ES2238690T3 - Muteina il-6. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA MUTEINA IL 6, UNA SECUENCIA DE DNA QUE LA CODIFICA, SU USO EN TERAPIA ASI COMO UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE LA INCLUYE. SE TRATA DE UN POTENTE ANTAGONISTA DE LA IL - 6, Y PUEDE UTILIZARSE VENTAJOSAMENTE COMO MEDICAMENTO, EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES EN LAS QUE LA IL 6 TIENE UNA ACCION PATOGENA COMO, POR EJEMPLO, EL PLASMOCITOMA/MIELOMA, LA OSTEOPOROSIS Y LAS ENFERMEDADES NEOPLASICAS Y DEL SISTEMA AUTOINMUNE.

Description

Muteína IL-6.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una nueva muteína IL-6, una secuencia de ADN codificante para ella, su uso terapéutico así como a una composición farmacéutica que la contenga.

Antecedentes de la invención

La interleuquina-6 es segregada en el plasma por diferentes tipos de célula en respuesta a agresiones o infecciones. Está implicada en un espectro de actividades tales como defensa inmune, hematopoyesis, maduración de megacariocitos, producción de plaquetas y respuesta de fase aguda (1).

Además de jugar un papel importante en la defensa del hospedador, la IL-6 está implicada en la patogénesis de una variedad de enfermedades tales como plasmocitoma/mieloma, osteoporosis y enfermedades neoplásicas y autoinmunes (1).

El complejo receptor de la IL-6 en las células diana consiste en dos subunidades diferentes, una subunidad (IL-6Ra) enlazante con un ligando específico de 80-kDa y una proteína (gp130) transductora de señal de 130-kDa (2-4). La IL-6 se une a la IL-6Ra y el complejo de IL-6/IL-6Ra resulta adecuado para asociarse con un dímero de la gp130, iniciando consecuentemente la señal de la IL-6. La IL-6 por sí misma no tiene una afinidad mensurable hacia la gp130 (5,6).

La interleuquina-6 es una proteína caracterizada por heterogeneidad N-terminal. Se ha descrito (7) como una proteína de 184 aminoácidos (la enumeración de estos aminoácidos se hará más adelante en esta solicitud de patente). Las predicciones sobre la estructura secundaria y el modelo de proteína apuntan a que la IL-6 es un miembro de la familia de citoquinas hematopoyéticas caracterizada por cuatro \alpha-hélices antiparalelas (A, B, C y D) (8,9). El LIF (factor inhibidor de leucemia), el CNTF (factor neurotrófico ciliar), la IL-11, la CT-1 (cardiotrofina-1) y la OSM (oncostatina M) también pertenecen a esta familia. Todos utilizan la proteína gp130 en sus complejos receptores, lo que explica el solapamiento de sus bioactividades (1, 10, 11).

Estudios de deleción de la IL-6 muestran que 28 residuos aminoácidos N-terminales son prescindibles para la actividad biológica de esta molécula. La eliminación de más de 28 aminoácidos inactiva la proteína (12). Estudios adicionales predicen que el C-terminal y el extremo del bucle A-B/al comienzo de la hélice-B (región 2c, residuos G77-E95) están implicados en la interacción con el IL-6R\alpha (9, 13-16). Estos resultados se corroboraron por el modelo (9) de la IL-6 humana recientemente publicado donde estas dos regiones estaban muy próximas.

En la actualidad, están identificados dos puntos de interacción de la IL-6 con la gp130.

i. La cartografía de epítopos de la proteína IL-6 con mAbs neutralizantes proporcionó la evidencia de que los residuos Q152-T162 (al comienzo de la hélice-D) están implicados en interacciones con la gp130 (17, 18). Análisis con proteínas quimera IL-6 humanas/ratón revelaron la presencia de un epítopo en el comienzo del bucle A-B de la IL-6 que estaban implicados en contactar y activar la gp130 (9, 19). Recientemente, este resultado se confirmó al demostrar que la leucina 57 está involucrada en esta interacción (20). Esta región está muy próxima al comienzo de la hélice D lo que conduce a la conjetura de que estas dos regiones juntas forman un sitio de interacción común con una gp130 (9, 19, 21).

ii. Se definió un segundo sitio de interacción con la gp130 en analogía con el complejo GH(hormona del crecimien-
to)/GHR_{2},cuya estructura se resolvió por análisis de rayos-X(22). Se especuló, que las partes de la GH importantes para la interacción con el segundo GHR eran las mismas en la proteína IL-6 importantes para la interacción con una gp130(23, 24). Efectivamente, la sustitución de dos aminoácidos en la hélice-A(Y31D/G35F) y dos aminoácidos en la hélice-C(S118R/V121D) también conducen a una proteína mutante IL-6 con afinidad próxima a la normal hacia la IL-6Ra, pero sin bioactividad. Estos cuatro aminoácidos parecen ser importantes para la interacción con una segunda proteína gp130(24, 25).

