapa suplementaria de cultivo en medio selectivo; y
-
las células así modificadas se reinyectan en el paciente.
Naturalmente, las modalidades de este protocolo terapéutico pueden estar sujetas a numerosas variantes determinadas por los médicos clínicos.
La invención se ilustra a continuación con referencia a las figuras siguientes.
La Figura 1 esquematiza el vector pTG2350 que permite la expresión de una variante transdominante TAT (Phe^{38} -> Asp) del VIH (TAT38), bajo control de la LTR 5' retrovírica.
La Figura 2 ilustra el vector pTG2428 que permite la expresión de la variante transdominante REV (Gln^{74}, Leu^{75} -> Gly, Ser) (REV*) del VIH, bajo control de la LTR 5' retrovírica.
La Figura 3 muestra los efectos de la expresión conjunta de las variantes transdominantes TAT y REV (\blacklozenge) en la evolución de la infección en las células infectadas por el VIH, comparada con la expresión de una variante transdominante TAT (\blacksquare) o la de una variante transdominante REV (\square).
La Figura 4 esquematiza el vector retrovírico pTG4367 que comprende las secuencias que codifican las variantes transdominantes TAT (Phe^{38} \rightarrow Asp) y REV (Gln^{74}, Leu^{75}, Leu^{78}, Glu^{79} y Leu^{81} \rightarrow Gly, Ser, Glu, Phe y Asp), indicado a continuación REV**, bajo control del promotor PGK murino (PGKpro) y la LTR 5' retrovírica.
La Figura 5 ilustra el vector pTG8301 en el que las secuencias que codifican el mutante REV** y el producto de fusión TAT (Gln^{54} -> STOP) (TAT54) - neo se ponen bajo control de la LTR 5' retrovírica (LTR) y del promotor PGK murino (PGK pro), respectivamente.
La Figura 6 ilustra el vector pTG8313 en el que las secuencias que codifican el mutante REV** y el producto de fusión TAT (Phe^{38} -> Asp) - neo se ponen bajo control de la LTR 5' retrovírica (LTR) y del promotor PGK murino (PGK pro), respectivamente.
La Figura 7 ilustra el vector pTG8315 en el que las secuencias que codifican, por una parte, el mutante REV** y, por otra parte, los productos TAT38 y neo, se ponen bajo control de la LTR 5' retrovírica (LTR) y del promotor PGK murino (PGK pro), respectivamente.
La Figura 8 ilustra el vector pTG8323 en el que las secuencias que codifican, por una parte, el mutante REV** y el producto neo, y, por otra parte, el mutante TAT (Gln^{54} -> STOP), se ponen bajo control de la mini LTR del VIH y de la LTR 5' retrovírica, respectivamente.
Ejemplos
Las construcciones descritas a continuación se realizan según las técnicas generales de ingeniería genética y de clonación molecular detalladas en Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). El conjunto de las etapas de clonación que utilizan plásmidos bacterianos se efectúa mediante pases en el cepa Escherichia coli (E. coli) 1106, BJ5183 o XL1-Blue, mientras que las que utilizan vectores derivados del fago M13 se realizan en E. coli NM522.
Por lo que respecta a los mutágenos dirigidos por oligodesoxinucleótidos sintéticos, se aplica el protocolo descrito por Zoller y Smith (1982, Nucleic Acids Res., 10, 6487), o se utiliza un kit de origen comercial según las recomendaciones del fabricante. Tratándose de la reparación de los sitios de restricción, el llenado de los extremos sobresalientes se puede realizar con la ayuda del fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. coli y la destrucción de los extremos 3' sobresalientes en presencia de la ADN polimerasa del fago T4, o por tratamiento mediante la nucleasa S1 seguido de una reparación mediante Klenow. Las técnicas de PCR son conocidas por el experto en la técnica y se describen ampliamente en "PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications" (Ed: Innis, Gelfand, Sninsky y White, Academic Press Inc.).
Por otra parte, la secuencia de una variante transdominante TAT o REV se alinea sobre la de la proteína TAT o REV del virus VIH-1, cepa clínica Lai, tal como se expone por Wain-Hobson et al. (1985, Cell, 40, 9-17). En la práctica, la numeración de los aminoácidos en la secuencia de una variante transdominante se copia de la establecida para la proteína nativa, secuencia tal como se muestra en los identificadores de secuencia nº: 1 para la proteína TAT y nº: 2 para la proteína REV.
