ES2236719T3 - Metodo para fabricar un medicamento para el tratamiento de la inmunodeficiencia secundaria. - Google Patents

Abstract

SE MUESTRA UN METODO PARA PRODUCIR UNA MEZCLA DE CITOQUINA NATURAL QUE INCLUYE LAS FASES DE INMOVILIZAR AL MENOS UN MITOGENO EN UN VASO DE CULTIVO DE TEJIDO. SE SUSPENDE UNA POBLACION AISLADA DE LINFOCITOS LIBRES DE NEUTROFILOS Y ERITROCITOS EN UN MEDIO SIN SUERO Y SE COLOCA EN EL VASO. LOS LINFOCITOS SE CULTIVAN, EL MEDIO SE RETIRA, Y SE DA LUGAR A LA PRODUCCION DE CITOQUINAS.

Description

Método para fabricar un medicamento para el tratamiento de la inmunodeficiencia secundaria.

Sector técnico

La presente invención se refiere a un método mejorado de producción de una mezcla natural de citocinas.

Antecedentes de la invención

En los últimos años ha sido posible modular el sistema inmune para mejorar su respuesta y allí donde los componentes del sistema no funcionan, recuperar parcial o completamente la función del componente. Por ejemplo, el transplante de médula ósea utilizado para sustituir células madre o proporcionar células madres ausentes puede curar una inmunodeficiencia combinada severa. En otro ejemplo, se extraen las células inmunes de los pacientes con cáncer, se tratan, y se devuelven al paciente en el que hay una regresión del tumor. (Hwu y Rosenberg, 1994a; Hwu y Rosenberg, 1994b). Además, los componentes del sistema inmune humeral, tales como \gamma-globulinas e inmunoglobulinas intravenosas (IVIG), están encontrando amplias aplicaciones terapéuticas (DeSimone y otros, 1990; Hall, 1993). También se están utilizando otros componentes del sistema inmune como productos terapéuticos. (Hadden y Smith, 1992; Hadden, 1993; Talmadge y Hadden, 1994).

Los inmunomodulares son compuestos que modifican la función inmune o tienen un efecto positivo o negativo sobre la actividad del sistema inmune. La utilización de inmunomoduladores en medicina clínica incluye la reconstitución de la función inmune (o la correlación de la inmunodeficiencia) y la supresión de la función inmune normal o excesiva. Una clase principal de inmunomoduladores son las citocinas. A través de tecnología recombinante, muchas de las citocinas están disponibles actualmente para su utilización clínica. Sin embargo, el sistema inmune es complejo y, frecuentemente, es necesaria la interacción de varios componentes para modificar de forma eficaz las funciones inmunes. Sería útil diseñar preparaciones que proporcionen los diversos componentes e interacciones para regular de forma eficaz la función inmune.

Las citocinas son inmunomodulares de péptidos/proteínas producidas por células inmunes activadas que incluyen los linfocitos T (células T) derivados del timo, linfocitos B y monocitos/macrófagos. Entre las citocinas se incluyen interleucinas (IL-1 a través de IL-15), factores estimulantes de colonias (CSFs) para granulocitos y/o macrófagos (CSF-G, CSF-M, CSF-GM), factores de la necrosis tumoral (TNFs \alpha & \beta), e interferones (IFN \alpha, \beta & \delta).

La interleucina-2 (IL-2) es una linfocina descrita inicialmente como un factor de crecimiento de células T (Morgan y otros, 1976). Químicamente, la IL-2 es una glicoproteína de 133 aminoácidos y un peso molecular de 15.000 daltons. Es producida por linfocitos periféricos normales de la sangre, por linfocitos T tonsilares y esplénicos, y por linfocitos granulares grandes. La IL-2 induce y apoya la proliferación de células T estimuladas por antígenos o mitógenos. Además de la función estimuladora de los linfocitos T, la IL-2 es importante en procesos, tales como la iniciación, expansión y regulación de la respuesta inmune, la producción de interferón gamma (IFN\gamma), la inducción de las células asesinas activadas por linfocinas (LAK), la propagación de células T citolíticas, y el aumento de la actividad asesina de células asesinas naturales (NK).

La IL-2 recombinante (rIL-2) es una proteína no glicosilada que es producida por la secuencia de ADNc humana. La IL-2 diseñada genéticamente se puede obtener tal como se describe por Taniguchi y otros (1983) y Devos (1983), y las Patentes de Estados Unidos 4.604.327 y 4.569.790. Tal como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 4.518.584 de Mark y otros, se puede obtener una muteína rIL-2, en la que la cisteína en la posición 125 de la molécula de tipo salvaje o nativa ha sido sustituida por un aminoácido neutro, por ejemplo, alanina o serina.

Se puede encontrar un método para producir y aislar la rIL-2 hasta una pureza clínica en la Patente de Estados Unidos No. 4.569.790 de Koths y otros, así como el aislamiento de la IL-2 nativa a partir de células T cultivadas. Los métodos para producir IL-2 naturales también se pueden encontrar en las Patentes de Estados Unidos 4.390.623; 4.464.355; y 4.448.879. Thurman y otros (1986) dan a conocer que preparaciones diferentes de IL-2 natural purificada parcialmente (nIL-2) y preparaciones de rIL-2 varían significativamente en su actividad en varios ensayos biológicos.

Se han investigado diversas citocinas individuales, tanto naturales como recombinantes, para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades. Por ejemplo, el inteferón \alpha_{2} recombinante (rIFN \alpha_{2}) está aprobado por la Administración de Alimentos & Fármacos (FDA) de Estados Unidos para el tratamiento de la leucemia de células capilares, el sarcoma de Kaposi, el condyloma accumenata, y la hepatitis crónica. Los IFN\alphas naturales, como una mezcla (Alferon®) de los veinte o más fabricados por leucocitos, está autorizado para el condyloma accumenata. El IFN-\gamma recombinante (rIFN-\gamma) está autorizado para la enfermedad granulomatosa crónica. La rIL-2 está autorizada para el cáncer de células renales. Estas y otras rILs y rIFNs están bajo una evaluación activa en una variedad de enfermedades incluyendo diversas formas de cáncer.

Además, en muchos centros médicos y centros de investigación se ha explorado la terapia del cáncer con rIL-2. Rosenberg y compañeros (Rosenberg y otros, 1985; Mule y Rosenberg, 1987; Rosenberg, 1988; Belldegrun y Rosenberg, 1989; Chang y Rosenberg, 1989; Rosenberg, 1994) han informado sobre la utilización de rIL-2 administrado sistemáticamente en la inmunoterapia de pacientes con cáncer de células renales, y melanoma maligno. Cortesina y otros (1988, 1994) describieron los efectos de inyecciones locales-regionales de IL-2 naturales y rIL-2 en pacientes con cáncer de cabeza y cuello y encontraron que la IL-2 natural era más eficaz en la obtención de la regresión del tumor. Los pacientes a los que se les administraron grandes dosis de rIL-2 han sufrido una toxicidad amenazadora para la vida (Rosenberg y otros, 1994).

El desarrollo de la disponibilidad comercial de inmunomoduladores diseñados genéticamente (recombinantes) ha acelerado la evaluación de estos agentes en los centros para el cáncer. La eficacia limitada y la toxicidad significativa asociada con dosis elevadas de rIL-2, rIFN-\gamma, rTNF-\alpha, y otras monoterapias, sugieren la reconsideración de combinaciones naturales de citocinas en las estrategias terapéuticas. Además, se han identificado más de cien actividades diferentes en las citocinas, lo cual aumenta la duda significativa de si la inmunoterapia, basada en la combinación recombinante de citocinas, tiene una probabilidad razonable de éxito en los centros para el cáncer en un futuro
próximo.

Por ejemplo, aunque la IL-2 puede estimular la proliferación de linfocitos T como un factor de crecimiento de las células T, en el timo se producen una serie de otros factores que incluyen otras interleucinas y péptidos tímicos, y también se consideran necesarios para el desarrollo y funcionamiento de los linfocitos T. (Hadden, 1992).

