JPH10508194A - ナノメートル構造物を作成するための材料およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、顕微鏡的および肉眼的構造物の構築に有用なナノ構造物(nanostructure)、すなわちナノメートルサイズの構造物に関する。特に、本発明はバクテリオファージＴ４尾部繊維タンパク質およびその変異体に基づくナノ構造物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ナノメートル構造物を作成するための材料およびその使用発明の分野 本発明は、顕微鏡的および肉眼的構造物の構築に有用なナノ構造物、すなわち ナノメートルサイズの構造物に関する。特に、本発明はバクテリオファージＴ４ テールファイバー(tail fiber)タンパク質およびその変異体に基づくナノ構造物 に関する。発明の背景 殆どの金属およびセラミックに基づく材料の強度は、その構成分子とクリスタ リット表面の間の理論的結合力に由来するが、結晶構造またはガラス様構造にお けるひび(flaw)によってその強度は有意に制限される。これらのひびは通常原材 料自体に固有のものであるか、または組み立て(fabrication)の間に発生するも ので、環境応力に暴露されることによりしばしば大きくなる。 ナノ技術が出現する分野は、従来の材料のこのような強度制限を一層重大なも のとした。複雑な機能を果たしうる非常に小さい構造物（すなわち、寸法がナノ メートルの構造物）を設計し作成する能力は、予測可能でかつ再現性のある様式 で操作しうる、そして新規な適用のそれぞれに要求される特性を有する、適切な 材料の使用に依存する。 生物的な系は、高度の複雑なナノ構造物のモデル(paradigm)として役立つ。生 細胞は、タンパク質を組み立て、結合して完全に形成された、そして通常の環境 において損傷に抵抗できる構造物にする。ある場合には、自己集合(self-assemb ly)のプロセスにより複雑な構造物が作出される。そのための指示は、これを構 成するポリペプチドの中に組み込まれている。最後に、タンパク質は高度な品質 管理を確実にする校正プロセスにかけらる。 したがって、当分野においては、タンパク質のこれら独特な特徴を活用して合 成ナノ構造物の構成要素を形成する方法および組成物が必要とされている。ナノ メートル規模技術の特別な要請に適するように特性をあつらえうる材料を設計す る必要がある。さらに、殆どの巨大構造素材、セラミック、金属、繊維等のサブ ユニットはナノ構造物サブユニットの結合に基づいているので、ひびがなく、か つ正確な寸法と均一性を有する適切なサブユニットの組み立ては巨大構造物の強 度および整合性を向上させるに相違ない。なぜなら、そのようなサブユニットの 表面はより大きい、より異質の材料に較べてより規則的であり、広い領域にわた ってより緊密に相互作用可能だからである。発明の概略 １つの側面において、本発明はバクテリオファージＴ４の改変されたテールフ ァイバータンパク質を含む、ナノ構造物のための単離されたタンパク質建築ブロ ック(building block)を提供する。ｇｐ３４、３６および３７タンパク質が様々 な方法で改変され、異なる特性を有する新規なロッド(rod，細い棒)構造を形成 する。特定の内部ペプチド配列を、二量体体を形成して天然のテールファイバー パートナーと会合するそれらの能力に影響を及ぼすことなく欠失させることがで きる。または、内部ペプチド配列を他の改変された、非天然のテールファイバー パートナーとのみ相互作用するように；パートナーと熱不安定性相互作用を示す ように；または、異種結合部分と相互作用することを可能とする付加的官能基を 含有するように、改変することができる。 本発明はまた、２つ以上の異なるテールファイバータンパク質由来の配列を含 む融合タンパク質を包含する。ひじ継ぎ手(angle joint)を形成するｇｐ３５タ ンパク質は、天然の平均角度である137°(±7°)または156°(±12°)と異なる 平均角度をなすように、かつパートナーと熱不安定性相互作用を示すように改変 される。 別な側面において、本発明はバクテリオファージＴ４の、天然のおよび改変さ れたテールファイバータンパク質を含むナノ構造物を提供する。このナノ構造物 は、一次元のロッド、二次元の多角形または開放若しくは閉鎖シート(sheet)、 または三次元の開放ケージ(cage)若しくは閉鎖固体でありうる。図面の簡単な説明 図１Ａおよび１Ｂは、バクテリオファージＴ４粒子（図１Ａ）およびバクテリ オファージＴ４テールファイバー（図１Ｂ）を図式的に示す。 図２はユニットロッドを図式的に示す。 図３Ａ〜３Ｄは、ｘ軸に沿って連結された一次元マルチユニットロッド（図３ Ａ）；閉鎖単純シート（図３Ｂ）；閉鎖レンガ積み(brickwork)シート（図３Ｃ ）；および開放レンガ積みシート（図３Ｄ）を図式的に示す。 図４は、多孔性シートおよび固体シート（上段および下段）を構築するのに用 いられる２種類のユニットを図式的に示す。これらのシートは、交互に重層する と、図に示すような多層化された１セットのケージを生成する。 図５は、120°の角度を有する、角度をつけた構造物を図式的に示す。 図６は、バクテリオファージＴ４の遺伝子３４、３５、３６および３７のＤＮ Ａ配列（配列番号１）を示す。 図７は、バクテリオファージＴ４の遺伝子３４（配列番号２、ＯＲＦＸ配列番 号３）、３５（配列番号４）、３６（配列番号５）および３７（配列番号６）の 遺伝子産物のアミノ酸配列（一文字表記で表した）を示す。アミノ酸配列（各対 の下の行）をヌクレオチド配列（各対の上の行）と並べて示してある。遺伝子３ ５の推定されるタンパク質配列（ＮＣＢＩデータベース由来）は正確でないよう に思われることに注意すべきである。 図８Ａ〜８Ｂは、自己集合して二量体になる分子由来のＰ３７二量体開始剤の 形成（図８Ａ）；および自己集合して三量体になる分子由来のＰ３７三量体開始 剤の形成（図８Ｂ）を図式的に示す。 図９は、自己集合二量体である開始剤を用いたポリマー（Ｐ３７−３６）ｎの 形成を図式的に示す。発明の詳細な説明 本明細書に引用する全ての特許、特許出願および参照文献は、参照としてその 全体をここに組み入れる。不一致がある場合は、定義を含めて本明細書の開示に 従うものとする。 本発明はバクテリオファージＴ４テールファイバータンパク質によって説明さ れているが、本発明はＴ４ファミリー（例：Ｔ４、ＴｕＩａ、ＴｕＩｂ）および Ｔ２ファミリー（Ｔ２、Ｔ６、Ｋ３、Ｏｘ２ Ｍ１、等）の例えば他のＴ偶数様 (T-even-like)ファージにも適用しうることが理解されよう。定義 ： 本明細書において、「ナノ構造物」は、ナノメートルサイズのタンパク質構成 要素から組み立てられる、異なる大きさおよび形状の構造物と定義される。 本明細書において、「カイマー(chimer)」は、少なくともアミノおよびカルボ キシ末端領域が起源を異にするポリペプチド（天然に存在するものであろうと、 突然変異誘発により改変されたものであろうと）に由来するキメラタンパク質と 定義される。 本明細書において、「ホモ二量体」は、明確な三次元構造物を形成する、２つ の実質的に同一なタンパク質サブユニットの組立品(assembly)と定義される。 「ｇｐ」という表示は、単量体ポリペプチドを指し、他方、「Ｐ」という表示 はホモオリゴマーを指す。Ｐ３４、Ｐ３６およびＰ３７は、恐らくホモ二量体ま たはホモ三量体であろう。 特定のアミノ酸配列から「本質的になる」単離されたポリペプチドは、本明細 書においては、特定の配列を有するポリペプチド、またはその配列内に同類置換 を有するポリペプチドと定義される。当業者であれば理解しているように、同類 置換とは、酸性残基が酸性残基によって、塩基性残基が塩基性残基によって、ま たは疎水性残基が疎水性残基によって置換される置換をいう。本発明の実施にお いて、特定残基の不在がポリペプチドの構造または機能に識別可能な影響を何ら 及ぼさない場合は、アミノ末端またはカルボキシ末端において１個またはそれ以 上のアミノ酸を、各末端において合計５個までのアミノ酸を欠くポリペプチドも また包含される。 本発明は、寸法がナノメートル単位で測定される、顕微鏡的および肉眼的構造 物の構築に有用な、新しいクラスのタンパク質建築ブロックに関する。理論に縛 られることを望まないが、基本ユニットは三量体構造も可能であるが、クロスβ 立体配置を有する２つの同一タンパク質サブユニットからなるホモ二量体である と思われる。したがって、明らかであろうが、本明細書に使用する「ホモ二量 体」または「二量体化」という用語への言及は、多くの場合ホモ三量体または三 量体化にも言及しているものと解釈されよう。これらの長い、堅い、かつ安定な ロッド形状のユニットは、遺伝子的に、またはin vitroで取り付けることの可能 な結合装置を用いて、他のロッドと共に集合することができる。１つのロッドの 両端は、他のロッドまたは類似したロッドの異なる端に取り付けることができる 。ロッドの長さ、取り付けの角度、および柔軟性特性における変動は、異なった 形状を与えられた構造物がin situ で自己集合することを可能とする。このよう にして、ユニットは自己集合して一、二または三次元のあらかじめ定められたよ り大きい構造物を作ることができる。自己集合は、構成要素のひびの無い生物的 製造による正確な寸法と均一な強度を有する構造物を形成するように、実施する ことが可能である。ロッドもまた遺伝子的および化学的修飾により改変して、他 の化学的存在物のためのあらかじめ定めた特異的取り付け部位を形成させ、複雑 な構造物の形成を可能とすることができる。 本発明の重要な側面は、異なる長さのロッドを含むようにタンパク質ユニット を設計することができ、そしてこれらのユニットを更に改変して、あらかじめ定 められた様式で表面特性を変化させることができ、および／または他の同一また は異なるユニットと結合する能力に影響を与える特徴を含むようにできることで ある。更に、このクラスの２つの異なるメンバーの特性を組み合わせるキメラタ ンパク質を作成することにより、自己集合能力を拡大させることが可能である。 この設計特徴は、これらのタンパク質をコードする遺伝子の構造を操作すること により達成される。 以下に詳述するように、本発明の組成物および方法は、天然のタンパク質の特 性、すなわち、得られる構造物が堅く、強く、水性媒質中で安定であり、耐熱性 であり、プロテアーゼ耐性であり、かつ生物分解性としうること、を利用してい る。大量のユニットを微生物中に容易に組み立てることができる。さらに、自動 化が容易なため、大量の部品および小組立部品(subassembly)を保存し、必要に 応じて使用することが可能である。 タンパク質サブユニットの配列は、大腸菌のＴ４バクテリオファージのテール ファイバーの構成要素に基づいている。原理および技法は、他のＴ偶数ファージ または類似したテールおよび／またはファイバー構造を有する他の関連バクテリ オファージのテールファイバーに応用可能であることが理解されるであろう。 Ｔ４バクテリオファージのテールファイバーの構造（図１に示す）は、図式的 に以下のように表すことができる（Ｎ＝アミノ末端、Ｃ＝カルボキシ末端）：す なわち、Ｎ〔Ｐ３４〕Ｃ−Ｎ〔ｇｐ３５〕Ｃ−Ｎ〔Ｐ３６〕Ｃ−Ｎ〔Ｐ３７〕Ｃ である。