Por otra parte, las estirpes celulares se cultivan según las recomendaciones del proveedor. De manera general, las células se transfectan según la técnica del fosfato de calcio (Maniatis et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory), excepto las células CEM-A3 para las cuales se utiliza la electroporación. Sin embargo, también se pueden utilizar otros protocolos que permitan introducir un ácido nucleico en una célula. Antes de toda transfección, el ADN se purifica en un gradiente de cloruro de cesio.
Ejemplo 1 Establecimiento de una estirpe celular que co-expresa las variantes transdominantes TAT y REV A. Construcción del vector retrovírico pTG2350 para la expresión de la variante transdominante TAT (Phe^{38} -> Asp) y caracterización de su fenotipo transdominante
Se modifica un fragmento de ADN que tiene el ADN-copia (ADNc) que corresponde a los 2 exones del gen tat del genoma del VIH, cepa Lai (Wain-Hobson et al., 1985, Cell, 40, 9-17; Sodroski et al., 1985, Science, 229, 74-77), a fin de crear un sitio BamHI en 5' del ATG iniciador. Además, un sitio BamHI existe naturalmente en 3' del codón stop. El fragmento BamHI de 300pb, que tiene el ADNc del tat no mutado, se inserta en el vector M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene, 26, 91-99). Se obtiene el vector M13TG2306.
Se genera una variante transdominante TAT sustituyendo el resto fenilalanina (Phe) en posición 38 de la proteína TAT nativa por un ácido aspártico (Asp). El M13TG2306 se somete a una mutagénesis dirigida utilizando un kit comercial (Amersham, RPN 1523) y utilizando el oligonucleótido descrito en el identificador de secuencia SEC ID nº: 3, dando M13TG2316.
El fragmento BamHI aislado del vector anterior se transfiere entonces al vector eucariota pSG5 (Green et al., 1988, Nucleic Acids Res., 16, 369). Se obtiene pTG2332, en el que la expresión de la variante TAT (Phe^{38} -> Asp) está bajo control del promotor SV40.
Se evalúa la capacidad de la variante TAT (Phe^{38} -> Asp) para transactivar la expresión del gen CAT (cloranfenicolacetil-transferasa) puesto bajo control de la LTR del VIH, que incluye la secuencia TAR (LTR-CAT; Emerman et al., 1987, EMBO J., 6, 34-55). La actividad transactivadora se determina mediante transfección transitoria en células HeLa (ATCC CCL2) (4x10^{5} células por pocillo) de 1 \mug del vector de expresión pTG2332 con 0,5 \mug del vector informador LTR-CAT. Se transfectan, en las mismas condiciones, 1 \mug de pHMG-Tat y 0,5 \mug de LTR-CAT, que constituye el testigo positivo de la transactivación (100%). El pHMG-Tat es el vector de expresión de la proteína TAT nativa, y resulta de la clonación del fragmento BamHI de M13TG2306 en el sitio BamHI del vector pHMG (Mehtali et al., 1990, Gene, 91, 179-184).
48 horas después de las transfecciones, se mide el nivel de expresión del gen CAT sobre una alícuota de extracto celular, que corresponde a 10 hasta 20 \mug de proteínas, según la técnica descrita en Gorman et al. (1982, Mol. Cell. Biol., 2, 1044-1051). La concentración de proteínas se determina con la ayuda de un kit comercial siguiendo el protocolo indicado por el proveedor. El porcentaje de actividad transactivadora de la variante se calcula con relación al porcentaje medido con el testigo positivo (pHMG-Tat + LTR-CAT), representando éste el 100% de la actividad transactivadora.
Después, se determina la capacidad de la variante TAT (Phe^{38} -> Asp) para inhibir la función transactivadora de la proteína TAT nativa, mediante transfección transitoria en células HeLa del vector de expresión pTG2332 (10 \mug) con el vector informador LTR-CAT (0,5 \mug) y el vector pHMG-Tat (1 \mug). Como antes, se mide la expresión del gen informador CAT sobre una alícuota de extracto, que corresponde a 10 hasta 20 \mug de proteínas. El porcentaje de inhibición de la proteína TAT nativa por la variante TAT (Phe^{38} -> Asp) se calcula con relación al testigo resultante de la cotransfección de pHMG-Tat y de LTR-CAT que representa el 0% de la actividad inhibidora.
La variante TAT (Phe^{38} -> Asp) es un mutante transdominante eficaz, porque su actividad transactivadora está reducida (expresión del gen CAT inferior a 10% con relación a la medida con la proteína TAT nativa) y porque inhibe fuertemente la actividad de la proteína TAT nativa (al menos 90% de inhibición).
