ES2236715T3

ES2236715T3 - Materiales para la produccion de estructuras nanometricas y su uso.

Info

Publication number: ES2236715T3
Application number: ES95936297T
Authority: ES
Inventors: Llc Nanoframes
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-13
Publication date: 2005-07-16
Anticipated expiration: 2015-10-13
Also published as: IL115632A0; KR970707152A; AU689662B2; US5877279A; US5864013A; EP0785946A4; WO1996011947A1; CA2202474A1; EP0785946A1; CN1113068C; AU3829695A; HUT77683A; RU2162856C2; KR100555998B1; MX9702657A; BR9509487A; KR100425966B1; CN1168676A; JPH10508194A; US20030236390A1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PERTENECE A NANOESTRUCTURAS, ES DECIR, ESTRUCTURAS CON TAMAÑO NANOMETRICO UTILES EN LA CONSTRUCCION DE ESTRUCTURAS MICROSCOPICAS Y MACROSCOPICAS. EN CONCRETO, LA PRESENTE INVENCION PERTENECE A NANOESTRUCTURAS BASADAS EN PROTEINAS DE FIBRA DE COLA T4 BACTERIOFAGAS Y A VARIANTES DE LAS MISMAS.

Description

Materiales para la producción de estructuras nanométricas y su uso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nanoestructuras, es decir, estructuras de tamaño nanométrico útiles en la construcción de estructuras microscópicas y macroscópicas. En concreto, la presente invención se refiere a nanoestructuras basadas en las proteínas de la fibra de la cola del bacteriófago T4 y variantes de las mismas.

Antecedentes a la invención

Aunque la resistencia de la mayoría de los materiales cerámicos y metálicos procede de las fuerzas teóricas de enlace entre sus moléculas componentes y las superficies cristalinas, está significativamente limitada por defectos en sus estructuras cristalinas o cuasicristalinas. Estos defectos son habitualmente inherentes en la materia prima en sí misma o desarrollados en la fabricación y a menudo expandidos debido a la exposición a tensiones ambientales.

El campo emergente de la nanotecnología ha hecho más críticas las limitaciones de los materiales tradicionales. La capacidad para diseñar y producir estructuras muy pequeñas (es decir, de dimensiones nanométricas) que puedan proporcionar funciones complejas depende del uso de materiales apropiados que se puedan manipular de modos predecibles y reproducibles, y que tengan las propiedades requeridas para cada nueva aplicación.

Los sistemas biológicos sirven como paradigma de nanoestructuras sofisticadas. Las células vivas fabrican proteínas y las combinan en estructuras que están perfectamente conformadas y pueden resistir a daños en su medio normal. En algunos casos las estructuras complejas se crean mediante un proceso de autoensamblaje, cuyas instrucciones están basadas en los polipéptidos componentes. Por último, las proteínas está sometidas a procesos de corrección de errores que asegurar un elevado grado de control de calidad.

Por tanto, en la técnica existe una necesidad de procedimientos y composiciones que aprovechen estas características únicas de las proteínas para formar constituyentes de nanoestructuras sintéticas. La necesidad consiste en diseñar materiales cuyas propiedades se puedan ajustar a medida para satisfacer los requerimientos particulares de la tecnología a escala nanométrica. Además, ya que las subunidades de la mayoría de los materiales macrostructurales, cerámicas, metales, fibras, etc., están basados en la unión de subunidades nanoestructurales, la fabricación de subunidades apropiadas sin defectos y de dimensiones y uniformidad exactas debería mejorar la resistencia y consistencia de las macrostructuras puesto que las superficies son más regulares y pueden interaccionar de forma más estrecha a lo largo de un área extensa que en un material mayor y más heterogéneo.

Resumen de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona bloques proteicos de construcción aislados para nanoestructuras, que comprenden proteínas modificadas de la fibra de la cola del bacteriófago T4. Las proteínas gp34, 36 y 37 se modifican de diversos modos para formar nuevas estructuras de varilla con diferentes propiedades. Se pueden eliminar secuencias peptídicas internas específicas sin afectar su capacidad para formar dímeros y asociarse con sus partícipes naturales de la fibra de la cola. De manera alternativa, se pueden modificar de modo que: interaccionen solamente con otros partícipes modificados de la fibra de la cola, y no naturales; presenten interacciones termolábiles con otros partícipes; o contengan grupos funcionales adicionales que les permitan interaccionar con restos de unión heteró-
loga.

La presente invención también abarca proteínas de fusión que contienen secuencias de dos o más proteínas de las fibras de la cola diferentes. La proteína gp35, que forma un junta en ángulo, está modificada para formar ángulos promedio diferentes del ángulo promedio natural de 137º (\pm7º) o 156º (\pm12º), y para presentar interacciones termolábiles con sus partícipes.

En otro aspecto, la presente invención proporciona nanoestructuras que comprenden proteínas naturales y modificadas de la fibra de la cola del bacteriófago T4. Las nanoestructuras pueden ser varillas unidimensionales, polígonos bidimensionales u láminas abiertas o cerradas, o celdas abiertas o sólidos cerrados tridimensionales.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A y 1B muestran una representación esquemática de la partícula de bacteriófago T4 (Figura 1 A) y una representación esquemática de la fibra de la cola del bacteriófago T4 (Figura 1B).

La figura 2 muestra una representación esquemática de una varilla unidad.

Las figuras 3A a 3D muestran una representación esquemática de una varilla multiunitaria unidimensional unido a lo largo del eje x (figura 3A); láminas cerradas simples (figura 3B); láminas cerradas de enladrillado (figura 3C); y láminas abiertas de enladrillado (figura 3D).

La figura 4 muestra una representación esquemática de dos unidades usadas para construir láminas sólidas y porosas (planta y base), que, cuando están estratificadas de manera alternativa, producen un conjunto multiescalonado de celdas como el mostrado.

La figura 5 muestra una representación esquemática de una estructura inclinada con un ángulo de 120º.

La figura 6 muestra la secuencia de ADN (ID SEC Nº1) de los genes 34, 35, 36 y 37 del bacteriófago T4.

La figura 7 muestra las secuencias de aminoácidos (mostradas en los códigos de una letra) de los productos génicos de los genes 34 (ID SEC Nº2, ORFX ID SEC Nº3), 35 (ID SEC Nº4), 36 (ID SEC Nº5) y 37 (ID SEC Nº6) del bacteriófago T4. Las secuencias de aminoácidos (línea inferior de cada par) están alineadas con las secuencias de nucleótidos (línea superior de cada par). Hay que tener en cuenta que la secuencia proteica deducida del gen 35 (de la base de datos del NCBI) no se considera que sea precisa.

Las figuras 8A a 8B muestran una representación esquemática de la formación de un iniciador del dímero P37 a partir de una molécula que se autoensambla en un dímero (Figura 8A); y la formación de un iniciador trimérico P37 a partir de una molécula que se autoensambla en un trímero (Figura 8B).

La figura 9 muestra una representación esquemática de la formación del polímero (P37-36)_{n} con un iniciador que es un dímero de autoensamblaje.

Descripción detallada de la invención

Todas las patentes, solicitudes de patente y referencias bibliográficas citadas en la memoria descriptiva se incorporan por la presente como referencia en la presente memoria en su integridad. En el caso de contradicciones, prevalecerá la presente descripción, incluyendo las definiciones.

Aunque la invención se describe en términos de proteínas de la fibra de la cola del bacteriófago T4, se comprenderá que la invención también es aplicable a proteínas de las fibras de la cola de otro fago de la serie T-par, por ejemplo, de la familia T4 (por ejemplo, T4, Tula, Tulb) y la familia T2 (T2, T6, K3, 0x2, M1, etc.)

Definiciones

Las "nanoestructuras" se definen en la presente memoria como estructuras de diferentes tamaños y formas que están ensambladas a partir de componentes proteicos de tamaño nanométrico.

Las "quimeras" se definen en la presente memoria como proteínas quiméricas en las que al menos las regiones amino- y carboxi-terminales proceden de diferentes polipéptidos originales, bien se encuentren los polipéptidos originales de forma natural o se hayan modificado mediante mutagénesis.

Los "homodímeros" se definen en la presente memoria como ensamblajes de dos subunidades proteicas sustancialmente idénticas que forman una estructura tridimensional definida.

La designación "gp" denota un polipéptido monomérico, mientras que la designación "P" denota homooligómeros. Presuntamente P34, P36 y P37 son homodímeros o homotrímeros.

Un polipéptido aislado que ``consta esencialmente de una secuencia de aminoácidos especificada se define en la presente memoria como un polipéptido con la secuencia especificada o un polipéptido que contiene sustituciones conservativas en esta secuencia. Las sustituciones conservativas, como aquellos expertos habituales de la técnica comprenderán, son aquellas en las que un residuo ácido está sustituido por un residuo ácido, un residuo básico por un residuo básico, o un residuo hidrófobo por un residuo hidrófobo. También se incluye un polipéptido que carece de uno o más aminoácidos tanto en el extremo amino como el extremo carboxilo, hasta un total de cinco en cada extremo, cuando la ausencia de los residuos particulares no tenga un efecto perceptible sobre la estructura o la función del polipéptido en la práctica de la presente invención.

La presente invención se refiere a una nueva clase de bloques proteicos de construcción cuyas dimensiones se miden en nanómetros, que son útiles en la construcción de estructuras microscópicas y macroscópicas. Sin restringirse a la teoría, se cree que la unidad básica es un homodímero compuesto por dos subunidades proteicas idénticas con una configuración de cruz beta, aunque también es posible una estructura trimérica. Por tanto, como será evidente, las referencias a un "homodímero" o a "dimerización", como las usadas por la presente memoria, se interpretan en muchos casos como referidas también a un homotrímero o a trimerización. Estas unidades baciliformes largas, rígidas y estables se pueden ensamblar con otras varillas usando dispositivos de acoplamiento que se pueden conferir de forma genética o in vitro. Los extremos de una varilla se pueden anclar a diferentes extremos de otras varillas o varillas similares. Las variaciones en la longitud de las varillas, en los ángulos de unión y en sus características de flexibilidad permiten autoensamblarse in situ a estructuras de distintas formas. De este modo, las unidades se pueden autoensamblar en mayores estructuras predeterminadas de una, dos o tres dimensiones. El autoensamblaje se puede realizar por etapas para formar estructuras de dimensiones precisas y resistencia uniforme, debido a la fabricación biológica perfecta de los componentes. Las varillas se pueden modificar también mediante modificaciones genéticas y químicas para formar sitios específicos de anclaje predeterminados para otras entidades químicas, permitiendo la formación de estructuras complejas.

Un importante aspecto de la presente invención es que las unidades proteicas se pueden diseñar de manera que comprendan varillas de diferentes longitudes, y se puedan modificar además para incluir características que alteren sus propiedades de superficie de maneras predeterminadas y/o afectar a su capacidad para unirse con otras unidades idénticas o distintas. Por lo tanto, las capacidades de autoensamblaje se pueden ampliar produciendo proteínas quiméricas que combinen las propiedades de dos miembros diferentes de esta clase. Esta característica de diseño se consigue manipulando la estructura de los genes que codifican estas proteínas.

Como se detalla a continuación, las composiciones y procedimientos de la presente invención se aprovechan de las propiedades de las proteínas naturales, es decir, las estructuras resultantes son rígidas, fuertes, estables en medios acuosos, termorresistentes, resistentes a proteasas, y se pueden convertir en biodegradables. Se puede fabricar fácilmente una gran cantidad de unidades en microorganismos.

Por lo tanto, para comodidad de automatización, se pueden almacenar y usar grandes cantidades de partes y subensamblajes, según se necesite.