Ｐ３４、Ｐ３６およびＰ３７は全て、同一方向に配位された２つの同一 βシートが、ロッドの長軸を通って180°回転対称軸と並列されたシート間の疎 水性相互作用によって表面−表面に向かい合って融合された、堅い、ロッド形状 のタンパク質ホモ二量体である（Ｐ３４、Ｐ３６およびＰ３７がホモ三量体であ る場合、構造は変わるであろう）。対照的に、ｇｐ３５はＰ３６のＮ末端に特異 的に結合し、次にＰ３４のＣ末端に結合して、２つのロッドの間にひじ継ぎ手を 形成する単量体ポリペプチドである。大腸菌のＴ４感染の間に、２個のｇｐ３７ 単量体は二量体化してＰ３７ホモ二量体を形成する。二量体化のプロセスは、Ｐ ３７のＣ末端付近から開始され、また２個の大腸菌シャペロン(chaperon)タンパ ク質を必要とすると考えられる。（本発明に用いられる、Ｃ末端付近に温度感受 性突然変異を有する変異体ｇｐ３７は、二量体化にあたって１個のシャペロンｇ ｐ５７のみを必要とする。）いったん二量体化すると、Ｐ３７のＮ末端は２個の ｇｐ３６単量体のＰ３６ロッドへの二量体化を開始する。Ｐ３６のＣ末端とＰ３ ７のＮ末端の間の接合部は緊密で堅いが、非共有結合である。次に、Ｐ３６のＮ 末端はｇｐ３５単量体に結合する。この相互作用はＰ３６を安定化させ、テール ファイバーのひじを形成する。最後に、ｇｐ３５はＰ３４（これは二量体化のた めｇｐ５７を用いる）のＣ末端と結合する。このように、テールファイバーの自 己集合は、特定サブユニットの相互作用のあらかじめ定められた秩序によって統 制されている。そこでは、第１の小組立部品の形成によってもたらされる構造的 成熟が、新しい（以前にはできなかった）サブユニットとの相互作用を可能とす る。これは、構成要素のランダムな混合物から、正確な明細を有する構造の生成 をもたらす。 本発明によれば、これらのタンパク質をコードする遺伝子を、異なった組合せ の末端を有する異なった長さのロッドを生成するように改変することが可能であ る。この点において、天然のタンパク質の特性は特に有利である。第１に、左（ Ｌ）および右（Ｒ）端部にβベンド(bend)を有する逆平行β鎖からβシートが構 成されている。第２に、シートの水平面の外で、アミノ酸側鎖が上下に互い違い になっている。第１の特性は、ベンドがのばされてＬとＲ表面の間に対称的で特 異的な結合部位を形成すること、および他の構造物のための結合部位を形成する ことを可能とする。さらに、βシートのコアセクションを遺伝子操作（例えば、 シートの同一端部上のβベンドをコードするＤＮＡ領域をスプライシングして介 在するペプチドを除外することにより、またはペプチドのセグメント(segment) を類似の方法でベンド角度におけるスプライシングにより挿入することにより、 短くまたは長くすることが可能である。第２の特性は、βシートの表面の上およ び下に伸びているアミノ酸側鎖を遺伝子的置換または化学結合により改変するこ とを可能とする。重要なことは、上記の改変の全てを、ロッドの構造的完全性を 損なうことなく達成することである。当業者には、広範な構造物（その幾つかを 以下に詳述する）に組み立て可能なユニットを設計するにあたり、これらの特性 が大きな柔軟性を許すことが理解されるであろう。構造ユニット 本発明のロッドは、建築用の木製２ｘ４間柱またはスチールの梁のように機能 する。この場合、表面は分子レベルで正確に再現可能であり、それにより類似し た、または異なるユニットロッドへの定まった連結部位における特異的結合に適 当である。表面はまた、正または負に帯電した基を含んでより多く、またはより 少なく疎水性となるように、そして他のユニットへの、または２つの受容体部位 を有する中間連結部への特異的結合のため組み込まれた突起部をもつように、改 変される。ロッドの構造、およびユニットロッドの図を図２に示す。ロッドの三 次元は、後ろ（Ｂ）から前（Ｆ）への次元としてｘ；下（Ｄ）から上（Ｕ）への 次元としてｙ；および左（Ｌ）から右（Ｒ）への次元としてｚ、と定義される。 一次元マルチユニットロッドは、ｘ軸に沿って連結された単一ユニットロッド から最も容易に組み立てることができるが（図３Ａ）、他の二次元のどちらにお いてもサブユニットの規則的な連結は長いがｘ次元におけるものとは異なる断面 を有する構造物を形成する。 二次元構築物は、任意の２つの軸に沿ったロッドの相互作用によって形成され るシートである。１）閉鎖単純シートは、任意の２つの軸に沿って正確にオーバ ーラップする表面から形成される（図３Ｂ）。２）閉鎖レンガ積みシートは、１ つの次元において正確にオーバーラップする表面を有し、かつ他の次元において 特別な種類のオーバーラップを有するユニット間の相互作用から形成される（図 ３Ｃ）。この場合、正確に１／２ユニットの距離をあけて配置された、２つの異 なるセットの相補的連結部がなければならない。連結部が中央に置かれる（すな わち、各セットが端部から１／４である）場合は、各連結部はユニットの中心部 の上下にくる。ユニットがオフセット(offset)の場合は、連結部もまたオフセッ 図示されている。相互作用部位が互いに対称的な場合は、互い違いになっている (alternating)列はロッドとどちらの方向にも相互作用可能である。相互作用部 位が対称的でなく、同一または反対の方向に面している相互作用列としか相互作 用できない場合は、シートは一方向ロッド、または互い違いの方向をもつロッド の層からなる。３）開放レンガ積みシート（またはネット）は、ユニットが１／ ２ユニット以上離されている場合に生じる（図３Ｄ）。開口部（または細孔）の 寸法は、相互作用部位を隔てている距離（ｄｘ）およびこれらの部位が表面を隔 てている距離（ｄｙ）に依存する。 三次元構築物は、固体を形成する３つの表面全ての間の立体的に調和する相互 作用を必要とする。１）閉鎖固体は、３次元の全てにおいて正確にオーバーラッ プする（例えば、閉鎖単純シートの正確なオーバーラップ）ユニットから組み立 てることができる。類似の方法で、閉鎖レンガ積みシートは、シートを正確にオ ーバーラップさせることにより閉鎖固体を形成することができる。または、閉鎖 レンガ積みシートを移動させてレンガ積みを３次元にすることができる。これは 、ユニットの３対の平行面の全ての上に適切な１セットの連結部を必要とする。 ２）多孔性固体は、開放レンガ積みシートを様々な方法で連結することにより作 られる。例えば、ユニットが第３次元において正確にオーバーラップする場合、 紙の水平面に対して垂直に走る、秩序立って並べられた正確な寸法を有する多数 の穴を用いて固体が形成される。代わりに閉鎖空間、幅ｄｚ（すなわち、Ｕ→Ｄ 次元において）の層を有する材料が必要な場合は、単純閉鎖シートを開放レンガ 積みシートの上に重層し、開口部を閉鎖する。開放レンガ積みシートの開口部が 例えば１／４ユニットである場合は、長さ３／４ユニットのロッドを用いてその シートを作成する。次に、ｚ次元において連結部が必要となる。これらの互い違 いの層を重合するために用いられる２つのユニット、および層自体を図４に図式 的に示す。 上記構造物の全ては、単純線形ロッドから構成される。第２ユニット、すなわ ちアングルユニット(angle unit)は、可能な構造物の種類および次元性(dimensi onality)を拡大する。アングルユニットはアングル鉄(angle iron)のように２つ のロッドを180°とは異なる角度で連結する。平均角度およびその剛性の程度は 、この連結構造物中に組みこまれている。例えば、図５に示す構造物は、120° の角度、ならびにａおよびｂにおける異なる特異的連結部位を有する。以下に、 ひじ継ぎ手を用いて形成される構造物の例を述べる。 １）開放レンガ積みシートは、シートに対して垂直な角度を付加することによ り、ロッド方向に対して直角をなす方向に拡大され、そして強化される。この場 合、３次元ネットワークが形成される。ロッド末端に90°のひじ継ぎ手を取り付 けることは、シートのほぼ水平面内にある角度をなし、それらのひじ継ぎ手（こ れらは第１に取り付ける元のシートの水平面の外に若干の遊びを持たなければな らない）に加えられた新しいロッドが、ほぼ水平な、上または下に隣接するシー トに対し垂直をなす配向を有する新しいシートを形成するのを可能とする。 ２）６角形は、ロッドおよび120°の角度を形成するひじ継ぎ手の混合物から 作られる。この場合、専用の２セットの連結部がある。各セットは、ロッドの両 端の片方および、ひじ継ぎ手の２つの相補的部位のうち片方から作られる。６角 形は１つの方向（時計回り又は反時計回り）を有するという意味において、これ は線形構造物である。６角形の辺を連結することにより、これを二次元開放ネッ ト（すなわち、二次元ハニカム）にすることが可能である。下の６角形の頂部を 上の６角形の底面に連結することにより６角形管を形成することができる。この 管がその側面ごとに連結したならば、それらは開放３次元多重６角形管を形成す る。 ３）らせん状６角形管は６角形と類似の方法で作られるが、第６のユニットを 第１のユニットと連結して６角形を閉鎖することはしない。代わりに、末端を６ 角形の水平面から移動させ、そして第７およびさらなるユニットを加えて、螺旋 のユニット間に接着力が殆どないか又は全くない場合はばねになりうる、また、 並置されたユニットの緊密な接近を維持するそのような力が存在する場合は堅い ロッドになりうる、６角形管を形成する。 当業者には、本発明の組成物および方法が、８角形等の他の多角形構造物、な らびに三角形から形成される四面体および二十面体、ならびに正方形および長方 形から形成される箱をも包含することが明らかであろう。構造物の範囲は、ロッ ドユニットの異なる軸上に工学的に作成可能なアングルユニットおよび置換物の 種類によってのみ制限される。例えば、バクテリオファージＴ７においては他の 天然に存在するひじ継ぎ手が見いだされ、これは90°の角度を有する(Steven ら ，J．Mol．Biol．200:352-365，1988)。ロッドタンパク質の設計および作成 本発明のナノ構造物を構築するのに用いられるタンパク質サブニュニットは、 バクテリオファージＴ４のテールファイバーを含む４つのポリペプチド、すなわ ち、ｇｐ３４、ｇｐ３５、ｇｐ３６およびｇｐ３７に基づいている。これらのタ ンパク質をコードする遺伝子はすでにクローン化され、そのＤＮＡ配列およびタ ンパク質配列はすでに決定されている（遺伝子３６および３７については、Oliv erら，J．Mol．Biol．153:545-568 参照）。遺伝子３４、３５、３６および３７ のＤＮＡおよびアミノ酸配列を図６および７に示す。 天然においてはｇｐ３４、ｇｐ３５、ｇｐ３６およびｇｐ３７は大腸菌細胞の 感染の後、完全なＴ４ファージ粒子により産生される。細菌細胞の細胞質におけ る合成の後、ｇｐ３４、３６および３７単量体はホモ二量体を形成する。このホ モ二量体は、集合して成熟しつつあるファージ粒子になる能力を有する。このよ うに、大腸菌は以下に記述するタンパク質サブユニットの合成および二量体化の ための効率的で便利な工場として役立つ。 本発明の実施において、興味のあるタンパク質をコードする遺伝子（天然の、 改変された、または組み換えられた）は当分野で周知のＤＮＡ発現ベクターに組 み込まれる。これらの環状プラスミドは、典型的には選択マーカー遺伝子（通常 形質転換細菌に抗生物質耐性を付与する）、大腸菌中で高いコピー数でプラスミ ドの複製を可能とする配列、および誘導プロモーターのすぐ下流にあるマルチク ローニング部位、およびリボソーム結合部位を含む。本発明における使用に適す る市販ベクターの例は、pET システム(Novagen，Inc.