ES2238996T3

ES2238996T3 - Composicion y metodo para inducir apoptosis en celulas de cancer de prostata.

Info

Publication number: ES2238996T3
Application number: ES00912310T
Authority: ES
Inventors: Nigel C. Phillips; Mario C. Filion; Stephanie Reader
Original assignee: Bioniche Life Sciences Inc
Current assignee: Telesta Therapeutics Inc
Priority date: 1999-04-01
Filing date: 2000-03-30
Publication date: 2005-09-16
Anticipated expiration: 2020-03-30
Also published as: AU3413500A; WO2000059518A3; EP1165106B1; PT1165106E; CA2366090A1; DE60020352T2; EP1165106B8; AU780909B2; CA2366090C; EP1165106A2; DE60020352D1; ATE296106T1; JP2002541114A; CY1107455T1; WO2000059518A2

Abstract

Uso de una composición que comprende M-DNA y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer de próstata.

Description

Composición y método para inducir apoptosis en células de cáncer de próstata.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de una composición para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar el cáncer de próstata.

Antecedentes de la invención

El cáncer es una acumulación aberrante neta de células atípicas, que pueden formarse como resultado de un exceso de proliferación, una insuficiencia de apoptosis, o una combinación de ambas. La apoptosis es un proceso activo de muerte celular caracterizado por cambios morfológicos distintivos que incluyen condensación de la cromatina nuclear, contracción celular, desintegración nuclear, formación de vesículas en la membrana plasmática, y la formación de cuerpos apoptóticos fijados a la membrana (Wyllie et al. Int. Rev. Cytol. 68:351, 1980). Una marca de contraste de la apoptosis es la degradación del DNA nuclear de la célula en fragmentos de longitud oligonucleosómica como resultado de la activación de endonucleasas endógenas (Wyllie A.H. Nature 284:555, 1981).

El cáncer de próstata es una causa principal de muertes por cáncer entre la población masculina. Para pacientes con cáncer de próstata confinado en la cápsula, prostatectomía radical, radioterapia, una combinación de ambas, y braquiterapia con implantes de semillas radiomarcadas son los tratamientos más comunes. La prostatectomía radical puede dar como resultado impotencia e incontinencia. La radioterapia está asociada con la recurrencia del antígeno específico de próstata (PSA). La braquiterapia puede utilizarse solamente en pacientes cuidadosamente seleccionados.

Para pacientes con tumores extracapsulares y metástasis, la ablación andrógena y la quimioterapia son los tratamientos más comunes. La ablación andrógena, para uso en pacientes con cáncer de próstata dependiente de andrógenos, incluye castración quirúrgica (orquiectomía bilateral) y castración química utilizando anti-andrógenos y supresores de la producción de hormona luteinizante. Muchos pacientes rechazan la orquiectomía. Los anti-andrógenos y los supresores de la producción de hormona luteinizante, utilizados juntamente para efectuar el bloqueo total de andrógenos, dan como resultado síntomas de supresión de los andrógenos y, además, son muy caros. Adicionalmente, la respuesta a la terapia de ablación de andrógenos es finita y dura un término medio de 12 a 16 meses (Crawford et al. New. Eng. J. Med. 321:419, 1989). La muerte celular programada o apoptosis incrementada se ha identificado como un avance terapéutico deseable en el tratamiento del cáncer de próstata (Kyprianou et al., Cancer Surv. 11:265, 1991). Las mutaciones en p53, una proteína que está implicada en el control y la inducción de la apoptosis, están asociadas con pronóstico clínico malo y eficacia reducida de una extensa gama de agentes terapéuticos utilizados en el tratamiento del cáncer (Chang et al., J. Clin. Oncol. 13:1009, 1995). Se sabe que la mutación del gen p53, que da como resultado la acumulación de proteína p53 no funcional, está asociada a una falta de respuesta a la terapia de ablación de los andrógenos en el tratamiento del cáncer de próstata (Navone et al., J. Natl. Cancer Inst. 85:1657, 1993).

Los agentes terapéuticos que son eficaces en la inhibición de la proliferación de y la inducción de la apoptosis en células de cáncer in vitro están reconocidos por tener utilidad terapéutica para el tratamiento in vivo del cáncer (Furukawa et al., J. Surg. Oncol. 48:188, 1991). Por ejemplo, se ha demostrado que la actividad anti-proliferativa in vitro de agentes quimioterapéuticos frente a las células cancerosas del adenocarcinoma de próstata está correlacionada positivamente con su actividad anti-cáncer in vivo (Pienta et al., Prostate 26:270, 1995). La actividad de muchos de estos agentes terapéuticos se ve influenciada sin embargo por el estado de mutación de p53, y aquellos agentes cuyo mecanismo de acción parece ser independiente de p53 son no selectivos y muy tóxicos. La quimioterapia, para uso en pacientes con cáncer de próstata independiente de los andrógenos (refractario a las hormonas) tiene como primera meta la paliación. Sin embargo, los efectos secundarios tóxicos de la quimioterapia son debilitantes, a menudo limitantes de la dosis, y deterioran la calidad de la vida del paciente.