Las secuencias de las subunidades proteicas están basadas en los componentes de las fibras de la cola del bacteriófago T4 de E. coli. Se comprenderá que los principios y las técnicas se pueden aplicar a las fibras de la cola de otros fagos T-par, u otros bacteriófagos relacionados que tengan estructuras similares de la cola y/o la fibra.

La estructura del de las fibras de la cola del bacteriófago T4 (ilustrada en la figura 1) se puede representar de forma esquemática como sigue (N = extremo amino, C = extremo carboxi): N[P34]C - N[gp35]C - N[P36]C - N[P37]C. P34, P36 y P37 son todos homodímeros proteicos baciliformes y rígidos en los que dos láminas beta idénticas, orientadas en la misma dirección, se fusionan frontalmente mediante interacciones hidrófobas entre las láminas yuxtapuestas con un eje rotacional de simetría de 180º a través del largo eje de la varilla. (La estructura variará si P34, P36 y P37 son homotrímeros). En contraste, gp35 es un polipéptido monomérico que se une de manera específica al extremo N de P36 y luego al extremo C de P34 y forma una junta en ángulo entre dos varillas. Durante la infección por T4 de E. coli, dos monómeros de gp37 dimerizan para formar un homodímero de P37; se cree que el proceso de dimerización se inicia cerca del extremo C de P37 y requiere dos proteínas chaperonas E. coli. (Una variante de gp37 con una mutación termosensible cerca del extremo C usada en la presente invención solamente requiere una chaperona, gp57, para la dimerización). Una vez dimerizado, el extremo N de P37 inicia la dimerización de dos monómeros de gp36 hasta una varilla P36. La unión entre el extremo C de P36 y el extremo N de P37 es estrecha y rígida pero no covalente. El extremo N de P36 se ancla después a un monómero gp35; esta interacción estabiliza P36 y forma el codo de la fibra de la cola. Por último, gp35 se ancla al extremo C de P34 (que usa gp57 para la dimerización). Con ello, se regula el autoensamblaje de la fibra de la cola mediante un orden predeterminado de interacción de subunidades específicas por medio de las cuales la maduración estructural causada por la formación del primer subensamblaje permite la interacción con nuevas subunidades (previamente imposibles). Esto da lugar a la producción de una estructura de especificaciones exactas a partir de una mezcla aleatoria de los componentes.

De acuerdo con la presente invención, los genes que codifican estas proteínas se pueden modificar para preparar varillas de diferentes longitudes con diferentes combinaciones de extremos. Las propiedades de las proteínas nativas son particularmente ventajosas a este respecto. En primer lugar, la lámina \beta está compuesta por hebras \beta antiparalelas con giros \beta en los bordes izquierdo (L) y derecho (R). En segundo lugar, las cadenas laterales de los aminoácidos se alternan hacia arriba y hacia abajo fuera del plano de la lámina. La primera propiedad permite a los giros extenderse para formar sitios de anclaje específicos y simétricos entre las superficies L y R, así como formar sitios de anclaje para otras estructuras. Además, las secciones centrales de la lámina \beta se pueden acortar o alargar mediante manipulaciones genéticas, por ejemplo, por corte y empalme de regiones de ADN que codifique giros \beta, sobre el mismo borde de la lámina, para formar nuevos giros que excluyan a péptidos intervinientes, o insertando segmentos de péptido de un modo análogo al corte y empalme en los ángulos de giro. La segunda propiedad permite modificar las cadenas laterales de los aminoácidos que se extienden por encima y por debajo de la superficie de la lámina \beta, mediante sustitución genética o acoplamiento químico. De forma importante, todas las modificaciones anteriores se consiguen sin comprometer la integridad estructural de la varilla. Alguien experto en la técnica comprenderá que estas propiedades permiten mucha flexibilidad en el diseño de unidades que se puedan ensamblar en una amplia variedad de estructuras, algunas de las cuales se detallan a continuación.

Unidades estructurales

Las varillas de la presente invención funcionan a modo de pernos de madera 2 X 4 o vigas de acero para la construcción. En este caso, las superficies son reproducibles de manera exacta a nivel molecular y en consecuencia aptas para anclajes específicos a varillas unitarias similares o distintas en sitios de unión fijos. Las superficies también se modifican para ser más o menos hidrófilas, incluyendo grupos cargados positiva o negativamente, y tener protuberancias incorporadas para la unión específica a otras unidades o a un junta intermedia con dos sitios receptores. En la figura 2 se ilustran las superficies de la varilla y un esquema de la unidad de varilla. Las tres dimensiones de la varilla se definen como: x, para la dimensión de atrás (B) al frente (F); y, para la dimensión de abajo (D) hacia arriba (U); y z, para la dimensión de izquierda (L) a derecha (R).

Las varillas multiunitarias unidimensionales se pueden ensamblar más fácilmente a partir de varillas unitarias únicas unidas a lo largo del eje x (Figura 3A) pero la unión regular de subunidades en cualquiera de las otras dos dimensiones también formará una estructura alargada, pero con diferentes secciones transversales que en la dimensión x.

Las construcciones bidimensionales son láminas formadas por la interacciones de varillas a lo largo de dos ejes cualquiera. 1) Las láminas cerradas simples se forman a partir superficies que se superponen de manera exacta, a lo largo de dos ejes cualquiera (figura 3B). 2) Las láminas cerradas de enladrillado se forman a partir de la interacción entre unidades que tienen superficies exactamente solapantes en una dimensión y un tipo especial de solapamiento en el otro (figura 3C). En este caso deben ser dos grupos diferentes de uniones complementarias separadas con exactamente 1/2 unidad de distancia entre ellos. Si están centrados (es decir, cada conjunto 1/4 desde el extremo) entonces cada conexión estará en el centro de las unidades por encima y por debajo. Si están desfasadas, entonces la conexión estará desfasada también. En esta construcción, los sitios complementarios de interacción se esquematizan por * y **. Si cada sitio de interacción es simétrico, las filas alternantes pueden interaccionar con las varillas en cualquier dirección. Si no son simétricos, y sólo pueden interaccionar con filas con vista a la misma u opuesta dirección, la lámina estará compuesta por varillas unidireccionales o capas de varillas en direcciones alternantes. 3) Las láminas abiertas de enladrillado (o redes) se generan cuando las unidades se separan por más de una mitad de unidad (figura 3D). Las dimensiones de las aberturas (o poros) dependen de la distancia (d_{x}) que separa los sitios de interacción y la distancia (d_{y}) por la cual estos sitios separan las superficies.

Las construcciones tridimensionales requieren interacciones estéricamente compatibles entre las tres superficies para formar sólidos. 1) Los sólidos cerrados pueden ensamblarse a partir de unidades que solapan de forma exacta en las tres dimensiones (por ejemplo, el solapamiento exacto de las láminas cerradas simples). De modo análogo, las láminas cerradas de enladrillado pueden formar sólidos cerrados solapando las láminas de manera exacta o desplazarse para introducir al enladrillado en la tercera dimensión. Esto requiere un conjunto apropiado de conexiones en los tres pares de caras paralelas de la unidad. 2) Los sólidos porosos están compuestos por uniones de láminas abiertas de enladrillados de diversos modos. Por ejemplo, si las unidades solapan de forma exacta en la tercera dimensión, se forma un sólido con la matriz de agujeros de dimensiones exactas que discurre perpendicular al plano del papel. Si en cambio se necesita un material con espacios cerrados, con capas de anchura d_{z} (es decir, en la dimensión U-»D), se dispone en capas una lámina cerrada simple sobre la lámina abierta de enladrillado para cerrar las aberturas. Si el solapamiento de la lámina abierta de enladrillado es por ejemplo, 1/4 de unidad, entonces se usa una varilla de longitud 3/4 de unidad para preparar la lámina. Así las conexiones se necesitan en la dimensión z. Las dos unidades usadas para polimerizar estas capas alternantes, y las capas mismas, se esquematizan en la figura 4.

Todas las estructuras anteriores están compuestas de varillas lineales simples. Una segunda unidad, la unidad angular, extiende el tipo y la dimensionalidad de las posibles estructuras. La unidad angular conecta dos varillas a ángulos diferentes de 180º, similar a una escuadra. El ángulo promedio y su grado de rigidez están construidos en esta estructura conectora. Por ejemplo, la estructura mostrada en la figura 5 tiene un ángulo de 120º y diferentes sitios específicos de unión en a y en b. Los siguientes son ejemplos de estructuras que se forman utilizando juntas en ángulo:

1) Las láminas abiertas de enladrillado se expanden y se consolidan en la dirección normal a la dirección de la varilla, añadiendo ángulos perpendiculares a la lámina. En este caso, se forma una red tridimensional. La conexión de ángulos de 90º a los extremos de las varillas hace un ángulo casi en el plano de la lámina, permitiendo nuevas varillas adicionales a estos ángulos (que deben tener algún juego fuera del plano de la lámina original para unirse en el primer lugar) para formar una nueva lámina, casi paralela, con una orientación normal hacia su proximidad superior o inferior.

2) Los hexágonos se preparan a partir de una mezcla de varillas y juntas en ángulo que formas ángulos de 120º. En este caso existen dos conjuntos exclusivos de juntas. Cada conjunto está constituido por uno de los dos extremos de la varilla y uno de los dos sitios complementarios sobre el ángulo. Esta es una estructura lineal en el sentido de que el hexágono tiene una dirección (bien en el sentido de las agujas del reloj o en contra de las agujas del reloj). Se puede preparar en una red abierta bidimensional (es decir, un panal bidimensional) uniendo los lados de los hexágonos. Se pueden formar tubos hexagonales uniendo la parte superior del hexágono por debajo de la cara inferior del hexágono situado por encima. Si también se unen los tubos por sus caras, formarán un tubo hexagonal múltiple abierto tridimensional.

3) Los tubos hexagonales helicoidales se preparan de forma análoga a los hexágonos pero la sexta unidad no está unida a la primera para cerrar el hexágono. En cambio, el extremo está desplazado del plano del hexágono y se añaden la séptima y las siguientes unidades para formar un tubo hexagonal que pueda ser un resorte si existen pequeñas fuerzas adhesivas o ninguna entre las unidades de la hélice, o una varilla rígida si existe una fuerza tal para mantener la estrecha proximidad de las unidades relevantes.

Será evidente para alguien experto en la técnica que las composiciones y los procedimientos de la presente invención también incluyen otras estructuras poligonales tales como octógonos, así como sólidos abiertos tales como tetraedros e icosaedros formados a partir de triángulos y cajas formadas a partir de cuadrados y rectángulos. La gama de estructuras solamente está limitado por los tipos de unidades angulares y los sustituyentes que se pueden diseñar sobre los diferentes ejes de las varillas unitarias. Por ejemplo, otros ángulos que existen de forma natural se encuentran en las fibras del bacteriófago T7, que tiene un ángulo 90º (Steven y col., J. Mol. Biol. 200. 352-365, 1988).

Diseño y producción de las proteínas varilla

Las subunidades proteicas que se usan para construir las nanoestructuras de la presente invención se basan en los cuatro polipéptidos que comprenden las fibras de la cola del bacteriófago T4, es decir, gp34, gp35, gp36 y gp37. Los genes que codifican estas proteínas han sido clonados, y se han determinado sus secuencias de ADN y de proteína (para los genes 36 y 37 véase Oliver y col. J. Mol. Biol. 153: 545-568,1981). Las secuencias de ADN y aminoácidos de los genes 34, 35, 36 y 37 se exponen a continuación en las figuras 6 y 7.

Gp34, gp35, gp36, y gp37 se producen de forma natural tras la infección de células de E. coli por partículas intactas del fago T4. Tras la síntesis en el citoplasma de la célula bacteriana, los monómeros de gp34, 36, y 37 forman homodímeros, que son competentes para ensamblarse en las partículas de fago que maduran. Así, E. coli sirve como una factoría eficiente y conveniente para la síntesis y dimerización de las subunidades proteicas descritas a continuación en la presente memoria.