，Madison，WI)およびSupe rlinker ベクターpSE280およびpSE380(Invitrogen，San Diego，CA)を含む。 戦略は、１）興味のある遺伝子を構築し、マルチクローニング部位にクローン 化する；２）組換えプラスミドを用いて大腸菌細胞を形質転換する；３）クロー ン化した遺伝子の発現を誘導する；４）タンパク質産物の合成を試験する；そし て最終的に５）機能性ホモ二量体の形成を試験する、ことである。ある場合にお いて、興味のあるタンパク質の二量体化に付加的遺伝子の機能が必要な時は、付 加的遺伝子もまた同一プラスミド中にクローン化される。例えば、野性型のまた は改変されたｇｐ３７を発現する場合、細菌シャペロン遺伝子もまたプラスミド に含まれる；野性型のまたは改変されたｇｐ３６を発現する場合、野性型の、ま たは改変されたｇｐ３７遺伝子が含まれる。改変されたｇｐ３７は、二量体化を 行う能力を有し、かつｇｐ３６の二量体化をシャペロンする(chaperon)ことがで きるＮ末端を含まなければならない。この方法は、単量体遺伝子産物の形成を可 能とし、そしてある場合には、Ｔ４に感染した細胞に通常存在する他のファージ 誘導タンパク質の不在下で、単量体のホモ二量体ロッドへの成熟を可能とする。 上に定義した戦略の工程１〜４は、組換えＤＮＡ技術および細菌におけるタン パク質発現の分野における周知の方法により達成することができる。例えば、工 程１においては、マルチクローニング部位における制限酵素開裂とそれに続く断 片の連結が、ｇｐ３４、３６および３７の内部ロッドセグメントにおける欠失を 構築するのに用いられる（下記の実施例参照）。あるいは、単一の又は多数の制 限酵素開裂とそれに続くエキソヌクレアーゼ消化(EXO-SIZE，New England Biola bs，Beverly，MA)が、最初の開裂部位から片方または両方向のＤＮＡ配列を欠失 させるのに用いられる。後に行う連結工程と組み合わせると、この手順は大きさ が増大していく積み重ね式の(nested)１セットの欠失を作成する。同様に、２つ の異なるテールファイバー遺伝子由来のＤＮＡセグメントを組み換えて、融合タ ンパク質（本明細書の記述では「カイマー」と称する）をコードするキメラ遺伝 子を作成するのに標準的方法が用いられる。一般に、この最後の方法は、互い違 いのＮまたはＣ末端を提供し、それによって異なるロッドセグメントの連結の新 しいパターンを可能とする末端の新規な組合せを創成するのに用いられる。この 種類のカイマーの代表的なものであるｇｐ３７−３６の融合体が、実施例２に記 述されている。これらのタンパク質の産生（工程２）のための好ましい宿主は、 大腸菌BL21(DE3)株およびBL21(DE3/pLysS)株(Novagen，Madison，WIより市販さ れている)であるが、HMS174(DE3)およびHMS174(DE3/pLysS)等の他の適合するrec A株も使用可能である。組換えプラスミドを用いた形質転換（工程２）は、標準 的方法により達成される(Sambrook，J.，Molecular Cloning，Cold Springs Har bor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY; これは本発明で用いた標準的組換 えＤＮＡ方法の資料でもある）。形質転換された細菌は、抗生物質（例えばアン ピシリンまたはカナマイシン）に対する耐性により選択される。クローン化テー ルファイバー遺伝子の発現を誘導する（工程３）方法は、使用された特定のプロ モーターに依存する。好ましいプロモーターは、ｐｌａｃ（バックグラウンド発 現を減少させるためベクター上にｌａｃｉ^qを有する）であり、このプロモータ ーはイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって調節することが 可能である。第２の好ましいプロモーターはｐＴ７φ１０であり、これはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに特異的で、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼによっては認識され ない。リファマイシン耐性であるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、大腸菌ＢＬ２１ 染色体内の欠陥ラムダＤＥ溶原菌(lysogen)上にコードされている。BL21(DE3)中 のＴ７ポリメラーゼは、プラスミド中のｌａｃｉ^q遺伝子により超抑制され、そ してIPTGにより誘導および調節される。 典型的には、形質転換された細菌の培養物は誘導物質と共に数時間の間インキ ュベートされ、その間に興味のあるタンパク質の合成がモニターされる。この例 では、細菌細胞の抽出物を調製して、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気 泳動によりＴ４テールファイバータンパク質を検出する。 一旦細菌抽出物中に改変されたタンパク質が検出されたならば、それが適切な ホモ二量体を形成するかどうかを確認する必要がある（工程４）。これは、まず 上記タンパク質の成熟した二量体化形態に特異的な抗血清によりそのタンパク質 が認識されるかどうかを試験することにより実施される。 テールファイバー特異的抗血清を記述されたように調製する(Edgar，R.S.およ びLielausis，I.,Genetics 52:1187，1965; Wardら，J．Mol．Bio．54:15，1970 )。要約すると、免疫原として全Ｔ４ファージを用いる；場合により、得られた 抗血清をテールのないファージ粒子を用いて吸着させ、それによりテールファイ バータンパク質に対する抗体以外の全ての抗体を除去する。次の工程において、 上記抗血清の異なるアリコートを、それぞれが特定のテールファイバータンパク 質を欠く抽出物を用いて別個に吸着させる。例えば、テールファイバー構成要素 Ｐ３４、ｇｐ３５及びｇｐ３６のみを含有する抽出物（機能性ｇｐ３７遺伝子を 欠く突然変異Ｔ４に感染した細胞に由来する）が吸着に用いられた場合、得られ る抗血清は成熟したＰ３７および二量体化Ｐ３６−Ｐ３７のみを認識する。同様 のアプローチを用いて、遠位の半分のテールファイバー、またはＰ３４、ｇｐ３ ５及びＰ３７をそれぞれ含有する抽出物を用いて吸着することにより、成熟した （すなわちホモ二量体化した）Ｐ３４およびＰ３６のみを認識する個々の抗血清 を調製することができる。別の方法は、精製されたテールファイバー半分、例え ばＰ３４およびｇｐ３５−Ｐ３６−Ｐ３７に対する抗体を作成することである。 次に、Ｐ３６−Ｐ３７を用いて抗ｇｐ３５−Ｐ３６−Ｐ３７を吸着させて抗ｇｐ ３５を生成させ、そしてＰ３７およびｇｐ３５を用いて吸着することにより抗Ｐ ３６を生成させることができる。抗Ｐ３７、抗ｇｐ３５および抗Ｐ３５は、免疫 原として精製されたＰ３７、ｇｐ３５およびＰ３５を用いることにより直接生成 させることもできる。別のアプローチは、異なるテールファイバー構成要素また はそのセグメントに対する特異的モノクローナル抗体を作成することである。 サブユニットまたはテール部分に対する特異的抗体は、以下の任意の方法にお いて適切にホモ二量体化されたテールファイバータンパク質を検出するために用 いられる。１）細菌コロニーを直接、あるいは溶菌または未溶菌培養物のサンプ ルをニトロセルロースフィルターに移し、必要であればフィルター上で細菌細胞 を溶菌させ、そして特異的抗体と共にインキュベートすることにより、成熟テー ルファイバータンパク質を発現するコロニーに関して細菌コロニーをスクリーニ ングする。次に、当分野で広く用いられている方法（例えば、第２抗体を発色酵 素または放射線標識化ブドウ球菌プロテインＡと結合させる）により免疫複合体 の形成を検出する。この方法は、多数のコロニー、例えば上記のEXO-SIZE欠失に より生産されたコロニーをスクリーニングするのに特に有用である。２）興味の あるタンパク質を発現する細菌細胞をまず³⁵Ｓ−メチオニンを用いて代謝的に標 識し、次いで抽出物を調製して抗血清と共にインキュベートする。次に、固定化 プロテインＡを用いたインキュベーションと、その後の遠心により免疫複合体を 回収する。その後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により上記複合体を 分解することができる。 ファージ感染を許さない、内部的に欠失させたテールファイバータンパク質が 二量体化し、適切なパートナーと会合する能力をなお保持しているかどうかを試 験するための代わりの競合的アッセイは、in vitroの相補系を使用する。１）先 に記述したような改変された興味のあるタンパク質を含む細菌抽出物を、興味の ある遺伝子の突然変異体であるＴ４ファージに感染した細胞から調製された第２ の抽出物と混合する。２）数時間インキュベーションした後、試験されているタ ンパク質の野性型タンパク質を含有する第３の抽出物を添加し、インキュベーシ ョンをさらに数時間継続する。３）最後に、大腸菌を感染させ、生じたファージ プラークを定量することにより、感染性ファージ粒子について抽出物の力価を測 定する。正しく二量体化されて、そのパートナーと連結することのできる改変テ ールファイバータンパク質は、工程１において非機能性の方法でテールファイバ ーに組み込まれており、それによりこのタンパク質の野性型のものが工程２にお いて組み込まれるのを妨げる。結果は、得られるファージサンプルの力価におけ る減少である。対照的に、改変タンパク質が二量体化して適切なＮおよび／また はＣ末端を形成することができない場合、それは工程１においてファージ粒子に 組み込まれないであろう。したがって、それは工程２における完全なファージ粒 子の集合(assembly)と競合しないであろう。したがって、ファージ力価は、工程 １において改変タンパク質が全く添加されない場合に観察される力価に等しくな るに相違ない（陰性対照）。 カイマーおよび内部的に欠失したテールファイバータンパク質が二量体化し、 適切なパートナーと会合する能力を保持しているかどうかを試験する別な方法は 、in vivoで実施される。このアッセイは、上記のようなカイマーおよび欠失タ ンパク質の、集合に関して正常なファージ部分と競合し、そしてカイマーまたは 欠失タンパク質を組換え的に発現している同一宿主細胞に感染している野性型フ ァージのバーストサイズを減少させる能力を検出する。このように、カイマーま たは欠失タンパク質をコードする発現ベクター由来の発現が細胞内で誘導され、 その細胞は次に野性型ファージにより感染する。野性型ファージ産生の阻害は、 組換えカイマーまたはタンパク質の、ファージの適切なテールファイバータンパ ク質と会合する能力を示す。 上記の種々の方法は、異なる種類の改変テールファイバータンパク質を設計お よび生産するのに単独で又は組み合わせて用いられる。例えば、適切に二量体化 されたタンパク質を発現しているコロニーについて多数の細菌コロニーを予備的 にスクリーニングすることは、陽性コロニーを同定するであろう。次にこれらを in vitro相補性により個別に試験することができる。 