ES2263286T3 - Nucleotidos y proteinas antitrombina de la mosca de los cuernos. - Google Patents

Abstract

Proteína purificada sustancialmente que tiene actividad antitrombina, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: (a) una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7; (b) una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 40% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, y (c) un fragmento de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, en la que dicho fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de dicha secuencia.

Description

Nucleótidos y proteínas antitrombina de la mosca de los cuernos.

Campo de la invención

La invención se refiere a vacunas veterinarias para la prevención de la infestación hematofágica de ganado y el tratamiento médico de la trombosis.

Antecedentes de la invención

Se ha estimado que las pérdidas en la producción de animales de cría en los Estados Unidos debidas a infestaciones por ectoparásitos superan los 2,26 mil millones de \textdollar (Byford et al. (1992) J. Anim. Sci. 70:597-602). De las cinco a seis especies de plaga de artrópodos principales implicadas, la mosca de los cuernos Haematobia irritans linneus es la más importante y extendida. Su impacto económico anual sobre la producción de ganado en los EE.UU. se ha estimado en 730,3 millones de \textdollar. En Canadá, el control de este ectoparásito en la producción de ganado se ha estimado que reduce las pérdidas en 71-107 millones de \textdollar cada año utilizando el valor del dólar de 1977 (Haufe y Weintraub (1985) Can. Entomol. 117:901-907). Por tanto, en Norte América, el impacto económico anual sobre la producción de ganado mediante esta mosca hematófaga se aproxima a mil millones de \textdollar.

Las manifestaciones fisiológicas de la infestación por la mosca de los cuernos incluyen un aumento en las frecuencias cardiacas, frecuencias respiratorias y temperaturas rectales. Adicionalmente, aumentan significativamente el consumo de agua y la producción de orina así como la secreción de nitrógeno en la orina. También aumentan significativamente las concentraciones de cortisol en sangre. También se han notificado disminución del aumento de peso, aumento de la actividad y disminución del pastoreo. (Schwinghammer et al. (1986) J. Econ. Entomol. 79:1010-1014).

La fase adulta de ambos sexos de H. irritans son ectoparásitos estrictos que se alimentan con sangre intermitentemente durante las 24 horas del día. A diferencia de otras plagas de dípteros que se alimentan con sangre de manera transitoria (mosca negra, mosquitos, tábanos, moscas de los establos), los adultos alados de H. irritans permanecen en los huéspedes bovinos y, cuando necesitan alimento, insertan de forma recurrente las partes de su boca en la piel para alimentarse. Harris et al. (1974) Antineoplásico. Entomol. Soc. Am. 67:891-894, indicaron que en condiciones experimentales, las moscas de los cuernos hembra invierten un promedio de 163 minutos/día a la alimentación; los machos promediaron 96 minutos al día. Cada hembra ingirió un promedio de 17,1 mg de sangre al día mientras que los machos ingirieron 12,1 mg/individuo debido a la diferencia en los tiempos de alimentación (Harris y Frazer (1970) Antineoplásico. Entomol. Soc. Am. 63:1475-1476).

La bibliografía científica que describe la fisiología de las glándulas salivales de H. irritans, particularmente con referencia a la alimentación con sangre, es escasa. Hori et al. (1981) Appl. Ent. Zool. 16:16-23 han comparado varias categorías de enzimas digestivas en el intestino y las glándulas salivales de H. irritans con Stomoxys calcitrans (Linnaeus), la mosca de los establos. Se detectó actividad aminopeptidasa débil en la saliva de H. irritans, lo que sugiere que las proteasas y glucosidasas en el intestino son responsables en exclusiva de la digestión de la sangre.

La mosca de los cuernos Haematobia irritans linnaeus es una subespecie con H. i. exigua de Meijere, la mosca de los búfalos que aparece en Australia y en otras partes del hemisferio sur. Kerlin y Hughes (1992) Med. Vet. Entomol. 6:121-126, han comparado enzimas en la saliva de cuatro artrópodos parásitos, H. irritans exigua, Boophilus microplus (Canestrini), Aedes aegypti (Linnaeus) y Lucilia cuprina (Wiedemann) y observaron diferencias en los perfiles de enzimas de la saliva entre las cuatro especies que reflejan aparentemente sus estrategias de alimentación diferentes. Estas diferencias fueron principalmente en el tipo y niveles de actividades glucosidasa y proteasa. La saliva de H. irritans exigua, recogida mediante estimulación de serotonina y luego evaluada mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, produjo 7-8 bandas mediante tinción con plata. La actividad apirasa en la saliva y los extractos de glándulas salivales (EGS) de esta especie fue ligeramente detectable, lo que sugiere que esta subespecie no evita la agregación plaquetaria bovina de la misma manera que otros artrópodos que se alimentan con sangre (Ribeiro (1987) Antineoplásico. Rev. Entomol. 32:463-478).

Además, la investigación de la respuesta inmunitaria del ganado expuesto a H. irritans exigua mostró la producción de altos niveles de anticuerpos circulantes frente a algunos pero no todos los antígenos de la mosca de los búfalos; no obstante, las moscas que se alimentaron de ganado expuesto previamente no mostraron una mortalidad superior que las alimentadas con ganado no expuesto. (Kerlin y Allingham (1992) Vet. Parasitol. 43:115-129).

En la última década, ha avanzado la elucidación de las estrategias bioquímicas adoptadas por los artrópodos que se alimentan con sangre. Aunque se conoce la presencia de anticoagulantes en la saliva de los artrópodos hematofágicos desde hace al menos ocho décadas, sólo recientemente se han purificado algunos de los componentes activos y se han definido sus estructuras moleculares. Ha resultado evidente que los factores de la coagulación tales como los factores Xa y trombina (factor II), que aparecen en un nexo de la cascada de coagulación, se seleccionan frecuentemente como diana.

Los estudios de la saliva de varias especies de moscas negras han sugerido que las dianas enzimáticas específicas pueden asociarse con la selección de huésped (Abebe et al. (1994)). Por ejemplo, los datos de especies zoofágicas que prefieren ganado indican que la trombina es una importante molécula diana cuya inactivación puede evitar también la agregación plaquetaria irreversible además de impedir la cascada de coagulación. Véase Hudson (1964) Can. J. Zool. 42:113-120 para Stomoxys calcitrans; y Parker y Mant (1979) Thrombos. Haemostas (Stuttg.) 42:743-751, sobre la saliva de G. morsitans (Westwood).

Debido al impacto adverso de la infestación ectoparásita descrita anteriormente en el ganado, existe una necesidad terapéutica y económica para prevenir tal infestación.

También existe la necesidad de un tratamiento para enfermedades tromboembólicas. Las enfermedades tromboembólicas se encuentran entre las enfermedades circulatorias más importantes. Un trombo es un coágulo sanguíneo que bloquea parcial o completamente en flujo sanguíneo a través de un vaso sanguíneo. Un émbolo es un trombo que se ha formado en cualquier parte del cuerpo, se ha separado y desplazado hasta el sitio en el que se produce el bloqueo. El bloqueo en el cerebro da como resultado un accidente cerebrovascular, es decir, un infarto cerebral, una zona localizada de células muertas. Un émbolo en un pulmón puede producir embolia pulmonar, una de las principales enfermedades pulmonares en pacientes postrados en cama. Las personas ancianas y postradas en cama también son particularmente propensas a tromboflebitis, que es el bloqueo de la circulación en una pierna producido por un émbolo. Un émbolo o trombo que se aloja en uno de los vasos sanguíneos que abastecen al corazón produce necrosis de parte del tejido cardiaco, un infarto de miocardio, denominado comúnmente ataque al corazón.

El acontecimiento que inicia muchos infartos de miocardio es la hemorragia en placas ateroscleróticas. Tal hemorragia a menudo da como resultado la formación de un trombo (o coágulo sanguíneo) en la arteria coronaria que riega la zona infartada. Este trombo se compone de una combinación de fibrina y plaquetas sanguíneas. La formación de un coágulo de fibrina-plaquetas tiene graves ramificaciones clínicas. El grado y la duración de la oclusión producida por el coágulo de fibrina-plaquetas determinan la masa de la zona del infarto y la extensión de la lesión.

La formación de coágulos de fibrina-plaquetas en otras partes del sistema circulatorio puede evitarse parcialmente a través del uso de anticoagulantes, tales como heparina. Desafortunadamente, no se ha encontrado que la heparina sea eficaz de manera universal en prevenir una nueva oclusión en las víctimas de infarto de miocardio en las que el grado de oclusión del vaso sanguíneo es superior o igual al 70%, particularmente en aquellos pacientes con grave estenosis coronaria residual. Entre los agentes más prometedores, se encuentran la hirudina y sus análogos, que se unen e inactivan la trombina. La hirudina tiene una ventaja teórica sobre la heparina como agente antitrombótico. La trombina unida a los trombos o plaquetas está protegida relativamente de la inhibición por heparina mientras que la hirudina, al menos in vitro, es aún eficaz. Otros agentes en investigación prometedores incluyen antagonistas del receptor de fibrinógeno, que bloquean la agregación plaquetaria y la liberación de gránulos densos mediante un mecanismo diferente al de la aspirina, e inhibidores de la producción de tromboxano.

Por tanto, existe la necesidad de agentes antitrombina adicionales que muestren baja toxicidad, poca o ninguna antigenicidad y un tiempo de aclaramiento muy corto de la circulación.

Sumario de la invención

Se proporcionan proteínas aisladas con actividad antitrombina y secuencias de nucleótidos que codifican para las proteínas. La proteína denominada trombostasina se aísla de las glándulas salivales de Haematobia irritans, la mosca de los cuernos que se alimenta con sangre. Las proteínas y los nucleótidos proporcionados son particularmente útiles como vacunas veterinarias en la prevención de la alimentación con sangre en ganado por la mosca de los cuernos que lo infesta.

Las proteínas de la invención son también útiles en el tratamiento de la trombosis.

También se proporcionan los métodos de administración de las proteínas y secuencias de nucleótidos de la invención.

La invención proporciona una proteína purificada sustancialmente que tiene actividad antitrombina, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

a.

una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;

b.

una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 40% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, y

c.

un fragmento de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, en la que dicho fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de dicha secuencia.

La invención también proporciona:

\bullet

una secuencia de nucleótidos aislada que codifica para una proteína que tiene actividad antitrombina, seleccionada de:

a.

una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;

b.

una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6;

c.

una secuencia de nucleótido que codifica para una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 40% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;

d.

una secuencia de nucleótidos que es idéntica en un 40% a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6;

e.

una secuencia de nucleótido que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15 residuos contiguos la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7; y

f.

una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6 en condiciones rigurosas.

\bullet

un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención

\bullet

una célula huésped que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención

\bullet

una preparación de anticuerpos que se une selectivamente a una proteína que tiene actividad antitrombina, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

a.

una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 40% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;

b.

una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;

c.

una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;

d.

una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7; y

e.

un fragmento de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, en el que dicho fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de dicha secuen- cia.

\bullet

una composición farmacológica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de la invención y un excipiente aceptable farmacéuticamente.

\bullet

una vacuna veterinaria que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína o de la secuencia de nucleótidos de la invención.

\bullet

una proteína o una secuencia de nucleótidos de la invención para el uso en un método de tratamiento del cuerpo animal o humano.

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uso de una proteína o una secuencia de nucleótido de la invención en la fabricación de una vacuna para tratar o prevenir la hematofagia en animales de cría.

\bullet

uso de una proteína de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar la trombosis en un mamífero.

