ES2239401T3 - Preparacion y uso de construcciones y vacunas de m2 recombinante del virus influenza a. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un procedimiento para aumentar la expresión recombinante y la solubilidad de polipéptido M2 del virus gripal A, que comprende ácidos nucleicos que codifican una proteína M2 modificada del virus gripal A en el que se han eliminado los dominios transmembrada y otros dominios hidrófobos. La presente invención proporciona también polipéptidos purificados codificados por los ácidos nucleicos, siendo inmunógenos dichos polipéptidos y son menos hidrófobos que los M2 de longitud completa. Se proporcionan también vacunas que comprende variantes de M2 expresados en huéspedes procariotas. Se proporcionan también procedimientos de prevención de la infección gripal A utilizando vacunas compuestas por variantes de M2. se proporciona también anticuerpos producidos contra los variantes de M2 y la utilización de dichos anticuerpos en diagnóstico y tratamiento de las infecciones gripales A,

Description

Preparación y uso de construcciones y vacunas de M2 recombinante del virus influenza A.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de las vacunas contra el virus influenza A así como a las construcciones útiles en su preparación.

Descripción de la técnica relacionada

La técnica anterior ilustra la estrategia actual destinada al control de influenza mediante la vacunación anual con vacunas de virus completo o de subunidad. Las vacunas que actualmente poseen licencia están diseñadas para que estimulen los anticuerpos neutralizantes contra la hemaglutinina (HA) y/o la neuraminidasa (NA), los principales antígenos de superficie del virus influenza. Sin embargo, debido a la frecuente e impredecible variación estructural de la HA y NA, las vacunas de influenza deben ser adaptadas en cada estación a las cepas de virus circulantes, un procedimiento que resulta deficiente en proporcionar una inmunidad protectora contra todas las cepas virales excepto las que son muy similares.

Existe la necesidad de un componente de vacuna de subunidad capaz de inducir una inmunidad más amplia y cruzada a los virus influenza de tipo A. Uno de tales componentes puede ser M2, una proteína superficial del virus influenza A estructuralmente conservada (Slepushkin et al., 1995; Ito et al., 1991). Se conocen las secuencias de ADN de los genes M2 de numerosos virus influenza A (Ito et al., 1991). Se cree que M2 proporciona un flujo de protones transmembrana obligatorio para la replicación viral (Sugrue et al., 1990; Ciampor et al., 1992b; Grambas y Hay, 1992). Como proteína de transporte de membrana, M2 funciona como un poro abierto que conduce cationes de un modo no selectivo (Tosteson et al., 1994; Shimbo et al., 1996). Se cree que esta conductancia permeabiliza las células huésped que expresan la M2 recombinante y puede explicar las dificultades que otros investigadores han encontrado para lograr niveles elevados de la expresión de M2 recombinante tanto en sistemas procariotas como eucariotas (Guinea y Carrasco, 1996; Black et al., 1993).

Se ha demostrado que el anticuerpo contra M2 limita la replicación del virus influenza en cultivos celulares y en ratones infectados (Zebedee y Lamb (1988) y Treanor et al., (1990)). Se ha demostrado que la M2 de secuencia completa expresada en baculovirus hace aumentar el título en el suero y estimula respuestas de células T en animales inmunizados (Katz et al., 1996). Adicionalmente, se ha demostrado que la vacunación de ratones con la M2 recombinante de secuencia completa potencia la eliminación del virus de pulmones infectados así como también proporciona protección contra un reto letal con el virus influenza A heterólogo (Slepushkin et al., 1995).

Puesto que M2 no se expresa en absoluto en los viriones (Zebedee & Lamb, 1988), la vacuna de influenza actual con todo el virus o con un producto escindido solo contiene cantidades mínimas de M2. Para que resulte útil como componente de una vacuna, M2 debe ser expresada y purificada como producto recombinante. Sin embargo, se ha demostrado que la expresión de la M2 de secuencia completa resulta perjudicial para el cultivo celular en sistemas de expresión procariótas y eucariótas (Guinea y Carrasco, 1996; Black et al., 1993). Hasta la actualidad, la expresión de cantidades suficientes de M2 recombinante para el uso en estudios experimentales solo se puede conseguir cultivando células huésped eucariotas en presencia de un inhibidor irreversible de M2, la amantadina.

Independientemente de los retos en la expresión de M2 recombinante, la naturaleza hidrofóbica de la M2 de secuencia completa compromete el rendimiento y pureza de las preparaciones de M2 y requiere del uso de detergentes u otros agentes para mantener M2 en forma soluble. Algunos de estos agentes solubilizantes no son constituyentes deseables en formulaciones de vacuna. La presente invención soluciona este inconveniente de la técnica anterior proporcionando una proteína M2 modificada con hidrofobicidad reducida y concomitantemente características de solubilidad potenciadas en comparación con la M2 de secuencia completa.

Sumario de la invención

La presente invención soluciona los problemas de los enfoques de la técnica anterior destinados a la preparación de M2 recombinante proporcionando nuevas formas de M2 cuya estructura ha sido modificada para permitir la expresión procariótica simple como proteína variante soluble y fácil de purificar que conserva las propiedades antigénicas e inmunogénicas. Una forma de realización preferida de la presente invención proporciona una construcción recombinante en la que por lo menos se ha delecionado toda la parte del dominio transmembrana. Alternativamente, simplemente se pueden alterar residuos del dominio transmembrana, por ejemplo, mediante la sustitución de aminoácidos hidrofílicos o neutros por residuos hidrofóbicos, de tal modo que (a) se potencie la expresión de la proteína en sistemas procariotas y/o eucariotas respecto a la proteína nativa y/o (b) se obtenga una proteína M2 modificada más soluble en soluciones acuosas respecto a la proteína M2 nativa. En la presente memoria, los términos polipéptido M2 y proteína M2 se utilizan indistintamente. Adicionalmente, la presente invención proporciona vacunas que comprenden estas nuevas formas recombinantes de M2 así como también procedimientos destinados a la prevención y tratamiento de las infecciones por el virus influenza A.

Lo anterior meramente resume ciertos aspectos de la invención y no pretende ni debe ser considerado como limitativo de la invención en modo alguno. Todas las solicitudes de patente, patentes, y otras publicaciones mencionadas en la presente memoria, se incorporan en su totalidad a la presente memoria como referencia.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1 es un diagrama esquemático de M2 y de las construcciones de deleción sM2 y ssM2;

La fig. 2 representa curvas de crecimiento que muestran la replicación celular a lo largo del tiempo y la expresión de los polipéptidos M2 de secuencia completa y modificados;

La fig. 3 (A) es un gel de SDS-PAGE teñido con Coomassie; y

La fig. 3 (B) es una transferencia Western de proteínas de fusión que contienen polipéptidos M2 modificados.

La fig. 4 muestra los resultados de la vacunación con construcciones de M2 tal como se describe en el Ejemplo 7.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una proteína M2 modificada que comprende la proteína M2 nativa en la que por lo menos se deleciona la región hidrofóbica transmembrana o se sustituye por residuos neutros o hidrofílicos. Los presentes inventores han descubierto que tal proteína M2 modificada es más soluble en solución acuosa respecto a su correspondiente proteína M2 nativa y en una forma apropiada para una expresión y purificación de elevado rendimiento. Adicionalmente, tal como se demuestra en la presente solicitud, las proteínas M2 modificadas de acuerdo con este aspecto de la invención son tanto inmunogénicas como inmunoprotectoras, por lo que resultan apropiadas para ser utilizadas como vacunas.

A los efectos de la presente invención, la región transmembrana de M2 se define generalmente como la parte del polipéptido M2 que cruza toda o parte de la bicapa lipídica de la superficie del virus influenza A. Los residuos 26-43 de la M2 nativa de virus A/Aichi/2/68 (H3N2) corresponden a la región transmembrana, aunque la M2 modificada de la presente invención se puede construir para que se corresponda con la proteína M2 nativa de cualquier cepa. Los expertos en la materia apreciarán que las regiones comparables de otros virus influenza A y de virus influenza A emergentes corresponderán a esta descripción general de la región transmembrana y la presente invención contempla la eliminación o alteración de suficientes residuos de la región transmembrana para hacer que tal región sea funcionalmente inactiva y, preferentemente, para reducir la hidrofobicidad total, permitiendo así la expresión y purificación eficiente de los polipéptidos M2 modificados tras el cultivo en huéspedes procariotas y
eucariotas.