La castración o terapia de ablación de andrógenos (sea sola o en combinación) induce apoptosis en los tumores de próstata. La cantidad de apoptosis que ocurre en los tumores de próstata después de la ablación de andrógenos ha sido correlacionada con el estado de p53 (Westin et al., Am. J. Pathol. 146:1368, 1995). Sin embargo, prácticamente todos los pacientes con cáncer de próstata metastático huirán de la terapia de ablación de andrógenos de primera línea. La inducción de apoptosis en el adenocarcinoma prostático después de ablación de andrógenos está asociada con células efectoras inmunes infiltrantes tales como las células T citotóxicas y los macrófagos activados (Landstrom y Funa, Int. J. Cancer 71:451, 1997). La activación de los sistemas inmunes innatos y adquiridos, además de la inhibición de la proliferación de las células de cáncer de próstata, sería beneficiosa para el tratamiento del cáncer de próstata.

WO 99/07383 describe el efecto de una composición que comprende M-DNA o M-DNA protegido y complejado en la pared celular de M. phlei (MCC) sobre tipos diferentes de líneas de células de cáncer. No se menciona el tratamiento del cáncer de próstata.

M.C. Filion et al., J. Pharm. Pharmacol. 1998, 50 (suplemento): 39 describe también la capacidad de los complejos pared celular micobacteriana-DNA para inducir apoptosis en diversas células de cáncer.

Por esta razón, existe necesidad de un nuevo agente terapéutico para el tratamiento del cáncer de próstata que es simple y relativamente económico de preparar, que se mantiene terapéuticamente estable a lo largo del tiempo, que es eficaz en presencia de p53 mutada, que es capaz de estimular el sistema inmunitario innato y/o el adquirido y que es eficaz a regímenes de dosificación que están asociados con toxicidad mínima incluso después de administración repetida.

Sumario de la invención

La presente invención satisface la necesidad anterior proporcionando una composición para tratamiento del cáncer de próstata en un animal, con inclusión de un humano, en donde una composición que comprende DNA de Mycobacterium phlei (M. phlei) (M-DNA) y M-DNA, en la cual el M-DNA está protegido y complejado en la pared celular de M-phlei (MCC), se administra al animal que precisa de dicho tratamiento en una cantidad eficaz para producir un efecto anti-neoplástico sobre las células del cáncer en la próstata del animal.

El M-DNA y la MCC son sencillos y relativamente económicos de preparar, sus actividades son reproducibles entre preparaciones, se mantienen terapéuticamente estables a lo largo del tiempo, y son eficaces a regímenes de dosis que están asociados con toxicidad mínima incluso después de administración repetida.

Para preparar MCC, se cultivan M. phlei en medio líquido y se cosechan. Los M. phlei se disgregan, y los componentes sólidos de los M. phlei disgregados se recogen por sedimentación centrífuga. Los componentes sólidos se desproteinizan, se deslipidan, y se lavan. El M-DNA se purifica a partir de MCC o se purifica directamente a partir de M. phlei. Se utilizan reactivos exentos de DNasas para minimizar la degradación del DNA (proteger el DNA) durante la preparación de MCC y M-DNA.

Una composición que comprende M-DNA o MCC y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administra a un animal, con inclusión de un humano, que padece cáncer de próstata en una cantidad eficaz para prevenir, tratar o eliminar las células de cáncer de próstata en el animal, con inclusión del humano, que padece cáncer de próstata. Opcionalmente, pueden administrarse agentes terapéuticos adicionales que incluyen, pero sin carácter limitante, anti-andrógenos, agentes quimioterapéuticos, agentes inmunomoduladores y esteroides con el M-DNA y MCC. La capacidad inesperada y sorprendente de M-DNA y de MCC para prevenir, tratar o eliminar las células de cáncer de próstata aborda una necesidad insatisfecha sentida desde hace mucho tiempo en las técnicas médicas y proporciona un beneficio importante para los animales, con inclusión de los humanos.

De acuerdo con ello, es un objeto de la presente invención proporcionar una composición eficaz para prevenir el cáncer de próstata.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para prevenir el cáncer de próstata sensible a las hormonas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para prevenir el cáncer de próstata insensible a las hormonas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para tratar el cáncer de próstata.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para tratar el cáncer de próstata sensible a las hormonas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para tratar el cáncer de próstata insensible a las hormonas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para eliminar el cáncer de próstata.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para eliminar el cáncer de próstata sensible a las hormonas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para eliminar el cáncer de próstata insensible a las hormonas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que tiene un efecto antineoplástico sobre las células del cáncer de próstata.

Otro ejemplo de la presente invención es proporcionar una composición que tiene un efecto antineoplástico sobre las células de cáncer de próstata sensibles a hormonas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que tiene un efecto antineoplástico sobre las células de cáncer de próstata insensibles a hormonas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para inhibir la proliferación de las células del cáncer de próstata.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para inhibir la proliferación de las células de cáncer de próstata.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para inhibir la proliferación de las células de cáncer de próstata sensibles a hormonas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para inhibir la proliferación de las células de cáncer de próstata insensibles a hormonas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para inducir la apoptosis en células de cáncer de próstata.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para inducir la apoptosis en células de cáncer de próstata sensibles a hormonas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para inducir la apoptosis en células de cáncer de próstata insensibles a hormonas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para potenciar la actividad de otros agentes terapéuticos en el tratamiento del cáncer de próstata.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para potenciar el efecto anti-neoplástico de los agentes anti-andrógenos en el tratamiento del cáncer de próstata.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para potenciar el efecto antineoplástico de los agentes quimioterapéuticos en el tratamiento del cáncer de próstata.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz para potenciar el efecto antineoplástico de la radiación en el tratamiento del cáncer de próstata.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que mantiene su eficacia a lo largo del tiempo.