本発明に包含される新規タンパク質の非制限的例は、以下のものを含む： １）内部的に欠失させたｇｐ３４、３６および３７ポリペプチド（後述の実施 例１参照）； ２）Ｎ末端を切断したｇｐ３７のＮ末端に融合した、Ｃ末端を切断したｇｐ３ ６； ３）ｇｐ３７がｇｐ３６のＮ末端にくる（すなわち、天然の順序が逆になって いる）、ｇｐ３６とｇｐ３７との間の融合体；本明細書では「ｇｐ３７−３６カ イマー」と称する、（後述の実施例２参照）； ４）ｇｐ３６がｇｐ３４のＮ末端にくる（すなわち、天然の順序が逆になって いる）、ｇｐ３４とｇｐ３６の間の融合体；本明細書では「ｇｐ３６−３４カイ マー」と称する； ５）野性型Ｐ３７のＮ末端と相互作用して（それに応答して二量体化する）能 力を欠くようにＣ末端を突然変異させた、ｇｐ３６の変異体；本明細書では「ｇ ｐ３６^*」と称する； ６）野性型ｇｐ３６のＣ末端と相互作用する能力を欠くＰ３７を形成するよう にＮ末端を突然変異させた、ｇｐ３７の変異体；本明細書では「^*Ｐ３７」と称 する； ７）互いに相互作用可能であるが、ｇｐ３６またはＰ３７とは相互作用できな い、ｇｐ３６^*および^*Ｐ３７の変異体。 ８）ｇｐ３６部分が上記５）に記載の変異体に由来する、変異体「Ｐ３７−３ ６カイマー」、すなわち「Ｐ３７−３６^*」。（上記５〜８については、後述の 実施例３参照）。 ９）ｇｐ３７部分が上記６）に記載の変異体に由来する、変異体「Ｐ３７−３ ６カイマー」、すなわち「^*Ｐ３７−３６」。 10）ｇｐ３６およびｇｐ３７部分が上記７）に記載の変異体に由来する、変異 体Ｐ３７−３６カイマー、すなわち^*Ｐ３７−Ｐ３６^*。 11）ｇｐ３６配列がｇｐ３４のＮ末端に位置する、ｇｐ３６とｇｐ３４との間 の融合体。その二量体を本明細書では「Ｐ３６−３４カイマー」と称する； 12）野性型ｇｐ３５タンパク質をＰ３４およびＰ３６−Ｐ３７二量体と組み合 わせた場合に137°の角度を形成する条件下で、137°または158°（天然の角度 ）と異なる平均角度（例えば、約125°未満または約145°以上）をなし、および ／またはその天然のポリペプチドよりも多少なりとも柔軟性を示す、ｇｐ３５の 変異体； 13）同じ由来の(cognate)パートナーと熱不安定性相互作用、または他の変異 体特異的な相互作用を示す、ｇｐ３４、３５、３６および３７の変異体；並びに 14）ポリペプチドのＣ末端ドメインが、全分子に特異的結合特性を付与する配 列を含むように改変されている、ｇｐ３７の変異体。そのような配列は、例えば 、ビオチンを認識するアビジン由来の配列、ブドウ球菌プロテインＡを認識する 免疫グロブリンＨ鎖由来の配列、それぞれのＦａｂ Ｌ鎖の片割れがそこに結合 して抗原結合部位を形成することができるモノクローナル抗体のＨ鎖のＦａｂ部 分 由来の配列、特異的抗体の認識する免疫活性な配列、または特定の金属イオンに 結合する配列、等である。これらのリガンドを固定化して、精製および／または 組み立てを容易にすることができる。 特定の実施態様において、本発明のカイマーは、第２テールファイバータンパ ク質の少なくとも最後の１０（Ｃ末端）アミノ酸からなる部分にペプチド結合に より融合している、第１テールファイバータンパク質の少なくとも最初の１０（ Ｎ末端）アミノ酸からなる部分を含む。第１および第２テールファイバータンパ ク質は、同一でも異なるタンパク質でもよい。別の実施態様において、カイマー は、第２テールファイバータンパク質由来の最後の１０〜６０アミノ酸からなる アミノ酸部分に融合している、テールファイバータンパク質由来の最初の１０〜 ６０アミノ酸からなるアミノ酸部分を含む。別の実施態様においては、各アミノ 酸部分は、テールファイバータンパク質の少なくとも２０個のアミノ酸である。 カイマーは、相互に融合した部分(portions)（すなわち、全長テールファイバー タンパク質ではない）を含む。好ましい側面において、カイマーの第１テールフ ァイバータンパク質部分はｇｐ３７に由来し、第２テールファイバータンパク質 はｇｐ３６に由来する。このようなカイマー（ｇｐ３７−３６カイマー）は、オ リゴマー化してＰ３７−３６を形成した後、他の等しいオリゴマーと重合するこ とができる。ｇｐ３６−３４カイマーは、オリゴマー化してＰ３６−３４を形成 した後、ｇｐ３５と結合することができる。そして、次にこのユニットは重合す ることができる。別の実施態様においては、第１部分はｇｐ３７に由来し、第２ 部分はｇｐ３４に由来する。好ましい側面において、本発明のカイマーはテール ファイバータンパク質のβ構造のβターン内における挿入または欠失により作成 される。最も好ましくは、テールファイバー配列への挿入、または別なテールフ ァイバータンパク質配列への融合（好ましくは、所望のコードされたタンパク質 を生産するための組換えＤＮＡレベルでの操作による）は、βシートの同一端部 (edge)上のβターン内の配列が連結されるように実施される。 上記のカイマーに加えて、本発明のナノ構造物もまた片方の端を切断した、テ ールファイバー欠失構築物、例えば、（少なくとも５または１０アミノ酸からな る）分子のアミノまたはカルボキシ末端を欠くものを含むことができる。アミノ 末端が切断されているこのような分子、例えば、切断されたｇｐ３７、ｇｐ３４ またはｇｐ３６は、ナノ構造物に「キャップをかぶせる」のに使用できる。なぜ なら、一旦組み込まれると、これらの分子は重合を停止させるからである。この ような分子は、好ましくはアミノ末端アミノ酸の少なくとも最初の１０、２０ま たは６０を欠くテールファイバータンパク質の断片を含む。 ロッド構成要素タンパク質の長さを所望に応じて変えるため、同一のまたは異 なるテールファイバータンパク質の部分をテールファイバーカイマーに挿入して ロッドを長くする、またはカイマーから削除してロッドを短くすることが可能で ある。個々のロッド構成要素のナノ構造物への組み立て 上に記述した大腸菌における本発明のタンパク質の発現は、タンパク質の大量 合成をもたらし、同一細胞内における異なる構成要素の同時発現および組み立て を可能とする。組換えタンパク質産生の規模を大きくする方法は当分野において 直接かつ広く知られており、また多数の標準的プロトコールが細菌培養物から天 然および改変タンパク質を回収するのに使用できる。 好ましい実施態様においては、遺伝子３６にアンバー突然変異を有するバクテ リオファージＴ４をｓｕ°細菌株（アンバーサプレッサーではない）において増 殖させ、得られた培養物から標準的方法によりｇｐ３５を単離することにより、 天然の（非組換えの）ｇｐ３５を使用のため単離する。 Ｐ３４、Ｐ３６−Ｐ３７、Ｐ３７およびこれらに由来するカイマーは、成熟二 量体として大腸菌培養物から精製される。ｇｐ３５およびその変異体は、単量体 として精製される。精製は、標準的方法を用いて、下記の手順またはそれらの組 合せにより達成される：１）分子ふるい、イオン交換、および／または疎水性マ トリックスを用いたクロマトグラフィー；２）分取超遠心分離；および３）固定 化リガンドとして特異的抗体または他の特異的結合部分を用いたアフィニティー クロマトグラフィー。例えば、Ｐ３７のＣ末端ドメインは大腸菌Ｂのリポ多糖に 結合する。他のＴ４様ファージは、ＯｍｐＦまたはＴＳＸタンパク質等の他の細 胞表面成分と結合するＰ３７類似体を有する。または、タンパク質がリガンドま たは結合部位として作用する異種ドメインを含むように工学的に作成されている 場合は、同種パートナーを固体マトリックス上に固定し、アフィニティー精製に 使用する。例えば、このような異種ドメインは、ストレプトアビジンを塗布した 固相に結合するビオチンでありうる。 または、数個の構成要素を同一の細菌細胞内に同時発現させ、そしてより大き いナノ構造物の小組立部品を限定的in vivo 組み立ての後で、上に列挙した方法 を用いて精製する。 次に、所望のナノ構造物の組み立てが約４℃から約37℃の温度範囲で、かつ約 ５〜約９のｐＨで起こるような条件下で、精製した構成要素をin vitroで組み合 わせる。与えられたナノ構造物について、組み立ての最適条件（すなわち、塩お よび金属イオンの種類および濃度）は日常的実験、例えば各変数を個別に変えて 適切な産物の形成をモニターする、等により容易に決定される。 または、１つ以上の細菌粗抽出物を調製し、混合して、精製に先立って組み立 て反応を進行させることが可能である。 ある場合には、１つ以上の精製された構成要素が開始剤を必要とせず自発的に 集合して所望の構造物になる。別の場合には、ロッドまたはシートの重合を凝集 させる(nucleate)ために開始剤が必要とされる。これは、組み立てプロセスの場 所を限定し（すなわち、もし開始剤が固定化されているか、別な方法で局在化し ているならば）、そして最終的構造物の寸法を調節する、という利点を提供する 。例えば、機能性Ｐ３６ Ｃ末端を含むロッド構成要素は、ロッド形成を開始す るために機能性Ｐ３７ Ｎ末端を化学量論的に必要とする。したがって、開始剤 とロッド構成要素の相対的量を変えることは、ロッドポリマーの平均長さに影響 を及ぼすであろう。量の比がｎである場合、平均ロッドは約（Ｐ３７−３６）ｎ −−Ｎ末端 Ｐ３７−Ｐ３７ Ｃ末端となろう。 さらに別の場合において、最終的ナノ構造物は、単独では自己集合することが できないが、相互に組み合わせられた場合のみ自己集合できる２つ以上の構成要 素からなる。この状況では、組み立ての交代サイクルを段階的に実施して、正確 に規定された構造の最終産物を作成することができる（後述の実施例６Ｂ参照） 。 固定化開始剤を用いる場合、段階的組み立ての後、重合したユニットをマトリ ックスから取り外すことが望ましい。この目的のため、第１のロッド構成要素と の相互作用が可逆的に熱不安定性となるように特殊化された開始剤が作成されて いる（後述の実施例５参照）。このように、ポリマーはマトリックス結合開始剤 から容易に分離することができ、これにより１）均一な部品または小組立部品の 原液の容易な調製、および２）ポリマー開始、増殖、および放出という多重サイ クルのためのマトリックス結合開始剤の再使用、が可能となる。 ｇｐ３４（またはＰ３４）を介して固体マトリックスに結合されているナノ構 造物を組み立てる実施態様において、ナノ構造物を分離して溶液にするための方 法は、より高い温度（例：40℃）に暴露されると分離可能となる突然変異（熱不 安定性）ｇｐ３４を使用することである。30℃ではＰ３４は遠位テールファイバ ーの半分に結合するが、40℃で1% SDSの存在下でインキュベートすることにより それからin vitroで分離することができる（これらの条件下では安定な野性型Ｔ ４とは異なる）ような突然変異をＣ末端に有する、Ｔ４ ｔｓＢ４５と称するこ のような突然変異ｇｐ３４が報告されており(Seed，1980，Studies of the Bact eriophage T4 Proximal Half Tail Fiber,博士論文，California Institute of Technology)、使用可能である。 タンパク質の正しい（最低エネルギーの）安定した第２（２⁰）構造の形成を 触媒するタンパク質は、シャペロンタンパク質と呼ばれる。（しばしば、特に球 形タンパク質において、この安定化は三次構造によって助けられる。例えば、β バレル内における相互作用による、またはαヘリックスとの相互作用による、β シートの安定化、等である）。通常、シャペロニン(chaperonin)は、不適当な準 安定折りたたみ中間体を生じて適切な折りたたみを妨げる又は遅らせる鎖内また は鎖間の相互作用を妨げる。Ｔ４ファージテールファイバーの形態形成には２つ の公知の補助タンパク質ｇｐ５７およびｇｐ３８が存在する。これらは時々シャ ペロニンと呼ばれる。なぜなら、これらはタンパク質オリゴマーの適切な成熟に 必須であるが、最終的構造物の中には存在しないからである。 