UA72426C2 - Human mutant interleukin-6, dna molecule coding it, vector, host cell, and also a method for obtaining and use of mutant il-6 for treatment of diseases with which il-6 has a pathogenic influence - Google Patents

Description

Область техники, к которой относится изобретение.

Настоящее изобретение относится к новому 1-6 мутеину (мутантному интерлейкину 6), кодирующей его последовательности ДНК и его применению в терапии, в том числе и в составе композиций.

Предпосьїлки изобретения.

Интерлейкин б вьіделяется в плазму во время травм или инфекций различньми типами клеток. Он вовлечен в спектр активностей таких как иммунная защита, гематопоезис, созревание мегакариоцитов, образование тромбоцитов, острьій фазовьїй ответ. (1)

Играя ключевую роль в защите организма - хозяйина ІІ -6 вовлечен в патогенез многих болезней таких как плазмоцитома/миелома, остеопорозис, неопластические и автоиммунньсе заболевания. (1)

Рецепторньй - комплекс І/-6 на клетках-мишенях состоит из двух различньх субьединиц: 80 килодальтонной специфической лиганд связьвающей субьединице и (І1/6-Ка) и 130 килодальтонного сигнал трансдуцирующего белка (др130). (2-4) І-6 (интерлейкин б) связьшвается с лиганд связь вающей субьединицей (ІІ 6-Ка) и комплекс ІІ6/І.6Ка ассоциируеєт с димером одр130, посредством зтого инициируя сигнал интерлейкина 6 (16). Сам по себе интерлейкин 6 (1-6) не обнаруживаєет доступного измерению сродства к др130 (сигнал-трансдуцирующему белку). (5. 6)

Интерлейкин б является белком характеризующимся М-концевой вариабельностью. Ранее бьло показано (71), что он состоит из 184 аминокислот. (Зта нумерация аминокислот далее будет применена в заявке.) Предсказанием вторичной структурь! белка на основе моделирования показано, что ІІ6 является членом семейства гематопоетических цитокининов, характеризуемьмм четьірьмя антипараллельньми а- спиралями (А, В, С и б) |в, 9|. СЕ (нгибиторньій фактор лейкемии), СМТЕ (ресничньїй или мерцательньй нейротропический фактор), І 11 (интерлейкин 11), СТ 1 (кардиотропин) и ОМ 1 (онкостатин М) также принадлежит к зтому семейству. Все они используют белок др130 в их рецепторном комплексе, что обьясняет их перекрьиівающиеся биологические активности. |1, 10, 111

Делеционньм анализом 1.6 (интерлейкина 6) показано, что 28 М-концевьїх аминокислотньїх остатков не являются необходимь!ми для биологической активности " молекульі. Удаление более чем 28 аминокислот инактивирует белок.(12) Дальнейшим изучением предсказано, что С-конец А-В петли/начало В спирали (район 2с, остатки 577-Е95) вовлечень! во взаймодействие с ІІ бКас (лигандсвязьвающей субьединицей)

ІЗ, 13-16). Данньй результат бьл подтвержден недавней публикацией модели І/б (интерлейкина 6) человека (9, где зти два района ближайшие к области прикрепления.

К настоящему времени идентифицировань! два сайта взаймодействия 16 (интерлейкина 6) с др130 (лигандсвязьявающей субьединицей). 1 Зпитопньім картированием белка І/б6 (интерлейкина 6) с нейтрализацией тАБр5 предоставлень доказательства, что остатки 0152-1162 (начало О-спирали) вовлеченьй во взаймодействиеє с др130 (лигандсвязьвающей субьединицей). (17-18). Анализом химерньх белков 1/6 (интерлейкинов б) человек/мьішь показано наличие зпитопа внутри начала А-В петли 16 (интерлейкина 6), вовлеченной в контактирование и активацию др130 (лигандсвязьівающей субьединицьі!). І9, 19| Недавно зтот результат бьл подтвержден посредством демонстрации того, что лейцин 57 вовлечен в зто взаймодействие. (201

Зтот район находится в непосредственной близости к началу О спирали, позтому зти два района вместе формируют один общий сайт взаймодействия с одним др130 (лигандсвязьівающей субьединицей). (9, 19, 211 2 Второй сайт взаймодействия с др130 (лигандсвязьвающей субьединицей), бьіл найден по аналогии с комплексом СН (ростовьм гормоном)/ЗНЕ», структура которого била определена с использованием рентгеноструктурного анализа. (22) Бьіло предсказано, что части ЗН (ростового гормона) важнье для взаймодействия со вторьм СНК (рецептором) являются аналогичньїми с (частями) І6 (йнтерлейкина 6) с одним из ор1іЗ0 (лигандсвязьвающей субьединицей). (23, 24). В действительности замена двух аминокислот в А спирали (У310/535Р) и двух аминокислот в С-спирали (5118К/Л/1210)) также приводит к мутантному белку ІІ 6 (интерлейкину 6) с близким к нормальному связьіванием 1І.6-Ка (рецептора), но не активному биологически. Зти четьтре аминокислотьі вероятно важньі для "взаимодействия со вторьм белком др130 (лигандсвязьівающей субьединицей). (24, 251.

З Принимая во внимание обсуждавшееся ранее участие І/6б в патогенезе некоторьїх заболеваний, разработка ингибиторов активности І/б (интерлейкина б) является обьектом активного изучения. Для достижения зтой цели бьіли применимь! различнье подходьі, включая использование антител для 1-6 (интерлейкина 6), др130 (лигандсвязьівающей субьединицьї), или др 80; применение растворимого др130 (лигандсвязь вающей субьединицьї) мутантньїх белков для 1-6 (интерлейкина 6), или рецепторов 1-6 (интерлейкина 6).

Заявитель исследовал возможность синтеза новьїх мутантньх белков 1-6 (интерлейкинов б), действующих как антагонисть! рецептора 1--6 (интерлейкина 6). С зтой целью одним из научньїх подходов являлся синтез мутантов сохраняющих способность связьшвания с І/-6бА», но теряющих способность использовать др130 (лигандовязьівающую субьединицу). Однако оптимальной молекулой является такая, которая не проявляеєт 1-6 активности (активности йнтерлейкина 6), но имеет более вьісокое сродство к рецептору І--6ВАо;, чем 1--6 (интерлейкин б) и содержит настолько меньше мутаций насколько зто только возможно для 1-6, учитьнввая уменьшение риска антигенности.

Раскрьтие изобретения

Заявителем бьло обнаружено, что комбинация точковьїх мутаций в положениий 54 с двумя мутациями

Е1701/5176К увеличивающих сродство к ІІ -6бАс, и двух мутаций 2159Е/71162Р, уменьшающих зависимость взаймодействия с др130 (лигандсвязьівающей субьединицей), полученньїх на мутантах человеческого 1-6 (интерлейкина 6) сохраняющих сродство связьівания с рецепторами, но не способньх связьіваться с др130 (лигандсвязьвающей субьединицей). В частности, основньмм обьектом данного изобретения является мутированньй 1-6 человека, имеющий аминокислотную последовательность, представленную на фигуре 2, и на нуклеотидной последовательности с идентификационньім номером 1, так же как и их внутренние фрагментьї. Зта молекула вела себя как зффективньй антагонист человеческого 1-6 на миеломе клеток линии ХО-1 и показьівает преимущества, описанньсе вьіше.