Estos y otros objetos, características y ventajas de la presente invención, resultarán evidentes después de una revisión de la descripción detallada que sigue de la realización expuesta y las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1. Inhibición de la proliferación de las células de cáncer de próstata humano por MCC.

Fig. 2. Inhibición de la proliferación de las células de cáncer de próstata humano LNCaP y PC3 por M-DNA.

Fig. 3. Inhibición de la proliferación de las células de cáncer de próstata humano PC3 por MCC y por MCC tratada con DNasa I.

Fig. 4. Cambios morfológicos en las células de cáncer de próstata humano PC3 después del tratamiento con MCC.

Fig. 5. Inducción de la fragmentación del DNA en las células de cáncer de próstata humano PC3 por MCC.

Fig. 6. Liberación de NuMA a partir de (A) LNCaP y (B) células de cáncer de próstata humano PC3 por MCC.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una composición para el tratamiento del cáncer de próstata en un animal, con inclusión de un humano, en donde una composición que comprende DNA de Mycobacterium phlei (M. phlei) (M-DNA) y M-DNA, en donde el M-DNA está protegido y complejado en la pared celular de M. phlei (MCC), se administra al animal que precisa dicho tratamiento en una cantidad eficaz para producir un efecto anti-neoplástico sobre las células del cáncer en la próstata del animal.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "protegido" se refiere a DNA que no se ha degradado en bases individuales.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "complejado en" se refiere a la asociación física de M-DNA con la pared celular de M. phlei.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "respuesta" hace referencia a inhibición de la proliferación de las células del cáncer, inducción de apoptosis en las células del cáncer, y estimulación de la producción de moléculas bioactivas por las células del sistema inmunitario.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "moléculas bioactivas" hace referencia a citoquinas y especies oxigenadas reactivas.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "células del sistema inmunitario" hace referencia a macrófagos, monocitos, leucocitos, células T, células B, células NK, células dendríticas, células de Langerhan, células intersticiales y células de soporte.

Se utiliza la especie de Mycobacterium M. phlei.

Los métodos para aumentar la actividad anti-neoplástica incluyen, pero sin carácter limitante, complementar químicamente o amplificar biotecnológicamente el M-DNA y la MCC con secuencias o confirmaciones estimuladoras de DNA derivadas de la misma o diferentes especies bacterianas; complementar el M-DNA y la MCC con ácidos nucleicos existentes naturalmente o sintetizados químicamente; y complejar el M-DNA y la MCC con vehículos naturales o sintéticos.

Opcionalmente, agentes terapéuticos que incluyen, pero sin carácter limitante, anti-andrógenos, quimioterapéuticos, agentes esteroidales e inmunológicos pueden incluirse en la composición de M-DNA y MCC de la presente invención. El M-DNA o la MCC y un agente terapéutico opcional pueden administrarse simultánea o secuencialmente en el mismo o diferentes programas.

Los agentes anti-andrógenos, incluyen, pero sin carácter limitante, flutamida, bicalutamida, nilutamida, acetato de megestrol, inhibidores de la secreción de la hormona adrenocorticotrópica, quetoconazol, estrógenos, anti-estrógenos, y supresores de la producción de LHRH.

Los agentes quimioterapéuticos incluyen, pero sin carácter limitante, anti-metabolitos y fármacos que deterioran el DNA, desestabilizadores de los microtúbulos, estabilizadores de los microtúbulos, despolimerizantes de la actina, inhibidores del crecimiento, inhibidores de las topoisomerasas, inhibidores de HMG-CoA, inhibidores de purinas, inhibidores de pirimidinas, inhibidores de metaloproteinasas, inhibidores de CDK, inhibidores de las caspasas, inhibidores de los proteosomas, inhibidores de la angiogénesis, inductores de diferenciación e inmunoterapéuticos. Estos agentes incluyen, pero sin carácter limitante, antibióticos de antraciclina tales como doxorrubicina y mitoxantrona, estramustina, vinblastina, paclitaxel, etoposido, ciclofosfamida, cisplatino, carboplatino y combinaciones de los anteriores con o sin la adición de fármacos esteroidales.

Agentes inmunológicos incluyen, pero sin carácter limitante, citoquinas, quimioquinas, interferones, interleuquinas, anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales.

Las composiciones que comprenden M-DNA y MCC y un vehículo farmacéuticamente aceptable se preparan poniendo en asociación uniforme e íntimamente el M-DNA y la MCC con vehículos líquidos, con vehículos sólidos o con ambos. Vehículos líquidos incluyen, pero sin carácter limitante, vehículos acuosos, vehículos no acuosos o ambos. Vehículos sólidos incluyen, pero sin carácter limitante, vehículos biológicos, vehículos químicos o ambos.