El solicitante ha mostrado que una preparación no caracterizada, referida como una preparación de interleucinas naturales (NI), es eficaz en la potenciación del desarrollo de linfocitos T. Esta preparación mixta no caracterizada (también referida como interleucina de la capa leucocitaria, BC-IL) estimuló la proliferación de protimocitos, timocitos inmaduros y maduros in vitro de forma más eficaz que una concentración equivalente de rIL-2 (Hadden y otros, 1989). Esta preparación de NI aumentó el desarrollo de linfocitos T en ratones neonatales a pesar de que la rIL-2 estaba inactiva (Hadden y otros, 1989). Además, esta preparación de NI aumentó el desarrollo y funcionamiento de linfocitos T en ratones envejecidos tratados con hidrocortisona a pesar de que la rIL-2 en dosis equivalentes estaba inactiva (Hadden y otros, 1992). Además, una mezcla de NI no caracterizada en dosis bajas prolongó la vida en ratones con melanomas malignos; la rIL-2 en dosis equivalentes estaba inactiva (Kameda y otros, 1992). Estos descubrimientos indican que las mezclas de interleucinas naturales tienen una actividad no proporcionada por la IL-2.

Para corregir los defectos de los linfocitos T se han realizado experimentalmente intentos en un conjunto de ajustes que incluyen la depleción de linfocitos T (linfocitopenia) y la disfunción de linfocitos T (anergia) que tienen lugar en el envejecimiento, el cáncer, el SIDA, y otras inmunodeficiencias. Por ejemplo, se han utilizado la rIL-2 y péptidos tímicos en la infección del virus (VIH) del SIDA con resultados variables (Hadden, 1991). Se ha observado que dosis elevadas de rIL-2 por infusión continua incrementan de forma transitoria la cantidad de linfocitos T en la sangre de pacientes con infección por VIH, aunque con una toxicidad considerable (Lane y Fauci, 1985). La rIL-2 peguilada en una y tres millones de unidades produjo menos toxicidad aunque sólo efectos menores sobre la cantidad de linfocitos en humanos con la infección por VIH (Merigan, 1993). Una preparación de NI aumentó significativamente la cantidad de linfocitos T en pacientes de cáncer con linfocitopenia, pero sin toxicidad (Hadden y otros, 1994). Estos descubrimientos indican que las interleucinas naturales actúan en los humanos en bajas dosis incrementando las células T sin toxicidad y que la rIL-2, aunque es activa en dosis elevadas, es demasiado tóxica para el uso médico. Estos descubrimientos también apoyan la extrapolación de los datos de murinos con respecto al
hombre.

Todo lo anterior sugiere que la utilización de preparaciones de citocinas naturales puede ser más eficaz en la acción sobre el sistema inmune con una menor toxicidad. Sin embargo, las preparaciones que están disponibles actualmente no están bien caracterizadas y son difíciles de producir tal como se describe a continuación en la presente descripción. Para modular de forma reproducible el sistema inmune, sería útil tener preparaciones bien caracterizadas de citocinas sin suero ni mitógeno que se pueden producir fácilmente y de forma barata, y a partir de las cuales será posible establecer una preparación reproducible de toxicidad baja para su uso clínico.

La Patente de Estados Unidos No. 4.985.241, de Zimmerman y otros, da a conocer la utilización de una linfocina o citotoxina recombinante en combinación con un modificador biológico, tal como un capturador de radicales libres o un inhibidor metabólico, en el tratamiento terapéutico y profiláctico del daño biológico causado a huéspedes mamíferos por la generación de radicales libres, pero no sugiere la producción de una mezcla definida de citocinas naturales.

Por lo tanto, sería útil producir una mezcla natural de citocinas (NCM) a partir de linfocitos que se pueden utilizar terapéuticamente en el tratamiento de enfermedades y otras condiciones que incluyen un funcionamiento, desarrollo y número de linfocitos T reducido, es decir, una deficiencia inmune celular. Para que sea terapéuticamente útil, la NCM debe ser estéril, sin endotoxinas, sin suero, sin mitógeno, sin virus y sin ADN para evitar reacciones de los recipientes. Las técnicas de tamizado molecular pueden eliminar muchos de estos contaminantes. Sin embargo, cuanto más necesarios son los procesos para la producción, más elevado es el coste. Adicionalmente, cuanto más manejables son las etapas requeridas, menor es el rendimiento, así como mayores son las posibilidades de contaminación. Por lo tanto, si la NCM puede producirse de manera que se minimiza o elimina cualquiera de estos contaminantes, más efectivo será el coste de producción.

La preparación de la NI empleada en los estudios descritos anteriormente en la presente invención no contenía suero ni mitógeno, pero debía concentrarse 10x previamente a su utilización.

La interleucina-2 natural fabricada, tal como se enseñó en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.390.623 y 4.464.355, se genera en un medio sin suero, se manera que no son necesarias etapas para eliminar las proteínas del suero. La preparación está descrita como una interleucina-2 natural sin suero ni mitógeno que tiene la pertinente actividad contra el cáncer. Este material se preparó exponiendo brevemente las células al mitógeno (técnica de impulsos), originalmente descrita por Hadden y otros, (1970).

La técnica de impulsos se utiliza para estimular linfocitos en cultivos de tejido y para evitar la presencia de mitógeno en el medio cuando se recogen. Las células se cultivan inicialmente durante dos horas en presencia de un mitógeno en un medio sin suero. Después de esta incubación, las células se reaíslan y se lavan tres veces en un medio que no contiene el mitógeno y, a continuación, se resuspenden a baja densidad en un medio de cultivo de tejido nuevo sin suero y sin mitógeno. La preparación no estaba caracterizada como el resto de componentes diferentes de la
IL-2.

La Patente de Estados Unidos No. 4.448.879, de Fabricius y otros, da a conocer también un proceso de cultivo celular para producir una IL-2 natural sin suero ni mitógeno. El método utilizó células de la capa leucocitaria en un sistema de cultivo con rodillo, o en un sistema que mecánicamente recircula el medio. Sin embargo, el método aún requiere una etapa en la que las células se lavan sin mitógeno y suero y, a continuación, se recultivan en un medio sin suero ni mitógeno. En gran medida, los métodos descritos son sólo escasamente eficaces para estimular las células y producir rendimientos bajos de IL-2. Los grandes volúmenes necesarios son caros y requieren un gran manejo habilidoso y se deben concentrar antes de su utilización dando lugar a una pérdida de actividad (aproximadamente en un 50%).

Martorell y otros (1987) dan a conocer un método de inducción de la mitogénesis en un medio que contiene suero. En su método el rendimiento de la IL-2 es extremadamente bajo y requiere la presencia de suero.

Sería útil tener un método que no requiera la etapa de lavado de las células sin suero ni mitógeno y que no requiera un equipo caro.

En los sistemas descritos anteriormente en la presente descripción, los mitógenos son, generalmente, lectinas de plantas, tales como la fitohemaglutinina (PHA) y la concanavalina A (con A), que tienen afinidad por el receptor de antígeno del linfocito T (TCR) (Chilson y Nelly-Chilson, 1989) y tienen un efecto mitogénico sobre el linfocito T. La exposición de linfocitos T a dichas lectinas estimula la producción de citocinas naturales. En ausencia de suero en el medio de cultivo, sólo se producen, generalmente, niveles bajos de citocinas, particularmente, interleucinas. Por ejemplo, la IL-2 sólo se encuentra, generalmente, en el intervalo de 0-20 unidades/ml unidades por mililitro bajo condiciones de cultivo sin suero (Patentes de Estados Unidos Nos. 4.390.623 y 4.464.355). Con suero, el intervalo de la producción de IL-2 es, generalmente, de 10 ó más unidades por ml.

Sería útil estimular los linfocitos para producir citocinas, tales como la IL-2, a niveles superiores en ausencia de suero, de manera que la mezcla se pueda utilizar de forma más eficaz como agente terapéutico y sin la etapa añadida y el descenso del rendimiento del lavado de las células después de la exposición de impulsos al mitógeno o la utilización de un equipo especializado para concentrar la preparación con la pérdida asociada de actividad.