A la vista de la implicación de la IL-6 previamente discutida en la patogénesis de algunas enfermedades, el desarrollo de inhibidores de la actividad de la IL-6 ha sido consecuentemente el objeto de activa investigación. Con este propósito, se han perseguido diferentes aproximaciones, incluyendo el uso de anticuerpos frente a la IL-6, la gp130 ó la gp80; el uso de gp130 soluble; o el uso de muteínas para la IL-6; o para el receptor de la IL-6.

Weiergräber et al.(FEBS Letters 379(1996)122-126) describen el uso de péptidos sintéticos inmovilizados en membranas de celulosa para la identificación de los sitios en la citoquina IL-6 implicados en el enlace con el receptor, y la identificación de una región en la parte extracelular del receptor de la IL-6 que es importante para la interacción con su ligando.

Ehlers et al. (The Journal of Biological Chemistry, Vol. 370, Nº14, págs. 8158-8163, 1995) describen la combinación de dos mutaciones de la IL-6 humana que afectan a la activación de la gp130 dando lugar a un potente antagonista del receptor de la interleuquina-6 en células de mieloma humanas que era inactivo en células de mieloma humana y además la actividad de la IL-6 silvestre estaba completamente inhibida en estas células.

De manera similar, el desarrollo de un antagonista del receptor de la IL-6 que inhibe el crecimiento de células de mieloma humano dependiente de la IL-6 fue descrito por Hon et al.(J. Exp. Med. Vol. 180, diciembre 1994, 2395-2400).

El solicitante ha investigado la posibilidad de sintetizar nuevas muteínas IL-6 que puedan actuar como antagonistas del receptor de la IL-6. Con este propósito, una aproximación científica a seguir es sintetizar muteínas que retuvieran la capacidad de unirse al IL-6R\alpha, pero que hubieran perdido la capacidad de enganchar a la gp130. En consecuencia, la molécula óptima debería ser una que no muestre actividad de la IL-6 pero presente una unión más fuerte con IL-6R\alpha que la IL-6 y que contenga tan pocas mutaciones como sea posible con respecto a la IL-6, con el fin de reducir los riesgos de antigenicidad.

Descripción de la invención

El solicitante ha encontrado recientemente que combinando mutaciones puntuales en la posición 54 con dos mutaciones F170L/S176R, que incrementan la afinidad hacia el IL-6Ra, y dos mutaciones Q159E/T162P, que disminuyen la interacción con la gp130 dependiente del IL-6Ra, se obtienen muteínas IL-6 humanas, que retienen la unión con el receptor pero fallan en la activación de la gp130. En particular, el objetivo principal de la presente invención es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. ID NO: 1, así como fragmentos suyos que comprenden las siguientes mutaciones con respecto a la secuencia de aminoácidos de la IL-6 humana que se produce de forma natural: Pro en la posición 54, Glu en la posición 159, Pro en la posición 162, Leu en la posición 170 y Arg la posición 176.

Esta molécula se ha comportado como una eficiente antagonista de la IL-6 en la línea celular XG-1 de mieloma dependiente de la IL-6 humana y presenta todas las ventajas descritas anteriormente.

Otro objetivo de la invención es una molécula de ADN que comprenda la secuencia codificante de ADN para el polipéptido de la SEC. ID NO: 1, así como sus variantes que resulten de la degeneración del código genético codificante de un polipéptido que tenga la misma actividad que el de la SEC. ID NO: 1.

Un objetivo adicional de la presente invención es un vector plásmido que contenga la secuencia de nucleótidos de la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de la proteína como un medicamento. En particular, se refiere al uso de la proteína de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades en las que la IL-6 tiene una acción patogénica, tales como, por ejemplo, plasmacitoma/mieloma, osteoporosis y enfermedades neo-plásicas y autoinmunes.

El medicamento se presenta preferiblemente en la forma de una composición farmacéutica que comprende la proteína de la invención junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y/o excipientes. Tal composición farmacéutica constituye además un aspecto adicional de la presente invención.

Un método para preparar la muteína de la invención es mediante la tecnología PCR usando como cebadores oligonucleótidos sintéticos, que contienen una incongruencia en la base que se quiere mutar.

La expresión de cualquiera de las proteínas recombinantes de la invención como se menciona en la presente memoria puede efectuarse en células eucariotas (es decir, levaduras, insectos o células de mamíferos) o células procariotas, usando los vectores de expresión apropiados. Puede utilizarse cualquier método conocido en la técnica.