El M-DNA y la MCC pueden administrarse en suspensión acuosa, emulsión en aceite, emulsión de agua en aceite, emulsión de agua-en-aceite-en-agua, emulsión específica del sitio, emulsión de residencia larga, emulsión pegajosa, microemulsión, nanoemulsión, liposomas, micropartículas, microesferas, nanoesferas, nanopartículas, mini-bombas, y con diversos polímeros naturales o sintéticos que permiten una liberación prolongada.

Adicionalmente, M-DNA y MCC pueden utilizarse con uno cualquiera, todos o cualquier combinación de excipientes con indiferencia del vehículo utilizado para presentar la composición a las células sensibles. Estos incluyen, pero sin carácter limitante, anti-oxidantes, tampones, bacteriostáticos, agentes de suspensión, agentes tensioactivos y agentes con actividad superficial.

En una realización, se administra MCC como una suspensión acuosa, en la cual el intervalo de tamaños de la MCC es con preferencia aproximadamente 0,025 a 1,000 \mum, de modo más preferible desde aproximadamente 0,050 a 0,750 \mum y de modo muy preferible entre aproximadamente 0,100 y 0,500 \mum. La MCC se suspende en un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como, pero sin carácter limitante, agua exenta de DNasa, solución salina o solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se homogeneíza y submicroniza por procedimientos estándar tales como, pero sin carácter limitante, tratamiento por ultrasonidos y microfluidización. Por ejemplo, la MCC liofilizada se suspende en agua estéril y se trata por ultrasonidos a 20% de la potencia durante 5 min (Sonicator Modelo W-385, Heat Systems-Ultrasonics Inc.) o se microfluidiza a 15.000-30.000 psi (1054,5-2109 kg/cm^{2}) durante una o más pasadas (Modelo M-110Y; Microfluidics, Newton, MA). La mezcla se procesa asépticamente o se esteriliza finalmente. Puede añadirse un agente terapéutico o agente estabilizador opcional a la MCC durante la submicronización u homogeneización o antes o después de la esterilización.

En una realización, se administra M-DNA como una suspensión acuosa en el intervalo de tamaños con preferencia desde aproximadamente 2 a > 12.000 p.b., de modo más preferible desde aproximadamente 2 a 250 p.b., y de modo muy preferible desde aproximadamente 2 a 20 p.b.. El M-DNA se suspende en un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como agua exenta de DNasa y se homogeneíza y fragmenta por procedimientos estándar tales como, pero sin carácter limitante, tratamiento por ultrasonidos y microfluidización. La mezcla se procesa asépticamente o se esteriliza finalmente. Puede añadirse Un agente terapéutico o agente estabilizador opcional al M-DNA durante el tratamiento por ultrasonidos o la homogeneización o antes o después de la esterilización.

Para la administración en un vehículo no acuoso, se emulsionan M-DNA o MCC con un aceite mineral o con un aceite neutro tal como, pero sin carácter limitante, un diglicérido, un triglicérido, un fosfolípido, un lípido, un aceite y mezclas de los mismos, en los cuales el aceite contiene una mezcla apropiada de ácidos grasos poliinsaturados y saturados. Ejemplos incluyen, pero sin carácter limitante, aceite de soja, aceite de canola, aceite de palma, aceite de oliva y migliol, en donde el número de carbonos de los ácidos grasos está comprendido entre 12 y 22 y en donde los ácidos grasos pueden ser saturados o insaturados. Opcionalmente, el lípido o fosfolípido cargado puede suspenderse en el aceite neutro. Por ejemplo, se añade fosfatidilcolina exenta de DNasa a aceite de soja triglicérido exento de DNasa en una relación de 1 gramo de fosfolípido para 20 ml de triglicérido y se disuelve por calentamiento suave a 50º-60ºC. Se añaden varios gramos de MCC a un envase seco introducido en un autoclave y se añade la solución de fosfolípido-triglicérido a una concentración de 20 ml para 1 gramo de MCC. La suspensión se incuba durante 60 min a 20ºC y se mezcla luego con BPS exenta de DNasa en la relación de 20 ml de suspensión de MCC por litro de P.B.S. La mezcla se emulsiona por tratamiento mediante ultrasonidos a 20% de potencia durante 5 min (Sonicator Modelo W-385, Heat Systems-Ultrasonics Inc.). Opcionalmente, la mezcla emulsionada se homogeneíza por microfluidización a 15.000-30.000 psi (1054,5-2109 kg/cm^{2}) durante una o más pasadas (Modelo M-110Y; Microfluidics). La emulsión de MCC se transfiere a un frasco tapado introducido en un autoclave para almacenamiento a 4ºC. Puede añadirse opcionalmente un agente terapéutico o un agente estabilizador a la composición de M-DNA o de MCC durante la incubación, el emulsionamiento o la homogeneización.

