ES2239334T3 - Inhibidores de traf. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A NUEVOS INHIBIDORES DE LA TRANSDUCCION DE SEÑAL MEDIADA POR FACTOR ASOCIADO AL RECEPTOR DE FACTOR DE NECROSIS TUMORAL (TRAF). LA INVENCION COMPRENDE LAS NUEVAS PROTEINAS INHIBIDORAS (I CODIFICAN, METODOS PARA SU PRODUCCION RECOMBINANTE, Y SU USO EN ENSAYOS DE ESCRUTINIO Y COMO PRODUCTOS FARMACEUTICOS.
Description
Inhibidores de TRAF.
La presente invención se refiere al aislamiento,
producción recombinante y caracterización de nuevos polipéptidos que
bloquean la señal de transducción mediada por factores asociados al
factor de necrosis tumoral (TRAF), incluyendo TRAF2. En particular,
esta invención se refiere a nuevas proteínas que actúan como
inhibidores específicos de la activación de
NF-\kappaB dependiente de TRAF-2
señalizado por ciertos miembros de la superfamilia de receptores de
TNF, tales como TNF-R2 y CD40., los procedimientos y
medios para hacer estos y su uso en ensayos de análisis o como
productos farmacéuticos.
El factor de necrosis tumoral (TNF) es una
citoquina producidaprincipalmente por macrófagos activados que
provoca una amplia gama de efectos biológicos. Estos incluyen una
importante función en el choque endotóxico y en actividades
inflamatorias, inmunorreguladoras, proliferativas, citotóxica y
antivirales (revisado por Goeddel, D. V. y col., Cold
Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 51,
597-609 [1986]; Beutler, B. y Cerami A., Ann.
Rev. Biochem. 57, 505-518 [1988]; Old, L.
J., Sci. Am. 258(5), 59-75 [1988];
Fiers, W. FEBS Lett. 285(2), 199-212
[1991]). La inducción de varias respuestas celulares mediadas por
TNF se inicia por su interacción con dos receptores diferentes de la
superficie celular, un receptor de aproximadamente 55 kDa denominado
TNF-R1 y un receptor de aproximadamente 75 kDa
denominado TNF-R2. Se han aislado y caracterizado
los ADNc humano y de ratón correspondientes a ambos tipos de
receptores (Loetscher, H. y col., Cell 61, 351
[1990]; Schall, T.J. y col., Cell 61, 361
[1990]; Smith, C.A. y col., Science 248, 1019
[1990]; Lewis M. y col., Proc Natl. Acad. Sci. USA
88, 2830-2834 [1991]; Goodwin, R.G. y
col., Mol. Cell. Biol. 11,
3020-3026 [1991]. Ambos TNF-R
comparten la estructura típica de receptores de la superficie
celular incluyendo región extracelular, transmembrana e
intracelular. Las porciones extracelulares de ambos receptores
también se encuentran de forma natural como proteínas solubles
unidas a TNF (Nophar, Y. y col., EMBO J 9, 3269
[1990] y Kohno, T. y col. Proc Natl. Acad Sci, U.S.A.
87, 8331 [1990]). La secuencia de aminoácidos del
TNF-R1 humano y la secuencia de nucleótidos
subyacente se describieron en el documento EP 417.563 (publicado el
20 de marzo de 1991), mientras que en el documento EP 418.014
(publicado el 20 de marzo de 1991) se describen las secuencias de
aminoácidos y nucleótidos del TNF-R2 humano.
Ambos receptores de TNF se activan
independientemente en respuestas de señalización de TNF.
Señalización directa por TNF-R2 se ha observado en
células linfoides en las que TNF-R2 estimula la
proliferación de timocitos y de una línea celular T citotóxica
murina CT6 (Tartaglia y col., Proc Natl Acad Sci. USA
88, 9292-9296 [1991], Tartaglia y col.
J. Immuno. 151, 4637-4641 [1993]).
Tanto TNF-R1 como TNF-R2, junto con
otros miembros de la superfamilia de receptores de TNF, por ejemplo
CD40, han mostrado mediar de forma independiente en la activación
del factor de transcripción NF-\kappaB (Leonardo y
Baltimore, Cell 58: 227-229 [1989];
Laegreid, A., y col. J. Biol. Chem 269,
7785-7791 [1994]; Rothe y col., Cell
78, 681-692 [1994]; Wiegmann y col,
J. Biol. Chem 267, 17997-18001
[1992]). NF-\kappaB es un miembro de la familia
Rel de activadores de la transcripción que controlan la expresión de
varios genes celulares y virales importantes (Leonardo y Baltimore,
supra, y Thanos y Maniatis, Cell 80,
529-532 [1995]). TNF-R2 también
media en la inducción transcripcional del gen del factor estimulante
de colonias de granulocito macrófago (GM-CSF)
(Miyatake y col. EMBO J, 4:
2561-2568 [1985]; Stanley y col, EMBO
J. 4: 2569-2573 [1985]) y el gen de la
proteína de dedos de cinc A20 (Opipari, y col., J. Biol.
Chem. 265:14705-14708 [1990]) en células
CT6, y participa como un componente accesorio de
TNF-R1 en la señalización de respuestas mediadas
principalmente por TNF-R1, como citotoxicidad
(Tartaglia, L.A. y Goeddel, D.V., Immunol Today, 13,
151-153 [1992]).
Investigaciones recientes han llevado al
aislamiento de factores polipeptídicos asociados con el dominio
intracelular del receptor del factor de necrosis tumoral de 75 kDa,
TNF-R2 ("factores asociados al receptor del factor
de necrosis tumoral" o "TRAF") que participan en la cascada
de transducción de la señal de TNF-R2. TRAF1 y TRAF2
fueron los dos primeros miembros identificados de esta nueva familia
de proteínas que contienen una nueva región de homología en el
extremo C-terminal, el dominio TRAF (Rothe y
col., Cell 78, 681-692 [1994];
documento PCT WO95/3305 publicado el 07 de diciembre de 1995).
También se ha identificó un dominio protéico TRAF adicional, TRAF3
(originalmente denominado CD40bp, CRAF, o LAP1) (Hu y col,
J. Biol. Chem. 269, 30069 [1994]; Cheng y col.;
Science 267, 1494 [1995], y Mosialos y col.,
Cell 80, 389 [1995]]). El TRAF2 humano se describe en
Song y Dooner, Biochem. J. 809,
925-829 (1995). El TRAF humano se describe en
Mosialos y col. supra. Los TRAF traducen señales a
partir de TNF-R2, CD40 y presumiblemente de otros
miembros de la superfamilia de receptores de TNF que también incluye
el receptor de baja afinidad del factor de crecimiento nervioso, el
antígeno Fas, CD27, CD30, OX40, 4-1BB, y
TNFR-RP (Rothe y col. supra; Hu y col.
J. Biol. Chem. 269, 30069-30072
[1994]; Cheng y col., Science, 267,
1494-1498 [1995]; Mosialos y col.,
Cell 80, 389-399 [1995]; Rothe y
col., Science, en imprenta; Smith y col.,
Cell 76, 959-962 [1994]). Además de
compartir el dominio C-terminal conservado TRAF que
está implicado tanto en la asociación como en la oligomerización del
receptor, TRAF2 y TRAF3 contiene cada uno un dominio N- terminal de
dedo RING y cinco estructuras de dedos de cinc de similitud de
secuencia débil. CD40 y TNF-R2 interaccionan
directamente con TRAF2 e indirectamente con TRAF1 por medio de un
heterodímero TRAF2/TRAF1. Se requiere TRAF2 (o el heterodímero
TRAF2/TRAF1) para la activación mediada por CD40 y
TNF-R2 del factor de transcripción
NF-\kappaB. TRAF3 interacciona con CD40 y
autoasociados pero parece que no se asocia con
TNF-R2, TRAF1, o TRAF2. El papel de TRAF3 en la
transducción de señal no está tan bien definido, pero puede ser
antagonista de los efectos de TRAF2 (Rothe y col.,
Science, en imprenta). Las proteínas TRAF también
interaccionan con el dominio citoplasmático
C-terminal de la proteína de transformación del
virus de Epstein-Barr LMP1 (Mosialos y col.,
Cell 80, 389 [1995]), LMP1 es un oncogén dominante
que tiene múltiples efectos secuencia arriba en el crecimiento
celular y en la expresión génica, algunos de los cuales al menos
requieren la activación de NF-\kappaB (Laherty
y col., J. Biol. Chem., 267, 24157 [1992];
Rowe y col., J. Virol. 68, 5602 [1994]). Se
cree que TRAF2 es un transductor común de señal para
TNF-R2, CD40 y LMP1.
La presente invención se basa en la
identificación, producción recombinante y caracterización de ciertas
proteínas nuevas que interaccionan con TRAF denominadas
"inhibidores de TRAF" (I-TRAF). Más
especialmente, la presente invención se basa en el aislamiento de
ADNc que codifican varias formas de I-TRAF murina y
humana que codifica proteínas sin similitud de secuencia
significativa con ninguna proteína conocida, y en la expresión y
caracterización de las proteínas I-TRAF
codificadas.
En un aspecto, la invención se refiere a
proteínas I-TRAF purificadas que inhiben la
interacción de los TRAF con miembros de la superfamilia de
receptores del TNF, tales como TNF-R2, CD40, y/u
otras proteínas celulares con las que las proteínas TRAF normalmente
se asocian, directa o indirectamente, tales como LMP1.
En particular, la invención se refiere a un
polipéptido I-TRAF aislado que comprende la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido seleccionado entre el
grupo constituido por:
(a) un polipéptido I-TRAF de
secuencia nativa
(b) un polipéptido que tiene al menos
aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con el
dominio de unión TRAF de una secuencia polipeptídica nativa
I-TRAF y capaz de inhibir un suceso de señalización
mediada por TRAF, y
(c) un fragmento de un polipéptido de (a) o (b)
capaz de inhibir un suceso de señalización mediado por TRAF.
Preferiblemente, los polipéptidos
I-TRAF de la presente invención tienen al menos
aproximadamente 60% en total de identidad de secuencia de
aminoácidos con una secuencia polipeptídica I-TRAF
nativa. Los polipéptidos I-TRAF preferiblemente
comprenden un fragmento de una proteína I-TRAF
nativa de mamífero que es necesaria y suficiente para la asociación
con una proteína nativa TRAF. Mas preferiblemente, los polipéptidos
I-TRAF comprenden un fragmento de una
I-TRAF nativa de mamífero o un polipéptido
suficientemente homólogo como para retener la capacidad de
interacción con el dominio TRAF de una proteína TRAF nativa de
mamífero. Aún más preferiblemente, los polipéptidos
I-TRAF comprende la porción N- terminal de una
I-TRAF nativa de mamífero capaz de interaccionar con
una TRAF nativa, preferiblemente con TRAF2. Las proteínas de
mamífero preferiblemente son huma-
nas.
nas.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
molécula de ácido nucleico aislada que codifica proteínas
I-TRAF que inhiben la interacción de las TRAF con
miembros de la superfamilia de receptores del TNF, tales como
TNF-R2, CD40, y/u otras proteínas intracelulares con
las que las proteínas TRAF están normalmente asociadas, directa o
indirectamente, tales como LMP1. El ácido nucleico preferiblemente
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína
I-TRAF murina de 413 a 447 aminoácidos (SEC ID Nº: 1
y 3) o una proteína I-TRAF humana de 425 aminoácidos
(SEC ID Nº: 5) o un derivado funcional de estas, incluyendo la
proteína murina truncada mostrada en la Fig. 1 (SEC ID Nº: 8). En
otra realización preferida, el ácido nucleico es capaz de hibridar
con el complementario de cualquiera de las moléculas de ácido
nucleico representadas por las SEC ID Nº: 2, 4 y 6.
La invención adicionalmente se refiere a
vectores, células y organismos que comprende este ácido
nucleico.
En un aspecto adicional, la invención se refiere
a un ensayo de análisis para identificar moléculas que modulan la
unión I-TRAF/TRAF. Preferiblemente, las moléculas
previene la interacción I-TRAF/TRAF o previene o
inhiben la disociación de complejos I-TRAF/TRAF. El
ensayo comprenden la incubación de una mezcla que comprende TRAF e
I-TRAF con una molécula candidata y la detección de
la capacidad de la molécula candidata para modular la unión
I-TRAF/TRAF, por ejemplo para prevenir la
interacción de I-TRAF con TRAF o para prevenir o
inhibir la disociación de los complejos I-TRAF/TRAF.
Las moléculas analizadas preferiblemente son moléculas pequeñas de
fármacos candidatos.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
ensayo para identificar una molécula cuya transducción de señal es
mediada por la asociación de un TRAF con una proteína celular,
comprendiendo (a) incubar una mezcla que comprende una TRAF, y una
I-TRAF con una molécula candidata, y (b) detectar la
capacidad de la molécula candidata para liberar TRAF del complejo
formado con I-TRAF un suceso de señalización mediado
por TRAF.
Todavía en otro aspecto, la invención se refiere
a medios de tratamiento de un tumor asociado con el virus de
Epstein-Barr. Las composiciones farmacéuticas que
comprenden una I-TRAF como ingrediente activo
también están dentro del alcance de la presente invención.
