ES2236807T3 - Moleculas de union de aminas vasoactivas. - Google Patents

Abstract

SEGUN LA PRESENTE INVENCION, SE PRESENTAN PROTEINAS QUE SE ENLAZAN A AMINAS VASOACTIVAS (VABPS) QUE SE ENLAZAN ESPECIFICAMENTE A AMINAS VASOACTIVAS CON UNA CONSTANTE DE DISOCIACION INFERIOR A 10 -7 M Y QUE PERTENECEN A LA MISMA FAMILIA DE PROTEINAS QUE LAS MA - HBP1, FS - HBP1, FS - HBP2 Y D.RET6.

Description

Moléculas de unión de aminas vasoactivas.

La presente invención se refiere a moléculas de unión de aminas vasoactivas (VABMs) y a su uso en la regulación de la acción de las aminas vasoactivas. En particular, la invención se refiere a VABMs derivadas a partir de proteínas de parásitos o derivados de las mismas. La presente invención se refiere igualmente a la detección y cuantificación de aminas vasoactivas y al control de enfermedades y lesiones causadas por parásitos en animales y humanos, especialmente las causadas por ectoparásitos de animales domésticos. Además, se refiere al uso de moléculas de unión vasoactivas en el tratamiento de enfermedades y alergias. La presente invención se refiere igualmente al uso de tecnología de DNA recombinante para producir VABMs.

Las aminas vasoactivas, tal como la histamina y serotonina, son mediadores de la inflamación y reguladores de ciertos procesos fisiológicos en animales, incluyendo los humanos. La histamina está presente en los gránulos secretores de mastocitos y basófilos y se forma mediante la descarboxilación de la histidina. Igualmente, está presente en la ergotina y las plantas y puede ser sintetizada sintéticamente a partir de la histidina o del ácido cítrico.

Las acciones principales de la histamina en los humanos son la estimulación de la secreción gástrica, la contracción de la mayor parte del músculo liso, la estimulación cardíaca, la vasodilatación y la permeabilidad vascular incrementada. Además de su papel regulador en reacciones inmunes y procesos inflamatorios, la histamina modula igualmente la producción de muchas citocinas en el cuerpo (incluyendo a las que regulan la inflamación) y puede interferir con la expresión de receptores de citocina. Además, la histamina promueve la curación de las heridas.

Los papeles patofisiológicos principales de la histamina son como un estimulante de la secreción de ácido gástrico y como un mediador de reacciones de hipersensibilidad de tipo I tal como la urticaria y la fiebre del heno. Igualmente, la histamina o sus receptores pueden estar implicados o bien directamente o bien indirectamente en la enfermedad autoinmune, p. ej., artritis, y en el crecimiento de tumores (Falus, 1994).

La histamina produce sus acciones mediante un efecto sobre receptores de histamina específicos, los cuales son de tres tipos, H_{1}, H_{2} y H_{3}, que se distinguen mediante medicamentos agonistas y antagonistas selectivos. Los antagonistas de receptores de histamina H_{1} y H_{2} tiene usos clínicos, pero, hasta ahora, los antagonistas del receptor de H_{3} se usan fundamentalmente como herramientas de investigación.

Los antagonistas del receptor de H_{1} (antihistaminas) son ampliamente usados para el tratamiento de reacciones alérgicas incluyendo la rinitis alérgica (fiebre del heno), urticaria, picaduras de insectos e hipersensibilidades a los medicamentos. Los medicamentos que carecen de actividades antagonistas del receptor muscarínico o sedantes, son los preferidos. Igualmente, los antagonistas del receptor de H_{1} se usan como anti-eméticos para la prevención de la enfermedad del movimiento u otras causas de nauseas, incluyendo la enfermedad matinal severa. Las acciones antagonistas del receptor muscarínico de algunas antihistaminas probablemente contribuyen eficazmente, pero igualmente causan efectos secundarios. Algunos antagonistas del receptor de H_{1} son claramente fuertemente sedantes y pueden usarse para esta acción.

Existen numerosos efectos indeseables de los antagonistas del receptor de H_{1}. Cuando se usan para acciones puramente antihistamínicas, todos los efectos sobre el SNC son indeseados. Cuando se usan por su acciones sedantes o anti-eméticas, algunos de los efectos sobre el SNC tal como desvanecimiento, zumbidos y fatiga son indesados. Las dosis excesivas pueden causar excitación y pueden producir convulsiones en los niños. Las acciones antimuscarínicas periféricas son siempre indeseables. Lo más común de estos es la sequedad de la boca, pero igualmente puede ocurrir la visión borrosa, estreñimiento y la retención de orina. Igualmente, pueden observarse efectos no deseados no relacionados con las acciones farmacológicas de los medicamentos. Así, los trastornos gastro-intestinales son claramente comunes, al mismo tiempo que la dermatitis alérgica puede seguir a la aplicación tópica de estos medicamentos.

Los antagonistas del receptor de H_{2} se usan frecuentemente como inhibidores de la secreción de ácidos gástricos. Estos se usan como los medicamentos más escogidos en el tratamiento de la úlcera péptica, como medicamentos de segunda línea en el tratamiento del síndrome de Zollinger-Ellison y para el tratamiento de la esofagitis de reflujo. Han sido informados efectos no deseados que incluyen la diarrea, desvanecimiento, dolor muscular, exantemas transitorios e hiper-gastrinemia. Algunos antagonistas del receptor de H_{2} pueden causar ginecomastia en los hombres y confusión en las personas de edad.

Además de estos efectos secundarios no deseados, algunos antagonistas de la histamina son molestos si se toman con alcohol o con medicamentos. Por ejemplo, la antihistamina Seldane usada en combinación con antibióticos y antihongos puede causar efectos secundarios amenazantes para la vida.

Los medicamentos usados para controlar las acciones de la histamina no son siempre eficaces. Las razones por las cuales estos pueden tener eficacia limitada pueden relacionarse con la especificidad de estos medicamentos para solamente una subclase de receptores de histamina, particularmente cuando ciertos estados requieren la interferencia con un espectro más grande de receptores. Las moléculas de unión de histamina (HBMs) competirían por la unión de histamina con todos los receptores y, por eso, podrían ser más adecuadas para el tratamiento de ciertos estados.

La hormona serotonina (también conocida como 5-hidroxitriptamina) es tanto un vasoconstrictor como un neurotransmisor. Igualmente, puede incrementar la permeabilidad vascular, inducir la dilatación de los capilares y causar la contracción del músculo liso no vascular. La serotonina está presente en los tejidos cerebral e intestinal y se produce por la glándula pineal y por las plaquetas de la sangre. Los aspectos patológicos relacionados con la serotonina incluyen la presión sanguínea anormal, migraña, trastornos psicológicos, enfermedad respiratoria y enfermedad cardíaca coronaria. Los agonistas y antagonistas de la serotonina se usan para tratar algunos de estos trastornos, pero de nuevo ofrecen efectos secundarios no deseables.

De acuerdo con ello, existe una gran necesidad de antagonistas eficaces de aminas vasoactivas que no generen los efectos secundarios que les apartan de su aplicabilidad al tratamiento de trastornos de humanos y animales.