Tal como se ha mencionado, las proteínas M2 modificadas de acuerdo con la invención manifiestan una expresión potenciada en los organismos huésped en comparación con los niveles de expresión de la proteína M2 nativa. Aunque la invención no está limitada por ninguna teoría, la expresión potenciada puede ser debida a la inactivación (o disminución significativa) de la actividad del canal iónico del polipéptido M2 modificado, haciendo decrecer así la toxicidad del polipéptido para el organismo huésped que lo expresa. Preferentemente, las proteínas M2 modificadas de la invención pueden ser expresadas en un organismo huésped a niveles de 5 a 50 mg/l o a niveles suficientes para producir una banda visible en un gel teñido con Coomassie.

En una forma de realización preferida, la proteína M2 modificada de acuerdo con este aspecto de la invención comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la proteína M2 nativa en la que se ha delecionado la región transmembrana y los residuos aminoacídicos de cero a doce adyacentes a la región transmembrana en su lado C-terminal. Con lo anterior se entiende que la proteína M2 modificada comprende la parte de una proteína M2 nativa del lado N-terminal de la región transmembrana fusionada a una parte de la proteína M2 nativa desde el lado C-terminal de la región transmembrana. En otra forma de realización preferida, la proteína M2 modificada comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la proteína M2 nativa del virus A/Aichi/2/68 (H3N2) en la que se ha delecionado desde el residuo 26 hasta algún punto entre los residuos 43 y 55. En otras palabras, esta forma de realización comprende la secuencia N-terminal de 25 aminoácidos fusionada en su lado C-terminal al aminoácido N-terminal de la parte C-terminal de la proteína M2 nativa, en la que la parte C-terminal empieza (en su extremo N-terminal) en uno de los aminoácidos 44 a 55 de la proteína M2 nativa. En una forma de realización más preferida, la proteína M2 modificada comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la proteína M2 nativa del virus A/Aichi/2/68 (H3N2) en la que se han delecionado los residuos 26 a 43. En otra forma de realización más preferida, la proteína M2 modificada comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la proteína M2 nativa del virus A/Aichi/2/68 (H3N2) en la que se han delecionado los residuos 26 a 55.

En otra forma de realización, los residuos delecionados de la proteína M2 nativa se sustituyen por uno o más aminoácidos neutros o hidrofílicos. En esta forma de realización, el número de residuos aminoacídicos de la proteína M2 modificada es inferior o igual al número de la proteína M2 nativa. Los residuos delecionados se sustituyen preferentemente por entre uno y seis residuos aminoacídicos neutros o hidrofílicos. En otra forma de realización preferida, los residuos neutros o hidrofílicos de las formas de realización anteriores son glicina.

En otra forma de realización preferida, la proteína M2 modificada de acuerdo con este aspecto de la invención comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la proteína nativa en la que los residuos aminoacídicos desde uno a todos de la región transmembrana y los residuos aminoacídicos de cero a doce adyacentes a la región transmembrana en su lado C-terminal se han sustituido por aminoácidos neutros o hidrofílicos. En esta forma de realización, la proteína M2 modificada presenta el mismo número de residuos aminoacídicos que la proteína M2 nativa. El número de sustituciones aminoacídicas y el tipo de sustitución son suficientes para proporcionar una proteína que tiene una mayor solubilidad en una solución acuosa que la proteína nativa y generalmente una expresión incrementada en los organismos huésped. Existen numerosas proteínas de acuerdo con esta forma de realización, y para los expertos en la materia resulta rutinario sustituir uno o más de los aminoácidos hidrofílicos y/o neutros conocidos en la región transmembrana y/o la región adyacente a la misma en su lado C-terminal para obtener una proteína M2 modificada de acuerdo con esta forma de realización de la invención. Preferentemente, la proteína M2 modificada de acuerdo con este aspecto de la invención presenta, a excepción de los aminoácidos sustituidos, una secuencia idéntica a la M2 nativa del virus A/Aichi/2/68 (H3N2).

En otra forma de realización preferida, la proteína M2 modificada de acuerdo con este aspecto de la invención comprende cualquiera de las formas de realización descritas anteriormente en forma de una proteína de fusión. En una forma de realización, la proteína M2 modificada se fusiona a un polipéptido que hace que la construcción de fusión se purifique más fácilmente que la proteína M2 modificada sola. En una forma de realización preferida, la proteína M2 modificada se fusiona a la glutationa S-transferasa (GST) (p. ej., de Schistosoma japonicum). Alternativamente o adicionalmente, la proteína M2 modificada se puede fusionar a un péptido señal para dirigir la secreción del polipéptido a partir de la célula huésped que lo expresa. Para los expertos en la materia resulta rutinario identificar, realizar y utilizar otras proteínas de fusión de acuerdo con la invención empleando una gran variedad de polipéptidos.

Los expertos en la materia reconocerán que los polipéptidos M2 modificados de la presente invención pueden ser preparados mediante cualesquiera de entre una variedad de procedimientos de recombinación. Las etapas básicas en la preparación recombinante de polipéptidos M2 modificados incluyen:

a)

construcción de un ADN sintético o semi sintético que codifica el polipéptido M2 modificado,

b)

integrar dicho ADN en un vector de expresión en un modo que sea apropiado para la expresión del polipéptido M2 modificado solo o como proteína de fusión,

c)

transformar una célula huésped eucariota o procariota adecuada con dicho vector de expresión,

d)

cultivar dicha célula huésped transformada o transfectada, y

e)

recuperar y purificar los polipéptidos M2 modificados preparados por recombinación.

Para la expresión recombinante, la secuencia codificante de M2 modificada puede ser completamente sintética, semi sintética o ser el resultado de la modificación de la secuencia génica nativa de M2.

En otro aspecto, la invención proporciona genes sintéticos, cuya transcripción y traducción in vitro o in vivo resultará en la producción de polipéptidos M2 modificados. Tales genes derivan a partir de la secuencia génica de la proteína M2 nativa y se modifican apropiadamente para que codifiquen la proteína M2 modificada particular cuya expresión se desea. Los genes de acuerdo con este aspecto pueden ser construidos mediante técnicas bien conocidas en la materia. Debido a la degeneración natural del código genético, el técnico experto en la materia reconocerá que se pueden construir un número considerable pero definido de secuencias de ADN que codifiquen polipéptidos M2 modificados. El gen que codifica el polipéptido M2 modificado se puede crear mediante metodología sintética. Tal metodología destinada a la construcción de genes sintéticos es bien conocida en la materia. La secuencia de ADN que corresponde a los genes de polipéptidos M2 modificados se puede generar utilizando un aparatos convencionales de síntesis de ADN tales como los sintetizadores de ADN de los modelos 380A o 380B de Applied Biosystems (comercialmente disponibles en Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404).

Un experto en la materia reconocerá que la secuencia nucleotídica para el gen M2 de otros aislados de virus influenza de tipo A será muy similar, aunque no necesariamente idéntica, a la secuencia del gen M2 de A/Aichi/2/68 (H3N2). Las enseñanzas de la presente memoria se pueden aplicar fácilmente a secuencias íntimamente relacionadas de otros virus influenza de tipo A, utilizando técnicas bien establecidas en la materia. Por consiguiente, esta invención contempla variantes de otros genes M2 en los que, como aquí, se han delecionado las regiones transmembrana y/o hidrofóbicas. Las condiciones de hibridación y lavado y los protocolos para obtener secuencias con el grado deseado de homología son estándar y bien conocidas por los expertos en la materia. Ver, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, unidad 2.10 (John Wiley & Sons, Inc, 1997). Estas técnicas se pueden emplear de forma rutinaria para aislar moléculas de ADN homólogas de acuerdo con este aspecto de la invención. Los ajustes rutinarios de las condiciones de hibridación y lavado permiten que el técnico experto obtenga ADN de virtualmente cualquier grado de homología deseado. Los ácidos nucleicos de acuerdo con esta forma de realización se pueden obtener utilizando el protocolo descrito en el capítulo 5, Tabla 3 de Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (Hames & Higgins, Eds., IRL Press, Washington D.C., 1985).

Construcción del vector

Para la construcción de vectores adecuados que contengan las secuencias codificantes y control deseadas se emplean técnicas estándar de ligación. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN se escinden, se adaptan y se religan en la forma deseada para formar los plásmidos requeridos.