Por ejemplo, la molécula de ADN codificante del polipéptido de la invención se inserta en vectores de expresión construidos apropiadamente por métodos bien conocidos en la técnica (véase Sambrook et al, 1989). Se inserta ADNc bicatenario en vectores plásmidos por prolongación homopolimérica o por inserciones de restricción que implican el uso de ADN enlazantes sintéticos o técnicas de unión de extremos romos: las ADN ligasas se utilizan para unir las moléculas de ADN y las uniones indeseables se evitan por tratamiento con fosfatasa alcalina.

Con el fin de ser capaz de expresar la proteína deseada, un vector de expresión debe comprender también secuencias de nucleótidos específicos que contengan información reguladora de la transcripción y traducción unidas al ADN codificante de la proteína deseada de tal forma que permita la expresión génica y la producción de la proteína. Primero, con el fin de que el gen sea transcrito, debe ir precedido de un promotor reconocible por la ARN polimerasa, al que se une la polimerasa y así se inicia el proceso de trancripción. Hay una variedad de tales promotores en uso, los cuales actúan con diferentes eficacias (promotores fuertes y débiles).

Para los hospedadores eucarióticos, se pueden emplear diferentes secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción, dependiendo de la naturaleza del hospedador. Pueden derivarse de fuentes víricas, tales como adenovirus, virus de papiloma bovino, virus de simios o similares, donde las señales reguladoras están asociadas con un gen particular que tiene un alto nivel de expresión. Ejemplos de ello son el promotor TK del virus Herpes, el promotor temprano SV40, el promotor del gen ga14 de levadura, etc. Pueden seleccionarse las señales reguladoras de la iniciación de la transcripción para que permita la represión y la activación, a fin de que la expresión de los genes pueda modularse.

La molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos codificante para el polipéptido de la invención se inserta en el(los) vector(es), que tienen la operatividad unida a las señales reguladoras de la transcripción y traducción, que es capaz de integrar las secuencias de genes deseadas en la célula hospedadora. Las células que han sido transformadas de forma estable por el ADN introducido pueden seleccionarse introduciendo también uno o más marcadores que permiten la selección de células hospedadoras que contienen el vector de expresión. El marcador también puede proporcionar fototrofismo a un hospedador auxotrópico, resistencia a los biocidas, es decir, a los antibióticos, o a los metales pesados como el cobre, o similares. El gen marcador seleccionable puede bien unirse directamente a la secuencia de genes del ADN a ser expresado, bien introducirse en la misma célula por co-transfección. También pueden necesitarse elementos adicionales para la síntesis óptima de las proteínas de la invención.

Los factores de importancia en la selección de un plásmido particular o vector viral incluyen: la facilidad con la que las células recipiente, que contienen el vector puedan tener una forma reconocida y seleccionada por aquellas células recipientes que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desea en un hospedador particular; y si es deseable que el vector actúe como "lanzadera" entre células hospedadoras de especies diferentes.

Una vez el(los) vector(es) o secuencia de ADN que contiene la construcción(es) está preparado para la expresión, el ADN construido(s) puede introducirse en una célula hospedadora apropiada por cualquiera de una variedad de medios adecuados: transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplasto, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa, etc.

Las células hospedadoras pueden ser tanto procarióticas como eucarióticas. Las preferidas son las hospedadoras eucarióticas, es decir, células de mamíferos tales como humanas, de mono, de ratón, y células de ovario de hamster chino(CHO), debido a que proporcionan modificaciones post-traducción a las moléculas de proteína, incluyendo plegamiento correcto o glicosilación en los sitios correctos. También las células de levaduras pueden llevar a cabo modificaciones post-traducción de péptidos incluyendo la glicosilación. Existen numerosas estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias de promotor fuerte y gran número de copias de plásmidos que pueden utilizarse para la producción de las proteínas deseadas en levaduras. Las levaduras reconocen las secuencias líderes en los productos de genes de mamífero clonados y segregan péptidos que tienen las secuencias líderes(es decir, pre-péptidos).

Después de la introducción del(los) vector(es), se dejan crecer las células hospedadoras en un medio selectivo, que se selecciona para el crecimiento de las células que contienen el vector. De la expresión de la(s) secuencia(s) de genes clonados resulta la producción de las proteínas deseadas.

La purificación de las proteínas recombinantes se lleva a cabo por uno de los métodos conocidos para este propósito, es decir cualquier procedimiento convencional incluyendo extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis, o similares. Un procedimiento de purificación adicional que puede usarse con preferencia para purificar la proteína de la invención es mediante cromatografía de afinidad usando anticuerpos monoclonales que fijan la proteína diana y que se han producido e inmovilizado en una matriz de gel contenida dentro de la columna. Las preparaciones impuras que contienen la proteína recombinante se pasan a través de la columna. La proteína quedará en la columna unida al anticuerpo específico mientras que las impurezas pasarán a través de ella. Después de lavar, la proteína se eluye del gel mediante un cambio de pH o fuerza iónica.