El M-DNA y la MCC se administran en una cantidad eficaz que tiene un efecto anti-neoplástico sobre las células del cáncer en la próstata de un animal. La dosificación de M-DNA y MCC administrada dependerá de la fase del cáncer de próstata que se esté tratando, los órganos a los cuales pueda haberse metastatizado, la formulación particular, y otros factores clínicos tales como tamaño, peso y condición del receptor, y de la ruta de administración.

Preferiblemente, la cantidad de M-DNA y MCC administrada es de aproximadamente 0,00001 a 200 mg/kg por dosis, de modo más preferible desde aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg por dosis, y de modo muy preferible desde aproximadamente 0,001 a 50 mg/kg por dosis. Preferiblemente, el contenido de M-DNA de la MCC está comprendido entre aproximadamente 0,001 y 90 mg/100 mg de MCC seco, de modo más preferible entre aproximadamente 0,01 y 40 mg/100 mg de MCC seco y de modo muy preferible entre aproximadamente 0,1 y 30 mg/100 mg de MCC seco. Inesperadamente, se ha encontrado que al menos aproximadamente 3,6% del peso seco de MCC es M-DNA extraíble.

Rutas de administración incluyen, pero sin carácter limitante, oral, tópica, subcutánea, intra-prostática, intra-muscular, intra-peritoneal, intra-venosa, intra-arterial, intra-dérmica, intra-tecal, intra-lesional, intra-tumoral, intra-vesical, intra-vaginal, intra-ocular, intra-rectal, intra-pulmonar, intra-espinal, transdérmica, subdérmica, colocación en el interior de cavidades del cuerpo, inhalación nasal, inhalación pulmonar, impresión en la piel y electrocorporación.

Dependiendo de la ruta de administración, el volumen por dosis es con preferencia aproximadamente 0,001 a 100 ml por dosis, de modo más preferible aproximadamente 0,01 a 50 ml por dosis, y de modo muy preferible aproximadamente 0,1 a 30 ml por dosis. El M-DNA y la MCC pueden administrarse en un tratamiento monodosis o en tratamientos multidosis conforme a un programa y a lo largo de un periodo de tiempo apropiado para la fase del cáncer de próstata que se esté tratando, los órganos a los cuales se ha metastatizado, el estado del receptor y la ruta de administración.

Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar adicionalmente la presente invención.

Ejemplo 1 Preparación de MCC y M-DNA

Se preparó MCC a partir de M. phlei como se describe en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/CA98/
00744, que se incluye por referencia en esta memoria. Todos los reactivos se seleccionaron para proteger el DNA.

Se preparó M-DNA a partir de M. phlei y de MCC como se describe en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/CA98/00744, que se incluye por referencia en esta memoria. Todos los reactivos se seleccionaron para mejorar la conservación (protección) del DNA.

A no ser que se indique otra cosa, el M-DNA y la MCC se suspendieron en agua exenta de DNasa o en un tampón farmacéuticamente aceptable exento de DNasa y se trataron por ultrasonidos. El tamaño de partícula de la MCC se evaluó durante el tratamiento por ultrasonidos por espectroscopía de correlación fotónica (Zetasizer 3000, Malvern Instruments, Malvern, Worcester, Inglaterra). El diámetro de la MCC disminuía gradualmente con el tratamiento por ultrasonidos (Tabla 1). El peso molecular del M-DNA se evaluó durante el tratamiento por ultrasonidos por electroforesis en gel de agarosa al 2% que contenía 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio (3 horas a 100 V). El peso molecular del M-DNA disminuía gradualmente con el tratamiento por ultrasonidos (Tabla 2).

TABLA 1 Diámetro de MCC

1

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Peso molecular del M-DNA

2

El M-DNA y la MCC no contenían endotoxinas como se determinó utilizando un kit de lisado de amebocitos de Limulus QCL-1000 (BioWhittaker, Walkersville, MD). La sensibilidad de este ensayo del lisado de amebocitos de Limulus es 5,5 pg endotoxina/ml.

Ejemplo 2 Preparación de B-DNA y BCC

Se preparan B-DNA y BCC a partir de M. smegmatis, M. fortuitous, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium parvum, M. kansaii, M. tuberculosis y M. bovis como en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3 Tratamiento con DNasa I

El tratamiento de M-DNA y MCC con DNasa I se llevó a cabo como se describe en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/CA98/00744. La DNasa I digiere tanto el DNA monocatenario como el bicatenario y causa una degradación casi total del DNA.

Ejemplo 4 Células y reactivos

Se obtuvieron de la ATCC células de cáncer de próstata humano PC3 o DU-145 independiente de andrógenos y LNCaP dependientes de andrógenos (#RCL-1435, HTB-81 y CRL-1740, respectivamente). Las células epiteliales de próstata humana primarias (PrEc) se obtuvieron de Clonetics (#CC-2555, Walkersville, MD, EE.UU.). Todas las líneas de células se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del suministrador. Las células PC3, DU-145, LNCaP y PrEc se sembraron a razón de 3 x 10^{5} células/ml de medio de crecimiento en microplacas de 6 pocillos con fondo plano y se dejaron proliferar durante 24 h a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO_{2}. Al cabo de 24 h, se reemplazó el medio de cultivo con un medio de crecimiento que contenía M-DNA o MCC.

