ES2229792T3

ES2229792T3 - Composicion y metodo de quimioterapia.

Info

Publication number: ES2229792T3
Application number: ES99957794T
Authority: ES
Inventors: Nigel C. Phillips; Mario C. Filion
Original assignee: Bioniche Life Sciences Inc
Current assignee: Telesta Therapeutics Inc
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2005-04-16
Anticipated expiration: 2019-12-03
Also published as: AU782335B2; WO2000033875A1; ATE276766T1; CA2353905C; AU1541200A; PT1135161E; JP2002531524A; DE69920506D1; EP1135161A1; JP4380922B2; NZ511941A; EP1135161B1; CA2353905A1; DE69920506T2; DK1135161T3

Abstract

Uso de ADN de Mycobacterium phlei (M-ADN) y un agente quimioterapéutico (M-ADN + agente quimioterapéutico) para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un cáncer en un animal, en el que el agente quimioterapéutico se selecciona de entre el grupo que comprende agentes alquilantes de ADN, agentes antibióticos antitumorales y agentes antimetabólicos.

Description

Composición y método de quimioterapia.

Referencia cruzada a aplicaciones relacionadas

La presente aplicación reivindica prioridad a la solicitud de patente provisional US nº de serie 60/111.019 presentada el 4 de diciembre de 1998 y a la solicitud de patente provisional US nº de serie 60/127.320 presentada el 1 de abril de 1999.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición que comprende ADN de Mycobacterium phlei (M. phlei) (M-ADN), M-ADN conservado y complejado sobre pared celular de M. phlei (MCC) así como a un agente quimioterapéutico, en la que el M-ADN y MCC resultan eficaces para el tratamiento de cáncer y para potenciar el efecto antineoplásico del agente quimioterapéutico sobre el cáncer.

Antecedentes de la invención

El cáncer es una acumulación neta aberrante de células atípicas que resulta de un exceso de proliferación, una muerte celular insuficiente, o una combinación de las dos.

La proliferación es la culminación de una progresión celular a través del ciclo celular y se caracteriza por la replicación del ADN celular total y la división de una célula en dos células. Para la división celular, las células de mamíferos pasan por una serie organizada de eventos controlados, denominados ciclo celular. El comienzo de un evento durante la progresión del ciclo celular depende de la finalización con éxito de un evento anterior. El ciclo celular se puede dividir en 5 fases principales. Éstas son las fases Go, G_{1}, S, G_{2} y M. Durante la fase Go, las células son quiascentes. La mayoría de células del cuerpo, en cualquier momento, se encuentran en este estadio. Durante la fase G_{1}, las células, respondiendo a señales para dividirse, producen el ARN y las proteínas necesarias para la síntesis de ADN. Durante la fase S (SE, fase S temprana; SM, fase S media; y SL, fase S tardía) las células replican su ADN. Al final de la fase S, cada célula contiene el doble de su contenido en ADN original pero aún se encuentra unida por una membrana celular externa. Durante la fase G_{2}, se elaboran proteínas en preparación para la división celular. Durante la fase mitótica (M), la célula se divide en dos células hijas.

En todos los cánceres se producen alteraciones en la progresión del ciclo celular y pueden ser el resultado de una sobreexpresión de genes, la mutación de genes reguladores o la abrogación de los puntos de control del daño del ADN, y pueden modular la respuesta celular al tratamiento con agentes quimioterapéuticos (Hochhauser D. Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents, 1997).

La muerte celular es llevada a cabo por mediadores inmunes que inician procesos citolíticos y promueven la apoptosis, y a partir de inductores de apoptosis que inician directamente rutas que conducen a la muerte celular. La apoptosis es un proceso activo de muerte celular caracterizado por cambios morfológicos distintivos que incluyen la condensación de la cromatina, retracción celular, desintegración nuclear, formación de ampollas en la membrana plasmática, y la formación de cuerpos apoptóticos unidos a la membrana (Wyllie et al. Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980). Un indicador molecular de la apoptosis es la degradación del ADN nuclear de la célula en fragmentos de longitud oligonuclosomal como resultado de la activación de endonucleasas endógenas (Wyllie A. Nature 284-555, 1981).

Las caspasas se han implicado como enzimas clave en la etapa de ejecución de la apoptosis. La familia de las caspasas consiste en por lo menos catorce cisteína aspartato proteasas relacionadas. Todas las caspasas presentan un motivo pentapéptido conservado QACXG (donde X es R, Q ó G) (SEC ID nº 1) en el centro activo (Cohen G. Biochim Biophys. Acta 1366:139, 1997). Varias caspasas se sintetizan como proenzimas inactivos, que se activan tras el corte en sitios de corte específicos de aspartato (Cohen G. Biochim Biophys. Acta 1366:139, 1997) o como enzimas inactivos que requieren de la asociación con moléculas reguladoras para su activación (Stennicke et al. J. Biol. Chem. 274:8359, 1999). La activación del iniciador de procaspasa activa caspasas efectoras situadas corriente abajo iniciando la cascada de muerte celular (Pan et al., J. Biol. Chem. 273:5841, 1998; Earnshaw W. Nature 397:387, 1999).

Los agentes quimioterapéuticos utilizados más corrientemente presentan una citotoxicidad no específica. Muchos de estos agentes quimioterapéuticos presentan efectos secundarios tóxicos, resultan debilitantes y frecuentemente comprometen la calidad de vida del paciente. Además, las alteraciones en el transporte y metabolismo de los agentes quimioterapéuticos en las células cancerígenas resultan en el desarrollo de resistencia de las células cancerígenas a los agentes quimioterapéuticos.

Por lo tanto, existe una necesidad de nuevas composiciones y procedimientos que induzcan la detención del ciclo celular en células cancerígenas, que inhiban la proliferación de células cancerígenas, que induzcan la apoptosis en células cancerígenas y que potencien el efecto antineoplásico de los agentes quimioterapéuticos sobre células cancerígenas. Además, tales composiciones han de poder ser preparadas de forma fácil y relativamente económica, su actividad debe permanecer terapéuticamente estable a lo largo del tiempo y deben ser eficaces a regímenes de dosis que estén asociados con una toxicidad mínima incluso tras varias administraciones.