En la práctica de la presente invención, los genes que codifican las proteínas de interés (nativa, modificada o recombinada) se incorporan en vectores de expresión de ADN que se conocen bien en la técnica. Estos plásmidos circulares contienen típicamente genes marcadores seleccionables (que confieren usualmente resistencia a antibióticos a las bacterias transformadas), secuencias que permiten la replicación del plásmido hasta un número elevado de copias en E. coli, y un sitio de clonación múltiple inmediatamente corriente debajo de un promotor inducible y un sitio de unión al ribosoma. Los ejemplos de vectores disponibles comercialmente adecuados para su uso en la presente invención incluyen el sistema pET (Novagen, Inc., Madison, Wl) y los vectores Superlinker pSE280 y pSE380 (Invitrogen, San Diego, CA).

La estrategia es 1) construir el gen de interés y clonarlo en el sitio de clonación múltiple; 2) transformar las células E. coli con el plásmido recombinante; 3) inducir la expresión del gen clonado; 4) analizar la síntesis del producto proteico; y, por último, 5) analizar la formación de homodímeros funcionales. En algunos casos, también se clonan genes adicionales en el mismo plásmido, cuando su función se requiere para la dimerización de la proteína de interés. Por ejemplo, cuando las versiones natural o modificada de gp37 se expresan, también se incluye el gen 57 de la chaperona bacteriana; cuando se expresa gp36 natural o modificada, se incluye la versión natural o una versión modificada del gen de gp37. La gp37 modificada debería tener la capacidad de dimerizar y contener un extremo N que pueda auxiliar a la dimerización de gp36. Este procedimiento permite la formación de productos génicos monoméricos y, en algunos casos, la maduración de los monómeros hacia varillas homodiméricas en ausencia de otras proteínas inducidas por fagos presente normalmente en una célula infectada por T4.

Las etapas 1 a 4 de la estrategia definida antes se consiguen mediante procedimientos que se conocen bien en la técnica de la tecnología del ADN recombinante y la expresión de proteínas en bacterias. Por ejemplo, en la etapa 1, se usa la escisión por la enzima de restricción en múltiples sitios, seguida de la ligación de los fragmentos, para construir eliminaciones en el segmento interno de la varilla de gp34, 36, y 37 (véase el ejemplo 1 a continuación). De forma alternativa, se usa una única o una múltiple escisión por enzima de restricción, seguida de digestión con exonucleasa (EXO-SIZE, New England Biolabs, Beverly, MA), para suprimir secuencias de ADN en una o en ambas direcciones desde el sitio inicial de escisión; cuando se combina con una etapa posterior de ligación, este procedimiento produce un conjunto anidado de eliminaciones de tamaños crecientes. De manera similar, se usan procedimientos estándar para recombinar segmentos de ADN a partir de dos genes diferentes de la fibra de la cola, para producir genes quiméricos que codifiquen proteínas de fusión (llamadas "quimeras" en esta memoria descriptiva). En general, este último procedimiento se usa para proporcionar extremos N o C alternativos y crear así nuevas combinaciones de extremos que permitan nuevos patrones de unión de diferentes segmentos de varillas. Un representante de este tipo de quimera, la fusión de gp37-36, se describe en el ejemplo 2. Los huéspedes preferidos para la producción de estas proteínas (Etapa 2) son las cepas BL21(DE3) y BL21 (DE3/pLysS) de E. coli (disponibles comercialmente en Novagen, Madison, Wl), aunque se pueden usar otras cepas recA compatibles, tales como HMS174(DE3) y HMS174 (DE3/pLysS). La transformación con el plásmido recombinante (Etapa 2) se lleva a cabo mediante procedimientos estándar (Sambrook, J., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY; este es también la fuente de los procedimientos estándar de ADN recombinante usados en esta invención). Las bacterias transformadas se seleccionan debido a su resistencia a antibióticos, por ejemplo, ampicilina o kanamicina. El procedimiento por el que la expresión de los genes clonados de la fibra de la cola se induce (Etapa 3) depende del promotor particular usado. Un promotor preferido es plac (con un lacl^{q} en el vector para reducir la expresión de fondo), que se puede regular mediante la adición de isopropiltiogalactósido (IPTG). Un segundo promotor preferido es pT7\Phi10, que es específico para la ARN polimerasa de T7 y no es reconocido por la ARN polimerasa de E. coli. La ARN polimerasa de T7, que es resistente a rifamicina, está codificada sobre el lisogen defectuoso lambda DE en el cromosoma BL21 de E. coli. La polimerasa de T7 en BL21(DE3) está muy reprimida por el gen laci^{q} en el plásmido y se induce y regula por IPTG.

Típicamente, un cultivo de bacterias transformadas se incuba con el inductor durante un periodo de horas, durante el cual se controla la síntesis de la proteína de interés. En el presente caso, se preparan extractos de las células bacterianas, y se detectan las proteínas de la fibra de la cola de T4, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.

Una vez que se detecta la proteína modificada en los extractos bacterianos, es necesario discernir si forman o no los homodímeros apropiados (etapa 4). Esto se lleva a cabo inicialmente probando si la proteína es reconocida por un antisuero específico para la forma dimerizada madura de la proteína.

Los antisueros específicos para fibras de la cola se preparan como se describe (Edgar, R. S. y Llelausis, I., Genetics 52:1187, 1965; Ward y col., J. Mol. Biol. 54:15, 1970). En pocas palabras, se usa el fago T4 completo como inmunógeno; opcionalmente, el antisuero resultante se adsorbe después con partículas de fagos sin cola, eliminando así todos los anticuerpos excepto aquellos dirigidos contra las proteínas de la fibra de la cola. En una etapa posterior, se adsorben de manera individual diferentes alícuotas del antisuero con extractos que carecen cada uno de una proteína concreta de la fibra de la cola. Por ejemplo, si se usa un extracto que contiene solamente los componentes de la fibra de la cola P34, gp35 y gp36 (procedentes de una célula infectada con un T4 mutante que carece de un gen gp37 funcional) para la absorción, el antisuero resultante reconocerá solamente la P37 madura y P36-P37 dimerizada. Se puede usar una aproximación similar para preparar antisueros individuales que reconocen sólo P34 y P36 maduros (es decir, homodimerizados) adsorbiendo con extractos que contienen la mitad distal de las fibras de la cola o P34, gp35 y P37, respectivamente. Una alternativa es construir anticuerpos frente a las mitades purificadas de la fibra de la cola, por ejemplo, P34 y gp35-P36-P37. Luego se pueden adsorber anticuerpos anti-gp35-P36-P37 con P36-P37 para producir anti-gp35, y se puede producir anti-P36 mediante adsorción con P37 y gp35. También se pueden producir directamente anticuerpos anti-P37, anti-gp35 y anti-P34 usando P37, gp35 y P34 purificadas como inmunógenos. Otra aproximación es producir anticuerpos monoclonales específicos frente a diferentes componentes de la fibra de la cola o segmentos de la misma.

Los anticuerpos específicos a las subunidades o partes de la cola se usan de cualquiera de los siguientes modos para detectar las proteínas de la fibra de la cola homodimerizadas de manera apropiada: 1) Se analizan de forma sistemática colonias bacterianas para aquellas que expresan las proteínas maduras de la fibras de la cola transfiriendo directamente las colonias, o, alternativamente, muestras de cultivos lisados o sin lisar, a filtros de nitrocelulosa, lisando las células bacterianas sobre el filtro si es necesario, e incubando con anticuerpos específicos. La formación de inmunocomplejos se detecta después mediante procedimientos usados ampliamente en la técnica (por ejemplo, anticuerpo secundario conjugado a una enzima cromogénica o a proteína A estafilocócica marcada radiactivamente). Este procedimiento es particularmente útil para analizar de forma sistemática grandes números de colonias, por ejemplo, aquellas producidas por supresión con EXO-SIZE según se ha descrito anteriormente. 2) Las células bacterianas que expresan la proteína de interés se marcan primero de forma metabólica con ^{35}S-metionina, seguido de la preparación de los extractos e incubación con el antisuero. Los inmunocomplejos se recuperan después por incubación con la proteína A inmovilizada seguido de centrifugación, tras lo cual se pueden resolver mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.

Un ensayo competitivo alternativo para probar si las proteínas suprimidas de la fibra de la cola que no permiten la infección del fago mantienen a pesar de todo la capacidad de dimerizar y asociarse con sus parejas apropiadas, utiliza un sistema de complementación in vitro. 1) Se mezcla un extracto bacteriano que contiene la proteína modificada de interés, como se ha descrito antes, con un segundo extracto preparado a partir de células infectadas con un fago T4 que es mutante en el gen de interés. 2) Después de varias horas de incubación, se añade un tercer extracto que contiene la versión natural de la proteína a probar, y se continúa la incubación durante varias horas más. 3) Por último, se valora el extracto para las partículas del fago infeccioso infectando E. coli y cuantificando las placas de fago que resultan. En la etapa 1 se incorpora de una manera no funcional una proteína modificada de la fibra de la cola que está correctamente dimerizada y es capaz de unirse con sus parejas a las fibras de la cola, previniendo con ello la incorporación de la versión natural de la proteína en la etapa 2; el resultado es una reducción en el valor de la muestra de fago resultante. En cambio, si la proteína modificada es incapaz de dimerizar y formar de este modo los extremos N y/o C apropiados, no se incorporará en las partículas de fagos en la etapa 1, y por ello no competirá con el ensamblaje de partículas intactas de fagos en la etapa 2; por tanto, el valor del fago deberías ser equivalente al observado cuando la proteína sin modificar se añade en la etapa 1 (control negativo).

Otro modo con el que probar si las quimeras y las proteínas de la fibra de la cola suprimidas internamente mantienen la capacidad de dimerizar y asociarse con sus parejas apropiadas es hacerlo in vivo. El ensayo detecta la capacidad de tales quimeras y proteínas suprimidas para competir por el ensamblaje con las partes de fagos normales, reduciendo así el tamaño de estallido de un fago natural que infecta la misma célula huésped en la que las quimeras o las proteínas suprimidas están expresadas de forma recombinante. Con esto, la expresión a partir de un vector de expresión que codifica la quimera o la proteína suprimida se induce en el interior de una célula, cuya célula se infecta después por un fago natural. La inhibición de la producción del fago natural demuestra la capacidad de la quimera o proteína recombinante para asociarse con las proteínas apropiadas de la fibra de la cola del fago.

Los procedimientos descritos anteriormente se usan, solos y en combinación, en el diseño y producción de diferentes tipos de proteínas modificadas de la fibra de la cola. Por ejemplo, un análisis preliminar de un gran número de colonias bacterianas para las que expresan una proteína correctamente dimerizada identificará colonias positivas, que luego se pueden probar individualmente mediante complementación in vitro.

Los ejemplos no limitantes de las nuevas proteínas que se recogen en la presente invención incluyen:

1): Polipéptidos gp34, 36 y 37 suprimidos interiormente (véase el ejemplo 1 a continuación);

2): Una gp36 truncada de forma C-terminal fusionada al extremo N de gp37 truncada de forma N-terminal;

3): Una fusión entre gp36 y gp37 en la que gp37 es N-terminal a gp36 (es decir, a la inversa del orden natural), denominada en la presente memoria "quimera gp37-36" (véase el ejemplo 2 a continuación);

4): Una fusión entre gp34 y gp36 en la que gp36 es N-terminal a gp34 (es decir, a la inversa del orden natural), denominada en la presente memoria "quimera gp36-34";

5): Una variante de gp36 en la que el extremo C está mutado de modo que carezca de la capacidad para interaccionar con (y dimerizar en respuesta al) extremo N de P37 natural, denominada en la presente memoria "gp36*";

6): Una variante de gp37 en la que el extremo N está mutado de modo que forme una P37 que carezca de la capacidad para interaccionar con el extremo C de gp36 natural, denominada en la presente memoria "*P37";

7): Variantes de gp36* y *P37 que puedan interaccionar unas con otras, pero no con gp36 ó P37.