Igualmente, existe una necesidad de cuantificación de la histamina en, por ejemplo, productos alimenticios, diversos fluidos corporales (p. ej., plasma u orina) o sobrenadantes de cultivos de células para monitorizar los efectos de ciertos alergenos, por ejemplo, o para indicar una terapia antagonística específica para una reacción alérgica. Los sistemas normalmente usados (radioinmunoensayos y ELISAs) usan anticuerpos contra la histamina o contra derivados de la histamina. Sin embargo, la histamina no es muy inmunógena, lo que la hace difícil de generar anticuerpos de alta afinidad contra ella, y la mayoría de los sistemas de cuantificación hoy en día usados no son muy sensibles o requieren la modificación de la histamina para ser medida (por ejemplo, mediante acilación o metilación). El uso de HBMs para reemplazar anticuerpos en ensayos de este tipo proporcionarían un sistema altamente sensible para medir histamina no modificada.

Otra ventaja de las HBMs sobre los anticuerpos anti-histamina es que pueden usarse como herramientas de investigación para la separación de la histamina libre (no unida) de, por ejemplo, cultivos de células cuando se están estudiando ciertos procesos biológicos. Debido a la presencia de receptores de anticuerpos sobre la mayoría de las células, los anticuerpos podrían interferir con el normal funcionamiento de estas células.

Es sabido que los ectoparásitos que se alimentan de la sangre, tales como garrapatas, producen numerosas proteínas bioactivas que inmunomodulan la respuesta del huésped a la alimentación del parásito y, de esta forma, promueven la alimentación de sangre del parásito. Dichas proteínas inmunomoduladoras incluyen proteínas de unión de inmunoglobulina (IGBPs) que se producen en la hemolinfa y la saliva de las garrapatas y se unen a las inmunoglobulinas del huésped vertebrado (Wang y Nuttall, 1995). Igualmente, incluyen hemo proteína que porta óxido nítrico (nitroforina) salivar de la chinche triatoma Rhodnius prolixus, la cual, además de portar el óxido nítrico, puede igualmente unir la histamina (Ribeiro y Walker, 1994). Las proteínas inmunomoduladoras puede ser igualmente producidas por otros parásitos que se alimentan de la sangre, tales como mosquitos y sanguijuelas, y animales productores de veneno tales como serpientes y arañas.

Los autores de la presente invención han encontrado que los ectoparásitos que se alimentan de la sangre, por ejemplo garrapatas, producen proteínas capaces de unirse a aminas vasoactivas, particularmente a histamina y serotonina. En adelante, a estas proteínas se denominarán como proteínas de unión de aminas vasoactivas (VABPs).

Los autores de la presente invención han aislado a partir de garrapatas cuatro VABPs, las cuales se las denominan aquí como MS-HBP1, FS-HBP1, FS-HBP2 y D.RET6, y las cuales están íntimamente relacionadas unas con otras. Estas proteínas son enteramente nuevas y no muestran semejanza significativa con ninguna proteína previamente descrita. Las secuencias de DNA que contienen la codificación de estas proteínas o fragmentos de las mismas pueden usarse para aislar otras proteínas relacionadas en la misma familia a partir de la misma especie o de especies diferentes.

La presente invención proporciona una proteína de unión de amina vasoactiva (VABP) que específicamente se une a aminas vasoactivas con una constante de disociación menor de 10^{-7} M y que pertenece a la misma familia de proteínas tal como MS-HBP1, FS-HBP1, FS-HBP2 y D.RET6.

Una proteína se considera que pertenece a esta familia si el 40% o más de los aminoácidos que están completamente conservados como restos idénticos en la alineación de las cuatro VABPs solamente, están aún completamente conservados como restos idénticos si la proteína se incluye en la alineación, habiéndose obtenido la alineación usando el comando "pileup" de GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, 1994; penalización por creación de espacios = 2,50; penalización por extensión de espacios = 0,05). Igualmente, se incluye como un miembro de la familia VABP aquellas proteínas procedentes de artrópodos hematófagos que unen la histamina con una afinidad caracterizada por una constante de disociación menor de 10^{-7} M y contienen los motivos de secuencia D/E A W K/R e Y/C E/D L/I W.

Las VABPs de la presente invención incluyen variantes biológicas naturales (p. ej., variantes alélicas o variaciones geográficas dentro de las especies a partir de las cuales derivan las VABPs).

La presente invención incluye igualmente derivados funcionalmente equivalentes y fragmentos de las proteínas de unión de aminas vasoactivas, o de proteínas que pertenecen a la misma familia de proteínas que las VABPs. A las VABPs, derivados y fragmentos de la presente invención, se hace referencia aquí en adelante como moléculas de unión de aminas vasoactivas (VABPs).

Las VABPs de acuerdo con la invención son unidores de aminas vasoactivas fuertes y específicos con valores de constantes de disociación considerablemente menores de 10^{-7} M. Los receptores de histamina y serotonina de alta afinidad previamente descritos son proteínas que forman parte de las membranas de las células que se han identificado por la histamina o serotonina (Falus, 1994). De acuerdo con ello, estas difieren de las proteínas de unión de no-membrana de la presente invención.

Las VABPs de la presente invención no están relacionadas con las proteínas inmunomoduladoras conocidas anteriormente expuestas y tienen un procedimiento de acción diferente. Las VABPs de la presente invención son secretadas a partir de un organismo extraño dentro de un animal huésped mamífero y funcionan como reguladores de las respuestas inflamatoria e inmune del huésped. En el caso de los ectoparásitos que se alimentan de la sangre, dichas respuestas inflamatoria e inmune inhibirían por otra parte la alimentación por sangre del parásito. Esta función deriva de la capacidad de las VABPs para unirse específicamente a aminas vasoactivas.

Las VABPs de la presente invención pueden derivarse a partir de parásitos que se alimentan de la sangre y animales productores de veneno tales como arañas y serpientes venenosas. Preferiblemente, las VABPs de la presente invención derivan a partir de ectoparásitos que se alimentan de la sangre. Lo más preferiblemente, derivan a partir de garrapatas.

Tal como se ha establecido anteriormente, la invención incluye igualmente derivados funcionalmente equivalentes y fragmentos de las VABPs. "Funcionalmente equivalente" se usa aquí para indicar que los derivados y fragmentos retienen la capacidad para unir aminas vasoactivas o que contienen epítopos que pueden usarse en el desarrollo de vacunas que identifican miembros de la familia de proteínas de VABP tal como se ha definido anteriormente. Los derivados y fragmentos pueden derivarse a partir de VABPs nativas mediante simple o múltiple substitución(es), adición(es), inserción(es) y/o deleción(es) de aminoácidos, o mediante modificación química de uno o más aminoácidos, por ejemplo mediante desglucosilación de formas glucosiladas.

Por ejemplo, un derivado puede incluir una proteína o polipéptido adicional fusionado a la VABP en su terminación amino o carboxi, o agregada internamente a la VABP. El fin del polipéptido adicional puede ser ayudar a la detección, expresión, separación o purificación de la VABM, o puede aportar propiedades adicionales a las VABPs, según se desee. Los ejemplos de parejas potenciales de fusión incluyen \beta-galactosidasa, glutationa-S-transferasa, luciferasa, marcas de polihistidina, fragmentos de polimerasa T7 y péptidos de señal de secreción.

Las VABMs de la presente invención pueden prepararse usando técnicas conocidas de biología molecular y química de proteínas. Por ejemplo, las VABMs pueden prepararse mediante síntesis química de péptidos. Esta técnica es especialmente útil para la generación de péptidos cortos derivados a partir de las VABPs para uso como inmunógenos. Las VABMs pueden prepararse igualmente usando las técnicas conocidas de ingeniería genética tales como mutagénesis dirigida al sitio o aleatoria tal como han sido descritas, por Sambrook, 1989. Las VABMs pueden igualmente prepararse de manera sintética, usando técnicas de química orgánica, dando como resultado moléculas que imitan estructuralmente y funcionalmente al sitio de unión de histamina de cualquiera de los miembros de la familia de VABP.