La invención también se refiere a medios para la
modulación de la transducción de señal mediada por TRAF en una
célula.
La figura 1(a) muestra las secuencias de
aminoácidos deducidas de I-TRAF murina y humana.
Los codones de iniciación de la traducción de las variantes de
ayuste murinas I-TRAF\alpha y \beta se indican
como \alpha y \beta, respectivamente. El sitio de unión se
marca con un asterisco (*). Todos los clones de ADNc de
I-TRAF humano aislados se corresponden con
I-TRAF\alpha murina. La metionina de inicio de
I-TRAF humana está precedida de un codón de
terminación en marco secuencia arriba que no está presente en los
clones de ADNc de I-TRAF\alpha murina. También se
muestran las secuencias de aminoácidos de dos variantes de ayuste
adicionales de I-TRAF\alpha, que terminan en dos
codones de terminación prematura.
La figura 1(b) muestra los resultados del
análisis de transferencia por Northern del ARNm de
I-TRAF en múltiples tejidos de ratón.
La figura 2 muestra que I-TRAF se
asocia con TRAF-1, TRAF-2 y TRAF3 en
un ensayo de unión in vitro.
La figura 3 muestra los resultados de análisis de
transferencia por Western que demuestra que I-TRAF
bloquea la asociación de TRAF2 con TNF-R2.
La figura 4 ilustra el efecto de inhibición de
I-TRAF en la activación de
NF-\kappaB.
SEC ID Nº: 1 muestra la secuencia de aminoácidos
de la I-TRAF murina de 413 aa
(I-TRAF\alpha murina), empezando con el aminoácido
marcado como "\alpha" en la Figura 1.
SEC ID Nº: 2 muestra la secuencia de nucleótidos
de I-TRAF\alpha murina. Esta secuencia se obtuvo a
partir de un compuesto de varias clonaciones independientes
secuenciadas.
SEC ID Nº: 3 muestra los 34 aminoácidos
adicionales presentes en la secuencia de I-TRAF
murina de 447 aa (I-TRAF\beta murina), empezando
con el aminoácido marcado como "\beta" en la Figura 1.
SEC ID Nº: 4 muestra la secuencia de aminoácidos
que codifica los 34 aminoácidos adicionales de
I-TRAF\beta murina.
SEC ID Nº: 5 muestra la secuencia de aminoácidos
de I-TRAF humana de longitud completa.
SEC ID Nº: 6 muestra la secuencia de nucleótidos
de I-TRAF humana de longitud completa.
SEC ID Nº: 7 es la secuencia de nucleótidos
completa no editada de un clon de longitud completa que codifica
I-TRAF\alpha murina (clon 8).
SEC ID Nº: 8 es la secuencia de nucleótidos que
codifica la proteína I-TRAF\alpha murina truncada
que termina en la secuencia VTVLH mostrada en la Figura 1 (clon
23).
Las expresiones "inhibidor de TRAF",
"inhibidor de proteína TRAF", "inhibidor de polipéptido
TRAF", "proteína I-TRAF", "polipéptido
I-TRAF" e "I-TRAF" se usan
de manera intercambiable y se refieren a una secuencia polipeptídica
nativa que inhibe la interacción de una TRAF nativa con un receptor
de la superficie celular que desencadena las cascadas de activación
de NF-\kappaB mediada por TRAF, tales como un
miembro de la superfamilia de receptores del TNF (por ejemplo
TNF-R2, CD40 y/o CD30) y/o con otra proteína celular
con la que la TRAF nativa se asocia normalmente (directa o
indirectamente), siempre que este polipéptido I-TRAF
sea distinto de un anticuerpo bloqueante, y derivados funcionales
de estos. La proteína I-TRAF preferiblemente ejerce
su función inhibidora uniéndose a una proteína TRAF, tal como TRAF1,
TRAF2 y/o TRAF3, manteniendo esta en un estado latente del que la
proteína TRAF puede liberarse, por ejemplo, por agregación del
receptor inducida por el ligando. Las expresiones "polipéptido de
secuencia nativa" y "polipéptido nativo" y sus variantes
gramaticales se usan de forma intercambiable y designan un
polipéptido que aparece en la naturaleza en cualquier tipo de célula
de cualquier especie animal humana o no humana, con y sin la
metionina de inicio, purificada a partir de una fuente nativa,
sintetizada, producida por tecnología de ADN recombinante o por
cualquier combinación de estos y/u otros procedimientos. Los
polipéptidos de secuencia nativa I-TRAF incluyen
especialmente la I-.TRAF murina de 413 aminoácidos
(I-TRAF\alpha SEC ID Nº: 1), la
I-TRAF murina de 447 aminoácidos
(I-TRAF\beta; SEC ID Nº:3), y la I-.TRAF humana de
425 aminoácidos (SEC ID Nº:5), y sus variantes de ayuste y alélicas
alternativas que aparecen naturalmente. También están incluidos los
polipéptidos I-TRAF nativos de otras especies de
mamífero, tales como porcino, canino, equino, etc.
Las expresiones "TRAF", "proteína TRAF"
y "polipéptido TRAF" se usan de manera intercambiable y se
refieren a un factor de secuencia nativa capaz de asociación
específica con el dominio intracelular de un miembro nativo de la
superfamilia de receptores del TNF (tales como
TNF-R2, CD40 o CD30), y derivados funcionales de
este factor nativo. En el contexto de esta definición, la expresión
"asociación específica" se usa en el sentido más amplio, e
incluye unión directa a un sitio o región en el dominio
intracelular de un miembro de la superfamilia de receptores del TNF
nativo de humano o de cualquier otra especie animal, y asociación
indirecta mediada por moléculas adicionales, tales como otra TRAF.
La expresión "factor de secuencia nativa" se define de manera
análoga a la definición de "polipéptido de secuencia nativa"
proporcionada anteriormente. Los polipéptidos TRAF de secuencia
nativa específicamente incluyen los polipéptidos nativos TRAF1 y
TRAF2 murinos descritos en Rothe y col., Cell
78, 681-692 [1994]), TRAF3 como se describe
en Hu y col., supra; Cheng y col.,
supra; y Mosialos y col, supra, y sus
equivalentes en humanos y en otras especies animales.
Un "derivado funcional" de un polipéptido
nativo es un compuesto que tiene una actividad biológica cualitativa
en común con el polipéptido nativo. Para el objetivo de la presente
invención, un "derivado funcional" de una
I-TRAF nativa se define por su capacidad para
inhibir la asociación de una TRAF con un miembro de la superfamilia
de receptores de TNF con el que TRAF se asocia de forma natural, con
el proviso de que estos derivados funcionales no son
anticuerpos bloqueantes (anti-TRAF o anti miembro de
la superfamilia de receptores de TNF). Preferiblemente, un derivado
funcional se une a un polipéptido nativo TRAF, tal como TRAF1, TRAF2
y/o TRAF3 previniendo de este modo (reversible o irreversiblemente)
su interacción con receptores de la superficie celular (por ejemplo,
TNF-R2, CD40, CD30) que desencadenan las cascadas de
activación de NF-\kappaB mediada por TRAF. En una
realización particularmente preferida, la prevención de la
señalización mediada por TRAF es reversible, y las TRAF pueden
liberarse de su estado latente inhibido, por ejemplo por agregación
del receptor mediado por ligando. Los derivados funcionales
preferiblemente tienen al menos aproximadamente 60%, más
preferiblemente al menos aproximadamente 70%, incluso más
preferiblemente al menos aproximadamente 80%, más preferiblemente al
menos aproximadamente 90% en total de identidad de secuencia de
aminoácidos con un polipéptido I-TRAF de secuencia
nativa, preferiblemente una I-TRAF humano. Incluso
más preferiblemente, los derivados funcionales muestran al menos
aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente
80% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 80% de
identidad de secuencia de aminoácidos con el dominio de unión a TRAF
de un polipéptido I-TRAF de secuencia nativa. Los
fragmentos de polipéptidos I-TRAF de secuencia
nativa de varias especies de mamíferos y secuencias homólogos a
estos fragmentos constituyen otro grupo preferido de derivados
funcionales I-TRAF. Estos fragmentos preferiblemente
incluyen la región N-terminal de una secuencia
I-TRAF nativa que es necesaria y suficiente para la
unión de TRAF, tal como los aminoácidos 35-236 de
las secuencias I-TRAF de ratón representadas en SEC
ID Nº: 1 ó 3, y la parte equivalente de una secuencia
I-TRAF humana, o muestra al menos aproximadamente
70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, los más
preferiblemente al menos aproximadamente 90% de identidad de
secuencia con la porción N-terminal de unión a TRAF
de una secuencia I-TRAF nativa. Otro grupo preferido
de derivados funcionales de I-TRAF está codificado
por ácido nucleótido que hibrida en condiciones severas con el
complementario del ácido nucleico que codifica un polipéptido
I-TRAF nativo.
Los derivados funcionales de polipéptidos TRAF
nativos, como se define para el objetivo de la presente invención,
se caracterizan por que retienen la capacidad de las TRAF nativas
para asociarse (directa o indirectamente) con el domino intracelular
de un miembro de la superfamilia de receptores de TNF, tal como
TNF-R2, CD40 y/o CD30. Estos derivados funcionales
de TRAF preferiblemente retienen o mimetizan la región o regiones
con una secuencia TRAF nativa que participa o participan
directamente en la asociación con el dominio intracelular de un
miembro de la superfamilia de receptores de TNF y/o en la homo o
heterodimerización, junto con la región o regiones a las que se un
polipéptido I-TRAF nativo. Un grupo preferido de
derivados funcionales de TRAF muestra al menos aproximadamente 60%,
más preferiblemente al menos aproximadamente 70%, incluso más
preferiblemente al menos aproximadamente 80%, lo más preferiblemente
al menos aproximadamente 80% en total de identidad de secuencia con
una secuencia TRAF nativa. Otros derivados funcionales preferidos
son o comprenden los dominios TRAF conservados de proteínas TRAF de
secuencia nativa. Dentro de este grupo, son particularmente
preferidos fragmentos de TRAF que comprenden al menos los
aminoácidos 264 a 501 de la secuencia de aminoácidos de TRAF2
nativa. También se prefieren variantes de TRAF que muestran al menos
aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente
80%, lo más preferiblemente al menos aproximadamente 90% de
identidad de secuencia de aminoácidos con la región TRAF de una
proteína TRAF de secuencia nativa, preferiblemente TRAF 2. Un grupo
adicional preferido de derivados funcionales de TRAF está codificado
por un ácido nucleico capaz de hibridar en condiciones severas con
el complementario de un polipéptido TRAF de secuencia nativa de
cualquier especie de mamífero, incluyendo humanos.
"Identidad" u "homología" con respecto
a un polipéptido nativo o polipéptido y sus derivados funcionales
en este documento es el porcentaje de restos de aminoácidos en la
secuencia candidata que son idénticos con los restos de un
polipéptido nativo correspondiente, después de alinear las secuencia
e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo
porcentaje de homología, y no considerando ninguna sustitución
conservativa como parte de la identidad de secuencia. Los
procedimientos y programas de ordenador para el alineamiento son
bien conocidos en la técnica.
Las "condiciones severas" pueden
proporcionarse de varias formas, tales como incubación durante toda
la noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, SSC
5x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH
7,6), solución Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de
espera de salmón cortado y desnaturalizado 20 \mug/ml.
Alternativamente, las condiciones severas se caracterizan por un
tampón de hibridación que comprende formamida al 30% en tampón SSPE
5x (NaCl 0,18M, NaPO_{4} 0,01M, pH 7,7 EDTA 0,0001 M) a una
temperatura de 42ºC, y posteriormente lavado a 42ºC con SSPE 0,2X.
Preferiblemente, las condiciones severas implican el uso de un
tampón de hibridación que comprende formamida al 50%, en SSPE 5x a
una temperatura de 42ºC y lavado a la misma temperatura con SSPE
0,2x.
Un polipéptido o ácido nucleico "aislado" no
va acompañado de ningún material con el que se asocia en su ambiente
nativo. Un polipéptido aislado constituye al menos aproximadamente
2% en peso, y preferiblemente al menos aproximadamente 5% en peso de
la proteína total en una muestra dada. Un ácido nucleico aislado
constituye al menos aproximadamente 0,5% en peso, y preferiblemente
al menos aproximadamente 5% en peso del total de ácido nucleico
presente en una muestra dada.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido
más amplio y específicamente abarca anticuerpos monoclonales únicos
(incluyendo anticuerpos agonistas y antagonistas), composiciones de
anticuerpo con especificidad poliepitópica, así como fragmentos de
anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2}, y Fv), mientras
que muestra la actividad biológica deseada.