Para efectuar la traducción de los polipéptidos M2 modificados, se inserta la secuencia de ADN codificante de M2 obtenida por ingeniería en cualquiera de una plétora de vectores de expresión de ADN recombinante apropiados mediante la utilización de endonucleasas de restricción apropiadas. Se diseña una secuencia codificante sintética de M2 modificada para que presente los sitios de corte de las endonucleasas de restricción en cualquier extremo del tránscrito para facilitar el aislamiento a partir de y la integración en estos plásmidos de expresión y amplificación y expresión. La secuencia codificante se puede modificar fácilmente mediante la utilización de adaptadores sintéticos para facilitar la incorporación de esta secuencia en los vectores de clonaje deseados mediante técnicas bien conocidas en la materia. Las endonucleasas particulares utilizadas estarán determinadas por el patrón de restricción de endonucleasas del vector de expresión parental a utilizar. La elección de los sitios de restricción se realiza para que la secuencia codificante de M2 modificada quede orientada adecuadamente con las secuencias control para conseguir una pauta de lectura y expresión correctas de los genes de los polipéptidos M2 modificados.

En general, los vectores plasmídicos contienen promotores y secuencias de control que derivan de especies compatibles con la célula huésped y se utilizan con estos huéspedes. Ordinariamente, el vector lleva un sitio de replicación así como también secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica de las células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma típicamente utilizando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (Bolivar, et al., 1977). pBR322 contiene genes para la resistencia a ampicilina y tetraciclina y así proporciona un modo fácil de identificar las células transformadas. El plásmido pBR322, u otro plásmido microbiano, también debe contener o deber ser modificado para contener promotores y otros elementos de control utilizados comúnmente en la construcción de ADN recombinate.

La secuencia codificante del polipéptido M2 modificado debe estar dispuesta de modo que esté en pauta de lectura correcta con el promotor y el sitio de unión ribosomal del vector de expresión, siendo ambos funcionales en la célula huésped en la que el polipéptido M2 modificado debe expresarse. En una realización preferida de la invención, la región promotor-operador se dispone en la misma orientación secuencial con respecto al codón de inicio ATG de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido M2 modificado que la que presenta el promotor-operador con respecto al codón de inicio ATG del gen del cual deriva. Son bien conocidas en la materia regiones promotor-operador sintéticas o modificadas tales como el promotor tac. Cuando se emplean tales regiones promotor-operador sintéticas o modificadas, éstas deben estar orientadas con respecto al codón de inicio ATG de la secuencia codificante del polipéptido M2 modificado tal como lo indican sus creadores.

Expresión procariota

En general, en la construcción de vectores útiles en la invención se utilizan procariotas para el clonaje de secuencias de ADN. Por ejemplo, la cepa de E. coli K12 294 (ATCC nº 31446) resulta particularmente útil. Entre otras cepas microbianas que pueden ser utilizadas se incluyen E. coli B y E. coli X1776 (ATCC nº 31537), E. coli W3110 (prototrófica, ATCC nº 27325), bacilos tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacteriaceas tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcescans, y se pueden utilizar varias especies de pseudomonas. Entre los promotores apropiados para el uso con huéspedes procariotas se incluyen sistemas promotores de la b-lactamasa (vector pGX2907 [ATCC 39344] contiene el replicón y el gen b-lactamasa) y la lactosa (Chang et al., 1978; Goeddel et al., 1979), fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptófano (trp) (vector pATH1 [ATCC 37695] diseñado para facilitar la expresión de una pauta abierta de lectura como una proteína de fusión trpE bajo el control del promotor trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac (aislable a partir del plásmido pDR540 ATCC-37282). Sin embargo, otros promotores bacterianos funcionales, cuyas secuencias nucleotídicas son generalmente conocidas, permiten al experto en la materia ligarlos al ADN que codifica polipéptidos M2 modificados utilizando "linkers" o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para el uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno unida operativamente al ADN que codifica polipéptidos M2 modificados. Estos ejemplos son ilustrativos y no limitativos.

Proteínas de fusión

Los polipéptidos M2 modificados se pueden preparar bien por expresión directa o como proteína de fusión que comprende el polipéptido M2 modificado seguido de corte enzimático o químico. En la preparación de ciertos polipéptidos en sistemas recombinantes se observa frecuentemente que la expresión como proteína de fusión prolonga la vida y/o incrementa el rendimiento del péptido deseado. Se conoce una variedad de peptidasas (p. ej. tripsina) que cortan un polipéptido por sitios específicos o que digieren los polipéptidos a partir del extremo amino o carboxi terminal (p. ej., diaminopeptidasa) de la cadena del péptido. Además, ciertos productos químicos particulares (p. ej. bromuro de cianogen) cortaran una cadena polipeptídica por sitios específicos. El técnico experto apreciará las modificaciones necesarias de la secuencia aminoacídica (y secuencia codificante sintética o semi sintética si se emplean medios recombinantes) para incorporar sitios de corte internos específicos. Ver, p. ej., Carter P.
(1990).

Por lo tanto, puede resultar necesario fusionar la secuencia codificante de un polipéptido M2 modificado particular en pauta con una secuencia génica codificante más larga resultando en la producción de una proteína de fusión.

Expresión eucariota

Los polipéptidos M2 modificados también se pueden preparar por recombinación en sistemas de expresión eucariotas.

Péptidos señal eucariotas

Una ventaja de los sistemas de expresión eucariotas es que resulta posible obtener un producto proteico secretado. Si se desea tal resultado, resulta necesario modificar la secuencia codificante del polipéptido M2 modificado para incorporar una secuencia que codifique un péptido señal traducido. Generalmente, los péptidos señal se cortan proteolíticamente a partir de una proteína residual como parte de un proceso de secreción en el que la proteína se transporta al periplasma de la célula huésped o al medio de cultivo.

Es bien conocido en la materia que los péptidos señal facilitan la descarga extracelular de las proteínas secretadas tanto en un ambiente procariota como eucariota. Se ha demostrado que la adición de un péptido señal heterólogo a una proteína que normalmente es citosólica resultará en el transporte extracelular de la proteína que normalmente es citosólica en E. coli (MacIntyre et al., 1987). Es bien conocido en la materia que secuencias de péptido señal alternativas pueden funcionar con secuencias codificantes heterólogas. La preparación recombinante de tales proteínas de fusión puede llevarse a cabo mediante la adición de una secuencia de ADN que codifique un péptido señal apropiado para el organismo huésped insertada en 5' y en pauta de lectura con la secuencia que codifica la proteína.

Son bien conocidos en la materia los péptidos señal que se podrían incorporar de modo similar en la estructura del polipéptido M2 modificado. En una realización preferida de la invención, el péptido señal utilizado es un péptido señal nativo a una proteína secretada de la línea celular huésped. Adicionalmente, la secuencia señal puede ser enteramente sintética. Se ha demostrado que péptidos señal "idealizados" sintéticos funcionan tanto en un ambiente procariota como eucariota. (von Heijne, G., 1990). Los principios de los péptidos señal son similares en organismos procariotas y eucariotas. Tanto los péptidos señal de procariotas como los de eucariotas poseen una estructura global de tres dominios y no necesitan la conservación de una secuencia precisa para conservar la función (von Heijne, G., supra). Generalmente, la presencia de residuos aminoacídicos básicos y/o cargados cerca del amino terminal de la proteína estructural inhibe la secreción. (Yamane, K., et al., 1988; Summers, R.G., et al, 1989). Con el propósito de asegurar la escisión eficiente del péptido señal a partir de la construcción de la proteína de fusión, resulta deseable mantener la naturaleza de la secuencia aminoacídica en la interfase entre el péptido señal y la secuencia codificante de la proteína madura. La conservación de la carga e hidrofobicidad y la eliminación de residuos cargados inmediatamente corriente abajo del punto de corte del péptido señal generalmente resultan importantes para una translocación eficiente. Sin embargo, no resulta crítico que se mantenga ninguna secuencia aminoacídica particular.

Promotores eucariotas

Los promotores preferidos que controlan la transcripción en células huésped de mamíferos se pueden obtener a partir de varias fuentes, por ejemplo, los genomas de virus tales como: polioma, virus simio 40 (SV40), adenovirus, retrovirus, virus de la hepatitos B y más preferentemente citomegalovirus, o a partir de promotores heterólogos de mamíferos, p. ej., promotor b-actina. Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40. (Fiers et al., 1978). El genoma entero de SV40 se puede obtener a partir del plásmido pBRSV, ATCC 45019. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se puede obtener a partir del plásmido pCMBb (ATCC, 77177). Por supuesto, también resultan útiles los promotores de la célula huésped o de especies relacionadas.