El fragmento BamHI de 300pb, aislado de M13TG2316, se inserta en el sitio BamHI del vector retrovírico pLXSP, generando pTG2350 (Figura 1). El vector pLXSP deriva del pLXSN (Miller y Rossman, 1989, Biotechniques, 7, 980-988) después de la sustitución del gen de neomicina (neo) por un gen que confiere una resistancia a la puromicina, y de la LTR 3' de MSV (virus del mielosarcoma) por la LTR 3' del MPSV (virus del mielosarcoma proliferativo).
B. Construcción de los vectores retrovíricos pTG2428 y pTG2430 para la expresión de la variante transdominante REV (Gln^{74}, Leu^{75} -> Gly, Ser) y caracterización de su fenotipo transdominante
Se inserta, en el vector M13TG130, un fragmento SalI de 830 pb, que comprende el ADN-copia que corresponde a los dos exones que codifican el gen rev del VIH1, cepa Lai, generando el vector M13TG2309. Éste se modifica mediante mutagénesis dirigida (kit Amersham) a fin de introducir dos sitios BglII, que incorporan la secuencia que codifica REV, el primero en dirección 5' del ATG iniciador y el segundo en dirección 3' del codón stop. La presencia de estos sitios BglII permite facilitar las etapas de clonación ulteriores. Pero se habría podido elegir cualquier otro sitio de restricción adecuado.
El vector así obtenido se somete a una mutagénesis dirigida utilizando el oligonucleótido OTG4672 dado a conocer en el identificador de secuencias nº: 4, con el objetivo de sustituir los restos Gln y Leu en posición 74 y 75 de la proteína REV nativa por los restos Gly y Ser. El vector resultante se digiere mediante BglII, y el fragmento de 390 pb se inserta en el vector de expresión eucariota pSG5 para dar el plásmido pTG REV.TD, en el que se evalúa el fenotipo transdominante del mutante REV (Gln^{74}, Leu^{75} -> Gly, Ser).
Su actividad sobre el transporte de los ARNm se determina por transfección transitoria en la estirpe celular HeLa de pTG REV.TD (1 \mug) y del vector informador pTG1335 (0,5 \mug). Este último comprende el gen CAT puesto bajo control del promotor SV40 y los elementos RRE/CRS del genoma del VIH1 insertados en dirección del gen CAT. Así, en ausencia de una proteína REV funcional, el elemento CRS mantendrá los ARNm en el núcleo, y no se detecta producto de expresión del gen CAT. Por el contrario, en presencia de una proteína REV funcional, ésta se fijará en la secuencia diana RRE e inducirá el transporte de los ARNm hacia el citoplasma y su traducción.
La expresión del gen CAT se determina sobre una alícuota de extracto celular en las mismas condiciones que antes. El porcentaje de actividad del mutante REV (Gln^{74}, Leu^{75} -> Gly, Ser) se calcula con relación al porcentaje medido con un testigo positivo resultante de la cotransfección del vector pHMG-Rev, que permite la expresión de la proteína REV nativa, y del vector informador pTG1335, que representa el 100% de la actividad REV.
Paralelamente, se evalúa su capacidad para inhibir la función de la proteína REV nativa, mediante transfección transitoria del vector de expresión pTG REV.TD (10 \mug) y del vector informador pTG1335 (0,5 \mug) en presencia de 1 \mug del vector pHMG-Rev. El porcentaje de expresión del gen CAT se mide con relación al testigo resultante de la cotransfección de pHMG-Rev y de pTG1335, y que representa 0% de inhibición.
Se determina que la variante REV (Gln^{74}, Leu^{75} -> Gly, Ser) es una variante transdominante eficaz que no tiene prácticamente actividad en el transporte de los ARNm hacia el citoplasma, pero que es capaz inhibir de manera dominante la función REV nativa.
El fragmento BglII de 390 pb, que tiene la secuencia que codifica el mutante transdominante REV, se subclona en el sitio BamHI de pTG5192. Este último deriva del pLXSN, en el que la LTR 3' que proviene del MSV se sustituye por la LTR 3' del MPSV. Se genera el vector retrovírico pTG2428 (Figura 2) que tiene igualmente el marcador de selección neomicina que confiere la resistencia al G418.
Por otra parte, este mismo fragmento BglII se inserta igualmente en el vector retrovírico pLXSP para dar PTG2430 portador del gen de la resistencia a la puromicina.
C. Establecimiento de una estirpe celular CEM-A3 que expresa los mutantes transdominantes TAT (Phe^{38} -> Asp) y REV (Gln^{74}, Leu^{75} -> Gly, Ser)
Se establece una estirpe celular estable que coproduce las dos variantes transdominantes a partir de células naturalmente infectables por el VIH, por ejemplo la estirpe linfocitaria humana CEM-A3 derivada de CCRF-CEM (ATCC CCL119) y que expresa fuertemente el marcador de superficie CD4, receptor del VIH.
