ES2237452T3 - Biomateriales de uso humano que contienen monocitos o macrofagos, procedimiento para su preparacion y sus aplicaciones. - Google Patents

Biomateriales de uso humano que contienen monocitos o macrofagos, procedimiento para su preparacion y sus aplicaciones.

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ES2237452T3 ES00960502T ES00960502T ES2237452T3 ES 2237452 T3 ES2237452 T3 ES 2237452T3 ES 00960502 T ES00960502 T ES 00960502T ES 00960502 T ES00960502 T ES 00960502T ES 2237452 T3 ES2237452 T3 ES 2237452T3
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Abstract

Biomaterial de uso humano que comprende un material compuesto biocompatible poroso personalizado e implantado con células derivadas de monocitos, y preferiblemente con macrófagos, estando dichas células derivadas de monocitos unidas de forma sustancialmente irreversible a dicho biomaterial, como un solo tipo de célula.

Description

Biomateriales de uso humano que contienen monocitos o macrófagos, procedimiento para su preparación y sus aplicaciones.
La invención se refiere a nuevos biomateriales de uso humano, a un procedimiento para su preparación y a sus aplicaciones.
La reparación de tejidos es necesaria después de fracturas óseas graves, pérdida de cartílago o fragilidad general durante el envejecimiento.
Las prótesis metálicas o incluso cerámicas artificiales no se integran muy bien en los tejidos del hospedante, y a menudo se requiere una sustitución con una nueva cirugía después de unos pocos años, un problema importante de minusvalía para ancianos.
Los injertos autólogos de huesos o tejido cartilaginoso son muy difíciles y costosos. Las nuevas tecnologías desarrollan matrices porosas implantadas como prótesis de andamiaje.
Estas matrices se pueden rellenar eventualmente con factores de crecimiento para la regeneración del tejido, o incluso con células madre de la médula ósea.
Sin embargo, la fijación de las células o de los factores en las matrices porosas con liberación muy prolongada y lenta de los factores de crecimiento es muy difícil de lograr, y se desconoce el cóctel y la concentración ideales de factores requeridos.
El objetivo de la presente invención es proporcionar un biomaterial bioactivo de uso humano homogéneo (por ejemplo, un material cerámico poroso) que se puede usar con el objeto de implantarlo, y que no presente los problemas de biocompatibilidad a largo plazo de la técnica anterior.
Otro objetivo de la invención es proporcionar un biomaterial bioactivo que permita el crecimiento de tejido (por ejemplo, de hueso y de cartílago) en su espacio poroso, y que asegure la integración del biomaterial injertado en los tejidos circundantes (huesos viables, etc.).
Otro objetivo de la invención es proporcionar prótesis de larga duración, que eviten la necesidad de sustituir las prótesis de biomaterial después de 10 años, a menudo necesario hasta ahora.
Estos objetivos se alcanzan mediante la invención, que consiste en biomaterial de uso humano que comprende un material compuesto biocompatible poroso personalizado e implantado con células derivadas de monocitos, y preferiblemente con macrófagos.
La expresión "de uso humano" significa que el biomaterial poroso ha sido colonizado con células humanas derivadas de monocitos de la sangre.
La expresión "material compuesto biocompatible" designa a un material compuesto de uno o varios de los siguientes materiales que han demostrado ser no tóxicos para los tejidos humanos (microfibras de carbono, materiales cerámicos, fosfatos de calcio, óxidos metálicos, polímeros de colágeno, etc.).
La expresión "poroso" significa que el biomaterial, y preferiblemente el material cerámico, presenta poros de alrededor de 100 hasta 2000 micrómetros de diámetro.
La expresión "material personalizado e implantado" significa que la forma y el tamaño del biomaterial se diseña específicamente para un paciente y para un sitio de implantación.
La expresión "células derivadas de monocitos" corresponde a células mononucleares humanas aisladas de la sangre, enriquecidas en monocitos y cultivadas a 37ºC en un medio apropiado, durante 5 a 10 días, para obtener macrófagos de tipo tisular.
Las células derivadas de monocitos, utilizadas en la invención, son por ejemplo las descritas en los documentos PCT/EP 93/01232, WO 99/13054, EP 96/901848.0-2107, WO 97/44441.
En una realización particular de la invención, las células derivadas de monocitos descritas anteriormente contienen compuestos exógenos, tales como fármacos, proteínas, factores de crecimiento, de interés.