Sumario de la invención

La presente invención satisface las necesidades anteriores proporcionando una composición que comprende ADN de Mycobacterium phlei (M. phlei) (M-ADN), M-ADN conservado y complejado sobre pared celular de M. phlei (MCC), un agente quimioterapéutico y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el M-ADN y el MCC inducen la detención del ciclo celular en células cancerígenas, inhiben la proliferación de células cancerígenas, inducen la apoptosis en células cancerígenas y potencian el efecto antineoplásico del agente quimioterapéutico sobre células cancerígenas. Además, el M-ADN y el MCC se preparan de forma fácil y relativamente económica, su actividad es reproducible entre preparaciones, permanece terapéuticamente estable a lo largo del tiempo y resulta eficaz a regímenes de dosis que están asociados con una toxicidad mínima incluso tras varias administraciones.

Para preparar MCC, se cultiva M. phlei en medio líquido y se recoge. Se realiza la disrupción de los M. phlei, y se recogen los componentes sólidos de M. phlei mediante sedimentación por centrifugación. Los componentes sólidos se desproteinizan, se deslipidizan y se lavan. Todos los reactivos se seleccionan para favorecer la conservación del ADN durante la preparación del MCC. El M-ADN se prepara a partir del MCC o directamente a partir de M. phlei. De nuevo, todos los reactivos se seleccionan para favorecer la conservación del ADN durante la preparación del M-ADN.

Una composición que comprende M-ADN, MCC, M-ADN + agente quimioterapéutico o MCC + agente quimioterapéutico se administra a un animal que sufre un cáncer, incluyendo un humano, en una cantidad eficaz para tratar el cáncer en el animal. La capacidad inesperada y sorprendente del M-ADN y del MCC para inducir la detención del ciclo celular en células cancerígenas, para inhibir la proliferación de células cancerígenas, para inducir la apoptosis en células cancerígenas y para potenciar el efecto antineoplásico de los agentes quimioterapéuticos sobre células cancerígenas da respuesta a una necesidad largamente considerada e insatisfecha en el arte médico y proporciona un beneficio importante para los animales, incluyendo humanos.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que induzca la detención del ciclo celular en células cancerígenas.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que inhiba la proliferación de células cancerígenas.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que potencie el efecto antineoplásico de un agente quimioterapéutico sobre células cancerígenas.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que potencie el efecto de un agente quimioterapéutico sobre células cancerígenas mediante la sincronización del ciclo celular de las células cancerígenas.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que potencie el efecto de un agente quimioterapéutico sobre la proliferación de células cancerígenas.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que resulte eficaz para tratar el cáncer en un animal, incluyendo un humano.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que potencie el efecto antineoplásico de un agente quimioterapéutico en el tratamiento del cáncer en un animal, incluyendo un humano.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que resulte eficaz para eliminar el cáncer en un animal, incluyendo un humano.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que potencie el efecto antineoplásico de un agente quimioterapéutico en la eliminación del cáncer en un animal, incluyendo un humano.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que induzca la detención del ciclo celular en las células de un melanoma maligno.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que inhiba la proliferación de las células de un melanoma maligno.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que potencie el efecto antineoplásico de un agente quimioterapéutico sobre las células de un melanoma maligno.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que potencie el efecto antineoplásico de un agente quimioterapéutico sobre la detención del ciclo celular en las células de un melanoma maligno.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que potencie el efecto antineoplásico de un agente quimioterapéutico sobre la proliferación de las células de un melanoma maligno.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que induzca la apoptosis en las células de un melanoma maligno.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que active las caspasas en las células de un melanoma maligno.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que resulte eficaz para tratar un melanoma maligno en un animal, incluyendo un humano.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que potencie el efecto antineoplásico de un agente quimioterapéutico en el tratamiento de un melanoma maligno en un animal, incluyendo un humano.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que resulte eficaz para eliminar el melanoma maligno en un animal, incluyendo un humano.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que potencie el efecto antineoplásico de un agente quimioterapéutico en la eliminación de un melanoma maligno en un animal, incluyendo un humano.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que potencie el efecto de la radiación en el tratamiento del cáncer en un animal, incluyendo un humano.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que potencie el efecto de la radiación en la eliminación del cáncer en un animal, incluyendo un humano.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que potencie el efecto de la radioterapia sobre células cancerígenas mediante la sincronización del ciclo celular de las células cancerígenas.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que pueda ser preparada en grandes cantidades.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que resulte relativamente económica de preparar.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que presente una actividad reproducible entre preparaciones.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que permanezca estable a lo largo del tiempo.

Estos y otros objetivos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes tras una revisión de la siguiente descripción detallada de la forma de realización dada a conocer y las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1. Inhibición de la división de células de melanoma B-16 por MCC, M-ADN, M-ADN sonicado y ADN de esperma de arenque.

Fig. 2. Inhibición de la división de células del melanoma B-16 por mitomicina-C, MCC y mitomicina-C + MCC.

Fig. 3. Inhibición de la división de células de melanoma B-16 por 5-fluorouracilo, MCC y 5-fluorouracilo + MCC.

Fig. 4. Inhibición de la división de células de melanoma B-16 por cisplatino, MCC y cisplatino+ MCC.

Fig. 5. Evaluación de la fase S de células de melanoma B-16 (A) y evaluación de la fase S de células de melanoma B-16 después del tratamiento con MCC (B).

Fig. 6. Inducción de la apoptosis en células de melanoma B-16 por MCC y M-ADN.

Fig. 7. Inducción de la actividad de la caspasa-1 en células de melanoma B-16 por MCC.

Fig.8. Citotoxicidad de MCC.

Descripción detallada de la invención

La presente invención es una composición que comprende ADN de Mycobacterium phlei (M. phlei) (M-ADN), M-ADN conservado y complejado sobre pared celular de M. phlei (MCC), un agente quimioterapéutico y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el M-ADN y el MCC inducen la detención del ciclo celular en células cancerígenas, inhiben la proliferación de células cancerígenas, inducen la apoptosis en células cancerígenas y potencian el efecto antineoplásico del agente quimioterapéutico sobre células cancerígenas. El M-ADN y MCC se preparan de forma fácil y relativamente económica, su actividad es reproducible entre preparaciones, permanece terapéuticamente estable a lo largo del tiempo y resulta eficaz a regímenes de dosis que están asociados con una toxicidad mínima incluso tras varias administraciones.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "M-ADN" incluye ADN aislado directamente a partir de M. phlei y ADN aislado a partir de MCC preparado a partir de M. phlei.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "MCC" es M-ADN conservado y complejado sobre pared celular de M. phlei desproteinizada y deslipidizada.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "agente quimioterapéutico" es cualquier agente aprobado por una agencia reguladora del gobierno de un país o estado o inscrito en la Pharmacopoeia de US u otra pharmacopoeia reconocida generalmente para la utilización en el tratamiento de cáncer en un animal, incluyendo un humano.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "antineoplásico" se refiere a la prevención del desarrollo, maduración, proliferación y propagación de células cancerígenas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "que potencia" se refiere a un grado de sinergismo que es mayor que aditivo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "sinergismo" se refiere a la acción coordinada de dos o más agentes quimioterapéuticos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "que intensifica" se refiere a la acción aditiva de dos o más agentes quimioterapéuticos.