Las VABMs de la presente invención pueden prepararse en forma recombinante mediante expresión en una célula huésped. Dichos procedimientos de expresión son bien conocidos por los expertos en la técnica y muchos de ellos han sido descritos en detalle por Sambrook y otros, 1989. Para el huésped elegido puede escogerse un vector de expresión adecuado. El vector puede contener una molécula de DNA recombinante conteniendo la codificación de una VABM ligada operativamente a una secuencia de control de expresión que es reconocida por la maquinaria de transcripción del huésped.

Los huéspedes adecuados incluyen las especies procarióticas comúnmente usadas, tal como E. coli, o levaduras eucarióticas que pueden hacerse con el fin de expresar altos niveles de proteínas recombinantes y que pueden fácilmente desarrollarse en grandes cantidades. Las líneas de células desarrolladas in vitro son igualmente adecuadas, particularmente cuando usan sistemas de expresión que impulsan virus, tal como el sistema de expresión de Baculovirus, el cual implica el uso de células de insectos como huéspedes. Las VABMs pueden igualmente expresarse in vivo, por ejemplo en larvas de insectos o en tejidos de mamíferos.

De acuerdo con un aspecto aún adicional, la presente invención proporciona el uso de dichas VABMs en la preparación de un medicamento para la unión de histamina en mamíferos, para regular, de esta forma, su acción y para controlar sus efectos patológicos.

La presente invención incluye igualmente el uso de las VABMs de la presente invención para preparar agentes anti-inflamatorios. Preferiblemente, las VABMs se suministran en forma de una composición farmacéutica que incluye un vehículo o vehículos inertes. La VABM puede constituir el único componente activo de la composición, o puede formar parte de un conjunto terapéutico, tal como un componente de cremas para administración tópica contra picaduras de insectos, serpientes o escorpiones, o a la piel afectada por dermatitis. Igualmente, las proteínas pueden usarse como moléculas vehículo para la histamina o compuestos relacionados con la histamina, en cremas, aceites, polvos o píldoras, con el fin de proporcionar una liberación lenta de los componentes unidos.

La presente invención comprende igualmente el uso de la VABMs de la presente invención para la cuantificación in vitro de niveles de histamina (por ejemplo, en sangre, fluido de lavado nasal, tejidos o productos alimenticios). Las VABMs pueden suministrarse como parte de un juego, conjuntamente con medios de detección que permiten la cuantificación exacta de la histamina en la muestra a ensayar (por ejemplo histamina radiomarcada, anticuerpos anti-VABM o enzimas tales como fosfatasas alcalinas, peroxidasas o luciferasas). Dichos juegos se asemejan a radioinmunoensayos, ensayos de proximidad por centelleo, o juegos ELISA, conteniendo las VABMs como moléculas de unión en lugar de anticuerpos dirigidos contra la histamina o contra análogos de la histamina. Un aspecto de la presente invención comprende la incorporación de las VABMs de la presente invención en dichos juegos.

Las VABMs de la presente invención pueden usarse igualmente para la detección de aminas vasoactivas. Cualquier procedimiento común en la técnica puede usarse como un procedimiento de detección y puede comprender el uso de técnicas de transferencia (Towbin y otros, 1979), retardo por gel o cromatografía de afinidad. Puede usarse la VABP entera, o simplemente un fragmento de unión activo con el fin de detectar el substrato. En otra realización, la VABP puede fusionarse o bien genéticamente o bien sintéticamente a otra proteína tal como fosfatasa alcalina, luciferasa o peroxidasa con el fin de facilitar la detección.

La invención comprende igualmente el uso de las VABMs de la presente invención como entidades de unión de histamina unidas a un soporte que puede usarse para separar, aislar o extraer histamina (procedente de tejidos corporales, sangre o productos alimenticios). El soporte puede comprender cualquier material inerte adecuado tal como geles, esférulas magnéticas o de otro tipo, microesferas, columnas de unión y resinas.

La presente invención incluye igualmente el uso de VABMs como herramientas en el estudio de la inflamación, procesos relacionados con la inflamación u otros efectos fisiológicos de las aminas vasoactivas, tal como el papel de la histamina en la formación de úlceras gástricas o su papel en reacciones inmunes. Por ejemplo, las VABMs pueden usarse para extraer la histamina o la serotonina en cultivos de células o en tejidos animales inflamados con el fin de estudiar la importancia de la histamina o la serotonina en estos sistemas.

Los parásitos metazoos, particularmente los artrópodos y helmintos, son igualmente fuentes de enfermedades infecciosas y otros efectos perjudiciales que tienen impactos importantes en la medicina humana y veterinaria. El control de parásitos artrópodos y helmintos normalmente se confía fundamentalmente al uso de productos químicos tales como acaricidas y anti-helmínticos. Se han realizado intentos para usar medios inmunológicos de control a través del uso de la tecnología de vacunas. Se han producido algunos éxitos en la identificación de ciertos antígenos protectores como candidatos potenciales a vacunas, pero únicamente unos pocos hasta ahora han logrado aceptación comercial, lo más notablemente para el gusano pulmonar del ganado vacuno Dictyocaulus viviparus y la garrapata del ganado vacuno Boophilus microplus. A pesar de estos desarrollos, existe, no obstante, una continua necesidad de vacunas contra parásitos metazoos y, en particular, de una vacuna que pueda usarse a través de una amplia gama de géneros de artrópodos y/o helmintos.

De acuerdo con ello, la presente invención proporciona el uso de VABMs tal como se han definido anteriormente como inmunógenos para uso como vacunas contra parásitos metazoos y, en particular, como inmonógenos protectores en el control de enfermedades causadas por artrópodos y otros parásitos metazoos. Los candidatos adecuados para la vacunación incluyen animales domesticados tales como ganado vacuno, cabras, ovinos, perros, gatos y otros animales que requieren protección contra parásitos metazoos, especialmente garrapatas. La vacuna puede incluir adyuvantes del tipo bien conocido en la técnica.

Las moléculas de ácido nucléico que comprenden una secuencia nucleótida que contiene la codificación de una VABM de la invención, forman aspectos adicionales de la invención. Estas moléculas incluyen DNA, cDNA y RNA, así como especies de ácidos nucléicos sintéticos.

Los cDNAs que contienen la codificación de las cuatro VABPs particulares se describen en la presente invención a modo de ejemplo, mostrándose sus secuencias de aminoácidos en las Figuras 1 a 4 (los nucleótidos y aminoácidos se dan en sus abreviaturas estándar de una letra).

La molécula de ácido nucléico preferida, de acuerdo con la invención, comprende una secuencia nucleótida idéntica a, o complementaria a cualquiera de, o cualquier porción que contenga la codificación de VABM, de una cualquiera de las secuencias nucleótidas mostradas en las Figuras 1 a 4 y 6, o una secuencia que está degenerada o substancialmente homóloga con la misma, o que se hibrida con dicha secuencia. Por "substancialmente homóloga" se entienden secuencias que muestran al menos un 60% de homología de secuencias. Las secuencias de ácido nucléico de acuerdo con la invención pueden ser DNA, cDNA o RNA de hebra sencilla o doble. Preferiblemente, las secuencias de ácido nucléico comprenden DNA.

Las "secuencias de hibridación" incluidas dentro del alcance de la invención son aquellas que unen bajo condiciones no restrictivas (6 x SSC/50% formamida a temperatura ambiente) y lavada bajo condiciones de baja restricción (2 x SSC, temperatura ambiente, o 2 x SSC, 40ºC) o condiciones de alta restricción, p. ej., 2 x SSC, 65ºC (en donde SSC = NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M, pH 7,2).