La expresión "anticuerpo monoclonal" según
se usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido a
partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos,
es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población
son idénticos excepto por la posibilidad de mutaciones ocurridas de
forma natural que pueden estar presentes en cantidades poco
importantes. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos,
dirigiéndose contra un sólo sitio antigénico. Además, en contraste
con preparaciones de anticuerpo convencional (policlonal) que
típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra
diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se
dirige contra un sólo determinante del antígeno. Además de su
especificidad, los anticuerpos monoclonales tiene la ventaja de que
se sintetizan en cultivos de hibridoma, no contaminados con otras
inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el
carácter del anticuerpo para obtenerse a partir de una población de
anticuerpos sustancialmente homogénea, y no tiene que pensarse en el
requerimiento de producción del anticuerpo por ningún procedimiento
en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usan
de acuerdo con la presente invención pueden hacerse por el
procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y
Milstein, Nature 256:495 (1975), o puede hacerse por
procedimientos de ADN recombinante [véase, por ejemplo la Patente de
Estados Unidos Nº: 4.816.567 (Cabilly y col.)].
Los anticuerpos monoclonales de este documento
incluyen específicamente anticuerpos (inmunoglobulinas)
"quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o
ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de
anticuerpos derivados de una especie en particular o pertenecen a
una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el
resto de la cadena o cadenas es idéntica u homóloga a las secuencias
correspondientes a los anticuerpos derivados de otra especie o
pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como
fragmentos de estos anticuerpos, siempre que muestren la actividad
biológica deseada [Patente de Estados Unidos Nº: 4.816.567; Cabilly
y col.; Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81, 6851-6855 (1984)].
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas,
cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de estas (tales como Fv,
Fab, Fab', F(ab')_{2} y otras subsecuencias de anticuerpos
de unión al antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de
una inmunoglobulina no humana. En la mayor parte, los anticuerpos
humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en
las que restos de una región determinante de complementariedad (CDR)
del receptor se sustituyen por restos de una CDR de una especie no
humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tiene
la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos,
se sustituyen restos de la región flanqueante de Fv de la
inmunoglobulina humana por los correspondientes restos no humanos.
Además, el anticuerpo humanizado puede comprender restos que no se
encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o
flanqueantes importadas. Estas modificaciones se hacen para una
posterior actuación de refinado y optimización del anticuerpo. En
general, el anticuerpo humanizado sustancialmente comprenderá al
menos uno, y típicamente dos, dominios variables completos, en los
que todas o sustancialmente todas las regiones CDR se corresponden
con las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente
todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de
inmunoglobulina humana. De manera óptima el anticuerpo humanizado
también comprenderá al menos una porción de una región constante de
inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana.
Para detalles adicionales véase: Jones y col, Nature
321, 522-525 (1986); Reichmann y
col., Nature 332, 323-329 (1988);
Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2
593-596 (1992) y la Patente de Estados Unidos Nº:
5.225.539 (Winter) expedida el 6 de julio, 1993.
Un "vector" como se define para el objeto de
la presente invención se refiere a una construcción de ADN que
contiene una secuencia de ADN que está unida de forma operativa a
una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión de
ADN es un huésped adecuado. Estas secuencias de control incluyen un
promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora
opcional para controlar esta transcripción, una secuencia que
codifica sitios adecuados de unión de ARNm al ribosoma, y secuencias
que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. El
vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, o simplemente
un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un huésped
adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente
del genoma del huésped, o puede, en algunos casos, integrarse en el
genoma mismo En la presente memoria descriptiva "plásmido" y
"vector" se usan algunas veces de forma intercambiable siendo
el plásmido la forma más comúnmente usada de vector actualmente. Sin
embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores que
cumplan funciones equivalentes y que sean, o llegue a ser, conocidas
en la técnica. Los vectores de expresión preferidos para expresión
en cultivos de células de mamífero se basan en pRK5 (Documento EP
307.247; Rothe y col., Cell, supra) y pSV16B
(Publicación PCT Nº WO 91/08291).
En el contexto de la presente invención, las
expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo
celular" se usan de forma intercambiable, y todas estas
designaciones incluyen progenie. También se entiende que toda la
progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN,
debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la
progenie mutante que tiene la misma función y propiedad biológica,
como se analizan en la célula originalmente transformada.
Las "células huésped" usadas en la presente
invención generalmente son huéspedes procarióticos o eucarióticos.
Estas células huésped se describen, por ejemplo, en la Patente de
Estados Unidos Nº 5.108.901 expedida el 28 de abril de 1992, y en la
Publicación PCT Nº WO95/33051. Procariotas adecuados incluyen
organismos gram negativo y gram positivo, por ejemplo, E.
coli o bacilli. Un huésped de clonación preferido es
E. coli 294 (ATCC 31.446) aunque son adecuados otros
procariotas gram negativo o gram positivo tales como E. coli
B, E. coli x 1776 (ATCC 31.537), E. coli W3110 (ATCC
27.325), especies de Pseudomonas, o Serratia
marcescens. Además de procariotas, los microbios eucarióticos
tales como hongos filamentosos y levaduras son huéspedes adecuados
para vectores apropiados de la invención. Saccharomyces
cerevisiae, o la levadura común de panadería, es el más
comúnmente usando entre los microorganismos huésped eucariotas
inferiores. Sin embargo, se usan comúnmente y son útiles en este
documento, muchos otros géneros, especies y cepas, tales como
aquellos descritos en la patente y solicitudes de patentes citadas
anteriormente. Una cepa de levadura preferida de la presente
invención es Saccharomyces cerevisiae HF7c (CLONTECH).
Células huésped adecuadas también puede derivar
de organismos multicelulares. Estas células huésped son capaces de
actividades complejas de procesamiento y glicosilación. En
principio., cualquier cultivo celular de eucariotas superiores es
factible, cultivo de vertebrado o invertebrado, aunque se prefieren
células de mamíferos tales como humanos. Los ejemplos de células de
invertebrados incluyen células vegetales e insectos, véase, por
ejemplo Luckow y col., Bio/Technology 6,
47-55 (1988); Millar y col. en: Genetic
Engineering, Setlow y col., eds., Vol. 8 (Plenum
Publishing, 1986) pág. 277-279; y Maeda y
col., Nature 315, 592-594 (1985).
Ha aumentado el interés por las células de vertebrados, y la
propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivos
tisulares) se conoce per se. Véase, Tissue Culture,
Academic Press, Kruse y Patterson, eds. (1973). Ejemplos de líneas
celulares huésped de mamíferos útiles son la línea de riñón de mono
CV1 transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la
línea celular de riñón embriónico humano (células 293 ó 293
subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham,
y col., J. Gen Virol, 36, 59 [1977]); células
de riñón de cría de hámster 9BHK, (ATCC CCL 10); células de ovario
de hamster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 77, 4216 [1980]); células de sertoli de ratón
(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23,
243-251 [1980]); células de riñón de mono (CVI ATCC
CCL 70); células de riñón de mono verde Africano
(VERO-76, ATCC CRL-1587); células de
carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL2); células de riñón de
perro (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de ratas búfalo (BRL 3A
ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL75); células
de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT
060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annals
N.Y. Acad. Sci. 383, 44068 [1982]); células MRC5;
células FS4; y una célula de hepatoma humano (Hep G2). Las células
huésped preferidas son células de riñón embriónico humano 293 y de
ovario de hamster Chino. Particularmente preferidas para la presente
invención son la línea celular T citotóxica dependiente de
Interleuquina-2 murina CT6, y la línea celular de
riñón embriónico humano 293, que se mantienen según se describe en
Tartaglia y col., Proc Natl. Acad. Sci, USA 88,
9292- 9296 (1991) y Pennica y col., J. Biol. Chem
267, 21172-21278 (1992).
"Disociación" es el procedimiento por el
cual dos moléculas paran de interaccionar: el procedimiento tiene
lugar a una tasa promedio fija en condiciones física
específicas.
Los polipéptidos I-TRAF nativos
puede, por ejemplo, identificarse y purificarse a partir de ciertos
tejidos que poseen un ARNm de TRAF (por ejemplo TRAF2) y expresan
éste a un nivel detectable. I-TRAF murina puede, por
ejemplo, obtenerse a partir de la línea celular del estroma hepático
fetal murino 7-4 (FL; Rothe y col., Cell
supra) o a partir de nódulos linfoides periféricos murinos
(PLN; Patente de Estados Unidos Nº 5.304.640 expedida el 9 de abril,
1994). I-TRAF humana puede, por ejemplo, purificarse
a partir de nódulos linfáticos periféricos humanos. El ARNm de
I-TRAF también está presente y se expresa en tejidos
de cerebro, bazo, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y
testículo (véase la Figura 1b), junto con TRAF; por ejemplo ARNm de
TRAF2. I-TRAF nativas pueden, por ejemplo,
identificarse y purificarse a partir de tejidos que expresan sus
ARNm basándose en su capacidad para unirse a TRAF2 (u otro TRAF, por
ejemplo TRAF1). I-TRAF nativas se coprecipitarán
TRAF2 inmunoprecipitada. En una realización preferida, la TRAF2
radiomarcada o un derivado se inmunoprecipita con proteína
A-agarosa (Oncogene Science) y con proteína
A-Sepharosa (Pharmacia). El inmunoprecipitado se
analiza después por autorradiografía o por fluorografía, dependiendo
del radiomarcaje usado. Las proteínas I-TRAF se
coprecipitarán con la TRAF-2 o sus derivados, y
puede purificarse adicionalmente por procedimientos conocidos en la
técnica, tales como purificación en una columna de afinidad. Para
purificación a gran escala se puede usar un esquema similar al
descrito por Smith y Johnson, Gene 67,
31-40 (1988). Un lisado celular que contiene la o
las I-TRAF para purificar se aplica a una columna de
afinidad de proteína de fusión
glutation-S-.transferasa (GST)-TRAF.
La proteína o proteínas unidas a la columna se eluyen, precipitan y
aíslan en PAGE-SDS en condiciones reductoras, y se
visualizan, por ejemplo por tinción con plata. Los vectores de
fusión génica GST (vectores pGEX) así como los kits para clonación y
expresión de sistemas de fusión GST están disponible en el mercado
en Pharmacia (véase el Catálogo de Pharmacia, 1994, páginas 133; y
142-143).
Preferiblemente, los polipéptidos
I-TRAF se preparan por procedimientos recombinantes
estándar cultivando células transfectadas para expresar el ácido
nucleico del polipéptido I-TRAF (típicamente
transformando las células con un vector de expresión) y recuperando
el polipéptido a partir de las células. Sin embargo, se prevé que
los polipéptidos I-TRAF puedan producirse por
recombinación homóloga, o por procedimientos de producción
recombinante utilizando elementos de control introducidos en células
que ya contiene ADN que codifica un polipéptido TRAF. Por ejemplo,
puede insertarse un potente elemento promotor/potenciador, un
supresor, o un elemento exógeno modulador de la transcripción en el
genoma de la célula huésped deseada en la proximidad y orientación
suficientes como para influenciar la transcripción del ADN que
codifica el polipéptido I-TRAF deseado. El elemento
de control no codifica el polipéptido I-TRAF, más
bien el ADN es autóctono del genoma de la célula huésped. La
siguiente vez se analizan las células que producen el polipéptido de
esta invención, o el aumento o descenso de los niveles de expresión,
según se desee. Las técnicas generales de tecnología de ADN
recombinante se describen, por ejemplo en Sambrook y col.,
Molecular Cloning: A Laboratoy Manual, Segunda Edición (Cold
Spring Harbor, Nueva Cork, Cold Spring Harbor Laboratory Press)
1989.
Para el objeto de la presente invención, puede
obtener ADN que codifica un polipéptido I-TRAF, por
ejemplo, a partir de librerías de ADNc preparadas de tejido que se
cree posee un ARNm de TRAF y expresa éste a nivel detectable. Por
ejemplo, se puede construir una librería de ADNc obteniendo el ARNm
poliadenilado de una línea celular de la que se conoce que expresa
una proteína TRAF, y usar el ARNm como molde para sintetizar ADNc de
doble cadena. Se han mostrado anteriormente en este documento líneas
celulares humanas y no humanas y tejidos adecuados para este
objetivo. Alternativamente, puede obtenerse ADN que codifica nuevos
polipéptidos I-TRAF a partir de librerías de ADNc
preparadas de tejidos de los que se conoce que expresan un
polipéptido I-TRAF previamente identificado a nivel
detectable. Los genes del polipéptido I-TRAF
también pueden obtenerse a partir de una librería genómica, tal como
una librería de cósmidos genómicos humanos.
Las librerías, de ADNc o genómicas, se analizan
por sondas diseñadas para identificar el gen de interés o la
proteína codificada por éste. Para las librerías de expresión de
ADNc, las sondas adecuadas incluyes anticuerpos monoclonales y
policlonales que reconocen y se unen específicamente a un
polipéptido I-TRAF. Para las librerías de ADNc, las
sondas adecuadas incluyen sondas oligonucleotídicas seleccionadas
cuidadosamente (normalmente de aproximadamente 20-80
bases de longitud) que codifican porciones conocidas o presuntas de
un polipéptido I-TRAF de la misma o diferente
especie, y/o ADNc complementarios u homólogos o fragmentos de estos
que codifican el mismo gen o uno similar. Las sondas apropiadas para
el análisis de librerías de ADN genómico incluyen, sin limitaciones,
oligonucleótidos, ADNc, o fragmentos de estos que codifican el mismo
gen o uno similar, y/o ADN genómicos homólogos o fragmentos de
estos. El análisis de la librería de ADNc o genómica con la sonda
seleccionada puede llevarse a cabo usando procedimientos estándar
como se describe en los Capítulos 10-12 de Sambrook
y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva
York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989):
Un procedimiento preferido para poner en práctica
esta invención es usar secuencias de oligonucleótidos seleccionados
cuidadosamente para analizar librerías de ADNc de diversos tejidos.
Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas pueden
ser suficientemente largas y suficientemente inequívocas como para
que se minimicen falsos positivos. La secuencia o secuencias
actuales normalmente se diseñan en base a regiones de una
I-TRAF que tiene la menor redundancia de codones.
Los oligonucleótidos pueden estar degenerados en una o más
posiciones. El uso de oligonucleótidos degenerados es especialmente
importante cuando se analiza una librería de una especie en la que
no se conoce el uso preferencial de los codones.
El oligonucleótido debe de marcarse de modo que
pueda detectarse tras la hibridación con el ADN de la librería que
se está analizando. El procedimiento preferido de marcaje es usar
ATP (por ejemplo, \gamma^{32}P) y la polipéptido quinasa para
radiomarcar el extremo 5' del oligonucleótido. Sin embargo, pueden
usarse otros procedimientos para marcar el oligonucleótido,
incluyendo, pero no de forma limitante, biotinilización o marcaje
enzimático.
Los ADNc que codifican las I-TRAF
también pueden identificarse y aislarte por otras técnicas conocidas
de tecnología de ADN recombinante, tales como clonación de expresión
directa o usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como
se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.683.195, expedida
el 28 de julio de 1987, en la sección 14 de Sambrook y col.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989, o en el Capítulo
15 de Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y
col., eds.; Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience, 1991. Este procedimiento
requiere el uso de sondas de oligonucleótidos que hibridarán con el
ADN que codifica una I-TRAF.
De acuerdo con un procedimiento preferido para
poner en práctica la invención, las secuencias que codifican las
proteínas I-TRAF pueden identificarse en una
librería de ADNc recombinante o en una librería de ADN genómico en
base a su capacidad para interaccionar con proteínas TRAF, por
ejemplo TRAF2. Para este objetivo se puede usan el sistema genético
de levadura descrito en Fields y colaboradores [Fields y Song,
Nature (Londres) 340, 245-246 (1989);
Chien y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
9578-9582 (1991)] como describen Chevray y Nathans
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
5789-5793 (1982)]. Muchos activadores
transcripcionales, tales como GAL4 de levadura, consisten en dos
dominios modulares físicamente discretos, uno actúa como el dominio
de unión a ADN mientras que el otro funciona como el dominio de
activación de la transcripción. El sistema de expresión de levadura
descrito en las publicaciones precedentes (generalmente referidos
como el "sistema de dos híbridos") aprovecha esta propiedad, y
emplea dos proteínas híbridas, una en la que la proteína diana se
fusiona con el dominio de unión a ADN de GAL4, y otra, en la que las
proteínas activadoras candidatas se fusionan con el dominio de
activación. La expresión de un gen indicador GAL1-lacZ bajo
el control de un promotor de GAL4 activado depende de la
reconstitución de la actividad de GAL4 por medio de la interacción
proteína-proteína. Las colonias que contiene
polipéptidos que interaccionan se detectan con un sustrato
cromogénico de la \beta-galactosidasa. Un kit
completo (MATCHMAKER^{TM}) para identificar las interacciones
entre dos proteínas específicas usando la técnica de los dos
híbridos de Clontech está disponible en el mercado. Este sistema
también puede extenderse a los dominios de un mapa proteico
implicados en interacciones específicas de proteína así como a
restos de aminoácidos puntuales que son cruciales para estas
interacciones. La clonación con dos híbridos de levadura puede
llevarse a cabo como se describe en Rothe y col.,
supra, usando TRAF2 o su dominio TRAF en el dominio GAL4 de
unión al ADN del vector pPC67 (Chevray y Nathans, supra) como
cebo.
Una vez que se conoce la secuencia, el gen que
codifica un polipéptido I-TRAF en particular
también pude obtenerse por síntesis química, siguiendo unos de los
procedimientos descritos en Engels y Uhlmann, Angew. Chem. Int.
Ed. Engl. 28, 716 (1989). Estos procedimientos incluyen
procedimientos triéster, fosfito, fosforamidita y
H-fosfonato, PCR y otros procedimientos de
autocebado, y síntesis de oligonucleótidos en soportes sólidos.
Los variantes de secuencia de aminoácidos de las
I-TRAF nativas y los fragmentos de
I-TRAF se preparan por procedimientos conocidos en
la técnica introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en un ADN
de I-TRAF nativo o variante, y por síntesis in
vitro del polipéptido deseado. Hay dos variables principales en
las construcciones de variantes de secuencia de aminoácidos: la
localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación.
Con la excepción de alelos que aparecen de forma natural, que no
requieren la manipulación de la secuencia de ADN que codifica la
I-TRAF, las variantes de secuencia de aminoácidos de
polipéptidos I-TRAF se construyen preferiblemente
por mutación del ADN, para llegar a un alelo o una variante de
secuencia de aminoácidos que no aparece en la naturaleza. Los
procedimientos para identificar restos diana en proteínas nativas y
para hacer variantes de secuencia de aminoácidos son bien conocidas
en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados
Unidos Nº 5.108.901 expedida el 28 de abril de 1992, y en la
Publicación PCT WO95/33501. Las técnicas preferidas incluyen
mutagénesis por análisis de alanina, mutagénesis por PCR,
mutagénesis por casete, el procedimiento de despliegue de fagoamida,
detalles de los cuales también se encuentran en libros generales de
texto, tales como, por ejemplo, Sambrook y col.,
supra, y Current Protocolos in Molecular Biology,
Ausubel y col., eds., supra.
Un grupo preferido de variantes de la secuencia
de aminoácidos de I-TRAF de la presente invención
comprende la sustitución, inserción y/o deleción de uno o más
aminoácidos en una región directamente implicada en la unión a TRAF.
Se espera que las alteraciones de aminoácidos en esta región tengan
como resultado cambios genuinos en la afinidad de unión de
I-TRAF/TRAF y puedan rendir variantes con afinidad
de unión más fuerte o débil que las I-TRAF nativas,
según se desee.
Los aminoácidos que aparecen de forma natural se
dividen en grupos en base a propiedades comunes de las cadenas
laterales:
(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu,
ile:
(2) hidrófobo neutro: cys, ser, thr;
(3) acídico: asp, glu;
(4) básico: asn, gln, his, lys, arg;
(5) restos que influyen en la orientación de la
cadena: gly, pro; y
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones conservativas implican
intercambio de un miembro de un grupo por otro miembro del mismo
grupo, mientras que las sustituciones no conservativas implicarán
intercambios de un miembro de una de estas clases por otra. Se
espera que las variantes obtenidas por sustituciones no
conservativas tengan como resultado cambios más significativos en
las propiedades/función biológica de la variante obtenida.
Las deleciones en la secuencia de aminoácidos
generalmente varían entre aproximadamente 1 a 30 restos, más
preferiblemente aproximadamente de 1 a 10 restos, y típicamente
están contiguos. Las deleciones preferiblemente se introducen en
regiones no directamente implicadas en la interacción con TRAF,
aunque también se contemplan deleciones, opcionalmente en
combinación con otro tipo de mutaciones, en el dominio de unión con
TRAF.
Las inserciones de aminoácidos incluyen fusiones
amino y/o carboxilo terminales oscilando en longitud de un resto a
polipéptidos que contiene una centena o más restos, así como
inserciones intrasecuencia de un único resto o múltiples restos de
aminoácidos. Las inserciones intrasecuencia (es decir, inserciones
en la secuencia de aminoácidos de la proteína
I-TRAF) puede oscilar generalmente de
aproximadamente 1 a 10 restos, más preferiblemente de 1 a 5 restos,
lo más preferiblemente de 1 a 3 restos. Ejemplos de inserciones
terminales incluyen los polipéptidos I-TRAF con un
resto metionil-N-terminal, un
artefacto de su expresión directa en cultivos celulares bacterianos
recombinantes, y fusión de una secuencia señal
N-terminal heteróloga con el extremo
N-terminal de la molécula I-TRAF
para facilitar la secreción de la I-TRAF madura de
las células huésped recombinantes. Estas secuencias de señal
generalmente se obtendrán a partir de, y de esta manera homóloga,
las especies huésped deseadas. Secuencias adecuadas incluyen STII o
1pp de E. coli, factor alfa de levadura, y señales virales
tales como la del herpes gD para células de mamífero.
Otras variantes de inserción de las moléculas de
I-TRAF nativas incluyen la fusión de los N y C
terminales de la molécula I-TRAF con polipéptidos
inmunogénicos, por ejemplo polipéptidos bacterianos tales como
beta-lactamasa y una enzima que codifica el locus
trp de E. coli, o proteína de levadura, y fusiones
C-terminales con proteínas que tiene una vida media
larga tales como regiones de inmunoglobulinas (preferiblemente
regiones constantes de inmunoglobulina para obtener
inmunoadhesinas), albúmina, o ferritina, como se describe en el
documento WO 89/02922 publicada en 6 de abril de 1989. Para la
producción de guiones de inmunoglobulina véase también la Patente de
Estados Unidos Nº 5.428.130 expedida el 27 de junio, 1995.
Puesto que a menudo es difícil predecir por
adelantado las características de una variante TRAF, se comprenderá
que sea necesario análisis para seleccionar la variante óptima. Para
este objetivo se dispondrá fácilmente de ensayos de análisis, tales
como aquellos descritos con anterioridad en el presente
documento.
Las variantes de secuencia de aminoácidos
preferidas de polipéptidos I- TRAF con secuencia nativa tienen
suprimidas las secuencias no requeridas para la unión a TRAF (por
ejemplo, la mayoría de los aminoácidos desde la posición 237 al
extremo C-terminal de la secuencia de
I-TRAF murina), dejando la región de interacción con
TRAF como el único dominio funcionalmente intacto. Estas variantes
adicionalmente pueden tener sustituciones, inserciones y/o
deleciones en la región de interacción con TRAF, para optimizar sus
propiedades de unión, estabilidad u otras características.
Una vez que se dispone del ácido nucleico de una
I-TRAF nativa o variante, generalmente se liga en un
vector de expresión replicable para la clonación (amplificación del
ADN) o expresión posterior.
Los vectores de expresión y clonación son bien
conocidos en la técnica y contienen una secuencia de ácido nucleico
que permite al vector replicarse en una o más células huésped
seleccionadas. La selección de un vector apropiado dependerá de 1)
si éste se usará para amplificación de ADN o para expresión de ADN,
2) el tamaño del ADN que se insertará en el vector, y 3) la célula
huésped que se transforma con el vector. Cada vector contiene
diversos componentes dependiendo de su función (amplificación de ADN
o expresión de ADN) y la célula huésped con la que es compatible.
Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no de forma
limitante, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un
origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento
potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la
transcripción. Vectores de expresión adecuados, para usar en
combinación con varias células huésped, son bien conocidos en la
técnica, y sus representantes preferidos se han mostrado
anteriormente en el presente documento.
Después se transforma la célula huésped, se
cultiva, y se detecta la amplificación/expresión del gen por
procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como aquellos
descritos en Sambrook et col., supra, y Ausubel y
col., supra.
Los polipéptidos I-TRAF
típicamente se recuperan a partir de lisados de células huésped
recombinantes. Cuando I-TRAF se expresa en una
célula huésped recombinante no de origen humano, está completamente
libre de proteína o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es
necesario purificar la proteína I-TRAF a partir de
las proteínas o polipéptidos de la célula recombinante para obtener
preparaciones de la I-TRAF sustancialmente
homogéneas. Como primera etapa, el medio de cultivo o lisado se
centrifuga para eliminar los restos celulares particulados. Después
se separan las fracciones de membrana y soluble. Entonces puede
purificarse la proteína I-TRAF a partir de la
fracción de proteína soluble. Los siguientes procedimientos son
ejemplos de procedimientos de purificación adecuados:
fraccionamiento o inmunoafinidad en columnas de intercambio iónico;
precipitación con etanol: HPLC en fase inversa; cromatografía en
gel de sílice o en una resina de intercambio catiónico tal como
DEAE; cromatoenfoque; PAGE-SDS: precipitación con
sulfato amónico; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex
G-75; y columnas de proteína A Sepharosa para
eliminar contaminantes tales como IgG. El esquema preferido para
purificación de I-TRAF nativas a partir de células
en las que aparece de forma natural es igualmente adecuado para la
purificación de I-TRAF recombinantes, incluyendo
derivados funcionales de las moléculas nativas, a partir de células
huésped recombinantes.
Las modificaciones covalentes de
I-TRAF se incluyen en el alcance de este documento.