Resumen de la invención y ventajas

La presente invención da a conocer un método único de producción de una mezcla de citocinas naturales mediante las etapas de inmovilización, como mínimo, de un mitógeno en un recipiente para el cultivo de tejidos. Se suspende una población aislada de linfocitos sin neutrófilos ni eritrocitos en un medio sin suero y se coloca en el recipiente. Se cultivan los linfocitos, se extrae el medio sin mitógeno ni suero y se caracteriza para la producción de
citocinas.

Breve descripción de las figuras

Otras ventajas de la presente invención se apreciarán fácilmente ya que las mismas se entenderán mejor en referencia a la siguiente descripción detallada considerada junto con las figuras acompañantes, en las que:

La figura 1 es un gráfico de barras que muestra el contenido de ILs (expresado como la densidad óptica de IL-2 (IL_{2}) medida mediante ELISA) de la NCM en X-vivo-10 (EX_{10}), X-vivo-15 (EX_{15}), X-vivo-20 (EX_{20}) y el medio mínimo esencial (MEM) y se compara la exposición continua (barra blanca) con la exposición de impulsos (rayada) con respecto al mitógeno PHA;

La figura 2 es un gráfico de barras que muestra el efecto de la concentración de células en la generación de la NCM con PHA en 1 \mug/ml en medios diferentes, 1 x 10^{6} células/ml (doble rayado), 2,5 x 10^{6} células/ml (líneas diagonales) y 5 x 10^{6} células/ml (barra blanca);

La figura 3 es un gráfico de barras que muestra el efecto de la concentración de células en la generación de la NCM con PHA en 2 \mug/ml en medios diferentes, 1 x 10^{6} células/ml (doble rayada), 2,5 x 10^{6} células/ml (líneas diagonales) y 5 x 10^{6} células/ml (barra blanca);

La figura 4 es un gráfico de respuesta a la dosis que muestra el efecto sobre la incorporación de timidina (estimulación por ConA) del tratamiento in vitro de esplenocitos de ratones simples con una NCM (línea continua) comparada con IL-2 recombinante (línea discontinua) en concentraciones equivalentes de IL-2;

La figura 5 es un gráfico de respuesta a la dosis que muestra el efecto sobre la incorporación de timidina del tratamiento in vitro de timocitos de ratones simples con una NCM (línea continua) comparada con IL-2 recombinante (línea discontinua) en concentraciones equivalentes de IL-2;

La figura 6 es un gráfico de barras de las respuestas de los esplenocitos in vitro a la rIL-1 (barra blanca), rIL-2 (barra sólida), NCM (doble rayada) y concanavalina A (líneas diagonales) tras el tratamiento in vivo con rIL-1, rIL-2, rIL-1 + rIL-2 ó NCM;

La figura 7 es un gráfico de barras de las respuestas de los timocitos in vitro a la rIL-1, rIL-2, NCM y ConA tras el tratamiento in vivo como en la figura 6;

La figura 8 es un gráfico de barras que muestra el efecto del tratamiento in vivo de ratones con un control (barra blanca) o una NCM (barra sólida) sobre los marcadores de esplenocitos para células CD4^{+}, CD8^{+}, y CD4^{-}/CD8^{-} (- -);

La figura 9 es un gráfico de barras que muestra el efecto del tratamiento in vivo de ratones con un control (barra blanca) o una NCM (barra sólida) sobre los marcadores de timocitos para células CD4^{-}/CD8^{-} (- -); células CD4^{+}/CD8^{+} (++) y células CD8^{+} y CD4^{+} (CD4 + CD8);

La figura 10 es un gráfico de barras de las respuestas de los timocitos in vitro a la IL-1, IL-2, NCM tras el tratamiento in vivo con un medio de control (barra blanca) y NCM (barra rayada);

La figura 11 es un gráfico de barras de las respuestas de los esplenocitos como en la figura 10;

La figura 12 es un gráfico de barras de las respuestas de los timocitos in vitro a la ConA y PHA tras el tratamiento in vivo con un medio de control (barra blanca) y NCM (barra rayada); y

La figura 13 es un gráfico de barras de las respuestas de los esplenocitos como en la figura 12;

Descripción detallada de la realización preferente

La presente invención da a conocer un método de producción de forma reproducible de una mezcla caracterizada de citocinas naturales (NCM), es decir, un sobrenadante de un cultivo celular que contiene citocinas múltiples.

Se utilizan donantes múltiples de linfocitos agrupados, generalmente de la capa leucocitaria, sin neutrófilos ni eritrocitos, negativo al VIH, negativo al virus de la hepatitis, para producir la mezcla de citocinas de la presente invención. La utilización de donantes múltiples toma ventaja de la respuesta mixta de los linfocitos (MLR). Además, en una realización preferente, se utilizarían hasta cincuenta donantes cada vez para producir la mezcla y asegurar que la respuesta MLR es constante para cada preparación y para igualar la variación.

En una realización alternativa, se utilizarían linfocitos autólogos para generar la NCM. En estos casos, el paciente no debería estar libre de virus. Además, si se utilizan linfocitos autólogos, se podrían devolver al paciente cuando fueran necesarios. En una realización alternativa, los animales podrían ser la fuente de células para usos veterinarios.

Los linfocitos se cultivan en presencia de mitógenos inmovilizados en un recipiente para el cultivo de tejidos. En una realización preferente, el mitógeno se inmoviliza sobre recipientes para el cultivo de células, activados en la superficie para la selección de subgrupos de células (placas AIS microCELLector^{TM} T-25), tal como se describe en las instrucciones del fabricante. Sin embargo, se podrían utilizar otros métodos de inmovilización de mitógenos sobre la superficie del recipiente de cultivo, tales como métodos que incorporan otras técnicas de "panning" o acoplamiento a bolas de sefarosa 4B, ya que son bien conocidos en las técnicas de aislamiento de células. La utilización de células inmovilizantes para su selección es bien conocida en la técnica; sin embargo, la utilización para la generación de citocinas es una novedad.

Los mitógenos se seleccionan, generalmente, entre lectinas y anticuerpos monoclonales que estimulan que los linfocitos produzcancitocinas. En una realización preferente, se utilizan la fitohemaglutinina (PHA) o OKT3 (Ortho-
clone®, Ortho Pharmaceuticals). Se pueden utilizar otras lectinas, tales como la concanavalina A (Con A) o mitógeno de fitolaca que estimula las células B. Como mitógenos se pueden utilizar anticuerpos monoclonales para los receptores de células T, tales como CD2, CD28, CD45 y serían eficaces. Se informa que los anticuerpos anti CD28 y CD45 son hiperproductores de IL-2 (Deans y otros, 1989 y June y otros, 1989). Además, la globulina antilinfocito (ALG) tiene una actividad mitogénica para las células T. Además, se podrían utilizar combinaciones de mitógenos para activar una combinación de subpoblaciones de linfocitos. La PHA se utiliza en la realización preferente y está recubierta en una concentración inicial de, aproximadamente, 25 \mug/ml.

Los linfocitos se incuban durante 24-48 horas en un medio sin suero con exposición continua a mitógeno, es decir, sin lavados. En una realización preferente, el medio es un medio X vivo-10 o bien X vivo-15 (Whittaker). Este es un medio sin suero aprobado por la FDA para infusiones de IL-2/LAK en pacientes, tal como se expone en las instrucciones del fabricante. También se podría utilizar un medio sin suero capaz de soportar la proliferación de linfocitos humanos, tal como RPMI-1640 (Sigma).

El medio también contiene un antibiótico de 4-aminoquinolona. En la realización preferente, el antibiótico es ciprofloxacina. El antibiótico se utiliza para mantener la esterilidad e hiperproducir linfocinas. Se ha informado que la ciprofloxacina y los antibióticos relacionados incrementan las IL-2 y otras citocinas en presencia de mitógeno soluble y suero. (Riesenbeck y otros, 1994). No se ha informado que sean eficaces en ausencia de suero. Su utilización con mitógenos inmovilizados también es novedosa. La ciprofloxacina se utiliza en la realización preferente en una concentración de, aproximadamente 20 a, aproximadamente, 200 \mug/ml y más preferentemente, en una concentración de, aproximadamente, 80 \mug/ml.