Los procedimientos para incrementar la eficacia terapéutica del M-ADN y MCC incluyen, pero no se limitan a, aportar químicamente o amplificar biotecnológicamente secuencias estimuladoras o confirmaciones de M-ADN y complejar el M-ADN, MCC, M-ADN + agente quimioterapéutico y MCC + agente quimioterapéutico a vehículos naturales o sintéticos. Opcionalmente, en el M-ADN y el MCC se pueden incluir agentes que incluyen, pero no se limitan a, agentes inmunológicos y agentes de unión a un receptor.

El M-ADN, MCC, M-ADN + agente quimioterapéutico y MCC + agente quimioterapéutico se administran en un vehículo farmacéuticamente aceptable, incluyendo, pero sin limitarse a, un vehículo líquido y un vehículo sólido. Los vehículos líquidos son vehículos acuosos, vehículos no-acuosos o ambos, e incluyen, pero no se limitan a, suspensiones acuosas, emulsiones de aceite, emulsiones de agua en aceite, emulsiones de agua-en-aceite-en-agua, emulsiones específicas de lugar, emulsiones de larga residencia, emulsiones adherentes, microemulsiones, nanoemulsiones y liposomas. Los vehículos sólidos son vehículos biológicos, vehículos químicos o ambos e incluyen, pero no se limitan a, micropartículas, nanopartículas, microesferas, nanoesferas, minibombas, extractos de pared celular bacteriana y polímeros naturales o sintéticos biodegradables o no biodegradables que permiten una liberación prolongada del M-ADN, MCC, M-ADN + agente quimioterapéutico o MCC + agente quimioterapéutico. Tales polímeros pueden ser implantados en la proximidad de la zona donde se requiere la liberación. Los polímeros y su utilización se describen en, por ejemplo, Brem et al., J. Neurosurg. 74:441-446 (1991).

Entre los vehículos acuosos preferidos se incluyen, pero no se limitan a, agua exenta de DNasa, solución salina exenta de DNasa y tampones fisiológicamente aceptables exentos de DNasa. Entre los vehículos no acuosos preferidos se incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral o aceite neutro incluyendo, pero sin limitarse a, un diglicérido, un triglicérido, un fosfolípido, un lípido, un aceite y mezclas de los mismos, en los que el aceite contiene una mezcla apropiada de ácidos grasos poliinsaturados y saturados. Entre los ejemplos se incluyen, pero no se limitan a, aceite de soja, aceite de canola, aceite de palma, aceite de oliva y migliol, en los que el número de carbonos de los ácidos grasos se encuentra comprendido entre 12 y 22 y en los que los ácidos grasos pueden ser saturados o insaturados. Opcionalmente, el lípido o fosfolípido cargado se puede suspender en el aceite neutro.

En un ejemplo, el M-ADN se suspende en agua estéril exenta de DNasa y se sonica a un rendimiento del 20% durante 5 minutos (Sonicador Modelo W-385, Heat Systems-Ultrasonics Inc). Opcionalmente, el M-ADN sonicado se homogeniza por microfluidización a 15.000-30.000 psi a través de un flujo (Modelo M-110Y; Microfluidics, Newton, MA) y se transfiriere a una recipiente con tapa autoclavado para guardarlo a 4ºC.

En un ejemplo, se añade fosfatidilcolina exenta de DNasa al triglicérido de aceite de soja exento de DNasa en una proporción de 1 gramo de fosfolípido por 20 ml de triglicérido y se disuelve mediante calentamiento suave a 50-60ºC. Se añaden varios gramos de MCC a un recipiente autoclavado seco y se añade la solución de fosfolípido-triglicérido a una concentración de 20 ml por gramo de MCC. La suspensión se incuba a 20ºC durante 60 min y seguidamente se mezcla con PBS exento de DNasa en una proporción de 20 ml de la suspensión de MCC por litro de PBS exento de DNasa. La mezcla se sonica a un rendimiento del 20% durante 5 minutos (Sonicador Modelo W-385, Heat Systems-Ultrasonics Inc). Opcionalmente, la mezcla sonicada de MCC se homogeniza por microfluidización a 15.000-30.000 psi a través de un flujo (Modelo M-110Y; Microfluidics) y se transfiriere a un recipiente con tapa autoclavado para guardarla a 4ºC.

Se puede añadir un agente quimioterapéutico al M-ADN o al MCC antes, durante o después de la sonicación o microfluidización o antes o después de guardarlo. Adicionalmente, se pueden utilizar otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica para preparar ácidos desoxirribonucleicos, extractos de pared celular bacteriana y agentes quimioterapéuticos para la administración a un animal, incluyendo un humano.

Además, el M-ADN, MCC, M-ADN + agente quimioterapéutico y MCC + agente quimioterapéutico pueden ser utilizados con cualquiera, todos o cualquier combinación de excipientes independientemente del vehículo utilizado para presentar la composición a las células de respuesta. Entre estos excipientes se incluyen, pero no se limitan a, antioxidantes, tampones y bacteriostáticos, y pueden incluir agentes de suspensión, agentes espesantes y agentes estabilizantes. Entre los agentes estabilizantes se incluyen, pero no se limitan a, polímeros no-iónicos e iónicos tales como, por ejemplo, monooleato polioxietilenosorbitán (Tween) o ácido hialurónico.