Другим обьектом изобретения является молекула ДНК, заключающая в себя и последовательность

Ме:1, кодирующую полипептид, также как и его вариантьі, полученнье в результате вьрожденности генетического кода, или в результате точковьїх мутаций, кодирующих полипептидьі, имеющие одинаковую активность с полипептидом, представленньїм на Ме1.

Следующим обьектом настоящего изобретения является плазмидньй вектор, содержащий нуклеотидную последовательность предмета изобретения.

Следующим аспектом настоящего изобретения обеспечение использования зтого белка в качестве медикамента. В частности зто связано с использованием заявленного белка в производстве медикаментов для лечения болезней, в которьїх 1/-б имеет патогенное действиє, таких как например плазмоцитома/миелома, остеопорозис, и неопластические и автоиммуннье болезни.

Медикаменть, прейимущественно в форме фармацевтических смесей, содержащих белок представленньій в изобретении вместе с одним или более фармацевтически приемлемьїх носителей и / или оболочек. Такие фармацевтические формь! смесей также являются дальнейшим аспектом, настоящего изобретения.

Одним из методов приготовления изобретенного мутантного белка является метод с использованием технологии ПЦР и синтетических олигонуклеотидов, содержащих несовпадения в основаниях, подлежащих мутированию в качестве праймеров.

Зкспрессия рекомбинантньїх белков изобретения, как описано здесь, может происходить в зукариотических клетках (таких как клетки дрожжей, насекомьх или клетки млекопитающих) или прокариотические клетки, используя соответствующие вектора зкспрессии. Может бьть использован любой из известньїх методов (зкспрессии).

Например, ДНК молекула, кодирующая полипептид изобретения, вставляется соответствующим образом в сконструированнье векторьі зкспрессии, с помощью техники известной из предшествующего уровня техники (см. Затргоок еї аі, 1989). Двунитевая кКДНК соединяется:с плазмидньми векторами гомополимерньм наращиванием или рестрикционньм связь'ванием, включающим использование синтетических ДНК линкеров или техникой лигирования по тупьім концам: ДНК лигаза используется для лигирования ДНК молекул и нежелательное, обьединение избегается обработкой щелочной фосфатазой.

Для того, чтобь! бьіть способньім зкспрессировать, желательньйй протеин, вектор зкспрессии должен включать также специфическую муклеотидную последовательность, содержащую транскрипционную и трансляционную регуляторную информацию, связанную с ДНК, кодирующей желательньй протейин, путем, дающим возможность генной зкспрессии и продукции белка. В первую очередь, для того, чтобь ген, транскрибировался, перед ним должен стоять промотор, узнаваемьй РНК полимеразой, с которьм полимераза связьшваєтся и таким образом инициирует транскрипционньій процесс. Имеется множество таких промоторов для использования, которне работают с различной зффективностью (сильньсе и слабье промоторьї).

Для зукариотических хозяев могут бить применень! различнье транскрипционнье и трансляционнье последовательности, в зависимости от природьй хозяина. Они могут бьть получень из вирусньх источников, таких как аденовирус, вирус папиломь! крупного рогатого скота, вирус Симиана или сходньх вирусов, где регуляторнье сигналь! ассоциировань! с определенньім геном, имеющим вьсокий уровень - зкспрессии. Примерами являются ТК промотор вируса герпеса, ранний промотор 5М40, дрожжевой промотор да14 гена и т.д. Регулярнье сигналь! инициации транскрипции, которнше делают возможньми репрессию и активацию, могут бьіть подобрань! так, что может бьіть модулирована зкспрессия генов.

ДНК молекула, включающая в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид изобретения, вставляеєтся, в вектор(ь), имеющие операбельно связанньюе регуляторньюе сигналь! транскрипции и трансляции, позволяющие интегрировать желательнье геннье последовательности в клетки хозяина. Клетки, которне бьіли стабильно трансформированьі введенной ДНК, могут отбираться введением: также одного или более маркеров, которне допускают селекцию клеток хозяина, содержащих вектор зкспрессии. Маркер может г также предусматривать фототрофность для ауксотрофньх хозяев, биоцидную устойчивость, например, к антибиотикам или тяжельм металлам, таким как медь или похожим.

Селектируемьй маркерньй ген может бьть либо напрямую связан с ДНК зкспрессируемой генной последовательности или введен в ту же клетку котрансфекцией. Дополнительнье злементь! могут также бьіть нужнь! для оптимального синтеза протеинов изобретения.

Факторьї, необходимье в селекции специфической плазмидьй или вирусного вектора включают: легкость, с которой реципиентньсе клетки, которне содержат вектор, могут бьіть узнань и отселектировань! от тех реципиентньїх клеток, которье не содержат вектор; количество копий вектора,, которое желательно в специфическом хозяине и желательна ли способность бьть челночньм вектором между клетками хозяина и различньіми другими видами.

В то же время вектор(ьї) или последовательности ДНК, содержащие конструкцию(и), полученнье для зкспрессии последовательности ДНК, могут бьіть введень! в соответствующие клетки хозяина различньїми подходящими методами: трансформацией, трансфекцией, коньюгацией, слиянием протопластов, злектропорацией, осаждением в фосфате кальция, прямой микроиньекцией и так далее.

Клетки-хозяева могут бьіть как прокариотическими так и зукариотическими. Преимуществом обладают зукариотические хозяева, например, клетки млекопитающих, таких как человек, обезьяна, мьішь, клетки из яичников китайского хомячка (СНО), поскольку они проводят посттрансляционную модификацию белковьмх молекул, включая правильное свертьивание или гликозилирование в нужном сайте. Дрожжевье клетки таюке могут производить посттрансляционную модификацию белков, включая гликозилирование. Ряд рекомбинантньїх стратегий с о использованием сильньїх промоторньх последовательностей и вьісококопийньїх векторов, которье могут бьіть использовань! для зкспрессии требуемого белка в дрожжах.

Дрожжи узнают лидерную последовательность клонированного генного продукта млекопитающих и секретируют пептид вместе с лидерной последовательностью (т.е. как препептид).

После введения вектора(ов), клетки хозяина вьіращивались на селективной среде, где отбирались только вектор-содержащие клетки. Зкспрессия клонированньїх генов приводила к продукции желаемого белка.

Очистка рекомбинантного белка проводится любьм из известньїх для зтой цели методов, любьм методом, включая зкстракцию, осаждение, хроматографию, злектрофорез и т.д. Прейимущественньм методом очистки заявленного белка является аффинная хроматография с использованием иммобилизованньїх на гелевой матрице колонки моноклональньїх антител, связьвающихся с белком- мишенью. Неочищеннье препаратьї, содержащие рекомбинантньй белок пропускались через колонку.

Белок будет оставаться на колонке специфически связьіваясь с антителами, в то время как примеси будут проходить сквозь нее. После отмьївки, белок злюируется с колонки посредством изменения рН или ионной силь! раствора.