Se extrae el sobrenadante y es la fuente de la mezcla de citocinas naturales (NCM) de la presente invención. El sobrenadante no tiene el mitógeno, tal como se muestra en el Ejemplo 1, y en estudios en animales y en estudios iniciales en humanos no tiene que estar concentrado.

Se puede añadir albúmina de suero humano (HSA) para estabilizar la NCM en el sobrenadante. La HSA se utiliza en lugar de la albúmina de suero de una fuente no humana, ya que la HSA ha sido aprobada por la FDA para su uso en humanos.

Se establece un perfil de citocinas del sobrenadante utilizando los siguientes ensayos. El contenido de interleucina (IL) de los sobrenadantes se confirma mediante el bioensayo para la IL-2 y mediante ELISA para otras interleucinas, CSFs, TNFs, e IFNs. Mediante el ensayo del lisato de limulus se probó la esterilidad y se midieron las endotoxinas. Específicamente, los siguientes ensayos y equipos se utilizaron en una realización preferente: ELISA de INF-\gamma (ENDOGEN), ELISAs de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, GM-CSF, G-CSF y TNF-\alpha (R&D Systems). El bioensayo de la IL-2 se realiza por el método de Gillis y otros (1978) y se expresa como unidades/ml en comparación con un patrón conocido de IL-2 (Schiapparelli Biosystems, Inc., Fairfield, NJ).

En la realización preferente, en la que se utiliza PHA como mitógeno, el perfil de citocinas para el sobrenadante tiene un perfil de:

	Citocina	Cantidad
	IL-1	10-2000 pg/ml
	IL-2	100-500 unidades/ml
	IL-6	250-10.000 pg/ml
	IL-8	12.000-100.000 pg/ml
	IL-12	100-10.000 pg/ml
	IFN-\gamma	50-15.000 pg/ml
	TNF-\alpha	50-15.000 pg/ml
	CSF-G	50-1.500 pg/ml
	CSF-GM	10-1.500 pg/ml
	IL-3/IL-4/IL-7	Cantidades Traza

La inmovilización del mitógeno produce un mayor rendimiento de NCM que el que se produce con las técnicas de impulsos de la técnica anterior. Por ejemplo, la producción de interleucinas mediante una técnica de impulsos con PHA en un medio sin suero era de IL-2 en 0-20 unidades/ml de medio (Patentes de Estados Unidos Nos. 4.390.623 y 4.464.355).

Sin embargo, la presente invención permite un incremento de la producción con una técnica de impulsos mediante la adición de un antibiótico de 4-aminoquinolona al medio sin suero para hiperinducir interleucinas que producen la IL-2 en, aproximadamente, 8-140 unidades/ml. Tal como se predice por los estudios en animales citados anteriormente, esta preparación, caracterizada como una mezcla de interleucinas naturales (NIM), en 200 unidades de IL-2/dosis, incrementó la cantidad de linfocitos T en sangre de pacientes linfopénicos con cáncer de cabeza y cuello (Hadden y otros, 1994), la cual no se ha informado para la rIL-2 en una dosis tan baja. Se ha informado de efectos similares de la IL-2 sólo en dosis superiores a 5000 veces la cantidad de IL-2 en la NCM. De este modo, es necesario indicar que la dosis de la IL-2 equivalente para la NCM se utiliza como índice de su potencia y no implica que la actividad biológica total de la NCM sea sólo la de la IL-2.

En la realización preferente de la presente invención, utilizando la exposición continua al mitógeno mediante la inmovilización y la presencia del antibiótico de 4-aminoquinolona, la NCM que se genera, generalmente, contiene IL-2 en 100-353 unidades/ml (índice de la potencia de la preparación). En la realización menos preferente, se puede llevar a cabo la presente invención con la presencia continua de antibiótico de 4-aminoquinolona y una presencia a impulsos del mitógeno, que producen la NCM. Esta combinación produce un nivel de citocinas mayor que en la técnica anterior con sólo un mitógeno a impulsos, pero no produce los niveles observados con la realización preferente de la presente invención (NCM): mitógeno inmovilizado y antibiótico de 4-aminoquinolona continuos. La realización preferente en esta situación se define por la potencia de la preparación de citocinas que no requieren de concentración, dando lugar a una pérdida de actividad biológica. La realización preferente en dosis equivalentes de IL-2 tiene la misma actividad biológica que la realización menos preferente (NIM o NI) (ver Hadden y otros (1992) y la solicitud co-pendiente por el mismo solicitante archivada el mismo día que las presentes solicitudes y asignadas al mismo asignante de la presente invención).

La producción de mezclas de citocinas naturales por linfocitos estimulados con PHA es representativa de lectinas de plantas que tienen afinidad por el receptor de antígeno de linfocitos T (TCR). Otro estimulante es la concanavalina A (Con A). De forma similar, debe esperarse que bajo estas condiciones se indujeran niveles elevados de interleucinas. La producción de mezclas de citocinas naturales por un anticuerpo monoclonal, tal como OKT-3, el cual se une a los receptores en la superficie de linfocitos T con respecto al TCR, es decir, el complejo CD3, es representativa de otros anticuerpos monoclonales de dichos receptores como DC2, CD28, CD45 y, de forma similar, debe esperarse que bajo estas condiciones se indujeran niveles elevados de citocinas. Otros mitógenos que estimulan los monocitos y células B podrían ser utilizados en combinación con mitógenos que estimulan células T para proporcionar una mezcla de citocina natural.

Debe esperarse que las combinaciones de estos estimulantes tengan efectos adicionales, tal como los observados en la Tabla III para IL-1 e IL-2.

La observación contenida en la presente descripción de que la NCM producida por PHA es rica en IL-1, IL-2, IFN-\gamma, y también contiene IL-12 (323 pg/ml), y tiene solamente cantidades de trazas de IL-3, IL-4, e IL-7, indica que bajo estas condiciones la PHA estimula, preferentemente, células T colaboradoras de tipo I (TH-1) sobre células T colaboradoras de tipo II. Esto permite la determinación de que estas preparaciones de linfocinas tendrán una actividad adyuvante para aumentar las respuestas inmunes celulares (ver Hadden, 1994). La producción de NCM con mitógenos inmovilizados se puede utilizar con subgrupos de células T (CD4, CD8, CD30, TH-1, TH-2, etc.) utilizando las placas adecuadas para la separación de células mediante "panning" previamente a la estimulación con PHA u otros mitógenos para obtener NCM que están enriquecidas en citocinas específicas de estos tipos de células.

La NCM se divide en alícuotas y se guarda a 4ºC o menos para mantener la actividad biológica.

La mezcla de citocinas naturales se puede administrar a un huésped mamífero, preferentemente humano, y tendrá un perfil específico de citocinas y, generalmente, tendrá, aproximadamente, 200-500 Unidades por dosis de IL-2 para humanos.

Los pacientes que recibirán el tratamiento serán aquellos a los que se haya diagnosticado deficiencias inmunes celulares en sí mismas o bien, en combinación con otros estados de la enfermedad. El funcionamiento y los niveles en sangre de células T de los pacientes se evaluarán tal como se conoce en la técnica y si están por debajo del valor normal, el paciente se convertirá en un candidato para el tratamiento ya que tiene una deficiencia inmune celular y la presente invención está diseñada para tratar, específicamente, la anormalidad de las células T. Es importante indicar que la linfocitopenia de células T no es sólo un reflejo de la deficiencia inmune celular en enfermedades, tales como el cáncer y el SIDA, sino también es un predictor de mortalidad en hombres ancianos sin enfermedades (Bender y otros, 1986).