En otra realización, las células derivadas de monocitos según se describen anteriormente contienen, en su citoplasma, ADN exógeno que codifica una proteína de interés.
La humanización sustancialmente irreversible de matrices de material compuesto biocompatible descrito en la presente invención permite una interacción fisiológica entre las prótesis fabricadas del material compuesto biomédico injertado y las células hospedantes en el cuerpo. Estas relaciones con células de tejidos del hospedante y con la matriz extracelular permiten la reconstrucción de láminas epiteliales y el crecimiento de una red capilar alrededor del biomaterial injertado, mediante la multiplicación local y el crecimiento rápido de células endoteliales.
Las células derivadas de monocitos, en particular los macrófagos utilizados para humanizar in vitro el material poroso en la invención, son particularmente adecuadas para aumentar la integración y la duración in vivo de las prótesis biocompatibles.
Ventajosamente, el biomaterial de uso humano de la invención es homogéneo.
Según una realización ventajosa, en el biomaterial de uso humano de la invención, el material compuesto biocompatible se selecciona de entre los siguientes materiales: microfibras, materiales cerámicos, óxidos metálicos tales como óxido de aluminio, material cerámico de fosfato de calcio, fibras de vidrio o de carbono, hidroxilapatita, carburo o nitruro de silicio, polímeros de colágeno, o una mezcla de estos materiales diferentes.
Según otra realización ventajosa, en el biomaterial de uso humano de la invención, los macrófagos humanos son susceptibles de ser obtenidos mediante diferenciación ex vivo a partir de monocitos de la sangre, conduciendo a macrófagos vivos, y se cultivan en condiciones que permitan su penetración y adhesión en el biomaterial, por ejemplo durante varias horas a 37ºC, con el biomaterial poroso, permitiendo la infiltración del biomaterial y uniendo de forma sustancialmente irreversible los macrófagos vivos al biomaterial, ahora de uso humano con los macrófagos del paciente y listo para su implante.
La expresión "unión de forma sustancialmente irreversible" significa que los macrófagos se unen fuertemente mediante numerosos contactos con el material, y no se pueden despegar en condiciones fisiológicas.
La invención se refiere asimismo a un implante de soporte de un organismo vivo, caracterizado porque comprende o consiste en biomaterial de uso humano como se define anteriormente, y está estructurado preferiblemente en forma de un andamio, esponjas de soporte de tejidos, hueso o cartílago.
La expresión "implante de soporte de un organismo vivo" designa un implante que tiene, por ejemplo, la forma física y la robustez de un hueso a sustituir.
La expresión "andamio" designa una estructura física eventualmente metálica que mantiene al biomaterial (cerámico u otro) en la conformación apropiada.
La expresión "esponjas de soporte de tejidos" designa un implante blando formado, por ejemplo, de colágeno, que se humanizará con macrófagos antes de la inserción en el cuerpo.
La invención también se refiere a la utilización de un biomaterial de uso humano de la invención, o de un implante de soporte de un organismo vivo, de la invención, para la preparación de un implante de tejido destinado a sustituir o reparar al tejido defectuoso, tal como hueso defectuoso, cartílago, tejido dental, tejido fibroso, tejido de soporte fibrocartilaginoso.
La expresión "tejido fibroso" designa tejidos que rodean a órganos, de soporte de este órgano y mantienen la forma de esta parte del cuerpo: están formados principalmente por láminas epiteliales.
Según otra realización ventajosa, la invención se refiere a la utilización para la preparación de un medicamento de un biomaterial de uso humano de la invención o de un implante de la invención de soporte de un organismo vivo, en el que las células derivadas de monocitos o los macrófagos son autólogos con respecto al tejido a sustituir o reparar, permitiendo que el biomaterial o el implante de soporte del organismo vivo sea reconocido como propio.
La expresión "implante reconocido como propio" significa que contiene células (es decir, macrófagos) procedentes del paciente en el que se injertarán, y por lo tanto es autólogo para el hospedante.
Un procedimiento para la preparación de un biomaterial de uso humano de la invención comprende las etapas siguientes:
-
preparación del biomaterial poroso estructurado en forma de huesos, cartílago,
-
preparación de macrófagos a partir de monocitos de la sangre,
-
inmersión del biomaterial en una disolución fisiológica apropiada para el cultivo de macrófagos, que se añaden después (por ejemplo, disolución tamponada de fosfato, medio tal como RPMI, IMDM, AIMV),
-
adición del macrófago a la disolución, en condiciones que permitan la unión al biomaterial, y particularmente durante 1 a 20 h a 37ºC, 5% de CO_{2} y 95% de aire, y
-
lavado del biomaterial y la conservación hasta la utilización en medio fisiológico.