Изобретение далее будет описано в нижеследующих примерах, которье не могут бьіть использовань никаким путем, поскольку защищень данньім изобретением.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 Точкове мутантьіь белка 1І/-6 (интерлейкина б) человека. (А) Изображение белка 1-6 (интерлейкина 6) человека с четьрьмя предсказанньми а-спиралями показано заштрихованньми прямоугольниками. Цифрами показаньь первье и опоследниє остатки а-спирали. Представлена аминокислотная последовательность районов 2с и 2а с их субрайонами внутри района 2а 1 и 2а2 для человеческого (наверху) и мьішиного 1І--6 (внизу). Присутствуют полученнье точковье мутации в районе 2а. (В) Представлено вьравнивание 2а района 1І/-б6 (интерлейкинов б) различньїх организмов. (С)

Ленточная модель человеческого ІІ6. Изображение Е78 (внизу) важно для связьівания с рецептором 1.6-На и К54 (наверху) важньй для 1І-6-На-зависимого взаймодействия с ор1ізо0 (лигандсвязьвающей субьединицей). М-конец соответствует остатку 17 человеческого І1І--6 (ЕпПієгз еї аї. 1994).

Фиг.2 Нуклеотидная последовательность человеческого ІЇ-б6 мутеина (мутантного интерлейкина б), обьекта настоящего изобретения. Она содержит пять точковьїх мутаций по сравнению с человеческим 1-6 (интерлейкином 6), в положениях 54, 159, 162, 170, 176. Зти-замень вьіделеньї жирньм, (шрифтом).

Фиг.3 Связьівание и биологическая активность точковьїх мутантов по позиции К54 человеческого 1-6 (интерлейкина 6). Связьівание мутеина 1-6 (мутантного интерлейкина б) с растворенньім человеческим рецептором І--6Ка. Представлено среднее из двух зкспериментов. (В) деление клеток мьіши линии ВУ и (С) человеческих линии ХО-1 в ответ на І/-6 мутанть». Представлен один из трех зкспериментов. (0)

Индукция зкспрессии гаптоглобина 1-6 мутеийном в клетках гепатомь! человека. Количество требуемого для 5095 зкспрессии гаптоглобина человеческого 1-6 принято за 100905.

Фиг.4 Связьувание и биологическая активность точечньїх мутантов в положении К54 в комбинации с

ЕРІ-К. (А) Связьівание мутейина 1І--6 (мутантного интерлейкина б) с растворимьм человеческим 1--6Ва.

Представлено среднее из двух зкспериментов. (В) деление клеток мьіши линии ВУ и (С) человеческой линии ХО-1 в ответ на І/-6 мутантьї. Представлен один из трех зкспериментов. (0) Индукция зкспрессии гаптоглобина 1-6 мутеином в клетках гепатомь! человека. Показано количество зкспрессии гаптоглобина в присутствий 1мкг/мл мутеина. Представлено среднее из двух зкспериментов.

Фиг.5 Зффект антагонизма точковой мутации К54 в комбинации с ЕР-ЇК на 1/6 человека индуцированном делениий клетках линии ХО-1. Указанньєе концентрации 1.6 мутантов добавлялись ХО-1 в присутствий 10Опкг/мл человеческого 1-6 и измерялось клеточное деление. Представлено среднее из двух зкспериментов.

ПРИМЕРЬ

Материаль и методь!

Реактивь!

Зндонуклеазь! рестрикции Асе І, ЕсОМІ, Ніпа І, Мсо І, Мпе І и Хва І били полученьі от компаний АС5 (Гейдельберг, Германия), полинуклеотидкиназа, щелочная фосфатаза тимуса теленка и Т4 ДНК лигаза полученьі от компании Врепгіпдег Мапппеїт (Манхейм, Германия). Зндонуклеаза рестрикции В5рЕЇ и Мепі

ДНК полимераза поставленьї компанией МЕМ Віоіар5 (Швальбах, Германия) и средь! для культур клеток полученьі от бСірсо (Зггенстейн, Германия). Реагент Болтона-Хантера (74Тб К/ттої) и метка ігапІ535) полученьі от фирмь! Атегзпат (Амершам, Англия).

Олигонуклеотидьі бьши полученьй от фирмь! РПпагтасіа (Фрейбург, Германия). Козьи и кроличьи поликлональнье сьвороточнье антитела против человеческого гаптогяобина бьли предоставлень компанией Зідта (Дейзенховен, германия) и щелочная фосфатаза-коньюгант осла поликлональная сьіворотка против иммуноглобулина с кролика из компаний Ріегсе (Рокфорд, США).

КДНК человеческого 1-6 бьіли получень от докторов Т. Хирано, Т.Хишимото (Осака, Япония).

Плазмида для бактериальной зкспрессии реЕЗЕТ 5а и организм-хозяйн ВІ О 21 (ОЕЗ) бьл описан ранее

Зпорієг еї аї., (26| После заменьі сигнальной последовательности на кодон старта трансляции, кКДНК кодирующая 1-6 человека бьіла клонирована на вектор рЕ5ЕТ 5а по сайтам рестрикции Мсо І и Ніпа І. 271.

Клетки человеческой миеломьї линии ХО-1 бьіли в основном предоставленьі доктором Б.Клейном (Нант, Франция).

Растворимьій 1І-6Ка (интерлейкин-бКа) бьіл зкспрессирован в Е.соїї, ренатурирован и очищен (281.

Поликлональнье моноспецифические антитела против І--6Ка (интерлейкина-бКа) бьіли приготовлень! введением части зкстрацеллюларного. домена растворимого белка І-6бРа (интерлейкина-бКа) кроликам (281.

Конструкция, векторов зкспрессия

Для введения точковьїх мутаций в районе аминокислоть 54 в интерлейкине-б (РАЗЕТ 5а-пиІ -6-КБ4Х), четьтре олигонуклеотида бьіли вставленьі и лигированьі в ЕсоМІ-Мпе! рестрикт РЕ5ЕТ5а-мутанта 2а (91.

Олигонуклеотидами биьли:

БААСАТОТОТОАААоСАвСОоАТОАоОССоЗ смьісловая последовательность (К540О) (Ме2)

БСТАвСОССТСАТСОСТОСТТТСАСАСЗ антисмьісловая последовательность (К540)) (МеЗ)

БААСАТаТатОАААдаСАа,СсаААадОа(ас(З смьісловая последовательность (К5АЕ) (Ме4)

БСТАоСОСссСТсСТТСОСТОсСТТТСАСАСЗУ антисмьісловая последовательность (К5АЕ) (Ме5)

БААСАТОТОТОАААССАССТТТОАСОСОЗ смьісловая последовательность (К5АР) (Меб)

БСТАОСОССТСАААОСТОСТТТСАСАСЗУ" антисмьісловая последовательность (К5АР) (Ме7)

БААСАТаАТатТаАААдасСсАасСААТИаАДОааСОЗ! смьісловая последовательность (К5АМ) (Ме8) 5СТАоСОо-ССТСАТТОСТОСТТТСАСАСЗ антисмьісловая последовательность (К5АМ) (Ме9)

БААСАТОТОТОАААвСАвССССвАСОоСОУ смьісловая последовательность (К5аР) (Ме10)

БСТАоСОоСсСсТооОООсСсТОсСТТТСАСАСУ антисмьісловая последовательность (К5АР) (Ме11)

БСАААОБАВАСАТОТААСААСАСТЗ! смьісловая последовательность (Ме12)

БАТОТТАСТСТТОТТАСАТОТСТОСТТТ3: антисмьісловая последовательность (Ме13)

Чтобьї обьединить точковье мутации в районе аминокислотьі 54 с двумя точковьіми мутациями

Е1701/51768 (кратко обозначаемьми, І В) и две точковне мутации О159Е/Т162Р (кратко обозначаемьми,

ЕР), бьіли сконструировань! вектори рАБЕТ ба-пи1Ї -6-ЕР-К54Х-І А лидированиеєм фрагментов Мео!1-Хбаї комплементарной ДНК из рАБЕТ-54-пиІ -6-КБА4Х в МеоІ-Хра! рестрицированньйй вектор РАБЕТ ба-пши -6-

О159Е/162Р-2даг2-Е1701/5178 (кратко обозначаємьми, рРАБЕТ ба-ни -6-ЕР-гаг-І В) (19). Целостность всех конструкций бьіла подтверждена анализом рестрикционньїх фрагментов и сиквенсом (291.