La NCM se administra en dosis bajas (200-500 unidades) de la equivalencia de IL-2 según las buenas prácticas médicas, teniendo en cuenta las condiciones clínicas del paciente individual, el lugar y el método de administración, la temporización de la administración, y otros factores conocidos por los profesionales médicos. La "cantidad eficaz" para los objetivos de la presente descripción se determina, de este modo, mediante las consideraciones, tales como las conocidas en la técnica. Es importante no utilizar dosis elevadas (>1000 unidades/dosis) ya que se pierde el efecto y se incrementa la toxicidad. La cantidad debe ser eficaz para mostrar la mejora en el funcionamiento inmune en el 25% de pacientes tratados que incluyen, aunque sin limitar, mejores respuestas en mediciones in vitro del funcionamiento inmune celular, niveles incrementados de linfocitos T in vivo, mejor respuesta en la prueba de la piel para recordar antígenos o NCM, mejor índice de supervivencia, mayor rapidez de recuperación, o la mejora o eliminación de síntomas y, en el cáncer, la reducción de la masa tumoral. La NCM se puede utilizar con otros tratamientos para mejorar el funcionamiento inmune y tratar el cáncer. Hadden y otros (1994) muestran un ejemplo de uso clínico de NCM o NIM en cáncer de cabeza y cuello.

En el método de la presente invención, la NCM se puede administrar de varias maneras. Debe indicarse que la NCM se puede administrar sola o en combinación con portadores farmacéuticamente aceptables. Se puede administrar de forma subcutánea o parenteral incluyendo la administración de forma intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, perilinfática, intralinfática, e intranasal. Se prefiere, si es posible, la administración en un punto específico. También son útiles los implantes o infusiones de los compuestos. Hadden y otros (1990) y Hadden y otros (1994) proporcionan una serie de consejos.

Para la administración parental en humanos, la presente invención se formulará, generalmente, en una forma inyectable de dosis unidad, preferentemente, en un medio portador farmacéuticamente aceptable y en una realización preferente será el medio X-vivo-10. Entre los medios portadores adecuados se pueden incluir, aunque sin limitar, solución salina, escualeno, dextrosa, albúmina de suero normal, solución de Ringer, y similares. Opcionalmente, se pueden incluir en dicho vehículo cantidades menores de aditivos, tales como, por ejemplo, estabilizantes, conservantes o tampones. Dicha formulación es adecuada para la reconstrucción en inyecciones acuosas para la administración parental. La mezcla se formulará, habitualmente, en el medio portador en una concentración de, aproximadamente, 50 a 100 unidades de IL-2 (equivalencia)/ml, preferentemente, de, aproximadamente, 150 a 350 unidades de IL-2 (equivalencia)/ml. Además, la mezcla tendrá un perfil consecuente para otras citocinas tal como se expone para la presente invención.

Opcionalmente, la NCM se puede adaptar en una formulación liofilizada estable y estéril en la que los ingredientes activos están mezclados con un portador soluble en agua, y opcionalmente, un estabilizante o conservantes no tóxicos. Se pueden añadir estos aditivos que potencian la estabilidad, esterilidad, e isotonicidad de las composiciones, que incluyen conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes enmascarantes, y tampones. Se puede asegurar la prevención de la acción de los microorganismos mediante la presencia de ciprofloxacina y mediante varios agentes antimicrobianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico, y similares. Se puede llevar a cabo una absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la utilización de agentes retardantes de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Según la presente invención, sin embargo, cualquier vehículo, diluyente, o aditivo o vehículo de liberación utilizado debería ser compatible con la NCM y no alterar la actividad biológica de la presente invención.

La dosis y el régimen de dosificación dependerán, principalmente, del paciente individual en tratamiento, el historial del paciente, el tipo y la magnitud del daño biológico al paciente, la extensión del tratamiento y el protocolo del tratamiento. Las dosis pueden ser una dosis única o dosis múltiples durante un periodo de varios días. Las dosis más preferentes son aquellas que consiguen una regresión máxima de la enfermedad en el caso del cáncer o la reducción máxima de los síntomas en otros estados de la enfermedad. Se indica que los humanos son tratados, generalmente, durante más tiempo que los ratones ejemplificados en la presente descripción, y que el tratamiento tiene una longitud proporcional con respecto a la longitud del proceso de la enfermedad y la eficacia del fármaco.

Se puede administrar al paciente una formulación farmacológica de la NCM en una formulación inyectable que contiene cualquier portador compatible, tal como varios vehículos, adyuvantes, aditivos, y diluyentes; o los compuestos utilizados en la presente invención se pueden administrar parenteralmente al paciente en forma de implantes subcutáneos de liberación lenta o sistemas de liberación marcados, tales como bombas de infusión, matrices de polímeros, liposomas, y microesferas. Un implante adecuado para su utilización en la presente invención puede tomar la forma de pastilla que se disuelve lentamente después de ser implantada o un módulo de liberación biocompatible bien conocido por los técnicos en la materia. Dichas formas y módulos de dosificación bien conocidos se diseñan, de manera que los ingredientes activos se liberan lentamente durante un periodo de varios días a varias
semanas.

Por ejemplo, se prevería utilizar dichas formas de liberación lenta en sistemas de liberación por infusión en el cáncer de pulmón y esófago para liberar la NCM descrita en la presente descripción a los nódulos linfáticos regionales en la proximidad del cáncer. Otros cánceres utilizarían técnicas de liberación regional similares.

Entre los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención se incluyen: la Patente de Estados Unidos No. 4.487.603, que da a conocer una bomba de micro-infusión implantable para administrar la medicación a una velocidad controlada; la Patente de Estados Unidos No. 4.486.194, que da a conocer un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la Patente de Estados Unidos No. 4.447.233, que da a conocer una bomba de infusión de la medicación para liberar la medicación a una velocidad de infusión precisa; la Patente de Estados Unidos No. 4.447.224, da a conocer un aparato de infusión implantable de flujo variable para liberación continua de fármacos; la Patente de Estados Unidos No. 4.439.196, que da a conocer un sistema osmótico de liberación de fármacos que tiene compartimentos multi-cámaras; y la Patente de Estados Unidos No. 4.475.196, que da a conocer un sistema osmótico de liberación de fármacos. Muchos de estos implantes, sistemas de liberación, y módulos son bien conocidos por los técnicos en la materia.

La presente invención es eficaz en el incremento del número y el funcionamiento de los timocitos y en la inversión de la inmunodeficiencia secundaria, tal como tiene lugar en el cáncer, VIH, infecciones, envejecimiento, etc. El método se puede utilizar para tratar pacientes desde dentro y desde fuera del mismo, siendo este último preferente.

La explicación anterior proporciona una base fáctica para fabricar una mezcla de citocinas naturales (NCM). Los métodos utilizados y la utilidad de la presente invención se pueden mostrar mediante los siguientes ejemplos.

Los ejemplos muestran la utilidad de la presente invención en el sistema murino; sin embargo, las preparaciones equivalentes (NI y NIM) han mostrado actividad en el sistema inmune del hombre (Pulley y otros, 1994; Hadden y otros, 1994). Se eligió el sistema para ratón porque, además del hombre, el ratón es la especie más estudiada en la estructura y el funcionamiento del sistema inmune y es aceptado por los técnicos en la materia como altamente predictivo de la respuesta humana. Hasta ahora, sólo se han observado pequeñas diferencias entre los ratones y el hombre. La mayoría de los mecanismos por los que el ratón se defiende frente a varios patógenos y tumores son, esencialmente, los mismos que para el hombre. Los modelos de ratón se han utilizado ampliamente en la evaluación de inmunomoduladores para su utilización en humanos (Talmadge y otros, 1985). Debido a esta técnica anterior, los resultados de experimentos actuales con murinos son predictivos de las respuestas humanas.

Tres ejemplos muestran la naturaleza predictiva del sistema murino con inmunomoduladores. Utilizando un espectro amplio de modelos de tumores en murinos se ha mostrado la actividad antitumoral de interferones (IFNs) (Borden, 1979; Talmadge y otros, 1985) y correspondientemente en humanos, los IFNs han mostrado actividad frente a una gran variedad de tumores (Goldstein y Laslo, 1988).