Estas modificaciones tradicionalmente se introducen por reacción de
los restos de aminoácidos diana de la I-TRAF con un
agente orgánico derivatizante capaz de reaccionar con los restos
laterales o terminales seleccionados, o por mecanismos de engarce de
modificaciones post-traduccionales que funcionan en
células huésped recombinantes seleccionadas. Los derivados
covalentes resultantes son útiles en programas dirigidos a
identificar restos importantes para la actividad biológica, para
inmunoensayos de la I-TRAF, o para la preparación
de anticuerpos anti-I-TRAF para
purificación por inmunoafinidad. Por ejemplo, la inactivación
completa de la actividad biológica de la proteína tras la reacción
con ninhidrina podría sugerir que al menos un resto arginilo o
lisilo es crítico para su actividad, donde antes los restos
individuales modificados en las condiciones seleccionadas se
identifican por aislamiento de un fragmento peptídico que contiene
el resto de aminoácido modificado. Estas modificaciones están dentro
de la práctica normal de la técnica y se llevan a caso sin excesiva
experimentación.
Los restos cisteinilo reaccionan más
frecuentemente con \alpha-haloacetatos (y aminas
correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida,
para dar derivados carboximetilo o carboxiamidometilo. Los restos
cisteinilo también se derivatizan por reacción con
bromotrifluoroacetona, ácido
\alpha-bromo-\beta-(5-imidozoil)
propiónico, cloroacetil fosfato,
N-alquilmaleimidas,
3-nitro-2-piridildisulfuro,
metil-2-piridildisulfuro,
p-cloromercuribenzoato,
2-cloromericuri-4-nitrofenol,
o
cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.
Los restos histidilo se derivatizan por reacción
con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este
agente es relativamente específico de la cadena lateral del
histidilo. También es útil el bromuro de
para-bromofenacilo; preferiblemente la reacción se
lleva a cabo en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.
Los restos lisinilo y amino terminales reaccionan
con ácido succinico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La
derivatización con estos agentes tiene el efecto de revertir la
carga del resto lisinilo. Otros reactivos adecuados para la
derivatización de restos que contiene restos
\alpha-amino incluye imidoésteres tales como
metilpicolinimidato; piridoxalfosfato; piridoxal; borohidruto de
cloro, ácido trinitrobencenosulfónico,
O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y
reacción catalizada por transaminasa con glioxalato.
Los restos arginilo se modifican por reacción con
uno o varios reactivos convencionales, entre estos fenilglioxal,
2,3-butanodiona, 1,2,-ciclohexanodiona, y
ninhidrina. La derivatización de restos de arginina requiera que la
reacción se lleve a cabo en condiciones alcalinas debido al alto
pK_{a} del grupo funcional de la guanidina. Además, estos
reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como con el
grupo épsilon-amino de la arginina.
La modificación específica de los restos tirosilo
puede hacerse, con particular interés en introducir marcadores
espectrales en el residuo tirisilo por reacción con compuestos
aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Más frecuentemente, se
usan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar
especies O-acetiltirosilo y derivados
3-nitro, respectivamente. Los restos tirosilo se
marcan con yodo usando ^{125}I ó ^{131}I para preparar proteínas
marcadas de uso en radioinmunoensayo.
Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o
glutamilo) se modifican selectivamente por reacción con
carbodiimidas (R'-N=C=N-R') tales
como
1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida
y
1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)
carbodiimida. Además, los restos aspartilo y glutamilo se convierten
en restos asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones
amonio.
Los restos glutaminilo y asparaginilo
frecuentemente se desamidan a los correspondientes restos glutamilo
y aspartilo. Alternativamente, estos restos se desamidan en
condiciones ligeramente acídicas Cualquier forma de estos residuos
entra en el alcance de esta invención.
Otras modificaciones incluyen hidroxilación de
prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de restos
serilo, treonilo o tirosilo, metilación de grupos
\alpha-amino de cadenas laterales de lisina,
arginina, e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Properties, W.H. Freeman y Co., San Francisco, pág.
79-86 [1983]), acetilación de la amina
N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo
C-.terminal. Adicionalmente, las moléculas pueden unirse
covalentemente con polímeros no proteicos, por ejemplo
polietilénglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la
manera mostrada en el documento U.S.S.N. 07/275.296 o en las
patentes de Estados Unidos 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;
4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
La derivatización con agentes bifuncionales es
útil para preparar agregados intramolecular de
I-TRAF con polipéptidos así como para la
reticulación del polipéptido a una matriz o superficie soporte
insoluble en agua de uso en ensayos o purificación por afinidad.
Además, un estudio de entrecruzamiento intercadena proporcionará
información directa de la estructura conformacional. Los agentes de
entrecruzamiento comúnmente usados incluyen
1,1-bis(diazoacetil)-2-
feniletano, glutaraldehido, esteres de
N-hidroxisuccinimida, imodoésteres homofuncionales,
y maleimidas bifuncionales. Agentes de derivatización tales como
metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato
rinden intermediarios fotoactivables que son capaces de formar
entrecruzamientos en presencia de luz. Alternativamente, las
matrices reactivas insolubles en agua tales como carbohidratos
activados con bromuro de cianógeno y los sistemas de sustratos
reactivos descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº 3.959.642,
3.969.287, 3.691.016, 4.195.128, 4.247.642, 4.229.537, 4.055.635, y
4.330.440 se emplean para la inmovilización y reticulación de
proteína.
Ciertas modificaciones postraduccionales son el
resultado de la acción de las células huésped recombinantes en los
polipéptidos expresados. Los restos glutaminil y asparginil
frecuentemente se desamidan postraduccionalmente a los restos
glutamilo y aspartilo correspondientes. De forma alternativa, estos
restos se desamidan en condiciones ligeramente acídicas. Cualquier
forma de estos restos entra en el alcance de esta invención.
Otras modificaciones postranslacionales incluyen
hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo
de restos serilo, treonilo o tirosilo, metilación de los grupos
\alpha-amino de las cadenas laterales de lisina,
arginina, e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Properties, W.H., Feeman y Co., San Francisco, pág.
79-86 (1983)].
El TRAF puede incluirse en microcápsulas
preparadas, por ejemplo, con técnicas de coacervación o
polimerización interfacial, en sistemas de suministro de fármacos
coloidales (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina,
microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en
microemulsiones. Estas técnicas se describen en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16ª Edición, Osol, A. Ed. (1980).
Los ácidos nucleicos que codifican los
polipéptidos I-TRAF de la presente invención
encuentran varias aplicaciones en sí mismos, incluyendo uso como
transcritos traducibles, sondas de hibridación para identificar
ácidos nucleicos que codifican I-TRAF de otras
especies y/o polipéptidos estructuralmente relacionados, cebadores
de PCR, y ácidos nucleicos terapéuticos, incluyendo aplicaciones de
terapia génica.
En las aplicaciones de terapia génica, los genes
se introducen en las células para obtener la síntesis in vivo
de un producto genético terapéuticamente efectivo, por ejemplo por
sustitución de un gen defectuoso. "Terapia génica" incluye
tanto la terapia génica convencional donde se alcanza un efecto
duradero por un único tratamiento, como la administración de agentes
terapéuticos génicos, que implican la administración una o
repetidas veces de un ADN o ARNm terapéuticamente efectivo. Pueden
usarse ARN antisentido y ADN como agentes terapéuticos para bloquear
la expresión in vivo de ciertos genes. Ya se ha demostrado
que pueden importarse a las células oligonucleótidos antisentido
cortos donde actúan como inhibidores a pesar de sus bajas
concentraciones intracelulares causadas por su restringida captación
por la membrana celular (Zamecnik y col., Proc. Natl Acad.
Sci. USA 83, 4143-4146 [1986]), Los
oligonucleótidos pueden modificarse para potenciar su captación, por
ejemplo sustituyendo sus grupos fosfodiester cargados negativamente
por grupos no cargados.
Hay varias técnicas disponibles para introducir
ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían
dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a células
cultivada in vitro, o in vivo en las células del
huésped deseado. Técnicas adecuadas para la transferencia de ácido
nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el uso de
liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular,
DEAE-dextrano, procedimiento de precipitación con
fosfato cálcico, etc., Las técnicas de transferencia de genes in
vivo preferidas actualmente incluyen transfección con vectores
virales (típicamente retrovirales) y transfección mediada por
liposomas con proteína de la cubierta viral (Dzau y col.,
Trends in Biotechnology 11, 205-210
[1993]). En algunas situaciones es deseable suministrar la fuente
de ácido nucleico con un agente que se dirija hacia las células
diana, tales como un anticuerpo específico de una proteína de
membrana de la superficie celular o de la célula diana, un ligando
para un receptor en la células diana, etc. Cuando se emplean
liposomas, pueden usarse proteínas que se unen a la proteína de
membrana de la superficie celular asociada con endocitosis para
dirigir y/o facilitar la captación, por ejemplo proteínas de la
cápside o fragmentos trópicos de la misma para un tipo de célula en
particular, anticuerpos para proteínas que experimentan
internalización cíclica, proteínas que se dirigen a localización
intracelular y potencia la vida media intracelular. La técnica de
endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo en Wu
y col., J. Biol. Chem. 262,
4429-4432 (1987); y en Wagner y col.,
Proc. Natl. Acad Sci. USA 87,
3410-3414 (1990). Para revisión de los conocimientos
actuales en protocolos para marcaje de genes y terapia génica véase
Anderson y col., Science 256,
808-813 (1992).
Los polipéptidos I-TRAF son
útiles en ensayos de identificación de cabezas de serie para agentes
terapéuticamente activos que modulan la unión
I-TRAF/TRAF. Específicamente, los cabezas de serie
que pueden prevenir la formación de complejos
I-TRAF/TRAF o prevenir o inhibir la disociación de
los complejos I-TRAF/TRAF ya formados pueden ser
convenientemente identificados. Las moléculas que previene la
interacción de I-TRAF y TRAF puede encontrar
utilidad en circunstancias en las que se desea potenciar la
respuesta inmune. Los inhibidores de la disociación de complejos
I-TRAF/TRAF pueden ser útiles como agentes
inmunosupresores o antiinflamatorios. Los ensayos de análisis
también pueden diseñarse para encontrar cabezas de serie que
mimetizan la actividad biológica de un ligando nativo de un miembro
de la superfamilia de receptores de TNF con el que se asocia una
proteína TRAF, por ejemplo, TNF, ligando de CD40, ligando de CD30,
etc. Estos procedimientos de análisis implican ensayar la capacidad
de los agentes candidatos para liberar las TRAF de la inhibición de
I-TRAF.
Los ensayos de análisis de la presente invención
están disponibles para análisis de gran capacidad de librerías
químicas, y son particularmente adecuados para identificar pequeñas
moléculas de fármacos candidatos. Se prefieren como terapéuticas,
pequeñas moléculas que normalmente tiene menos de 10 K de peso
molecular, ya que pernean más fácilmente en las células, son menos
susceptibles de degradación por diversos mecanismos celulares, y no
son tan aptas para provocar una respuesta inmune como las proteínas.
Las pequeñas moléculas incluyen pero no de forma limitante
compuestos sintéticos orgánicos o inorgánicos. Muchas compañías
farmacéuticas tienen amplias librerías de estas moléculas, que
pueden analizarse convenientemente usando los ensayos de la presente
invención.
Los ensayos pueden llevarse a cabo en varios
formatos, incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína, ensayos de análisis bioquímico,
inmunoensayos, ensayos a base de células, etc. Estos formatos de
ensayos son bien conocidos en la técnica.
Las mezclas de ensayo típicamente contienen una
I-TRAF y una proteína TRAF con la que
I-TRAF normalmente se asocia (por ejemplo TRAF2 o
TRAF3), normalmente en forma aislada, parcialmente pura o pura. Uno
o ambos compuestos puede fusionarse con otro péptido o polipéptido,
que puede, por ejemplo, proporcionar o potenciar la interacción
proteína-proteína, mejorando la estabilidad en las
condiciones del ensayo, etc. Además, uno de los compuestos
normalmente comprende o está unido a un marcador detectable. El
marcador puede proporcionar detección directa midiendo
radiactividad, luminiscencia, densidad óptica o electrónica, etc., o
detección indirecta tal como un epítopo marcador, un enzima, etc. La
mezcla de ensayo adicionalmente comprende un agente farmacológico
candidato, y opcionalmente otros compuestos varios, tales como
sales, tampones, proteínas vehículo, por ejemplo, albúmina,
detergentes, inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa,
agentes antimicrobianos, etc., que facilitan la unión, aumentan la
estabilidad, reducen las interacciones no específica o de fondo o,
aparte de esto, mejoran la eficacia o sensibilidad del ensayo.
Para analizar los inhibidores de la unión
I-TRAF/TRAF, la mezcla del ensayo se incuba en
condiciones similares, excepto por la presencia del agente
farmacológico candidato. La I-TRAF une
específicamente la proteína TRAF con una afinidad de unión de
referencia. Los componentes de la mezcla puede añadirse en cualquier
orden que mantenga el requisito de la unión. La incubación puede
llevarse a cabo a cualquier temperatura que facilite la unión
óptima, típicamente entre aproximadamente 4º y 40ºC, más
frecuentemente entre aproximadamente 15º y 40ºC. Los periodos de
incubación igualmente se seleccionan para la unión óptima, pero
minimizados también para facilitar un análisis rápido, de gran
capacidad, y típicamente es de entre aproximadamente 0,1 y 10 horas,
preferiblemente menos de 5 horas, más preferiblemente menos de 2
horas. Tras la incubación, el efecto del agente farmacológico
candidato en la unión I-TRAF/TRAF se determina en
cualquier forma conveniente. Para los ensayos del tipo de unión a
célula libre, a menudo se usa una fase de separación para separar
los componentes unido y no unido. La separación puede efectuarse,
por ejemplo, por precipitación (por ejemplo precipitación con TCA,
inmunoprecipitación, etc.), inmovilización (por ejemplo en un
sustrato sólido) seguido de lavado. La proteína unida se detecta
convenientemente utilizando un marcador unido a esta, por ejemplo
midiendo la emisión radiactiva, densidad óptica o electrónica, o por
detección indirecta usando, por ejemplo conjugados con
anticuerpo.