Potenciadores eucariotas

La transcripción de un ADN que codifica polipéptidos M2 modificados mediante eucariotas superiores se incrementa insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los potenciadores presentan una orientación y posición relativamente independiente, habiéndose encontrado en 5' (Laimins, L. et al., 1981) y 3' (Lusky, M. L., et al., 1983) a la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji, J. L., et al., 1983), así como también dentro de la propia secuencia codificante (Osborne, T.F., et al., 1984). Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, RSV, SV40, EMC, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Sin embargo, típicamente se usará un potenciador de un virus de célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador tardío de SV40, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus.

Vectores de expresión eucariotas

Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción que pueden afectar la expresión de ARNm. Estas regiones se transcriben como segmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica polipéptidos M2 modificados. Las regiones 3' no traducidas también incluyen sitios de terminación de la transcripción.

Marcadores eucariotas seleccionables

Los vectores de expresión pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Entre los ejemplos de marcadores seleccionables apropiados para células de mamíferos se encuentran la dihidrofolato reductasa (DHFR, que puede derivar del fragmento de restricción BgIII/HindIII de pJOD-10 [ATCC 68815]), timidina quinasa (la timidina quinasa del virus herpes simplex se encuentra contenido en el fragmento BamHI del clon vP-5 [ATCC 2028]) o genes de resistencia a la neomicina (G418) (obtenibles a partir del vector de cromosoma artificial de levadura pNN414 [ATCC 37682]). Cuando dichos marcadores seleccionables se transfieren exitosamente a una célula huésped de mamífero, la célula huésped de mamífero transfectada puede sobrevivir si se somete a una presión selectiva. Existen dos amplias categorías distintas utilizadas de regímenes de selección. La primera categoría se basa en el metabolismo de la célula y la utilización de una línea celular mutante que no presenta la capacidad de crecer sin un medio complementado. Dos ejemplos son: células CHO DHFR^{-} (ATCC CRL-9096) y células LTK^{-} de ratón (L- M(TK-) ATCC CCL-2.3). Estas células no presentan la capacidad de crecer sin la adición de nutrientes tales como la timidina y la hipoxantina. Puesto que estas células no presentan ciertos genes necesarios para una ruta de síntesis de nucleótidos completa, éstas no pueden sobrevivir a menos que los nutrientes ausentes se proporcionen en un medio complementado. Una alternativa a complementar el medio se basa en introducir un gen DHFR o TK intacto en las células que no presentan los genes respectivos, alterando así sus requerimientos de crecimiento. Las células individuales que no se transformaron con el gen DHFR o TK no serán capaces de sobrevivir en un medio sin complementar.

La segunda categoría es la selección dominante que se refiere a un esquema de selección utilizado con cualquier tipo celular y no requiere de la utilización de una línea celular mutante. Típicamente, estos esquemas utilizan un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que presenten un gen nuevo expresarían una proteína que les conferiría resistencia al fármaco y sobrevivían a la selección. En los ejemplos de tal selección dominante se utilizan los fármacos neomicina (Southern P. y Berg, P., 1982), ácido micofenólico (Mulligan, R. C. y Berg, P., 1980) o higromicina (Sugden, B. et al., 1985). En los tres ejemplos expuestos anteriormente se emplean genes bacterianos bajo control eucariota para conferir resistencia al fármaco apropiado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina, respectivamente.

Células huésped eucariotas

La células huésped se pueden transformar con los vectores de expresión de la invención y cultivar en medio nutritivo convencional modificado según lo apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las utilizadas previamente con las células huésped seleccionadas para la expresión, y resultarán evidentes para los técnicos expertos. Las técnicas para transformar células con los vectores mencionados anteriormente son bien conocidas en la materia y pueden encontrarse en referencia generales tales como Maniatis et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York ó Current Protocols in Molecular Biology (1989) y suplementos.

Entre las células huésped apropiadas preferidas para expresar los vectores de esta invención que codifican polipéptidos M2 modificados en eucariotas superiores se incluyen: línea celular de la línea de riñón de mono verde africano transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL-1651); línea celular primaria humana de riñón embrional 293 transformada, (Graham, F.L. et al. 1977); células de riñón de bebé hámster (BHK-21(C-13), ATCC CCL-10); células del ovario de hamster chino CHO-DHFR (ATCC CRL-9096); células Sertoli de ratón (TM4, ATCC CRL-1715); células de riñón de mono verde africano (VERO 76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma epiteloide cervical humano (HeLa, ATCC CCL-2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL-34), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL-1442); células diploides de pulmón humano (WI-38, ATCC CCL-75); células de carcinoma hepatocelular humano (Hep G2, ATCC HB-8065); y células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51).

Expresión en levadura

Además de los procariotas, también se pueden utilizar microbios eucariotas tales como cultivos de levadura. Saccharomyces cerevisiae, o levadura panadera común, es el microorganismo eucariota utilizado más comúnmente, aunque se encuentran comúnmente disponibles muchas otras cepas. Para la expresión en Saccharomyces, habitualmente se utiliza, por ejemplo, el plásmido YRp7 (ATCC-40053, Stinchcomb, et al., 1979); Kingsman et al., 1979); Tschemper et al., 1980). Este plásmido ya contiene el gen trp, el cual proporciona un marcador seleccionable para una cepa de levadura mutante que no presente la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo ATCC nº 44076 ó PEP4-1 (Jones, 1977).

Entre las secuencias promotoras apropiadas para la utilización con los huéspedes de levadura se incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa (encontrado en el plásmido pAP12BD ATCC 53231 y descrito en la patente US nº 4.935.350, 19 de junio, 1990) u otros enzimas glicolíticos tales como la enolasa (encontrado en el plásmido pAC1 ATCC 39532), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (derivado a partir del plásmido pHcGAPC1 ATCC 57090, 57091), Zymomonas mobilis (patente US nº 5.000.000 publicada el 19 de marzo, 1991), hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que presentan la ventaja adicional de controlar la transcripción mediante las condiciones de crecimiento, son las regiones del promotor para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativos asociados con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina (contenido en el vector plasmídico pCL28XhoLHBPV ATCC 39475, patente US nº 4.840.896), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa (GAL1 encontrado en el plásmido pRY121 ATCC 37658). Los vectores y promotores adecuados para el uso en la expresión en levadura se describen adicionalmente en R. Hitzeman et al., publicación de patente europea nº 73.657A. Los potenciadores de levadura tales como el UAS Gal de Saccharomyces cerevisiae (encontrado en conjunción con el promotor CYC1 en el plásmido YEpsec--hI1beta ATCC 67024), también se utilizan ventajosamente con promotores de levadura.

Expresión en Vaccinia

Los polipéptidos M2 modificados también se pueden expresar en el virus Vaccinia.

Los documentos de Paoletti et al. (patentes US nº 4.722.848 y nº 5.110.587) describen un procedimiento general en el que se introducen secuencias exógenas de ADN en regiones no esenciales del genoma del virus Vaccinia, efectuando de ese modo la expresión de dichas secuencias exógenas. Paoletti et al., (patente US nº 5.174.933) describe un procedimiento destinado a inducir una respuesta inmunológica en un mamífero frente a un patógeno mediante la incorporación de secuencias exógenas de ADN derivadas del patógeno en el virus avipox. Las enseñanzas de estas patentes se incorporan en la presente memoria en su totalidad como referencias. El procedimiento de estas patentes se puede modificar fácilmente para incorporar las secuencias del polipéptido M2 modificado de la presente
invención.

Expresión mediante ADN desnudo

Los polipéptidos M2 modificados también se pueden expresar in vivo utilizando el enfoque del "ADN desnudo" tal como describe Felgner et al. (patentes US nº 5.589.466, nº 5.703.055 y nº 5.580.859). Este enfoque supone la liberación (típicamente mediante inyección) de ácidos nucleicos aislados en tejidos de mamíferos, resultando en la expresión transiente de los ácidos nucleicos inyectados. La expresión transiente de genes foráneos en un tejido de mamífero invoca una respuesta inmunológica que puede resultar protectora. Las enseñanzas de esta patente se incorporan a la presente memoria en su totalidad como referencia y se pueden modificar fácilmente para su uso con las secuencias del polipéptido M2 modificado de la presente invención.