\bullet

un método para producir una proteína que tiene actividad antitrombina, comprendiendo dicho método:

a.

cultivar una célula procariota o eucariota que se transforma con una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de la invención en condiciones en las que se produce dicha proteína; y

b.

aislar dicha proteína.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la comparación del peso molecular de proteínas en moscas recogidas en colonias frente a recogidas en el campo mediante movilidad relativa en SDS-PAGE.

La figura 2 muestra el ensayo del tiempo de recalcificación para probar la actividad anticoagulante en saliva de H. irritans.

La figura 3 muestra el efecto de la saliva de H. irritans sobre la coagulación de plasma deficiente en factor II.

La figura 4 muestra la inhibición de la hidrólisis de trombina de S238 por saliva de H. irritans.

La figura 5 muestra purificación mediante HPLC de trombostasina salival activa.

La figura 6 muestra el perfil de SDS-PAGE de la proteína de anticoagulación salival purificada mediante HPLC, trombostasina.

Descripción detallada de la invención

Se proporcionan métodos y composiciones para prevenir la hematofagia (alimentación con sangre) en el ganado, y el tratamiento de la trombosis en un mamífero. Las composiciones comprenden proteína procedente de las glándulas salivales de la mosca de los cuernos hematófaga Haematobia irritans que, tal como se describe en Yeates et al. (1999) Annu. Rev. Entemol. 44:397-428, pertenece al suborden Cyclorrhapha del orden Diptera. Se proporcionan adicionalmente secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína antitrombina. La proteína se ha designado como trombostasina. La función principal de la proteína es prevenir la coagulación inhibiendo la actividad de la trombina (factor II).

Por "hematofagia" se pretende que sea la alimentación con la sangre de un organismo por otro organismo. Por "infestación hematofágica" se pretende que sea una relación de huésped-parásito que comprende la alimentación con la sangre del huésped por el parásito. Por "trombosis" se pretende que sea la formación, desarrollo o presencia de un trombo. Por "actividad antitrombina" se pretende que sea una actividad biológica que reduce o elimina la acción procoagulante de la trombina; y/o inhibe la trombosis.

Se reconoce que hay métodos disponibles en la técnica para obtener la secuencia codificante completa para la proteína antitrombina de la invención. Tales métodos se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York).

Se proporcionan preparaciones sustancialmente purificadas de trombostasina. Tales preparaciones sustancialmente purificadas incluyen proteínas sustancialmente libres de cualquier compuesto asociado normalmente con la proteína en su estado natural. Tales proteínas pueden evaluarse para determinar su pureza mediante SDS-PAGE, cromatografía, electroforesis u otros métodos. Véase, M. P. Deutscher (ed.), Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. (1990).

Los términos "sustancialmente puro" o "sustancialmente purificado" no pretenden excluir mezclas artificiales o sintéticas de la proteína con otros compuestos. Se reconoce que las proteínas antitrombina de la presente invención incluyen aquellas proteínas homólogas a, y que tienen esencialmente las mismas propiedades biológicas que, la proteína antitrombina descrita en el presente documento, y particularmente la proteína descrita en el presente documento en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7. Esta definición pretende englobar las variaciones alélicas naturales en los genes. También se reconoce que las proteínas "sustancialmente puras" de la presente invención tal como se describen en el presente documento pueden ser de otra especie de origen, incluyendo pero sin limitarse a otras especies del suborden Cyclorrhapha.

La invención también proporciona fragmentos de la proteína antitrombina y/o secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 6 y 7. Los fragmentos de la proteína pueden oscilar en tamaño desde al menos 10, 20, 30 o más aminoácidos. Tales fragmentos pueden conservar la actividad biológica o comprender regiones activas de la proteína.

Los fragmentos de polinucleótido pueden también oscilar en tamaño desde al menos 15, 20, 30 o más nucleótidos contiguos. Las secuencias encuentran uso como marcadores moleculares o en un proceso de hibridación.

Tales fragmentos pueden prepararse fácilmente mediante métodos químicos incluyendo métodos automatizados disponibles comercialmente o mediante métodos de ADN recombinante conocidos por el experto ordinario en la técnica, y descritos a continuación. Se reconoce que las funciones biológicas de antihemostasia, incluyendo las relacionadas con la actividad anticoagulante antitrombina y/o la modulación de la respuesta inmunitaria pueden llevarse a cabo mediante los fragmentos descritos.

La invención engloba adicionalmente las secuencias de nucleótidos que codifican para las proteínas de la invención. La secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante clonada mediante PCR de H. irritans se proporciona en SEQ ID NO: 1; sin embargo, se reconoce que los genes clonados de la presente invención pueden ser de otra especie de origen, incluyendo pero sin limitarse a otras especies del suborden Cyclorrhapha.

Los ADN que se hibridan con la secuencia de nucleótidos del gen de la antitrombina procedente de la mosca de los cuernos son sólo un aspecto de esta invención. Las condiciones, que permitirán que se hibriden otros ADN con el ADN descrito en el presente documento, pueden determinarse según técnicas conocidas. Por ejemplo, la hibridación de tales secuencias puede llevarse a cabo en condiciones de rigurosidad reducida, rigurosidad media o incluso condiciones rigurosas (por ejemplo, condiciones representadas por una rigurosidad de lavado de formamida al 35-40% con solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5% y 1x SSPE a 37ºC; condiciones representadas por una rigurosidad de lavado de formamida al 40-45% con solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5% y 1x SSPE a 42ºC; y condiciones representadas por una rigurosidad de lavado de formamida al 50% con solución de Denhardt 5x, SS al 0,5% y 1x SSPE a 42ºC, respectivamente, para ADN que codifica para los genes descritos en el presente documento en un ensayo de hibridación habitual. Véase J. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.) (Cold Spring Harbor Laboratory).

En general, las secuencias que codifican para la proteína antitrombina y se hibridan con la secuencias de nucleótidos descrita en el presente documento pueden ser homólogas en al menos el 40%, homólogas en aproximadamente del 60% al 70%, e incluso homólogas en aproximadamente del 80%, 85%, 90% o más con las secuencias descritas. Tales secuencias son sustancialmente homólogas a las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento y englobadas por la invención. Además, las secuencias de aminoácidos de las proteínas antitrombina aisladas mediante hibridación con los ADN descritos en el presente documento son también un aspecto de esta invención. La degeneración del código genético, que permite que diferentes secuencias de ácido nucleico codifiquen para la misma proteína o péptido, se conoce bien en la bibliografía. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 4.757.006.

Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADNc u oligonucleótidos, y pueden marcarse con un grupo detectable tal como se conoce en la técnica. Pueden utilizarse pares de sondas que servirán como cebadores de PCR para el gen de la antitrombina o una proteína del mismo según el procedimiento descrito en las patentes de los EE.UU. números 4.683.202 y 4.683.195.

Los polipéptidos de la invención pueden someterse a una o más modificaciones postraduccionales tales como sulfatación, COOH-amidación, acilación o alteración química de la cadena polipeptídica.

Se reconoce que las secuencias de nucleótidos y péptidos de la invención pueden alterarse de varias maneras incluyendo sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones se conocen generalmente en la técnica. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácidos de péptidos y proteínas pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN. En la técnica, se conocen bien métodos para la mutagénesis y las alteraciones de las secuencias de nucleótidos. Véase, por ejemplo, Kunkel, T. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente de los EE.UU. número 4.873.192; Walker y Gaastra (eds.) Techniques in Molecular Biology, MacMillan Publishing Company, NY (1983) y la bibliografía citada en ellos. Por tanto, las secuencias de nucleótidos de la invención incluyen tanto las secuencias que se producen de manera natural como mutantes. Asimismo, los péptidos y proteínas de la invención engloban tanto formas que se producen de manera natural como modificadas de los mismos. Tales variantes continuarán teniendo la actividad deseada. Se reconoce que las mutaciones que se realizarán en el ADN que codifica para la variante no situarán la secuencia fuera del marco de lectura y preferiblemente no producirán secuencias perjudiciales para la expresión del producto génico. Véase, la solicitud de patente EP, publicación nº 75.444.

Las proteínas de la invención incluyen las formas que se producen de manera natural así como variantes de las mismas. Estas variantes serán sustancialmente homólogas y funcionalmente equivalentes a la proteína nativa. Tal como se utiliza en el presente documento, dos proteínas (o una región de las proteínas) son "sustancialmente homólogas" cuando las secuencias de aminoácidos son normalmente idénticas en al menos aproximadamente el 40%, más normalmente en al menos aproximadamente el 60%-70%, y lo más normalmente en al menos aproximadamente el 80%, 85%, 90% o más. Una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga, según la presente invención, estará codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la secuencia de ácido nucleico, o parte de la misma, de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, o por lo demás descrita en el presente documento en condiciones rigurosas tal como se explica con más detalle a continuación.

Por tanto, una variante de una proteína nativa es "sustancialmente homóloga" a la proteína nativa cuando al menos aproximadamente el 40%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 60%-70%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, 85%, 90% o más de su secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa. Una variante puede diferir en tan sólo 1, 2, 3 ó 4 aminoácidos. Un polipéptido variante puede diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, deleciones, inserciones, inversiones, fusiones y truncamientos o una combinación de éstos.

Por "funcionalmente equivalente" se pretende que sea que la secuencia de la variante defina una cadena que produce una proteína que tiene sustancialmente la misma actividad biológica que la proteína nativa de interés. Tales variantes funcionalmente equivalentes que comprenden variaciones de secuencia sustanciales también están englobadas por la invención. Por tanto, una variante funcionalmente equivalente de la proteína nativa tendrá una actividad biológica suficiente para ser terapéuticamente útil. Por terapéuticamente útil se pretende que sea eficaz en conseguir un objetivo terapéutico tal como se trata a continuación.

Están disponibles métodos en la técnica para determinar la equivalencia funcional. La actividad biológica puede medirse utilizando ensayos diseñados específicamente para medir la actividad de la proteína nativa, incluyendo los ensayos descritos en la presente invención. Adicionalmente, pueden probarse anticuerpos producidos frente a la proteína nativa activa biológicamente para determinar su capacidad para unirse a la variante funcionalmente equivalente, en la que la unión eficaz es indicativa de una proteína que tiene una conformación similar a la de la proteína nativa.

Los polipéptidos variante pueden ser totalmente funcionales o carecer de función en una o más actividades. Por tanto, en el presente caso, las variaciones pueden afectar la función, por ejemplo, de uno o más de los módulos, dominios o subregiones funcionales de las proteínas y polipéptidos de la invención.

Las variantes totalmente funcionales contienen sólo una variación conservativa o una variación en residuos no críticos o en regiones no críticas. Las variantes funcionales pueden contener también una sustitución de aminoácidos similares, que no da como resultado cambio o un cambio insignificante en la función. Alternativamente, tales sustituciones pueden afectar positiva o negativamente a la función en cierto grado.

Las variantes no funcionales contienen normalmente una o más sustituciones, deleciones, inserciones, inversiones o truncamiento de aminoácidos no conservativos o una sustitución, inserción, inversión o deleción en un residuo crítico o una región crítica. Tal como se indica, las variantes pueden producirse de manera natural o pueden prepararse mediante medios recombinantes o síntesis química para proporcionar características útiles y novedosas para el polipéptido.

Los aminoácidos que son esenciales para la función pueden identificarse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis con barrido de alanina (Cunningham et al. Science 244:1081-1085 (1989)). Este último procedimiento introduce mutaciones únicas de alanina en cada residuo en la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se prueban entonces para determinar la actividad biológica. También pueden determinarse los sitios que son críticos mediante análisis estructural tal como cristalización, resonancia magnética nuclear o marcaje de fotoafinidad (Smith et al., J. Mol. Biol. 244:899-904 (1992); de Vos et al. Science 255:306-312 (1992)).