8): Una variante de la "quimera P37-36" en la que el resto gp36 procede de la variante como en 5), es decir, "P37-36*". (Para 5 a 8, véase el ejemplo 3 a continuación).

9): Una variante de la "quimera P37-36" en la que el resto gp37 procede de la variante como en 6) anteriormente, es decir, "*P37-36".

10): Una variante de la quimera P37-36, *P37-P36*, en la que los restos gp36 y gp37 proceden de las variantes de 7).

11): Una fusión entre gp36 y gp34 en las que las secuencias de gp36 se disponen de forma N-terminal a gp34, cuyo dímero se denomina en la presente memoria "quimera P36-34";

12): Variantes de gp35 que forman ángulos promedio distintos de 137º o 158º (el ángulo nativo), por ejemplo, menores de 125º o mayores de aproximadamente 145º en condiciones en las que la proteína gp35 natural forma un ángulo de 137º cuando se combina con los dímeros P34 y P36-P37, y/o exhiben más o menos flexibilidad que el polipéptido nativo;

13): Variantes de gp34, 35, 36 y 37 que presentan interacciones termolábiles u otras interacciones específicas variantes con sus parejas similares; y

14): Variantes de gp37 en las que el dominio C-terminal del polipéptido está modificado para incluir secuencias que confieran propiedades específicas de unión a la molécula entera, por ejemplo, secuencias derivadas de la avidina que reconocen biotina, secuencias derivadas de la cadena pesada de la inmunoglobulina que reconocen la proteína A estafilocócica, secuencias derivadas de la porción Fab de la cadena pesada de anticuerpos monoclonales a los que sus respectivos homólogos Fab de la cadena ligera pueden unirse y formar un sitio de unión a antígeno, secuencias inmunoactivas que reconocen anticuerpos específicos, o secuencias que unen iones metálicos específicos. Estos ligandos se pueden inmovilizar para facilitar la purificación y/o el ensamblaje.

En realizaciones específicas, las quimeras de la invención comprenden una porción que está constituida de al menos los 10 primeros aminoácidos (N-terminales) de una primera proteína de la fibra de la cola fusionada a través de un enlace peptídico a una porción compuesta de al menos los últimos 10 aminoácidos (C-terminales) de una segunda proteína de la fibra de la cola. La primera y segunda proteínas de la fibra de la cola pueden ser las mismas o proteínas diferentes. En otra realización, las quimeras comprenden una porción de aminoácidos en el intervalo de los primeros 10 a 60 aminoácidos de una proteína de la fibra de la cola fusionada a una porción de aminoácidos en el intervalo de los 10 a 60 últimos aminoácidos de una segunda proteína de la fibra de la cola. En otra realización, cada porción de aminoácidos es de al menos 20 aminoácidos de la proteína de la fibra de la cola. Las quimeras comprenden porciones, es decir, proteínas de la fibra de la cola de tamaño incompleto, fusionadas a otra. En un aspecto preferido, la primera porción de proteína de la fibra de la cola de la quimera es de gp37, y la segunda porción de proteína de la fibra de la cola es de gp36. Tal quimera (quimera gp37-36), tras la oligomerización para formar P37-36, puede polimerizar hasta otros oligómeros idénticos. Una quimera gp36-34, tras la oligomerización para formar P36-34, puede unirse a gp35, y esta unidad puede polimerizar después. En otra realización, la primera porción es de gp37, y la segunda porción es de gp34. En un aspecto preferido, las quimeras de la invención están compuestas por inserciones y supresiones dentro de un giro \beta de la estructura \beta de las proteínas de la fibra de la cola. Lo más preferiblemente, las inserciones en una secuencia de la fibra de la cola, o fusionando a otra secuencia de proteína de fibra de la cola, (preferiblemente a través de la manipulación a nivel de ADN recombinante para producir la proteína codificada deseada) se realiza de modo que las secuencias en los giros \beta estén unidos en la misma cara de la lámina \beta.

Además de las quimeras descritas anteriormente, las nanoestructuras de la invención también pueden comprender construcciones de supresión de proteína de la fibra de la cola que estén truncadas en un extremo, por ejemplo, carezcan de un extremo amino o carboxilo (de al menos 5 ó 10 aminoácidos) de la molécula. Tales moléculas truncadas en el extremo amino, por ejemplo, de gp37, gp34 o gp36 truncadas, se pueden usar para "cerrar" una nanoestructura, ya que, una vez incorporadas, terminarán la polimerización. Tales moléculas comprenden preferiblemente un fragmento de una proteína de la fibra de la cola que carece de al meno los primeros 10, 20 ó 60 aminoácidos amino terminales.

Con el fin de cambiar la longitud de las proteínas componentes de varilla según se desee, se pueden insertar porciones de las mismas o distintas proteínas de la fibra de la cola en una quimera de la fibra de la cola para alargar la varilla, o eliminarse de una quimera, para acortar la varilla.

Ensamblaje de componentes varilla individuales en nanoestructuras

La expresión de la proteínas de la presente invención en E. coli como se ha descrito antes da lugar a la síntesis de grandes cantidades de proteína, y permite la expresión simultánea y el ensamblaje de diferentes componentes en las mismas células. Los procedimientos para aumentar de escala en la producción de proteínas recombinantes son sencillos y conocidos ampliamente en la técnica, y se pueden usar muchos protocolos estándar para recuperar las proteínas nativas y modificadas de la fibra de la cola a partir de un cultivo bacteriano. En una realización preferida, se aísla gp35 nativa (no recombinante) para su uso haciendo crecer un bacteriófago T4 con una mutación ámbar en el gen 36, en una cepa bacteriana suº (no un supresor ámbar), y aislando gp35 del cultivo resultante mediante procedimientos estándar.

P34, P36-P37, P37 y las quimeras derivadas de ellas se purifican a partir de cultivos de E. coli en forma de dímeros maduros. Gp35 y las variantes de la misma se purifican en forma de monómeros. La purificación se consigue mediante los siguientes procedimientos o combinaciones de los mismos, usando procedimientos estándar: 1) cromatografía en tamiz molecular, de intercambio iónico, y/o matrices hidrófobas; 2) ultracentrifugación preparativa; y 3) cromatografía de afinidad, usando como ligando inmovilizado anticuerpos específicos u otros dominios específicos de unión. Por ejemplo, el dominio C-terminal de P37 se une al lipopolisacárido de E. coli B. Otros fagos similares a T4 tienen análogos de P37 que se unen a otros componentes de la superficie celular tales como OmpF o la proteína TSX. De manera alternativa, si las proteínas se han diseñado para incluir dominios heterólogos que actúen como ligandos o sitios de unión, la pareja similar se inmoviliza sobre una matriz sólida y se usa en la purificación por afinidad. Por ejemplo, tal dominio heterólogo puede ser biotina, que se une a una fase sólida recubierta de estreptavidina.

De manera alternativa, varios componentes se coexpresan en las mismas células bacterianas, y los subensamblajes de nanoestructuras mayores se purifican con posterioridad al ensamblaje limitado in vivo, usando los procedimientos enumerados anteriormente.

Los componentes purificados se combinan después in vitro en condiciones en las que el ensamblaje de la nanoestructura deseada tiene lugar a temperaturas entre aproximadamente 4ºC y aproximadamente 37ºC, y a pH entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9. Para una nanoestructura dada, las condiciones óptimas para el ensamblaje (es decir, el tipo y la concentración de sales e iones metálicos) se determinan fácilmente por experimentación habitual, tal como cambiando cada variable individualmente y controlando la formación de los productos apropiados.

De modo alternativo, se pueden preparar uno o más extractos bacterianos brutos, mezclarse y dejar que las reacciones de ensamblaje tengan lugar antes de la purificación. En algunos casos, uno o más componentes purificados se ensamblan de forma espontánea en la estructura deseada, sin necesidad de iniciadores. En otros casos se requiere un iniciador para nuclear la polimerización de varillas o láminas. Esto ofrece la ventaja de localizar el proceso de ensamblaje (es decir, si el iniciador está inmovilizado o localizado de otro modo) y de regular las dimensiones de la estructura final. Por ejemplo, los componentes varilla que contienen un extremo C funcional de P36 necesitan un extremo N funcional de P37 para iniciar la formación de varillas de forma estequiométrica; así, al modificar la cantidad relativa de iniciador y el componente de varilla se afectará la longitud promedio del polímero varilla. Si la relación es n, la varilla promedio será aproximadamente (P37-36)_{n}-extremo N P37-P37 extremo C.

En otros casos, la nanoestructura final está compuesta por dos o más componentes que no se pueden autoensamblar de manera individual pero solamente en combinación con los otros. En esta situación, se pueden lograr ciclos alternantes de ensamblaje para producir productos finales de estructura definida de forma precisa (véase a continuación el ejemplo 6B).

Cuando se usa un iniciador inmovilizado, podría ser deseable retirar la unidad polimerizada desde la matriz tras el ensamblaje logrado. Para este propósito se diseñan iniciadores especializados de modo que la interacción con el primer componente de varilla se hace reversiblemente termolábil (véase a continuación el ejemplo 5). De este modo, el polímero se puede separar fácilmente del iniciador unido a la matriz, permitiendo con ello: 1) una fácil preparación de disoluciones de origen de partes uniformes o subensamblajes, y 2) la reutilización del iniciador unido a la matriz para múltiples ciclos de iniciación, crecimiento y liberación de polímeros.

En una realización en la que se ensambla una nanoestructura que está anclada a una matriz sólida a través de gp34 (o P34), una manera con la que separar la nanoestructura para ponerla en disolución es usar un mutante (termolábil) de gp34 que pueda estar realizado para separarse tras la exposición a una temperatura elevada (por ejemplo, 40ºC). Dicho mutante gp34, denominado T4 tsB45, que tiene una mutación en su extremo C-terminal de modo que P34 se ancla a la mitad distal de la fibra de la cola a 30ºC, pero se puede separar de él in vitro mediante incubación a 40ºC en presencia de SDS al 1% (a diferencia de los T4 naturales que son estables en esas condiciones), ha sido publicado (Seed, 1980, Studies of the T4 Bacteriophage Proximal Half Tail Fiber, Tesis Doctoral, California Institute of Technology), y se puede usar.

Las proteínas que catalizan la formación de la estructura secundaria (2ª) correcta (de menor energía) estable de proteínas se denominan proteínas chaperonas. (A menudo, especialmente en las proteínas globulares, esta estabilización está auxiliada por la estructura terciaria, por ejemplo, la estabilización de láminas \beta mediante su interacción en barriles \beta o mediante la interacción con hélices á). Normalmente las chaperoninas previenen las interacciones intracatenarias o intercatenarias que producirían intermedios metastables adversos de plegamiento y previenen o retrasan el plegamiento adecuado. Hay dos proteínas accesorias conocidas, gp57 y gp38, en la morfogénesis de las fibras de la cola del fago T4 que se denominan a veces chaperoninas ya que son esenciales para la maduración adecuada de los oligómeros proteicos pero que no están presentes en las estructuras finales.

El sistema habitual de chaperoninas (por ejemplo, groEL/ES) interacciona con determinados resto oligopeptídicos del producto génico para prevenir interacciones indeseadas con restos oligopeptídicos en otro sitio sobre el mismo polipéptido u otro péptido. Esto formaría intermediarios metastables de plegamiento que retrasen o prevengan el plegamiento adecuado del polipéptido hacia su estado nativo (de menor energía).