En otro aspecto, la invención comprende composiciones inmunogénicas, incluyendo vacunas. Tales composiciones inmunogénicas comprenden una proteína M2 modificada de acuerdo con el primer aspecto de la invención y se pueden preparar como inyectables, soluciones líquidas, suspensiones o emulsiones. El ingrediente o ingredientes inmunogénicos activos se pueden mezclar con excipientes farmacéuticamente aceptables que sean compatibles con los mismos. Tales excipientes pueden incluir agua, solución Salina, dextrosa, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. Las composiciones inmunogénicas y vacunas pueden contener adicionalmente sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, o adyuvantes destinados a potenciar la eficacia de las mismas. Las composiciones inmunogénicas y vacunas se pueden administrar parentalmente, mediante inyección subcutánea o intramuscular. Alternativamente, las composiciones inmunogénicas preparadas de acuerdo con la presente invención, pueden ser formuladas y suministradas de un modo que evoque una respuesta inmunológica en superficies mucosas. Así, la composición inmunogénica se puede administrar a superficies mucosas, por ejemplo, por vía nasal u oral (intragástrica). Alternativamente, otros modos de administración, incluyendo supositorios y formulaciones orales, pueden resultar deseables. En el caso de los supositorios, los aglutinantes y vehículos pueden incluir, por ejemplo, polialcaleno glicoles o triglicéridos. Tales supositorios se pueden preparar a partir de mezclas que contienen el ingrediente(s) activo(s) en el intervalo comprendido entre aproximadamente 0,5 y 10%, preferentemente entre aproximadamente 1 y 2%. Las formulaciones orales pueden incluir incipientes empleados normalmente tales como, grados farmacéuticos de sacarina, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones pueden presentarse en forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación mantenida o polvos y contienen aproximadamente entre 1 y 95% del ingrediente(s) activo(s), preferentemente entre aproximadamente 20 y aproximadamente 75%.

Las preparaciones inmunogénicas y vacunas se administran de un modo compatible formulación de la dosificación, y en una cantidad tal que resulte terapéuticamente eficaz, protectora e inmunogénica. La cantidad a administrar depende del sujeto a tratar, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunológico del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, y si es necesario, provocar una respuesta inmunológica mediada por células. Las cantidades precisas requeridas del ingrediente activo a administrar dependerán del juicio del practicante. Sin embargo, los intervalos de dosificación apropiados pueden ser fácilmente determinados por un experto en la materia y pueden ser del orden de microgramos del ingrediente(s) activo(s) por vacunación. Los regímenes apropiados para la administración inicial y dosis de refuerzo también son variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida de administraciones posteriores. La dosificación también puede depender de la vía de administración y variará según el tamaño del huésped.

La concentración del ingrediente activo de proteína en una composición inmunogénica de acuerdo con la invención se encuentra generalmente entre aproximadamente 1 y 95%. Una vacuna que contiene un material antigénico de únicamente un patógeno es una vacuna monovalente. Las vacunas que contienen material antigénico de varios patógenos son vacunas combinadas y también se contemplan en la presente invención. Tales vacunas combinadas contienen, por ejemplo, material de varios patógenos o de varias cepas del mismo patógeno, o de combinaciones de varios
patógenos.

La inmunogenicidad se puede mejorar significativamente si los antígenos se administran conjuntamente con adyuvantes, utilizados habitualmente como una solución entre 0,05 y 0,1 por ciento en tampón fosfato Salinano. Los adyuvantes potencian la inmunogenicidad de un antígeno pero no son necesariamente inmunogénicos en sí mismos. Los adyuvantes pueden actuar reteniendo el antígeno localmente cerca del sitio de administración para provocar un efecto depósito que facilita una liberación lenta y mantenida del antígeno a las células del sistema inmunitario. Los adyuvantes también pueden atraer células del sistema inmunitario hacia un depósito de antígeno y estimular tales células para que eliciten respuestas inmunológicas.

Los agentes inmunoestimulantes o adyuvantes se han utilizado durante muchos años para mejorar las respuestas inmunológicas del huésped, por ejemplo, frente a vacunas. Los adyuvantes intrínsecos, tales como lipopolisacáridos, normalmente son componentes de las bacterias muertas o atenuadas utilizadas como vacunas. Los adyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que típicamente se encuentran unidos a antígenos y se formulan para potenciar las respuestas inmunológicas del huésped. Así, se han identificado adyuvantes que potencian la respuesta inmunológica frente a antígenos suministrados parenteralmente. Sin embargo, algunos de estos adyuvantes son tóxicos y pueden causar efectos secundarios indeseados, haciendo que resulten inapropiados para el uso en humanos y en muchos animales. Así, únicamente el hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (colectivamente conocidos comúnmente como alumbre) se utilizan rutinariamente como adyuvantes en vacunas humanas y veterinarias. La eficacia del alumbre en aumentar las respuestas de anticuerpos frente a la difteria y toxoides tetánicos está bien establecida y una vacuna HBsAg se ha adyuvantado con alumbre. Existe una amplia variedad de adyuvantes extrínsecos que pueden provocar respuestas inmunológicas potentes frente a antígenos. Entre estos adyuvantes se incluyen las saponinas complejadas a proteínas antigénicas de membrana (complejos estimulantes del sistema inmunológico), polímeros plurónicos con aceite mineral, micobacterias muertas en aceite mineral, adyuvante completo de Freund, productos bacterianos, tales como muramil dipéptido (MDP) y lipopolisacárido (LPS), así como también el lípido A y liposomas.

Para inducir eficazmente las respuestas inmunológicas humorales (HIR) y la inmunidad mediada por células (CMI), los inmunógenos se emulsionan frecuentemente en adyuvantes. Muchos adyuvantes son tóxicos, induciendo granulomas, inflamaciones agudas y crónicas (adyuvante completo de Freund, FCA), citolisis (saponinas y polímeros plurónicos) y pirogenicidad, artritis y uveítis anterior (LIPS y MDP). Aunque el FCA es un adyuvante excelente y se utiliza ampliamente en investigación, no tiene licencia para ser utilizado en vacunas humanas o veterinarias debido a su toxicidad.

Entre las características deseables de los adyuvantes ideales, se incluyen:

(1)

ausencia de toxicidad;

(2)

capacidad de estimular una respuesta inmunológica de larga duración;

(3)

simplicidad en la fabricación y estabilidad durante un almacenaje a largo plazo;

(4)

capacidad de elicitar tanto CMI como HIR frente a antígenos administrados por varias vías, si resulta necesario;

(5)

sinergismo con otros adyuvantes

(6)

capacidad de interactuar selectivamente con poblaciones de células que presentan antígenos (APC);

(7)

capacidad de elicitar específicamente respuestas inmunológicas específicas de células TH1 ó TH2; y

(8)

capacidad de incrementar selectivamente los niveles del isotipo de anticuerpo apropiado (por ejemplo, IgA) contra antígenos.

La patente US nº 4.855.283 concedida a Lockhoff et al. el 8 de agosto de 1989, que se incorpora a la presente memoria como referencia, enseña análogos de glicolípidos incluyendo N-glicosilamidas, N-glicosilureas y N-glicosilcarbamatos, cada uno de los cuales está sustituido en el residuo de azúcar por un aminoácido, como inmunomoduladores o adyuvantes. Así, Lockhoff et al. (patente US nº 4.855.283 y ref. 32) describen que los análogos de N-glicolípidos que presentan similaridades estructurales con glicolípidos que se encuentran en la naturaleza, tales como glicosfingolípidos y glicoglicerolípidos, son capaces de elicitar respuestas inmunológicas fuertes tanto en la vacuna del virus herpes simplex como en la vacuna del virus pseudorabia. Se han sintetizado algunos glicolípidos a partir de alquilaminas de cadena larga y ácidos grasos que se encuentran enlazados directamente con los azúcares a través del átomo de carbono anomérico, para mimetizar las funciones de los residuos lipídicos que se encuentran en la naturaleza.

La patente US nº 4.258.029 describe que el hidrocloruro de octadecil tirosina (OTH) funcionaba como adyuvante cuando se complejaba con toxoide tetánico y con la vacuna del virus de la poliomelitis de tipo I, II y III inactivado con formalina. Asimismo, Nixon-George et al. describieron que ésteres octadecilo de aminoácidos aromáticos complejados con un antígeno de superficie de la hepatitis B recombinante potenciaba las respuestas inmunológicas del huésped contra el virus de la hepatitis B.