En un segundo ejemplo, la utilización de modelos de tumores en murinos no produjo ningún efecto del levamisol utilizado solo sobre los tumores, aunque se observó actividad tras la quimioterapia (Symoens y Rosenthal, 1977; Spreafico, 1980). De forma similar en humanos, el levamisol mostró actividad en el cáncer de colon humano cuando se utilizó con 5-fluorouracil, pero no solo (Mutch y Hutson, 1991).

En un tercer ejemplo, la utilización de la interleucina-2 (IL-2) en dosis bajas en modelos de tumores en murinos mostró que tenía una actividad antitumoral sin toxicidad mientras que la IL-2 en dosis elevadas mostró actividad especialmente con células asesinas activadas por linfocinas (LAK) (Rosenberg y otros, 1985), pero con una toxicidad potencialmente letal. Los estudios en humanos también mostraron la eficacia de la IL-2 en dosis elevadas \pm células LAK en melanomas malignos y cáncer de células renales pero con una toxicidad mayor (Rosenberg, 1994). Aún así, actualmente están autorizadas por la FDA para el cáncer de células renales. Algunos estudios recientes muestran la eficacia de la IL-2 en dosis bajas en cáncer humano sin toxicidad (Cortesina y otros, 1988 y 1994). Los mecanismos son similares a los observados con dosis bajas en el sistema murino (Chirigos y Talmadge, 1985).

Los tres ejemplos anteriores de inmunomoduladores están actualmente aprobados para su uso clínico en el cáncer y fueron bien pronosticados por los estudios de tumores en murinos.

Además, los estudios en animales han mostrado efectos de las mezclas interleucinas naturales (nILs) no mostrados por las interleucinas recombinantes (rILs). Las nILs, pero no la rIL-2, se muestran activas en la recuperación y potenciación de las respuestas inmunes dependientes del timo (Hadden y otros, 1992) y la potenciación de la resistencia al melanoma maligno con ciclofosfamida (Kameda y otros, 1992). Este mismo patrón se ha observado en humanos en los que las ILs naturales no estaban activas en el cáncer de cabeza y cuello de una forma no compartida por IL-2 recombinantes. (Cortesina, 1988, 1994; Hadden y otros, 1994; Mattijissen y otros, 1991).

Ejemplos Métodos generales

Todas las etapas relativas al cultivo de las células se llevan a cabo bajo condiciones estériles. Los métodos generales de inmunología celular no descritos en la presente descripción se realizan tal como se describen en las referencias generales para técnicas de inmunología celular, tales como Mishell y Shiigi (Selected Methods in Cellular Immunology, 1981) y las conocidas en la técnica.

Materiales

La interleucina beta 1 recombinante humana (rIL-1 beta) fue una donación del Dr. C. Reynolds, Biological Response Modifiers Program, NCI (Frederick, MD). La interleucina 2 humana (IL-2; actividad específica de 640 U/ml) se obtuvo de Pharmacia AB (Silver Spring, MD). La IL-2 recombinante fue una donación de G. Caspritz (Hoescht Pharm., Frankfurt, Alemania). La Ciprofloxacina se adquirió de Miles Inc. (West Haven, CT); Ofloxacina de McNeil Pharmaceutical (Spring House, PA); y Norfloxacina de Merck & Co. (West Point, PA). La albúmina de suero humano (HSA) se obtuvo de Armour Pharmaceuticals (Kankakee, IL). El medio X-vivo se adquirió de Whittaker Bioproducts (Walkersville, MD). El 21-hemisuccinato de hidrocortisona y la Con A se adquirieron de Sigma Chemicals (St. Louis, MO). La PHA (HA-16) se obtuvo de Murex Diagnostics Ltd., (Dartford, Reino Unido). El OKT3 se adquirió de Ortho Pharmaceuticals (Raritan, NJ).

Preparación de la mezcla de citocinas naturales (NCM)

Se recogen glóbulos blancos de la capa leucocitaria de sangre humana de donantes múltiples con VIH negativo y virus de la hepatitis negativo. En una realización alternativa, los animales podrían ser la fuente de células para usos veterinarios. Las células de los donantes se reagrupan y se colocan en capas sobre gradientes de ficoll hypaque (Pharmacia) para producir linfocitos sin neutrófilos ni eritrocitos (Patentes de Estados Unidos Nos. 4.390.623 y 4.448.879). Se podrían utilizar métodos alternativos que darían lugar a la misma población de linfocitos de partida, tal como se conoce en la técnica.

Los linfocitos se lavan y se distribuyen en un medio X vivo-10 (Whittaker Bioproducts) en recipientes (micro-
CELLector^{TM} T-25 Cell Culture Flasks) en los que hay estimulantes inmovilizados, es decir, mitógenos. En un grupo de experimentos, se utilizaron los medios X vivo-15 y X-vivo-20 tal como se indica. El proceso de inmovilización de los estimulantes se realiza, tal como se describe por el fabricante, para inmovilizar varias sustancias para procesos de "panning", es decir, la separación de células, en los recipientes.

Las células se incuban durante 24-48 horas en un medio X vivo-10 con un 80 \mug/ml de ciprofloxacina (Miles Lab) a 37ºC en una incubadora de CO_{2}/aire. Alternativamente, se podría utilizar un medio RPMI 1640 (Webb y otros 1973). Generalmente, se utiliza HSA en un 0,1 a 0,5% (peso por volumen). Tras la incubación, se vierten los sobrenadantes y se recogen. Se puede añadir albúmina de suero humano (HSA) para estabilizar posteriormente las interleucinas. Los sobrenadantes se guardan de 4ºC a -70ºC.

Caracterización de los sobrenadantes

Los sobrenadantes recogidos se caracterizan midiendo el contenido de citocinas mediante un bioensayo para la IL-2 y ELISAs para las interleucinas restantes IL-1 - IL-15, CSFs, TNFs, e IFNs. La esterilidad se prueba mediante el cultivo en un caldo de tioglicolato y la endotoxina se medió mediante el ensayo del lisato de limulus, tal como se conoce en la técnica.

Estandarización del sobrenadante para el contenido de citocinas

Cada sobrenadante se estandariza por concentración, o bien, la administración de una cantidad, de manera que se pueden hacer comparaciones.

Extracción de contaminantes del sobrenadante

La exclusión de virus y ADN, si se utiliza, utilizará técnicas, tales como la ultrafiltración, la cromatografía en columna, el virasol, el fraccionamiento con etanol, precipitación con polietilenglicol/bentonita, radiación gamma, y/o el tratamiento con disolvente/detergente, tal como se ha utilizado para la gammaglobulina y anticuerpos monoclonales intravenosos (por ejemplo, folleto de IGIV News Update).

Modelo

Se utilizó, a no ser que se indicara lo contrario, el modelo de la involución tímica inducida por hidrocortisona en ratones envejecidos (Hadden y otros, 1992).

Animales de laboratorio

Se utilizaron en pruebas in vivo ratones hembras BALB/C envejecidas (Life Science, St. Petersburg, FL) (8-9 meses) cuyos timos habían empezado a involucionar. Los ratones se eligieron por el peso y se agruparon aleatoriamente en grupos de cinco. Los animales se alimentaron con dietas de laboratorio estándars con agua como bebida improvisada. Todos los ratones, a excepción de un grupo de control, se trataron intraperitonealmente (i.p.) con hidrocortisona (5 mg/ratón en 0,1 ml de cloruro sódico al 0,9%) durante dos días consecutivos para inducir una timectomía química y una reducción del peso del bazo.

Los ratones adultos tratados con hidrocortisona muestran una involución tímica (menos de un 30% del control) y una reducción en el tamaño del bazo (menos de un 80% del control) en dos días con una recuperación progresiva hasta 10 días.