Se electroporan 20 \mug de ADN plásmico pTG2350 en 2x10^{7} células CEM-A3 (Gene Pulser de Biorad, voltaje 210V, capacidad 960\muF). Después, las células se recolocan en cultivo en un medio RPMI (Gibco-BRL) a 37ºC en presencia de 5% de CO_{2}. Dos días más tarde, las células se colocan en un medio selectivo (puromicina 0,5 \mug/ml) y se aíslan los clones resistentes (células CEM-A3 2350).
La expresión de la variante transdominante se puede detectar en los diferentes clones por transfección transitoria mediante los vectores LTR-CAT y pHMG-Tat, y midiendo la extinción de la expresión del gen CAT con relación a un testigo de células de origen CEM-A3 transfectadas con estos dos vectores.
Se selecciona un clon resistente a la puromicina, en el que se introducen 20 \mug de pTG2428 según el protocolo de electroporación indicado aquí arriba. Las células se colocan en medio doblemente selectivo (puromicina 0,5 \mug/ml y G418 1 mg/ml). El conjunto de células resistentes a los dos antibióticos se denomina en lo sucesivo CEM-A3 2350+2428.
A título de comparación, se establece igualmente una línea CEM-A3 productora de la variante transdominante REV mediante transfección del vector pTG2430. Las células resistentes a la puromicina se denominan CEM-A3 2430.
Ejemplo 2 Evaluación de la resistencia de las células CEM-A3 2350+2428 a una infección por el VIH
Se centrifugan, a baja velocidad, aproximadamente 10^{6} células CEM-A3 2350+2428. Después del lavado, el residuo celular se recoge en 200 \mul de medio RPMI en ausencia de suero. Las células se infectan mediante una preparación del VIH a una TCID_{50} comprendida entre 1 y 1000, preferentemente 50 a 100. La TCID_{50} se determina según el método descrito en Reed et al. (1938, Am. J. Hyg., 27, 493-497), en estirpes celulares infectables por el VIH, como por ejemplo las células CEM-A3, y corresponde a la dosis a la que el 50% de las células se infectan y el 50% no se infectan. Se verifica para cada lote de VIH usado. La infección continúa 1h a 37ºC.
Después, las células se lavan 2 veces en un RPMI y se colocan en cultivo en 5 ml de este mismo medio, complementado con 10% de SVF (suero fetal bovino). Esta etapa constituye el T=0 del experimento. El medio se renueva 2 ó 3 veces por semana. La propagación del virus se evalúa midiendo la actividad de transcriptasa inversa a intervalos regulares en el sobrenadante del cultivo, según el método descrito en Spire et al. (1985, Lancet i, 188-189).
Los resultados ilustrados en la Figura 3 muestran que la actividad de transcriptasa inversa de los sobrenadantes CEM-A3 2350+2428 se sitúa en un nivel muy bajo durante al menos 35 días de cultivo. Se indica que, en las células normales infectadas por el VIH, se detecta normalmente una actividad de transcriptasa inversa después de 5 a 6 días, debido a la reemisión de nuevas partículas víricas en el medio, que va en aumento rápidamente a lo largo del tiempo hasta la muerte celular.
A título comparativo, el experimento se efectúa sobre alícuotas de cultivos celulares CEM-A3 2350 y CEM-A3 2430 en condiciones estrictamente idénticas. En este caso, se observa un retraso en la propagación del virus, traduciéndose en una actividad reducida de transcriptasa inversa durante los 20 primeros días de cultivo, pero seguida de un aumento cuando se continúa el cultivo.
Ejemplo 3 Construcción de vectores retrovíricos que coexpresan variantes transdominantes TAT y REV, y establecimiento de estirpes anfótropas correspondientes A. Construcción del vector pTG4367
El vector M13TG2309 se somete a una mutagénesis dirigida con la ayuda del oligonucleótido OTG5254 dado a conocer en el identificador de secuencia nº: 5, que permite modificar la secuencia del ADN que codifica la proteína REV nativa en 5 sitios para crear una variante transdominante REV (sustitución de los codones que codifican los restos Gln^{74} en Gly, Leu^{75} en Ser, Leu^{78} en Glu, Glu^{79} en Phe y Leu^{81} en Asp). Se obtiene el vector M13TG4303.