La invención se describirá a continuación por medio del siguiente Ejemplo, que ningún caso debe interpretarse como limitante de la presente invención. El Ejemplo se referirá a las figuras especificadas a continuación.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Mutaciones puntuales de la proteína IL-6 humana. (A) representación de la proteína IL-6 humana con las cuatro hélices-a predichas mostradas como cajas sombreadas. Los números indican los residuos primero y último predichos de las hélices-a. Se muestran las secuencias de aminoácidos de las regiones 2c y 2a con sus subdivisiones en las regiones 2a1 y 2a2 de la IL-6 humana(arriba) y murina(abajo). Se presentan las mutaciones puntuales producidas en la región 2a. (B)alineamiento de la IL-6 de distintas especies en la región 2a. (C) representación en lazo del modelo de IL-6 humana. Representación de F78(arriba) importante para la unión con la IL-6Ra y K54(arriba) importante para la interacción con la gp130 dependiente de la IL-6Ra. El N-terminal corresponde al residuo 17 de la IL-6 humana (Ehlers et al. 1994)

Figura 2. Secuencia de nucleótidos de la muteína IL-6 humana de la presente invención. Contiene cinco mutaciones puntuales con respecto a la IL-6 humana, en las posiciones 54, 159, 162, 170, 176. Tales posiciones se indican resaltadas.

Figura 3. Unión y bioactividad de las mutaciones puntuales K54 de la IL-6 humana. (A) unión de las muteínas IL-6 a la IL-6Ra soluble humana. Se muestran los valores medios de dos experimentos. (B) proliferación de células B9 murinas y (C) células XG-1 humanas en respuesta a las IL-6 mutantes. Se muestra una representación de tres experimentos. (D) inducción de la expresión de la haptoglobina en células de hepatoma humano por muteínas IL-6. La cantidad de IL-6 humana necesitada para el 50% de la expresión de haptoglobina se estableció como 100%. Se muestran valores medios de dos experimentos.

Figura 4. Unión y bioactividad de las mutaciones puntuales de K54 en combinación con EP-LR. (A) unión de las muteínas IL-6 a la IL-6Ra humana soluble. Se muestran valores medios de dos experimentos. (B) proliferación de células B9 murinas y (C) células XG-1 humanas en respuesta a las IL-6 mutantes. Se muestra una representación de tres experimentos. (D) inducción de la expresión de la haptoglobina en células de hepatoma humano por muteínas IL-6. Se muestra la cantidad de expresión de haptoglobina en presencia de 1 \mug/ml de mutante. Se muestran los valores medios de dos experimentos.

Figura 5. Efecto antagonístico de las mutaciones puntuales de K54 en combinación con EP-LR sobre la proliferación de células XG-1 inducida por la IL-6 humana. Las concentraciones indicadas de IL-6 mutantes se añadieron a las células XG-1 en presencia de 100 pg/ml de IL-6 humana y se midió la proliferación. Se muestran valores medios de cuatro experimentos.

Ejemplos Materiales y métodos Productos químicos

Las enzimas de restricción AccI, EcoNI, HindIII, NcoI, NheI, y XbaI se obtuvieron de AGS(Heidelberg, Alemania), la polinucleótido quinasa, la fosfatasa intestinal de ternero y la T4 ADN ligasa procedían de Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemania). Las enzimas de restricción BspEI y la ADN polimerasa Vent fueron adquiridas a NEN Biolabs (Schwalbach, Alemania) y los medios de cultivo celulares a Gibco (Eggenstein, Alemania). El reactivo Bolton-Hunter (74 TBq/mmol) y la etiqueta tran[^{35}S] se obtuvieron de Amersham International (Amersham, Reino Unido).

Los oligonucleótidos se obtuvieron de Pharmacia (Freiburg, Alemania).

El suero policlonal anti-haptoglobina humana de cabra y conejo se compraron a Sigma (Deisenhofen, Alemania) y el suero policlonal de burro anti-IgG de conejo conjugada con fosfatasa alcalina a Pierce (Rockford, EE.UU).

El ADNc para la IL-6 humana fué un obsequio de los Drs. T.Hirano y T. Kishimoto (Osaka, Japón).

El plásmido de expresión bacteriano pRSET 5d y la bacteria hospedadora BL21(DE3) fueron descritos por Schöpfer et al.(26). Después de reemplazar las secuencias de señal por un codón de iniciación de la traducción, el ADNc codificante para la IL-6 humana se clonó en el vector pRSET 5d usando los sitios de restricción NcoI y HindIII(27).