Diseño experimental

Cada grupo de tratamiento tenía cinco (5) animales y cada experimento se repitió de 2 a 5 veces. El tratamiento se inició intraperitonealmente (i.p.) en el Día 3 y se continuó una vez por día durante un total de cinco (5) días. Se inyectaron a los grupos de tratamiento uno de los siguientes tratamientos in vivo, tal como se indican en el
texto:

1.

solución salina sin pirógeno (controles);

2.

interleucina-1 recombinante (rIL-1; 4 ng);

3.

interleucina-2 recombinante (rIL-2; 50 unidades);

4.

rIL-1 +rIL-2 (4 ng + 50 unidades, respectivamente)

5.

mezcla de citocinas naturales (NCM; 50 unidades equivalentes de IL-2)

En el día 8, los ratones se pesaron, se sacrificaron por dislocación cervical, y se extrajeron y se pesaron sus bazos y timos. Los órganos se trocearon, se lisaron los eritrocitos residuales utilizando cloruro amónico (Mishell y Shiigi 1981), y se contaron las células.

A continuación se determinó la respuesta proliferativa de las células a varias sustancias. Se preparó una muestra de células para el cultivo de células a 37ºC, CO_{2} al 5% en un medio RPMI 1640 con suero bovino fetal al 5%, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml) y 2-mercaptoetanol(2 x 10^{-5}M). Las células se colocaron en placas de micropocillos de 0,2 ml por cuadriplicado en una concentración de 1,5 x 10^{6}/ml y se incubaron durante 72 horas con uno de los que se indican en el texto a continuación:

\newpage

1.

diluyente de control (medio RPMI 1640 completo);

2.

rIL-1 (1 ng/ml);

3.

rIL-2 (2 Unidades/ml);

4.

NCM (2 Unidades/ml de equivalentes de IL-2)

5.

concanavalina A (Con A; 1,5 \mug/ml)

6.

fitohemaglutinina (PHA; 0,5 \mug/ml)

El cultivo se terminó para medir la síntesis de ADN, y por tanto, la proliferación celular, con un impulso de 18 horas de timidina tritiada (^{3}H-Timidina; New England Nuclear, Boston, MA; actividad específica 6,7 Ci/mM), se recogió con un recogedor de muestras múltiple automático y se procesó para el recuento por centelleo líquido. También se llevaron a cabo estudios de marcadores, tal como describe Hadden y otros (1992). Los resultados se expresaron como la media aritmética de cpm de tres muestras para cada animal. Para simplificar la representación de los datos obtenidos con diferentes animales, se agruparon los resultados con los diferentes animales y se calcularon juntos y, en algunos casos, se expresaron como la proporción respecto al control y en otros como medias + paréntesis para el error estándar de la media (SEM).

Análisis estadístico

Se utilizó la prueba de T de Student para analizar los datos apropiados.

Ejemplo 1

El objetivo fue encontrar una manera de estimular linfocitos para producir niveles elevados de interleucina-2 en ausencia de suero y en una manera que no producía cantidades significativas de PHA en el sobrenadante. Para hacer esto, se inmovilizó PHA sobre matraces para el cultivo de células activados en la superficie para la selección de subgrupos de células (placas AIS microCELLector^{TM} T-25), tal como se describe en las instrucciones del fabricante para la separación de las células por "panning".

El medio utilizado en estos experimentos fue X vivo-10 (Whittaker) y está aprobado para la administración en humanos por la Administración de Alimentación y Fármacos de Estados Unidos para los protocolos de las células asesinas (LAK) activadas por la linfocina interleucina-2. También se podrían utilizar medios sin suero capaces de ayudar en la proliferación de linfocitos humanos, tal como un medio esencial mínimo (MEM) o RPMI-1640 (Sigma).

Los experimentos iniciales indicaron que la PHA (HA-16, Murex Diagnostics Ltd., Dartford, Reino Unido) se podía inmovilizar mediante la técnica descrita por el fabricante y que en las condiciones óptimas apropiadas de número de células de 7,5-15 x 10^{6}/ml, tiempo de exposición de 24 horas-48 horas, y concentración de PHA de 25 ó 50 \mug/ml, se podría obtener una producción elevada de interleucinas-2 en el sobrenadante sin suero. La producción fue superior que en los métodos previos (técnica de impulsos) que utiliza exposiciones breves a PHA (NI) seguidas de lavado y el cultivo posterior con ciprofloxacina (NIM) en un medio sin suero (Tabla 1). Por lo tanto, este procedimiento con matraz se utiliza para generar la mezcla NCM.

TABLA I

	Contenido de IL de sobrenadante/ml
Breve exposición a PHA (NI)	2-20 unidades
Breve exposición a PHA \textamp ciprofloxacina (NIM) (80 \mug/ml)	8-140 unidades
Inmovilización en matraz con PHA \textamp ciprofloxacina (80 \mug/ml)	100-353 unidades

El contenido de IL-2 se midió en el sobrenadante utilizando la línea de células dependiente de CTLL IL-2 mediante los métodos descritos por Gillis y otros (1978). Se cuantificó la IL-2 en unidades internacionales con respecto a un estándar conocido que contenía 640 unidades (Pharmacia AB).

Se estudiaron sobrenadantes sin células de matraces incubados sin células en linfocitos humanos para determinar si la PHA residual estaba presente en cantidades suficientes para producir una respuesta proliferativa. Cualquier PHA residual superior a 0,01 \mug/ml daría dicha respuesta. En ausencia de células, se observaron cantidades pequeñas de PHA en el sobrenadante en 40-48 horas; sin embargo, cuando se utilizó PHA (25 \mug/ml) durante sólo 24 horas, estos niveles fueron insignificantes. Por lo tanto, se consideró que una incubación de 24 horas era óptima.

Cuando se compararon nuevos matraces con matraces antiguos en condiciones comparables, se observó un nivel más elevado de IL-2 con los matraces más antiguos. Por lo tanto, los matraces antiguos fueron, generalmente, pero no siempre, utilizados en los ejemplos para generar la mezcla NC.

Ejemplo 2

En la presente invención se llevó a cabo una comparación de los medios X vivo-10, X vivo-15 y X vivo-20 (Whittaker) y MEM, y se muestra en las figuras 1-3. Los medios X vivo-10 y X vivo-15 están aprobados para la administración a humanos por la Administración de Alimentación y Fármacos de Estados Unidos para los protocolos de las células asesinas (LAK) activadas por la linfocina interleucina-2. La generación de la NCM se comparó en medios diferentes utilizando una exposición continua frente a una exposición de impulsos a PHA a 1 \mug/ml (figura 1). El efecto de la concentración de la célula se exploró con una exposición continua a PHA a 1 \mug/ml (figura 2) y PHA a 2 \mug/ml (figura 3). Se encontró que la combinación óptima de estos factores fue una exposición continua mediante una inmovilización en un medio X vivo-10 a concentraciones de células de 2,5 ó 5,0 x 10^{6}/ml con PHA a 2 \mug/ml o a 5 x 10^{6}células/ml con PHA a 1 \mug/ml. Dado que la producción por célula es más eficaz a 2,5 x 10^{6} células/ml, se elige como óptima la concentración con PHA a 2 \mug/ml.

Ejemplo 3

Los experimentos preliminares, en tubos en lugar de matraces, se realizaron para determinar los parámetros para la ciprofloxacina y otros dos antibióticos de 4-aminoquinolona (Norfloxacina y Ofloxacina) para aumentar la producción de citocinas a partir de leucocitos humanos tras la exposición a PHA. La Tabla II muestra que 80 \mug/ml de cada uno de estos antibióticos de 4-aminoquinolona aumentó la producción de IL-1, IL-2, IL-6, IFN-\delta, TNF\alpha, y G-CSF. La producción de IL-8 fue máxima. IL-3, IL-4 e IL-7 fueron indetectables en estas circunstancias en todos los sobrenadantes. Estos resultados indican que en estas condiciones sin suero todas las 4-aminoquinolonas estudiadas a 80 \mug/ml aumentaron la producción de citocinas inducidas por PHA en condiciones sin suero.