Ejemplo 5 Inhibición de la proliferación del cáncer de próstata por MCC

La proliferación celular se determinó utilizando reducción con bromuro de dimetiltiazoldifeniltetrazolio (MTT) (Mosman et al., J. of Immunol. Meth. 65:55, 1983).

Las células de cáncer de próstata PC3, DU-145 y LNCaP y las células epiteliales de próstata PrEc se incubaron con 0, 0,01, 0,10, 1, 10 y 100 \mug/ml de MCC. Después de 48 h, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de MTT en 5 mg/ml de solución salina tamponada con fosfato y se continuó la incubación durante 4 h. Se aspiró luego el medio de cada pocillo, se añadió 1 ml de alcohol isopropílico acidificado, y se solubilizó el MTT reducido por mezcla. La absorbencia del producto de reacción se determinó a 570 nm. MCC a 1, 10 y 100 \mug/ml inhibía la proliferación de las células de cáncer de próstata LNCaP dependientes de andrógenos y de las células de cáncer de próstata PC3 y DU-145 independientes de andrógenos, pero no inhibían la proliferación de las células de próstata normales PrEc (Fig. 1).

Estos datos demuestran que MCC inhibe la proliferación tanto de las células de cáncer de próstata independientes de andrógenos como de las dependientes de andrógenos en ausencia de células efectoras inmunes. MCC no inhibe la proliferación de las células de próstata normales.

Ejemplo 6 Inhibición de la proliferación de células de cáncer de próstata por M-DNA

Se incubaron células de cáncer de próstata PC3 y LNCaP con 10 y 100 \mug/ml de M-DNA. La proliferación de las células se determinó como en el Ejemplo 5. M-DNA a 10 y 100 \mug/ml inhibía la proliferación de las células de cáncer de próstata PC3 (Fig. 2). Estos datos demuestran que M-DNA inhibe la proliferación de las células de cáncer de próstata dependientes de andrógenos e independientes de andrógenos en ausencia de células efectoras inmunes.

Ejemplo 7 Inhibición de la proliferación de las células de cáncer de próstata por MCC y por MCC tratada con DNasa I

Se incubaron células de cáncer de próstata PC3 con 1 Unidad/ml de DNasa I, con 1 \mug/ml de MCC y con 1 \mug/ml de MCC tratada con DNasa I.

La DNasa I inhibía la proliferación de las células de cáncer PC3 aproximadamente 5%, MCC inhibía la proliferación de las células de cáncer PC3 aproximadamente un 50%, y MCC tratada con DNasa I inhibía la proliferación de las células de cáncer PC3 aproximadamente 30% (Fig. 3).

Estos datos demuestran que MCC inhibe la proliferación de las células de cáncer de próstata independientes de andrógenos en ausencia de células efectoras inmunes. Adicionalmente, estos datos demuestran que el tratamiento de MCC con DNasa I induce el efecto anti-proliferativo de MCC.

Ejemplo 8 Inducción de la apoptosis como se indica por cambios morfológicos

Los cambios morfológicos indicativos de la muerte celular por apoptosis incluyen la condensación de la cromatina nuclear, contracción celular, desintegración nuclear, formación de vesículas en la membrana plasmática y la formación de cuerpos fijados a la membrana (Wyllie et al. Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980).

Las células de cáncer de próstata PC3 se incubaron con 0 y con 200 \mug/ml de MCC durante 48 h. Las imágenes se recogieron sobre un microscopio óptico con un objetivo Apochromat de 40 x 2,5 NA. Las células incubadas con 0 \mug/ml de MCC exhibían morfología normal, mientras que las células incubadas con 200 \mug/ml de MCC exhibían cambios morfológicos llamativos indicadores de la muerte celular por apoptosis (Fig. 4).

Estos cambios demuestran que MCC induce apoptosis en células de cáncer de próstata independientes de andrógenos en ausencia de células efectoras inmunes.

Ejemplo 9 Inducción de apoptosis como se indica por fragmentación del DNA

La fragmentación del DNA celular en fragmentos de tamaño nucleosómico por la activación de endonucleasas endógenas es característica de las células que están sufriendo apoptosis (Wyllie A.H. Nature 284:555, 1981; Newell et al. Nature 357:286, 1990).

Durante el cultivo rutinario de monocapas de células PC3, un número considerable de células se desprendían de la superficie de plástico de los pocillos de cultivo de tejidos y flotaban en el medio (Palayoor et al., Radiation Res. 148:105, 1997). Después de 48 horas de tratamiento con MCC, la proporción de células desprendidas aumentaba. Por esta razón, se analizó la fragmentación del DNA tanto en las células PC3 desprendidas como en las fijadas (Smith et al. Nature 337:795, 1989).