El vector retrovírico pLXSP se digiere por el EcoRI-HpaI. Se aísla un fragmento EcoRI-PstI, que tiene el promotor PGK murino descrito en Adra et al. (1987, Gene, 60, 65-74), liberándose el sitio PstI mediante tratamiento con la T4 polimerasa. El vector así obtenido se elimina del casete de expresión del gen de resistencia a la puromicina. Para esto, después de la digestión mediante ClaI-BamHI, y del tratamiento mediante el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, se vuelve a ligar sobre sí mismo a fin de generar pTG2673.
Se introduce el fragmento BamHI, aislado de M13TG2316, en el vector pTG2673, previamente digerido por BamHI. Después, el vector obtenido se digiere por EcoRI y se trata mediante el fragmento Klenow de la ADN polimerasa. Paralelamente, el M13TG4303 se digiere mediante BglII, se trata mediante el Klenow y después se digiere mediante PvuII. Se aísla el fragmento portador de la secuencia que codifica la variante transdominante REV 5 veces mutada, que se inserta en pTG2673 así tratado. Se obtiene pTG4367 (figura 4), en el que la secuencia de ADN que codifica TAT (Phe^{38} -> Asp) se pone bajo control del promotor PGK, y la que codifica REV transdominante se pone bajo control de la LTR 5' del vector retrovírico.
Se establece una estirpe anfótropa a partir de una estirpe celular, denominada de encapsidamiento, en la que se inserta un gen env de un retrovirus anfótropo, por ejemplo la estirpe PA317 (Miller et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 2895-2902), o Gp. Env. Am. 12 (Markowitz et al., 1988, Virology, 167, 400-406). Se transfecta el vector pTG4367 y un vector de selección cualquiera, tal como, por ejemplo, un vector que tiene el gen de resistencia a la puromicina, bajo control del promotor SV40. Al día siguiente de la transfección, las células se colocan en medio selectivo (puromicina 6 \mug/ml). Se aíslan las células resistentes, productoras de partículas víricas anfótropas capaces de infectar a las células humanas.
Se puede constituir un lote vírico que se podría utilizar en terapia génica para la infección de células cepas hematopoyéticas o linfocitos de un paciente.
B. Construcción del vector pTG8301 (expresión de TAT (Gln^{54} -> STOP) fusionada al producto del gen neo y de REV mutado al nivel de los restos 74, 75, 78, 79 y 81)
La construcción de la variante transdominante TAT, en la que el resto glutamina (Gln) en posición 54 de la proteína nativa se sustituye por un codón stop, se describe en la solicitud europea EP 0614980. En resumen, el vector M13TG2306 (Ejemplo 1) se somete a una mutagénesis dirigida (Kit Amersham) con la ayuda del oligonucleótido OTG4376 (véase SEC ID nº: 3 del documento EP 0614980). Se obtiene M13TG2330. A fin de realizar la fusión con el gen de selección, éste se somete de nuevo a una mutagénesis dirigida con el objetivo de destruir el codón STOP del gen tat y de insertar en él un brazo de tres restos de alanina que corresponden a un sitio NotI. Se utiliza el oligonucleótido mutágeno OTG4413 (SEC ID nº: 6), y se genera M13TG2330*.
Paralelamente, el gen de selección neo se amplifica mediante PCR a partir del vector pAG60 (Colbère-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol., 150, 1-14). Para ello, se utilizan cebadores convencionales que tienen en sus extremos 5' sitios NotI. El fragmento PCR así obtenido se clona en M13TG2330* linealizado mediante NotI para dar M13TG6389. Después de la digestión de este último mediante BamHI, se purifica el fragmento de 1,2 kb que lleva el gen de fusión que codifica el producto híbrido TAT seguido de neo. Éste se introduce en el sitio BamHI del vector retrovírico pTG2673 para dar pTG6392.
El vector M13TG4303 se somete a una mutagénesis dirigida a fin de crear un sitio BglII en dirección 3' del codón stop del transdominante REV, con el objetivo de facilitar las etapas de clonación ulteriores. Para ello se usa el oligonucleótido OTG 4370 (SEC ID nº: 7); después, el fragmento BglII (0,38 kb) así generado se inserta finalmente en el vector pTG6392. Se obtiene pTG8301 (Figura 5) en el que el gen que codifica el mutante REV transdominante se pone bajo control de la LTR 5' del vector retrovírico, mientras que la expresión de la variante TAT transdominante fusionada al producto del gen neo depende del promotor PGK murino.