Приготовление белков

Бактериий ВІ 21(0Е3) бьіли трансформированьй вектором зкспрессии рЕБЕТ. Генная:зкспрессия и ренатурация белков, переведенньїх в растворимое состояние из телец включения бьли произведень и описаньі (27, 30, 31). Ренатурированнье белки бьли очищень до 29095 гомогенности. Чистота рекомбинантньх белков бьіла проверена 12,595 505-РАСЕ и окрашиванием солями серебра.

Связьівание ХІ--6 (интерлейкина-6б) с растворимьм І--6На (рецептором-бНа)

Очищенньюе 1-6 (интерлейкин-6) мутантнье белки бьли последовательно разведень в РВ5 содержащем 0.02956 ТУМЕЕМ 20/0.29085А и добавлень к нг. человеческого 725І-ІЇ-6 (интерлейкина-б) (60.000-90,000Осріт/нг) и 1.7нг растворимого человеческого 1І--6На (рецептора-бКа) зкспрессированного в

Б.соїї (28) до конечного обьема 500мкл. После инкубации в течение ночи при 4"С ІІ -6/5ІЇ-6Ка комплексь! бьли иммунопреципетированнь с использованием 1І/-6Ка (рецептор-6Ка) антисьшворотки и протеин А

Сефарозьі, радисоактивность бьіла подсчитана счетчиком Гейгера.

Биологические анализь

Для анализа пролиферации мьішиньх клеток ВО и человеческих линий ХО-1, 1-6 (интерлейкин-б) мутантнье белки бьіли последовательно разведень! до концентраций, показанньїх на фигурах. Анализь! вьполнялись как описано ранее |ІЗ2, 33)|. Одна единица ВУ соответствовавшая приблизительно 1пг человеческого 1-6 (интерлейкина-б) на мл, вела к половине от максимальной пролиферации клеток В9. С человеческими клетками ХО-1 половина максимальной пролиферации бьіла получена после стимуляции с 5Опг/мл человеческого 1-6, Для анализа секреции белка в фазе пика, клетки гепатомь! человека (Нер 38) культивировались на среде Игла в модификации Дульбекка (ОМЕМ) с 1095 змбриональной бьічьей сьівороткой, распределеньї на 96-луночньюе планшеть! для культурь! клеток и оставлень! для достижения связьівания. Клетки бьіли отмьітьі РВ5, хранились 1ч в ОМЕМ без змбриональной бьічьей сьіворотки, и потом бьіли обработаньї 20ч в 100мл свободной от сьіворотки ОМЕМ с возрастающими количествами 1-6 (интерлейкин-б) мутантньїх белков. Количество гаптоглобина секретированного в культуральную среду определялось фермент-связьівающим иммуносорбентньїм анализом |З41.

РЕЗУЛЬТАТЬ

Аминокислота К5а4 1-6 (интерлеихина-6) вовлечена, в ІІ -бЄНа-зависимое др130 взаймодействие исследования, с человеческими/мьсшшиньми 1І--6 химерньми белками показали, что область 2а2 (остатки 50-55) ІЇ/-6 (интерлейкина-6) белка необходима для 1І/-6Ка (интерлейкин-бНа)-зависимого взаймодействия с др1ЗО (19| (Фиг.1А). Замена зтих остатков против Соответствующих мьшиньх аминокислот имела результатом уменьшение связьівания с др130 и 30-ти кратное снижение биоактивности человеческих ХО-1 клеток. Вьіравнивание с десятью видами 1-6 (интерлейкина-6б) показала, что внутри 2а2 области положительно заряженная К54 сохраняєтся в 8 видах, но меняєется на отрицательно заряженную аспарагиновую кислоту в мьішиной и криісиной аминокислотной последовательности ІЗ5, 361 (Фиг.18). Позтому произведена замена К5б4 (Фиг.1С) на аминокислоть! показаннье на Фиг.1А. Процедура клонирования привела" также к трем двухточечньім мутациям 1-6: С4АА4АР/К54Е, С5ОР/К54М и В52Е/К5АаМ, которье бьіли также проанализировань! (Фиг.1А).

Для исследования влияния К54 точковьїх мутаций на І--ЄВа-зависимоє др130 взаимодействие, проведено, в первую очередь измерение связьівания ІЇ-бБа путем замещения человеческого 1251-|| -6, связанного с растворимой формой белка ІІ -6Ка на избьток точковьїх мутантов. Как показано на Фиг.ЗА, непомеченньій человеческий дикий вариант 1-6 замещал человеческий 125І-ІЇ-6, связьиваясь на 5095 при использованиий 10-20-кратного молярного избьтка. Точковьій мутант К5АР и двойной мутант 5522/К5АМ показал в 10 раз большее сродство, чем человеческий 1-6 (интерлейкин-б) , тогда как мутант К5АЕ имел в три раза меньшее сродство, чем Ппш/-б к І/-6бКа. Другие исследованньюе мутанть! показали сходное сродство с человеческим 1І--6 (интерлейкином-б). Кроме того, мутантьї стимулировали пролиферацию 1--6 (интерлейкин-б)-зависимьїх ВУ клеток в той же мере, что и человеческий І--6 (интерлейкин-б), что демонстрирует интактность их структурь (Фиг.3В).

В клетках миеломь! ХО-1 и клетках человеческой гепатомь! характер биоактивности 1-6 мутеина била:

К54»5528/К54М» Пи -6-К54Е2К5402К54Е»С5ОР/К54М»С44Р/К5АЕ, Так, мутанть К5АР и 5528/К5АМ имевшие найвьісшее сродство к ІІ-6Ка (рецептору-6бКа) также показьввали найвьісшую бисоактивность на человеческих клетках. Замена положительно заряженного лизина 54 против соответственно отрицательно наряженной аспарагиновой кислотьї имела результатом только слегка ослабленную биоактивность в человеческих клетках, тогда как замена на Сіи (глутаминовую кислоту) имела результатом существенное снижение (10-кратноеє) биоактивности.

Недавно, бьіло показано на мьіши, что введение остатков 50-55 (область 2а2) и двух точковьїх мутаций

Е1701/5176Е (обозначениєе, КК), которне повьишают сродство к ІЇ/-6бКа (рецептору ІІ-6Ка), в двойной мутант 2159Е/71162Р (обозначение 1І-6-ЕР), которне обнаруживают пониженное взаймодействие с др130, приводит в результате к 1-6 мутеину (интерлейкин-6 мутантному белку) с отсутствием биоактивности в человеческих клетках |19). Сродство зтого 1-6 мутанта (1--6-ЕР-2аг2-ІЇК) к человеческому І1--6бВа (рецептору-бКа) бьіло схожим с таковой к человеческому 1І/-6 (интерлейкину-6б). Зтот І/-6 мутант бьл зффективньм антагонистом рецептора 1-6 в вьісоко чувствительньїх человеческих 1-6 зависимьїх клетках линии миеломь! человека ХО-1.