El M-ADN, MCC, M-ADN + agente quimioterapéutico y MCC + agente quimioterapéutico se administran a un animal con cáncer en una cantidad eficaz para inducir la detención del ciclo celular, inhibir la proliferación de las células cancerígenas, inducir la apoptosis en las células cancerígenas y potenciar el efecto antineoplásico del agente quimioterapéutico sobre células cancerígenas. El agente quimioterapéutico se puede administrar antes, al mismo tiempo, o después de la administración del M-ADN o del MCC. El agente quimioterapéutico utilizado, así como la cantidad de M-ADN, MCC y agente quimioterapéutico administrada por dosis, el número de dosis y la programación de dosis, dependerán del tipo de cáncer, la severidad del cáncer, la localización del cáncer y otros factores clínicos tales como el tamaño, peso y condición física del receptor y de la vía de administración y pueden ser determinados por el médico practicante utilizando técnicas clínicas estándar y sin experimentación indebida. Adicionalmente, se pueden utilizar opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar rangos óptimos para la administración de M-ADN, MCC M-ADN + agente quimioterapéutico y MCC + agente quimioterapéutico.

Preferentemente, la cantidad de M-ADN administrada se encuentra entre aproximadamente 0,00001 y 500 mg/Kg por dosis, más preferentemente entre aproximadamente 0,0001 y 100 mg/kg por dosis, y aún más preferentemente entre aproximadamente 0,001 y 40 mg/kg por dosis. Preferentemente, la cantidad de MCC administrada se encuentra entre aproximadamente 0,00001 y 500 mg/Kg por dosis, más preferentemente entre aproximadamente 0,0001 y 100 mg/kg por dosis, y aún más preferentemente entre aproximadamente 0,001 y 40 mg/kg por dosis. Preferentemente, el contenido en M-ADN del MCC se encuentra entre aproximadamente 0,001 y 90 mg/100 mg de MCC seco, más preferentemente entre aproximadamente 0,01 y 40 mg/100 mg de MCC seco, y aún más preferentemente entre aproximadamente 0,1 y 30 mg/100 mg de MCC seco. El contenido en proteína del MCC debe ser inferior a aproximadamente 20 mg/100 mg de MCC seco y el M-ADN extraíble debe ser inferior a aproximadamente el 4,5% del peso seco de MCC.

Los agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes de ADN, agentes antibioticos y antimetabólicos antitumorales.

Entre los agentes alquilantes de ADN se incluyen, pero no se limitan a, nitrosureas, agentes de metales pesados y agentes de entrecruzamiento; entre los agentes antibióticos antitumorales se incluyen, pero no se limitan a, mitomicina-C; entre los agentes antimetabólicos se incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo y metotrexato; entre los agentes inhibidores de topoisomerasa se incluyen, pero no se limitan a, CPT-11; entre los agentes estabilizantes de tubulina se incluyen, pero no se limitan a, taxol; entre los agentes desestabilizantes de tubulina se incluyen, pero no se limitan a, vincristina y vinblastina; y, entre los agentes antagonistas de hormonas se incluyen, pero no se limitan a, tamoxifeno.

Preferentemente, la cantidad de agente quimioterapéutico administrada por dosis se encuentra entre aproximadamente 0,0001 y 1000 mg/m^{2} o entre aproximadamente 0,0001 y 1000 mg/kg, más preferentemente entre aproximadamente 0,5 y 70 mg/m^{2} o entre aproximadamente 0,5 y 70 mg/kg y aún más preferentemente entre aproximadamente 1 y 50 mg/m^{2} o entre aproximadamente 1 y 50 mg/kg.

Entre las vías de administración de la composición de la presente invención se incluyen, pero no se limitan a, oral, tópica, subcutánea, transdérmica, subdérmica, intra-muscular, intraperitoneal, intraarticular, intravesical, intraarterial, intravenosa, intradérmica, intracraneal, intralesional, intratumoral, intraocular, intrapulmonar, intraespinal, disposición en cavidades del cuerpo, inhalación nasal, inhalación pulmonar, impresión en la piel y electrocorporación. Dependiendo de la vía de administración, el volumen por dosis se encuentra preferentemente entre aproximadamente 0,001 y 500 ml por dosis, más preferentemente entre aproximadamente 0,01 y 100 ml por dosis y aún más preferentemente entre aproximadamente 0,1 y 50 ml por dosis.

Los ejemplos siguientes servirán para ilustrar la presente invención, sin, al mismo tiempo, no obstante, constituir una limitación de la misma. Por el contrario, se entenderá claramente que se puede recurrir a otras formas de realización, modificaciones y equivalentes de la misma que, tras leer esta descripción, pueden sugerir los expertos en la técnica sin salir del espíritu de la presente invención y/o el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 Preparación de M-ADN y MCC a partir de M. phlei

Se preparó M-ADN y MCC a partir de M. phlei (cepa 110) tal como se describe en la solicitud de patente internacional nº PCT/CA98/00744, la cual se incluye en la presente memoria como referencia. Todos los reactivos se seleccionaron para favorecer la conservación del ADN. A menos que se indique lo contrario, el M-ADN y MCC se resuspendieron en agua exenta de DNasa o en un tampón exento de DNasa farmacéuticamente aceptable y se sonicaron a un rendimiento del 20% durante 5 minutos (Sonicador Modelo W-385, Heat Systems-Ultrasonics, Inc). El M-ADN y MCC no contenían endotoxinas tal como se determinó utilizando un kit de lisado de amebócitos de Limulus QCL-1000 (BioWhittaker, Walkersville, MD).

Para el tratamiento con DNasa, el M-ADN y MCC se digirieron con 1 unidad internacional de DNasa I exenta de RNasa (Life Technologies) durante 1 hora a 25ºC en Tris HCl 20 mM, pH 8,4, MgCl_{2} 2 mM y KCl 50 mM. La DNasa I se activó mediante la adición de EDTA hasta una concentración final de 2,5 mM y calentando durante 10 minutos a 65ºC. La DNasa I digiere tanto el ADN de doble cadena como el de cadena simple y proporciona una degradación casi total del ADN.

Ejemplo 2 Preparación de ADN micobacteriano (B-ADN) y de ADN micobacteriano conservado y complejado sobre pared celular micobacteriana (BCC) a partir de especies distintas a M. phlei

Se preparó BCC y B-ADN a partir de especies micobacterianas incluyendo, pero sin limitarse a, M. vaccae, M. chelonei, M. smegmatis, M. terrae, M. duvalii, M. tuberculosis, M. bovis BCG, M. avium, M. Szulgai, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. kansaii, M. gastr, M. fortuitous y M.asiaticum tal como en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3 Células y reactivos

Células de leucemia celular humana Jurkat T (Jurkat), células de leucemia promielocítica humana HL60 (HL-60), células de leucemia promielocítica humana resistentes a mitoxantrona HL-60MX1 (HL-60MX1), células de linfoma murino EL-4 (EL-4), y células de melanoma murino B-16 se obtuvieron a partir del American Type Tissue Culture Collection (ATCC Rockville, MD, USA) y se cultivaron en el medio recomendado por el ATCC a menos que se indique lo contrario, las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos de fondo plano a concentraciones comprendidas entre 5 x 10^{3} y 1 x 10^{6} células/ml y se mantuvieron a 37ºC durante entre 24 y 72 horas.