C. Construcción del vector pTG8313 (expresión de TAT (Phe^{38} -> Asp) fusionada al producto del gen neo y de REV mutado a nivel de los restos 74, 75, 78, 79 y 81)
El vector M13TG6390 resulta de la inserción del fragmento NotI de M13TG6389 que contiene el gen neo en el M13TG2316. Previamente se ha creado un sitio NotI en este último, en dirección 3' del codón STOP del mutante TAT38, con la ayuda del oligonucleótido mutágeno OTG4413 descrito anteriormente. Después, el fragmento BamHI (1,2 kb), purificado del M13TG6390, se introduce en el vector pTG2673 previamente digerido mediante BamHI para dar pTG8305. Finalmente, el fragmento BglII de 0,38 kb, que comprende el gen rev mutado, se clona en el sitio EcoRI (tratado con el Klenow) del vector obtenido en la etapa anterior para generar pTG8313 (Figura 6).
D. Construcción de los vectores retrovíricos pTG8315 y pTG8316
El fragmento BamHI de 0,3 kb, resultante de M13TG2316 (que contiene TAT Phe^{38} -> Asp) o de M13TG2330 (TAT (Gln^{54} -> STOP)), se inserta en el sitio BamHI del p polyIII-I* (Lathe et al., Gene, 1987, 57, 193-201), dando lugar a p poly-2316 o p poly-2330. Éstos se escinden mediante EcoRI y PvuII, y se introduce un fragmento EcoRI-NcoI (cuyos sitios se liberan mediante tratamiento con el Klenow) que corresponde a los elementos IRES del virus EMCV (virus de la encefalomiocarditis). Éste deriva del vector IRES-\betageo descrito en la Solicitud Internacional WO 94/24301.
Después, el gen neo se clona en dirección 3' del IRES en forma de un fragmento con extremos libres, aislado de pAG60. El experto en la técnica sabe cómo generar un fragmento libre a partir de un plásmido de la técnica anterior. Se introduce en el sitio AccI (tratado mediante el Klenow) de la construcción anterior. Se obtienen los vectores pTG6399 y pTG6398 que comprenden, respectivamente, los casetes bicistrónicos TAT (Phe^{38} -> Asp) - IRES - neo y TAT (Gln^{54} -> STOP) - IRES - neo.
Paralelamente, el fragmento BglII (0,38 kb), purificado de M13TG4303 mutado, se trata mediante el Klenow y después se inserta en el vector pTG2673 digerido mediante EcoRI, igualmente tratado mediante el Klenow. El vector así obtenido se digiere finalmente mediante XhoI a fin de clonar el fragmento XhoI obtenido de pTG6399 o de pTG6398. Se generan así los vectores pTG8315 (Figura 7) y pTG8316, en los que el gen rev modificado (5 mutaciones) está bajo control de la LTR 5' retrovírica y el casete bicistrónico que codifica TAT (Phe^{38} -> Asp) o TAT (Gln^{54} -> STOP), y el producto del gen neo está bajo el control del promotor PGK.
E. Construcción de los vectores inducibles por la proteína TAT nativa del VIH
El fragmento BglII (0,38 kb), que contiene el gen rev transdominante, se purifica del M13TG4303 mutado y se subclona en el sitio BamHI de p polyIII-I*. El vector resultante se linealiza mediante SmaI, y se introduce el fragmento EcoRIº-NcoIº que contiene el IRES. Después, se inserta en el sitio EcoRV, del vector así generado, el gen neo en forma de un fragmento con extremos libres descritos anteriormente, a fin de generar un casete bicistrónico que contiene las secuencias que codifican REV (Gln^{74}, Leu^{75}, Leu^{78}, Glu^{79}, Leu^{81} -> Gly, Ser, Glu, Phe, Asp) y el producto del gen neo cuya traducción se reinicia mediante el IRES EMCV.
Este casete se aísla mediante digestión XhoI-XbaI seguido de un tratamiento mediante Klenow, y se inserta en el sitio BalI del vector pTG4347. Este último resulta de la clonación en el p polyIII-I* de un fragmento que contiene la parte 3' de la LTR 5' del VIH (cepa clínica Lai), en lo sucesivo denominado "mini-LTR", y la señal de poliadenilación del virus SV40. A título indicativo, la mini LTR corresponde al fragmento ScaI-HindIII de la LTR 5' del VIH, y contiene los elementos que aseguran la transcripción y la transactivación mediante la proteína TAT nativa. El vector así generado se denomina pTG8314.