La línea celular XG-1 de mieloma humano fue generosamente aportada por el Dr. B. Klein (Nantes, Francia).

La proteína soluble IL-6Ra se expresó en E.coli, se renaturalizó y se purificó(28).

El antisuero monoespecífico policlonal dirigido contra la IL-6 humana se preparó inyectando una parte del dominio extracelular de la proteína IL-6Ra soluble en conejos(28).

Construcción de los vectores de expresión

Para introducir las mutaciones puntuales en el aminoácido 54 en la IL-6 humana (pRSET 5d-huIL-6-K54X), se fusionaron y unieron cuatro oligonucleótidos en el mutante 2a pRSET 5d digerido con EcoNI-NheI(9). Los oligonucleótidos fueron:

1

2

Para combinar las mutaciones puntuales del aminoácido 54 con dos mutaciones puntuales F170L/S176R(abreviadamente, LR) y las dos mutaciones puntuales Q159E/T162P(abreviadamente, EP), los vectores pRSET 6d-huIL-6-EP-K54X-LR se construyeron ligando fragmentos de ADNc procedentes de pRSET-5d-huIL-6-K54X con NcoI-XbaI en el vector pRSET 6d-huIL-6-Q159E/T162P-2a2-F170L/S176R(abreviadamente pRSET 6d-huIL-6-EP-2a2-LR)(19)digerido con NcoI-XbaI. La integridad de todas las construcciones se verificó mediante análisis de fragmentos de restricción y secuenciación de ADN(29).

Preparación de proteínas

Se transformaron las bacterias BL21(DE3) con los vectores de expresión pRSET apropiados. La expresión génica y replegado de proteínas solubilizadas a partir de los cuerpos de inclusión se llevó a cabo tal como está descrito en la bibliografía (27, 30, 31). Las proteínas replegadas se purificaron hasta >90% de homogeneidad. La pureza de las proteínas recombinantes se comprobó mediante SDS-PAGE 12,5% y tinción con plata.

Unión de la IL-6 a la IL-6Ra humana soluble

Las proteínas mutantes IL-6 purificadas se diluyeron en serie en PBS que contenía 0,02% TWEEN 20/2% BSA y se añadió 1 ng de ^{125}I-IL-6 humana(60.000-90.000 cpm/ng) y 1,7 ng de IL-6Ra humana soluble expresada en E.coli(28) hasta un volumen final de 500 \mul. Después de incubar toda una noche a 4ºC los complejos IL-6/sIL-6Ra se inmunoprecipitaron usando un antisuero IL-6Ra y proteína A Sefarosa, y se determinó la radioactividad por conteo-g.

Ensayos biológicos

Para los ensayos de proliferación de la B9 murina y la XG-1 humana, las proteínas mutantes IL-6 se diluyeron en serie a las concentraciones indicadas en las figuras. Los ensayos se realizaron tal como está descrito en la bibliografía (32,33). Una unidad B9 que correspondía aproximadamente a 1 pg de IL-6 humana por ml, condujo a la mitad de proliferación máxima de las células B9. Con células XG-1 humanas la mitad de proliferación máxima se obtuvo después de estimular con aproximadamente 50pg/ml de IL-6 humana. Para el ensayo de secreción de proteínas de fase aguda, se cultivaron células de hepatoma humano(Hep3B) en medio de Eagle modificado con el de Dubelcco (DMEM) con suero fetal bovino al 10%, se colocaron en placas de cultivo celular de 96 pocillos y se dejó alcanzar la confluencia. Las células se lavaron con PBS, se dejaron desnutrir durante 1 h en DMEM sin suero fetal bovino y seguidamente se trataron durante 20 h con 100 ml de DMEM exento de suero con cantidades crecientes de muteínas IL-6. La cantidad de haptoglobina secretada en el medio de cultivo se detectó mediante un ensayo de inmunosorbente unido a enzima(34).

Resultados El aminoácido K54 de la IL-6 está implicado en la interacción con la gp130 dependiente de la IL-6Ra

Estudios con proteínas quimera IL-6 humanas/murinas apuntan a que la región 2a2(residuos 50-55) de la proteína IL-6 es importante para la interacción con la gp130 dependiente de la IL-6-R (19)(Fig. 1A). El intercambio de estos residuos frente a los correspondientes aminoácidos murinos dan como resultado disminuir la unión a la gp130 y disminuir 30 veces la bioactividad en células XG-1 humanas. El alineamiento de diez especies IL-6 revela que dentro de la región 2a2 el K54 cargado positivamente se conserva en 8 especies pero se cambia en una asparagina ácida cargada negativamente en las secuencias murinas y de rata(35, 36)(Fig. 1B).