通常のシャペロニン系（例えば、ｇｒｏＥＬ／ＥＳ）は遺伝子産物の特定のオ リゴペプチド部分と相互作用して、同一のポリペプチドまたは他のペプチド上の どこか別の場所におけるオリゴペプチド部分との望ましくない相互作用を妨げる 。 これらの相互作用は、ポリペプチドの天然（低エネルギー）状態への適切な折り たたみを遅らせる、または妨げる準安定な折りたたみ中間体を形成するであろう 。 恐らくある膜タンパク質と共同で、ｇｐ５７は、２または３個の等しいｇｐ３ ７分子を並置し（そして整列させ）、および／またはその折りたたみを開始させ る役割を有する。次に、整列させたペプチドは（相互にそれらの発生しつつある β構造を安定化させながら）、ｇｐ５７とそれ以上相互作用することなく、ジッ パーをしめて梁を形成する。ｇｐ５７は、Ｔ４組み立てにおいて、ｇｐ３７のオ リゴマー化のために作用するばかりでなく、ｇｐ３４およびｇｐ１２のためにも 作用する。梁のin vitro自己集合のための構造構成要素 in vivo で産生される、開始剤とよばれる、あらかじめ形成されたキメラ又は 天然オリゴマーユニットを用いてカイマーの重合を開始する代わりに、自己集合 可能な分子（好ましくはペプチド）を、本発明のテールファイバー変異体のＮま たはＣ末端に融合した融合タンパク質（カイマー、欠失／挿入構築物）として産 生させることができる。そして、それらの末端を整列させ、通常必要とされるシ ャペロニンタンパク質（例えばｇｐ５７）および宿主細胞膜タンパク質の不在下 で、次の助けなしのオリゴマー性、安定なβ−折りたたみロッド状（梁）ユニッ トへのin vitro折りたたみを容易にすることが可能である。 例証として、ｇｐ３７−３６オリゴマー化および重合の開始剤としてＰ３７ユ ニットを考えてみられたい。ｇｐ３７のＰ３７開始剤への適切な折りたたみは、 ファージに感染した細胞膜並びに２個のシャペロンタンパク質ｇｐ３８およびｇ ｐ５７を必要とする。好ましい実施態様においては、ｇｐ３８の必要性は遺伝子 ３８を抑制する突然変異ｔｓ３８１３（ｇｐ３７のトランジションゾーンのすぐ 下流の７残基の重複）の使用によって回避されうる(Wood，W.B.，F.A．Eiserlin g およびR.A．Crowther，1994「長テールファイバー：遺伝子、タンパク質、構 造および組み立て」、Molecular Biology of Bacteriophage T4，(Jim D．Karam 編)，American Society for Microbiology，Washington，D.C.，pp282-290)。自 己集合して二量体または三量体または他のオリゴマーとなる部分（「自己集合 部分」）がトランジション領域〔トランジション領域とは、Ｔ４様テールファイ バータンパク質における保存された１７アミノ酸残基からなる領域で、ここでタ ンパク質の構造は細い繊維に狭まる；Henning ら，1994，「Ｔ偶数型コリファー ジによる受容体認識」，Molecular Biology of Bacteriophage T4，Karam(編)， American Society for Microbiology，Washington，D.C.，pp 291-298; Woodら ，1994「長テールファイバー：遺伝子、タンパク質、構造および組み立て」、Mo lecular Biology of Bacteriophage T4，Karam(編)，American Society for Mic robiology，Washington，D.C.，pp 282-290］の上流または下流にあるｇｐ３７ のＣ末端欠失に融合している場合は、発現させると自己集合部分は並行してオリ ゴマー化し、そして融合したｇｐ３７ペプチドを整列させ、他のシャペロニンタ ンパク質の不在下でそれらがin vitroで折りたたまれるのを可能とする。 Ｐ３７が二量体の場合（図８Ａ）、自己集合部分は、酵母転写因子ＧＣＮ４由 来の残基２５０〜２８１よりなるロイシンジッパー(E.K．O'Shea，R．Rutkowski およびP.S．Kim，Science 243:538，1989)等の自己二量体化ペプチド、またはａ 位置がイソロイシンと、そしてｄ位置がロイシンと置換されている自己二量体化 突然変異体ロイシンジッパーペプチド、ｐＩＬ(Harbury P.B.，T．Zhang，P.S． Kim およびT．Alper，1993，”ＧＣＮ４ ロイシンジッパー突然変異体における ２−，３−および４本鎖渦巻きコイルの間の切替え”，Science，262:1401-1407 )でありうる。Ｐ３７が三量体の場合（図８Ｂ）、自己集合部分は、ａおよびｄ 位置の両方がイソロイシンで置換された自己三量体化突然変異体ロイシンジッパ ーペプチドｐＩＩ(Harbury P.B.ら、前出)でありうる。または、自己集合部分と して Bellaら(J．Bella，M．Eaton，B．Brodsky およびH.M．Berman，1994，”1 .9 Å分割におけるコラーゲン様ペプチドの結晶および分子構造”，Science，22 6:75-81)が記述するようなコラーゲンペプチドを用いることができる。このペプ チドは中央付近の挿入された特定の非繰り返しアラニン残基により自己整列(sel f align)する。 自己集合部分を用いて、通常の開始剤の不在下で、重合の開始剤を作ることが できる。例えば、キメラ単量体のオリゴマー化および重合のための開始剤を作出 するため、ｇｐ３７−３６およびｇｐ３７−３６−Ｃ₂を図９に例証するように 用いることができる。（Ｃ₂は、二量体を形成するペプチドがｇｐ３６部分のＣ 末端に融合されていることを意味する。梁が二量体構造の場合にこれが用いられ る。別の場合は、Ｃ₃--Ｃ末端に融合されている三量体形成ペプチド-- が用いら れる。）さらに、例えば、四量体として各方向に向いている２つのコイルと会合 する大腸菌ｌａｃリプレッサーのＮ末端の使用は、２つの二量体（または二量体 のポリマー）をそれらのＮまたはＣ末端で（どちらの末端に自己集合ペプチドが 位置しているかによる）末端と末端を連結することができるであろう。それらは Ｎ末端をＣ末端に連結することもできるであろう。いずれの場合にも、それらは 単独では二量体を形成できるのみで、その各末端は適切なカイマー単量体を付加 することにより延長することができる（図９においてより単純な場合について示 すように）。 別の実施態様においては、自己集合部分をカイマーのＮ末端に融合させること ができる。ある特定の実施態様においては、自己集合部分をＴ偶数様テールファ イバータンパク質の少なくとも１０個のアミノ酸部分に融合させる。 集合してヘテロオリゴマーとなる自己集合部分もまた用いることができる。例 えば、梁の間の重合が二量体クロスβ表面の表面によって引き出される場合、そ れ以上の重合を促進しない１つの表面を有するヘテロ二量体ユニットの添加は、 終わりから２番目のユニットにキャップをして重合を終了させるのに非常に有用 である。自己集合部分の２種類の渦巻いた領域がそれら自体に対するよりも相互 にはるかに誘引的である場合は、二量体の全てはヘテロ二量体である。これは、 Ｎ末端ＪｕｎおよびＦｏｓロイシンジッパー領域についてもそう言える。 このようなヘテロ二量体ユニットのさらなる利点は、重合を段階的にして１つ のユニット（または２Ｄ整列(array)内の１つの表面）を一度に構築する能力で ある。例えば、表面ＡはＢに結合するが、両者とも自身には結合しない、と仮定 されたい。（この種類の相互作用を表すため、〔Ａ＜−＞Ｂ〕が用いられる。） Ａ／ＡとＢ／Ｂ₀とを混合する（精製を容易にするため、Ｂ₀をマトリックスに結 合させる。）。これはＢ₀／Ｂ−Ａ／Ａを形成するであろう。ここでＡ／Ａを洗 い流してＢ／Ｂを添加する。構築物はＢ₀／Ｂ−Ａ／Ａ−Ｂ／Ｂとなる。次にＡ ／Ａ₀を添加する。構築物はＢ₀／Ｂ−Ａ／Ａ−Ｂ／Ｂ−Ａ／Ａ₀となり、これ以 上の梁を加えることはできない。もちろん、他にも多くの可能性がある。使用 本発明のナノ構造物の用途は多方面にわたり、そして高度に規則的な、はっき りと定められた、秩序だって並べられた多数のファイバー、ケージ、または固体 を必要とする使用を含む。これらの材料は、他の材料と会合することを可能にす る特定の結合部位を含むことができる。 １つの実施態様において、管を三次元６角形に配列したものが分子ふるい又は フィルターとして用いられ、大きさによる粒子の選択的分離のための、正確な直 径を有する規則的な垂直細孔を提供する。このようなフィルターは、溶液の滅菌 のため（すなわち、微生物またはウイルスを除去するため）、または一連の分子 量分画フィルターとして使用することができる。この場合、細孔のタンパク質構 成要素は特定の表面特性（すなわち、親水性または疎水性、特定のリガンドに結 合する能力、等）をもたらすように改変することができる。この種類のフィルタ ー装置の利点の中には、細孔の均一性および直線性、ならびに高い細孔対マトリ ックス比が挙げられる。 別の実施態様においては、長い一次元ファイバーが、例えば紙またはセメント またはプラスチックに製造中に組み込まれ、付加的な湿潤および乾燥引っ張り強 さをもたらす。 さらに別の実施態様においては、異なるナノ構造物の整列に、抗模造マーカー として水および織物をしみ込ませる。この場合、単純な色結合抗体反応（キット の形で市販されているような）を用いて、材料の起源を確認する。または、その ようなナノ構造物の整列は、組み込みの前または後で、染料または他の物質と結 合して紙または織物を発色させるか、または別な方法でそれらの外観または特性 を改変することができるであろう。キット 本発明はまた、１つ以上の容器に本発明のカイマーおよび欠失構築物を含ん でなる、ナノ構造物を作成するためのキットを提供する。例えば、このようなキ ットの１つは、１つ以上の容器に精製ｇｐ３５および精製ｇｐ３６−３４カイマ ーを含む。別のキットは、精製ｇｐ３７−３６カイマーを含む。 以下の実施例は、本発明の範囲を制限することなく本発明を説明することを意 図するものである。 以下の実施例において、全ての制限酵素、ヌクレアーゼ、リガーゼ、等はNew England Biolabs(NEB)，Beverly，MA; Life Technologies(GIBCO-BRL)，Gaither sburg，MD およびBoehringer Mannheim Corp．(BMC)，Indianapolis，IN 等の多 数の商業的提供源から市販されているものである。 実施例１ 内部欠失P37の設計、構築及び発現 gp37をコードする遺伝子は、制限酵素BgIII のための２つの部位を含む。ヌク レオチド293 の後に生じる第一の開裂とヌクレオチド1486の後に生じる第二の開 裂である（ヌクレオチドは開始メチオニンコドンATG から番号を付けている）。 このようにBgIII によりgp37をコードするＤＮＡ断片を消化し、介在する断片（ ヌクレオチド294 〜1485）を切り出し、5'及び3'断片を再結合することにより内 部欠失gp37（△P37と称する）が生成される。この内部欠失gp37において、アル ギニン98はセリン497 に結合している。 制限消化反応混合物は以下のものを含む。 gp37プラスミドＤＮＡ（１μｇ/μl） ２μl ＮＥＢ緩衝液＃２（１０×） １μl H₂O ６μl BgIII（10 U/μl） １μl gp37プラスミドは、良好なリボソーム結合部位及び二量化につき添う遺伝子57 の下流の多数のクローニング部位に遺伝子37が挿入されたpT7-5プラスミドを表 す。