La invención incluye igualmente la clonación y vectores de expresión que contienen las secuencias de DNA de la invención. Dichos vectores de expresión incorporan las secuencias de control de transcripción y traducción apropiadas, por ejemplo elementos potenciadores, regiones promotor-operador, secuencias de parada de terminación, secuencias de estabilidad de mRNA, codones de iniciación y parada o sitios de unión ribosómicos, ligados en el marco con las moléculas de ácido nucléico de la invención.

Adicionalmente, puede ser conveniente provocar que la proteína recombinante sea secretada a partir de ciertos huéspedes. De acuerdo con ello, los componentes adicionales de dichos vectores pueden incluir secuencias de ácido nucléico que contengan la codificación de las secuencias de señalamiento y transformación de la secreción.

Los vectores de acuerdo con la invención, incluyen plásmidos y virus (incluyendo tanto virus bacteriófagos como eucarióticos). Muchos de dichos vectores y sistemas de expresión son bien conocidos y están documentados en la técnica. Los vectores víricos particularmente adecuados incluyen vectores a base de baculovirus, adenovirus y virus vaccinia.

Se conocen una diversidad de técnicas, las cuales pueden usarse para introducir los vectores de acuerdo con la presente invención dentro de células procarióticas o eucarióticas. Las técnicas de transformación o transfección adecuadas se encuentran bien descritas en la literatura (Sambrook y otros, 1989). En células eucarióticas, los sistemas de expresión puede ser o bien transitorios (p. ej., episómico) o permanente (p. ej., integración cromosómica), de acuerdo con las necesidades del sistema.

Las moléculas de ácido nucléico de acuerdo con la presente invención pueden igualmente usarse para crear animales transgénicos. Esto puede realizarse localmente mediante modificación de células somáticas o mediante terapia de línea de gérmenes para incorporar modificaciones heredables.

Por ello, la invención incluye igualmente células huéspedes procarióticas o eucarióticas transformadas o transfectadas u organismos transgénicos no humanos que contienen un vector que contiene la codificación de las VABMs de acuerdo con la invención tal como se han definido anteriormente.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un procedimiento para la preparación de una VABM de la invención, el cual comprende el cultivo de una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucléico de acuerdo con la invención bajo condiciones por las cuales se expresa dicha proteína, y la recuperación de la proteína así producida.

Todos los documentos mencionados en el texto se incluyen aquí como referencias.

A continuación, se describirán con mayor detalle y a modo de ejemplo diversos aspectos y realizaciones de la presente invención, con particular referencia a las VABPs aisladas a partir de garrapatas, y especialmente de la garrapata Rhipicephalus appendiculatus. Se comprenderá que pueden realizarse modificaciones de detalles sin apartarse del alcance de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es la secuencia de FS-HBP1, mostrando los cebadores de secuenciación y la estrategia de secuenciación usada.

La Figura 2 es la secuencia de FS-HBP2, mostrando los cebadores de secuenciación y la estrategia de secuenciación usada.

La Figura 3 es la secuencia de MS-HBP1, mostrando los cebadores de secuenciación y la estrategia de secuenciación usada.

La Figura 4 es la secuencia de D.RET6, mostrando los cebadores de secuenciación y la estrategia de secuenciación usada.

La Figura 5 es un gel SDS-PAGE con tinción Coomassie al 12%, mostrando extractos de glándula salivar procedentes de garrapatas que han sido purificados sobre una columna de unión de histamina. Extracto de glándula salivar de garrapatas hembra antes (banda A) y después de purificación (banda B; 1 = FS-HBP1, 2 = FS-HBP2); extracto de glándula salivar de garrapatas macho antes (banda C) y después de purificación (banda D; 3 = MS-HBP1). Se indican los pesos moleculares de los marcadores.

La Figura 6 muestra una alineación de las cuatro secuencias de aminoácidos deducidos del cDNA de las VABPs, creada usando los comandos "pileup" y "prettyplot" del Wisconsin Package de GCG.

La Figura 7 es un gel SDS-PAGE con tinción Coomassie al 12%, mostrando VABPs producidas de manera recombinante. Banda A, rMS-HBP1; banda B, rFS-HBP2); banda C, rFS-HBP1. Los marcadores, de arriba a abajo, indican pesos moleculares de 66, 48,5, 29, 18,4 y 14,2 kDa.

La Figura 8 es una transferencia Western de extractos de glándula salivar tomados a partir de garrapatas hembra y macho.

La Figura 9 muestra curvas de saturación y gráficas Scatchard que ilustran las propiedades de unión de histamina de las VABPs purificadas.

La Figura 10 es una gráfica que representa experimentos de contracción-inhibición realizados sobre íleon de cobayas. Abreviaturas usadas: H = histamina (1,25 nmol); lavado = solución de Krebs. Se agregaron aproximadamente 2 nmol de FS-HBP2; se usaron aproximadamente 4 nmol (cantidad de monómero) de MS-HBP1.

Ejemplos Garrapatas

Se criaron garrapatas de acuerdo con Jones y otros, (1988). Los tres estados de desarrollo de Rhipicephalus appendiculatus y Dermacenter reticularis se alimentaron sobre cobayas Dunkin Hartley, excepto las Dermacenter reticularis adultas, las cuales se alimentaron sobre conejos. Cuando no recibían alimentación, todas las garrapatas se mantuvieron a 21ºC y 85-90% de humedad relativa.

Ejemplo 1 Identificación de proteínas

Las glándulas salivares se extirparon de especímenes R. appendiculatus adultos hembra que habían sido alimentados sobre cobayas durante tres días. Las garrapatas macho se alimentaron durante cuatro días. Las glándulas se homogeneizaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,4), los residuos celulares se separaron por centrifugación durante 3 minutos a 10.000 g y, a continuación, el sobrenadante se aplicó a una columna que contenía 400 ml de suspensión de histamina-agarosa (Sigma). La proteína no unida se separó por lavado de la columna con 10 ml de PBS que contenía glicerol al 5% y la proteína unida pudo, a continuación, eluirse usando histamina 100 mM en PBS (2 ml). Los eluyentes se concentraron usando una unidad de ultrafiltración Centricon 3 (Amicon).

Los extractos se trataron sobre un gel SDS-PAGE al 12%, identificándose las dos proteínas principales procedentes de garrapatas hembra y una procedente de garrapatas macho (véase Figura 5). Estas proteínas se denominaron proteínas de unión de histamina específicas de las hembras 1 y 2 (FS-HBP1 y FS-HBP2) y proteína de unión de histamina específica de los machos 1 (MS-HBP1). La MS-HBP1 nunca fue detectada en tejidos de hembras; sin embargo, estuvo claramente presente en las glándulas salivares de machos y ninfas y en la totalidad de los homogenatos corporales de las larvas.

Ejemplo 2 Clonación de genes 1) Construcción de una biblioteca de cDNA

Con el fin de clonar los cDNAs que contienen la codificación de las tres proteínas del Ejemplo 1, se construyó una biblioteca de cDNA. Las glándulas salivares se extirparon a partir de 20 machos y 20 hembras de especímenes de R. appendiculatus adultos que habían sido alimentados sobre cobayas durante dos días. Las glándulas se recogieron en un tubo Eppendorf en hielo seco. El RNA mensajero se aisló usando el juego de aislamiento de mRNA FastTrack (Invitrogen).