La invención engloba además polinucleótidos variante, y fragmentos de los mismos, que difieren de la secuencias de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, o por lo demás descrita en el presente documento, debido a degeneración del código genético y por tanto, codifican para la misma proteína codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, o por lo demás descrita en el presente documento.

La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos variante descritos en el presente documento. Tales polinucleótidos pueden producirse de manera natural, tales como variantes alélicas (mismo locus), homólogos (diferente locus) y ortólogos (diferente organismo), o pueden construirse mediante métodos de ADN recombinante o mediante síntesis química. Tales variantes que no se producen de manera natural puede prepararse mediante técnicas de mutagénesis, incluyendo las aplicadas a polinucleótidos, células u organismos. En consecuencia, tal como se trató anteriormente, las variantes pueden contener sustituciones, deleciones, inversiones e inserciones de nucleótidos.

La variación puede producirse en cualquiera o ambas de las regiones codificante y no codificante. Las variaciones pueden producir tanto sustituciones de aminoácidos conservativas como no conservativas.

Los ortólogos, homólogos y variantes alélicas puede identificarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Estas variantes comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína que es homóloga al menos normalmente en aproximadamente el 40%, más normalmente en al menos aproximadamente el 60%-70%, y lo más normalmente en al menos aproximadamente el 80%, 85%, 90% o más a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, o por lo demás descrita en el presente documento, o un fragmento de esta secuencia. Tales moléculas de ácido nucleico pueden identificarse rápidamente al poder hibridarse en condiciones rigurosas, con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, o por lo demás descrita en el presente documento, o un fragmento de la secuencia. Se entiende que la hibridación rigurosa no indica homología sustancial cuando se debe a homología general, tal como secuencias de poli A, o secuencias comunes a todas o la mayoría de proteínas en un organismo o clase de proteínas.

Para determinar la homología en porcentaje de dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de nucleótidos, las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una proteína o ácido nucleico para la alineación óptima con la otra proteína o ácido nucleico). Se comparan entonces los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en una secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la otra secuencia, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. Tal como se utiliza en el presente documento, la "homología" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a la "identidad" de aminoácido o ácido nucleico. La homología en porcentaje entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, la homología en porcentaje es igual al número de posiciones idénticas / número total de posiciones 100 veces).

La invención también engloba proteínas o polipéptidos que tienen un grado inferior de identidad pero que tienen suficiente similitud de modo que realizan una o más de las mismas funciones realizadas por las proteínas antitrombina descritas en el presente documento. La similitud se determina mediante la sustitución de aminoácidos conservados. Tales sustituciones son aquellas que sustituyen el aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Es probable que las sustituciones conservativas sean fenotípicamente silenciosas. Una guía acerca de qué cambios de aminoácidos es probable que sean fenotípicamente silenciosos se encuentra en Bowie et al. Science 247:1306-1310 (1990).

Tanto la identidad como la similitud pueden calcularse rápidamente (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Los métodos de programa informático preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, paquete de programas CGC (Devereux, J. (1984) Nuc. Acids Res. 12(1):387), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Atschul, S.F. (1990) J. Molec. Biol. 215:403); utilizando los parámetros por defecto disponibles dentro del programa. Por similitud, identidad u homología de secuencia sustancial, se pretenden secuencias que tienen una similitud de al menos aproximadamente el 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más.

Las secuencias de ADN también pueden sintetizarse químicamente o modificarse mediante mutagénesis dirigida al sitio para reflejar la preferencia de codones de la célula huésped y aumentar la eficacia de expresión.

Las proteínas de la invención pueden modificarse mediante ingeniería según la presente invención, mediante métodos químicos o técnicas de biología molecular. Los métodos de biología molecular son los más convenientes dado que las proteínas pueden modificarse mediante ingeniería manipulando las secuencias de ADN que las codifican. Puede utilizarse ADN genómico, ADNc, ADN sintético y cualquier combinación de los mismos, para este fin. Las secuencias de ADN genómico, o secuencias de ADNc que codifican para las proteínas pueden aislarse basándose en la secuencia de aminoácidos de las proteínas o ciertas propiedades de las proteínas. Se conocen muchos métodos de aislamiento de secuencias en la técnica de la biología molecular. Véase particularmente, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York).

Para producir un polipéptido antitrombina mediante tecnología de ADN recombinante, se prepara un gen que codifica para un polipéptido de la invención. La secuencia codificante de ADN normalmente no contiene intrones. La secuencia de ADN se aísla y purifica, el gen se inserta en un vector de expresión que puede conducir la expresión y la producción del producto recombinante. La secuencia de ADN puede ser una secuencia de ADNc, o alternativamente una secuencia de ADN sintético. Un gen sintético se prepara normalmente sintetizando químicamente oligonucleótidos que, en total, corresponden al gen deseado. Los oligonucleótidos sintetizados se ensamblan entonces para obtener el gen.

Si se desea, la secuencia del gen puede modificarse mediante mutagénesis dirigida al sitio para introducir uno o más cambios codificantes. Normalmente, se construye un gen con sitios de restricción en cada extremo para facilitar su posterior manipulación.

La secuencia de ADN puede construirse para comprender un péptido líder. El péptido líder puede dirigir la secreción de polipéptido desde las células en las que el polipéptido va a expresarse. La secuencia que codifica para el péptido líder se fusiona normalmente al extremo 5' de la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido. Se conocen secuencias líder en la técnica e incluyen el péptido líder OmpA, el péptido líder de la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (proteína G de VEV). El líder OmpA es útil cuando la expresión es en un huésped bacteriano, tal como E. coli mientras que la proteína VEVG es útil cuando la expresión es en células de insecto.

La secuencia de ADN puede construirse para comprender un sitio escindible para liberar el polipéptido de la invención. Puede utilizarse una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de polipéptido portador fusionada a través de un enlace escindible al extremo N-terminal de un polipéptido de la invención. El enlace escindible puede ser uno escindible mediante bromuro de cianógeno.

Para la expresión de los polipéptidos, se construye un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica para el polipéptido, que puede expresar el polipéptido en un huésped adecuado. Se proporcionan otros elementos de control transcripcional y traduccional apropiados, incluyendo un promotor para la secuencia de ADN, un sitio de terminación de la transcripción y codones de inicio y terminación de la traducción. La secuencia de ADN se proporciona en el marco correcto de modo que se permita que la expresión del polipéptido se produzca en un huésped compatible con el vector.

El vector de expresión normalmente comprende un origen de replicación y, si se desea, un gen marcador seleccionable tal como resistencia a antibióticos. El vector de expresión puede ser un plásmido, un virus, particularmente un baculovirus, y similares.

Una vez que se han aislado las secuencias de nucleótidos que codifican para las proteínas antitrombina de la invención, pueden manipularse y utilizarse para expresar la proteína en una variedad de huéspedes incluyendo otros organismos, incluyendo microorganismos.

Una vez que se identifica y conoce la secuencia de nucleótidos, los expertos en la técnica pueden producir grandes cantidades de la proteína para uso terapéutico. En consecuencia, la proteína recombinante y los métodos para producir la proteína recombinante están englobados por la presente invención. De esta manera, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína antitrombina puede utilizarse en vectores para la expresión en varios tipos de células huésped, incluyendo tanto procariotas como eucariotas, para producir grandes cantidades de la proteína, o análogos activos, o fragmentos de los mismos, y otros constructos que tienen actividad antitrombina.

Generalmente, los métodos para la expresión de ADN recombinante se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory. Adicionalmente, las células huésped y los vectores de expresión, tales como la expresión en baculovirus descrita en las patentes de los EE.UU. números 4.745.051 y 4.879.236. En general, un vector de expresión de baculovirus comprende un genoma de baculovirus que contiene el gen que va a expresarse insertado en el gen de poliedro en una posición que oscila desde la señal de inicio de la transcripción del poliedro hasta el sitio de inicio ATG y bajo el control transcripcional de un promotor de poliedro de baculovirus.

Está disponible una amplia variedad de vectores procariotas y microbianos adecuados. Asimismo, están disponibles en la técnica los promotores y otros agentes reguladores utilizados en la expresión de proteínas foráneas. Los promotores utilizados comúnmente en vectores de expresión microbianos recombinantes se conocen en la técnica e incluyen los sistemas de promotor de beta-lictamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang et al. (1978) Nature 275:615 y Goeddel et al. (1979) Nature 281:544); sistema de promotor de triptófano A (Goeddel et al. (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057 y la publicación de solicitud de la EPO número 36.776); y el promotor Tac (DeBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 80:21). Aunque estos se utilizan comúnmente, están disponibles otros promotores microbianos. Se han publicado detalles referentes a las secuencias de nucleótidos de muchos, permitiendo que un trabajador experto las ligue operativamente a ADN que codifica para la proteína en vectores de plásmido o virales. Véase, por ejemplo, Siedenlist et al. (1980) Cell 20:269.

Las células huésped eucariotas tales como de levaduras pueden transformarse con vectores que codifican para proteínas adecuados. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 4.745.057. Saccharomyces cerevisiae es el utilizado más comúnmente entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores, aunque están disponibles comúnmente varias otras cepas. Los vectores de levaduras pueden contener un origen de replicación desde el plásmido de levaduras de 2 micras o una secuencia de replicación autónoma (SRA), un promotor, ADN que codifica para la proteína deseada, secuencias para poliadenilación y terminación de la transcripción y un gen de selección. Un plásmido a modo de ejemplo es YRp7, (Stinchcomb et al. (1979) Nature 282:9; Kingsman et al. (1979) Gene 7:141; Tschemper et al. (1980) Gene 10:157). Este plásmido contiene el gen trp1, que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC nº 44076 o PEP4-1 (Jones (1977) Genetics 85:12). La presencia de la lesión de trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano.

Las secuencias de promotor adecuadas para su uso en vectores de levaduras incluyen los promotores para metalotioneína, alcohol deshidrogenasa, adenilato ciclasa, 3-fosfoglicerato cinasa ((Hitzeman et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:2073) y otras enzimas glucolíticas (Hess et al. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; y Holland et al. (1978) Biochemistry 17:4900) tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucocinasa. Vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levaduras se describen además en R. Hitzeman et al. Publ. de la EPO nº 73.657.

La invención proporciona preparaciones de anticuerpos que se unen selectivamente a las proteínas de la invención, o cualquier variante o fragmento de las mismas tal como se describió. Un anticuerpo se considera que se une selectivamente, incluso si se une también a otras proteínas que no sean sustancialmente homólogas a la proteína antitrombina. Estas otras proteínas comparten homología con un fragmento o dominio de la proteína antitrombina dando lugar a anticuerpos que se unen a ambas proteínas en virtud de la secuencia homóloga. En este aspecto, se reconoce que la unión de anticuerpos a la proteína antitrombina es aún selectiva.

Las preparaciones engloban anticuerpos monoclonales o policlonales, anticuerpos intactos o fragmentos de los mismos (por ejemplo, Fab), preparaciones purificadas tales como preparaciones purificadas por afinidad, o preparaciones menos puras tales como líquido ascítico, sueros y similares. Los métodos para producir anticuerpos se conocen bien en la técnica e incluyen pero no se limitan a los descritos en Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). La invención también realiza preparaciones de anticuerpos que neutralizan las funciones biológicas de las proteínas proporcionadas, variantes o fragmentos de las mismas. Tales funciones incluyen pero no se limitan a actividad antitrombina. La invención también proporciona combinaciones que pueden modular la respuesta inmunitaria. Por modular la respuesta inmunitaria se pretende que sea un cambio determinable en el sistema inmunitario de un organismo huésped efectuado al administrar las composiciones de la invención descritas en el presente documento a ese huésped. Se proporcionan ejemplos de trabajo de tal modulación de la respuesta inmunitaria, así como métodos para preparar y evaluar la selectividad de las preparaciones de anticuerpos en la sección experimental de esta solicitud, y se incorporan como referencia al presente documento.