Un procedimiento para la preparación de un implante de soporte de un organismo vivo de la invención comprende las etapas siguientes:
-
preparación de un implante o andamio poroso personalizado compuesto de material biocompatible como se define anteriormente,
-
preparación de macrófagos a partir de monocitos de la sangre del paciente que necesite el implante personalizado de biomaterial, y
-
cocultivo de macrófagos y el implante en un medio adecuado en condiciones que permitan la penetración y la adhesión al biomaterial, en particular a 37ºC, 5% de CO_{2} en bolsas o recipientes hidrófobos hasta el injerto del implante.
La invención se refiere asimismo a la utilización para la preparación de un medicamento del biomaterial de uso humano o de un implante de soporte de un organismo vivo, que se puede implantar en un tejido, para el suministro in vitro o in vivo o ex vivo de factores seleccionados de entre el grupo de quimioquinas y/o monoquinas, y/o citoquinas y/o factores de crecimiento, siendo los factores liberados útiles para la atracción local de células requeridas para el crecimiento tisular (tales como osteoblastos, condrocitos, fibroblastos, células epiteliales, etc.) y/o para la neovascularización alrededor del biomaterial implantado, y/o para la liberación de factores de crecimiento que ayudan a la proliferación de células y/o al crecimiento de nuevos tejidos.
De hecho, los macrófagos mantienen la homeostasis tisular a través de la secreción de al menos 80 factores de crecimiento o monoquinas que controlan e inducen la proliferación de células mesenquimatosas (fibroblastos, etc.), endoteliales, condrocitos, osteoblastos, células epiteliales, etc. También segregan enzimas y mediadores que permiten el crecimiento y la renovación de las células y tejidos circundantes (véase la Tabla 1).
Los factores clave segregados por macrófagos que ayudan a la integración, regeneración y crecimiento tisular de células mesenquimatosas son: IGF1 y TGF, pero también PDGF, bFGF, MDGF, GM-CSF, NAF, IL-8, TNF, angiogenina y factores angiogénicos. Estos factores de crecimiento también permiten el desarrollo de todas las etapas requeridas para la angiogénesis, permitiendo la neovascularización y reconstitución de microcapilares sanguíneos alrededor del biomaterial injertado.
En este aspecto, los macrófagos sintetizan 10 veces más proteínas que monocitos, muchos más factores de crecimiento y menos mediadores inflamatorios.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
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1
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En una realización ventajosa de la invención, los macrófagos migran inicialmente al biomaterial poroso y se incorporan irreversiblemente en esta prótesis mediante adhesión muy fuerte y extensión. Cuando se mantienen en condiciones fisiológicas, los macrófagos son células que viven mucho, desde varios meses hasta varios años después de la implantación. Durante este tiempo, los macrófagos segregarán continuamente factores de crecimiento y citoquinas en su entorno local; estos factores actuarán sinérgicamente a concentraciones muy bajas (10^{-10} M) sobre las células y tejidos circundantes.
Además, los macrófagos presentan en sus membranas receptores para citoquinas, hormonas, azúcares, permitiendo que respondan a las necesidades micromedioambientales y que ajusten su secreción al estado local alrededor del biomaterial, a diferentes períodos después del injerto.
Los factores de crecimiento segregados por macrófagos representan los requisitos globales para la reparación tisular, la diferenciación y la angiogénesis local. Las quimioquinas que se liberarán continuamente en un gradiente de concentración alrededor del implante llamarán en la prótesis, y alrededor de ella, a las células requeridas para la recolonización e integración del biomaterial en el medioambiente del hospedante. Por lo tanto, los nuevos biomateriales porosos personalizados, colonizados con macrófagos del hospedante, presentan una nueva biotolerancia y una duración de rendimiento adecuado mucho mejor que la prótesis utilizada en ausencia de macrófagos autólogos. Las aplicaciones son múltiples en prótesis sólidas o cartilaginosas necesarias en la reparación ósea, particularmente la reparación cartilaginosa.
Según otra realización ventajosa, la invención se refiere a la utilización para la preparación de un medicamento del biomaterial de uso humano o de un implante de soporte de un organismo vivo, que se puede usar como un injerto para la sustitución de tejidos de soporte, tales como huesos, cartílagos, tejidos dentales, láminas epiteliales y matriz tisular subcutánea.