La elección del adyuvante o combinación de adyuvantes está totalmente comprendida en la capacidad de un inmunólogo experimentado. Los adyuvantes descritos anteriormente incluyen adyuvantes útiles en los desarrollos experimentales así como también adyuvantes con aplicación potencial humana o veterinaria. Las vacunas de influenza A de la invención se pueden formular utilizando cualquiera de los adyuvantes mencionados anteriormente y como tal el uso de cualquiera de los adyuvantes en combinación o conjunción con los polipéptidos M2 modificados de la invención queda contemplado y se encuentra dentro del alcance de la presente invención.

En otro aspecto, la invención comprende procedimientos destinados a generar anticuerpos contra M2, los cuales pueden producirse mediante un procedimiento que comprende la administración de una composición de acuerdo con la invención a un sujeto capaz de producir anticuerpos contra M2 (dicha composición comprende una proteína M2 modificada de acuerdo con la invención) y la recogida de los anticuerpos contra M2 a partir del sujeto.

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para determinar la exposición actual o previa de un sujeto al virus influenza, comprendiendo dicho procedimiento la puesta en contacto de una muestra del sujeto con una proteína M2 modificada de acuerdo con el primer aspecto de la invención y la detección de la unión de los anticuerpos a la proteína M2 modificada. La presencia de anticuerpos indica la exposición actual o previa del sujeto al virus influenza.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una cantidad profilácticamente eficaz de una composición de acuerdo con la invención que contiene una proteína M2 modificada para la preparación de una composición farmacéutica destinada a limitar la infección por el virus influenza A en un sujeto. Las cantidades profilácticas de la composición se pueden determinar rutinariamente.

En aún otro aspecto, la invención proporciona el uso del anticuerpo contra M2 de acuerdo con la invención para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención o tratamiento de un sujeto que padece una infección por el virus influenza A.

Los ejemplos siguientes se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no pretenden, ni se deberían interpretar, como limitativos de la invención en modo alguno.

Ejemplos Ejemplo 1 PCR y construcción del plásmido

Se prepararon secuencias completas y formas truncadas de ADNc de M2 mediante PCR a partir del ARN del virus A/Aichi/2/68 (H3N2). La figura 1 muestra diagramas esquemáticos de M2 y las construcciones de deleción sM2 y ssM2. Cada diagrama muestra un diagrama en cajas de la estructura de M2 y el área delecionada. Debajo de cada uno se encuentran las posiciones de los oligonucleótidos cebadores utilizados en la construcción de los ADNc. F(1) es el cebador directo 1, F(2) es el cebador directo 2, R(1) cebador inverso 1, (R2) cebador inverso 2. (A) La secuencia aminoacídica de M2 se representa en tres cajas, un dominio extracelular, un dominio transmembrana sombreado, y un dominio intracelular. Las anotaciones dentro de las cajas incluyen los epítopos o modificaciones post-traduccionales que han sido descritas para M2: (<>) epítopo para Mab 14C2; líneas verticales discontinuas son enlaces del sulfidrilo de la cisteína; (p) es un sitio de palmitoilación; y (*) es un sitio de fosforilación. (B) sM2 presenta una deleción entre Pro(25) y Asp(44). La deleción se realiza con el apareamiento de cebadores indicado con líneas verticales. ssM2 presenta una deleción entre Pro(25) y Glu(56).

Se diseñaron 4 oligonucleótidos cebadores para generar ADNc. El cebador directo 1 (5'-CCCGAATTCTTAT
GAGCCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCCTATCAGAAACGAATGGGGATGC-3') (SEC ID nº: 1) era específico para la región codificante 5'del gen M2 (nucleótidos 1 a 51) y empezaba con un sitio de restricción 5' EcoRI. El cebador inverso 1 (5'-GTCTTTGCTTACCCCTACGTCTACGTTGCTAAGTTCACTAGGACCTCCTCCC-3') (SEC ID nº:2) [3'-CCCTCCTCCAGGATCACTTGAATCGTTGCATCTGCATCCCCATTCGTTTCTG-5'] codificaba para una amplificación 3' a partir del nucleótido 75. El cebador directo 2 (sM2, 5'-CAAGTGATCCTGGAGGAGGA
GATCGTCTCTTCTTCAAATGC-3'(SEC ID nº: 3); ssM2, 5'-CAAGTGATCCTGGAGGAGGAAAACACGGTCT
GAAAAGAGGGCC-3' (SEC ID nº: 5)) se varió para flanquear áreas escogidas para la deleción y contenía una región 5' homóloga al cebador inverso 1 para permitir el apareamiento. Estos cebadores también codificaban para tres residuos de glicina insertados en lugar de los segmentos delecionados. El cebador inverso 2 (3'-CTATCAGTAAAGCAGTCG
TATCTCGACCTCATCAGCTGCCC-5') (SEC ID nº: 4) [5'-CCCGTCGACTACTCCAGCTCTATGCTGACGAAAT
GAC-TATC-3] codificaba para el extremo 3' de M2 y proporcionaba un sitio de restricción 3' SaII. La secuencia completa del ADNc de M2 se preparó mediante RT-PCR utilizando los cebadores directo 1 e inverso 2. Para las construcciones de deleción, se realizaron las reacciones en el “lado 5'” y el “lado 3'”, se aparearon, seguidamente se amplificó para generar una secuencia completa de M2 ó ADNc de deleción. Estos se digirieron con EcoRI y SaII, se purificaron mediante electroforesis en gel y se ligaron en los sitios EcoRI y SaII de un vector plasmídico, pGEX-5X_{a} (Pharmacia, Piscataway, NJ). La construcción que se ha denominado sM2 presenta una deleción entre los aminoácidos 25 y 44 de la M2 nativa. La construcción que se ha denominado ssM2 presenta una deleción entre los aminoácidos 25 y 56 de la M2 nativa. Los plásmidos se transformaron en la cepa competente de E. coli JM109 (Stratagene, La Jolla, CA). Las secuencias del plásmido se verificaron mediante el análisis automatizado de la secuencia nucleotídica utilizando protocolos estándar.

Ejemplo 2 Expresión y aislamiento de la proteína de fusión

Se escogió el vector pGEX (Pharmacia, Piscataway, NJ) para expresar las construcciones, y permitir la purificación de los productos con una matriz de afinidad simple. pGEX está diseñado para expresar, bajo el control del promotor tac inducible, la glutationa S-transferasa (GST; de Schistosoma japonicum) como una fusión de 29 kD al N-terminal de una secuencia subclonada (Smith y Johnson, 1988). La proteína de fusión se puede purificar a partir de lisados bacterianos mediante cromatografía de afinidad utilizando glutathione sepharose® 4B. El producto de fusión también se puede separar mediante una proteasa específica de sitio, Factor Xa, cuyo sitio se encuentra inmediatamente corriente abajo del C-terminal de la GST.

Proteínas de fusión solubles

Se cultivaron células de stocks congelados en cultivos de una noche de caldo Luria (LB) que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. La mañana siguiente se diluyó el cultivo 1:10 y se cultivó durante 1,5 h a 37ºC con agitación vigorosa. Seguidamente se añadió IPTG (isopropil \beta-D-tiogalactosidasa) hasta una concentración final de 0,1 mM y se continuó la incubación durante 3 a 4 h. Para registrar el crecimiento celular se tomó una alícuota del cultivo cada 0,5 h tras la dilución inicial y se midió la densidad celular (A_{600 \ nm}) durante todo el periodo de inducción. Las células se peletearon por centrifugación y se resuspendieron en tampón de lisis frío (Tris 50, NaCl 100, EDTA 1, pH 8,0). Se añadió lisozima hasta 1 mg/ml y se añadió fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) hasta una concentración de 0,5 mM. La suspensión se mantuvo en hielo durante 15 min. Se añadió ditiotreitol (DTT) hasta una concentración de 5 mM, y la suspensión se lisó mediante sonicación (probe-tip) en hielo durante 1 min. Se añadió Triton X-100 hasta una concentración de 1% y el lisado de mezcló suavemente durante 0,5 h. Seguidamente el lisado se centrifugó a 12.000 x g durante 10 min a 4ºC. Se decantó el sobrenadante y se añadió a una suspensión lavada de glutathiona sepharose® (Pharmacia, Piscataway, NJ) (50% v/v en solución fosfato Salina (PBS)), siendo el volumen de la suspensión igual al 0,2% del volumen del cultivo bacteriano original. Esta mezcla se agitó suavemente durante 30 minutos. Seguidamente se peleteó la sepharose® y el sobrenadante se retiró y se descartó. La sepharose® se lavó un mínimo de tres veces con PBS. La proteína de fusión se eluyó a partir del pellet de sepharose® mediante la adición de tampón de elución (Tris 50, glutationa reducida 10, pH 8,0) utilizando un volumen igual al volumen de lecho de sepharose®. La mezcla de tampón de elución/resina se mezcló durante 15 minutos a temperatura ambiente y seguidamente se peleteó a 500 x g durante 5 minutos. Se recogió el sobrenadante y se realizó una segunda elución para obtener el producto residual.