La mitomicina-C, 5-fluorouracilo, cisplatino, metotrexato y el ADN de esperma de arenque se obtuvieron a partir de Sigma Aldrich Canada (Oakville, Ontario, Canadá).

Ejemplo 4 Análisis del ciclo celular

El estadio del ciclo celular se determinó utilizando un kit comercial CYCLETEST^{TM} PLUS DNA (Becton Dickinson, San José, CA, USA). Brevemente, se obtuvieron núcleos de células tratadas disolviendo la membrana plasmática con un detergente no iónico, eliminando el citoesqueleto celular y las proteínas nucleares con tripsina, digiriendo el ARN celular con RNasa y estabilizando la cromatina nuclear con espermina. Se añadió ioduro de propidio a los núcleos celulares y se analizó su fluorescencia en un citómetro de flujo equipado con capacidad de discriminación electrónica de dobletes (FACSCalibur, Becton Dickinson). La acumulación de células en las fases GO/G_{1}, S (SE, SM, SL) o G_{2}/M del ciclo celular se analizó utilizando un software MODFIT LT (Verity Software House Inc., Topsham, MA, USA). Los resultados se expresan como el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular.

Ejemplo 5 Sincronización de las poblaciones celulares con metotrexato

Para sincronizar las poblaciones celulares, las células en crecimiento exponencial se incubaron en un medio de cultivo de tejidos que contenía entre 0,04 y 0,16 \muM de metotrexato (MTX) durante 20 horas. Se eliminó el medio MTX, las células se lavaron extensamente con tampón fosfato salino (PBS), se añadió medio nuevo, se continuó la incubación durante 8 horas y se realizó el análisis del ciclo celular tal como en el Ejemplo 4.

Ejemplo 6 Inducción de la detención del ciclo celular por MCC en células cancerígenas en división sincrónica

Células en crecimiento exponencial de tipo Jurkat, HL-60, HL-60MX1 y EL-4, a 1 x 10^{6} células/ml, y células B-16, a 3 x 10^{5} células/ml, se prepararon para el análisis como en el Ejemplo 5 con 0,10 y 100 \mug/ml de MCC en el medio MTX.

La tabla 1 muestra que el MCC, tanto a 10 como a 100 \mug/ml induce la detención en la fase SL + G_{2}M del ciclo celular en células cancerígenas Jurkat, HL-60, HL-60MX1, EL-4 y B-16 en división sincrónica. La acumulación de células en la fase SL+G_{2}M iba acompañada de una reducción de células en la fase GO/G_{1}+SE o en las fases GO/G_{1}+SE y SM del ciclo celular.

TABLA 1 Inducción de la detención del ciclo celular por MCC en células cancerígenas en división sincrónica

1

^{a}0,08 \muM, ^{b}0,16 \muM ó ^{c}0,04 \muM

Estos datos demuestran que el MCC induce la detención del ciclo celular en células cancerígenas en división sincrónica, incluyendo células cancerígenas HL-60 MX1, que presentan una resistencia atípica a agentes quimioterapéuticos, alteración de la actividad catalítica de la topoisomerasa II y niveles reducidos de las proteínas topoisimerasa II alfa y beta (Harker et al., Cancer Res. 49:4542-4549, 1989).

Ejemplo 7 Inducción de la detención del ciclo celular por MCC y MCC tratado con DNasa I en células leucémicas Jurkat en división sincrónica

Células leucémicas Jurkat en crecimiento exponencial, a 1 x 10^{6} células/ml, se prepararon para el análisis como en el Ejemplo 5 con 0 y 10 \mug/ml de MCC y 10 \mug/ml de MCC tratado con DNasa I en el medio MTX.

La tabla 2 muestra que el MCC inducía la detención en la fase SL+G_{2}M del ciclo celular en células Jurkat sincronizadas. La acumulación de células en la fase SL+G_{2}M iba acompañada de una reducción de células en la fase GO/G_{1}+SE o en las fases GO/G_{1}+SE y SM del ciclo celular. La tabla 2 también muestra que el MCC tratado con DNasa I no inducía la detención del ciclo celular en células Jurkat en división sincrónica.

TABLA 2 Inducción de la detención del ciclo celular por MCC y por MCC tratado con DNasa I en células Jurkat en división sincrónica

2

El MCC es M-ADN conservado y complejado sobre pared celular de M. phlei y la DNasa I digiere el M-ADN del MCC. Por lo tanto, el hecho que el MCC tratado con DNasa I no induzca la detención en células leucémicas Jurkat en división sincrónica demuestra la importancia del M-ADN para la inducción por MCC de la detención del ciclo celular en células cancerígenas en división.

Ejemplo 8 Inducción de la detención del ciclo celular en células cancerígenas por MCC

Células en crecimiento exponencial de tipo Jurkat, HL-60, HL-60MX1 y EL-4, a 1 x 10^{6} células/ml, y células B-16, a 3 x 10^{5} células/ml, se prepararon para el análisis como en el Ejemplo 5 en ausencia de MTX y en presencia de 0,10 y 100 \mug/ml de MCC.

La tabla 3 muestra que el MCC, tanto a 10 como a 100 \mug/ml inducía la detención en la fase SL+G_{2}M del ciclo celular en células Jurkat, HL-60, HL-60MX1, EL-4 y B-16 en división asincrónica. La acumulación de células en la fase SL+G_{2}M iba acompañada de una reducción de células en la fase GO/G_{1}+SE o en las fases GO/G_{1}+SE y SM del ciclo celular.

TABLA 3 Inducción de la detención del ciclo celular por MCC en células cancerígenas en división asincrónica

3

El MCC inducía la detención del ciclo celular en células cancerígenas en división asincrónica, incluso en células cancerígenas HL-60MX1, que presentan una multiresistencia atípica a agentes quimioterapéuticos, alteración de la actividad catalítica de la topoisomerasa II y niveles reducidos de las proteínas topoisomerasa II alfa y beta (Harker et al., Cancer Res. 49:4542-4549, 1989).