Para la síntesis del cDNA y su inserción unidireccional dentro del vector Lambda Zap II, se usó el juego de síntesis de cDNA Zap (Stratagene). Antes de la inserción dentro del vector lambda, el cDNA se fraccionó sobre una columna Sephacryl S-400 (Pharmacia). Se construyó una biblioteca de DNA (denominada d2-I) usando cDNAs de bajo peso molecular (que variaron desde aproximadamente 100 hasta 2.000 pares de bases). La fracción de peso molecular más alto se usó para construir una segunda biblioteca (d2-II). Para el empaquetamiento se usaron extractos de empaquetamiento Packagene (Promega) de acuerdo con las instrucciones del suministrador. Aproximadamente 1,5x10^{6} unidades de formación de calvas (PFU) de cada biblioteca se amplificaron en células XL-1 Blue (Strata-
gene).

Se construyó una biblioteca de Dermacenter reticularis con mRNA de glándula salivar procedente de hembras que habían sido alimentadas con conejos durante 3 días. El aislamiento del mRNA, y la construcción de la biblioteca de cDNA se realizaron tal como se ha descrito anteriormente para la biblioteca d2-II, excepto que se usó el juego de clonación Zap Express (vector pre-digerido) (Stratagene) en lugar del juego Lambda Zap II.

2a) Rastreo de la biblioteca de cDNA de d2-II

Se extirparon fagémidos in vivo procedentes de una fracción de la biblioteca y se usaron para generar plásmidos pBluescript de doble hebra SK(-) en células XL-1 Blue (Stratagene), tal como ha sido descrito por Short y otros, (1988). Las colonias se sembraron sobre placas de agar LB que contenían ampicilina suplementadas con 5-bromo-4-cloro-3-indol-\beta-D-galactopiranosido (X-gal, Merford Laboratories, UK) e isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido (IPTG, Novabiochem) para la selección de colonias azul/bancas. Se seleccionaron aproximadamente 75 plásmidos procedentes de colonias blancas para secuenciación. El tamaño de los insertos de DNA varió desde 250 hasta 1.000 pares de bases, tal como se determinó mediante digestión con PvuII y electroforésis sobre un gel de agarosa al
1%.

Se obtuvieron los clones FS-HBP1, FS-HBP2 y MS-HBP1, y se secuenciaron parcialmente. A continuación, se rastreó la biblioteca d2-II para la búsqueda de clones adicionales mediante hibridación de DNA de extracciones de calvas (Sambrook y otros, 1989) con sondas marcadas con digoxigenina (Boehringer Manhheim). Las sondas se construyeron mediante marcado aleatorio de cebadores usando el inserto purificado procedente de los clones originales y se detectaron usando antisuero anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina (Boehringer Manheim). Por cada clon original, se aislaron y secuenciaron 3 clones adicionales.

2b) Rastreo de la biblioteca de cDNA de Dermacenter reticularis

En primer lugar, se construyó una sonda de DNA. Una fracción de la biblioteca de Dermacenter no se insertó dentro del vector Zap Express, pero, en su lugar, se sometió a PCR, usando los cebadores degenerados 5'-KTRTMRTCNGTN
RYCCANARYTCRTA (inverso). Estos cebadores estaban basados en dominios conservados en los cDNAs de FS-HBP1, FS-HBP2 y MS-HBP1 y proteínas.

La PCR consistió en 35 ciclos con una etapa de fusión de 30 segundos a 95ºC, una etapa de reasociación de cebador de 30 segundos a 50ºC y una etapa de extensión de 30 segundos a 72ºC (la Taq polimerasa procedía de Perkin Elmer y los deoxinucleótidos de Pharmacia). Se obtuvo una banda de DNA sencilla del tamaño esperado (alrededor de 400 pares de bases), la cual se marcó con digoxigenina para rastrear la biblioteca (tal como anteriormente). El D.RET6 fue uno de los diversos clones positivos.

3) Secuenciación

Se secuenciaron las hebras de codificación y de no codificación enteras de los insertos FS-HBP1, FS-HBP2, MS-HBP1 y D.RET6. Los plásmidos se purificaron a partir de cultivos de una noche de acuerdo con Good y Feinstein (1992), se desnaturalizaron mediante álcali (Meirendorf y Pfeffer, 1987) y se secuenciaron mediante la reacción de terminación de cadena mediada por dideoxi de Sanger (Sanger y Coulson, 1975). En las Figuras 1-4 se muestran las estrategias de secuenciación.

3a) FS-HBP1

Tal como se muestra en la Figura 1, el clon original se secuenció a partir de los sitios del cebador T3 (potenciación) y T7 (inverso) que flanquean la región del poliligador pBluescript SK(-). Adicionalmente, se secuenciaron los subclones XVIIa (que comprende los nucleótidos 221 a 770 del inserto original) y XVIIb (nucleótidos 509 a 770) a partir del sitio T3 (reacciones indicadas mediante T3a y T3b en la figura). Los subclones XVIIIc (1 a 221) y XVIIId (1 a 509) se secuenciaron a partir del sitio T7 (T7c y T7d).

El Xviiia se creó mediante la digestión del clon original con PstI (cortes en la posición 221 del inserto y en la región del poliligador más arriba) seguido de re-ligamiento; el Xviiib mediante digestión con XbaI (cortes en la posición 509 y más arriba del inserto). Los Xviiic y Xviiid se obtuvieron usando EcoRI (cortes más arriba del inserto) conjuntamente con PstI y XbaI, respectivamente, y ligamiento de las piezas escindidas nuevamente dentro del plásmido pBluscript (SK(-). La secuencia señal se muestra en letras de tipo negrita en la figura y el sitio de escisión de la señal se indica mediante la flecha vertical (\uparrow). Igualmente, la secuencia subrayada se obtuvo mediante secuenciación con terminación amino de la proteína expresada.

3b) FS-HBP2

La Figura 2 muestra el cDNA y la secuencia aminoácida deducida del clon FS-HBP2. El clon original se secuenció a partir de los sitios del cebador T3 (potenciación) y T7 (inverso), como lo fueron 2 subclones (52a y 52b) obtenidos mediante digestión de 52-1 con HincII (cortes en la posición 254, las reacciones se indican mediante T3b y T7a). El HincII se usó en combinación con XhoI (cortes del poliligador más abajo del inserto) para la construcción de 52a (que comprende los nucleótidos 1 a 254) y, en combinación con SmaI (cortes más arriba), para la construcción de 52b (nucleótidos 254 a 793). La digestión fue seguida por terminación con extremos romos con T4 polimerasa (New England Biolabs) y re-ligamiento de los plásmidos. Finalmente, se usaron cebadores específicos del inserto potenciador (\rightarrow) e inverso (\leftarrow), los cuales fueron idénticos o complementarios de las secuencias subrayadas en la figura.

La cola polyA está en itálicas y la señal de poliadenilación relacionada está doblemente subrayada. La secuencia señal se muestra en tipo de letra negrita y el sitio de escisión de la señal se indica mediante la flecha vertical (\uparrow). Igualmente, la secuencia subrayada se obtuvo mediante secuenciación con terminación amino de la proteína expre-
sada.

3c) MS-HBP1

La Figura 3 muestra el cDNA y la secuencia aminoácida deducida del clon MS-HBP1. El clon se secuenció a partir de los sitios del cebador T3 (potenciación) y T7 (inverso) que flanquean la región del poliligador pBluescript SK(-) Adicionalmente, se usaron cebadores específicos del inserto potenciador (\rightarrow) e inverso (\leftarrow), los cuales fueron idénticos o complementarios de las secuencias subrayadas en la figura.