この反応物を37℃で１時間インキュベートする。その後、89μlのT4ＤＮＡ リガーゼ緩衝液と１μlのT4ＤＮＡリガーゼとを加え、16℃で４時間反応を続け る。次いで、２μlのStuI制限酵素を加え、37℃で１時間インキュベーションを 続ける(StuI 制限酵素は、第一段階でBgIII により切断されずに残ったプラスミ ドを消化し、その形質転換能を約100 分の１に減少させる)。 次に、反応混合物を標準的な手順により、大腸菌株BL21（Novagenから入手） を形質転換する。形質転換混合物を100 μg/mlのアンピシリンを含む栄養寒天培 地上で平板培養し、プレートを37℃で１晩インキュベートする。 １晩のインキュベーション後に現れたコロニーを採取し、プラスミドＤＮＡを 抽出し、上述のようにBgIII で消化する。制限消化物を１％のアガロースゲル上 で分離する。欠失が成功したことは、ゲル電気泳動後に4.2 kbpの新しいＤＮＡ 断片が現れることにより示され、このＤＮＡ断片は、未だプラスミドに付着した 遺伝子37の欠失されていない部分を表し、結合反応によりBgIII 部位を再生成し た。もとの遺伝子においてBgIII 部位に結合された1.2 kbpのＤＮＡ断片はこの 時点でプラスミド中にはなく、従ってゲルから消失している。 上述のように予測される欠失について選択したプラスミドを、大腸菌株BL21（ DE3）中に入れ形質転換する。形質転換体を、培養物密度(A₆₀₀)が0.6 に達する まで30℃で増殖させる。次いで、IPTGを最終濃度0.4 mMまで添加し、30℃で２時 間インキュベートを続け、その後培養物を氷上で冷却する。20μlの培養物を取 り出し、それを１％ドデシル硫酸ナトリウム、グリセロール及び追跡用色素を含 む２倍濃度の「分解緩衝液」20μlに添加する。この溶液15μlを10％のポリアク リルアミドゲルにロードする。15μlの第２のアリコートは、最初に沸騰水浴中 で３分間インキュベートしてから同じゲルにロードする。電気泳動後、ゲルを固 定し、染色する。欠失gp37の発現は、加熱サンプル中の65〜70,000ダルトンのみ かけ分子量で移動するタンパク質種が現れることにより示される。二量化の程度 は、加熱しなかったサンプル中の分子量の高い方の種の強度及び／または65〜70 ,000ダルトンのタンパク質バンドの消失によって示される。 欠失ポリペプチドが適切に二量化する能力は、標準的なタンパク質免疫ブロッ ティング法を用いて、成熟したP37二量体としか反応しない抗P37抗血清によって 欠失ポリペプチドが認識される能力を試験することにより直接評価される。 欠失P37ポリペプチド（これも△Ｐ３７と称する）の機能的な二量化をアッセ イする別の方法は、in vivoでT4 37^-ファージと相補できる能力であり、これは まず△P37の発現を誘発し、次にT4変異体で感染し、子孫のファージを検出する ことによる。 △P37は上述したように製造され、in vivoでT4 37^-ファージを相補できること が判った。 実施例２ gp37-36 チャイマーの設計、構築及び発現 この構築物のための出発プラスミドは、gp37をコードする遺伝子を、gp36をコ ードする遺伝子の直ぐ下流（即ち、5'）にクローニングしたものである。このプ ラスミドをHaeIII で消化し、これによりヌクレオチド724の下流から3'末端まで gp37ＤＮＡの3'末端全領域を欠失させ、また5'末端からヌクレオチド349までのg p36ＤＮＡの5'末端を除去する。反応混合物は、異なるプラスミドＤＮＡを用い ることを除き実施例１に記載したものと同じであり、酵素はHaeIIIである。T4Ｄ ＮＡリガーゼを用いた結合反応、細菌の形質転換及び制限酵素分析は実施例１と 同様に行う。この場合、遺伝子37-36挿入物の中心部分の切り出し及び再結合反 応により、346フレーム内コドンの新規な挿入物が現れる。これはHaeIIIにより 一度だけ切断される（ヌクレオチド725の後）。その後得られた構築物を実施例 １に記載したように大腸菌BL21(DE3)中で発現させる。 gp37-36チャイマーの発現が成功したことは、約35,000ダルトンのタンパク質 生成物が現れることによって示される。このタンパク質は、gp36の最後の104Ｃ 末端アミノ酸に融合するgp37の最初の242Ｎ末端アミノ酸を持つ(番号118-221)。 このチャイマーの有用性は、二量化して尾−尾(end-to-end)結合する能力に依存 する。即ち、前記ポリペプチドのカルボキシ末端は、バクテリオファージT4のP3 7 タンパク質二量体のアミノ末端と相互作用し、結合二量体を形成する能力を持 ち、前記ポリペプチドの二量体のアミノ末端は、他の前記チャイマーポリペプチ ドと相互作用する能力を持つ。この性質は、△P37の導入により二量化及び重合 が開始するかどうかをアッセイすることによって試験することができる。あるい はP36二量体に特異的なポリクロナール抗体を使用して、△P37による二量化の開 始後P36を検出してもよい。 gp37-36チャイマーを、制限酵素としてHaeIIIの代りにTaqIを使用したこと以 外は上述した方法と同様にして製造した。簡単に説明すると、遺伝子37のTaqI消 化により生じた5'断片を、遺伝子36のTaqI消化により生じた3'断片に結合させた 。これにより、gp37のアミノ酸1-48がgp36のアミノ酸100-221に融合されたgp37- 36チャイマーをコードする構築物が生成された。この構築物を大腸菌BL21(DE3) 内で発現させ、チャイマーはl8kDのタンパク質として検出された。このgp37-36 チャイマーは、感染の前にgp37-36チャイマーの発現が誘発されたときに、野生 型T4の増殖を阻害することがわかった(in vitro ファージ阻害アッセイにおける ）。 実施例３ 相補的サプレッサーを製造するためのGP37-36チャイマーの突然変異 この構築の目的は、二量化可能なP37-36チャイマーの２つの変異体を生成する ことである。１つはポリペプチドのＮ末端が突然変異しているものであり（A、* P37-36 と称する）、もう１つはポリペプチドのＣ末端が突然変異しているもの である（B、P37-36*と称する）。突然変異した*P37Ｎ末端は、野生型のP36Ｃ末 端と結合を形成することができず、突然変異した*P36Ｎ末端とだけ結合を形成で きることが必要である。これは、（親P37-36タンパク質ができたようには）AとB はそれぞれ独立には重合することができず、互いに連続して連結することができ るのみであるということである（即ち、P37-36*+*P37-36→P37-36*--*P37-36） 。 第２の構築物、*P37-P36*は、*P37-36とP37-36*をin vitroで再結合すること によって生成される。*gp37-36*及びgp37-36の各モノマーをP37開始剤の存在下 で混合するとgp37-36は二量化し、重合して（P37-36）nとなり、同様に*P37は*g p37-36*の（*P37-36*）nへの重合のみを触媒するはずである。この場合、２つの チャイマーは、異なるサイズで、異なるポテンシャルの側基相互作用を持つ異な る一次配列を有し、P37の結合特性に依存して異なる表面で結合を開始し得る。 出発細菌株は、大腸菌のsu°株である（これはアンバー突然変異を抑制する能 力を欠いている）。この株に、遺伝子35、36及び37中にアンバー突然変異を含む 変異体T4バクテリオファージを感染させると、尾部繊維タンパク質が合成されな いのでファージの複製は不完全なものとなる。この株を、最初に野生型gp35、gp 36及びgp37遺伝子の発現を指向するプラスミドで形質転換し、IPTGで誘発し、続 いて変異体ファージで感染させると、感染性ファージ粒子が製造される。これは 「欠けた」コロニーが現れることによって示される。欠けたコロニーは丸くは見 えず、平坦な縁を有するが、欠損した扇形をしている。これは１つのファージに よるミクロコロニーの攻撃によって起こる。このファージは複製し、欠損した扇 形集落での細菌の増殖を抑制する。 この構築の目的のために、遺伝子36の3'末端領域（gp36のＣ末端領域に対応す る）を、ランダムにドープされたオリゴヌクレオチドで突然変異誘発する。ラン ダムにドープされたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの化学合成中に 、痕跡量（２〜３％まで）の他の３つのヌクレオチドを所定の位置で加え、その 位置に少量の割合の不正ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド混合物を得る ことにより製造される。このようなヌクレオチドをプラスミドに導入することに より、ランダムな突然変異が生じる(Hutchisonら、Methods．Enzymol．202:356 ，1991)。 プラスミドの突然変異誘発集団（但し、未修飾の遺伝子36、37を含んでいる） を、次いでsu°細菌に入れて形質転換し、上記のように変異体T4ファージを感染 させる。この場合、「欠けて」いないコロニーが現れることは、突然変異gp36の Ｃ末端がもはや野生型P37と相互反応して機能的な尾部繊維を生成できないこと を示す。このような欠けていないコロニー中に見出される推定gp36*の表現型を 、上述したような適当な免疫特異性によって二量体のＮ末端の欠如についてチェ ックし、陽性のコロニーを次のステップにおいてプラスミド源として用いる。 これらの突然変異プラスミドのいくつかを回収し、今度は同じプラスミド上に 存在するgp37のＮ末端領域にランダム突然変異を導入する、ドープされたオリゴ ヌクレオチドを用いて２回目の突然変異誘発にかける。（二重に）突然変異誘発 されたプラスミドを、再び大腸菌のsupo株中に入れて形質転換し、形質転換体を 突然変異T4ファージに感染させる。この段階で、細菌プレートを「欠けた」コロ ニーの再出現についてスクリーニングする。この段階での欠けたコロニーは、*P 37突然変異により非機能的なgp36*突然変異が抑制されたことにより、ファージ が複製したことを示す。換言すれば、このようなコロニーは、同じプラスミド上 にコードされるP36*タンパク質と相互作用する能力を得た、新規な*P37ポリペプ チドを含んでいるはずである。 次いで、*P37-36及びP37-36*の対のサプレッサーチャイマー（上述のA及びB） を、実施例２に記載したのと同様な方法で構築する。但し、この場合は、野生型 P37の代りに*P37を、野生型P36の代りにP36*を用いる。*P37-36*チャイマーは、 今度は組換えの順序における*P37-36とP37-36*の制限酵素分解と、再結合により 製造できる。*P37-36*は、P37-36チャイマーと混合することができ、そ れぞれの重合は他方の存在下で独立に行うことができる。これはこれらチャイマ ーの棒状中心部が異なる方法で修飾されているときに有用である。 実施例４ gp36-34 チャイマーの設計、構築及び発現 この構築の出発プラスミドは、遺伝子57及びgp36をコードする遺伝子を含むベ クターを、gp34をコードする遺伝子のすぐ上流（即ち、5'）にクローニングした ものである。このプラスミドをNdeIで消化すると、遺伝子36のbp219の後及び遺 伝子34のbp2594の後で切断され、これによりpg36部分から最後の148Ｃ末端コド ンが欠失し、pg34部分から最初の865Ｎ末端コドンが欠失する。反応混合物は、 異なるプラスミドＤＮＡを用いる以外は実施例１と同様であり、用いる酵素はNd eI(NEB)である。