Las composiciones de la presente invención encuentran uso terapéutico como vacunas veterinarias en el tratamiento de la hematofagia en un mamífero. Los métodos comprenden administrar al mamífero una vacuna veterinaria que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones de la invención. En este aspecto, una cantidad terapéuticamente eficaz se pretende que sea esa cantidad que logra una reducción, mejoría, eliminación o prevención determinable de la infestación hematofágica en el mamífero al que se administró la vacuna de la presente invención. Aunque las vacunas de la invención pueden utilizarse con cualquier mamífero, de particular interés son los animales de cría, más particularmente, caballos, ganado y similares. Las composiciones son útiles para la vacunación frente a la mosca hematofágica del suborden Cyclorrhapha, más particularmente de la especie Haematobia irritans, incluso más particularmente de la subespecie irritans o exigua. Sin embargo, la vacunación de la invención frente a cualquier organismo hematofágico en la que tal vacunación que utiliza las composiciones y métodos de la presente invención es terapéuticamente eficaz.

Para aplicaciones veterinarias, las composiciones de la invención pueden formularse en cualquier preparación farmacéutica aceptable tal como se describe a continuación o cualquier otra preparación aceptable para uso veterinario. En una realización de la invención, las vacunas comprenden cantidades terapéuticamente eficaces de las proteínas de la invención, o cualquier variante o fragmento de las mismas tal como se describen en el presente documento.

En una realización preferida, las vacunas comprenden las composiciones de nucleótidos de la invención tal como se describen en el presente documento. Tal como se describe por Cox et al. (1993) J. Virol. 67:5664-5667; Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-11482; y Lewis et al. (1997) Vaccine 15:861-864; y revisado por Robinson (1997) Vaccine 15:785-787; y Tighe et al. (1988) Immunol. Today 19:89-97, pueden construirse y producirse fácilmente vacunas de ácido nucleico. En general, las secuencias de ADN diana que codifican para la proteína que va a utilizarse como inmunógeno se clonan en vectores de expresión eucariotas. El plásmido construido se hace crecer en bacterias y se purifica. El ADN de plásmido purificado se inyecta directamente al animal generalmente mediante inyección intramuscular, pero también mediante inyección transdérmica; en la que su expresión por las células en el huésped inoculado produce la proteína diana, produciendo así una respuesta inmunitaria. Véase, por ejemplo, Cox et al. (1993) J. Virol. 67:5664-5667. Pueden utilizarse niveles de nanogramos de proteína expresada por el ADN para estimular una respuesta inmunitaria y proteger frente a agentes infecciosos obtenidos mediante las inoculaciones en la piel, músculo e intravenosas de ADN. Véase, por ejemplo, Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-11482; Cox et al. (1993) J. Virol. 67:5664-5667. Tales plásmidos introducidos mediante inyección intramuscular o intradérmica estimulan una respuesta protectora que elimina la enfermedad clínica tras la exposición.

Las composiciones de la presente invención pueden formularse en preparaciones farmacéuticas para su uso terapéutico como agentes antitrombina. Tales composiciones encuentran uso en el tratamiento de la trombosis venosa, oclusión por derivación vascular y coagulación intravascular diseminada incluida por trombina.

Las composiciones de la invención pueden utilizarse solas o en combinación con otros agentes terapéuticos y antitrombina incluyendo agentes veterinarios tales como vacunas. Se conocen en la técnica otros agentes.

Las composiciones antitrombina pueden formularse según métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, tales como mediante mezclado con un vehículo excipiente farmacéuticamente aceptable. Vehículos adecuados y su formulación se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences 19ª ed., Osol, A. (ed.), Mack Easton PA (1980). Con el fin de formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para la administración eficaz, tales composiciones contendrán una cantidad eficaz de la proteína antitrombina, ya sea sola o con una cantidad adecuada de vehículo excipiente.

Pueden emplearse métodos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la acción. Pueden obtenerse preparaciones de liberación controlada mediante el uso de polímeros para complejar o absorber las composiciones. La administración controlada puede ejercerse seleccionando macromoléculas apropiadas (por ejemplo, poliésteres, poliaminoácidos, polivinilpirrolidona, etileno-acetato de vinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o sulfato de protamina). La velocidad de liberación del fármaco puede controlarse también alterando la concentración de tales macromoléculas.

Otro método posible para controlar la duración de la acción comprende incorporar los agentes terapéuticos en partículas de una sustancia polimérica tal como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico) o copolímeros de etileno-acetato de vinilo. Alternativamente, es posible atrapar los agentes terapéuticos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, mediante el uso de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina o microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, o en un sistema de administración de fármaco coloidal, por ejemplo, liposomas, albúmina, microesferas, microemulsiones, nanopartículas, nanocápsulas, o en macroemulsiones. Tales enseñanzas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980).

En realizaciones más específicas, puede convertirse un polipéptido de la invención en una sal farmacéuticamente aceptable. Puede convertirse en una sal de adición de ácido con un ácido orgánico o inorgánico. Los ácidos adecuados incluyen ácido acético, succínico y clorhídrico. Alternativamente, el péptido puede convertirse en una sal de ácido carboxílico tal como la sal de amonio o la sal de metal alcalino, tal como la sal de sodio o potasio.

Puede utilizarse un polipéptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo en una composición farmacéutica, junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para los mismos. Tal formulación es normalmente para la administración intravenosa (en cuyo caso el vehículo es generalmente solución salina estéril o agua de pureza aceptable). Por tanto, puede utilizarse un polipéptido para la terapia y la profilaxis de la trombosis y tromboembolias en un ser humano u otro mamífero, incluyendo la profilaxis de trombosis posoperatoria, para la terapia de choque aguda (por ejemplo, para choque séptico o politraumático), para la terapia de coagulopatías por consumo, en hemodiálisis, hemoseparaciones y en circulación sanguínea extracorporal. En una realización de la invención, el polipéptido o la sal del mismo puede coadministrarse con un activador del plasminógeno, tal como un activador del plasminógeno tisular.

La dosificación depende especialmente de la forma específica de administración y del fin de la terapia o profilaxis. El tamaño de las dosis individuales y el régimen de administración pueden determinarse de la mejor manera por medio de un criterio individual del caso particular de enfermedad; los métodos para determinar los factores sanguíneos relevantes requeridos para este fin son familiares para la persona experta en la técnica. Normalmente, en el caso de una inyección de la cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos según la invención es en el intervalo de dosificación de desde aproximadamente desde 0,005 o 0,01 hasta aproximadamente 0,05 p 0,1 mg/kg de peso corporal, preferiblemente desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 0,05 mg/kg de peso corporal.

La administración se efectúa mediante inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea. En consecuencia, las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral en forma de dosis única contienen por dosis, dependiendo del modo de administración, desde aproximadamente 0,4 hasta aproximadamente 7,5 mg del compuesto según la invención. Además del principio activo, estas composiciones farmacéuticas también contienen normalmente un tampón, por ejemplo, un tampón fosfato, que se pretende que mantenga el valor de pH entre aproximadamente 3,5 y 7, y también cloruro de sodio, manitol o sorbitol para ajustar la isotonicidad. Las preparaciones pueden liofilizarse o disolverse. Puede incluirse un conservante activo de manera antibacteriana, por ejemplo, desde el 0,2 hasta el 0,5% de éster metílico o éster etílico del ácido 4-hidroxibenzoico.

Una composición para la aplicación tópica puede estar en la forma de una solución acuosa, loción o gel, una solución o suspensión aceitosa o que contiene grasa o, especialmente una pomada emulsionada. Se obtiene una composición en la forma de una solución acuosa, por ejemplo, disolviendo los principios activos según la invención, o una sal terapéuticamente aceptable de los mismos, en una solución tampón acuosa de desde, por ejemplo, pH 4 hasta pH 6,5 y, si se desea, añadiendo un principio activo adicional, por ejemplo, un agente antiinflamatorio, y/o un aglutinante polimérico, por ejemplo polivinilpirrolidona, y/o un conservante. La concentración de principios activos es desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 1,5 mg, preferiblemente desde 0,25 hasta 1,0 mg, en 10 ml de una solución o 10 g de un gel.

Se obtiene una forma aceitosa de administración para aplicación tópica, por ejemplo, suspendiendo el principio activo según la invención, o una sal terapéuticamente aceptable del mismo, en un aceite, opcionalmente con la adición de agentes de hinchamiento, tales como estearato de magnesio, y/o surfactantes (tensioactivos) que tienen un valor de HLB ("equilibrio hidrófilo-lipófilo") inferior a 10, tales como monómeros de ácido graso de alcoholes polihidroxilados, por ejemplo, monoestearato de glicerina, monolaurato de sorbitano, monoestearato de sorbitano o monooleato de sorbitano. Se obtiene una pomada que contiene grasa, por ejemplo, suspendiendo el principio activo según la invención, o una sal del mismo, en una base grasa extendible, opcionalmente con la adición de un tensioactivo que tiene un valor de HLB inferior a 10. Se obtiene una pomada emulsionada triturando una solución acuosa del principio activo según la invención, o una sal del mismo, en una base grasa extendible, suave con la adición de un tensioactivo que tiene un valor de HLB inferior a 10. Todas estas formas para la aplicación tópica también pueden contener conservantes. La concentración de principio activo es desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 1,5 mg, preferiblemente desde 0,25 hasta 1,0 mg, en aproximadamente 10 g de base.

Además de las composiciones descritas anteriormente y composiciones farmacéuticas análogas a las mismas que se destinan al uso medicinal directo en el cuerpo de un ser humano o un mamífero, la presente invención se refiere también a composiciones y preparaciones farmacéuticas para su uso medicinal fuera del organismo vivo de seres humanos o mamíferos. Tales composiciones y preparaciones se utilizan especialmente como aditivos anticoagulantes para la sangre que se está sometiendo a circulación o tratamiento fuera del organismo (por ejemplo, hemoseparación). Tales preparaciones, tales como soluciones madre o alternativamente preparaciones en forma de dosis única, son similares en composición a las preparaciones para inyección descritas anteriormente; sin embargo; la cantidad de concentración del principio activo se basa ventajosamente en el volumen de sangre que va a tratarse o, más precisamente, en su contenido en trombina. Dependiendo del fin específico, la dosis adecuada es desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 1,0 mg del principio activo/litro de sangre, aunque el límite superior todavía puede superarse sin riesgo ya que el agente es inocuo incluso en cantidades relativamente elevadas.

Parte experimental Recogida y cría de H. irritans

Se enviaron crisálidas desde el U.S.D.A. Livestock Insects Research Laboratory en Kerrville, Texas, de manera bisemanal y se almacenaron a 4ºC hasta que se necesitaron. Se sacaron y se colocaron en jaulas de acero inoxidable (18'' \times 18'' \times 18'') a temperatura ambiente (21 - 22ºC) con 16 : 8 horas (L : O) para promover la aparición de adultos. Se colocó una almohadilla de algodón absorbente en la parte superior de cada jaula y se usó como una mecha para suministrar sangre fresca a los adultos de manera diaria.

Se usaron para algunos ensayos adultos cogidos naturales tomados de la manada lechera de la Universidad de Arizona y de las terneras y manada lechera de la universidad de Auburn. Se transportaron al laboratorio en el plazo de una hora desde la recogida y se mantuvieron tal como anteriormente, antes de la experimentación.