Por consiguiente se intercambió el K54(Fig. 1C) por los aminoácidos indicados en la Fig. 1A. El proceso de clonación produjo también tres mutaciones puntuales de la IL-6: C44F/K54E, C50F/K54N y S52R/K54N, que también fueron analizadas(Fig. 1A).

Para examinar la influencia de las mutaciones puntuales K54 en la interacción de la gp130 dependiente de la IL-6Ra, primero se midió la unión al IL-6Ra por desplazamiento de la unión de la ^{125}I-IL-6 humana hacia una forma soluble de la proteína IL-6Ra mediante un exceso de mutaciones puntuales. Como se muestra en la figura 3A la IL-6 silvestre humana sin etiquetar desplazó la unión de la ^{125}I-IL-6 humana al 50% cuando se usó de 10-20 veces de exceso molar. La mutación puntual K54P y el mutante doble S52R/K54N mostraron una afinidad 10 veces superior que la IL-6 humana, mientras que el mutante K54E tenía un afinidad 3 veces inferior que el huIL-6 hacia el IL-6Ra. Los otros mutantes examinados mostraron una afinidad similar a la de la IL-6 humana. De nuevo los mutantes estimularon la proliferación de células B9 murinas dependientes de la IL-6 en una extensión similar que la IL-6 humana, lo que demostró que sus estructuras estaban intactas (Fig. 3B).

Sobre células XG-1 de mieloma humano y sobre células de hepatoma humano el patrón de bioactividad de las muteínas IL-6 fué: K54P > S52R/K54N > huIL-6 = K54F > K54D > K54E > C50F/K54N > C44F/K54E. Así, los mutantes K54P y S52R/K54N que tenían la mayor afinidad hacia el IL-6Ra también mostraron la mayor bioactividad en células humanas. El intercambio de la lisina 54 cargada positivamente por la correspondiente asparagina ácida cargada negativamente sólo produjo una bioactividad ligeramente reducida en células humanas mientras que el intercambio con Glu dió como resultado una reducción sustancial (10 veces) de la bioactividad.

Diseño de nuevos antagonistas del receptor de la IL-6 humana

Recientemente, se ha demostrado que la introducción de residuos 50-55 de murina (región 2a2) y de dos mutaciones puntuales F170L/S176R (abreviadamente, LR) que incrementan la afinidad hacia el IL-6Ra, en el doble mutante Q159E/T162P(abreviadamente EP) que muestra disminuida la interacción con la gp130, da como resultado una muteína IL-6 con bioactividad no detectable en células humanas(19). La afinidad de esta Il-6 mutante (IL-6-EP-2a2-LR) hacia el Il-6Ra humano fué similar a la de la IL-6 humana. Esta IL-6 mutante fué un efectivo antagonista del receptor de la IL-6 en la línea celular XG-1 altamente sensible de mieloma humano dependiente de la IL-6.

Se introdujeron mutantes K54 en la IL-6-EP-LR mutante. A las proteínas mutantes resultantes IL-6 se les llamó IL-6-EP-K54X-LR en donde X designa todas las mutaciones introducidas en la posición 54 (Fig. 1A). La IL-6-EP-C44F/K54E-LR mutante y la IL-6-EP-K54-LR mutante mostraron una afinidad reducida hacia el IL-6Ra humano mientras que todos los demás mutantes se comportaron como la IL-6 humana (Fig. 4A). La proliferación de células B9 murinas fué fuertemente reducida por la IL-6-EP-2a2-LR mutante y la IL-6-EP-S52R/K54N-LR. Todas las demás mutantes fueron aproximadamente de 5-10 veces menos activas que la IL-6 humana (Fig. 4B). En contraste, la proliferación de células XG-1 de mieloma humano se redujo en aproximadamente tres órdenes de magnitud para las mutantes IL-6-EP-LR, IL-6-EP-K54F-LR y IL-6-EP-S52R/K54N-LR (Fig. 4C). Todas las demás mutantes no presentaron bioactividad detectable. Sobre las células Hep3B humanas sólo las mutantes IL-6-EP-LR y IL-6-EP-K54F-LR mostraron actividad residual (Fig. 4D).

Cuando se añadieron en cantides crecientes las mutantes sin bioactividad a células(XG-1) de mieloma humano que habían sido estimulada con 100 pg/ml de IL-6 humana, se observó una inhibición de la proliferación. La Fig. 5 muestra que la adición de las mutantes IL-6-EP-2a2-LR e IL-6-EP-K54P-LR conduce al 50% de inhibición de la proliferación hasta aproximadamente 100 ng/ml mientras que todas las demás mutantes fueron aproximadamente 5-10 veces menos efectivas.