Бьіли введеньі К54 мутанть! в мутанть! І--6-ЕР-ЇК. Полученнье в результате ІЇ/-6 мутантньюе белки бьіли названь 1/-6-ЕР-К5Б4АХ-І Е, где Х обозначаєт все мутации введеннье в позицию 54 (Фиг.1А). Мутант

І--6-ЕР-С44Р/К54Б-І 2 и мутант І--6-ЕР-К54Е-І КЕ обнаружили пониженное сродство к человеческому 1І--6-

Ка (рецептору-б6-Ка), тогда как все другие мутантьй вели себя как человеческий 1-6 (Фиг.4А).

Пролиферация мьшиньх клеток ВУ бьла сильно снижена для мутантов ІІ/-6-ЕР-2а2-ЇК и 1--6-ЕР-

ЗБ2В/К5аМ-І К. Все другие-мутанть бьіли приблизительно в 5-10 раз менее активнь, чем человеческий 1-6 (Фиг.АВ). В противоположность к зтому, величина пролиферации клеток человеческой, миеломь! ХО-1 снижаеєется на три порядка для мутантов 1 -6-ЕР-І В, ІІ -6-ЕР-КБАР-ІК и І--6-ЕР-5528/К5АМ-І ВЕ (Рис.4С). Все другие мутанть! не обнаруживали регистрируемой биоактивности. В человеческих НерЗзВ клетках только мутанть 1С-6-ЕР-ЇК и І--6-ЕР-К5АР-І К обнаруживали остаточную активность (Фиг.40).

Когда мутантьі без биоактивности бьіли добавленьй в возрастающих количествах к человеческим клеткам миеломь! (ХО-1) стимулированньїх 100пг/мл человеческого 1-6, било обнаружено ингибирование пролиферации. фиг.5 показьіваєт, что прибавление мутантов І--6-ЕР-гаг-ІК и І--6-ЕР-КБаР-І Е приводит к 5095 ингибированию пролиферации при "приблизительно 100нг/мл, тогда как все другие мутанть! бьіли приблизительно в 5-10 раз менее зффективнь.

ОБСУЖДЕНИЕ

АМИНОКИСЛОТА К54 ЯВЛЯЕТСЯ ЧАСТЬЮ ор130 СВЯЗАННОГО ЗПИТОПА

Все 1-6 мутейиньї (интерлейкин-6 мутантнье белки) с К54, замененной, различньмми аминокислотньіми остатками зффективно связьувались с человеческим 1І-6Ка (рецептором-бКа). Интересно, что введение

Р54 и двойной мутации 5522Е/К54М приводило к 1-6 (интерлейкинам-б6) с более вьісоким сродством к человеческому 1ІІ-6Ка (рецептору-6Ка). С тех пор как 2а2 область, которая" включаєт остаток 54, била идентифицирована как участвующая во взаймодействии с др130 |19), зто указьтвает, скорее всего, на непрямой зффект. Сделано предположение, что присутствие Р54 или заряженной аминокислоть! аргинина в положенийи 52 приводит к перемещению петли между спиралью А и спиралью В, посредством изменения местоположения области 2С, которая напрямую вовлечена в ІІ-6Ка (рецептором-б6Ка) взаймодействие.

Замена консервативного для восьми видов лизина 54, на аспарагиновую кислоту, являющуюся консервативной для мьши и крьсь, ведет к слабому снижению активности, тогда как замена на глутаминовую кислоту, приводит к существенному снижению (в 10 раз) биоактивности. Хотя глутаминовая кислота несет боковую цепь на одну метальную группу длиннее, чем аспарагиновая кислота, похоже что расстояние между заряженной группой и человеческим І--6Ка (рецептором-бНа) существенно. Исходя из зтих данньїх, возможно предсказать, что мутация по положению К54 взаймодействует с отрицательно заряженньіми остатками в положении 54 человеческого 1-6, приводя к восстановлению узнавания между 9р130 и І--6/ЛІ/-6Ка комплексом. Мутация в цистеинах положения 44 или 50 в І/-6 мутеине (мутантном интерлейкине-6) приводят к слабой потере биологической активности, что подтверждается недавними результатами КоскК с соавторами (34), сумевшим продемонстрировать, что замена цистеийнов в положениях 44 и 50 не приводит инактивации 1-6 мутейина.

Взаимодействие лиганда с рецептором.

Структура комплекса гормона роста человека с его рецептором (СН/ЗНК2) бьіла показана в работе (22). Сайт взаймодействия гормона роста с его рецептором многократно подвергался мутагенезу ІЗ8-40| и оценен вклад каждого аминокислотного остатка в знергию связьшвания |44|Ї. С тех пор как комплекс ростовой гормон/его рецептор являются единственной парой из семейства гемопоетических цитокинов, чья структура разрешена на атомном уровне, она является парадигмой для других членов семейства. Для комплекса ростовой гормон/рецептор известно, что зпитоп взаймодействия для обоих состоит примерно из аминокислотньїх остатков І41|Ї. Однако вклад зтих аминокислотньїх остатков не одинаков. Основной вклад в знергию связьшвания производят два гидрофобньх взаймодействия. Зто ядро связьвания окружено менее важньми для контакта остатками, которне в основном гидрофильнь и частично гидратированьї, они дают примерно треть вклада в знергию связьівания. Существует теория, что такое определение сайтов связьіувания применимо и к другим взаймодействиям типа - лиганд/рецептор. (411.

Однако, как считаєтся, К54 является одним из остатков окружения центрального района взаймодействия І-6б/др!30, имеющего слабьй вклад в знергию взаимодействия. Относительно сильньй зффект замень!ї К5АР в антагонисте 1-6 мутеийне является следствием структурньїх изменений в петле АВ.

Антагонисть! рецептора 1-6.

Как известно, били идентифицировань! два района вероятно контактирующие с др130, (І) 2а2 район (остатки 50-55) и лейцин 57 комплиментарньй вершине спирали О 1-6, І(2| зпитет сформированньй частями спиралей А, и О (9, 18-21, 23, 24|. Для связьввания 1І/-6 с І/-6Ка необходим конец А-В петли (остаток 78), также как и С-конец белка (9,13-16). Ясно, что две молекульї д9рі30 необходимь! для инициации сигнала и весьма вероятно, что роль двух сайтов взаймодействия с др130 на 1-6 заключается во взаиймодействиий с двумя белками др130. Перестройки вблизи обоих сайтов взаимодействия с др130 приводили к образованию молекул способньїх связьіваться с рецептором, но не способньїх инициировать сигнал. Бьіло показано, что такие молекуль! могут бьіть использовань! в качестве антагонистов рецептора для 1-6 (19, 21, 23, 24|. Факт одновременного увеличения связь'вающей характеристики ІІ -6 мутеина по отношению к І/-бКа привел к так назьшваєемьм суперантагонистам (|19, 21, 24), что предполагает возможность изменения связьшающих свойств различньїх субьединиц рецептора по какому либо независимому варианту.

Новиьїй антагонист рецептора 1-6, представленньй в данной заявке на патент, содержит единственную

К5АР замену в 2а2 районе, и тем не менее является столь же зффективньм, как и недавно сконструированньй 1-6 мутеин с пятью аминокислотньіми заменами в районе 2а2 (191. интересно, что мутантньій КАР белок показал большее связьівание с ІІ -6Ка, чем 1-6, в то время как, комбинация мутантов ЕР и І ЕК показала нормальное связьівание.