Los compuestos que inhiben o previenen la
disociación de los complejos I-TRAF/TRAF pueden
identificarse convenientemente formando el complejo I- TRAF/TRAF en
ausencia del gente farmacológico, añadiendo el agente a la mezcla y
cambiando las condiciones de modo, que debido a la presencia del
agente candidato, TRAF pueda liberarse de su forma complejada. Como
ejemplo, este compuesto puede ser un ligando nativo de la señal de
transducción mediada por TRAF, por ejemplo, un ligando de CD40, un
ligando de CD30, etc. Después puede detectarse la concentración de
TRAF libre o unido y/o puede determinarse la constante de
disociación del completo I-TRAF/TRAF y compararla
con la del control.
Para identificar los cabezas de serie como
agentes terapéuticamente activos que mimetizan la actividad
biológica de un ligando nativo de un miembro de la superfamilia de
receptores de TNF con los que se asocia una proteína TRAF (por
ejemplo TNF, ligando de CD40, ligando de CD30, etc.), el agente
candidato se añade a la mezcla de I-TRAF y TRAF (por
ejemplo TRAF2 y TRAF). La proporción mutua de la proteína TRAF y la
proteína celular y las condiciones de incubación se seleccionan de
modo que los complejos I-TRAF/TRAF se forman antes
de la adición del agente candidato. Tras la adición de un agente
candidato, se ensaya su capacidad para liberar TRAF del complejo
I-TRAF/TRAF. Las condiciones típicas de ensayo, por
ejemplo, temperatura de incubación, tiempo, separación y detección
de material unido y no unido, etc., se describen anteriormente en
este documento. En una versión en particular de este ensayo, la
mezcla de ensayo adicionalmente contiene una proteína celular con la
que TRAF normalmente está asociada (por ejemplo,
TNF-R2 o CD40), y la proporción mutua de la proteína
TRAF y de la proteína celular y las condiciones de incubación se
seleccionan de modo que la señalización de TRAF no tenga lugar antes
de la adición del análogo de ligando candidato. Tras la adición de
la molécula candidata, se detecta su capacidad para iniciar un
suceso de señalización mediada por TRAF. Como punto final, es
posible medir la capacidad de un agente candidato para inducir la
activación de NF-\kappa.B mediada por TRAF de
forma convencional. De acuerdo con un procedimiento preferido, se
usa un gen indicador dependiente de NF-\kappaB,
tal como una construcción indicadora de
E-selectina-luciferasa (Schindler y
Baichwal, Mol. Cell. Biol. 14, 5820 [1994]) en un
ensayo de tipo celular. Las actividades luciferasa se determinan y
normalizan en base a la expresión de
\beta-galactosidasa. Alternativamente, la
activación de NF-\kappaB puede analizarse por
ensayos de cambios en la movilidad electroforética (Schütze y
col., Cell 71, 765-776 [1992]).
Sin embargo, otros ensayos bioquímicos convencionales son
igualmente adecuados para detectar la liberación de TRAF de su forma
complejada (e inhibida).
Basado en su capacidad para unir TRAF, pueden
usarse los polipéptidos I-TRAF de la presente
invención para purificar TRAF nativas y variantes y sus derivados
funcionales, que, por turnos, son útiles para la purificación de
TNR-R2, CD40 y otros miembros de la superfamilia de
receptores de TNF a los que se unen de forma específica. Los
miembros de la superfamilia de receptores de TNF son candidatos
prometedores para el tratamiento de varias afecciones patológicas,
por ejemplo, TNF-R2 (como proteína soluble o como
una inmunoadhesina TNF-R2-Ig) está
en ensayos clínicos para el tratamiento del choque (séptico)
endotóxico y de la artritis reumatoide (RA).
Las moléculas de la presente invención
adicionalmente puede usarse para generar anticuerpos bloqueantes
(antagonistas) o agonistas
anti-I-TRAF, que bloquean o
mimetizan la capacidad de I-TRAF para inhibir la
transducción de la señal mediada por TRAF. Los procedimientos
genéricos para la generación de anticuerpos son bien conocidos en la
técnica y se describen, por ejemplo, en los libros de texto y otra
bibliografía referenciada anteriormente en este documento en
conexión con la definición de anticuerpo y técnicas generales
relacionadas con la tecnología de ADN recombinante.
Las moléculas I-TRAF (incluyendo
derivados funcionales de I-TRAF nativas) también son
útiles como agente terapéuticos para el tratamiento de condiciones
patológicas asociadas con efectos secuencia abajo del encogen LMP1
en el crecimiento celular y la expresión génica. LMP1 es una
proteína transformante del virus de Epstein-Barr de
la que se cree que juega una función importante en el desarrollo de
tumores asociados con el virus EB, tales como linfoma de Burkitt
(cáncer de linfocitos B) que tiene alta incidencia en el Este de
África y en Papua Nueva Guinea, y carcinoma nasofaríngeo, que es más
común en el Sur de China y en Groenlandia. Basado en su capacidad
para bloquear la señalización mediada por TRAF a través de LMP1, las
I-TRAF de la presente invención pueden inhibir los
efectos secuencia debajo de LMP1, incluyendo la activación de
NF-\kappaB mediada por LMP1, y son, opcionalmente
en combinación con otras terapias contra el cáncer, agentes
prometedores para el tratamiento de estos tipos de cánce-
res.
res.
La eficacia in vivo del tratamiento puede
estudiarse contra tumores inducidos químicamente en varios modelos
de roedores. Las líneas celulares tumorales propagadas en cultivos
celulares in vitro pueden introducirse en roedores de
experimentación, por ejemplo en ratones, por inyección, por ejemplo
por al ruta subcutánea. Técnicas de inducción química de tumores en
animales de experimentación son bien conocidas en la técnica.
El tratamiento puede combinarse con terapias
tumorales conocidas, tales como terapia de radiación, quimioterapia,
terapia con inmunotoxina.
Las composiciones terapéuticas que comprenden los
polipéptidos I-TRAF de la presente invención,
incluyendo derivados funcionales, se preparan para almacenamiento
mezclando el ingrediente activo con el grado de pureza deseado con
vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente
aceptables (Remington's Pharmaceutical Science, 16ª Edición, Osol,
A. Ed. 1980) en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones
acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no
serán tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones
empleadas, e incluyen tampones tálese como fosfato, citrato y otros
ácidos orgánicos; antioxidantes incluyen ácido ascórbico;
polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10
restos); proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o
inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como
polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como glicina, glutamina,
asparragina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros
carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes
quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o
sorbitol; contraiones que forman sales tales como sodio; y/o
tensioactivos no iónicos tales como Tween, Pluronicos o
PEG:
PEG:
Los ingredientes activos también pueden estas
incluidos en preparaciones de microcápsulas, por ejemplo, por
técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por
ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y
microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente), en
sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas,
microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y
nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se describen en
Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.
Las formulaciones usadas para administración
in vivo han de estar estériles. Esto se consigue fácilmente
por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes
o después de la liofilización y reconstitución.
Las composiciones terapéuticas de este documento
generalmente se sitúan en un recipiente que tiene un sitio de acceso
estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial
que tiene un cierre perforable por una aguja de inyección
hipodérmica.
La ruta de administración está de acuerdo con
procedimientos conocidos, por ejemplo inyección o infusión por vía
intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular,
intraocular, intraarterial o rutas dentro de las lesiones, o por
sistemas de liberación mantenida.
Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación
mantenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de
artículos conformados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Las
matrices de liberación mantenida incluyen poliésteres, hidrogeles,
polilactidas (Patente de Estados Unidos Nº 3.773.919, documento EP
58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma
etil-L-glutamato (U. Sidman y
col., Biopolymers, 22 (1): 547-556
[1983]), poli
(2-hidroxietil-metacrilato) (R.
Langer y col, J. Biomed. Mater. Res., 15:
167-277 [1981], y R. Langer, Chem. Tech.,
12: 98-105 [1982]), acetato de etilénvinilo
(R. Langer y col., Id) o ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico
(documento EP 133.988). Las composiciones de liberación mantenida
también incluyen liposomas. Los liposomas que contienen una
molécula dentro del alcance de la presente invención se preparan
por procedimientos conocidos per se: documento DE 3.218.121;
Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:
3688-3692 (1985); Hwang y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034
(1980); documento EP 52322; documento EP 36676A; documento EP
88046; documento EP 143949; documento EP 142641; solicitud de
Patente Japonesa 83-118008; Patentes de Estados
Unidos 4.485.045 y 4.544.545; y documento EP 102.324. Generalmente
los liposomas son del tipo unilamelar más pequeño (aproximadamente
200-800 Ángstroms) en los que el contenido lipídico
es mayor de aproximadamente 30% de colesterol, la proporción
seleccionada se ajustó para la terapia NT-4
óptima.
\newpage
Una cantidad eficiente del ingrediente activo
dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, de la ruta
de administración, y del estado del paciente. Por lo tanto, será
necesario que el terapeuta titule la cantidad de dosis y modifique
la ruta de administración como se requiera para obtener el efecto
terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica puede oscilar de
aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de
los factores mencionados anteriormente. Típicamente, el clínico
administrará una molécula de la presente invención hasta una dosis
que proporcione el efecto biológico requerido. El progreso de esta
terapia se sigue fácilmente por ensayos convenciona-
les.
les.
Detalles adicionales de la invención serán
evidentes a partir de los siguientes ejemplos no limitantes.
I-TRAF se identificó en un
sistema de análisis de dos híbridos de levadura (Fields y Song,
Nature 340, 245-246 [1989]) como se ha
descrito (Rothe y col., Cell 78
681-692 [1994]), usando TRF2 de longitud completa en
el vector pPC97 del dominio de unión a ADN de GAL4 (Chevray y
Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
5789-5793 [1992]) como cebo. Se construyó una
librería de ADNc plasmídico en el vector pPC86 del dominio de
activación transcripcional de GAL4 (Chevray y Nathans, supra)
a partir de ADNc de doble hélice de la línea celular del estroma de
hígado fetal 7-4 adaptado en
SalI-NotI (FL, Rothe y col., supra) y de
nódulos linfoides periféricos murinos (PLN; suministrados por P.
Young, D. Dowbenko, y L. Lasky, Patente de Estados Unidos Nº
5.304.640 expedida el 19 de abril, 1994). Los rendimientos de
transformación de las dos librerías fueron de 10 y 1 millón,
respectivamente. Los mapas de restricción de 24 clones positivos
indicaron que la mayoría derivaban del mismo gen. Cuatro clones de
ADNc de FL y dos de PLN se secuenciaron en un secuenciador
automático de ADN 373A (Applied Biosystems). También se secuenciaron
los extremos 5' de seis clones adicionales de ADN de
I-TRAF murina aislados por selección de una librería
de ADNc de CT6 preparada en \lambdagt221 (Rothe y col.,
supra). Los ADNc aislados correspondían a varios transcritos
diferentes del gen I-TRAF murino. Debido a un ayuste
alternativo, estos transcritos tienen la capacidad de utilizar dos
codones de iniciación de traducción diferentes. Se predice que las
dos formas principales de ARNm de I-TRAF codifican
dos proteínas de 413 y 477 aminoácidos que se denominan
I-TRAF\alpha e I-TRAF\beta,
respectivamente (Figura 1a; SEC. ID. Nº 1 y 2).
Se secuenciaron cinco clones de ADNc de
I-TRAF humana, obtenidos por selección de una
librería de ADNc de HUVEC en \lambdagt221 (Hsu y col.,
Cell 81, 495-504 [1995]) con una
sonda de I-TRAF murina. Todos los ADNc de
I-TRAF humana aislados codifican una proteína de
longitud completa de 425 aminoácidos (M, 48 K) que muestra una
identidad de aminoácidos del 82% con la
I-TRAF\alpha murina (Figura 1a). Las búsquedas en
bases de datos no revelaron ninguna proteína que tenga una similitud
significativa de secuencia con I-TRAF. Los análisis
de transferencia por Northern usando ARNm de tejidos de ratón
indicaron que el ARNm de I-TRAF de \sim2,4 kb se
expresa de forma ubicua (Figura 1b). La transferencia de tejido
múltiple (Clontech) se hibridó con una sonde de ADNc de
I-TRAF murina de acuerdo con el protocolo de
Clontech. El ARNm de I-TRAF es la banda de
\sim2,4 kb.
Las secuencias de ADNc de I-TRAF
murina y humana se depositaron en el GenBank y en la American Type
Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA:
con números de acceso y, respectiva-
mente.
mente.