Gp57, probablemente junto con alguna(s) proteína(s) de membrana, tiene la función de yuxtaponer (y alinear) y/o hincar el plegamiento de 2 ó 3 moléculas gp37 idénticas. Los péptidos alineados se cierran después en cremallera (mientras estabilizan mutuamente sus estructuras \beta emergentes) para formar una barra, sin posterior interacción con gp57. Gp57 actúa en el ensamblaje de T4 no sólo para la oligomerización de gp37 sino también para gp34 y gp12.

Componentes estructurales para el autoensamblaje de barras in vitro

De manera alternativa a comenzar la polimerización de las quimeras con el uso de una unidad oligomérica natural o quimérica preformada denominada iniciador producido in vivo, las moléculas que se pueden autoensamblar (preferiblemente péptidos) se pueden producir como proteínas de fusión, fusionadas al extremo N o C de variantes de la fibra de la cola de la invención (quimeras, construcciones de eliminación/inserción) para alinear sus extremos y facilitar así su posterior plegamiento in vitro sin ayuda en unidades plegadas en \beta similares a las varillas (barra) oligoméricas estables, en ausencia de las proteínas chaperoninas normalmente requeridas (por ejemplo, gp57) y proteínas de membrana de la célula huésped.

A modo de ilustración, considérese la unidad P37 como un iniciador de la oligomerización y polimerización de gp37-36. Normalmente, el plegamiento adecuado de gp37 a un iniciador P37 requiere que un fago infecte la membrana celular, y dos proteínas chaperonas, gp38 y gp57. En una realización preferida, se puede obviar la necesidad de gp35 con el uso de una mutación, ts3813 (una duplicación de 7 residuos justo corriente debajo de la zona de transición de gp37) que suprime el gen 38 (Wood, W.B., F.A. Eiserling y R.A. Crowther, 1994, "Long Tail fibers: Genes, Proteins, Structure, and Assembly," en Molecular Biology of T4 bacteriophage, (Jim D. Karam, Editor) American Society for Microbiology, Washington, D.C., páginas 282 a 290). Si un resto que se autoensambla en un dímero o un trímero u otro oligómero ("resto de autoensamblaje") se fusiona a una eliminación en el extremo C de gp37 corriente abajo o corriente arriba de la región de transición [la región de transición es una región de 17 residuos aminoacídicos conservados en proteínas de la fibra de la cola de tipo T4 en la que la estructura de la proteína se estrecha hasta una fina fibra; véase Henning y col., 1994, "Receptor recognition by T-even-type coliphages" en Molecular Biology of T4 bacteriophage, Karam (editor), American Society for Microbiology, Washington, D.C., páginas 291 a 298; Wood y col., 1994, "Long tail fibers: Genes, proteins, structure, and assembly," en Molecular Biology of T4 bacteriophage, Karam (editor), American Society for Microbiology, Washington, D.C., páginas 282 a 290], cuando se expresa, el resto de autoensamblaje oligomerizará en paralelo y alineará así los péptidos gp37 fusionados, permitiéndoles plegarse in vitro, en ausencia de otras proteínas chaperoninas.

Si P37 es un dímero (figura 8A), el resto de autoensamblaje puede ser un péptido autodimerizante tal como la cremallera de leucinas, compuesta por los residuos 250 a 281 de factor de transcripción de levaduras GCN4 (E. K. O'Shea, R. Rutkowski y P. S. Kim, Science 243:538, 1989) o el péptido autodimerizante mutante de la cremallera de leucinas, pIL en el que las posiciones a están sustituidas por isoleucina y las posiciones d por leucina (Harbury P. B., T. Zhang, P. S. Kim y T. Alper. 1993. A Switch Between Two-, Three-, y Four-Stranded Coiled Coils in GCN4 Leucine Zipper Mutants. Science, 262: 1401-1407). Si P37 es un trímero (figura 8B), el resto de autoensamblaje puede ser un péptido mutante autotrimerizantes de la cremallera de leucinas, pll en el que las posiciones a y d están sustituidas por isoleucina (Harbury P. B., y col. ibid). De manera alternativa, se puede usar un péptido de colágeno como resto de autoensamblaje, tal como el descrito por Bella y col. (J. Bella, M. Eaton, B. Brodsky y H.M. Berman. 1994. Crystal y Molecular structure of a Collagen-Like Peptide at 1.9\ring{A} Resolution. Science, 226:75-81), que se autoalinea mediante un residuo específico de alanina insertado no repetitivo cerca del centro.

Los restos de autoensamblaje se pueden usar para preparar iniciadores para polimerizaciones en ausencia de los iniciadores normales. Por ejemplo, para crear un iniciador para la oligomerización y polimerización, del monómero quimérico gp37-36, se puede usar gp37-36-C_{2}, como se ilustra en la figura 9. (C_{2} significa que un péptido formador de dímeros se fusiona con el extremo C del resto gp36. Esto se usa si la barra es una estructura dimérica. Por otro lado se podría usar C_{3}, un péptido formador de trímeros fusionado con el extremo C). Por lo tanto, el uso del extremo N del represor lac de E. coli, por ejemplo, que se asocia en forma de un tetrámero, con dos enrollamientos apuntando en cada dirección, podría unir dos dímeros (o polímeros de dímeros) entre extremos, bien en sus extremos N o C, dependiendo de qué extremo de los péptidos de autoensamblaje se pusiera. También podría unir extremos N con C. En cualquier caso, solos podrían forman solamente un dímero, cada extremo de los cuales sería extensible añadiendo un apropiado monómero quimérico (como se muestra para el caso más simple en la figura 9).

En una realización alternativa, el resto de autoensamblaje se puede fusionar a los extremos N de la quimera. En una realización específica, el resto de autoensamblaje se fusiona con al menos una porción de 10 aminoácidos de una proteína de la fibra de la cola de la serie T-par.

También se puede usar un resto de autoensamblaje que se ensamble en un heteroligómero. Por ejemplo, si la polimerización entre barras se dirige por la superficie de una superficie de cruz \beta dimérica, la adición de una unidad heterodimérica con una superficie que no promueva la posterior polimerización sería útil para cerrar la penúltima unidad y terminar así la polimerización. Si los dos tipos de regiones enrolladas del resto del autoensamblaje son mucho más atractivos a los otros que a sí mismos, entonces todos los dímeros serán heterodímeros. Tal es el caso de las regiones N-terminales de cremallera de leucinas de Jun y Fos.

Una ventaja adicional a tales unidades heterodiméricas es la capacidad para lograr la polimerización y construir así una unidad (o una superficie en un matriz 2D) al mismo tiempo. Por ejemplo, se supone que superficie de A se ancla a B pero no se ancla a sí misma (se usa [A<->B] para simbolizar este tipo de interacción). Se mezclan A/A y B/B_{o} (B_{o} está anclado a una matriz para facilitar la purificación). Esto formará B_{o}/B-A/A. Ahora se lava A/A y se añade B/B. La construcción es ahora B_{o}/B-A/A-B/B. A continuación se añade A/A_{o}. La construcción es ahora B_{o}/B-A/A-B/B-A/A_{o} y no se pueden añadir más barras. Por supuesto, existen más posibilidades.

Aplicaciones

Los usos de las nanoestructuras de la presente invención son numerosos e incluyen aplicaciones que requieren conjuntos bien definidos y muy regulares de fibras, celdas o sólidos, que pueden incluir sitios específicos de anclaje que les permitan asociarse con otros materiales.

En una realización, se usa un conjunto hexagonal tridimensional de tubos como filtro o tamiz molecular, proporcionando poros verticales regulares de diámetro preciso para la separación selectiva de partícula en función del tamaño. Tales filtros se pueden usar para esterilización de disoluciones (es decir, para eliminar microorganismos o virus), o como una serie de filtros de peso molecular límites. En este caso, los componentes proteicos de los poros se pueden modificar para proporcionar propiedades específicas de superficie (es decir, hidrofilia o hidrofobia, capacidad para unir ligandos específicos, etc.). Entre las ventajas de este tipo del dispositivo de filtración es la uniformidad y linealidad de los poros y la elevada relación de poro a matriz.

En otra realización, se incorporan fibras unidimensionales largas, por ejemplo, en papel o cemento o plástico durante la fabricación, para proporcionar una resistencia adicional a la tracción seca y húmeda.

En otra realización más, se impregnan diferentes conjuntos de nanoestructuras en papel y tejido como para comprobar el origen del material. De manera alternativa, tales conjuntos de nanoestructuras podrían unir colorantes u otras sustancias, bien antes o después de la incorporación para colorear el papel o el tejido o modificar su apariencia o propiedades de otras maneras.

Equipos

La invención proporcionar también equipos para preparar nanoestructuras, que comprenden la quimera y las construcciones de eliminación de la invención en uno o más recipientes. Por ejemplo, uno de dichos equipos comprende gp35 purificada y la quimera gp36-34 purificada en uno o más recipientes. Otro de dichos equipos comprende la quimera gp37-36 purificada.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la presente invención sin limitar su alcance.

En los siguientes ejemplos, todas las enzimas de restricción, nucleasas, ligasas, etc. están disponibles comercialmente de numerosos distribuidores comerciales, tales como New England Biolabs (NEB), Beverly, MA; Life Technologies (GIBCO-BRL), Gaithersburg, MD; y Boehringer Mannheim Corp. (BMC), Indianapolis, IN.

Ejemplo 1 Diseño, construcción y expresión de p37 suprimida interiormente

El gen que codifica gp37 contiene dos sitios para la enzima de restricción Bgl II, ocurriendo la primera escisión después del nucleótido 293 y la segunda después del nucleótido 1486 (los nucleótidos se numeran desde el codón iniciador ATG de metionina) Así, la digestión de un fragmento de ADN que codifica gp37 con Bglll, la escisión del fragmento interviniente (nucleótidos 294 a 1485) y la religación de los fragmentos 5' y 3' da lugar a la formación de una gp37 suprimida interiormente, denominada AP37, en la que la arginina 98 está unida con la serina 497.

La mezcla de reacción de digestión de la restricción contiene:

\newpage

AND plasmídico de gp37 (1 ng/\mul)	2 \mul
Tampón NEB nº2 (10X)	1 \mul
H_{2}O	6 \mul
Bgl II (10 U/\mul)	1 \mul

El plásmido gp37 significa un plásmido pT7-5 en el que se ha insertado el gen 37 en el sitio de clonación múltiple, corriente debajo de un buen sitio de unión al ribosoma y del gen 57 para favorecer la dimerización. La reacción se incuba durante 1 h a 37ºC. Luego se añaden 89 \mul del tampón para ADN ligasa T4 y 1 \mul de ADN ligasa T4, y se continúa la reacción a 16ºC durante 4 horas. Después se añaden 2 \mul de la enzima de restricción Stu I, y continúa la incubación a 37ºC durante 1 h. (La enzima de restricción Stu I digiere plásmidos residuales que no fueron cortaron por Bgl II en la primera etapa, reduciendo su capacidad de transformación en aproximadamente 100 veces).

La mezcla de reacción se transformó después en E. coli, cepa BL21, obtenido de Novagen, usando procedimientos estándar. La mezcla de transformación se sembró en placas sobre agar nutriente mixture que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, y las placas se incubaron durante la noche a 37ºC.

Se picaron las colonias que aparecieron tras la incubación durante la noche, y se extrajo el ADN plasmídico y se digirió con Bgl II como antes. Los extractos de restricción se resolvieron por geles de agarosa al 1%. Por la aparición de un nuevo fragmento de ADN de 4,2 kpb tras electroforesis en gel se hace evidente una eliminación satisfactoria, que representa la parte sin eliminar del gen 37 que aún está incluido en el plásmido y que formó de nuevo un sitio para Bgl ll mediante ligación. El fragmento de ADN de 1,2 kpb unido a los sitios para Bgl ll en el gen original ya no está en el plásmido y por tanto no aparece en el gel.