Говоря о терапевтическом потенциале антагонистов цитокиновьїх рецепторов понятно, что чем меньше аминокислот изменяется, тем меньше шанс, что аантагонист будет антигеном. Исходя из зтой точки зрения

І/-6 мутейин и І--6-ЕР-К-54Р-ІЇ К являются улучшением антагонистов рецептора 1І--6 доступньїх ранее.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЬ

1. АКіга, 5 єї аї|., Аду. Іттипої. 54:71, 1993. 2. ХМатавгакі К. єї аїЇ, Зсіеєпсе 241:825, 1988. 3. Тада, Т. егаї, Сеї!І 58:573, 1989. 4. Нірі, Меїаї, Сеї! 63:1149, 1990. 5. 2оПпіІппогтег, О. еїаІ., РЕВ5 Гей. 306:219, 1992. 6. Мигакаті, М егаї,, 5сіепсе 260:1808, 1993. 7. Нігапо, Т. еї ам. Машге 324:73, 1986. 8. Вагап, 9.РЕ., Іттипої. Тодау 11:350, 1990. 9. ЕПаІегв, М., 9. Іттипої. 153:1744, 1994. 10. Реппіса, 0. єї аі!., Ргос. Маї. Асад. 5сі. 0О.5.А. 92:1142, 1995. 11. Реппіса, 0. еї аї., У. Віої. Спет. 270:10915, 1995. 12. ВгаКеппоїї; У.Р.У. еї аї., У. Іттипої. 143:1175, 1989. 13. Ктійндеп, А. ехаі, РЕВ5 І ей. 262:323, 1990. 14. Ктійндеп, А., еї а, РЕВ5 І ей. 273:95, 1990. 15. Ії ищекеп, С. єї аІ., РЕВ5 І вії. 282:265,1991. 16. І еереск, БЕ.М/.С2 єї аї, 9. Віо!. Спет. 267:14832,1992. 17. Вгакеппоїй; У.Р.У, бегопо Зутр. Риб. Намеп Ргевгв. 88:33, 1992. 18. Вгакеппоя У.Р.У., у. ВіоЇ Спет. 269:86, 1994. 19. ЕНіегв, М. еї аї,, 9. Віої Спет. 270:8158, 1995. 20. Ое Ноп, Р.О. ес а, РЕВ5 Гей. 369:187, 1995. 21. Ое Ноп, Е.О. еї аї, 9. Ехр. Мед. 180:2395, 1994. 22. Ве Мов, А.М. еїг а! бсіепсе 255:306, 1992. 23. Заміпо, К егаіІ, ЕМВО 9. 13:281,1994. 24. баміпо, А егаі, ЕМВО 4). 13:5863, 1994. 25. Раопезза, ОС. ес аі, ЕМВО 9. 14:1942, 1995. 26. Зспоергіег, К егаї.. Мецйгоп 5:393, 1990. 27. Мап Оат, М.еї аї, 9. Віо!. Спет. 268:15285, 1992. 28. Бібуап, Т., Єиг. у. Віоспет. 216:239, 1993. 29. Запдег, Е. ес аї, Ргос. Маї)!. Асад. 5сі. 0О.5.А. 74:5463, 1977. 30. зщшаїег, Е.М. єї а!., Мей. Епгутої. 185:60, 1990. 31. Агсопе, В. єї аї., Єиг. У. Віоспет. 198:541, 1991. 32. Аагаєп, ГА єї аї., Єиг. У. Іттипі. 17:1411, 1987. 33. 7папод, Х.-2. єї аї., Віоса 76:2599, 1990. 34. Замаї), А... еї аї,, у. ВіоїЇ Спет. 270:12242, 1995. 35. Мап 5піск, 9. еї аї., Еиг. 9. Іттипої. 18:193, 1988. 36. Мопретапп, МУ. єї аї,, 9. ВіоІ. Спет. 264:16072,1989. 37. Воск, Б.І. ес а! Віоспет. 33:5146,1994. 38. Сиппіпопат, В.С.еї а), Зсіепсе 244:1081, 1989. 39. Сиппіпопат, В,С. еї аї., У. Мої Віої. 234:554, 1993. 40. Вав5, 5.Н еїгаї, Ргос. Майї. Асай. 5сі. 0.5.А. 88:4498, 1991. 41. Сіаскзоп Т., ех а, бсіепсе 267:383, 1995.

Перечень последовательностей () характеристики последовательности 1 (а) длина 212 аминокислот (р) тип аминокислоть! (с) цепь (4) топология линейная (ії) тип молекуль! - белковая (ії) негипотетическая (м) антисмьісловая (у) тип фрагмента: М-концевой (м) признаки (а) имя/ключ: белок (Б) местонахождение 1.....184 (мі) описание последовательности с идентификационньїм номером 1

Мет ля) Зв» бе Бех Тбг оЯву Зіх Би Му Без Уві Лія ов бЗ»г рях піу їй жа МеУ хві іш» хе АЧа Ата на Бгто Дів Бу Уві уз Рух оку сі; дар Зау Їх Хзр Уві Мі Зі рус Мі Бо Мі ро зе Ву

ХЕ Зх З3» ду 118 Адросув Зі» (15 дку Ту 118 во дер опіж 115

23 Ще . з5

Бех Аіа сту Ату Пуй Бій Трх Суя депо був Бех Авт Мей Суя Зі» 5ех 40 45 . 5о

Шиег Бка Піо Аза ву А) піс Аюп Ап ри Ап дви йо Муз Мес 51

КБ ва Й 85 сій Муз Аюробіу Сує тра дів бЗсх ШІу Бе Аза О1и сла ТЕ Су Шем 70 78 30

Чаї муз Ії8 112 тре Зіу Бех овен бХ3и бе Оди Мах Тут мви біц тут з3 35 ве фрез бій Аза Агу бра зу Бех дах Зі боїв СІ Аза дгя вха Уаї Бій 305 . їх15 11:

Мет бег Тит пув уаї феи 18 біп пе цей ба цу уз віз Муз Ази 129 125 122 зей Азродіа тів Ту Тйх Буо АБровус ТИХ ОТГ Аза діа Бех ва цу 135 145 135

Тк іа бе Зіп Ліз піл ззлобі Ттрогео Піб АвроМех рко ЗБк Що «7 188 ре хо їже Ї12 Пе» деп Бет йво» пйуя 016 Ре йез біб Ага Как обем АхУ АТ 185 Й 175 175 їва ем о йго Зів Мас Й (2) информация для идентификации последовательности М2 () характеристики последовательности; (а) длина 27 пар оснований (Б) тип нуклеиновая кислота (с) цепи одноцепочечная (8) топология линейная. (ї) тип молекуль! геномная ДНК (ії) не гипотетичеекая (м) описание последовательности 2

ААСАТИаТаТОа ААДОЯССАаСаАтТадаасс, (2) информация для идентификации последовательности З () характеристики последовательности; (а) длина 26 пар оснований (Б) тин нуклеиновая кислота (с) цени одноцепочечная (4) топология линейная (ї) тип молекуль! геномная ДНК (її) не гипотетическая (м) описание последовательности З

СТАССОССТСАТСОСТОСТТТСАСАС

(2) информация для идентификации последовательности 4 () характеристики последовательности 4 (а) длина 27 пар оснований (Б) тип нуклеиновая кислота (с) цени одноцепочечная (4) топология линейная (ї) тип молекуль! геномная ДНК (ії) не гипотетическая (м) описание последовательности 4