Recuperación de glándulas salivales

Ambos sexos de H. irritans se alimentan con sangre de manera estricta y sus glándulas salivales son similares en morfología y localización en el cuerpo de las moscas de los establos (Stomoxys calcitrans) y moscas tsetsé (Glossina spp.). Se usó el siguiente protocolo para la disección de las glándulas: (a) se "fulminó" la mosca con CO_{2} humidificado, se hizo pasar brevemente a través de un baño de etanol (ETOH) al 70%, y entonces se enjuagó con agua desionizada; (b) se colocó en un portaobjetos de vidrio limpio en un gota de solución salina 0,15 M helada y se extirparon las patas, alas y cabeza. Se abrió sagitalmente el tórax usando una cuchilla de navaja o un bisturí; (c) se transfirió entonces la mosca a una gota nueva de solución salina helada en un vidrio de reloj o una placa pequeña llena de parafina. Entonces usando agujas de disección diminutas, se despegaron las dos mitades del tórax; (d) usando pinzas, se tiró hacia afuera de la cutícula abdominal, exponiendo los órganos internos. Entonces se sacaron las glándulas salivales del tejido del intestino. Se sujetó el extremo anterior del intestino (el cardias) y entonces se retiró un conjunto de glándulas salivales - intestino empujándolo a través de la constricción torácica abdominal: (e) Entonces se sacaron las glándulas del intestino, se enjuagaron una vez en solución salina fría y se transfirieron a un tubo Eppendorf para mantenerse en hielo para la recogida, y entonces se congelaron a -70ºC.

Preparación de extractos de glándulas salivales

Se prepararon extractos de glándulas salivales (EGS) tal como se describió en Cupp et al. (1993) J. Insect Physiol. 39 : 817-821, o mediante sonicación. Por el primer método, se homogeneizaron las glándulas en un mezcla 1 : 1 de solución de NaCl 0,15 M y se añadió Triton X-100 al 0,1% a la muestra descongelada, que se congeló entonces de nuevo. Se prepararon extractos descongelando las muestras solubilizadas, agitándolas con vortex durante 30 segundos y centrifugándolas después a 14.000 x g durante 30 segundos a 4ºC. Por este último método, se obtuvo la perturbación sónica de las glándulas usando el ciclo del 70% y una potencia de salida del 70% de un sonicador Sonifier 450 (Branson Ultrasonics, Danbury, CT) durante 2 minutos. Se descongelaron los tubos Eppendorf con glándulas y se perturbó el contenido cogiendo la punta de cada tubo hacia la base de la sonda sónica inmersa en un baño de hielo para dispersar el calor. Se transfirieron los extractos de glándulas salivales a un tubo nuevo tras la eliminación de fragmentos de células mediante centrifugación a \sim 12.000 x g durante 5 minutos a 4ºC. Se determinó la cantidad de proteína por glándula individual usando un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). La medición inicial de proteína soluble obtenida a partir de glándulas salivales de H. irritans sonicadas fue de 0,54 \pm 0,09 \mug/par de glándulas para las hembras y de 0,63 \pm 0,02 \mug/par de glándulas para los machos.

Recogida de saliva

Para determinar la actividad antihemostática atribuible específicamente a la secreción salival, se combinaron dos métodos que se han usado previamente para la mosca de los búfalos (Kerlin y Hughes (1992) Med. Vet. Entomol. 6 : 121-126) y mosquitos (Hurlbut (1996) Am. J. Trop. Med. Hyg. 15:989-993) para recoger saliva a partir de esos insectos. Se privó de comida a moscas adultas, mantenidas a temperatura ambiente, durante 24 horas para garantizar que las secreciones se retuvieron en las glándulas salivales y que se digirió todo el contenido de intestino. Es necesaria esta última precaución ya que las moscas muscoides a menudo regurgitan durante la alimentación. Se anestesiaron entonces las moscas con CO_{2} humidificado y se extirparon sus alas con unas tijeras de microdissección. Entonces se pegaron las moscas sin alas a bastoncillos aplicadores de tal manera que sus partes de la boca pudieron situarse dentro de un tubo capilar que contenía aceite mineral. Justo antes de esta etapa, se inyectó a cada mosca 1 \mul de serotonina 80 mM. Se insertó entonces la probóscide de la mosca en el aceite que, debido a su diferencia de viscosidad con la saliva, sirvió como un medio colector para las secreciones inducidas por serotonina. Normalmente, la salivación empezó en 30-60 segundos y pudo observarse fácilmente la saliva como una gotita acuosa transparente cuando se expulsó hacia el aceite.

Electroforesis en gel

A menos que se indique lo contrario, se resolvieron las proteínas en geles de poliacrilamida/SDS al 15% (SDS-PAGE) mediante el método de Laemmeli (1970) Nature 227:680-685, y se visualizó mediante tinción con plata (Bassam et al. (1991) Annal. Biochem. 196:80-83). Se barrieron los geles teñidos mediante análisis de densitometría de migración de bandas e intensidad de tinción (Personal Densitometer S.I., ImageQuaNT para Windows NT, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Proteínas en saliva

La figura 1 representa la comparación del peso molecular de proteínas en saliva de moscas recogidas en colonia (carril C) frente a recogidas en el campo (carril B) por movilidad relativa en SDS-PAGE. Los pesos moleculares habituales en el intervalo de 10 - 220 kDa se muestran en los carriles A y D. Se observa un perfil muy similar excepto por la presencia de una banda ligera a \approx 36 KDa en las moscas recogidas en el campo. Sin embargo, la concentración de proteínas en la saliva de las 30 moscas recogidas en el campo (B), tal como se determinó mediante la intensidad relativa de la tinción de las bandas, supera la de las correspondientes bandas en la saliva de las 84 moscas de colonia 84 (C). Esta diferencia se observó rutinariamente en geles teñidos con plata e indica que poblaciones de campo de H. irritans producen mayores concentraciones de proteínas salivales de lo que lo hacen las moscas de esta cepa colonizada.

Actividad apirasa

Se probó la actividad apirasa en EGS usando un ensayo habitual (véase Cupp et al. (1993) j. Insect Physiol.39:817-821). Esta enzima degrada rápidamente adenosina trifosfato (ATP) y adenosina difosfato (ADP) para dar el monofasto, eliminando de ese modo una señal química crucial que normalmente promueve la agregación plaquetaria. Se prepararon extractos a partir de moscas machos y hembras cogidas naturales que se mantuvieron en agua durante 48 h antes de la disección. La actividad en esta enzima en EGS fue ligeramente detectable en H. irritans (2,59 \pm 0,21 miliunidades/par de equivalentes de glándulas salivales). Esta carencia de actividad apirasa se confirmó también por la incapacidad de la saliva de H. irritans para afectar la agregación de plaquetas inducida por ADP en plasma rico en plaquetas bovino (observaciones no publicadas). Por tanto, se eliminó la actividad apirasa tal como un mecanismo de hematofagia por H. irritans.

Actividad de eritema

Se evaluó el potencial de la saliva de H. irritans para inducir eritema, utilizando inyecciones intradérmicas de EGS o por alimentación directa de moscas machos y hembras en el lomo afeitado de un conejo blanco de Nueva Zelanda. Como un control, también se inyectó EGS de Simulium vittatum que producen un eritema persistente en un plazo de 15 min. desde la administración intradérmica (Cupp et al. (1994) Am. J.Trop. Med. Hyg. 50:235-240). Una cepa colonizada de S. vittatum sirvió como fuente de material de glándulas salivales (Bernardo et al. (1986) Ann. Entomol. Soc. Am. 79:610-621). No se produjo eritema ni por la saliva de los machos ni de las hembras de H. irritans, ya fuera inyectada como un EGS o administrada mediante una picadura. EGS de Simulium vittatum produjo un eritema visible en un plazo de 15 minutos. Por tanto, se eliminó la actividad de eritema como un mecanismo de hematofagia por
H. irritans.

Otra actividad vasodilatadora

Se llevaron a cabo estudios para detectar la presencia de actividad vasodilatadora en EGS de H. irritans o saliva utilizando mediciones de tensión de bandas de estomago de rata (ensayo para las prostaglandinas) y bandas aórticas de conejo, con o sin endotelio intacto (véase Ribeiro et al. (1992) Exp. Parasitol. 74:112-16; Ribeiro et al. (1994) J. Med. Entomol. 31:747-753). Para detectar la actividad histamina o bradicinina en EGS de H. irritans, el ensayo siguió el procedimiento de Webster y Prado (1970) que utiliza la contracción in vitro de íleon de cobaya como un ensayo directo de la actividad cinina. Se obtuvieron respuestas normales a las sustancias de prueba (prostaglandina E_{2} para bandas de estomago de rata y norepinefrina o acetilcolina para bandas aórticas de conejo), mientras que los EGS de H. irritans no mostraron actividad vasodilatadora. Inicialmente, las recogidas de saliva inducida mostró actividad en el ensayo de la banda de estomago de rata pero esto se perdió cuando se incluyó maleato de metilsergida (Pertz y Eich (1992) Navnyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 345:394-401). Esta sustancia es un inhibidor conocido de la serotonina, el compuesto utilizado para provocar la salivación por la mosca. La presencia de actividad en saliva inducida por serotonina, pero no en EGS, indicó que la actividad serotonina en aquellas muestras se derivó a partir del compuesto inyectado utilizado para provocar la salivación. La extracción de EGS de H. irritans para aumentar la detección de actividad prostaglandina confirmó los resultados negativos del estudio vasodilatador anterior. No se detectó actividad salival en el ensayo de íleon de cobaya para bradicinina o histamina. Por tanto, las actividades vasodilatadores probadas se eliminaron como mecanismos de hematofagia por H. irritans. La incapacidad de EGS de la mosca de los cuernos para provocar la vasodilatación cuando se inyecta por vía intradérmica en la piel afeitada de conejos de Nueva Zelanda, in vivo, se confirmó utilizando la obtención de imágenes de perfusión por láser doppler.

Actividad anticoagulante

Se seleccionó el ensayo de tiempo de recalcificación para examinar la actividad anticoagulante, ya que este ensayo general puede detectar inhibidores que atacan a cualquiera de las tres ramas principales de la cascada de coagulación; la ruta extrínseca, la ruta intrínseca y la ruta común final. Se prepararon extractos de glándulas salivales tanto a partir de H. irritans macho y hembra como a partir de S. vittatum hembra. Se utilizaron EGS de la ultima especie tal como un control positivo porque el mismo ensayo de tiempo de recalcificación se ha utilizado anteriormente para detectar la actividad anticoagulante en esa especie (Abebe et al. (1994) J. Med. Entomol. 31:908-911). Los extractos de glándulas salivales de H. irritans hembra fueron tan potentes como aquellos de S. vittatum en retrasar el tiempo de recalcificación de plasma normal tal como se muestra en la figura 2. También los EGS de macho retrasaron el tiempo de recalcificación (datos no mostrados). Tiene lugar una inhibición comparable a pesar del hecho de que el contenido de proteínas medido fue un 50% inferior en los extractos de H. irritans. Por tanto, esta actividad anticoagulante fue la única actividad antihemostática detectada para la mosca de los cuernos, H. irritans.

Especificidad antihemostática

El ensayo de tiempo de recalcificación puede detectar inhibición de cualquiera de las etapas en la cascada de reacciones que conduce finalmente a la coagulación de la sangre (coagulación), y por tanto es una prueba general útil para examinar la presencia de un inhibidor desconocido. Debido a que la coagulación de la sangre es el resultado de una serie de reacciones, la saliva de la mosca de los cuernos podría retrasar la coagulación inhibiendo una etapa específica en la cascada de coagulación de la sangre o, alternativamente, retrasar la velocidad normal de hemostasia disolviendo un coagulo después que se forme (actividad fibrinolítica).