Paralelamente, los fragmentos BamHI de M13TG2316 y M13TG2330 que comprenden las secuencias que codifican las variantes transdominantes TAT (Phe^{38} -> Asp) y TAT (Gln^{54} -> STOP), respectivamente, se insertan en el vector pTG2682, el cual corresponde a pTG2673 desprovisto del promotor PGK. Después, el fragmento NotI, aislado de pTG8314, tratado mediante Klenow, se introduce finalmente en el sitio XhoI (liberado mediante tratamiento con el Klenow) de una u otra de las construcciones anteriores que resultan de pTG2682. Se obtienen vectores en los cuales los genes tat transdominantes respectivos se expresan de manera constitutiva bajo control de la LTR 5' retrovírica, mientras que el gen rev transdominante se expresa de manera inducible por la proteína TAT nativa del VIH bajo control de la mini LTR del VIH. Se seleccionan preferentemente clones en los que los dos casetes de expresión tienen una orientación inversa una con relación a la otra (Figura 8; pTG8323).
F. Evaluación de la funcionalidad de las construcciones anteriores
La actividad transdominante de los productos TAT y REV producida mediante cada una de las construcciones del Ejemplo 3 puede ser evaluada como anteriormente, mediante cotransfección transitoria de células humanas (por ejemplo, de células A549 ATCC CCL185) con un vector informador (LTR-CAT que depende de TAT, o pTG1335 que depende de REV) y un vector de expresión de la proteína TAT o REV salvaje (pHMG-Tat o pHMG-Rev).
G. Constitución de partículas víricas infecciosas
Se pueden preparar unos lotes de partículas víricas infecciosas que comprenden cada una construcciones del ejemplo 3 de manera convencional. Brevemente, los vectores retrovíricos se transfectan en las células de encapsidamiento ecótropas GP+E 86 (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62, 1120-1124). Después de la selección de las células resistentes a la neomicina, los sobrenadantes de cultivo se recolectan para transducir una estirpe de encapsidamiento anfótropa, por ejemplo la estirpe PA317. Las estirpes así obtenidos constituirán las células productoras de partículas víricas infecciosas, las cuales pueden ser utilizadas en el ámbito de una terapia génica contra el SIDA. Su capacidad para inducir una resistencia a la infección por el VIH se puede evaluar in vivo e in vitro como se indica en el ejemplo 2.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
Solicitante
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Nombre: Transgene S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Dirección: 11 rue de Molsheim
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Ciudad: Estrasburgo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
País: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
Código postal: 67082
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
Teléfono: (33)88 27 91 00
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
Fax: (33)88 22 58 07
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nueva composición para efecto antivírico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 86 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: nº
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: nº
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Lai
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: secuencia de la proteína TAT del VIH-1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: nº
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: nº
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ORGANISMO: Virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CEPA: Lai
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CEPA CLÍNICA: secuencia de la proteína REV del VIH-1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULAS: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: nº
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: nº
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de mutagénesis (TAT Phe38 en Asp)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAAAGCTTTT GTTGTGTCAC AAACTT 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bajas
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULAS: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: nº
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: nº
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de mutagénesis (REV Gln, Leu en Gly, Ser)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTCTCAAGC CGTGGGGATC CAAGAGGCAC AGG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bajas
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULAS: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: nº
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: nº
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de mutagénesis
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCAAGAGTA TCTCTGAATT CCGGTGGGGA TCCAAGAGGC A 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULAS: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: nº
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: nº
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis (OTG4413)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTCTCCACC TTCGCGGCCG CTTCCTTCGG GCCT 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULAS: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: nº
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: nº
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis (OTG4370)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCATTGAGA GATCTAACAG CA 
\hfill
22

Claims (17)

1. Composición que comprende al menos:
(a) una primera variante transdominante de la proteína TAT del virus del VIH; y
(b) una segunda variante transdominante de la proteína REV del virus del VIH, caracterizada porque la variante transdominante de la proteína REV tiene la secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº: 2, que empieza en el aminoácido +1 y termina en el aminoácido +116, en la que el resto glutamina en posición +74 se sustituye por un resto glicina, y el resto leucina en posición +75 se sustituye por un resto serina.
2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la variante transdominante de la proteína REV tiene además el resto leucina en posición +78 sustituido por un resto ácido glutámico, el resto ácido glutámico en posición +79 sustituido por un resto fenilalanina y el resto leucina en posición +81 sustituido por un resto ácido aspártico.
3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la variante transdominante de la proteína TAT tiene la secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº: 1, que empieza en el aminoácido +1 y termina en el aminoácido +86, en la que:
(1) el resto fenilalanina en posición +38 se sustituye por un resto aspártico;
(2) el resto treonina en posición +40 se sustituye por un resto alanina;
(3) el resto lisina en posición +41 se sustituye por un resto ácido glutámico;
(4) el resto isoleucina en posición +45 se sustituye por un resto serina; y/o
(5) el resto tirosina en posición +47 se sustituye por un resto arginina.