Las células desprendidas se recogieron y se centrifugaron a 350 x G durante 5 min. El sedimento de células desprendidas y las células fijadas remanentes se lisaron en 50 \mul de tampón que contenía Tris-HCL 50 mM (pH 8,0), EDTA 10 mM, 0,5% (p/v) de lauril-sarcosinato de sodio (SDS) y 0,5 mg/ml de proteinasa K (Sigma-Aldrich Canadá, Oakville, Ontario) y a 55ºC durante 1 h. Se añadieron 10 \mul de RNasa A de 0,5 mg/ml (Sigma-Aldrich, Canadá) a cada muestra y se continuó la incubación durante 1 h. Las muestras se calentaron a 65ºC y se mezclaron con cada muestra 10 \mul de EDTA 10 mM (pH 8,0) que contenía 1% (p/v) de agarosa de temperatura de gelificación baja, 0,25% (p/v) de azul de bromofenilo y 40% (p/v) de sacarosa. Las muestras se sometieron a electroforesis a 100 V durante 3 h en un gel de agarosa al 2% que contenía tampón Tris-borato/EDTA (TBE). El DNA se visualizó bajo transiluminación UV utilizando tinción con bromuro de etidio.

Las células de cáncer de próstata PC3 desprendidas y fijadas se incubaron durante 48 h con 0 y 100 \mug/ml de MCC. Las células desprendidas tratadas con 100 \mug/ml de MCC mostraban una fragmentación significativa del DNA (Fig. 5, pistas 3 y 4), mientras que las células desprendidas tratadas con 0 \mug/ml de MCC no mostraban fragmentación alguna (Fig. 5, pista 1). Las células fijadas tratadas con 100 \mug/ml de MCC no mostraban fragmentación alguna (Fig. 5, pista 2).

Estos datos demuestran que MCC induce apoptosis, como se indica por la fragmentación del DNA, en células de cáncer de próstata desprendidas independientes de andrógenos en ausencia de células efectoras inmunes.

Ejemplo 10 Inducción de apoptosis como se indica por la liberación de NuMA

La inducción de apoptosis puede demostrarse también por la solubilización y liberación de la proteína de la matriz nuclear (NuMA). Se incubaron células de cáncer de próstata LNCaP durante 48 h con 0, 100, 200 y 300 \mug/ml de MCC, al mismo tiempo que se incubaban células de cáncer de próstata PC3 durante 48 h con 0, 100 y 300 \mug/ml de MCC. Se separó el medio por aspiración, se centrifugó a 10.000 x G y el sobrenadante se congeló a -20ºC hasta que se ensayó respecto a NuMA (Miller et al. Biotech. 15:1042, 1993).

Las células de cáncer de próstata LNCaP tratadas con 100, 200, o 300 \mug/ml de MCC liberaban 20%, 50% y 135% más, respectivamente, de proteínas NuMA al medio que las células tratadas con 0 \mug/ml de MCC (Fig. 6a). Las células de cáncer de próstata PC3 tratadas con 100 y 300 \mug/ml de MCC liberaban 24% más de proteínas NuMA al medio que las células tratadas con 0 \mug/ml de MCC (Fig. 6b). Estos datos demuestran que MCC induce apoptosis, como se indica por la liberación de NuMA, en células de cáncer de próstata independientes de andrógenos en ausencia de células efectoras inmunes.

Ejemplo 11 Efecto de MCC y M-DNA sobre la síntesis de IL-12 y TNF-\alpha por monocitos y células LNCaP

Se obtuvieron células monocíticas humanas THP-1 de la ATCC y se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del suministrador. Las células THP-1 (1 x 10^{6} células/ml) y las células LNCaP (3 x 10^{5} células/ml) se incubaron con 0, 0,1 y 10 \mug/ml de MCC durante 48 horas en 5% de CO_{2} en microplacas de 6 pocillos con fondo plano. Al cabo de 48 horas, se recogieron los sobrenadantes y se determinó la presencia de IL-12 y TNF-\alpha utilizando kits ELISA comerciales (Biosource, Camarillo, Ca, EE.UU.). MCC y M-DNA inducían la síntesis de IL-12 (Tabla 3) y TNF-\alpha (Tabla 4) por las células del sistema inmunitario, los monocitos THP-1, y por las células de tumor de próstata LNCaP. Se ha demostrado que las citoquinas IL-12 y TNF-\alpha poseen ambas actividad anti-neoplástica contra una gama de células de cáncer, con inclusión de las células de cáncer de próstata (Izquierdo et al., Anticancer Drugs 7:275, 1996; Sensibar et al., Cancer Res. 55:2431, 1995).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Inducción de IL-12 por MCC y M-DNA

3

TABLA 4 Inducción de TNF-\alpha por MCC y M-DNA

4

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12 Efectos de MCC, M-DNA y MCC tratada con DNasa I sobre tumores PC3 en ratones

Se implantan subcutáneamente células de cáncer de próstata PC3 independientes de andrógenos en 40 ratones BALB/c macho atímicos y se dejan proliferar hasta que son palpables (0,1 a 0,5 cm de diámetro). Los ratones se dividen en 4 grupos y se mide la masa del tumor en cada ratón. Los 10 ratones del Grupo 1 reciben cada uno solución salina. Los 10 ratones del Grupo 2 reciben cada uno solución salina que contiene MCC. Los 10 ratones del Grupo 3 reciben cada uno solución salina que contiene M-DNA. Los 10 ratones del Grupo 4 reciben cada uno MCC tratada con DNasa I. Después de 4 semanas de tratamientos intratumorales una vez por semana, se sacrifican los ratones y se determina la masa tumoral y el número de metástasis. Los ratones del Grupo 2 y del Grupo 3 tienen menos masa tumoral y menos metástasis que los ratones del Grupo 1 y el Grupo 4.