Ejemplo 1
Se colocó un material cerámico poroso de fosfato de calcio, con poros de 200 hasta 2000 micrómetros (porosidad > 20% y < 80%), sobre un soporte hidrófobo (etileno-acetato de vinilo), en presencia de 50 ml de medio de cultivo AIMV (life-cell Gibco, Paisley G.B.). A esta preparación se añaden los macrófagos a la concentración de 5 x 10^{6} células/ml; se obtienen después de la diferenciación durante 7 días de monocitos de la sangre en cultivo según el estado de la técnica publicado en las publicaciones y patentes (documentos PCT/EP 93/01232, WO 99/13054, EP 96/901848.0-2107, WO 97/44441); y se mantiene una preparación de control en ausencia de macrófagos. La preparación se incuba toda la noche a 37ºC, 5% de CO_{2}, 95% de aire, para permitir la fijación de los macrófagos sobre el material cerámico.
El material cerámico poroso se lava y se cultiva en presencia de fibroblastos y/o en presencia de condrocitos. En ambos casos, la proliferación celular es mayor en un factor de 2 a 10 para el material cerámico poroso colonizado con macrófagos, en comparación con el material cerámico del control.
Ejemplo 2
Se implanta un pequeño fragmento de material microcerámico poroso en la córnea de conejo. La pieza de microcerámica inerte induce una inflamación muy pequeña a moderada, y sólo el crecimiento periférico de nuevos vasos sanguíneos desde el anillo de la córnea.
Por el contrario, el material microcerámico cubierto con macrófagos, como se describe en el Ejemplo 1, induce una importante neovascularización alrededor del centro de la córnea. La córnea se vasculariza a través de una invasión de células endoteliales que surgen desde el borde rico en suministro de sangre y que crecen alrededor del biomaterial implantado.
Ejemplo 3
Se prepararon fragmentos de 100 +/- 20 mg de material cerámico de hidroxiapatita (Endobon®, Merck) y piezas de un cm^{2} de un andamio de polipropileno. Se suspendieron (2,5 x 10^{6} células/ml) macrófagos no activados recientes, obtenidos después de la diferenciación durante 7 días de monocitos de la sangre en cultivo según las solicitudes de patentes publicadas (WO 94/26875, WO 99/13054, WO 96/22781, WO 97/44441), en medio de cultivo IMDM (medio de Dulbecco modificado de Iscove). Cada fragmento de biomaterial se incubó en 1 ml de suspensión de macrófagos, en tubos estériles de polipropileno, durante 4 horas a temperatura ambiente. Para comprobar la unión de los macrófagos al biomaterial, se contaron las células presentes en el sobrenadante tras la incubación. Después de la incubación con Endobon®, en el sobrenadante había de 12 a 17% de las células añadidas (3 experimentos), indicando que más de 2 x 10^{6} macrófagos fueron adsorbidos en 100 mg de material cerámico poroso. Después de la incubación con el andamio de polipropileno, en el sobrenadante había de 23 a 55% de las células añadidas inicialmente, indicando una adsorción de 1 a 2 x 10^{6} macrófagos/cm^{2} de andamio.
Se implantó el biomaterial en ratones atímicos, y cada ratón recibió dos implantes del mismo tipo, uno en cada ijada.
3
Los ratones se sacrificaron después de 21 días. La observación macroscópica no muestra una diferencia importante entre implantes de biomaterial solo o implantes de biomaterial colonizado por macrófagos.
La observación microscópica de tejidos en parafina muestra que, cuando se comparan con los implantes de biomaterial solo, los implantes de biomaterial colonizado por macrófagos inducen primero un fenómeno de inflamación, que es una etapa importante para inducir la migración y alojamiento de células competentes para la reparación tisular. También se ha observado una neovascularización más importante en el sitio de implantación del biomaterial colonizado con macrófagos.
El análisis histológico de tejidos en resina confirma el aumento de la neovascularización para ratones implantados con biomateriales colonizados por macrófagos, cuando se compara con los ratones implantados sólo con el biomaterial.
Las aplicaciones terapéuticas para la reparación tisular se confirman en un ser humano que tiene úlceras que no se curan. Las úlceras cubiertas con un andamio implantado con macrófagos autólogos muestran una cicatrización mejorada, según se mide mediante la determinación y el tamaño de la úlcera.