4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, como producto de combinación para una utilización simultánea, separada o espaciada en el tiempo, destinada al tratamiento o prevención de infecciones debidas al VIH.
5. Vector recombinante, que comprende:
(a) una primera secuencia de ADN que codifica una variante transdominante de la proteína TAT del virus del VIH, puesta bajo control de los elementos necesarios para su expresión constitutiva; y
(b) una segunda secuencia de ADN que codifica una variante transdominante de la proteína REV del virus del VIH, que tiene la secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº: 2, que empieza en el aminoácido +1 y termina en el aminoácido +116, en la que el resto glutamina en posición +74 se sustituye por un resto glicina, y el resto leucina en posición +75 se sustituye por un resto serina, puesta bajo control de los elementos necesarios para su expresión constitutiva.
6. Vector recombinante según la reivindicación 5, caracterizado porque la variante transdominante de la proteína REV tiene además el resto leucina en posición +78 sustituido por un resto ácido glutámico, el resto glutámico en posición +79 sustituido por un resto fenilalanina, y el resto leucina sustituido en posición +81 sustituido por un resto ácido aspártico.
7. Vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque la variante transdominante de la proteína TAT tiene la secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº: 1, que empieza en el aminoácido +1 y termina en el aminoácido +86, en la que:
(1) el resto fenilalanina en posición +38 se sustituye por un resto ácido aspártico;
(2) el resto treonina en posición +40 se sustituye por un resto alanina;
(3) el resto lisina en posición +41 se sustituye por un resto ácido glutámico;
(4) el resto isoleucina en posición +45 se sustituye por un resto serina; y/o
(5) el resto tirosina en posición +47 se sustituye por un resto arginina.
8. Vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque los elementos necesarios para la expresión constitutiva son el promotor PGK o la LTR del virus MoMuLV.
9. Vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado porque deriva de un virus seleccionado entre los retrovirus, adenovirus y virus asociados al adenovirus.
10. Célula eucariota en el genoma del cual se insertan:
(a) una primera secuencia de ADN que codifica una variante transdominante de la proteína TAT del virus del VIH, puesta bajo control de los elementos necesarios para su expresión constitutiva; y
(b) una segunda secuencia de ADN que codifica una variante transdominante de la proteína REV del virus del VIH, que tiene la secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº: 2, que empieza en el aminoácido +1 y termina en el aminoácido +116, en la que el resto glutamina en posición +74 se sustituye por un resto glicina, y el resto leucina en posición +75 se sustituye por un resto serina, puesta bajo control de los elementos necesarios para su expresión constitutiva.
11. Célula eucariota según la reivindicación 10, caracterizada porque la variante transdominante de la proteína REV tiene además el resto leucina en posición +78 sustituido por un resto ácido glutámico, el resto glutámico en posición +79 sustituido por un resto fenilalanina, y el resto leucina en posición +81 sustituido por un resto ácido aspártico.
12. Célula eucariota según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, caracterizada porque la variante transdominante de la proteína TAT tiene la secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº: 1, que empieza en el aminoácido +1 y termina en el aminoácido +86, en la que:
(1) el resto fenilalanina en posición +38 se sustituye por un resto ácido aspártico;
(2) el resto treonina en posición +40 se sustituye por un resto alanina;
(3) el resto lisina en posición +41 se sustituye por un resto ácido glutámico;
(4) el resto isoleucina en posición +45 se sustituye por un resto serina; y/o
(5) el resto tirosina en posición +47 se sustituye por un resto arginina.
13. Célula eucariota según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizada porque los elementos necesarios para la expresión constitutiva son el promotor PGK o la LTR del virus MoMuLV.
14. Uso de un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, o de una célula según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o a la prevención de las infecciones víricas debidas al VIH.
15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. Composición farmacéutica que comprende un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, o una célula según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. Kit que comprende:
(a) una primera variante transdominante de una proteína TAT del virus del VIH, y
(b) una segunda variante transdominante de la proteína REV del virus del VIH, caracterizada porque la variante transdominante de la proteína REV tiene la secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº: 2, que empieza en el aminoácido +1 y termina en el aminoácido +116, en la que el resto glutamina en posición +74 se sustituye por un resto glicina, y el resto leucina en posición +75 se sustituye por un resto serina;
con instrucciones para su administración concomitante o secuencial.
ES95903829T 1993-12-13 1994-12-13 Composicion de variantes transdominantes de proteinas viricas para un efecto antivirico. Expired - Lifetime ES2229232T3 (es)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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