Ejemplo 9 Inducción de la detención del ciclo celular en células leucémicas Jurkat por M-ADN, MCC y MCC tratado con

\hbox{DNasa I}

Células leucémicas Jurkat en crecimiento exponencial, a 1 x 10^{6} células/ml, se prepararon para el análisis como en el Ejemplo 5 en ausencia de MTX y en presencia de 200 \mug/ml de M-ADN, 10 \mug/ml de MCC y 10 \mug/ml de MCC tratado con DNasa I.

La tabla 4 muestra que tanto el M-ADN como el MCC inducían la detención en la fase SL+G_{2}M del ciclo celular en células Jurkat en división asincrónica. La acumulación de células en la fase SL+G_{2}M iba acompañada de una reducción de células en las fases GO/G_{1}+SE y SM del ciclo celular. La tabla 3 también muestra que, después del tratamiento con DNasa I, el MCC inducía menos detención del ciclo celular en células Jurkat en división asincrónica.

TABLA 4 Inducción de la detención del ciclo celular por M-ADN, MCC y MCC tratado con DNasa I en células leucémicas Jurkat en división asincrónica

4

El M7,3-ADN y el MCC inducían la detención del ciclo celular en células Jurkat en división asincrónica. El MCC es M-ADN conservado y complejado sobre pared celular de M. phlei y la DNasa I digiere el M-ADN del MCC. Por lo tanto, el hecho que el MCC tratado con DNasa I induzca una detención menor en células leucémicas Jurkat en división asincrónica demuestra de nuevo la importancia del M-ADN para la inducción por MCC de la detención del ciclo celular en células cancerígenas en división.

Ejemplo 10 Inhibición de la proliferación de células de melanoma B-16 por MCC, M-ADN, M-ADN sonicado y ADN de esperma de arenque

Células de melanoma B-16 en crecimiento exponencial, a 3 x 10^{5} células/ml, se prepararon para el análisis como en el Ejemplo 5 en ausencia de MTX y en presencia de entre 1 y 100 \mug/ml de MCC, M-ADN o M-ADN sonicado durante 20 minutos en hielo en un procesador de ultrasonidos Modelo W-38 (HeatSystems-Ultrasonics, Inc.) para reducir la longitud de oligonucleótidos, y DNA de esperma de arenque.

Tal como se muestra en la figura 6, a 1 \mug/ml, el MCC inhibía la proliferación aproximadamente un 25%, el M-ADN aproximadamente un 5%, el M-ADN sonicado aproximadamente un 10% y el DNA de esperma de arenque un 0%. A 10 \mug/ml, el MCC inhibía la proliferación aproximadamente un 50%, el M-ADN aproximadamente un 30%, el M-ADN sonicado aproximadamente un 25% y el DNA de esperma de arenque un 0%. A 100 \mug/ml, el MCC inhibía la proliferación aproximadamente un 80%,el M-ADN y el M-ADN sonicado aproximadamente un 50% y el DNA de esperma de arenque aproximadamente un 5%.

Cada uno de MCC, M-ADN y M-ADN sonicado inhibían la proliferación de células de melanoma B-16 en división asincrónica, mientras que el DNA de esperma de arenque no inhibía la proliferación de células de melanoma B-16 en división asincrónica.

Ejemplo 11 Inhibición de la proliferación de células de melanoma B-16 por agentes quimioterapéuticos + MCC

El melanoma maligno se encuentra entre los cánceres más refractarios a la quimioterapia y muchos agentes quimioterapéuticos no parecen modificar el pronóstico de esta enfermedad. Las líneas celulares derivadas de melanoma también demuestran una resistencia significativa a la mayoría de agentes quimioterapéuticos, sugiriendo la presencia de resistencia celular intrínseca. Esta resistencia puede estar mediada por mecanismos incluyendo, pero sin limitarse a, P-glicoproteína, proteína del sistema glutationa/glutationa S-transferasa asociada a la multiresistencia a agentes terapéuticos, N-Ras mutada, oncogenes Bcl-2 y p53 y enzima topoisomerasa II (Serrone et al., Melanoma Res. 9:51, 1999).

Células de melanoma B-16, a 3 x 10^{5} células/ml, se incubaron durante 72 h con los agentes quimioterapéuticos mitomicina-C, 5-fluorouracilo y cisplatino en ausencia y en presencia de MCC. La proliferación celular se determinó utilizando la reducción de bromuro de dimetiltiazol-difeniltretazolio (MTT) (Mosman et al. Journal of Immunological Methods 65:55-63, 1983). Después de 72 h, a cada pocillo se le añadieron 20 \mul de MTT en medio de cultivo y se incubó durante 3 h. Seguidamente se aspiró el medio de cada pocillo, se añadieron 100 \mul de alcohol isopropílico acidificado a cada muestra y el MTT reducido se solubilizó mezclando. La absorbancia del producto de reacción se determinó utilizando un lector de microplacas ELISA a una longitud de onda de 570 nm.

Las células de melanoma B-16 se incubaron con entre 0,01 y 100 \mug/ml de mitomicina-C, con entre 1 y 100 \mug de MCC y con entre 0,01 y 10 \mug/ml de mitomicina-C + 1 \mug/ml de MCC.

La mitomicina-C es un antibiótico antitumoral sintetizado por Streptomyces caespitosus, el cual entrecruza el ADN, despolimeriza el ADN y forma radicales libres.

La figura 2 muestra que con células B-16, 0,1 \mug/ml de mitomicina-C inhibían la proliferación aproximadamente un 5%, 1 \mug/ml aproximadamente un 10%, y 10 y 100 \mug/ml un 100%, mientras que 1 \mug/ml de MCC inhibía la proliferación aproximadamente un 25%, 10 \mug/ml aproximadamente un 50%, y 100 \mug/ml aproximadamente un 80%. La figura 2 también muestra que, en presencia de 1 \mug/ml de MCC, 0,1 \mug/ml de mitomicina-C inhibían la proliferación aproximadamente un 40%, 1 \mug/ml aproximadamente un 65% y 100 \mug/ml un 100%. Estos datos muestran que el MCC potencia el efecto antineoplásico de la mitomicina-C sobre células cancerígenas en proliferación.