ААСАТИаТатТОаАААаСсАасСсаААаАОаасСа (2) информация для идентификации последовательности 5 () характеристики последовательности 5 (а) длина 26 пар оснований (Б) тип нуклеиновая кислота (с) цени одноцепочечная (4) топология линейная (ї) тип молекуль! геномная ДНК (ії) не гипотетическая (м) описание последовательности 5

СстТАаСОаСсСстТсТТо5ОСТОСТТТСАСАС (2) информация для идентификации последовательности 6 () характеристики последовательности б (а) длина 27 пар оснований (Б) тип нуклеиновая кислота (с) цепи одноцепочечная (4) топология линейная (ї) тип молекуль! геномная ДНК (її) не гипотетическая (їм) описание последовательности 6

ААСАТИаТатТОаАААас,СсАасттталаасСа (2) информация для идентификации последовательности 7

() характеристики последовательности 7 (а) длина 26 пар оснований (Б) тип нуклеиновая кислота (с) цепи одноцепочечиая (/) топология линейная (ї) тип молекуль! геномная ДНК (ії) не гипотетическая (ім) описание последовательности 7

СТАОСОССТСААОСТОСТТТСАСАС

(2) информация для идентификации последовательности 8 () характеристики последовательности 8 (а) длина 27 пар оснований (Б) тип нуклеиновая кислота (с) цепи одноцепочечиая (4) топология линейная (ії) тип молекульі геномная ДНК (ії) не гипотетическая (м) описание последовательности 8

ААСТаТатОАААсаСАаСААТаАЛСасСа (2) информация для Идентификации последовательности 9 () характеристики последовательности 9 (а) длина 26 пар оснований (Б) тип нуклеиновая кислота (с) цепи одноцепочечная (4) топология линейная (ї) тип молекуль! геномная ДНК (ії) не гипотетическая (м) описание последовательности 9

СТАОСОССТСАТТОСТОСТТТСАСАС

(2) информация для идентификации последовательности 10 () характеристики последовательности 10 (а) длина 27 пар оснований (Б) тип нуклеиновая кислота (с) цепи одноцепочечная (4) топология лилейная (ї) тип молекуль! геномная ДНК (ії) не гипотетическая (м) описание последовательности 10

ААСАТИТаТтаАААаСАСССССаАааса (2) информация для идентификации последовательности 11 () характеристики последовательности 11 (а) длина 26 пар оснований (Б) тип нуклеиновая кислота (с) цепи одноцепочечная, (4) топология линейная (ї) тип молекуль! геномная ДНК (ії) не гипотетическая (м) описание последовательности 11

СТАоСОССсТоООООсСТОсСТТТСАСАС (2) информация для идентификации последовательности 12 () характеристики последовательности 12 (а) длина 23 пар оснований (р) тип нуклеиновая кислота (с) цепи одноцепочечная (8) топология линейная (ї) тип молекуль! геномная ДНК (ії) не гипотетическая (м) описание последовательности 12

САААСааАпАСАТаТтААСААСАаТт (2) информация для идентификации последовательности 13 () характеристики последовательности 13 (а) длина 27 пар оснований (Б) тип нуклеиновая кислота (с) цени одноцейочсчиая (4) топология линейная (ї) тип молекуль! геномная ДНК (ії) не гипотетическая (м) описание последовательности 13

АТОТТАСТСТТОТАСАТОТСТОСТТТ

А , 19 45 80 401306 32 57. 84

Ж я са - дл я . ав, ФівеЕ. - ЩЕ о тваР БІЛО БІТ7бА 43 Бо 85

ТСМКЕММСЕВКЕ !

ЖЖ Ж : ї -

БСМЕМЯрСИММоО ше

Е М й

Кк я Точкове

Е мутацин о - : Е в й, ФИГУРА А

Аз 50 БВ й тТеМКБММСЕВОКЕ человек

МОЕКУКЕСЕМОЖЕ 0СНЬЕ

ІСЕКМОЕСЕМОКЕ евця

ІСЕКМОБСЕЯЕЖЕ ОКО, ! МСПМЧУМАСВОБКЕ 00кошка.

МОТЖКЕМЕСЕОВКЕ вобака 00

ТеМЕЯММСОБІКЕ. сехсосебив обезьяна.

ТСМЕЯММСЕВЯКЕ смакака 2

ТеМамсосММцио меш

ПЕМОМВІСММО ВО. крика і ФИГУРА1Н дян ; х шою Не /4

Ж -ї ц й Е ; Бл І

АЙ іо , . жи ШИК І й і 7 4 у 4 і ч о ч ї 7 : зіва і ! І / а оса. 1 і в і ! - йкя К і р ге й о і і пт р с ! і і т о ще ї І х ож / І «а ? їх В їх Кї. ГУ хм і з ; 7 меч Ї М а / х / ух й Я х Ще й З ЕЙ х ; Ж ! й х і і і у ШИЯ

Х - А І х й Н М ча і х . / й / у І у / (і ї пат у і и ї хи 5 х - /

Ще ? А М у, і 3 Ь. І М ій / і т в- а ді

Уж ооо Ву

М / ; Ше й я ї рсетаргучнї Й Ми су с г р

АХ я з

Ай Е ей й ни їх х - я ва ен ля МК ї

МК цих дн о

ФИГУРАІС

. МННОКЦСДУГТІВА ПИСЛЦКВаУ ТИ ТЬНЮЄТЬ З) о дути рентна ТЯ тт чт тт почти т п пт тт тю ню т тт

Ї меру док дес Ме Зеу Тих ЗУ Ай БУ пір Шже У2Х Аїд Жло бер їже

ШіУ вс дез ре) Узі дп Рус ВІЗ Ліз вх бі» Діз бує УЗ) Рі» орду .

Н - 1

Н ; : с ди,

І ОМ ЗМ Аки Явх ру же уві Муз щі4 ро мії Ате ЩІ РО ово ЕХ

Н Ж ух . «ах

І 2 їз їх Я

І ех йох йі» ке 3 бор ої»х Пій оїі5 Ак ту Лів йбм жяр іх Це

Н 35 зе зх і дееє Мі бом Асц вБуй Зі: їм су. хи бух ох Ако Мес пухолім Ясх зе ях й і

Хек оРтш Мф) із же Аз ЗЛ АБИ АФ ем Лжо Сом Бу» Бо МОВІ ! хх ко вк сім бук ляхо БАу пух вва біл дек З3Му ВА Аяп лій біо ТИЛУ бух бо

МУ ТЕ з

Уукі Муз ї18 ЩІ» цк У цбо уво Мак бах пім ХВ ОСтУУ фі Зі лЛух а за 5 5 їм бій дже» ху Ме Мі Хек о йех Пі» бо пли АТХ Аг Міо Ул Ах хр ме 115

МепоЗкр тик пух ча йом Тіз іо бпе бебп пі» му ух дім бух АХ 33у5 Й М 3435 ки дор ода ЇМО Ти: Тйх бе Аву біб» ТМ: ТБгоденм Дій пхб ко хе

Тл 155 15 лвтокує м ЗАП КАТА лій ди лій ТуУб с15и БІ» З5р З) Ясз ТБ Кіх

І58 152 КЕЗм шо ЇМ їси ЗгЗ хек одео цу ПЛ ЕХ дах пів ту Бе дело руФ із 155 172 ЕКСЯ ї52

Та Ву Зі МЕх 184 ловчжжажжиютж ЖЖ ДАК АЖА ЖЖ ди пл я ВА ЖАЖЖЖЖЖ А Ж Ж А ЖАХ ЖЖ ЖЖ ЖИ ЖИТА А лем жьтя ж

ФИГУРА З

А. по : ї щі 00100 вер у о 90 д СКУ д пе во | ж

Но та ) з ! во- і х

Я 5 й д Е - зо «человеческий й « В. гЗ 20 вІ-бНа. Х

Я ож че , о Вся

І бал 1 10300 1000 10000 рах провришевия коттурснтя т шо БоОнов А Кар 7 Й е КО а садБКБЯє

І | в 'кБаЕ о сок поКкБаК д БІВ БаМ й. ФИГУРА ЗА

В !