La triple línea indica el sitio de N-glucosilación relacionada. Las letras en itálica indican la cola polyA y la doble línea marca la señal de poliadenilación relacionada. La secuencia señal se muestra en tipo de letra negrita y el sitio de escisión de la señal se indica mediante la flecha vertical (\uparrow). Igualmente, la secuencia subrayada se obtuvo mediante secuenciación con terminación amino de la proteína expresada.

3d) D.RET6

En la Figura 4 se muestra el cDNA y la secuencia aminoácida deducida del clon D.RET6. El inserto de DNA se secuenció a partir de los sitios del cebador T3 (potenciación) y T7 (inverso) que flanquean la región del poliligador pBK-CMV y a partir de los cebadores específicos del inserto potenciador (\rightarrow) e inverso (\leftarrow), los cuales fueron, respectivamente, idénticos o complementarios de las secuencias subrayadas en la figura. La secuencia señal se muestra en tipo de letra negrita y el sitio de escisión de la señal se indica mediante la flecha vertical (\uparrow).

3e) Análisis de secuencias

Los datos de secuencias se analizaron usando el software de análisis de secuencias GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, 1994). Las investigaciones sobre la base de datos de proteínas se realizaron en el National Centre for Biotechnology Information (NCBI) usando el servicio de red BLAST.

En la Figura 6 se muestra un alineamiento de las secuencias aminoácidas deducida del cDNA de las VABPs. Este se creó usando los comandos "pileup" y "prettyplot" del software GCG. Las proteínas maduras comienzan en los aminoácidos subrayados, tal como se determinó mediante secuenciación N-terminal de las VABPs secretadas (véase más abajo), lo que sugiere que las regiones precedentes representan secuencias señal. Los pesos moleculares calculados, excluyendo las secuencias señal, son 19.442 para FS-HBP1, 19.471 para FS-HBP2, 21.026 para MS-HBP1 y 21.025 para D.RET6. Los puntos iso-eléctricos calculados son 4,0, 3,9, 5,0 y 4,6, respectivamente.

El MS-HBP1 tiene una identidad del 40% (57% de similitud) con la FS-HBP1, 43% (62%) con la FS-HBP2 y 32% (50%) con la D.RET6. La FS-HBP1 tiene un 66% de identidad (78% de similitud) con la FS-HBP2 y 32% (49%) con la D.RET6. La FS-HBP2 tiene una identidad del 39% y 56% de similitud con la D.RET6. Estos porcentajes se obtuvieron con el comando "Bestfit" del software GCG, usando el peso de espacio de 3 y el peso de longitud de 0,1.

Las estructuras secundarias predichas son similares para las cuatro proteínas, con hélices \alpha que prevalecen en la mitad amino terminal de las moléculas y relativamente más en hoja \beta y giros en la mitad carboxi terminal. La menor afinidad de la FS-HBP1 por la histamina (cargada positivamente), sugiere que los restos en estas posiciones pueden formar parte del sitio de unión.

Ejemplo 3 Expresión de proteína recombinante 1) Construcción de clones

Las FS-HBP1, FS-HBP2 y MS-HBP1 se expresaron como proteínas marcadas con histidina (rFS-HBP1, rFS-HBP2 y rMS-HBP1) en células ováricas de Spodoptera frugiperda (Sf21).

Con el fin de agregar el marcador His_{6}, la región de codificación de la FS-HBP1 se amplificó primeramente usando la reacción de cadena de polimerasa (PCR). La PCR consistió en 20 ciclos con una etapa de fusión de 30 segundos a 95ºC, una etapa de reasociación con cebador de 30 segundos a 50ºC y una etapa de extensión de 30 segundos a 72ºC. El cebador potenciador usado fue: 5'-GCAGGAGCTCGGCACGAC; el cebador inverso fue: 5'-TTTACTAGTGATGGTGATGATGATGGATCCCTTCTGGGAGGCAATCACTT. Los cebadores se diseñaron de manera tal que se agregó un sitio SacI más arriba del codón de iniciación, mientras que el codón de parada se reemplazó por un sitio BamHI, seguido por 6 codones de histidina y un sitio SpeI que comprendía un codón de parada TAG. El producto de PCR se cortó con SacI y SpeI. Esta última enzima crea un colgante compatible con XbaI, haciendo posible el ligamiento del fragmento entre los sitios SacI y XbaI del vector de transferencia pAcC129.1 (Livingstone y Jones, 1989), generando el plásmido pACC129.1-FS1.HIS. De acuerdo con ello, este plásmido contenía la secuencia Gly-Ile-(His)_{6} agregada al terminal carboxi del producto de traducción de FS-HBP1.

Este plásmido pACC129.1-FS.HIS se usó igualmente para la expresión de FS-HBP2 y MS-HBP1 marcados con histidina. El cDNA de FS-HBP1 se eliminó usando SacI y BamHI dejando los codones de histidina intactos. Mediante PCR, se agregaron a las regiones de codificación de FS-HBP2 y MS-HBP1 un sitio SacI más arriba y uno BglII más abajo (BglII y BamHI crean colgantes compatibles). La PCR consistió en 20 ciclos con una etapa de fusión de 30 segundos a 95ºC, una etapa de reasocición del cebador de 30 segundos a 50ºC y una etapa de extensión de 30 segundos a 72ºC. El cebador potenciador, en el caso de FS-HBP2 fue: 5'-AAGGAGCTCAGCATGAAGCTTCTCAT; el cebador inverso fue: 5'-TATAGATCTCTAGGCAAGCACTTGTG.

En el caso de MS-HBP1, el cebador potenciador fue: 5'-GCAGGAGCTCGGCACGAG, y el cebador inverso fue: 5'-TATAGATCTGGTTCTGAGCTGGTGCTG.

Después de la PCR, los cDNAs derivados se insertaron dentro del vector. De esta forma, se agregó una secuencia Gln-Ile-(His)_{6} a la terminación carboxi del producto de traducción de MS-HBP1, y una Ile-(His)_{6} al producto de traducción de FS-HBP2.

El sistema de expresión de baculovirus se usó para la expresión de los tres polipéptidos marcados. Las células de Spodoptera (Sf21) se transfectaron con los vectores de transferencia y baculovirus (BacPak6; Clontech). El virus recombinante se amplificó de acuerdo con Kitts y Possee (1993). Las VABPs son claramente productos de secreción puesto que se encontraron fundamentalmente en el medio de cultivo de las células transfectadas así como en la saliva.

Igualmente, la región de codificación de FS-HBP2 (madura) se clonó dentro del vector de expresión pET-23a(+). Las secuencias desde la posición (a) a (b) y desde (c) a (d) en la Figura 7 se eliminaron en versiones truncadas de FS-HBP2 expresada bacterialmente. La proteína truncada N-terminalmente se obtuvo mediante PCR sobre el plásmido pACC129.1-HIS que contenía la FS-HBP2, usando el cebador potenciador 5'-TATGGATCCTTCACTTGCGTGGGTGTT y el cebador inverso 5'-TATAGCGGCCGCCCGGGCTAGTGATGGTGATGATGAT. El producto de PCR se cortó con BamHI y NotI y se insertó entre los sitios BamHI y NotI del vector pET-23a(+).