Células de melanoma B-16 se incubaron con entre 0,01 y 100 \mug/ml de 5-fluorouracilo, con entre 1 y 100 \mug de MCC y con entre 0,01 y 10 \mug/ml de 5-fluorouracilo + 1 \mug/ml de MCC. El 5-fluorouracilo es un antimetabólico que interfiere con la síntesis de ADN y ARN.

La figura 3 muestra que con células B-16, 0,01 \mug/ml de 5-fluorouracilo inhibían la proliferación aproximadamente un 8%, 0,1 \mug/ml aproximadamente un 50%, 1 \mug/ml aproximadamente un 90% y 10 y 100 \mug/ml un 100%, mientras que 1 \mug/ml de MCC inhibía la proliferación aproximadamente un 25%, 10 \mug/ml aproximadamente un 50%, y 100 \mug/ml aproximadamente un 80%. La figura 3 también muestra que, en presencia de 1 \mug/ml de MCC, 0,01 \mug/ml de 5-fluorouracilo inhibían la proliferación aproximadamente un 75%, 0,1 \mug/ml aproximadamente un 85%, 1 \mug/ml aproximadamente un 90% y 10 \mug/ml un 100%. Estos datos muestran que el MCC potencia el efecto antineoplásico del 5-fluorouracilo sobre células cancerígenas en proliferación.

Células de melanoma B-16 se incubaron con entre 0,01 y 100 \mug/ml de cisplatino, con entre 1 y 100 \mug de MCC y con entre 0,01 y 10 \mug/ml de cisplatino + 1 \mug/ml de MCC. El cisplatino es una gente alquilante que entrecruza el ADN e inhibe los precursores de ADN.

La figura 4 muestra que, con células B-16, 0,01 \mug/ml de cisplatino inhibían la proliferación un 0%, 0,1 \mug/ml aproximadamente un 8%, 1 \mug/ml aproximadamente un 62%, 10 \mug/ml aproximadamente un 90% y 100 \mug/ml un 100%, mientras que 1 \mug/ml de MCC inhibía la proliferación aproximadamente un 25%, 10 \mug/ml aproximadamente un 50% y 100 \mug/ml aproximadamente un 80%. La figura 4 también muestra que, en presencia de 1 \mug/ml de MCC, 0,01 \mug/ml de cisplatino inhibían la proliferación aproximadamente un 40%, 0,1 \mug/ml aproximadamente un 50%, 1 \mug/ml aproximadamente un 70% y 10 \mug/ml aproximadamente un 90%. Estos datos muestran que el MCC intensifica el efecto antineoplásico del cisplatino sobre células cancerígenas en proliferación.

La tabla 5 muestra las concentraciones de la mitomicina-C, 5-fluorouracilo y cisplatino necesarias para una inhibición del 50% de la división de células de melanoma B-16 en ausencia y presencia de 1 \mug/ml de MCC.

TABLA 5 Concentración de mitomicina-C, 5-fluorouracilo y cisplatino necesaria para una inhibición del 50% de la proliferación de células de melanoma B-16 en ausencia y presencia de 1 \mug/ml de MCC

5

* concentración para una inhibición del 50%

La tabla 5 muestra la inhibición dependiente de dosis de la proliferación de células de melanoma B-16 por el MCC a entre 10 y 100 \mug/ml (IC_{50} = 10 \mug/ml) y por mitomicina-C, 5-fluorouracilo y cisplatino a entre 0,1 y 10 \mug/ml (IC_{50} = 2,2, 0,12 y 0,6 \mug/ml respectivamente). La tabla 5 también muestra que 1 \mug/ml de MCC potenciaba la inhibición de la proliferación de células de melanoma B-16 por mitomicina-C (IC_{50} = 0,12 \mug/ml) y 5-fluorouracilo (IC_{50} = 0,005 \mug/ml) y que 1 \mug/ml de MCC intensificaba la inhibición de la proliferación de células de melanoma B-16 por cisplatino (IC_{50} = 0,16 \mug/ml).

Estos datos muestran que el MCC no solo inhibe la proliferación de células cancerígenas, sino que también potencia los efectos antineoplásicos de la mitomicina-C y 5-fluorouracilo sobre la proliferación de células cancerígenas e intensifica el efecto antineoplásico del cisplatino sobre la proliferación de células cancerígenas.

Ejemplo 12 Inducción de la apoptosis en células de melanoma B-16 por MCC y M-ADN

La fragmentación del ADN celular en fragmentos de tamaño de nucleosoma es característica de las células bajo apoptosis (Newell et al. Nature 357:286-289, 1990). Para evaluar la fragmentación del ADN, las células B-16 se lisaron con 0,5 ml de tampón de lisis hipotónico (tampón Tris 10 mM, EDTA 1 mM, 0,2% de octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100), pH 7,5). Los lisados se centrifugaron a 15.000 g durante 10 min y los sobrenadantes, que contenían el ADN fragmentado, se precipitaron durante una noche a -20ºC en 50% de isopropanol y NaCl 0,5 M. Los precipitados se recogieron por centrifugación y se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 0,7% durante 3 h a
100 V.

Células de melanoma B-16, a 5 x 10^{5} células/ml, se incubaron durante 72 h con 1 \mug/ml de M-ADN (figura 6, carril 1) y con 100 (carril 2), 10 (carril 3) y 1 \mug/ml de MCC (carril 4). Las células de melanoma B-16 tratadas con M-ADN y MCC mostraron una fragmentación significativa del ADN, mientras que las células de melanoma B-16 sin tratar (figura 6, carril 5) no mostraban fragmentación del ADN. Se utilizó un marcador de ADN de 123 pb (Gibco Life Science) para determinar el peso molecular de los fragmentos de ADN de tamaño de nucleosoma (figura 6, carril L). Estos datos demuestran que el M-ADN y MCC inducen la apoptosis en células de melanoma B-16.

Ejemplo 13 Activación de la caspasa-1 en células de melanoma B-16 por MCC

El enzima de conversión de la interleucina-1 (ICE/caspasa 1) es una cisteína proteasa implicada en la activación secuencial de la cascada de caspasas necesaria para la apoptosis. La ICE/caspasa-1 resulta rápidamente y transitoriamente activada por varios estímulos pro-apoptóticos. Para determinar si el MCC puede activar directamente la ICE/caspasa-1, se ensayó el efecto del MCC sobre la actividad ICE/caspasa-1 en células de melanoma B-16.