Para fines analíticos, las reacciones de coagulación se agrupan normalmente en tres sub-rutas que se monitorizan mediante diferentes ensayos de coagulación; es decir, la ruta intrínseca (prueba del tiempo de tromboplastina parcial activada = TTPA), la ruta extrínseca (prueba del tiempo de protrombina = TTP) y la ruta común final (tiempo de trombina = TT). Los ensayos del tiempo de recalcificación, TTP, TT y TTPA se conocen bien por los expertos ordinarios en la técnica. Por ejemplo, véase Biggs et al. ((1962) Human Blood Coagulation And Its Disorders, 3ª ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford) para los ensayos del tiempo de recalcificación, y Turgeon M.L. ((1993) Clinical Hematology, Theory and Procedures, 2ª ed., Little, Brown y Company, Boston) para los ensayos de TTPA, TTP y TT. TTPA II es una modificación del ensayo de TTPA I y es más sensible.

Utilizando estas pruebas, se determinaron varias propiedades de la actividad de anticoagulación de la mosca de los cuernos tal como se muestran en la tabla 1: 1) saliva o extractos de glándulas salivales de mosca de los cuernos produjeron un retraso en la coagulación de todas las pruebas, indicando que al menos esta presente un inhibidor que funciona en la ruta común final, es decir después de la formación de trombina a partir de protrombina. 2) La saliva de moscas de tipo natural contiene más actividad de inhibidor que la saliva recogida a partir del mismo número de moscas de colonia. 3) La actividad de inhibidor en moscas de colonia mantenidas durante 48 horas después de aparecer, es mayor que 24 horas tras la aparición.

TABLA 1 Retraso en la coagulación de la sangre por extractos de glándulas salivales de Haematobia irritans (EGS) o saliva inducida por serotonina

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Fuente	nº de moscas	Tipo de ensayo	% de control*
EGS-colonia	1	Recalcificación	106
EGS-colonia	2	Recalcificación	128
Saliva-colonia (24 h)	4	Recalcificación	143
Saliva-colonia (48 h)	4	Recalcificación	175
Saliva-tipo natural	1	Recalcificación	127
Saliva-tipo natural	2	Recalcificación	161
EGS-colonia	1	TTPA-I	113
EGS-colonia	2	TTPA-I	149
Saliva -colonia	1	TTPA-I	112
EGS-colonia	1	TTPA-II	144
Saliva-tipo natural	1	TTPA-II	210
EGS-colonia	1	TTP	120
EGS-colonia	2	TTP	140
Saliva-tipo natural	1	TTP	156
EGS-colonia	1	TT	ND
EGS-colonia	2	TT	109
Saliva -tipo natural	1	TT	158
ND no determinado
*cada valor es la media de 4 ensayos.

La inhibición de la coagulación en el ensayo de TT por saliva de mosca de los cuernos indica que se selecciona como diana una reacción que tiene lugar después de la formación de trombina. Tienen lugar dos reacciones después de ese punto - 1) la formación de monómeros de fibrina mediante la acción de la trombina (factor II) sobre el fibrinógeno y 2) la reticulación de los monómeros de fibrina mediante la acción del factor XIII. La trombina está implicada también en la activación del factor XIII. Por tanto, la trombina (factor II) fue una diana probable de la saliva de la mosca de los cuernos. Para probar esta posibilidad, se determinaron los tiempos de coagulación de plasma que se ha reducido en factor II utilizando anticuerpos específicos (Sigmal Chemical, St. Louis, MO). La adición de cantidades crecientes de plasma normal (que contiene factor II), disminuyó el tiempo para la coagulación tal como se midió mediante el ensayo de TTP (figura 3, - saliva). Cuando se añadió saliva de la mosca de los cuernos (equivalente a 2 moscas) con las cantidades crecientes de plasma normal (figura 3, + saliva), el retraso en porcentaje en el tiempo de coagulación aumentó con cantidades crecientes de factor II (presente en el plasma normal). Esta pauta indicó que la saliva contenía un inhibidor específico del factor II.

La acción coagulante de la trombina puede medirse utilizando un sustrato sintético (S238, American Diagnostica Inc., Greenwich, CT) que produce un cromóforo tras la hidrólisis por la trombina. Se midieron las velocidades de hidrólisis de S238 por trombina bovina sola (250 pM; figura 4, - saliva) y en presencia de saliva de la mosca de los cuernos (equivalente a 2 moscas) a concentraciones crecientes de sustrato en el intervalo de 2,5 - 100 \muM. Estos datos confirmaron la observación de que la saliva de la mosca de los cuernos contiene un inhibidor de la trombina e indica que puede ser un inhibidor competitivo, ya que su efecto disminuye cuando el sustrato es ilimitado (100 \muM). Varios modelos pueden explicar tal comportamiento bioquímico (Segel (1976) Biochemical Calculations, John Wiley &
Sons, Nueva York). Para análisis, se genera un diagrama de Dixon determinando la velocidad (v) de la hidrólisis del sustrato por trombina en presencia de diferentes concentraciones fijas de sustrato, y representando l/v frente a la concentración del inhibidor. Esto proporciona los medios para identificar el tipo de inhibición y para determinar la constante de inhibición, Ki.

Caracterización de las propiedades físicas del (de los) componente(s) de anticoagulación en glándulas salivales de la mosca de los cuernos para crear un plan de purificación

Los tiempos de coagulación TTPA en tabla 2 indican que la actividad en EGS disminuye después de asentar a temperatura ambiente durante 60 minutos o cuando se somete a 100ºC durante 5 minutos. La actividad precipita con etanol, y es razonablemente estable para su tratamiento con acetonitrilo / TFA y liofilización. Estas características físicas coinciden con un inhibidor proteico que puede purificarse con procedimientos de HPLC habituales utilizando elución en gradiente de acetonitrilo / TFA.

TABLA 2 Caracterización de las propiedades físicas de la actividad anticoagulante en extractos de glándulas salivales de Haematobia irritans

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Tratamiento	Tiempo de coagulación TTPA (segundos)
Control	52,3
EGS-tiempo O	62,6
EGS-temperatura ambiente \times 60 min	56,8
EGS-100ºC \times 5 min	55,2
EGS-precipitado en etanol	59,8
EGS-sobrenadante de etanol	50,1
EGS-liofilizado	57,0
EGS-acetonitrilo al 50% / TFA al 0,1%	57,8

Purificación por HPLC y ensayo de recalcificación de fracciones de saliva por HPLC

Para el desarrollo de método analítico, se reunió saliva de desde 100 hasta 150 moscas para cada serie de HPLC. Para la separación preparativa, se utilizó saliva de más de 500 moscas para cada serie. Antes de la inyección en la columna, se diluyó siempre la saliva reunida con el disolvente inicial de los disolventes \ring{A} de gradiente emparejado. Se utilizó una columna de de macroesferas, C18, 4,6 \times 250 nm, 300 \ring{A} (AllTech) para todas las preparaciones de HPLC. Se monitorizó la elución de proteína mediante absorción UV a 220 nM, que detecta enlaces peptídicos. Se recogieron los componentes eluídos de la columna en intervalos de 0,5 o de 1 minuto. Se transfirió una alícuota para los ensayos de la actividad de cada fracción a un segundo tubo que contenía albúmina de suero bovino (BSA) antes de la liofilización de todas las muestras para eliminar los disolventes orgánicos. Se reconstituyeron las fracciones secas con BSA (utilizado para aumentar la solubilización de la proteína purificada) con tampón Tris (tris 5 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 37ºC). Se definió la actividad inhibidora en las fracciones mediante el retraso en la formación de coágulos utilizando en ensayo de recalcificación descrito anteriormente.

La figura 5 representa los tres procedimientos en columna de HPLC de fase inversa utilizados para obtener una preparación altamente pura de la actividad de anticoagulación. Las líneas negras son cromatogramas de HPLC, mientras que las barras grises indican tiempos de coagulación del ensayo de recalcificación. El panel A muestra la separación por HPLC de saliva de H. irritans utilizando elución en gradiente (acetonitrilo, 2-propanol, y TFA). El panel B muestra la separación por HPLC de la fracción con la actividad de anticoagulación máxima en "A" utilizando elución en gradiente (acetonitrilo y TFA). El panel C muestra la separación por HPLC de la fracción con la actividad de anticoagulación máxima en "B" utilizando elución en gradiente (acetonitrilo y HCl). Los datos de coagulación de la primera serie de fraccionamiento (A) indican que la saliva de la mosca de los cuernos contiene sólo un inhibidor de la coagulación que eluye a aproximadamente 45 minutos en las condiciones utilizadas. Para la separación por HPLC secundaria, se combinaron las fracciones del pico diana y se inyectaron directamente en la columna después que se hubiera equilibrado la columna con el disolvente inicial. Se conservó la actividad anticoagulante después de 3 series de HPLC consecutivas, secándose a vacío y se almacenaron durante 4 días a 4ºC.

La figura 6 muestra SDS-PAGE de proteína anticoagulante salival de la mosca de los cuernos después de la separación por HPLC de 3 etapas. El carril 1 contenía marcador de concentración de proteínas; el carril 2, marcador habitual de peso molecular de proteínas, el carril 3, la fracción de HPLC con mayor actividad anticoagulante (figura 5-C) y el carril 4, la fracción de HPLC con menor actividad anticoagulante (figura 5-C). Este perfil indicó una única proteína de alta pureza con una movilidad relativa de \sim 16,5 KDa.

Construcción de una biblioteca de ADNc de glándulas salivales de la mosca de los cuernos

Se descongeló ARN de glándulas salivales total (almacenado en varias alícuotas a -70ºC durante un período de \sim 3
años), se reunió y se aisló el ARNm utilizando reactivos de poly(A) Quick® (Strategene, LaJolla, CA). Se construyó una biblioteca de ADNc utilizando un vector ZAP express^{TM} y un kit de Stratagene. Análisis preliminares de los números de insertos indicaron que se obtuvo un número relativamente pequeño de insertos primarios (\sim 3 \times 10^{4}). Aproximadamente se reservó un 1/5 de la biblioteca primaria y el restó se utilizó para una tanda de amplificaciones para dar un título de 5,1 \times 10^{6} unidades formadoras de placas (UFP) por ml.

Clonación del ADNc que codifica para la trombostasina

Se envió una cantidad estimada de 110 pmoles de trombostasina pura por HPLC al Laboratorio de Microquímica de Harvard para obtener una masa molecular precisa mediante espectroscopia de masas y la identificación de 30 residuos de la secuencia amino-terminal (N-). Aunque el análisis mediante SDS-PAGE indicó sistemáticamente una masa de \sim 16,5 KDa (véase, por ejemplo, la figura 6), la espectroscopia de masas de la muestra pura por HPLC detectó una "familia" aparente de 4 proteínas con una masa promedio de 9,3 \pm 0,06 KDa. Se obtuvo una secuencia N-terminal a partir de la proteína de \sim 9 KDa (SEQ ID NO: 3), indicando que se obtuvieron las masas variables a partir de proteínas en gran medida idénticas que pueden tener pares iónicos variables o que difieren en tan sólo 1-2 aminoácidos. También sugirió la secuencia procedente del extremo N-terminal que la proteína es altamente ácida. Una segunda muestra de trombostasina, que se purificó mediante HPLC y se envió para análisis, dio una masa similar. Se volvieron a analizar los restos no utilizados de esta segunda muestra mediante SDS/PAGE. De nuevo la proteína corrió tal como una masa de \sim 16,5. La búsqueda de bibliografía científica reveló otro informe de proteína altamente ácida que produce una masa molecular anómalamente alta cuando se analiza mediante PAGE (Takano et al. (1988) Biochemistry 27:1964-1972). Con el fin de confirmar la masa molecular, se sometió a SDS/PAGE una tercera serie de trombostasina con actividad confirmada en un ensayo de recalcificación. La banda única de proteína de \sim 16,5 KDa se transfirió a una membrana de PVDF. La inmunotransferencia se tiñó con ponceau S para revelar la banda de trombostasina transferida. Se cortaron esta banda y una región de control de área similar y se enviaron al laboratorio de Harvard para el análisis de la secuencia. La secuen-
cia N-terminal de este análisis (SAGPI) confirmó la identidad de los 5 primeros aminoácidos del extremo N-terminal.