Para escindir enzimáticamente ssM2 de la fracción GST el producto de fusión se dejó unido a la sepharose® y se trató durante una noche con 10 \mug de Factor Xa (New England Biolabs, Beverly, MA) a 4ºC. La sepharose® con la GST unida se centrifugó y se recogió el sobrenadante, que contenía el ssM2 liberado.

Proteínas de fusión insolubles

Las formas insolubles de M2 se aislaron utilizando el protocolo anterior con las adiciones sugeridas de Frangioni y Neel (1993), las cuales incluyen: (1) introducción de 1,5% de sarcosil antes de la sonicación y (2) aumento de la concentración de Triton X-100 a 4%. Los lavados de PBS de la glutathione sepharose® unida y el tampón de elución contenían un 0,1% de Triton X-100.

Ejemplo 3 Electroforesis y transferencia Western

Se analizó el tamaño y pureza de las proteínas expresadas sobre un gel de SDS-12% poliacrilamida, seguido de la tinción con azul brillante de Coomassie R-250. La figura 3 (A) muestra un gel de SDS-PAGE de las proteínas recombinantes. Los carriles son: (1) marcadores de peso molecular (2) muestra de lisado bacteriano crudo de un cultivo sM2/G inducido (3) muestra purificada de la proteína GST (4) proteína sM2/G (6) proteína ssM2 que ha sido aislada escindiendo ssM2/G con la proteasa Factor Xa. Los pesos moleculares se compararon con marcadores Rainbow de bajo peso molecular (Amersham International, Arlington Heights, IL). Para las inmunotransferencias, los geles se transfirieron a una membrana Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA) utilizando un aparato de transferencia semi-seca (Bio-Rad, Richmond, CA). Las membranas se inmunotransfirieron con una dilución 1:5000 de líquido ascítico que contenía el anticuerpo 14C2 específico contra M2, seguido del marcaje con el sistema ECL (Amersham International, Arlington Heights, IL) y la exposición a una película de rayos X. La figura 3(B) muestra una transferencia Western de GST, sM2/G y ssM2/G utilizando 14C2 como anticuerpo primario.

Ejemplo 4 Vacunación y reto animal

Las proteínas de fusión o la proteína GST control se añadieron a volúmenes iguales de PBS y adyuvante incompleto de Freund. Un volumen de 0,2 ml, que contenía 10 \mug de proteína, se inyectó intraperitonealmente (i.p.) a ratones hembra BALB/c, de 6 a 12 semanas de edad. Se administraron refuerzos después de 3 y 6 semanas para un total de 3 inoculaciones. Se desangraron los animales a partir del plexo orbital en las semanas 6 y 9 y se ensayó el suero individual para detectar anticuerpos que reaccionaran con un péptido sintético compuesto por los primeros 17 aminoácidos de M2 (péptido PM_{2}-1, Slepushkin et al., 1995). La unión del anticuerpo se detectó sobre placas ELISA revestidas con péptido añadiendo Ig contra ratón conjugada a peroxidasa y o-fenilenodiaminohidrocloruro y peróxido de hidrógeno como sustratos colorimétricos. Los títulos se expresan como la mayor dilución que proporcionaba una densidad óptica (DO)_{490} dos veces superior a la del suero control diluido de modo similar.

Tras las inoculaciones, los ratones se sometieron a un reto subletal por virus influenza A heterólogo. Los ratones se anestesiaron con CO_{2} y se infectaron intranasalmente (i.n.) con 100 dosis infecciosas de ratón (MID)_{50} del virus MA A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) ó A/Taiwan/1/86 (H1N1) [equivalente a 5,3 x 10^{6} y 1,3 x 10^{5} dosis infecciosas de huevo (EID)_{50} respectivamente] en un volumen de 50 \mul de PBS. Los ratones se eutanizaron siete días después del reto. Se prepararon homogenados de pulmón y se titularon en huevos embrionados para determinar la infectividad del virus. La significancia estadística de los datos se determinó utilizando la prueba exacta de Fisher o la prueba de la t

\hbox{de
Student.}

Ejemplo 5 Expresión de los recombinantes M2 y M2 con deleciones transmembrana

Los efectos de la expresión de GST-fusión M2/G, sM2/G, ssM2/G y GST sobre la viabilidad celular se ensayaron a varios tiempos tras la inducción de células de E. coli JM109 que contenían las construcciones pGEX respectivas (Fig. 2). Los cultivos de una noche se diluyeron 1:100, se reamplificaron durante 2 horas, y seguidamente se indujeron con IPTG. En el momento de la inducción, la densidad del cultivo M2/G era siempre inferior a la de otros cultivos, presumiblemente debido a la expresión basal de la proteína. La densidad de células que expresaban la M2/G de secuencia completa incrementó sólo marginalmente tras la inducción, lo cual es coherente con las propiedades líticas descritas para M2 cuando se expresa en E. coli (Guinea y Carrasco, 1994). La adición de 5 \muM de amantadita al medio de cultivo no aceleró este patrón de crecimiento, y se obtuvo muy poca, o ninguna proteína de fusión M2/G a partir de estos cultivos. En comparación, los cultivos de sM2/G y ssM2/G mantenían un robusto patrón de crecimiento comparable al del cultivo control de la proteína GST control.

La primera construcción de deleción, en la cual se elimina el dominio transmembrana de M2 (sM2/G, residuos 26 a 43), aunque se expresaba bien, no proporcionaba la proteína de fusión purificada cuando se utilizaba un protocolo estándar de lisis, sugiriendo que permanecía insoluble o en forma agregada. Con la utilización del protocolo con sarcosil se obtenía un modesto rendimiento de aproximadamente 3 mg de la proteína de fusión/l del cultivo bacteriano, según se determinó mediante el ensayo de Bradford para proteínas. Se observó que la deleción adicional, desde el residuo 26 hasta el 55 (ssM2/G), mejoraba sustancialmente el rendimiento de la proteína de fusión sin el procedimiento del sarcosil, sugiriendo un producto soluble. Todos los residuos 44 a 55 de la M2 madura son hidrofóbicos y contribuyen a un índice hidrofóbico positivo para M2 en el análisis Kyte-Doolittle (Lamb et al., 1985). Rutinariamente se consiguen valores de hasta 15 mg/l de cultivo, con una pureza de las proteínas de fusión en cualquier preparación >90%.

Ejemplo 6 SDS-PAGE y transferencia Western

La GST y las proteínas de fusión se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida y, o bien se tiñeron con azul de Coomassie o se prepararon para la inmunotransferencia. En la fig. 3 (A) se muestra un gel teñido con Coomassie. Se incluye una muestra de proteínas totales de células inducidas tomada en la fase inicial del lisado (carril 2). La GST (carril 3), proveniente de una inducción de pGEX sin el inserto M2, se observa como una proteína de 29 kDa. Las proteínas de fusión, sM2/G (carril 4) y ssM2/G (carril 5) se encuentran en aproximadamente 43 kDa. El panel (B) muestra proteínas corridas en un gel simultáneamente con (A), transferidas a una membrana Immobilon-P, e inmunotransferidas con el anticuerpo 14C2 específico contra M2. Las proteínas con un peso aproximado de 43 kDa reaccionaron con 14C2. La GST no se visualiza en la transferencia. Conjuntamente, estos resultados sugieren que el epítopo del anticuerpo 14C2 de las proteínas de deleción de M2 no queda bloqueado por la construcción de fusión y que 14C2 se une exclusivamente al dominio de M2.

Ejemplo 7 Propiedades inmunogénicas y protectoras de las proteínas de fusión recombinantes

La eficacia inmunogénica y protectora de varias construcciones de M2 se ensayó mediante la vacunación de grupos de ratones BALB/c con sM2/G y ssM2/G, y proteínas recombinantes ssM2 aisladas enzimáticamente. El péptido GST se administró como control. Los resultados se muestran en la tabla 1.