Se plaquearon células de melanoma B-16, a 3 x 10^{5} células/ml, en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos utilizando un volumen de 1 ml y se incubaron durante 3 h con entre 1 y 100 \mug/ml de MCC. Las células se lavaron, se lisaron en HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, 0,1% de 3-[3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano-sulfonato (CHAPS), DTT 10 mM, EDTA 1 mM y 10% de glicerol y se centrifugaron a 11.000 g durante 10 minutos. La actividad ICE/caspasa-1 en el sobrenadante se determinó utilizando el estrato sintético fluorogénico Z-tyr-val-ala-asp[OMe]-7-amino-4-metilcumarina [Calbiochem # 6 88225]. La fluorescencia se determinó a una longitud de onda de excitación de 400 nm y una longitud de onda de emisión de 505 nm.

Tal como se muestra en la figura 7, la incubación de células de melanoma B-16 con MCC resultó en un incremento significativo dependiente de dosis de la actividad ICE/caspasa-1, mientras que la incubación de células de melanoma B-16 sin MCC no resultó en un cambio de la actividad ICE/caspasa-1.

Ejemplo 14 Efectos citotóxicos del MCC sobre células de melanoma maligno

La citotoxicidad celular se caracteriza por la pérdida de la integridad de la membrana plasmática y la liberación de enzimas citoplasmáticos tales como, por sin limitarse a, LDH (Phillips et al., Vaccine 14:898-904).

Para evaluar la citotoxicidad del MCC, las células de melanoma B-16 se incubaron durante 48 h con 100 \mug/ml de MCC o con tampón de lisis (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, 0,2% de Triton X-100, pH 7,5) como control para la liberación total de LDH (Filion et al. Biochim Biophys Acta 1329:345-356, 1997). El LDH se determinó mediante un ensayo comercial (Sigma-Aldrich).

Tal como se muestra en la Figura 8, el MCC no resultó citotóxico para las células de melanoma B-16. Estos datos demuestran que el MCC no actúa rompiendo la membrana de las células, sino que el MCC actúa directamente sobre las células de melanoma B-16 para inducir la apoptosis.

Ejemplo 15 Efectos del M-ADN, MCC y MCC tratado con DNasa I sobre tumores de melanoma B-16 en ratones

Células de melanoma B-16 se implantan subcutáneamente en 20 ratones macho nude BALB/c y se dejan crecer durante 10 días. Los ratones se dividen en 4 grupos y se mide la masa tumoral en cada ratón. En el día 0, los ratones del Grupo 1 reciben solución salina, los ratones del Grupo 2 reciben MCC, los ratones del Grupo 3 reciben M-ADN y los ratones del Grupo 4 reciben MCC tratado con DNasa I. Tras 4 semanas de tratamiento, se sacrifican los ratones y se mide la masa tumoral. Los ratones del Grupo 2 y Grupo 3 presentan una masa tumoral menor que los ratones del Grupo 1 y el Grupo 4.

Ejemplo 16 Efectos del M-ADN y MCC en combinación con mitomicina-C sobre tumores de melanoma B-16 en ratones

Células de melanoma B-16 se implantan subcutáneamente en 30 ratones macho nude BALB/c y se dejan crecer durante 10 días. Los ratones se dividen en 6 grupos y se mide la masa tumoral en cada ratón. En el día 0, los ratones del Grupo 1 reciben solución salina, los ratones del Grupo 2 reciben M-ADN, los ratones del Grupo 3 reciben MCC, los ratones del Grupo 4 reciben mitomicina-C, los ratones del Grupo 5 reciben M-ADN y mitomicina-C y los ratones del Grupo 6 reciben MCC y mitomicina-C. Tras 4 semanas de tratamiento, se sacrifican los ratones y se determina la masa tumoral y el número de metástasis. Los ratones del Grupo 1 presentan la mayor masa tumoral. Los ratones del Grupo 4 presentan una masa tumoral menor que los ratones del Grupo 1. Los ratones del Grupo 2 y el Grupo 3 presentan una masa tumoral menor que los ratones del Grupo 4. Los ratones del Grupo 5 y el Grupo 6 presentan la masa tumoral menor.

Claims

1. Uso de ADN de Mycobacterium phlei (M-ADN) y un agente quimioterapéutico (M-ADN + agente quimioterapéutico) para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un cáncer en un animal, en el que el agente quimioterapéutico se selecciona de entre el grupo que comprende agentes alquilantes de ADN, agentes antibióticos antitumorales y agentes antimetabólicos.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que el M-ADN se conserva y compleja sobre la pared celular de Mycobacterium phlei (MCC).

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el agente alquilante de ADN es cisplatino.

4. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el agente antibiótico antitumoral es mitomicina-C.

5. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el agente antimetabólico es 5-fluoruracilo.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que M-ADN + agente quimioterapéutico y MCC + agente quimioterapéutico induce la detención del ciclo celular en las células del cáncer.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que M-ADN + agente quimioterapéutico y MCC + agente quimioterapéutico inhibe la proliferación de las células del cáncer.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que M-ADN + agente quimioterapéutico y MCC + agente quimioterapéutico induce la apoptosis en las células del cáncer.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cáncer es leucemia, linfoma o melanoma.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que el cáncer es melanoma.

11. Uso de M-ADN para la preparación de un medicamento destinado a inducir la detención del ciclo celular en células cancerígenas en un animal, activar la actividad caspasa en células de melanoma maligno, o inhibir la actividad neoplásica en células cancerígenas en un animal.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que el M-ADN se conserva y compleja sobre pared celular de Mycobacterium phlei (MCC).

13. Uso según la reivindicación 11 ó 12, en el que la detención del ciclo celular en células cancerígenas se induce en la fase SL + GM2 del ciclo celular.

14. Uso según la reivindicación 11, 12 ó 13, en el que las células cancerígenas son células de melanoma.

15. Composición que comprende M-ADN y un agente quimioterapéutico, en la que el M-ADN potencia la actividad anticancerígena del agente quimioterapéutico en el tratamiento del cáncer en un animal que sufre un cáncer, y en la que el agente quimioterapéutico se selecciona de entre el grupo que comprende agentes alquilantes de ADN, agentes antibióticos antitumorales y agentes antimetabólicos.

16. Composición según la reivindicación 15, en la que el M-ADN se conserva y compleja sobre pared celular de Mycobacterium phlei (MCC) y en la que el MCC potencia la actividad anticancerígena del agente quimioterapéutico en el tratamiento del cáncer en un animal que sufre un cáncer.