Los plásmidos seleccionados para la eliminación predicha según lo expresado anteriormente se transformaron en E. coli, cepa BL21(DE3). Los transformantes se crecieron a 30ºC hasta que la densidad (A_{600}) del cultivo alcanzó 0,6. Después se añade IPTG hasta una concentración final de 0,4 mM y se continúa la incubación a 30ºC durante 2 horas, tras lo cual se enfrían los cultivos sobre hielo. Luego se retiran 20 \mul del cultivo y se añaden a 20 \mul de un "tampón de rotura" doblemente concentrado que contenía dodecilsulfato sódico al 1% glicerol y colorante de seguimiento. Se cargan 15 \mul de esta disolución en un gel de poliacrilamida al 10%; primero se incuba una segunda alícuota de 15 \mul en un baño de agua hirviendo durante 3 minutos y luego se carga en el mismo gel. Tras la electroforesis, se fija el gel y se tiñe. La expresión de la gp37 suprimida se muestra por la aparición de una especie proteica que migra a una masa molecular aparente de 65-70.000 dalton en la muestra hervida. La extensión de la dimerización se sugiere por intensidad de la especie de mayor masa molecular en la muestra sin hervir y/o por la desaparición de la banda de proteína de 65-70.000 dalton.

La capacidad del polipéptido suprimido para dimerizar de manera apropiada se evalúa directamente probando su capacidad para ser reconocido por un antisuero anti-P37 que reaccione solamente con los dímeros de P37 maduros, usando un procedimiento estándar de inmunotransferencia de proteínas.

Un ensayo alternativo para la dimerización funcional del polipéptido P37 suprimido (también mencionado como \DeltaP37) es su capacidad para complementar in vivo a un fago T4 37^{-}, induciendo primero la expresión del \DeltaP37 e infectando luego con el mutante T4, y detectando la progenie del fago.

Se preparó un \DeltaP37 como se ha descrito antes, y se descubrió capaz de complementar a un fago T4 37^{-} in vivo.

Ejemplo 2 Diseño, construcción y expresión de una quimera gp37-36

El plásmido de partida para esta construcción es uno en el que el gen que codifica gp37 está clonado inmediatamente corriente arriba (es decir, 5') del gen que codifica gp36. El plásmido se digiere con Hae III, que suprime la región 3' completa del ADN de gp37 ADN corriente abajo del nucleótido 724 hasta el extremo 3', y retira también el extremo 5' del ADN de gp36 desde el extremo 5' hasta el nucleótido 349. La mezcla de reacción es idéntica a la descrita en el ejemplo 1, excepto que se usa un ADN plasmídico diferente, y que la enzima es HaeIII. La ligación usando la ADN ligasa de T4, la transformación bacteriana y el análisis de restricción se realizan también como en el ejemplo 1. En este caso, la escisión de la porción central del inserto del gen 37-36 y la religación revela un nuevo inserto de 346 codones en fase, que se corta solamente una vez por HaeIII (tras el nucleótido 725). La construcción resultante se expresa después en E. coli BL21 (DE3) según se describe en el ejemplo 1.

La expresión satisfactoria de la quimera gp37-36 se muestra por la aparición de un producto proteico de aproximadamente 35.000 dalton. Esta proteína tendrá los primeros 242 aminoácidos N-terminales de gp37 fusionados a los últimos 104 aminoácidos C-terminales de gp36 (numerados 118 a 221.) La utilidad de esta quimera depende de su capacidad para dimerizar y unirse de extremo a extremo. Es decir, los extremos carboxilo de dicho polipéptido tendrán la capacidad de interaccionar con el extremo amino del dímero proteico P37 del bacteriófago T4 y formar un dímero fijado, y el extremo amino del dímero de dicho polipéptido tendrá la capacidad de interaccionar con otros de dichos polipéptidos quimera. Esta propiedad se puede probar analizando si la introducción de \DeltaP37 inicia la dimerización y la polimerización. De manera alternativa, se pueden usar anticuerpos policlonales específicos para el dímero P36, para detectar P36 tras el inicio de la dimerización por \DeltaP37.

Se preparó una quimera gp37-36 de manera similar a los procedimientos descritos anteriormente, excepto que se uso la enzima de restricción TaqI en lugar de HaeIII. De manera concisa, el fragmento 5' resultante de la digestión con TaqI del gen 37 se ligó al fragmento 3' resultante de la digestión con TaqI del gen 36. Esto produjo una construcción que codificaba una quimera gp37-36 en la que los aminoácidos 1 a 48 de gp37 estaban fusionados a los aminoácidos 100 a 221 de gp36. Esta construcción se expresó en E. coli BL21 (DE3), y la quimera se detectó como una proteína de 18 kDa. Se descubrió que esta quimera gp37-36 inhibía el crecimiento de T4 natural cuando la expresión de la quimera gp37-36 se inducía antes de la infección (en un ensayo in vitro de inhibición de fago).

Ejemplo 3 Mutación de la quimera gp37-36 para producir supresores complementarios

La meta de esta construcción es producir dos variantes de una quimera dimerizable P37-36: una en la que el extremo N del polipéptido está mutado (A, denominado *P37-36) y una en la que el extremo C del polipéptido está mutado (B, denominado P37-36*). El requerimiento es aquel en el que el extremo N mutado de *P37 no puede formar una unión con el extremo C natural de P36, sino sólo con el extremo N de *P36. La razón fundamental es que A y B no pueden polimerizar cada uno de forma independiente (como puede hacerlo la proteína original P37-36), sino que solamente puede asociarse con cada otro de forma secuencial (es decir, P37-36* + *P37-36 - -> P37-36*-*P37-36).

Una segunda construcción, *p37-P36*, se forma recombinando *P37-36 y P37-36* in vitro. Cuando los monómeros *gp37-36* y gp37-36 se mezclan en presencia del iniciador P37, gp37-36 dimerizaría y polimerizaría hasta (P37-36)_{n}; de manera similar, *P37 catalizaría solamente la polimerización de *gp37-36* hacia (*P37-36*)_{n}. En este caso, las dos quimeras podrían ser de distinto tamaño y distinta secuencia primaria con diferentes interacciones potenciales de grupos laterales, y podría iniciar la unión a diferentes superficies dependiendo de la especificidad de unión de P37.

La cepa bacteriana de partida es una cepa suº de E. coli (que carece de la capacidad para suprimir las mutaciones ámbar). Cuando esta cepa se infecta con un bacteriófago T4 mutante que contiene mutaciones ámbar en los genes 35, 36 y 37, la replicación del fago es incompleta, pues las proteínas de la fibra de la cola no se pueden sintetizar. Cuando esta cepa se transforma primero con un plásmido que dirige la expresión de los genes naturales gp35, gp36 y gp37 y se induce con IPTG, y se infecta posteriormente con el fago mutante, se producen las partículas del fago infeccioso; esto se hace evidente por la aparición de colonias "mordidas". Las colonias mordidas no parecen redondas, con bordes lisos, pero en cambio tienen zonas que faltan. Esto es producido por el ataque de una microcolonia mediante un solo fago, que se replica e impide el crecimiento de las bacterias en la zona que falta.

Para los propósitos de esta construcción, se ha realizado mutagénesis a la región 3' terminal del gen 36 (correspondiente a la región C-terminal de gp36), con oligonucleótidos dopados de forma aleatoria. Los oligonucleótidos dopados de manera aleatoria se preparan durante la síntesis química de oligonucleótidos, añadiendo una cantidad traza (hasta un pequeño porcentaje) de los otros tres nucleótidos en una posición dada, de modo que la mezcla resultante de oligonucleótidos tenga un pequeño porcentaje de nucleótidos incorrectos en esa posición. La incorporación de tales oligonucleótidos en el plásmido dará lugar a mutaciones aleatorias (Hutchison y col., Methods. Enzymol. 202:356, 1991).

La población mutada de plásmidos (que contienen, sin embargo, los genes 36 y 37 sin modificar) se transforma después en las bacterias suº, seguida de la infección con el fago T4 mutante como antes. En este caso, la aparición de colonias no "mordidas" indica que los extremos C mutados de gp36 ya no pueden interaccionar con P37 natural para formar las fibras de la cola funcionales. Los posibles fenotipos de gp36* encontrados en tales colonias no mordidas se analizaron en busca de la ausencia de los extremos N diméricos mediante la inmunoespecificidad apropiada, como se expuso anteriormente, y se usan las colonias positivas como fuente de plásmidos para la siguiente etapa.

Varios de estos plásmidos mutados se recuperaron y se sometieron a una segunda ronda de mutagénesis, esta vez usando oligonucleótidos dopados que introducen mutaciones aleatorias en la región N-terminal de gp37 presente sobre el mismo plásmido. De nuevo, los plásmidos (ahora doblemente) sometidos a mutagénesis se transforman en la cepa supo de E. coli y los transformantes se infectan con el fago T4 mutante. En esta etapa, las placas bacterianas se analizaron para la reaparición de colonias "mordidas". Una colonia mordida en esta etapa indica que el fago se ha replicado debido a la supresión de la(s) mutación(es) no funcionales de gp36* por la mutación *P37. Con otras palabras, tales colonias deben contener nuevos polipéptidos *P37 que ahora hayan adquirido la capacidad de interaccionar con las proteínas P36* codificadas en el mismo plásmido.

Las quimeras supresoras apareadas *P37-36 y P37-36* (A y B como antes) se construyeron después del mismo modo que el descrito en el ejemplo 2. Sin embargo, en este caso se usa *P37 en lugar del P37 natural y P36* se usa en lugar del P36 natural. Una quimera *P37-36* se puede preparar ahora mediante la restricción de *P37-36 y P37-36* y la religación en el orden recombinado. La *P37-36* se puede mezclar con la quimera P37-36, y la polimerización de cada una se puede llevar a cabo de manera independiente en presencia del resto. Esto es útil cuando la porción central similar a las varillas de estas quimeras ha sido modificada de distintas maneras.

Ejemplo 4 Diseño, construcción y expresión de una quimera gp36-34

El plásmido de partida para esta construcción es uno en el que el vector que contiene el gen 57 y el gen que codifica gp36 está clonado inmediatamente corriente arriba (es decir, 5') del gen que codifica gp34. El plásmido se digiere con NdeI, que corta después de 219 pb del gen 36 y después de 2594 pb del gen 34, suprimiendo con ello los últimos 148 codones C-terminales del resto gp36 y los primeros 865 codones N-terminales del resto gp34. La mezcla de reacción es idéntica a la descrita en el ejemplo 1, excepto que se usa un ADN plasmídico diferente, y que la enzima es NdeI (NEB). La ligación usando la ADN ligasa de T4, la transformación bacteriana y el análisis de restricción se realizan también como en el ejemplo 1. Esto da lugar a un nuevo gen híbrido que codifica una proteína de 497 aminoácidos (73 aminoácidos N-terminales de gp36 y 424 aminoácidos C-terminales de gp34, numerados 866 a 1289).

Como alternativa, el plásmido de partida se corta con SphI a 648 pb en el gen 34, y se usa el equipo para supresión Exo-Size (NEB), para crear eliminaciones como se ha descrito antes.

La construcción resultante se expresa después en E. coli BL21 (DE3) según se describe en el ejemplo 1. La expresión satisfactoria de la quimera gp36-34 se muestra por la aparición de un producto proteico de aproximadamente 55.000 dalton. Preferiblemente, los extremos amino del homodímero polipeptídico tienen la capacidad de interaccionar con la proteína gp35, y luego los extremos carboxilo tienen la capacidad de interaccionar con otras moléculas gp35 unidas. La formación satisfactorias del dímero se puede detectar mediante la reacción con anticuerpos anti-P36 o por la unión de gp35 o mediante el ensayo de inhibición de fagos in vitro descrito en el ejemplo 2.