La inspección de los diversos ADNc de
I-TRAF obtenidos de la selección de dos híbridos
indica que la porción N-terminal de
I-TRAF murina (aminoácidos 35-236)
es suficiente para la interacción con TRAF2. Se llevaron a cabo
experimentos de dos híbridos adicionales para determinar que porción
de TRAF2 se requiere para la interacción con I-TRAF.
Células de levadura HF7c se contransformaron con un vector de
expresión que codifica una proteína de fusión del dominio de
activación de GAL14-I-TRAF y los
vectores de expresión de dominio de unión a ADN de Gal4 indicado
(Rothe y col., supra). Cada mezcla de transformación
se puso en una placa de dextrosa sintética carente de leucina y
triptófano. Se llevaron a cabo ensayos de filtro de actividad
\beta-galactosidasa para detectar la interacción
entre las proteínas de fusión (Fields y Song, supra). Los
datos se presentan a continuación en la Tabla
1.
1.
| Híbrido del dominio de unión a ADN | Híbrido del dominio de activación | Interacción* |
| - | I-TRAF | - |
| TRAF1 | I-TRAF | ++ |
| TRAF2 | I-TRAF | ++ |
| TRAF2 (87-501) | I-TRAF | ++ |
| TRAF3 | I-TRAF | + |
| TNF-R2 | I-TRAF | - |
| * \begin{minipage}[t]{150mm} Dos signos positivos y un signo positivo indican fuerte desarrollo de color azul tras 30 minutos y una hora de ensayo, respectivamente. El signo negativo indica que no se desarrolló color en 24 horas. \end{minipage} |
Los resultados muestran que sólo se requiere el
dominio TRAF conservado (aminoácidos 264-501) de
TRAF2 par ala interacción con I-TRAF. Además, TRAF1
y TRAF3 también se asocian con I-TRAF.
Se examinaron las interacciones de TRAF1 marcado
con ^{35}S (Rothe, y col., supra), TRAF2 (Rothe
y col., supra), TRAF3 (Hu y col.,
supra, TNF-R2 (Smith y col.,
Science 248, 1019-1023 [1990]), y
TRADD (Hsu y col., Cell 81,
495-504 [1995]) con I-TRAF\alpha
expresada como una proteína de fusión
(GST-I-TRAF) de la
glutation-S-transferasa (GST) y la
proteína de control de GST.
GST-I-TRAF se expresó usando el
vector pGEX3X (Pharmacia) y se purificó como se ha descrito (Smith
y Johnson, Gene 67, 31-40 [1988]). Las
proteínas marcadas con ^{35}S se generaron usando un sistema de
lisado de reticulocitos conjugado con TNT (Promega) y los diversos
ADNc se clonaron en pBluescript KS (Stratagene) o en pRK5 (Schall
y col., Cell 61, 361-370
[1990]. Para cada ensayo de unión, se incubaron 0,5 \mug de
GST-I-TRAF ó 0,5 \mug de GST
unidos a perlas de glutation Sepharosa con el equivalente en cpm de
las proteínas individuales marcadas con ^{35}S en 1 ml de tampón
E1A (HEPES 50 mM [pH 7,6], NaCl 250 mM, NP-40 al
0,1%, EDTA 5 mM) a 4ºC durante 1 hora. Las perlas se lavaron seis
veces con tampón E1A y los precipitados se fraccionaron en
PAGE-SDS al 10%, El gel se secó y expuso a una
película Kodak de rayos X. Por este ensayo se encontró que
I-TRAF interacciona de forma específica con TRAF1,
TRAF2, y TRAF3.
Los resultados tanto de los experimentos de dos
híbridos como los de unión in vitro muestran que
I-TRAF interacciona más fuertemente con TRAF1 y TRAF
2 que con TRAF3.
I-TRAF no interacciona
directamente con TNF-R2 (Tabla 1). Sin embargo, como
TRAF1 y TRAF2 forman un complejo con TNF-R2, era
importante preguntarse si I-TRAF puede asociarse
indirectamente con TNF-R2 por medio de las TRAF. Se
llevó a cabo un ensayo de interacción de tres híbridos (Rothe y
col., supra) para responder a esta pregunta. Mientras que
TRAF2 puede unirse simultáneamente a TRAF1 y a
TNF-R2 (Rothe y col., supra), no es
capaz de mediar en la interacción de I-TRAF con
TNF-R2. De hecho, se encontró que la expresión de
I-TRAF en levaduras inhibe la asociación de TRAF2
con TNF-R2 (dato no mostrado). Este resultado es
coherente con la unión tanto de I-TRAF como de
TNF-R2 al mismo dominio TRAF
C-terminal de TRAF2.
El efecto inhibitorio observado de
I-TRAF en la interacción
TRAF2:TNF-R2 se investigó posteriormente en células
de mamífero. TRAF2 y I-TRAF se expresaron como
proteínas de longitud completa que contenían etiquetas con epítopo
FLAG en N-terminal (Kodak) usando el vector de
expresión basado en citomegalovirus pRK5 (Schall y col.,
supra). Las células de riñón embriónico humano 293 (2 x
10^{6}) se sembraron en placas de 150 mm y se transfectaron
(Ausubel y col., Curr Prot Mol Biol 1,
9.1.1-9.1.3 [1994]) al día siguiente con el vector
de expresión pRK-TRAF2 (0 ó 1 \mug) (Rothe y
col., Science en imprenta; Publicación PCT Nº
WO95/33051) y cantidades crecientes del vector de expresión
pRK-FLAG-I-TRAF (0,
1, 3, ó 9 \mug). Las células se incubaron a 37ºC durante 24 horas,
y se lisaron en 0,5 ml de tampón E1A. Se incubaron alícuotas de 450
\mul de los lisados con 10 \mul de proteína de fusión GST-
TNF-R2 (Rothe y col., Cell,
supra, Publicación PCT Nº WO95/33051) unida a perlas de
glutation Sepharosa durante 15 minutos a 4ºC. Las perlas se lavaron
tres veces con 0,6 ml de tampón E1A y las proteínas unidas se
fraccionaron por PAGE-SDS al 8% y se transfirieron a
una membrana de nitrocelulosa. El análisis de la transferencia por
Western se llevó acabo usando un anticuerpo monoclonal M2
anti-FLAG (Kodak) e inmunoglobulina de conejo
anti-ratón conjugada con la peroxidasa de rábano
picante (Amersham). La detección se hizo por quimioluminiscencia
potenciada de acuerdo con el protocolo de Amersham. El análisis de
transferencia por Western de alícuotas de 50 \mul de los lisados
indicaba que los niveles de expresión de TRAF2 eran similares en
todas las muestras transfectadas con pRK-TRAF2 (dato
no mostrado). Las coexpresión de TRAF2 con cantidades crecientes de
I-TRAF bloqueaba de forma efectiva la interacción
TRAF2:TNF-R2 (Figura 3). Además, el complejo
TRAF2:TNF-R2 no precipitada I-TRAF.
Estos resultados muestran que TRAF2 no es capaz de unirse a
TNF-R2 e I-TRAF simultáneamente,
posiblemente debido a sitios de unión que se solapan.
La capacidad de I-TRAF para unir
el tercer miembro conocido de la familia TRAF pone de relieve la
curiosa posibilidad de que I-TRAF funcione como un
regulador general de los sucesos de señalización mediada por TRAF.
Además, el efecto inhibidor observado de I-TRAF en
la interacción TRAF2:TNF-R2 sugiere que la expresión
de I-TRAF podría influenciar negativamente en la
traducción de la señal de TRAF2. Por consiguiente, se midió el
efecto de la expresión de I-TRAF en la activación
de NF-\kappaB mediada por TRAF2.
Se sembraron células de riñón embriónico humano
293 a 2 x 10^{5} células/pocillo en placas de 6 pocillos (35 mm)
y se transfectaron (Ausubel y col, Curr Prot. Mol.
Biol. 1, 9.1.1-0.1.3 [1994]) al día
siguiente con (a) 0,5 \mug de pRK-TRAF2 (Rothe
y col., Science en imprenta; Publicación PCT
WO95/33051) (b) 1\mug de pCDM8-CD40 (Rothe y
col., Science supra; Publicación PCT WO95/33051),
o (c) 0,1 \mug de pRK5mTNF-R2 (Lewis y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
2830-2834 [1991]), y cantidades crecientes de
pRK-I-TRAF (0; 0,1; 0,32; 1,0 y 3,0
\mug). Cada transfección también contenía 0,25 \mug de plásmido
indicador luc y 1\mug de pRSV-\betagal (Hsu y
col., supra). Para cada uno de (a), (b) y (c), se llevó
a cabo un control de transfección que contenía sólo el
pELAM-luc y pRSV-\betagal. Tras 24
horas, se realizaron las actividades de la luciferasa y las
normalizaciones de la \beta-galactosidasa como se
describe (Hsu y col., supra). Los valores relativos
al control se muestran en la Figura 4 como medias \pm SEM de los
experimentos en los que cada transfección se realizó por
triplicado.
La expresión transitoria de TRAF2 en células 293
potencialmente activa el gen indicador dependiente de
NF-\kappaB (Rothe y col., Science,
supra). Esta activación se inhibía drásticamente con la
coexpresión de I-TRAF de manera dependiente de
dosis (Figura 4A). Se examinó a continuación el efecto de la
sobreexpresión de I-TRAF en la activación de
NF-\kappaB desencadenada por la interacción de
TRAF2 con los receptores CD40 y TNF-R2. Se mostró
que la expresión transitoria de estos receptores induce la
agregación del receptor independiente de ligando que activaba
NF-\kappaB en un procedimiento dependiente de
TRAF2 (Rothe y col., Science supra). Como se
observó anteriormente para TRAF2, la activación de
NF-\kappaB a través tanto de CD40 (Figura 4b)
como de TNR-R2 (Figura 4c) se bloqueaba de forma
efectiva por el incremento de la expresión de
I-TRAF. La activación de
NF-\kappaB mediada por interleuquina 1
(IL-1) disminuyó sólo ligeramente con la
sobreexpresión de I-TRAF (dato no mostrado). De
esta manera, I-TRAF es un inhibidor específico de la
activación de NF-\kappaB dependiente de TRAF2
señalizada por CD40 y TNF-R2.
Conceptualmente, el sistema
I-TRAF/TRAF muestra una notable similitud con el
sistema regulador ampliamente estudiado
I\kappaB/NF-\kappaB (Liou y Baltimore, Curr.
Op. Cell. Bio. 5, 477-487 [1993]; Thanos
y Maniatis, Cell 80, 529-532 [1995]).
Ambos sistemas están implicados en la regulación de la actividad del
factor de transcripción NF-\kappaB a través de la
utilización de proteínas inhibidoras. I\kappaB regula
directamente la función de NF-\kappaB
manteniéndolo secuestrado en el citoplasma. I-TRAF
actúa en una etapa más temprana uniéndose a las TRAF y previniendo
su interacción con receptores de la superficie celular (CD40,
TNF-R2) que desencadenan las cascadas de activación
de NF-\kappaB mediada por TRAF2. La función de
I-TRAF puede ser prevenir la señalización continua
de TRAF en ausencia de ligando (CD40L o TNF). Esta función concuerda
con el hallazgo de que sólo la sobreexpresión de TRAF2, en ausencia
de la agregación del receptor, puede desencadenar la activación de
NF-\kappaB. Podría esperarse que la agregación
del receptor inducida por el ligando liberase las TRAF de la
inhibición de I-TRAF proporcionando un nuevo sitio
de unión a TRAF de mayor afinidad.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Genentech, Inc. Tularik, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: Inhibidores de TRAF
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Genentech, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 460 Point San Bruno Blvd
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Francisco Sur
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 94080
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible, 8,9 cm, 1,44 Mb,
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: WinPatin (Genentech)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dreger, Ginger R.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.055
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: P0960PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 415/225-3216
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 415/952-9881
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 910/371-7168
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 413 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1955 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 170 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 425 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2108 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1922 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2160 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (34)
1. Un polipéptido inhibidor de TRAF aislado que
comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido seleccionado
entre el grupo constituido por.
(a) un polipéptido inhibidor TRAF murino
caracterizado por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 1
(b) un polipéptido inhibidor TRAF murino
caracterizado por una combinación de las SEC ID Nº: 1 y 3
con la SEC ID Nº: 3 presente de forma adicional en el extremo
N-terminal de la secuencia de la SEC ID Nº: 1.
(c) un polipéptido inhibidor de TRAF humano
caracterizado por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 5,
(d) polipéptidos que tiene 60% en total de
identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos de cualquiera de los polipéptidos de (a)-(c) y capaz de
inhibir un suceso de señalización mediado por TRAF.
(e) un polipéptido que tiene al menos
aproximadamente 70% en total de identidad de secuencia de
aminoácidos con el dominio de unión al inhibidor TRAF de los
aminoácidos 35-236 de la SEC ID Nº: 1, o la parte
equivalente de un polipéptido inhibidor de TRAF humano, y capaz de
inhibir un suceso de señalización mediado por TRAF.