TABLA II

\vskip1.000000\baselineskip

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Las unidades para las citocinas, excepto para IL-2,
son pg/ml y para IL-2,  unidad internacional/ml.\cr
\cr  ND: No
detectable.\cr}

Ejemplo 4

Se determinó también que se podría utilizar un anticuerpo monoclonal, OKT-3, (Ortho) que induce a los linfocitos T a proliferar y producir interleucinas como un estimulante en estas condiciones. La Tabla III muestra que el OKT-3 indujo citocinas similares a las inducidas por PHA más ciprofloxacina con células incubadas en matraces, tal como se establece en el Ejemplo 1. No se detectaron IL-3,4 y 7 con ningún tipo de estimulante. El OKT-3 produjo un pequeño efecto aditivo para diversas ILs cuando se unían con PHA y ciprofloxacina (CIPRO).

TABLA III

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Las unidades de las interleucinas, excepto para
IL-2, son pg/ml y para IL-2,  unidad
internacional/ml.\cr \cr  ND: No
detectable.\cr}

Ejemplo 5

Para mostrar la superioridad de la NCM sobre la rIL-1 in vitro, se cultivaron esplenocitos y timocitos de ratón con MEM y rIL-2 en niveles comparables de IL-2, tal como se determinó mediante el bioensayo y la síntesis de ADN medida mediante la incorporación de timidina tritiada. La NCM induce una mayor proliferación de esplenocitos (figura 4) y timocitos (figura 5) que la rIL-2 basándose en el contenido de IL-2.

Ejemplo 6

En una serie de experimentos, tal como se establece en las figuras 6 y 7, se trataron in vivo ratones con timos involucionados con rIL-1, rIL-2, combinaciones de estos factores, NCM o solución salina (controles). Se extrajeron los bazos y los timos, se estudiaron las células para las respuestas de la proliferación celular frente a las interleucinas (IL-1, IL-2), NCM y el mitógeno ConA. Los resultados se expresan como la proporción respecto de solución salina de control tratada. En el tratamiento in vivo con rIL-1, rIL-2, y sus combinaciones (rIL-1 y rIL-2) no hubo un efecto significativo en el incremento de las respuestas proliferativas de esplenocitos (figura 6) o de timocitos (figura 7) con respecto a la estimulación in vitro con IL-1, IL-2 NCM o ConA. El tratamiento con NCM in vivo aumentó significativamente tanto los esplenocitos como los timocitos con respecto a los cuatro estímulos. Estos resultados concuerdan con una mayor sensibilidad de estas células con respecto a la estimulación y/o un incremento en el número de células de respuesta.

Ejemplo 7

Las figuras 8 y 9 muestran el efecto del tratamiento in vivo con NCM sobre marcadores de esplenocitos y timocitos. Las células T no maduras están indicadas por - - y pueden representar los precursores de linfocitos T, particularmente en el timo. La NCM aumentó proporcionalmente esta población en el bazo y el timo. Las células T inmaduras están indicadas por ++ y esta población decrece proporcionalmente en el timo debido al tratamiento con NCM. Las células T maduras están indicadas por CD4+ y CD8+. La NCM incrementó las proporciones de células T maduras en el timo, pero no en el bazo. Estos resultados concuerdan con el efecto de la NCM para incrementar los precursores de células T y potenciar su desarrollo para madurar células T en el timo.

Ejemplo 8

Las figuras 10 y 11 muestran las respuestas de esplenocitos y timocitos in vitro al medio (RPMI), rIL-1 (IL_{1}), rIL-2 (IL_{2}), o NCM tras el tratamiento in vivo con un medio de control o NCM en el modelo con hidrocortisona. Los ratones se trataron tal como se ha descrito anteriormente en la presente descripción. Estos datos demuestran que la NCM aumenta las respuestas de fondo de los esplenocitos, las respuestas de los esplenocitos a IL-1 e IL-2, pero no NCM ni respuestas de fondo de los timocitos y respuestas de los timocitos a IL-1, IL-2, y NCM.

Las figuras 12 y 13 muestran las respuestas de esplenocitos y timocitos in vitro a ConA y PHA tras el tratamiento in vivo con un medio de control o la NCM. Los ratones se trataron tal como se ha descrito anteriormente en la presente descripción.

Los estudios in vitro muestran la superioridad de la NCM sobre la rIL-2 en dosis equivalentes en la sensibilización de esplenocitos y timocitos con respecto a las señales de proliferación. Los efectos sobre los timocitos también reflejan la potenciación de la diferenciación. La composición de la NCM, pero no la rIL-1, rIL-2, ni sus combinaciones, promociona potencialmente el funcionamiento (respuestas de IL) y el desarrollo (respuestas de mitógeno y marcadores celulares) de linfocitos T in vivo que es terapéuticamente relevante en cualquier medida terapéutica que requiere la estimulación del sistema inmune o la recuperación, incluso parcial, del funcionamiento del sistema inmune dañado o defectuoso. Por ejemplo, los agentes quimioterapéuticos pueden dañar las células, incluyendo los linfocitos T, implicadas en la respuesta inmune. La presente invención mediante la estimulación del funcionamiento y el desarrollo de linfocitos T puede restablecer, parcial o completamente, esta característica del sistema inmune si es dañado.

A través de esta solicitud, se hace referencia, mediante citas o numeración, a varias publicaciones, incluyendo patentes de Estados Unidos. Todas las citas de las publicaciones se listan a continuación.

Referencias

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Claims (13)

1. Método de producción de una mezcla no recombinante de citocinas, que incluye las etapas de inmovilización de, como mínimo, unmitógeno en un recipiente para el cultivo de tejido, la suspensión de una población aislada de linfocitos sin neutrófilos ni eritrocitos, en un medio sin suero, la colocación en el recipiente de los linfocitos suspendidos, el cultivo de los linfocitos, la extracción del medio, y la caracterización del medio para la producción de citocinas.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que el medio sin suero se selecciona de X vivo-10 y X vivo-15.

3. Método, según la reivindicación 1, en el que el mitógeno se selecciona del grupo que consiste en una lectina, fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (Con A), un anticuerpo monoclonal que estimula los linfocitos para la producción de citocinas, OKT3, anti-CD2, anti-CD-28, y anti CD-45.

4. Método, según la reivindicación 3, en el que se utiliza una combinación de mitógenos.

5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el mitógeno comprende PHA.

6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que entre las citocinas a caracterizar se incluyen, como mínimo, una de IFN-\gamma, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, GM-CSF, G-CSF y TNF-\alpha.

7. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el medio sin suero contiene un antibiótico de 4-aminoquinolona, estando éste seleccionado del grupo que consiste en Ciprofloxacina, Norfloxacina, y Orfloxacina.

8. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el recipiente para el cultivo de tejido es un AIS microCELLector^{TM} T-25 para el cultivo de tejido activado en la superficie, y la duración del cultivo es de veinticuatro a cuarenta y ocho horas.

9. Mezcla no recombinante de citocinas producidas, según el método de la reivindicación 1, mediante el cultivo de linfocitos en presencia de un mitógeno inmovilizado y un medio sin suero.

10. Mezcla no recombinante de citocinas, según la reivindicación 9, en la que dicho medio sin suero contiene un antibiótico de 4-aminoquinolona, y dicho mitógeno es fitohemaglutinina.

11. Mezcla no recombinante de citocinas, según la reivindicación 9, en la que dicho medio sin suero contiene un antibiótico de 4-aminoquinolona, y dicho mitógeno es fitohemaglutinina, y en la que dicha mezcla no recombinante de citocinas contiene un perfil de citocinas de IL-1 de 10 a 2.000 pg/ml, IL-2 de 100 a 500 unidades/ml, IL-6 de 250 a 10.000 pg/ml, IL-8 de 12.000 a 100.000 pg/ml, IL-12 de 100 a 10.000 pg/ml, IFN-\gamma de 50 a 15.000 pg/ml, TNF-\alpha de 50 a 15.000 pg/ml, G-CSF de 50 a 1.500 pg/ml, GM-CSF de 10 a 1.500 pg/ml, y IL-3, IL-4, IL-7 presentes en cantidades de traza.

12. Mezcla no recombinante de citocinas producidas, según el método de reivindicación 1, que comprende entre 100 y 500 unidades/ml de IL-2.

13. Utilización de una mezcla no recombinante de citocinas producidas, según la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un deficiencia inmune celular.