Ejemplo 5 Aislamiento de proteínas termolábiles para autoensamblaje

Las estructuras termolábiles se pueden utilizar en nanoestructuras para: a) el inicio de la polimerización de quimeras (por ejemplo, gp37-36) a baja temperatura y la consiguiente inactivación de y separación del iniciador a temperatura elevada; b) el inicio de la formación del ángulo entre P36 y gp35 (por ejemplo, variantes de gp35 que tienen sitios de unión termolábiles para extremos N de P36 o extremos C de P34, una variante de P36 que forma una unión termolábil con gp35, y una variante de P34 con un sitio de unión C-terminal termolábil). La termolabilidad puede ser reversible, permitiendo la reconexión de los extremos apropiados cuando se restituye la temperatura inferior, o puede ser irreversible.

Para crear una variante de gp37 que permita la separación termoinducida de la unión P36 - P37, se somete a mutagénesis aleatoria el extremo 5' del ADN de gp37 usando oligonucleótidos dopados como se han descrito antes. El fragmento de ADN sometido a mutagénesis se recombina después en un fago T4 mediante infección de la célula que contenía el ADN sometido a mutagénesis por un fago T4 que contenía dos mutaciones ámbar flanqueando la región sometida a mutagénesis. Después de una infección de baja multiplicidad, se seleccionan los fagos no ámbar a baja temperatura en E. coli Suº a 30ºC. La progenie de estas placas se resuspende en tampón y se prueban por calentamiento a 60ºC. A esta temperatura, las fibras de la cola naturales permanecen intactas y funcionales, mientras que las versiones termolábiles liberan las unidades P37 terminales y hacen así a estos fagos no infecciosos.

En esta etapa, el fago natural se elimina: 1) adsorbiendo el fago natural a bacterias sensibles y sedimentando (o filtrando) las bacterias con el fago natural adsorbido; o 2) haciendo reaccionar el lisado con el anticuerpo anti-P37, seguido de la proteína A inmovilizada y eliminación del fago natural adsorbido. Cualquiera de estos procedimientos deja a las partículas del fago mutante no infeccioso en el líquido sobrenadante o filtrado, desde el cual se pueden recuperar. Los fagos no infecciosos que carecen de los restos P37 terminales (y probablemente el resto de las fibras de las cola también) se tratan después con urea 6 M, y se mezclan con esferoplastos bacterianos para permitir la infección a baja multiplicidad con lo cual se replican a baja temperatura y liberan la progenie. De manera alternativa, los fagos infecciosos se reconstituyen por incubación in vitro del fago mutante con la P37 natural a 30ºC; a esto le sigue la infección de células bacterianas intactas usando el protocolo estándar. El último procedimiento de infección selecciona de manera específica los fagos mutantes en los que la termolabilidad de la unión P36-P37 es reversible.

Usando cualquier procedimiento, se someten las poblaciones de fagos a múltiples rondas de selección como las anteriores, tras lo cual se aíslan partículas de fagos individuales mediante purificación en placa a 30ºC. Por último, los posibles mutantes se evalúan de manera individual para las siguientes características: 1) pérdida de infectividad tras la incubación a altas temperaturas (40-60ºC), medida por el descenso en la valoración; 2) pérdida de P37 tras la incubación a alta temperatura, mediada por el descenso en la unión del anticuerpo específico para P37 a las partículas del fago; y 3) cambios morfológicos en las fibras de la cola tras la incubación a altas temperaturas, evaluados por microscopia electrónica.

Después de aislarse los mutantes y confirmar sus fenotipos, se secuenció el gen P37. Si las mutaciones se localizan en regiones o residuos concretos, estas secuencias se seleccionan para mutagénesis dirigida a sitio para optimizar las características deseadas.

Por último, el gen mutante 37 se clona en plásmidos de expresión y se expresa individualmente en E. coli como en el ejemplo 1. Los dímeros P37 mutantes se purifican después a partir de extractos bacterianos y se usa en las reacciones de ensamblaje in vitro.

De un modo similar, se pueden aislar los polipéptidos gp35 mutantes que exhiban una interacción termolábil con el extremo N de P36 o el extremo C de P34. Para la interacción termolábil con P34, se incuban fagos a alta temperatura, dando lugar a la pérdida de la mitad distal completa de la fibra de la cola (es decir, gp35-P36-P37). La única diferencia en el protocolo experimental es que, en este caso, 1) la mutagénesis aleatoria se realiza sobre el gen gp35 completo; 2) los fagos naturales (y las mitades distales de las fibras de los mutantes termolábiles) se separan de los fagos mutantes termolábiles que se han inactivado a alta temperatura (pero que aún tienen unida la mitad proximal de las fibras de las cola) precipitando ambas mitades distales de las fibras y las partículas del fago que contienen fibras de la cola intactas con cualquier anticuerpo anti-mitad distal de la fibra de la cola seguido de perlas con la proteína A estafilocócica; 3) los fagos mutantes que permanecen en el sobrenadante se reactivan por incubación a baja temperatura con extractos bacterianos que contienen las mitades distales de las fibras intactas naturales; y 4) se pueden analizar cepas de mutantes termolábiles del gen 35 crecidos a 30ºC para termolabilidad reversible mediante la inactivación a 60ºC y reincubación a 30ºC. La inactivación se realiza en una suspensión concentrada de fagos, y la reincubación a 30ºC se realiza bien antes o bien después de la dilución. Si los fagos se reactivan satisfactoriamente antes, pero no después de la dilución, esto indica que su gp35 es reversiblemente termolábil.

Para crear una mutación en el gen 36 con una conexión gp35-P36 termolábil, se somete a mutagénesis el extremo C del gen 36 como se ha descrito anteriormente, y se selecciona el mutante para reversibilidad. Una alternativa es someter a mutagénesis a gp35 para crear un gen 35 mutante en el que la conexión gp35-P36 se disociará a 60ºC. En este caso, se puede usar la incubación con anticuerpos anti-gp35 para precipitar los fagos sin P36-P37 y separarlos de este modo de los fagos naturales y las mitades distales de las fibras de la cola (P36-P37), ya que la variante gp35 se mantendría unida a P34.

Ejemplo 6 Ensamblaje de rods unidimensionales

A. Ensamblaje simple: La quimera P37-36 descrita en el ejemplo 2 es capaz de autoensamblarse, pero requiere un iniciador P37 para unir la primera unidad de la varilla. Por tanto, un dímero P37 o \DeltaP37 está unido bien a una matriz sólida o está libre en disolución para servir como iniciador. Si el iniciador está unido a una matriz sólida, se usa preferiblemente un dímero P37 termolábil. La adición de un extracto que contiene gp37-36, o la quimera gp37-36 purificada, da lugar al ensamblaje de multímeros lineales de longitud creciente. En el caso de la matriz unida, las varillas finales se liberan mediante una breve incubación a temperatura elevada (40-60ºC, dependiendo de las características de la variante P37 termolábil particular).

La relación de iniciador a gp37-36 se puede variar, y la distribución de tamaños de las varillas se mide por cualquiera de los siguientes procedimientos: 1) Cromatografía de exclusión por tamaño; 2) Aumento de la viscosidad de la disolución; y 3) Medida directa mediante microscopia electrónica.

B. Ensamblaje por etapas: Las variantes de P37-36, *P37-36 y P37-36*, descritas en el ejemplo 3 no pueden autopolimerizar. Esto permite el ensamblaje por etapas de varillas de longitud definida, de acuerdo con el siguiente protocolo:

1.: Se une el iniciador P37 (preferiblemente termolábil) a una matriz.

2.: Se añade *gp37-36 en exceso para unirse y oligomerizar como homooligómeros P37-36 al extremo N de P37.

3.: Se lava la *gp37-36 sin reaccionar y se llena con gp37-36*.

4.: Se lava la gp37-36* sin reaccionar y se llena con *gp37-36 en exceso.

5.: Se repiten las etapas 2 a 4, n-1 veces.

6.: Se libera el ensamblaje de la matriz mediante una breve incubación a temperatura elevada como se ha descrito antes.

Las dimensiones lineales de las proteínas varilla en la serie dependerán de las longitudes de las heteroquimeras unidad y el número de ciclos (n) de adición. Este procedimiento tiene la ventaja de asegurar una absoluta reproducibilidad de la longitud de la varilla y una distribución homogénea y monodispersa de tamaños de una preparación a la otra.

Ejemplo 7 Ensamblaje escalonado de polígonos

La siguiente estrategia de ensamblaje utiliza gp35 como junta en ángulo para permitir la formación de polígonos. Para el propósito de este ejemplo, se supone que el ángulo formado por gp35 es 137º. La varilla unitaria comprende la quimera P36-34 descrita en el ejemplo 4, que es incapaz de autopolimerización. El homodímero P36-34 se prepara a partir de un clon bacteriano en el que se expresan tanto gp36-34 como gp57. La gp57 puede auxiliar la homodimerización de gp36-34 a P36-34.

1.: Iniciador: La mitad distal incompleta de la fibra P36-37 está unida a una matriz sólida mediante el extremo C de P37. Después se añade gp35 termolábil, como se describe en el ejemplo 5, para formar el iniciador intacto.

2.: Se añade quimera P36-34 para unir una única P36-34. Después de la unión a la matriz a través de gp35, se lava la quimera sin unir.

3.: Después se añade en exceso gp35 natural (es decir, no termolábil). Tras la incubación, se lava el material sin unir.

4.: Se repiten las etapas 2 y 3, 7-8 veces.

5.: El ensamblaje se libera de la matriz mediante una breve incubación a temperatura elevada.

La varilla polimérica liberada, de 8 unidades de longitud, formará un polígono regular de 8 lados, cuyos lados comprenden el dímero P36-34 y cuyas uniones comprenden el monómero natural gp35. Sin embargo, habrá algunos multímeros de estas 8 unidades unidas como hélices. Cuando una unidad no cierra, pero en cambio añade otra a su extremo, la unidad no puede cerrar más y la hélice puede construir en cualquier dirección. La dirección de la primera superposición también determina el sentido de giro de la hélice. Diez (o siete) varillas unitarias pueden formar hélices más frecuentemente que polígonos ya que sus ángulos naturales son 144º (ó 128,6º). La probabilidad de cierre de un polígono regular no depende solamente del ángulo promedio de gp35 sino también de su flexibilidad, que se puede manipular además mediante modificación genética o ambiental.

El tipo de polígono que se forma usando este protocolo depende de la longitud de las varillas unitarias y el ángulo formado por la junta en ángulo. Por ejemplo, en la etapa 2 se pueden usar varillas unitarias alternativas de diferentes tamaños. Además, se pueden usar polipéptidos gp35 variantes que forman ángulos diferentes del ángulo natural de 137º, permitiendo la formación de diferentes polígonos regulares. Por lo tanto, para un polígono dado con un número par de lados y ángulos iguales, los lados en cualquier mitad pueden ser de cualquier tamaño siempre que las dos mitades sean simétricas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Goldberg, Edward B.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MATERIALES PARA LA PRODUCCIÓN DE ESTRUCTURAS NANOMÉTRICAS Y SU USO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORREO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Pennie and Edmonds

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 1155 Avenue of the Americas

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: US

\vskip0.500000\baselineskip

(F): C.P.: 10036

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: Sin asignar

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE RADICACIÓN: 13-OCT-1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Misrock, S. Leslie

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 18.872

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 8471-0005-999

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (212) 790-9090

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FAX: 212-869-8864

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX: 66441 PENNIE

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8855 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Bacteriófago T4

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: GENES DE LA FIBRA DE LA COLA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1289 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Bacteriófago T4

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: p34 aminoácido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº2:

6

7

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 65 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Bacteriófago T4

\vskip0.800000\baselineskip

: (vii) FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: ORF X aminoácido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº3:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 295 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Bacteriófago T4

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: p35 aminoácido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº4:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 221 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Bacteriófago T4

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: p36 aminoácido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº5:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1026 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Bacteriófago T4

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: p37 aminoácido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº6:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

16

Claims

1. Un polipéptido aislado que está compuesto esencialmente por la proteína gp37 de la fibra de la cola del bacteriófago T4 que carece de los aminoácidos 99 a 496 (ID SEC Nº 6), cuando se numeran desde el extremo amino, en el que dicho polipéptido tiene la capacidad de formar oligómeros e interaccionar con el oligómero de la proteína P36 del bacteriófago T4.