Й 18 н г й З я 15 : 13 МБЕОЬ. ду ке 2 | во Ді Ше 14 ' / 4 7 ! 10 ши.

Я 98 й. о :

Е 027 и ої г 05 ше та ши : 05 ду о я дж й 03 фрералррнн ! ; а тт я в 0. я 1 т 100 000 вармаєт (ролі) я пиї-6 А КІР . -е КВ А сМЕКБЯЕ бот ква о СБОБ/КБАМ пока до ВБОВКБАМ що ФИГУРА ЗВ с . : 0.7 р неолий . ; . н Человек т 061 ХВ доунстевеий : 75 г й ак ди В / 8 І ня р св пе ; я д / д Щ й

В я, з! що З 04 й Й и рт " до, й о і . 03 ож ях: . бач т і ! ; 0 Ку 4 1 таобо 0005 й І варнант Апа/ті) жо пон -в А КБар . е КБ) а СЯАБЕКБАє ше що КБаЕ о оБ5ОРКБаМ : покБак А 852Б/КБЯМ ст ФИГУРА зе о - - ооо : то человек, | І :

В Нерзв б. пою. м Е

Во. 1

Е; 100 г. я 8 « я : в о ие а "ее « . ак

Фе : Бе ФИГУРА 30 д . ше Гл тази сикво зі нада в. може у / о вне шко я ою Б що Ме

Во Що

В Бе

Е о чу г в - р: 40 т :

Е "за чедовеческий у ; ї ! 20 АННИ ХУ у 8 10 пам я о і дж Я і й г МЕНШ 16100. 1000 10000 й раз преввинення конкурента. шов що И-6-ЕВ-КЕЯЕ-А : в ПА8ЕРЯАЯ А пев ЕР-КВАРЬН а П.-6б-ЕР-282- В А ОВ ЕР-СЯЯЕКаЯЕЯИ я по ЕР-КБаМЬН 6 0 Пе ЕР-СБОБИКБаАМАЯ во поАвЕРАКБІЕН Пов-ЕР-ЗБеВКВаМ В є ФИГУРА. 4А в . : їм : : меле 19 менш с Доу вису

Зо семи моих 68 Во вин

Е ! 07 /, і

В ре я. ов їй !

С /

В . : яй о 05 | / ом Й і ; . Ко я 0.3 вс в сф сера ди я і - о А 10 т 1000. 00010006 варнант роті жо ВвшСЄ І зо еЄбвЕРЖБАВА В й шо 8 ЕРАВ 4 НОВ ЕР-КБаАР.СН .

А ПобЕР-гаг А. А ОЗЕР СЯДЕ

Фо рев КнаО- і о 0028 ЕР СОКАМИ до -АВ-ЕР-КБЯВ-В А пов-ЕР-ЗБ2НКБАМАЯ ше ФИГУРА 4В с . вв юр . аг

І челанок ЕЕ ха-ї і

Й ЩІ и - ! / ше 2,3 / в пи ЛИ я й

ЕВ Кнсс С нд шви З

І їх 5,2 ї

З Кз НН 1 15 таб 1900 оба а варив : ЗО; ти по шбЕРЖВІвІЯ в о еЕРАН А АВР КБЯРАЯ а пАВЕР гамі В А ВАВБЕР-САЗЕЖБАЕЯВ ж. шЩбЕРКяДНЯ о ПОФЕР-СВФЕЛКВІМАВ во ве-ЕРКБАВАЯ А пов'кР-ЗБаВИКВанА я й ФИГУРАЯС в . ' 600 ав 20.5 Що и Е человек. и ш 165 Нерзв 16.5 - у ! 5 на що 15.5 - : 08 оло5. я : . !

Е В. я

Е 1 . ! - 55 І й 4.5 : пісня ще яз в З т 1 ї т. Мо

ЛЕВ: яв Ж М Ж м ж ХУ о ов в оф од шо ; ж не чи, Ще СИ ШІ

І в б Фе ве о оф а вве ав в ве г ва х ФИГУРА 41у:

Со згданя дом пиві

Е Во вух во З с що й й У у її "ченовок | У : т 20 ха а, с " г ко М КЕ 0-й й - й З -ЗВ: ЗИ

З НЕ . Ехо 100 1000 0000 100000

Зариянт (пд/ті)

А є врРовВо-А А 8-ЕРАКБАРАВ , е й ЕР.КБАЮЯЯА до ПВ ЕР-СЛАЕЙКВЕЛЯ тоб Кая о 0 ов-ЕР-ОБОВИКБАМЯ

Ш ФИГУРА 5

Claims (8)

1. Мутантньш о интерлейкин-б (П/-6б) человека. имеющий аминокислотную последовательность 5ЕО ІЮ МО:1, содержащую следующие точечнье мутации по сравнению с аминокислотной последовательностью встречающегося в природе ПШ/-б человека: Рго в положений 54, СЇш в положении 159, Рго в положенийи 162, Гей в положениий 170 и Аге в положении 176, или его фрагмент, обладающий такой же ПП /-б-антагонистической активностью, как и указанньй мутантньйй Ц.-6.

2. Молекула ДНК, включающая последовательность ДНК, кодирующую мутантньй Ш-6б по п. І или его фрагмент, обладающий такой же Ц.-б-антагонистической активностью, как и указанньй мутантньйй Ц.-6.

3. Вектор, включающий последовательность молекуль! ДНК по п.2.

4. Клетка-хозяин, трансформированная молекулой ДНК по п.2 или вектором по п.3.

5. Способ получения мутантного П--6 по п.1 или его фрагмента, обладающего такой же Ц-6- антагонистической активностью, как и указанньй мутантньй П.-6, предусматривающий (а) культивирование клетки-хозяйна по п.4 в подходящей культуральной среде; и (б) вьіделение указанного мутантного Ц.-6 или его фрагмента из культуральной средні.

б. Применение мутантного Ш-б по п.!І или его фрагмента, обладающего такой же П--6- антагонистической активностью, как и указанньій мутантньй ШЦШ.-б, в качестве лекарственного средства.

7. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента мутантньй І/-6 по п.1 или его фрагмент, обладающий такой же ЦП .-б-антагонистической активностью, как и указанньій мутантньй Ш-6б, и один или несколько фармацевтически приемлемьх носителей и/или наполнителей.

8. Способ лечения болезней, при котором П/-б имеет патогенноеє действие, предусматривающий введение зффективного количества мутантного П/-б по п.!І или его фрагмента, обладающего такой же П.-б-антагонистической активностью, как и указанньй мутантньй Ц.-6.