Claims (10)

1. Biomaterial de uso humano que comprende un material compuesto biocompatible poroso personalizado e implantado con células derivadas de monocitos, y preferiblemente con macrófagos, estando dichas células derivadas de monocitos unidas de forma sustancialmente irreversible a dicho biomaterial, como un solo tipo de célula.
2. Biomaterial de uso humano según la reivindicación 1, en el que el material compuesto biocompatible se selecciona de entre los siguientes materiales: microfibras, materiales cerámicos, óxidos metálicos tales como óxido de aluminio, material cerámico de fosfato de calcio, fibras de vidrio o de carbono, hidroxilapatita, carburo o nitruro de silicio, polímeros de colágeno, o una mezcla de estos materiales diferentes.
3. Biomaterial de uso humano según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que los macrófagos humanos son susceptibles de ser obtenidos mediante diferenciación ex vivo a partir de monocitos de la sangre que conducen a macrófagos vivos, y se cultivan en condiciones que permitan su penetración y adhesión en el biomaterial, por ejemplo durante varias horas a 37ºC, con el biomaterial poroso, permitiendo la infiltración del biomaterial y uniendo de forma sustancialmente irreversible los macrófagos vivos al material, siendo de uso humano con los macrófagos del paciente y estando listo para el implante.
4. Implante de soporte de un organismo vivo, caracterizado porque comprende o consiste en biomaterial de uso humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y está estructurado preferiblemente en forma de un andamio, esponjas de soporte de tejido, hueso o cartílago.
5. Utilización de un biomaterial de uso humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o de un implante de soporte de un organismo vivo según la reivindicación 4, para la preparación de un implante tisular destinado a sustituir o reparar tejido defectuoso, tal como hueso defectuoso, cartílago, tejido dental, tejido fibroso, tejido de soporte fibrocartilaginoso.
6. Utilización de un material de uso humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o de un implante de soporte de un organismo vivo según la reivindicación 4, en el que las células o macrófagos derivados de monocitos son autólogos con respecto al tejido a sustituir o a reparar, permitiendo que el biomaterial o el implante de soporte de un organismo vivo sea reconocido como propio.
7. Procedimiento para la preparación de un biomaterial de uso humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende las etapas siguientes:
-
preparar el biomaterial poroso estructurado en forma de huesos, cartílago,
-
preparar macrófagos a partir de monocitos de la sangre,
-
sumergir el biomaterial en una disolución fisiológica apropiada para el cultivo de macrófagos que se añaden después (por ejemplo: disolución tamponada de fosfato, medio tal como RPMI, IMDM, AIMV),
-
añadir los macrófagos a la disolución en condiciones que permitan la unión al biomaterial, y particularmente durante 1 a 20 h a 37ºC, 5% de CO_{2} y 5% de aire, y
-
lavar el biomaterial y conservarlo en medio fisiológico hasta su utilización.
8. Procedimiento para la preparación de un implante de soporte de un organismo vivo, que comprende las etapas siguientes:
-
preparar un implante o andamio poroso personalizado, compuesto de material biocompatible, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,
-
preparar macrófagos a partir de monocitos de la sangre del paciente que necesite el implante personalizado de biomaterial, y
-
cocultivar macrófagos y el implante en medio adecuado en condiciones que permitan la penetración y la adhesión al biomaterial, en particular a 37ºC, 5% de CO_{2}, en bolsas o recipientes hidrófobos hasta injertar el implante.
9. Utilización de biomaterial de uso humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o de un implante de soporte de un organismo vivo según la reivindicación 4, para la preparación de un implante, siendo dicho implante capaz de ser implantado en un tejido, para el suministro in vitro o in vivo o ex vivo de factores seleccionados de entre el grupo de quimioquinas y/o monoquinas, y/o citoquinas y/o factores de crecimiento, siendo los factores liberados útiles para la atracción local de células requeridas para el crecimiento tisular (tales como osteoblastos, condrocitos, fibroblastos, células epiteliales, etc.) y/o para la neovascularización alrededor del biomaterial implantado, y/o para la liberación de factores de crecimiento que ayudan a la proliferación de células y/o al crecimiento de nuevos tejidos.
10. Utilización de biomaterial de uso humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o de un implante de soporte de un organismo vivo según la reivindicación 4, para la preparación de un injerto, siendo dicho injerto susceptible de ser utilizado para la sustitución de tejidos de soporte tales como huesos, cartílagos, tejidos dentales, láminas epiteliales y matriz tisular subcutánea.
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