2. Un polipéptido aislado que está compuesto esencialmente por una proteína de fusión entre las proteínas gp36 y gp37 del bacteriófago T4, en el que los residuos aminoacídicos 1 a 242 de gp37 (ID SEC Nº 6) están fusionados en el adecuado marco de lectura con los residuos aminoacídicos 118 a 221 de gp36 (ID SEC Nº 5).

3. El polipéptido de la reivindicación 2 en el que una pluralidad de extremos carboxilo de dicho polipéptido tienen la capacidad de interaccionar con el extremo amino del oligómero de la proteína P37 del bacteriófago T4 y para formar un oligómero fijado y los extremos amino del oligómero de dicho polipéptido tienen la capacidad de interaccionar con los extremos carboxilo de los polipéptidos gp36 del bacteriófago T4.

4. Un oligómero polipeptídico aislado que está compuesto esencialmente por una proteína P37 modificada de un bacteriófago de la serie T-par, en el que la proteína P37 modificada está modificada en el extremo amino terminal de la misma de modo que dicho oligómero carece de la capacidad de interaccionar con los extremos carboxilo de los polipéptidos gp36 de un bacteriófago de la serie T-par.

5. Un polipéptido aislado que está compuesto esencialmente por una variante de la proteína gp36 de un bacteriófago de la serie T-par, en el que una proteína gp36 está modificada en el extremo amino terminal de la misma para formar la variante tal que dicho polipéptido carezca de la capacidad de interaccionar con el extremo amino del oligómero de la proteína P37 de un bacteriófago de la serie T-par.

6. Un polipéptido aislado que está compuesto esencialmente por una proteína de fusión entre las proteínas gp36 y gp34 del bacteriófago T4, en el que los residuos aminoacídicos 1 a 73 de gp36 (ID SEC Nº 5) están fusionados en el adecuado marco de lectura amino-terminal con los residuos aminoacídicos 866 a 1289 de gp34 (ID SEC Nº 2).

7. Un oligómero del polipéptido de la reivindicación 6, en el que los extremos amino de los polipéptidos en dicho oligómero forma conjuntamente una estructura que tiene la capacidad de interaccionar con la proteína gp35 del bacteriófago T4.

8. Un polipéptido aislado que está compuesto esencialmente por una variante de la proteína gp35 del bacteriófago T4, en el que la proteína gp35 se modifica en secuencia para formar la variante que, cuando se combine con los oligómeros de las proteínas P34 y P36-P37 del bacteriófago T4, forme una estructura girada en la que gp35 quede situada entre P34 y P36-37 y defina un ángulo menor de 125º, en condiciones en las que la proteína gp35 natural forma un ángulo de 137º cuando se combina con los oligómeros.

9. Un polipéptido aislado que está compuesto esencialmente por una variante de la proteína gp35 del bacteriófago T4, en el que la proteína gp35 se modifica en secuencia para formar la variante que, cuando se combine con los oligómeros de las proteínas P34 y P36-P37 del bacteriófago T4, forme una estructura girada en la que gp35 quede situada entre P34 y P36-37 y defina un ángulo mayor de 145º, en condiciones en las que la proteína gp35 natural forma un ángulo de 137º cuando se combina con los oligómeros.

10. Un polipéptido aislado que está compuesto esencialmente por una variante de la proteína gp35 del bacteriófago T4, en el que una proteína gp35 está modificada en el extremo amino terminal de la misma para formar la variante tal que la interacción de dicho polipéptido con el oligómero de la proteína P34 del bacteriófago T4 sea inestable a temperaturas entre 40ºC y 60ºC.

11. Un oligómero polipeptídico aislado compuesto esencialmente por una variante de la proteína P37 del bacteriófago T4, en el que se modifica una proteína P37 en el extremo amino terminal de la misma para formar la variante tal que la interacción de dicho polipéptido con el oligómero de la proteína P36 del bacteriófago T4 sea inestable a temperaturas entre 40ºC y 60ºC.

12. Un oligómero polipeptídico aislado compuesto esencialmente por una variante de la proteína P37 de un bacteriófago de la serie T-par, en el que el dominio carboxilo terminal de dicho oligómero está modificado para conferir la capacidad del polipéptido completo para unirse de forma específica a un ligando inmovilizado.

13. El polipéptido de la reivindicación 12, en el que dicho ligando se selecciona del grupo constituido por biotina, inmunoglobulina o iones metálicos divalentes.

14. Una nanoestructura que comprende una pluralidad de proteínas de fusión, comprendiendo dichas proteínas de fusión una primera porción compuesta por al menos los 10 primeros aminoácidos N-terminales de una proteína de la fibra de la cola fusionada a través de un enlace peptídico a una segunda porción compuesta por al menos los últimos 10 aminoácidos C-terminales de una segunda proteína de la fibra de la cola, en la que las proteínas de la fibra de la cola se seleccionan del grupo constituido por las proteínas gp34, gp35, gp36 y gp37 de un bacteriófago de la serie T-par y en la que las primera y segunda proteína de la fibra de la cola son iguales o distintas.

15. La nanoestructura de la reivindicación 14, en la que la primera y segunda proteínas de la fibra de la cola son diferentes.

16. La nanoestructura de la reivindicación 14, que comprende además una molécula que se puede autoensamblar en un oligómero y fusionarse con al menos una porción de 10 aminoácidos de una proteína de la fibra de la cola de la serie T-par.

17. La nanoestructura de la reivindicación 16, en la que la molécula tiene la estructura de una cremallera de leucinas.

18. La nanoestructura de la reivindicación 14, en la que dicha nanoestructura comprende una varilla lineal unidimensional.

19. La nanoestructura de la reivindicación 14, en la que dicha nanoestructura comprende un polígono.

20. La nanoestructura de la reivindicación 14, en la que dicha nanoestructura comprende un sólido o jaula tridimensional.

21. La nanoestructura de la reivindicación 14, en la que dicha nanoestructura comprende una lámina bidimensional abierta o cerrada.

22. Una proteína de fusión aislada que está compuesta esencialmente por una primera porción de una proteína gp37 de un bacteriófago de la serie T-par, consistente en el intervalo de los primeros 10 a 60 aminoácidos N-terminales de la proteína gp37, fusionada con una segunda porción de un proteína gp36 de un bacteriófago de la serie T-par, consistente en el intervalo de los últimos 10 a 60 aminoácidos C-terminales de la proteína gp36.

23. Una proteína de fusión aislada que está compuesta esencialmente por una porción de una proteína gp37 de un bacteriófago de la serie T-par, compuesta de al menos los primeros 10 aminoácidos N-terminales de la proteína gp37 fusionada con una segunda porción de un proteína gp36 de un bacteriófago de la serie T-par, compuesta de al menos los 10 últimos aminoácidos C-terminales de la proteína gp36.

24. Una proteína de fusión aislada que está compuesta esencialmente por una porción de una proteína gp37 de un bacteriófago de la serie T-par, compuesta de al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales de la proteína gp37 fusionada con una segunda porción de una proteína gp36 de un bacteriófago de la serie T-par, compuesta de al menos los 20 últimos aminoácidos C-terminales de la proteína gp36.

25. Una proteína de fusión aislada que está compuesta esencialmente por una primera porción de una proteína gp36 de un bacteriófago de la serie T-par, compuesta de los primeros 73 aminoácidos N-terminales de la proteína gp36 fusionada con una segunda porción de una proteína gp34 de un bacteriófago de la serie T-par, compuesta de los últimos 424 aminoácidos C-terminales de la proteína gp34.

26. Una proteína aislada que comprende al menos 20 aminoácidos contiguos de la proteína gp37, gp36 o gp34 de un bacteriófago de la serie T-par, y que carece de al menos 5 aminoácidos de los extremos amino o carboxilo de la proteína.

27. Un ADN aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 1.

28. Un ADN aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 2.

29. Un ADN aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 4.

30. Un ADN aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 5.

31. Un ADN aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 6.

32. Un ADN aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 8.

33. Un ADN aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 9.

34. Un ADN aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 10.

35. Un ADN aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 11.

36. Un ADN aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 12.

37. Un ADN aislado que codifica la proteína de la reivindicación 22.

38. Un ADN aislado que codifica la proteína de la reivindicación 24.

39. Un ADN aislado que codifica la proteína de la reivindicación 25.

40. Un ADN aislado que codifica la proteína de la reivindicación 26.

41. Un procedimiento para preparar una nanoestructura poligonal que comprende poner en contacto la proteína de la reivindicación 25 con proteínas gp35 purificadas de un bacteriófago de la serie T-par.

42. Un procedimiento para preparar una nanoestructura que comprende poner en contacto una pluralidad de las proteínas de la reivindicación 22 unas con otras.

43. Un equipo que comprende la proteína de fusión de la reivindicación 22 en uno o más recipientes.

44. Un equipo que comprende la proteína de fusión de la reivindicación 24 en uno o más recipientes.

45. Un equipo que comprende la proteína de fusión de la reivindicación 25 en uno o más recipientes.

46. Un equipo que comprende la proteína de fusión de la reivindicación 25 en uno o más recipientes, y una proteína gp35 aislada de un bacteriófago de la serie T-par.

47. La proteína de la reivindicación 22 en la que el bacteriófago de la serie T-par es T4.

48. La proteína de la reivindicación 25 en la que el bacteriófago de la serie T-par es T4.

49. Un polipéptido aislado que está compuesto esencialmente por una variante de la proteína gp36 del bacteriófago T4, en el que se modifica una proteína gp36 en el extremo carboxilo terminal de la misma para formar la variante tal que la interacción de dicho polipéptido con el oligómero de la proteína P37 del bacteriófago T4 sea inestable a temperaturas entre 40ºC y 60ºC.

50. Un polipéptido aislado que está compuesto esencialmente por una variante de la proteína gp36 del bacteriófago T4, en el que se modifica una proteína gp36 en el extremo amino terminal de la misma para formar la variante tal que la interacción de dicho polipéptido con el oligómero de la proteína gp35 del bacteriófago T4 sea inestable a temperaturas entre 40ºC y 60ºC.

51. Un polipéptido aislado que está compuesto esencialmente por una variante de la proteína gp34 del bacteriófago T4, en el que se modifica una proteína gp34 en el extremo carboxilo terminal de la misma para formar la variante tal que la interacción de dicho polipéptido con el oligómero de la proteína gp35 del bacteriófago T4 sea inestable a temperaturas entre 40ºC y 60ºC.

52. Un procedimiento para preparar un nanoestructura helicoidal que comprende poner en contacto la proteína de la reivindicación 25 con proteínas gp35 purificadas de un bacteriófago de la serie T-par.

53. El oligómero polipeptídico aislado de la reivindicación 4 ó 12, en el que el bacteriófago de la serie T-par es el bacteriófago T4.

54. El polipéptido aislado de la reivindicación 5, en el que el bacteriófago de la serie T-par es el bacteriófago T4.