DISCUSION El aminoácido K54 es parte de un epítopo de unión con la gp130

Todas las muteínas IL-6 con una sustitución de K54 por varios residuos aminoácidos se unen de manera eficaz al IL-6Ra humano. Curiosamente, la introducción de P54 y la mutación doble S52R/K54N dan como resultados proteínas IL-6 con mayor afinidad hacia el IL-6Ra humano. Dado que la región 2a2 que incluye el residuo 54 está implicado en las interacciones con la gp130(19), éste es lo más probablemente un efecto indirecto. Se especuló acerca de que la presencia de P54 o el aminoácido arginina cargado en la posición 52 conduce a una redisposición del bucle entre la hélice A y la hélice B cambiando consecuentemente la posición de la región 2C que está directamente implicada en la interacción con el IL-6Ra. La sustitución de la lisina 54 que se conserva en ocho especies por una asparigina ácida que se conserva en ratón y rata conduce a una bioactividad ligeramente reducida mientras que la sustitución por glutamina ácida conduce a una reducción sustancial (10 veces) de la bioactividad. Dado que la glutamina ácida tiene una cadena lateral que es por un grupo metileno más larga que la de la asparagina ácida, probablemente esto es porque la distancia entre el grupo cargado y el IL-6Ra humano es crítica. A partir de estos datos se puede hacer la hipótesis de que el K54 establece contacto con un residuo cargado negativamente de la gp130 humana y que la introducción de un aminoácido cargado negativamente en la posición 54 en la IL-6 humana conduce a un reducción del reconocimiento entre la gp130 y el complejo IL-6/IL-6Ra. La mutación de las cisteínas 44 ó 50 dieron como resultado muteínas IL-6 que sólo reducían ligeramente la bioactividad confirmando los resultados recientes de Rock et al.(34) quienes pudieron demostrar que las cisteínas 44 y 50 no daban como resultado muteínas IL-6 inactivas.

Interacción receptor ligando

La estructura del complejo hormona del crecimiento /receptor hormona del crecimiento humano (GH/GHR_{2}) está resuelta(22). Se han mutado extensivamente (38-40) los sitios de interacción entre la hormona del crecimiento y su receptor y se ha evaluado (41) la contribución de residuos aminoácidos simples a la energía de enlace. Dado que el complejo receptor hormona del crecimiento es hasta el momento el único par receptor-ligando de la familia de las citoquinas hematopoyéticas que se conoce hasta el nivel atómico ha servido de paradigma para otros miembros de esta familia. Para el complejo receptor hormona del crecimiento se ha demostrado que el epítopo de interacción en ambos, ligando y lado del receptor consiste en aproximadamente 30 residuos aminoácidos (41). La contribución de estos residuos aminoácidos, sin embargo, es desigual. La mayor parte de la energía de enlace es aportada por dos interacciones hidrofóbicas. Este centro enlazante está rodeado por residuos de contacto menos importantes que generalmente son hidrofílicos y están parcialmente hidratados, de los que sólo una tercera parte contribuye a la energía de enlace. Se ha postulado que un establecimiento como éste del sitio de unión es aplicable también a otras interacciones ligando-receptor(41).

Sin embargo, se cree que el K54 es uno de los residuos que rodean un área de interacción central IL-6/gp130 lo que por consiguiente contribuye en una pequeña extensión a la energía de enlace. El efecto relativamente fuerte de la sustitución del K54P en la muteína antagonista IL-6 se atribuye a los cambios estructurales en el bucle AB.

Antagonistas del receptor IL-6

Hasta el presente se han identificado dos regiones principales de la IL-6 que se cree se ponen en contacto con la gp130, (i) la región 2a2 (residuos 50-55) y la leucina 57 que están complementadas en la parte superior de la hélice D de la IL-6 y (ii) un epítopo que se forma con partes de la hélice A y la hélice C (9, 18-21, 23, 24). La unión de la IL-6 a la IL-6Ra requiere el extremo del bucle A-B(residuo 78) así como el C-terminal de la proteína (9, 13-16).

Está claro que son necesarias dos moléculas de la gp130 para la iniciación de la señal y es muy probable que el papel de los dos sitios de interacción con la gp130 en la IL-6 sea enlazar las dos proteínas gp130. Las alteraciones en ambas regiones de interacción con la gp130 conducen a moléculas que retienen su capacidad de unión con su receptor pero fallan en la iniciación de la señal. Se ha demostrado que tales moléculas pueden usarse como antagonistas del receptor de la IL-6(19, 21, 23, 24). El hecho de que simultáneamente mejoren las características de unión con el IL-6Ra de las mutéinas IL-6 ha llevado a denominarlas superantagonistas(19, 21, 24) sugiriendo que es posible cambiar las propiedades de unión a varias subunidades receptoras en una manera de algún modo independiente.