TABLA 1 Reto viral de ratones vacunados con construcciones de M2

1

	Los virus del reto eran A/AA/6/60 (H2N2) y A/Taiwan/1/86 (H1N1) adaptados a ratón.
	Todas las vacunaciones eran de 3 x 10 \mug de antígeno en adyuvante incompleto de Freund.
	^{a} \begin{minipage}[t]{145mm}Los títulos se expresan como la mayor dilución de suero que presentaba una (DO_{490}) media superior a la media más dos desviaciones estándar del suero control diluido de modo similar.\end{minipage}
	^{b} \begin{minipage}[t]{145mm}Log_{10}EID_{50}/ml \pm SD medio. Los valores para todas las reducciones de los títulos virales eran significativamente inferiores a los de los grupos control según la prueba t de Students (p<0,001).\end{minipage}

Se vacunaron grupos de 5 a 7 ratones según lo descrito anteriormente y se analizó el anticuerpo en suero que podía reconocer un péptido sintético diseñado para mimetizar el dominio extracelular de M2. El suero de ratones vacunados con el péptido GST control no mostraron un título de anticuerpo detectable (<50) en ningunas de las muestras antes del reto. Sin embargo, los grupos vacunados con las proteínas sM2/G, ssM2/G y ssM2 mostraron títulos elevados tras dos inoculaciones y una tercera inoculación aumentó sustancialmente los títulos medios de anticuerpo en el suero para cada grupo. Sorprendentemente, la deleción de la región transmembrana y residuos hidrofóbicos adicionales de M2 no parece alterar las propiedades inmunológicas del polipéptido variante, haciendo que tales polipéptidos variantes sean candidatos apropiados para vacunas.

Para el reto viral, los ratones vacunados con GST, sM2/G, ssM2/G ó ssM2 se retaron con virus MA A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) ó A/Taiwan/1/86 (H1N1) 4 semanas antes de su refuerzo final. Tras 7 días se eutanizaron los ratones y se recogieron los pulmones. Los títulos virales en los pulmones para los grupos de las proteínas de fusión sM2/G y ssM2/G y ssM2 aislada, eran unas 1000 veces inferiores que los del PBS o de los grupos control de la proteína GST (tabla 2). No se encontró una diferencia significativa entre el efecto protector de sM2/G, ssM2/G y ssM2. Esta tendencia demuestra un potencial de los péptidos M2 alterados para proteger contra el reto viral, tal como se ha demostrado para la M2 de secuencia completa de baculovirus. Las composiciones inmunogénicas, apropiadas para ser utilizadas como vacunas, se pueden preparar a partir de M2 inmunogénica tal como se da a conocer en la presente memoria. Preferentemente, el material antigénico se dializa extensamente para eliminar moléculas indeseables de bajo peso molecular y/o se liofilizan para obtener una formulación más disponible en un vehículo deseado. La composición inmunogénica elicita una respuesta inmunológica que produce anticuerpos, incluyendo anticuerpos M2 que pueden inhibir la replicación viral, así como también respuestas inmunológicas mediadas por células específicas contra el virus influenza A.

Los protocolos y descripción proporcionados anteriormente resultan suficientes para permitir que un experto en la materia reproduzca las invenciones reivindicadas. Los presentes inventores complementan la exposición mediante una lista de publicaciones científicas pertinentes a los protocolos y materiales utilizados para llevar a cabo la presente invención.

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<110> Frace, Michael

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Klimov, Alexander

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Katz, Jaquelline

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Centers for Disease Control and Prevention

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<120> PREPARACIÓN Y USO DE CONSTRUCCIONES Y VACUNAS DE M2 RECOMBINANTE DEL VIRUS INFLUENZA A

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<130> Proteína M2 modificada

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<140>

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<141>

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<150> US 08/906.930

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<151> 1997-08-06

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<160> 5

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 62

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador específico directo-1 para la región codificante 5'del gen M2.

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<400> 1

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cccgaattct tatgagcctt ctaaccgagg tcgaaacgcc tatcagaaac gaatggggat

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60

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gc

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62

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<210> 2

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<211> 52

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador inverso-1 que codifica para la amplificación 3' a partir del nucleótido 75 de la proteína M2.

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<400> 2

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gtctttgctt acccctacgt ctacgttgct aagttcacta ggacctcctc cc

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52

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<210> 3

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<211> 41

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador directo-2 para sM2 que contiene una región 5' homóloga al cebador inverso-1.

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<400> 3

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caagtgatcc tggaggagga gatcgtctct tcttcaaatg c

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<210> 4

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<211> 41

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador inverso-2 que codifica para el extremo 3'de M2.

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<400>4

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ctatcagtaa agcagtcgta tctcgacctc atcagctgcc c

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41

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<210> 5

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador directo-2 para ssM2 que contiene una región 5' homóloga al cebador inverso-1.

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<400> 5

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caagtgatcc tggaggagga aaacacggtc tgaaaagagg gcc

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43

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Claims (21)

1. Polipéptido M2 modificado de la superficie del virus influenza A con hidrofobicidad reducida y expresión recombinante potenciada respecto a la M2 nativa, comprendiendo el polipéptido M2 modificado una secuencia de aminoácidos idéntica a la proteína M2 nativa en la que se ha delecionado la región transmembrana y los residuos de 0 a 12 adyacentes a la región transmembrana en el lado C-terminal.

2. Polipéptido M2 modificado según la reivindicación 1, en el que se ha delecionado la región transmembrana y ninguno de los residuos adyacentes en el lado C-terminal.

3. Polipéptido M2 modificado según la reivindicación 1, en el que se ha delecionado la región transmembrana y 12 aminoácidos adyacentes en el lado C- terminal de la región transmembrana.

4. Polipéptido M2 modificado según la reivindicación 1, en el que la proteína M2 nativa es del virus A/Aichi/68(H3N2).

5. Polipéptido M2 modificado según la reivindicación 4, en el que se han delecionado los aminoácidos 26 a 43.

6. Polipéptido M2 modificado según la reivindicación 4, en el que se han delecionado los aminoácidos 26 a 55.

7. Polipéptido M2 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los residuos aminoacídicos delecionados se sustituyen por uno o más residuos aminoacídicos neutros o hidrofílicos, con la condición de que el número total de residuos aminoacídicos del polipéptido M2 modificado sea inferior o igual al número en el polipéptido M2 nativo.

8. Polipéptido M2 modificado según la reivindicación 7, en el que los residuos aminoacídicos delecionados se sustituyen por entre uno y seis residuos de glicina.

9. Polipéptido M2 modificado de la superficie del virus influenza A con hidrofobicidad reducida y expresión recombinante potenciada respecto a M2 nativo, comprendiendo el polipéptido M2 modificado una secuencia de aminoácidos idéntica a la proteína M2 nativa en la que todos de los residuos aminoacídicos de la región transmembrana y entre 0 y 12 residuos aminoacídicos adyacentes a la región transmembrana en el lado C-terminal se sustituyen por residuos aminoacídicos neutros o hidrofílicos.

10. Polipéptido M2 modificado según la reivindicación 9, en el que todos de los residuos aminoacídicos de la región transmembrana y entre uno y doce aminoácidos adyacentes a la región transmembrana en el lado C-terminal se han sustituido por residuos aminoacídicos neutros ó hidrofílicos.

11. Polipéptido M2 modificado según la reivindicación 9 ó 10, en el que la proteína M2 nativa procede del virus A/Aichi/2/68(H3N2).

12. Proteína de fusión del polipéptido M2 modificado, que comprende un polipéptido M2 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido M2 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Vector capaz de expresar un polipéptido M2 modificado, comprendiendo el vector la molécula de ADN según la reivindicación 13.

15. Célula huésped capaz de expresar un polipéptido M2 modificado, comprendiendo la célula huésped un vector según la reivindicación 14.

16. Célula huésped según la reivindicación 15, en la que el huésped es un procariota.

17. Célula huésped según la reivindicación 15, en la que el procariota es E. coli.

18. Composición que comprende un polipéptido M2 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Anticuerpo específico para un polipéptido M2 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

20. Uso de una cantidad de anticuerpo que resulta profiláctica o que reduce de la carga viral según la reivindicación 19, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a prevenir o tratar un paciente que sufre una infección por el virus influenza A.

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21. Procedimiento destinado a determinar la exposición actual o previa de un sujeto al virus influenza A, comprendiendo el procedimiento poner en contacto una muestra del sujeto con una proteína M2 modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y detectar la unión de anticuerpos a la proteína M2 modificada.