T4ＤＮＡリガーゼを用いた結合反応、細菌の形質転換及び制限 分解分析は、実施例１と同様に行う。これにより497アミノ酸（gp36の73Ｎ末端 アミノ酸とgp34の424 Ｃ末端アミノ酸、866〜1289と番号付けられる）のタンパ ク質をコードする新しいハイブリッド遺伝子が得られる。 あるいは、出発プラスミドを、遺伝子34のbp648でSphIにより切断し、Exo-Siz e−Deletion Kit(NEB)を用いて上記の欠失を生成する。 その結果得られる構築物を、実施例１に記載したように、大腸菌BL21(DE3)で 発現させる。gp36-34チャイマーの発現が成功したことは、約55,000ダルトンの タンパク質生成物が現れることにより示される。ポリペプチドホモ二量体のアミ ノ末端はgp35タンパク質と相互作用でき、そしてカルボキシ末端は他の結合gp35 分子と相互作用できることが好適である。二量体が生成したことは、実施例２に 記載したように、抗P36抗体との反応により、あるいはgp35の付着により、ある いはin vitroのファージ阻害アッセイにより検出される。 実施例５ 自己組立てのための熱不安定なタンパク質の単離 熱不安定な構造は、ナノ構造において、ａ）低温でのチャイマー重合（例えば 、gp37-36）の開始及びそれに続く不活性化と高温での開始剤からの分離、ｂ）P 3 6とgp35との間の角度形成の開始（例えば、P36のＮ末端あるいはP34のＣ末端に ついて熱不安定な付着部位を持つgp35の変異体、gp35への熱不安定な付着を生成 する変異体P36、及び熱不安定なＣ末端付着部位を持つ変異体P34）に利用するこ とができる。熱不安定性は可逆的であって、より低い温度に戻した時に適当な末 端の再付着を可能とするものでもよく、また不可逆的なものであってもよい。 熱で誘導されるP36--P37結合部の分離を可能とする変異体gp37を生成するため に、上述したようにドープされたオリゴヌクレオチドを用いてgp37ＤＮＡの5'末 端をランダムに突然変異誘発する。次いで、突然変異誘発された領域の両側に隣 接する２つのアンバー突然変異を含むT4ファージを、突然変異誘発されたＤＮＡ を含む細胞に感染させることにより、突然変異誘発されたＤＮＡ断片をT4ファー ジ中で組換えする。低多重度の感染の後、30℃の低温にて大腸菌Su°上で、非ア ンバーファージを選択する。これらプラークの子孫を緩衝液中に再懸濁し、60℃ に加熱してチャレンジする。この温度では、野生型の尾部繊維は損われることな く機能的なまま残るが、熱不安定なものは末端のP37ユニットを遊離させ、これ らのファージを非感染性にする。 この段階で、野生型ファージは、１）野生型ファージを感受性細菌に吸着させ 、吸着した野生型ファージを含む細菌を沈降（あるいは瀘別）する工程、あるい は２）ライゼートを抗P37抗体と反応させ、その後固定化プロテインＡと反応さ せ、吸着した野生型ファージを除く工程により除去される。どちらの方法におい ても、上清あるいは瀘液中に非感染性の突然変異ファージ粒子が残り、そこから 除去することができる。末端のP37部分（及びおそらく尾部繊維の残りも同様に ）が欠損した非感染性ファージを、次いで、6Mの尿素で尿素処理し、細菌スフェ ロプラストと混合し、低多重度の感染ができるようにする。これによりファージ は低温で複製し、子孫を放出する。あるいは、感染性のファージは、突然変異フ ァージを野生型P37とともに30℃でin vitroでインキュベートして再構築し、そ の後標準的なプロトコルを用いて完全な細菌細胞に感染させる。後者の感染方法 は、P36-P37結合部の熱不安定性が可逆的であるような変異体ファージを特異的 に選択する。 どちらの方法を使用しても、ファージ集団は上記のように多数回の選択を受け 、 その後個々のファージ粒子は30℃でのプラーク精製により単離される。最後に、 推定変異体のそれぞれについて以下の特性を評価する：１）高温（40〜60℃）で インキュベートした後の感染力の喪失（力価の減少で測定）２）高温でインキュ ベートした後のP37の喪失（P37特異抗体のファージ粒子への結合の減少により測 定）及び３）高温でインキュベートした後の尾部繊維の形態学的変化（電子顕微 鏡で評価）。 突然変異体を単離し、その表現型を確認した後、P37遺伝子を配列決定する。 突然変異が特定の領域あるいは残基に局在するときは、これらの配列を部位特異 的突然変異誘発の標的とし、所望の特性を最適化する。 最後に、変異体遺伝子37を発現プラスミドにクローニングし、実施例１に記載 したように大腸菌で個々に発現させる。その後、変異体P37二量体を細菌抽出物 から精製し、in vitroでの組立て反応に使用する。 同様の方法で、変異体gp35ポリペプチドを単離することができ、これはP36の Ｎ末端あるいはP34のＣ末端と熱不安定な相互作用を示す。P34との熱不安定な相 互作用のために、ファージを高温でインキュベートすると尾部繊維の遠位半分全 体（即ち、gp35-P36-P37）が失われる。この場合、実験プロトコルにおける違い は、１）ランダムな突然変異誘発をgp35遺伝子全体にわたって行なうこと、２） 遠位半分の繊維と完全な尾部繊維を含むファージ粒子の両方を、任意の抗−遠位 半分尾部繊維抗体、その後ブドウ状球菌Ａタンパク質ビーズによって沈殿させる ことにより、野生型ファージ（及び熱不安定な変異体からの遠位半分の繊維）を 、高温で不活性化された熱不安定な変異体ファージから分離すること（しかし、 まだ近位の半分の尾部繊維は結合している）、３）上清に残っている変異体ファ ージを、野生型の完全な遠位半分繊維を含む細菌抽出物とともに低温でインキュ ベートすることによって再活性化すること、及び４）30℃で増殖した熱不安定な 遺伝子35変異体のストックを、60℃での不活性化及び30℃での再インキュベーシ ョンによって可逆的熱不安定性をテストすることができるということのみである 。不活性化は、ファージの濃縮懸濁液で行い、30℃での再インキュベーションは 希釈前あるいは後のいずれかで行う。ファージが希釈後ではなく希釈前にうまく 再活性化されれば、それらのgp35が可逆的に熱不安定性であることを示す。 熱不安定なgp35--P36結合を持つ遺伝子36突然変異を生成するために、遺伝子3 6のＣ末端を上述のように突然変異誘発し、突然変異体を可逆能について選択す る。あるいは、gp35を突然変異誘発し、gp35--P36結合が60℃で解離する遺伝子3 5変異体を生成する。この場合、変異体gp35はP34に付着したままとなるので、抗 gp35抗体とともにインキュベーションをして、P36--P37のないファージを沈殿さ せ、それらを野生型ファージ及び遠位半分尾部繊維(P36-P37)から分離すること ができる。 実施例６ １次元棒状体の組立て Ａ．単純組立て：実施例２に記載したP37-36チャイマーは自己組立てが可能で あるが、棒状体の最初のユニットと結合するためのP37開始剤を必要とする。従 って、P37あるいは△P37二量体は固相マトリックスに付着されるか、開始剤とし て働く溶液中で遊離のものとする。開始剤を固相マトリックスに付着させる場合 は、熱不安定なP37二量体が好適に用いられる。gp37-36、あるいは精製gp37-36 チャイマーを含む抽出物を添加すると、長さが増加した線形の多量体（multimer ）の組立てが起こる。マトリックスに結合した場合、最終的な棒状体は高温（40 〜60℃、特定の熱不安定なP37変異体の特性に依存する）での短時間のインキュ ベーションによって遊離される。 gp37-36に対する開始剤の比率は変えることができ、棒状体のサイズ分布は、 １）サイズ排除クロマトグラフィ、２）溶液の粘度の増加、及び３）電子顕微鏡 による直接計測のいずれかにより測定する。 Ｂ．段階的組立て：実施例３に記載したP37-36の変異体*P37-36及びP37-36*は 自己重合できない。これにより、次のプロトコルに従い、規定された長さの棒状 体の段階的組立てが可能となる。 １．マトリックスに開始剤P37（好適には熱不安定なのもの）を付着させる。 ２．過剰の*gp37-36を加え、P37-36ホモオリゴマーとしてP37のＮ末端に付着 させ、オリゴマー化する。 ３．未反応の*gp37-36を洗い落とし、過剰のgp37-36*で満たす。 ４．未反応のgp37-36*を洗浄除去し、過剰の*gp37-36で満たす。 ５．２〜４のステップをn-1回繰り返す。 ６．上記のように高温での短時間のインキュベーションによりマトリックスか ら組立体を放出する。 バッチ内のタンパク質棒状体の長さは、単位ヘテロチャイマーの長さと添加の サイクル数(n)に依存する。この方法は、棒状体の長さの完全な再現性と、一回 の調製物と別の調製物との間での均一な単分散サイズ分布を保証するという利点 がある。 実施例７ 多角形(polygon)の段階的組立て 以下の組立て方法は、多角形を生成させるために角継手としてgp35を利用する 。この実施例の目的のため、gp35によって形成される角を137°であると仮定す る。棒状体単位は、実施例４に記載したP36-34チャイマーからなり、これは自己 重合できない。P36-34のホモ二量体は、gp36-34及びgp57の両方を発現する細菌 クローンから形成される。gp57は、gp36-34のP36-34へのホモ二量化に付き添う ことができる。 １．開始剤：不完全な遠位半分の繊維P36-37をP37Ｃ末端によって固体マトリ ックスに付着させる。次いで、実施例５に記載した熱不安定なgp35を加え、完全 な開始剤を生成する。 ２．過剰のP36-34チャイマーを一つのP36-34を結合するために添加する。gp35 を介してマトリックスへ結合した後、未結合チャイマーを洗浄除去する。 ３．次いで野生型（即ち非熱不安定性）gp35を過剰に添加する。インキュベー ションの後、未結合物質を洗浄除去する。 ４．ステップ２及び３を７、８回繰り返す。 ５．高温での短時間のインキュベーションによりマトリックスから組立体を遊 離させる。 遊離された重合棒状体（８単位長）は正八角形を形成し、その辺はP36-34二量 体からなり、その結合部は野生型gp35モノマーからなる。しかし、これらの８単 位は螺旋状に結合された多量体としても存在し得る。単位が閉じず、代りにもう 一つのものがその末端に付加されると、その単位はさらに閉じることができず、 どちらかの方向に螺旋が形成され得る。最初の重複の方向もまた、螺旋の対称性 を決定する。10（あるいは７）単位の棒状体は、その自然角が144°（または128 .6°）なので、多角形よりも高頻度で螺旋体を形成し得る。正多角形の閉じる可 能性はgp35の平均角のみならず、その柔軟性にも依存し、これらは遺伝的または 環境的修飾によってさらに操作できる。 このプロトコルを用いて生成される多角形の型は、棒状体単位の長さと角継手 により形成される角度に依存する。例えば、ステップ２において異なるサイズの 棒状体単位を交互に用いることができる。さらに自然角の137°とは異なる角を 形成する変異体gp35ポリペプチドを用いることもでき、これにより異なる正多角 形を生成させることができる。さらに、偶数の辺と等しい角を持つ所与の多角形 については、２つの半分が対称ならば各半分の辺は任意の寸法とすることができ る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アミノ末端から数えてアミノ酸９９〜４９６（配列番号６）を欠く、バクテ リオファージＴ４のｇｐ３７テールファイバー(tail fiber)タンパク質から本質 的になる単離されたポリペプチドであって、二量体を形成し、そしてバクテリオ ファージＴ４のＰ３６タンパク質オリゴマーと相互作用する能力を有する、該ポ リペプチド。 ２．バクテリオファージＴ４のｇｐ３６およびｇｐ３７タンパク質の間の融合タ ンパク質から本質的になる単離されたポリペプチドであって、ｇｐ３７（配列番 号６）のアミノ酸残基１〜２４２が適切な読み枠内でｇｐ３６（配列番号５）の アミノ酸残基１１８〜２２１に融合している、該ポリペプチド。 ３．該ポリペプチドの複数のカルボキシ末端がバクテリオファージＴ４のＰ３７ タンパク質のアミノ末端と相互作用し、そして付着したオリゴマーを形成する能 力を有し、かつ該ポリペプチドのオリゴマーのアミノ末端はバクテリオファージ Ｔ４のｇｐ３６ポリペプチドのカルボキシ末端と相互作用する能力を有する、請 求項２に記載のポリペプチド。 ４．バクテリオファージＴ４の２個のｇｐ３７ポリペプチドから本質的になる単 離されたポリペプチドオリゴマーであって、該オリゴマーのアミノ末端がバクテ リオファージＴ４のｇｐ３６ポリペプチドのカルボキシ末端と相互作用する能力 を欠く、該オリゴマー。 ５．バクテリオファージＴ４のＰ３７タンパク質から本質的になる単離されたポ リペプチドオリゴマーであって、該オリゴマーのアミノ末端がバクテリオファー ジＴ４のｇｐ３６ポリペプチドのカルボキシ末端と相互作用する能力を欠く、該 オリゴマー。 ６．バクテリオファージＴ４のｇｐ３６タンパク質の変異体から本質的になる単 離されたポリペプチドであって、バクテリオファージＴ４のＰ３７タンパク質オ リゴマーのアミノ末端と相互作用する能力を欠く、該ポリペプチド。 ７．バクテリオファージＴ４のｇｐ３６およびｇｐ３４タンパク質との間の融合 タンパク質から本質的になる単離されたポリペプチドであって、ｇｐ３６（配列 番号５）のアミノ酸残基１〜７３が適切な読み枠内でｇｐ３４（配列番号２）の アミノ酸残基８６６〜１２８９に融合している、該ポリペプチド。 ８．該二量体のアミノ末端がバクテリオファージＴ４のｇｐ３５タンパク質と相 互作用する能力を有する、請求項７に記載のポリペプチドのオリゴマー。 ９．バクテリオファージＴ４のｇｐ３５タンパク質の変異体から本質的になる単 離されたポリペプチドであって、バクテリオファージＴ４のＰ３４およびＰ３６ −Ｐ３７タンパク質オリゴマーとを組み合わせた時に、野性型ｇｐ３５タンパク 質を該オリゴマーと組み合わせた場合に１３７°の角度を形成する条件下で、約 １２５°未満の角度を形成する、該ポリペプチド。 10．バクテリオファージＴ４のｇｐ３５タンパク質の変異体から本質的になる単 離されたポリペプチドであって、バクテリオファージＴ４のＰ３４およびＰ３６ −Ｐ３７タンパク質オリゴマーとを組み合わせた時に、野性型ｇｐ３５タンパク 質を該オリゴマーと組み合わせた場合に１３７°の角度を形成する条件下で、約 １４５°以上の角度を形成する、該ポリペプチド。 11．バクテリオファージＴ４のｇｐ３５タンパク質の変異体から本質的になる単 離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドとバクテリオファージＴ４のＰ ３４タンパク質オリゴマーとの相互作用が約４０℃から約６０℃の温度範囲で不 安定である、該ポリペプチド。 12．バクテリオファージＴ４のＰ３７タンパク質の変異体から本質的になる単離 されたポリペプチドオリゴマーであって、該オリゴマーとバクテリオファージＴ ４のＰ３６タンパク質オリゴマーとの相互作用が約４０℃から約６０℃の温度範 囲で不安定である、該オリゴマー。 13．バクテリオファージＴ４のＰ３７タンパク質の変異体から本質的になる単離 されたポリペプチドオリゴマーであって、固定化されたリガンドに特異的に結合 する能力を全ポリペプチドに付与するように該オリゴマーのカルボキシ末端ドメ インが改変されている、該オリゴマー。 14．該リガンドがビオチン、免疫グロブリン、または二価の金属イオンからなる 群より選択される、請求項13に記載のポリペプチド。 15．複数の融合タンパク質を含んでなるナノ構造物(nanostructure)であって、 該融合タンパク質は第２テールファイバータンパク質のＣ末端アミノ酸の少なく とも最後の１０個からなる第２部分にペプチド結合によって融合している、テー ルファイバータンパク質のＮ末端アミノ酸の少なくとも最初の１０個からなる第 １部分を含み、ここで該テールファイバータンパク質はＴ偶数様(T-even-like) バクテリオファージのｇｐ３４、ｇｐ３５、ｇｐ３６およびｇｐ３７タンパク質 からなる群より選択され、該第１および第２テールファイバータンパク質が同一 であるか又は異なる、該ナノ構造物。 16．第１および第２テールファイバータンパク質が異なる、請求項15に記載のナ ノ構造物。 17．Ｔ偶数様テールファイバータンパク質の少なくとも10個のアミノ酸部分に融 合している、自己組立てして二量体または三量体を生成することが可能な分子を さらに含む、請求項15に記載のナノ構造物。 18．該分子がロイシンジッパー(zipper)の構造を有する、請求項17に記載のナノ 構造物。 19．ナノ構造物が線形一次元ロッド(rod)を含む、請求項15に記載のナノ構造物 。 20．ナノ構造物が多角形を含む、請求項15に記載のナノ構造物。 21．ナノ構造物が三次元ケージ(cage)または固体を含む、請求項15に記載のナノ 構造物。 22．ナノ構造物が二次元開放または閉鎖シートを含む、請求項15に記載のナノ構 造物。 23．Ｔ偶数様バクテリオファージのｇｐ３６タンパク質のＣ末端アミノ酸の少な くとも最後の１０〜６０個からなる該ｇｐ３６タンパク質の第２部分に融合した 、Ｔ偶数様バクテリオファージのｇｐ３７タンパク質のＮ末端アミノ酸の少なく とも最初の１０〜６０個からなる該ｇｐ３７タンパク質の部分から本質的になる 、単離された融合タンパク質。 24．Ｔ偶数様バクテリオファージのｇｐ３６タンパク質のＣ末端アミノ酸の少な くとも最後の１０個からなる該ｇｐ３６タンパク質の第２部分に融合した、Ｔ偶 数様バクテリオファージのｇｐ３７タンパク質のＮ末端アミノ酸の少なくとも最 初の１０個からなる該ｇｐ３７タンパク質の部分から本質的になる、単離された 融合タンパク質。 25．Ｔ偶数様バクテリオファージのｇｐ３６タンパク質のＣ末端アミノ酸の少な くとも最後の２０個からなる該ｇｐ３６タンパク質の第２部分に融合した、Ｔ偶 数様バクテリオファージのｇｐ３７タンパク質のＮ末端アミノ酸の少なくとも最 初の２０個からなる該ｇｐ３７タンパク質の部分から本質的になる、単離 された融合タンパク質。 26．Ｔ偶数様バクテリオファージのｇｐ３４タンパク質のＣ末端アミノ酸の少な くとも最後の１０〜６０個からなる該ｇｐ３４タンパク質の第２部分に融合した 、Ｔ偶数様バクテリオファージのｇｐ３６タンパク質のＮ末端アミノ酸の少なく とも最初の１０〜６０個からなる該ｇｐ３６タンパク質の部分から本質的になる 、単離された融合タンパク質。 27．Ｔ偶数様バクテリオファージのｇｐ３７、ｇｐ３６またはｇｐ３４タンパク 質の少なくとも２０個の隣接するアミノ酸を含んでなり、かつ、該タンパク質の アミノまたはカルボキシ末端の少なくとも５個のアミノ酸を欠く、単離されたタ ンパク質。 28．請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。 29．請求項２に記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。 30．請求項４に記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。 31．請求項５に記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。 32．請求項６に記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。 33．請求項７に記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。 34．請求項９に記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。 35．請求項10に記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。 36．請求項11に記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。 37．請求項12に記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。 38．請求項13に記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。 39．請求項23に記載のタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ。 40．請求項25に記載のタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ。 41．請求項26に記載のタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ。 42．請求項27に記載のタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ。 43．請求項26に記載のタンパク質をＴ偶数様バクテリオファージの精製ｇｐ３５ タンパク質と接触させることを含んでなる、多角形ナノ構造物の作成方法。 44．請求項23に記載のタンパク質の複数を相互に接触させることを含んでなる、 ナノ構造物の作成方法。 45．１つ以上の容器内に請求項23に記載の融合タンパク質を含んでなる、キット 。 46．１つ以上の容器内に請求項25に記載の融合タンパク質を含んでなる、キット 。 47．１つ以上の容器内に請求項26に記載の融合タンパク質を含んでなる、キット 。 48．１つ以上の容器内に請求項26に記載の融合タンパク質およびＴ偶数様バクテ リオファージの単離されたｇｐ３５タンパク質を含んでなる、キット。 49．Ｔ偶数様バクテリオファージがＴ４である、請求項23に記載のタンパク質。 50．Ｔ偶数様バクテリオファージがＴ４である、請求項26に記載のタンパク質。 51．バクテリオファージＴ４のｇｐ３６タンパク質の変異体から本質的になる単 離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドとバクテリオファージＴ４のＰ ３７タンパク質オリゴマーとの相互作用が約４０℃から約６０℃の温度範囲で不 安定である、該ポリペプチド。 52．バクテリオファージＴ４のｇｐ３６タンパク質の変異体から本質的になる単 離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドとバクテリオファージＴ４のｇ ｐ３５タンパク質との相互作用が約４０℃から約６０℃の温度範囲で不安定であ る、該ポリペプチド。 53．バクテリオファージＴ４のｇｐ３４タンパク質の変異体から本質的になる単 離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドとバクテリオファージＴ４のｇ ｐ３５タンパク質との相互作用が約４０℃から約６０℃の温度範囲で不安定であ る、該ポリペプチド。