En el caso del truncamiento carboxi-terminal, la región de codificación de la FS-HBP2 completa se insertó dentro del vector pET23(+), usando el cebador potenciador: 5'-TATAGGATCCGGGAGCTCCAATCAGCCAGATTGGGC y el cebador inverso: 5'-TATAGCGGCCGCCCGGGCTAGTGATGGTGATGATGAT. El producto de PCR se cortó con BamHI y NotI y se insertó entre los sitios BamHI y NotI del vector pET-23a(+). A continuación, el plásmido (con el inserto) se usó como un molde para PCR con los cebadores inversos: 5'-TATATGGTACCCATCATCATCACCATCAC y 5'-ATATATGGTACCGTTGTCGTAATCCGTAGTC. Esto dio como resultado la amplificación del plásmido completo menos la región a eliminar. El religamiento se realizó después del corte con KpnI (los cebadores contienen sitios KpnI). El plásmido no amplificado, original, se destruyó mediante digestión con DpnI, antes de la transformación. Todas las PCRs consistieron en 20 ciclos con una etapa de fusión de 30 segundos a 95ºC, una segunda etapa de reasociación del cebador de 30 segundos a 50ºC y una etapa de extensión de 90 segundos a 72ºC.

2) Purificación de proteínas y producción de antisueros

Sesenta horas después de la infección de las células Sf21, se recogió el medio de cultivo, la células y los residuos celulares se centrifugaron (2.000 g, 10 minutos) y el sobrenadante se fraccionó mediante precipitación con (NH_{4})_{2}SO_{4}. Las rFS-HBP1 y rFS-HBP2 precipitaron en la fracción de (NH_{4})_{2}SO_{4} de 50% al 80% y la MS-HBP1-His en la fracción de 65-100%. Los gránulos se lavaron en (NH_{4})_{2}SO_{4} al 100%, se redisolvieron en PBS y se purificaron sobre columnas de Ni-agarosa (Qiagen) de acuerdo con Janknecht y otros, (1991). Las proteínas marcadas con histidina se eluyeron usando imidazol. Para concentrar los eluyentes y para el intercambio de tampones, se usaron concentradores Centricon 10 (Amicon). La proteína purificada se almacenó a -20ºC en PBS.

Para la producción de antisueros policlonales, se mezcló proteína recombinante purificada (2 \mug aprox. en 150 \mul de PBS) con un volumen igual de adyuvante Montanide ISA 50 (Seppic, Francia) y se inyectaron subcutáneamente en cobayas Dunkin Hartley. Este procedimiento se repitió cada 10 días. El suero se recogió 10 días después de la cuarta inyección.

3) Electroforésis y transferencia Western

Se extirparon glándulas salivares (y otros tejidos) procedentes de garrapatas en diferentes momentos de tiempo del período de alimentación, y se homogeneizaron en PBS. Los homogenatos se centrifugaron a 10.000 g durante 5 minutos y los sobrenadantes se sometieron a electroforésis con dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE; Laemmli, 1970).

La Figura 7 muestra un gel de SDS-PAGE al 12% sobre el cual se ensayaron las rFS-HBP1, rFS-HBP2 y rMS-HBP1. Las rFS-HBP1 y rFS-HBP2 se ensayaron sobre agarosa con masas moleculares aparentes de -21 y -24kDa respectivamente, en tanto que la rMS-HBP1 se ensayó a -22kDa.

Para la transferencia Western, las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa (Gelman Sciences) mediante electrotransferencia semi-seca (Kyhse-Anderson, 1984) usando un aparato AE-6675 Horizblot (Atto Corporation, Japón). Las FS-HBP1, FS-HBP2 y MS-HBP1 se identificaron usando los antisueros producidos en cobayas (véase anteriormente), en combinación con inmunoglobulinas anti-cobaya de cabra conjugadas con fosfatasa alcalina (Sigma). La actividad quinasa se visualizó con sal nitro azul tetrazolio y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (Blake y otros, 1984).

La eventual glucosilación ligada a asparagina de las proteínas se estudió mediante ensayos de cambios de movilidad. La SDS-PAGE y la inmunotransferencia se realizaron con extractos de glándulas salivares y muestras de proteínas recombinantes, antes y después del tratamiento con N-glucosidasa F (PNGase G; New England Biolabs), una endoglucosidasa que hidroliza todos los tipos comunes de cadenas Asn-glucano procedentes de glucoproteínas (Maley y otros, 1989). Unicamente la MS-HBP1 muestra algún cambio hacia abajo en la movilidad en geles de SDS-PAGE durante el tratamiento con N-glucosidasa F, lo cual indica que es una glucoproteína. El cambio hacia abajo corresponde a un cambio de 2-3kDa en el peso molecular.

La Figura 8 muestra transferencias Western que contienen extractos de glándulas salivares de garrapatas hembra (A y B) y macho (C) tomados en momentos de tiempo diferentes del período de alimentación de adultos y resueltos sobre un gel de SDS-PAGE al 12%. Los sueros anti-FS-HBP1 (A) y anti-FS-HBP2 (B) muestran reacciones positivas desde el primer al tercer día después de la unión (p.a.). El suero anti-MS-HBP1 (C) detectó MS-HBP1 a partir del primer día p.a. hasta el final del período de alimentación.

4) Secuenciación N-terminal

Las secuencias amino terminales de rFS-HBP1, rFS-HBP2 y rMS-HBP1 purificadas se determinaron en la Unidad de Inmunoquímica MRC del Departamento de Bioquímica de la Universidad de Oxford. Las muestras se ensayaron sobre geles de SDS-PAGE de acuerdo con el procedimiento de Schägger y von Jagow (1987) y electrotransferencia sobre membranas ProBlott (Applied Biosystems, Warrington, Inglaterra). Las membranas se tiñeron con azul brillante Coomassie y las bandas interesantes se cortaron y secuenciaron, de acuerdo con Matsudaria (1987). Las muestras electrotransferidas se ensayaron sobre un secuenciador de proteínas "Procise" de Applied Biosystems 494A (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Warrington, R.U.), usando un cartucho "MiniBlott" de Applied Biosystems (sobre el cual se insertaron las piezas de la membrana). Para la secuenciación se usó el programa recomendado por el fabricante para las muestras de unión a la membrana.

Ejemplo 4 Características de las proteínas 1) Ensayos de unión de histamina

Las proteínas recombinantes purificadas se sometieron a ensayos de unión de histamina tal como ha sido establecido por Warlow y Bernard (1987). Este procedimiento usa la precipitación de proteínas para separar el ligando libre del unido (histamina radiomarcada) mediante la adición de polietilenoglicol (P. mol. 8.000) y centrifugación. En todos los experimentos, los cromatogramas de capa fina se ensayaron en un sistema disolvente de acetato-amoníaco, después de un período de incubación de una hora, con el fin de asegurar que no se había producido la metabolización de la histamina.

Se obtuvo la unión saturable de ^{3}H-histamina con las 3 rVABPs (Figuras 9Ai, 9Bi y 9Ci). Las representaciones Scatchard (Figuras 9Aii, 9Bii y 9Cii) muestran altas afinidades para rMS-HBP1 (K_{d}= 1,2x10^{-9}M; SD = 0,4; 3 mediciones) y para rFS-HBP2 (K_{d}= 1,7x10^{-9}M; SD = 0,9), pero una menor afinidad para rFS-HBP1 (K_{d}= 7,8x10^{-8}M; SD = 1,5), lo cual sugiere que la unión con histamina puede no ser la función primaria de esta proteína.