La secuencia N-terminal obtenida a partir de los 30 primeros residuos de trombostasina tal como se expone en SEQ ID NO: 3 se utilizó para construir cebadores de nucleótidos degenerados por el laboratorio de ADN de Scout-Ritchey Research Center (SRRC) en la universidad de Auburn. Para ADN molde, se utilizó una alícuota de ADNc de glándulas salivales de Haematobia irritans que se había extraído y congelado a -20ºC tras una síntesis de ADNc de primera hebra para la construcción de la biblioteca descrita anteriormente. Una reacción de PCR que utiliza este molde, el cebador directo degenerado diseñado a partir de la secuencia N-terminal de trombostasina y un cebador inverso de oligo dT, dio un producto de aproximadamente 350 pares de bases. Se utilizó una alícuota de 1 \mul del producto de PCR en una reacción de ligamiento con el vector PCR 2.1 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) a 14ºC durante la noche. Entonces se transformaron células OneShot^{TM} (Invitrogen Corporation) con el producto de ligamiento y se transfirieron a placas de LB-agar que contenían ampicilina. Tras el crecimiento durante la noche, fueron visibles colonias azules y blancas representando células que contenían plásmido sin un inserto (azul) y plásmidos con un inserto que perturbaban el gen de la beta-galactosidasa (colonias blancas). Se recogieron 10 colonias blancas y 2 colonias azules para la amplificación en cultivo líquido en crecimiento durante la noche a \sim 30ºC. Se conservaron alícuotas de cada cultivo mediante almacenamiento en glicerol a -70ºC. Se estimó el tamaño del plásmido visualmente mediante tinción con bromuro de etidio y comparación con respecto a los marcadores de peso molecular. Se prepararon minipreparaciones de ADN y se secuenciaron por el laboratorio de ADN de SRRC utilizando cebadores basados en secuencias en el vector del plásmido que flanquea el sitio de inserción de clonación múltiple.

El análisis de la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína, expuesta en SEQ ID NO: 2, codificada por el ADNc clonado mediante PCR expuesto en SEQ ID NO: 1, confirmó la identidad de la trombostasina; es decir el ADNc codifica para una proteína de \sim 9 KDa e incluye todos los aminoácidos revelados por la secuenciación N-terminal, incluso aunque sólo una parte de esa información se utilizara en la síntesis de cebadores degenerados que permitan la amplificación por la PCR. El veintiún por ciento de la supuesta proteína está compuesto por residuos de ácido aspártico y glutámico. Esta información también confirmó que el ADNc que codifica para la trombostasina activa está contenido en la biblioteca de ADNc de H. irritans. Una búsqueda de bases de datos de proteínas en GenBank no reveló secuencias similares.

Preparación de una sonda de trombostasina marcada con digoxigenina

Se utilizó el fragmento de ADNc de trombostasina clonado por PCR descrito anteriormente para producir una sonda marcada con digoxigenina para examinar la biblioteca de ADNc de H. irritans en condiciones muy rigurosas. Se sintetizó un cebador marcado con digoxigenina mediante PCR utilizando el fragmento de trombostasina clonado como molde y el sistema Genius^{TM} (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) en una razón de 1 : 5 de digoxigenina-11-dUTP con respecto a dTTP. Se purificó el ADN marcado con digoxigenina mediante electroforesis en gel de azarosa. Se estimó el rendimiento de la sonda marcada mediante titulación y comparación visual con respecto a ADN control marcado con DIG suministrado en el kit Genius.

Clonación y secunciación de un ADNc de longitud completa

Se tranfectaron células XL1-blue con 50.000 unidades formadoras de placas (ufp) a partir de la biblioteca amplificada y se cultivaron en placa sobre una placa NZY de 150 mm. Tras la incubación durante la noche, se enfrió la placa durante 2 h a + 4ºC antes de que se prepararan las hibridaciones en placa por duplicado con membranas de nylon y se trataron con sonda con el fragmento de ADN marcado con digoxigenina, En resumen, se desnaturalizó el ADN "hibridado" durante 5 min a TA, se secó durante 5 min., se neutralizó 5 min. y se reticulizó en un Stratalinker 1800 (Stratagene, LaJolla, CA) en un ciclo de reticulación automática; la prehibridación y la hibridación fueron en 5\times SSC, el 0,1% de N-lauroilsarcosina, el 0,02% de SDS, el 2% de reactivo de bloqueo y el 50% de formamida en 65ºC; se lavaron las membranas 4 veces antes de la visualización de la trombostasina-DIG hibridada mediante incubación con anti-digoxigenina conjugada a fosfatasa alcalina seguida de sustrato que produce un producto coloreado azul. Se subclonaron varias recogidas de placas de la primera selección para confirmar clones positivos en una selección secundaria. Se extrajo fago de las recogidas de placas en tampón SM y se amplificó mediante crecimiento en células XL1-Blue MRF sobre placas NZY tal como se describió anteriormente. Se aisló ADN en minipreparaciones de colonias bacterianas hechas crecer durante la noche. Se probaron clones positivos mediante amplificación por PCR con cebadores internos inversos y directos específicos de trombostasina que se sintetizaron basados en la secuencia del fragmento de PCR clonado. Se probaron además los clones positivos mediante un ensayo de placas adicional y mostraron ser puros mediante hibridación de todas las colonias con la sonda marcada/DIG.

Se obtuvieron fagémidos que contenían insertos clonados por escisión automática utilizando el sistema ExAssist/XLOLR y el protocolo de Stratagene. Se hicieron crecer colonias sobre placas de LB-kanamicina y se prepararon bloques de glicerol para su almacenamiento a -70ºC. Se recogieron colonias similares para amplificación mediante crecimiento durante la noche. Se extrajo ADN en minipreparaciones y se analizaron mediante secuenciación de ciclo automático (SRRC) en la dirección directa utilizando cebadores T3 y trombostasina-F1 y en la dirección inversa utilizando cebadores T7 y trombostasina-R1, y con cebadores directos e inversos para secuencias internas a los extremos terminales. Se obtuvieron y se secuenciaron varios clones de ADNc. Las secuencias de nucleótidos para un ADNc parcial designado como TB8 están expuestas en SEQ ID NO: 4, y la secuencia de aminoácidos codificada por ellas está expuesta en SEQ ID NO: 5. Se observa que los residuos de aminoácidos 88 -168 expuestos en SEQ ID NO: 5 codificados por los nucleótidos 263 - 505 expuestos en SEQ ID NO: 4 corresponden a la trombostasina activa.

Se utilizó el Wisconsin Package^{TM} del Genetics Computer Group (GCG, Madison WI) para analizar las secuencias de ácido nucleico y de la supuesta proteína de ADNc de trombostasina.

Para obtener la secuencia de ADNc de longitud completa, se empleó un procedimiento 5' RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc), utilizando ARNm de glándulas salivales y cebadores internos que tienen una secuencia consenso en 3' correspondiente a los clones de ADNc descritos anteriormente. Se compilaron secuencias solapantes para determinar una secuencia de ADNc de longitud completa compuesta. El clon TB8 de ADNc descrito anteriormente se utilizó para construir un ADNc de longitud completa que codifica para trombostasina, adaptando el clon para contener los nucleótidos del extremo 5' determinados a partir del procedimiento 5' RACE. Las secuencias de nucleótidos para el ADNc de longitud completa están expuestas en SEQ ID NO: 6 y las secuencias de aminoácidos codificadas por ellas están expuestas en SEQ ID NO: 7. Se observa que los residuos de aminoácidos 95 -175 expuestos en SEQ ID NO: 7 codificados por los nucleótidos 283 - 525 expuestos en SEQ ID NO: 6 corresponden a la trombostasina activa.

Producción de una proteína de trombostasina recombinante (r-trombostasina)

Se digirieron el ADN de plásmido de trombostasina y el vector de transferencia pBacPAK8 (CLONTECH, Palo Alto, CA) con 2 enzimas de restricción que cortan en los sitios de clonación múltiple del plásmido pero no las secuencias internas de trombostasina. La trombostasina escindida y pBacPAK8 linealizado se purificaron mediante electroforesis en gel de TAE. Se escindieron las bandas digeridas y se extrajo el ADN con el kit de preparación de bandas "Sephaglas" (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Se estableció una reacción de ligamiento (vector:inserto) 1:2 para que discurriera durante la noche a 15ºC. Se transformaron células OneShot^{TM} con el plásmido BacPAK8 que contiene el inserto de trombostasina descrito para el fragmento de PCR. Las células transformadas se hicieron crecer durante la noche en placas de LB-ampicilina. Se seleccionaron varias colonias para el líquido, se hicieron crecer durante la noche a 37ºC. Se prepararon reservas en glicerol y se congelaron a -70ºC y se prepararon preparaciones rápidas de plásmido para la evaluación del tamaño mediante visualización en gel de agarosa. Se preparó ADN de la minipreparación mediante purificación en columna (Qiagen Corp., Santa Clarita, CA) para la secuenciación del ADN utilizando el cebador Bac 2 (CLONTECH).

Se generó un baculovirus recombinante que contenía el inserto de trombostasina mediante cotransfección de células Sf9 con ADN viral BacPAK6 digerido con BSu36I y Tb8/3 de plásmido de trombostasina / BacPAK8 utilizando Lipofectin^{TM} (Life Technologies, Grand Island, NY) como reactivo de transfección y medio libre de suero High Five^{TM} (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los controles incluyeron virus de tipo natural (control positivo) y ADN de plásmido sólo (control negativo). Las células se incubaron con medio de transfección durante 5 h a temperatura ambiente antes de añadir medio TNM-FH que contenía un 10% de suero bovino fetal (TNM-FH/FBS) y se incubaron además a 27ºC durante 72 h. Se recogió el sobrenadante del cultivo celular que contenía el virus y se almacenó a 4ºC. Se realizó un ensayo de placas para aislar los clones de virus-trombostasina puros a partir del sobrenadante celular. Se infectaron placas de treinta y cinco mm que contenían 1,5 X 10^{6} células Sf9 cada una por duplicado con 100 \mul de sobrenadante o una dilución de hasta 10^{-3} en un volumen de 100 \mul de medio TNM-FH/FBS. Tras asentar durante 1 h a temperatura ambiente, se eliminó el medio de infección y se recubrieron las células con 3,5 ml cada una de medio de Grace (Life Technologies, Grand Island, NY) que contenía un 10% de FBS, gentamicina 50 \mug/ml y un 1% de agarosa. Se incubaron las células en una caja de almacenamiento de plástico con toallitas de papel húmedas a 27ºC. Tras 5 días, se añadió un segundo recubrimiento que también incluía colorante rojo neutro 0,16 mg/ml y XgaI 250 \mug/ml. Tras formar el recubrimiento de agarosa un gel, se invirtieron las placas y se incubaron durante 48 h a temperatura ambiente. Se recogieron placas transparentes, positivas y el virus eluyó mediante incubación durante la noche en medio TNM-FH. Se infectaron células Sf9 con el virus eluido y se incubaron durante 4 días a 27ºC para generar el virus de pase 1.