El nuevo antagonista del receptor IL-6 que se presenta en esta solicitud de patente contiene una única sustitución K54P en la región 2a2 y no obstante es tan efectiva como la muteína IL-6 recientemente establecida con 5 aminoácidos intercambiados en la región 2a2(19).

Curiosamente, la proteína mutante K54P mostró la unión con la IL-6Ra más fuerte que la IL-6 humana mientras que la combinación mutante con EP y LR presentó la unión con la IL-6Ra normal.

En lo que concierne al potencial terapéutico de los antagonistas del receptor de la citoquina está claro que contra menor sean los aminoácidos intercambiados más pequeño será el riesgo de que los antagonistas puedan ser antigénicos. A este respecto la muteína IL-6 IL-6-EP-K54P-LR es una avance en los antagonistas del receptor IL-6 disponibles hasta el momento.

Referencias

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18. Brakenhoff, J.P.J., J. Biol. Chem. 269:86, 1994.

19. Ehlers, M. et al., J. Biol. Chem. 270:8158, 1995.

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21. De Hon, F.D. et al., J. Exp. Med. 180:2395, 1994.

22. De Vos, A.M. et al., Science 255:306, 1992.

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24. Savino. R. et al., EMBO J. 13:5863, 1994.

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28. Stoyan, T., Eur. J. Biochem. 198:541, 1991.

29. Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463, 1977.

30. Studier, F.W. et al., Meth. Enzymol. 185:60, 1990.

31. Arcone, R. et al., Eur. J. Biochem. 198:541, 1991.

32. Aarden, L.A. et al., Eur. J. Immunol. 17:1411. 1987.

33. Zhang, X.G. et al., Blood 76:2599, 1990.

34. Salvati, A.L. et al., J. Biol. Chem. 270:12242, 1995.

35. Van Snick, J. et al., Eur. J. Immunol. 18:193, 1988.

36. Northemann, W. et al., J. Biol. Chem. 264:16072, 1989.

37. Rock, F.L. et al., Biochem. 33:5146, 1994.

38. Cunningham, B.C. et al., Science 244:1081, 1989.

39. Cunningham, B.C. et al., J. Mol. Biol. 234:554, 1993.

40. Bass, S.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:4498, 1991.

41. Clackson, T. et al., Science 267:383, 1995.

(1)INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 14 JOHN GORSIRAWEG

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: CURAÇAO

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PAÍS: ANTILLAS NEERLANDESAS

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): NINGUNO

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MUTEÍNA IL-6

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

SISTEMA INFORMÁTICO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC Compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIN Release #1.0, Versión #1.3(EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 212 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:1..184

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 1:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACATGTGTG AAAGCAGCGA TGAGGCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº: 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCGCCTC ATCGCTGCTT TCACAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACATGTGTG AAAGCAGCGA AGAGGCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD:26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº: 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCGCCTC TTCGCTGCTT TCACAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD:27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACATGTGTG AAAGCAGCTT TGAGGCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD:26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCGCCTC AAAGCTGCTT TCACAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD:27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACATGTGTG AAAGCAGCAA TGAGGCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD:26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº: 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCGCCTC ATTGCTGCTT TCACAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD:27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº: 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACATGTGTG AAAGCAGCCC CGAGGCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD:26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº:11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCGCCTC GGGGCTGCTT TCACAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD:23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº: 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAAGGAGAC ATGTAACAAG AGT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD:27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº: 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTTACTCT TGTTACATGT CTCCTTT

\hfill

Claims (8)

1. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Nº:1, así como sus fragmentos que comprenden las siguientes mutaciones con respecto a la secuencia de aminoácidos de la IL-6 humana que se produce de forma natural: Pro en la posición 54, Glu en la posición 159, Pro en la posición 162, Leu en la posición 170 y Arg en la posición 176.

2. Una molécula de ADN que comprende la secuencia codificante de ADN para el polipéptido de la reivindicación 1, así como sus variantes, que resultan de la degeneración del código genético, que codifican un polipéptido que tiene la misma actividad antagonista de la IL-6 en la línea celular XG-1 de mieloma dependiente de la IL-6 humana que el polipéptido de la reivindicación 1.

3. Un vector que comprende la secuencia de ADN de la reivindicación 2.

4. Una célula hospedadora transformada con la secuencia de ADN de la reivindicación 2 o el vector de la reivindicación 3.

5. Un procedimiento para producir el polipéptido de la reivindicación 1, que comprende:

(a)

cultivar las células hospedadoras de la reivindicación 4 en un medio de cultivo adecuado; y

(b)

aislar dicho polipéptido a partir del medio de cultivo.

6. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso como un medicamento.

7. El polipéptido de la reivindicación 1 para usar en un método para el tratamiento de las enfermedades en las que la IL-6 tiene una acción patogénica.

8. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y/o excipientes.