Ejemplo 13 Efectos de MCC y de M-DNA solos y en combinación con estramustina y etoposido sobre los tumores PC3 en los ratones

Se implantan subcutáneamente células de cáncer de próstata PC3 independientes de andrógenos en 60 ratones BALB/c macho atímicos y se dejan proliferar hasta que son palpables (0,1 a 0,5 cm de diámetro). Los ratones se dividen en 6 grupos y se mide la masa tumoral en cada ratón. Los 10 ratones del Grupo 1 reciben solución salina. Los 10 ratones del Grupo 2 reciben MCC en solución salina. Los 10 ratones del Grupo 3 reciben M-DNA en solución salina. Los 10 ratones del Grupo 4 reciben estramustina y etoposido en solución salina. Los 10 ratones del Grupo 5 reciben MCC en combinación con estramustina y etoposido en solución salina. Los 10 ratones del Grupo 6 reciben M-DNA en combinación con estramustina y etoposido en solución salina. Después de 4 semanas de tratamiento intra-tumoral una vez por semana, los ratones se sacrifican y se determina la masa tumoral y el número de metástasis. Los ratones del Grupo 1 tienen la mayor masa tumoral. Los ratones del Grupo 4 tienen menos masa tumoral que los ratones del Grupo 1. Los ratones del Grupo 2 y del Grupo 3 tienen menos masa tumoral que los ratones del Grupo 4. Los ratones del Grupo 5 y del Grupo 6 tienen la masa tumoral mínima.

Ejemplo 14 Efectos de MCC, M-DNA y MCC tratada con DNasa I sobre los tumores LNCaP en los ratones

Se implantan subcutáneamente células de cáncer de próstata LNCaP dependientes de andrógenos en 40 ratones BALB/c macho atímicos y se dejan proliferar hasta que son palpables (0,1 a 0,5 cm de diámetro). Los ratones se dividen en 4 grupos y se mide la masa tumoral en cada ratón. Los 10 ratones del Grupo 1 reciben cada uno solución salina. Los 10 ratones del Grupo 2 reciben cada uno solución salina que contiene MCC. Los 10 ratones del Grupo 3 reciben cada uno solución salina que contiene M-DNA. Los 10 ratones del Grupo 4 reciben cada uno MCC tratada con DNasa I. Después de 4 semanas de tratamiento intra-tumoral una vez por semana, los ratones se sacrifican y se determina la masa tumoral y el número de metástasis. Los ratones del Grupo 2 y del Grupo 3 tienen menos masa tumoral y menos metástasis que los ratones del Grupo 1 y el Grupo 4.

Ejemplo 15 Efectos de MCC y de M-DNA solos y en combinación con flutamida sobre los tumores LNCaP en los ratones

Se implantan subcutáneamente células de cáncer de próstata LNCaP dependientes de andrógenos en 60 ratones BALB/c macho atímicos y se dejan proliferar hasta que son palpables (0,1 a 0,5 cm de diámetro). Se dividen los ratones en 6 grupos y se mide la masa tumoral en cada ratón. Los 10 ratones del Grupo 1 reciben solución salina. Los 10 ratones del Grupo 2 reciben MCC en solución salina. Los 10 ratones del Grupo 3 reciben M-DNA en solución salina. Los 10 ratones del Grupo 4 reciben flutamida en solución salina. Los 10 ratones del Grupo 6 reciben MCC en combinación con flutamida en solución salina. Los 10 ratones del Grupo 6 reciben M-DNA en combinación con flutamida en solución salina. Después de 4 semanas de tratamiento intra-tumoral una vez a la semana, los ratones se sacrifican y se determinan la masa tumoral y el número de metástasis. Los ratones del Grupo 1 tienen la masa tumoral máxima. Los ratones del Grupo 4 tienen menos masa tumoral que los ratones del Grupo 1. Los ratones del Grupo 2 y del Grupo 3 tienen menos masa tumoral que los ratones del Grupo 4. Los ratones del Grupo 5 y del Grupo 6 tienen la masa tumoral mínima.

Claims

1. Uso de una composición que comprende M-DNA y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer de próstata.

2. Uso de una composición que comprende M-DNA protegido y complejado en la pared celular de M. phlei (MCC) y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer de próstata.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual el cáncer de próstata es cáncer de próstata sensible a las hormonas.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual el cáncer de próstata es cáncer de próstata insensible a las hormonas.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual se inhibe la proliferación de las células de cáncer en la próstata.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual se induce apoptosis en las células de cáncer en la próstata.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual se induce la síntesis de citoquinas por las células en la próstata.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual las citoquinas se seleccionan del grupo constituido por IL-12 y TNF-\alpha.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual las células en la próstata se seleccionan del grupo constituido por células del sistema inmunitario y células de cáncer de próstata.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual el vehículo farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo constituido por un vehículo sólido y un vehículo líquido.

11. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la composición comprende adicionalmente agentes anti-andrógenos, agentes quimioterapéuticos, agentes esteroidales o/y agentes inmunológicos.