2. El polipéptido de la reivindicación 1 que
tiene al menos aproximadamente 70% en total de identidad de
secuencia de aminoácidos con la secuencia de cualquiera de los
polipéptidos de (a)-(c) o con el dominio de unión al inhibidor TRAF
de los aminoácidos 35-236 de la SEC ID Nº: 1 o la
parte equivalente de un polipéptido inhibidor de TRAF humano, y
capaz de inhibir un suceso de señalización mediado por TRAF.
3. El polipéptido de la reivindicación 1 que
tiene al menos aproximadamente 80% en total de identidad de
secuencia de aminoácidos con la secuencia de cualquiera de los
polipéptidos de (a)-(c) o con el dominio de unión al inhibidor TRAF
de los aminoácidos 35-236 de la SEC ID Nº: 1, o la
parte equivalente de un polipéptido inhibidor de TRAF humano, y
capaz de inhibir un suceso de señalización mediado por TRAF.
4. El polipéptido de la reivindicación 1 que
tiene un total de aproximadamente 90% en total de identidad de
secuencia de aminoácidos con la secuencia de cualquiera de los
polipéptidos de (a)-(c) o con el dominio de unión al inhibidor TRAF
de los aminoácidos 35-236 de la SEC ID Nº: 1, o la
parte equivalente de un polipéptido inhibidor de TRAF humano, y
capaz de inhibir un suceso de señalización mediado por TRAF.
5. El polipéptido de la reivindicación 1 que es
un inhibidor TRAF nativo de mamífero o un fragmento de éste capaz
de inhibir un suceso de señalización mediado por TRAF.
6. El polipéptido de la reivindicación 5 que es
un inhibidor TRAF nativo murino o un fragmento de éste capaz de
inhibir un suceso de señalización mediado por TRAF.
7. El polipéptido de la reivindicación 5 que es
un inhibidor TRAF nativo humano o un fragmento de éste capaz de
inhibir un suceso de señalización mediado por TRAF.
8. Un polipéptido codificado por un ácido
nucleico capaz de hibridar en condiciones severas con el
complementario de una cualquiera de las SEC ID Nº:6, SEC ID Nº: 4 o
SEC ID Nº: 2, y capaz de inhibir un suceso de señalización mediado
por TRAF.
9. Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-7.
10. Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica un polipéptido de la reivindicación 8.
11. Un vector que comprende y es capaz de
expresar, en una célula huésped adecuada, la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 9.
12. Un vector que comprende y es capaz de
expresar, en una célula huésped adecuada, la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 10.
13. Una célula huésped transformada con el ácido
nucleico de la reivindicación 9.
14. Una célula huésped transformada con el ácido
nucleico de la reivindicación 10.
15. Un anticuerpo capaz de unión específica a un
polipéptido inhibidor de TRAF de la reivindicación 1.
16. Una línea celular de hibridoma que produce un
anticuerpo de la reivindicación 15.
17. Un procedimiento para usar una molécula de
ácido nucleico de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10 que
comprende expresar esta molécula de ácido nucleico en una célula
huésped en cultivo transformada con ésta, y recuperar el polipéptido
codificado por esta molécula de ácido nucleido de la célula
huésped.
18. Un procedimiento para producir un polipéptido
inhibidor TRAF de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-8 que comprende inserta en el ADN de una célula
que contiene el ácido nucleico codificador de este polipéptido, un
elemento modulador de la transcripción suficientemente próximo y en
orientación con la molécula de ácido nucleico como para influenciar
en la transcripción del mismo.
19. Un ensayo para identificar una molécula capaz
de modular la asociación de un polipéptido inhibidor de TRAF que
comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido
seleccionado entre el grupo constituido por
(a) un polipéptido inhibidor de TRAF murino
caracterizado por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 1.
(b) un polipéptido inhibidor de TRAF murino
caracterizado por una combinación de las SEC ID Nº: 1 y 3
con la SEC ID Nº:3 presente de forma adicional en el extremo
N-terminal la secuencia de la SEC ID Nº: 1.
(c) un polipéptido inhibidor de TRAF humano
caracterizado por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 5,
(d) polipéptidos que tienen al menos 60% en total
de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos de cualquiera de los polipéptidos de (a)-(c) y capaces
de inhibir un suceso de señalización mediado por TRAF.
(e) un polipéptido que tiene al menos
aproximadamente 70% en total de identidad de secuencia de
aminoácidos con el dominio de unión al inhibidor TRAF de los
aminoácidos 35-236 de la SEC ID Nº:1, o la parte
equivalente de un polipéptido inhibidor de TRAF humano, y capaz de
inhibir un suceso de señalización mediado por TRAF.
(f) un fragmento de un polipéptido de (a), (b),
(c) o (d) y capaz de inhibir un suceso de señalización mediado por
TRAF y
(g) el polipéptido de la reivindicación 8,
y un TRAF, que comprende (a)
incubar una mezcla que comprende este inhibidor de TRAF y TRAF con
una molécula candidata y (b) detectar la capacidad de la molécula
candidata para modular la asociación inhibidor
TRAF/TRAF.
20. El ensayo de la reivindicación 19 en el que
tal molécula candidata previene o inhibe la disociación de un
complejo inhibidor de TRAF/TRAF.
21. El ensayo de la reivindicación 19 en el que
tal molécula candidata previene la asociación del inhibidor de TRAF
y TRAF.
22. El ensayo de la reivindicación 19 en el que
tal molécula candidata es una molécula pequeña.
23. Un ensayo para identificar una molécula de la
transducción de señal mediada por la asociación de un TRAF con una
proteína celular, que comprende (a) incubar una mezcla que
comprende esta TRAF y un polipéptido inhibidor seleccionado entre el
grupo constituido por
(a) un polipéptido inhibidor de TRAF murino
caracterizado por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 1,
(b) un polipéptido inhibidor de TRAF murino
caracterizado por una combinación de las SEC ID Nº: 1 y 3
con la SEC ID Nº:3 presente de forma adicional en el extremo
N-terminal la secuencia de la SEC ID Nº: 1.
(c) un polipéptido inhibidor de TRAF humano
caracterizado por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 5,
(d) polipéptidos que tienen al menos 60% en total
de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos de cualquiera de los polipéptidos de (a)-(c) y capaces
de inhibir un suceso de señalización mediada por TRAF,
(e) un polipéptido que tiene al menos
aproximadamente 70% en total de identidad de secuencia de
aminoácidos con el dominio de unión al inhibidor TRAF de los
aminoácidos 35-236 de la SEC ID Nº:1, o la parte
equivalente de un polipéptido inhibidor de TRAF humano, y capaz de
inhibir un suceso de señalización mediado por TRAF,
(f) un fragmento de un polipéptido de (a), (b),
(c) o (d) y capaz de inhibir un suceso de señalización mediado por
TRAF y
(g) el polipéptido de la reivindicación 8,
con una molécula candidata, y (b)
detectar la capacidad de esta molécula candidata para liberar TRAF
de un complejo formaron con el inhibidor
TRAF.
24. El ensayo de la reivindicación 23 en el que
tal mezcla adicionalmente comprende esta proteína celular, y se
detecta la capacidad de esta molécula candidata para iniciar la
señalización mediada por TRAF a través de esta proteína celular.
25. El ensayo de las reivindicaciones 19 ó 24 en
el que tal TRAF comprende el dominio TRAF de un polipéptido TRAF1,
TRAF2 o TRAF3 nativo.
26. El ensayo de las reivindicaciones 19 ó 24 en
el que dicho TRAF, inhibidor de TRAF y la proteína celular son
humanas.
27. El ensayo de la reivindicación 26 en el que
dicho TRAF comprende los aminoácidos 264-501 de un
polipéptido TRAF2 nativo humano.
28. El ensayo de la reivindicación 26 en el que
dicha proteína celular es un miembro de la superfamilia de
receptores del TNF.
29. El ensayo de la reivindicación 28 en el que
dicha proteína celular se selecciona entre el grupo constituido por
TNF-R2, CD40 y CD30.
30. Una formulación farmacéutica que comprende
una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido inhibidor
de TRAF seleccionado entre el grupo constituido por
(a) un polipéptido inhibidor de TRAF murino
caracterizado por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 1,
(b) un polipéptido inhibidor de TRAF murino
caracterizado por una combinación de las SEC ID Nº: 1 y 3
con la SEC ID Nº:3 presente de forma adicional en el extremo
N-terminal la secuencia de SEC ID Nº: 1.
(c) un polipéptido inhibidor de TRAF humano
caracterizado por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 5,
(d) polipéptidos que tienen al menos 60% en total
de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos de cualquiera de los polipéptidos de (a)-(c) y capaces
de inhibir un suceso de señalización mediada por TRAF,
(e) un polipéptido que tiene al menos
aproximadamente 70% en total de identidad de secuencia de
aminoácidos con el dominio de unión al inhibidor TRAF de los
aminoácidos 35-236 de la SEC ID Nº:1, o la parte
equivalente de un polipéptido inhibidor de TRAF humano, y capaz de
inhibir un suceso de señalización mediado por TRAF,
(f) un fragmento de un polipéptido de (a), (b),
(c) o (d) y capaz de inhibir un suceso de señalización mediado por
TRAF y
(g) el polipéptido de la reivindicación 8,
en asociación con un vehículo
farmacéuticamente
aceptable.
31. Un polipéptido inhibidor de TRAF seleccionado
entre el grupo constituido por
(a) un polipéptido inhibidor de TRAF murino
caracterizado por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 1,
(b) un polipéptido inhibidor de TRAF murino
caracterizado por una combinación de las SEC ID Nº: 1 y 3
con la SEC ID Nº:3 presente de forma adicional en el extremo
N-terminal la secuencia de la SEC ID Nº: 1.
(c) un polipéptido inhibidor de TRAF humano
caracterizado por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 5,
(d) polipéptidos que tienen al menos 60% en total
de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos de cualquiera de los polipéptidos de (a)-(c) y capaces
de inhibir un suceso de señalización mediada por TRAF,
(e) un polipéptido que tiene al menos
aproximadamente 70% en total de identidad de secuencia de
aminoácidos con el dominio de unión al inhibidor TRAF de los
aminoácidos 35-236 de la SEC ID Nº:1, o la parte
equivalente de un polipéptido inhibidor de TRAF humano, y capaz de
inhibir un suceso de señalización mediado por TRAF,
(f) un fragmento de un polipéptido de (a), (b),
(c) o (d) y capaz de inhibir un suceso de señalización mediado por
TRAF y
(g) el polipéptido de la reivindicación 8,
para uso como
medicamento.
32. Uso de un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1 para la producción de un medicamento para tratar
un tumor asociado con el virus de Epstein-Barr.
33. Uso de acuerdo con la reivindicación 32, en
el que dicho tumor se selecciona entre el grupo constituido por
linfoma de Burkitt y carcinoma nasofaríngeo.
34. Un ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 9 para modular la traducción de la señal mediada por
TRAF en una célula.
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| US6723517B1 (en) | 1998-06-02 | 2004-04-20 | Minerva Biotechnologies Corporation | Use of self-assembled monolayers to probe the structure of a target molecule |
| WO1999067380A1 (en) * | 1998-06-22 | 1999-12-29 | Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education | c-Cbl SUPPRESSION OF NEOPLASTIC TRANSFORMATION |
| AU1366901A (en) * | 1999-09-23 | 2001-04-24 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Traf4 associated cell cycle proteins, compositions and methods of use |
| WO2002064786A1 (fr) * | 2001-02-15 | 2002-08-22 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Nouveau gene tcif |
| US20050100547A1 (en) * | 2001-06-07 | 2005-05-12 | Pu Xia Etal | Sphingosine kinase interacts with traf2 and modulates tumor necrosis factor-induced cellular activity |
| EP2295081B1 (en) | 2001-06-26 | 2018-10-31 | Amgen Inc. | Antibodies to OPGL |
| US20030083304A1 (en) * | 2001-10-09 | 2003-05-01 | Smart Robert C. | CCAAT/enhancer binding protein-beta (C/EBPbeta) is a molecular target for cancer treatment |
| IL145918A0 (en) * | 2001-10-14 | 2002-07-25 | Ares Trading Sa | Method and kit for monitoring recruitment of proteins to the intracellular domain of a receptor in intact cells |
| US20060078944A1 (en) * | 2002-08-01 | 2006-04-13 | Jun Kuai | Methods and reagents relating to inflammation and apoptosis |
| KR20100014565A (ko) * | 2007-04-11 | 2010-02-10 | 알콘 리서치, 리미티드 | 알레르기성 비염 및 알레르기성 결막염을 치료하기 위한 ｔｎｆａ의 억제제 및 항히스타민의 용도 |
| US20090182035A1 (en) * | 2007-04-11 | 2009-07-16 | Alcon Research, Ltd. | Use of a combination of olopatadine and cilomilast to treat non-infectious rhinitis and allergic conjunctivitis |
| US10669345B2 (en) * | 2008-05-19 | 2020-06-02 | Case Western Reserve University | Method for treating CD40-mediated diseases |
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| CN102548536A (zh) * | 2009-10-01 | 2012-07-04 | 爱尔康研究有限公司 | 奥洛他定组合物及其用途 |
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|---|---|---|---|---|
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