Se recogieron las células en solución salina tamponada con fosfato (10 mM, pH 7,4) y se extrajo el ADN utilizando el kit de microextracción de ADN y el protocolo II de Stratagene en el manual de instrucciones. El ADN extraído se utilizó como molde para PCR con un par de cebadores directo e inverso de trombostasina y el par de cebadores Bac 1 /
Bac 2 (CLONTECH). La amplificación con ambos pares de cebadores garantizó que se produjera el acontecimiento de transformación correcto. Se realizó un segundo ensayo de placas para garantizar la pureza de los clones, y para determinar el título del virus.

Caracterización de la producción de r-trombostasina

Se infectaron células Sf9 con virus (multiplicidad de infección = 2) y se incubaron a 27ºC hasta que se recogieron los medios a las 12, 24, 48, 72 y 96 h. Se concentró el virus y se retiró de los medios mediante centrifugación en concentradores Centriplus^{TM} 100 (Amicon, Beverly, MA) a 3.000 x g durante 2 h a temperatura ambiente. Se estimó la proteína total en la fracción < 100 KDa mediante el ensayo de Lowry modificado (Sigma Chemical, St. Louis, MO).

Se probaron la actividad anticoagulante y/o antitrombina de r-trombostasina utilizando el ensayo del sustrato cromogénico S238 tal como se describió anteriormente.

Purificación de r-trombostasina mediante RP/HPLC

Se concentraron los componentes de gran peso molecular (\geq 10 KDa) en el sobrenadante de cultivo células libre de virus mediante centrifugación a 3.000 x g durante 4 h en concentradores Centriplus^{TM} 10. Se utiliza RP/HPLC que utiliza una columna de macroesferas C18 y elución con un gradiente de acetonitrilo para el aislamiento de r-trombostasina a partir de otros componentes del medio tal como se describió anteriormente.

Propiedades inmunogénicas de trombostasina en un modelo de animales de laboratorio (conejos) como la primera etapa hacia la producción de una vacuna de ácido nucleico (ADN) frente a la mosca de los cuernos que se alimenta con sangre.

Las proteínas antihemostáticas en la saliva de los insectos que se alimentan con sangre no son altamente inmunogénicas (véase Cupp y Cupp (1997) J. Med. Entomol. 34:87-94). Esta observación experimental coincide con el concepto intuitivo de que la generación de una respuesta inmunitaria, especialmente la producción de anticuerpos neutralizantes, podría prevenir o disminuir la alimentación con sangre y la producción de progenie y buen estado físico. Por tanto, es importante desarrollar métodos para provocar una respuesta inmunitaria robusta ante tales moléculas. Además, la inmunización eficaz de ganado en el campo también requiere una vacuna práctica que necesita un mínimo de manejo y almacenamiento. En los últimos años, la inmunización con ácidos nucleicos ha demostrado generar fuertes respuestas inmunitarias frente a proteínas codificadas que pueden dirigirse a compartimentos inmunitarios específicos mediante la localización y/o cantidad de ácido nucleico administrado. Tales vacunas, compuestas por plásmidos con el ADN de interés insertado, pueden producirse a bajo coste y mediante técnicas relativamente sencillas de cultivo bacteriano: son estables al almacenamiento a temperatura ambiente y evitan así muchos de los problemas de las vacunas basadas en proteínas. Por tanto, inicialmente, la inmunización de los conejos se prueba con ácido nucleico de trombostasina.

Se construye un plásmido de vacuna que contiene el promotor CMV y resistencia a kanamicina para la selección. Se utilizan los procedimientos de digestión por restricción y nuevo ligamiento del vector de transferencia de baculovirus según se describieron anteriormente para producir el plásmido de vacuna que contiene la trombostasina (TS-Vac).

Se obtiene suero, que sirve como control de preinmunización, de muestras de sangre tomadas de cada conejo a través de la gran vena de la oreja. Se inyecta a nueve conejos por vía intradérmica uno de tres plásmidos TS-Vac en PBS (500 \mug de plásmido sin inserto = control; 200 \mug, o 500 \mug de TS-Vac = plásmidos de prueba). Se toma una muestra de sangre después de aproximadamente 4 semanas y se probaron para determinar la respuesta humoral (la presencia de título de anticuerpos específicos) y celular (respuesta blastogénica) frente a trombostasina. Se monitorizaron estos parámetros de manera semanal posteriormente hasta 20 semanas tras la inyección. Todos los ensayos inmunológicos utilizados son habituales y se han utilizado en trabajo publicado previamente sobre la respuesta inmunitaria a los factores de la saliva de insectos que se alimentan con sangre (Cross et al. (1993) J. Med. Entomol. 30:725-734; Cross et al. (1993) J. Med. Entomol. 30:928-935).

Se determina el título de anticuerpos mediante un ensayo ELISA directo (Cross et al. (1993) J. Med. Entomol. 30:725-734; Cross et al. (1993) J. Med. Entomol. 30:928-935). Brevemente, se recubren placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos con r-trombostasina, o proteína no específica, luego se bloquean con albúmina de suero bovino (BSA) al 1% en PBS. Se incuban los pocillos con sueros preinmunitarios o sueros de prueba, luego se lavan con PBS-Tween antes de la adición de IgG anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma Immunochemicals,
St. Louis, MO) o IgM anti-conejo (Southern Biotechnology Assoc. Inc., Birmingham, AL). Tras la reacción del sustrato con fosfato de p-nitrofenilo (pNPP), se lee la intensidad del color a 405 nm utilizando un lector de placas de microtitulación Spectramax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se calcula el titulo de anticuerpos y se compara entre tratamientos para determinar la cantidad óptima de inmunógeno para la generación de anticuerpos.

Se evalúan los anticuerpos para determinar la especificidad por trombostasina mediante inmunotransferencia puntual (Cross et al. (1993) J. Med. Entomol. 30:725-734) utilizando r-trombostasina. Se siembra en puntos r-trombostasina, o control de albúmina de suero bovino (BSA) en pocillos de placas de microtitulación de fondo de nitrocelulosa de 96 pocillos (Millipore, Marlborough, MA). Se utiliza leche desnatada (3%) en PBS como una solución de bloqueo. Se añaden los sueros de prueba y se incuban durante 1 h antes del lavado y la reacción del sustrato. La especificidad de la reacción se determina mediante inspección visual.

Se prueba la respuesta celular a la trombostasina utilizando células mononucleares de sangre periféricas (PBM) aisladas mediante centrifugación con Ficoll-Paque de sangre recogida en EDTA como anticoagulante (Ramachandra & Wickel (1992) J. Med. Entomol. 29:818-826). Se determina la viabilidad de las células aisladas en una alícuota utilizando diacetato de fluoresceína (FDA; Sigma, St. Louis, MO) que marca brillantemente las células sanas. Se añaden PBM a 5 x 10^{5} células/pocillo de una placa de microtitulación antes de la adición de r-trombostasina, saliva de mosca de los cuernos o proteína no específica. Se añade el mitógeno ConA y se continúa la incubación durante 72 h. S determina la respuesta celular a la proteína de prueba utilizando el ensayo de colorimetría de MTT (Denizot y Land (1986) J. Immunol. Methods. 89(2):271-277) que se lee en el Spectromax a 570 nm. Se determina la respuesta blastogénica a trombostasina mediante el aumento sobre el control. Puede monitorizarse la comparación de la respuesta en presencia de la saliva completa para los factores inmunomoduladores en la saliva.

Se le ocurrirán otras modificaciones y realizaciones de la invención a un experto en la técnica a la que pertenece esta invención, teniendo el beneficio de las enseñanzas presentadas en el presente documento. Por tanto, ha de entenderse que la invención no debe limitarse a las realizaciones específicas descritas. Aunque se emplean términos específicos, se utilizan en sentido genérico y descriptivo únicamente y no con fines de limitación, y esas modificaciones y realizaciones se pretende que estén incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

<110> Cupp, Eddie Wayne

\hskip1cm

Cupp, Mary Smith

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<120> NUCLEÓTIDOS Y PROTEÍNAS ANTITROMBINA DE LA MOSCA DE LOS CUERNOS

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<130> 5721-10

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<160> 7

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 370

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<212> ADN

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<213> Haematobia irritans

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<220>

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<221> CDS (secuencia codificante)

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<222> (1) … (243)

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 81

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<212> PRT

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<213> Haematobia irritans

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<400> 2

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2

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<210> 3

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<211> 30

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<212> PRT

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<213> Haematobia irritans

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<400> 3

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3

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<210> 4

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<211> 611

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<212> ADN

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<213> Haematobia irritans

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<220>

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<221> CDS

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<222> (2) … (505)

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<400> 4

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4

400

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<210> 5

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<211> 168

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<212> PRT

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<213> Haematobia irritans

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<400> 5

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5

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<210> 6

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<211> 631

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<212> ADN

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<213> Haematobia irritans

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1) … (525)

\newpage

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<400> 6

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6

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<210> 7

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<211> 175

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<212> PRT

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<213> Haematobia irritans

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<400> 7

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7

Claims (21)

1. Proteína purificada sustancialmente que tiene actividad antitrombina, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(a)

una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;

(b)

una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 40% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, y

(c)

un fragmento de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, en la que dicho fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de dicha secuencia.

2. Proteína según la reivindicación 1, parte (b), que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7.

3. Proteína según la reivindicación 2, que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en la secuencia SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7.

4. Proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha proteína se aísla de las glándulas salivales de una especie de Haematobia.

5. Proteína según la reivindicación 4, en la que dicha especie es H. irritans.

6. Proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha proteína se produce mediante métodos recombinantes.

7. Proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha proteína puede modular la respuesta inmunitaria.

8. Secuencia de nucleótidos aislada que codifica para una proteína que tiene actividad antitrombina, seleccionada de:

(a)

una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;

(b)

una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6;

(c)

una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 40% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;

(d)

una secuencia de nucleótidos que es idéntica en un 40% a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6;

(e)

una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15 residuos contiguos la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7; y

(f)

una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6 en condiciones rigurosas.

9. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 8, parte (c) o (d), que comprende:

(a)

una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7; o

(b)

una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 70% a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6.

10. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 9, que comprende:

(a)

una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7; o

(b)

una secuencia de nucleótidos que es idéntica en un 90% a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6.

11. Vector que comprende la secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

12. Célula huésped que comprende la secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

13. Preparación de anticuerpos que se une selectivamente a una proteína que tiene actividad antitrombina, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(a)

una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 40% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;

(b)

una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;

(c)

una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;

(d)

una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7; y

(e)

un fragmento de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, en el que dicho fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de dicha secuencia.

14. Composición farmacológica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un excipiente aceptable farmacéuticamente.

15. Vacuna veterinaria que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína según una de las reivindicaciones 1 a 3 o de la secuencia de nucleótidos según una de las reivindicaciones 8 a 10.

16. Proteína según una de las reivindicaciones 1 a 3 o una secuencia de nucleótidos según una de las reivindicaciones 8 a 10 para el uso en un método de tratamiento del cuerpo animal o humano.

17. Uso de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una secuencia de nucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en la fabricación de una vacuna para tratar o prevenir la hematofagia en animales de cría.

18. Uso según la reivindicación 17, en el que dichos animales de cría son ganado.

19. Uso de la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la fabricación de un medicamento para tratar la trombosis en un mamífero.

20. Uso según la reivindicación 19, en el que dicha proteína se produce mediante métodos recombinantes.

21. Método para producir una proteína que tiene actividad antitrombina, comprendiendo dicho método:

(a)

cultivar una célula procariota o eucariota que se transforma con una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en condiciones en las que se produce dicha proteína; y

(b)

aislar dicha proteína.