Existe alguna evidencia de una unión co-operativa en el caso de rMS-HBP1. Cuando las muestras que contenían ^{3}H-histamina (aprox., 0,3 pmol; 11,200 cpm) y cantidades en exceso de rMS-HBP1 (aprox, 100 pmol) se suplementaron con pequeñas cantidades de histamina (0,5 pmol), se midió un incremento significativo de radioligando unido (7.560\pm110 cpm, comparado con 6.840\pm150 cpm; 5 mediciones), lo cual indica una potenciación de la capacidad de unión. La unión co-operativa está de acuerdo con la naturaleza dímera o polímera de la MS-HBP1. Realmente, la MS-HBP1 parece formar puentes disulfuro intermoleculares; tiene una menor movilidad sobre geles de SDS cuando el agente reductor se omite del tampón de carga. Las FS-HBPs parecen tener únicamente enlaces disulfuro intramoleculares, tal como se sugiere por las altas movilidades en ausencia del agente reduc-
tor.

En un experimento de competencia (realizado por triplicado), se agregaron una serie de compuestos de tipo histamina (histamina, imidazol, serotonina, dopamina, el agonista del receptor de H_{1} betahistidina, los antagonistas de H_{1} clorofeniramina y pirilamina, el agonista de H_{2} dimaprit, y los antagonistas de H_{2} ranitidina y cimetidina) a cada uno de las rVABPs en 1.000 veces las cantidades a las cuales la histamina fría desplaza más del 95% de la ^{3}H-histamina de los sitios de unión. Los compuestos de tipo histamina causaron pocos o ningún desplazamiento del radioligando, lo cual indica que las VABPs se unen específicamente a la histamina y de una manera diferente de los receptores de H_{1} y H_{2}.

La FS-HBP2 se expresó en el vector pET-23a(+) en bacterias AD494(DE3)pLysS (Novagen). La FS-HBP2 expresada bacterianamente se une a la histamina con una afinidad algo más baja (K_{d}= 0,6-0,9x10^{-8}M) que la expresada en el sistema baculovírico. Las versiones truncadas de la proteína (véase anteriormente) que carecen o bien de los 45 aminoácidos N-terminales o bien de los 28 aminoácidos C-terminales, no se unen en absoluto a la histamina. Esto sugiere que la estructura total de la FS-HBP2 es importante para la unión de la histamina y que el sitio de unión es más probable que esté determinado por restos dispersados, en lugar de por una extensión de aminoácidos consecutivos localizados en alguna parte sobre una hélice \alpha o una hoja \beta.

2) Contracción-inhibición

Los experimentos de contracción-inhibición (Figura 10) se llevaron a cabo sobre íleon de cobaya suspendido en una cámara de 10 ml que contenía solución de Krebs aireada. Las contracciones (registradas como picos) se indujeron mediante la adición de 1,25 nmol de histamina (H) a la cámara. Después de alcanzado un pico, la histamina se eliminó por lavado con solución de Krebs (W), lo cual permitió al íleon relajarse. La contracción se redujo substancialmente mediante la adición de aprox. 2 nmol de rFS-HBPs (F2) conjuntamente con la histamina. Los aprox. 2nmol de rFS-HBP1 no tuvieron efectos significativos (datos no mostrados). Los aprox. 4 nmol (cantidad de monómero) de rMS-HBP1 (M) agregados conjuntamente con la histamina inhibieron completamente la contracción, incluso después de agregar histamina extra (xH).

Las proteínas rMS-HBP1 y rFS-HBP2 son unidores lo suficientemente fuertes como para competir con la histamina con los receptores H_{1} de íleon de cobaya (véase Figura 10). De acuerdo con su relativamente baja afinidad, se observó poca o ninguna inhibición de la contracción del iléon con rFS-HBP1.

Referencias

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Claims (23)

1. Una proteína de unión de amina vasoactiva (VABP) que específicamente se une a histamina con una constante de disociación menor de 10^{-7} M y que pertenece a la misma familia de proteínas que MS-HBP1, FS-HBP1, FS-HBP2 y D.RET6, en donde una proteína se considera que pertenece a esta familia si el 40% o más de los aminoácidos que están completamente conservados como restos idénticos en la alineación de las VABPs de MS-HBP1, FS-HBP1, FS-HBP2 y D.RET6 solamente, están aún completamente conservados como restos idénticos si la proteína está incluida en la alineación, habiéndose obtenido la alineación usando el comando "pileup" de GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, 1994; penalización por creación de espacios = 2,50; penalización por extensión de espacios = 0,05) y en donde dichas VABPs contienen los motivos de secuencia D/E A W K/R e Y/C E/D L/I W.

2. Una VABP de acuerdo con la Reivindicación 1, derivada a partir de garrapatas.

3. Una VABP de acuerdo con la Reivindicación 2, derivada a partir de la garrapatas Rhipicephalus appendiculatus o Dermacenter reticularis.

4. Una VABP de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1-3, que consiste en la secuencia de FS-HBP1, FS-HBP2, MS-HBP1 o D.RET6, tal como se presentan en las Figuras 1, 2, 3, y 4, respectivamente.

5. Un fragmento equivalente funcionalmente de una cualquiera de las VABPs de la Reivindicación 4, que específicamente se une a histamina con una constante de disociación menor de 10^{-7} M, y en donde el 40% o más de los aminoácidos que están completamente conservados como restos idénticos en la alineación de las VABPs de MS-HBP1, FS-HBP1, FS-HBP2 y D.RET6 solamente, están aún completamente conservados como restos idénticos si la secuencia del fragmento de proteína está incluido en la alineación, habiéndose obtenido la alineación usando el comando "pileup" de GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, 1994; penalización por creación de espacios = 2,50; penalización por extensión de espacios = 0,05) y en donde dicho fragmento contiene los motivos de secuencia D/E A W K/R e Y/C E/D L/I W.

6. Una VABP o fragmento de acuerdo con cualquier Reivindicación precedente, que está expresado en forma recombinante.

7. Una VABP de acuerdo con la Reivindicación 5 o la Reivindicación 6, en la que la VABP ha sido genéticamente o químicamente fusionada a uno o más péptidos o polipéptidos.

8. Una VABP de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, que está unida a un soporte, tal como una resina.

9. Una molécula de ácido nucléico que contiene el código de una VABP de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, o que se hibrida con una molécula que contiene el código de una VABP bajo condiciones de alta restricción, p. ej., 2 x SCC, 65ºC (en donde SCC = NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M, pH 7,2).

10. El ácido nucléico de la Reivindicación 9, el cual es DNA, cDNA o RNA.

11. El ácido nucléico de la Reivindicación 9 o la Reivindicación 10, el cual es DNA.

12. Un vector de expresión o clonación que comprende una molécula de ácido nucléico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 9 a 11.

13. El vector de la Reivindicación 12, el cual está basado en un virus.

14. El vector de la Reivindicación 13, el cual está basado en un baculovirus.

15. Una célula huésped que contiene el vector de una cualquiera de las Reivindicaciones 12 a 14.

16. Un animal transgénico no humano que contiene el vector de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 12 a 14.

17. Un procedimiento de preparación de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, que comprende la expresión de un vector de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 12 a 14 en una célula huésped, y el cultivo de dichas células huéspedes bajo condiciones en las que dicha proteína se expresa, y la recuperación de dicha proteína así producida.

18. Un juego adecuado para la cuantificación de niveles de histamina en un fluido corporal de un humano o un animal, que comprende una VABP de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, y medios de detección.

19. Una VABP de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8 para uso en terapia.

20. El uso de una VABP de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, conjuntamente con vehículo aceptable farmacéuticamente, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de inflamación en humanos o animales.

21. Uso de acuerdo con la Reivindicación 20, en el que dicho medicamento es un agente anti-histamínico.

22. Uso de acuerdo con la Reivindicación 20, en el que dicho medicamento es un medicamento anti-inflamatorio.

23. Una composición farmacéutica o vacuna que comprende una VABP de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1-8.