ES2240136T3 - Antigeno basb120 de moraxella catarrhalis. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 a lo largo

Description

Antígeno BASB120 de Moraxella catarrhalis.

Campo de la invención

La invención se refiere a polinucleótidos (referidos aquí como "polinucleótido(s) BASB120"), polipéptidos codificados por ellos (referidos en el presente documento como "BASB120" o "polipéptidos BASB120", materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar infección de ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

Moraxella catarrhalis (también llamada Branhamella catarrhalis) es una bacteria gram-negativa aislada frecuentemente del tracto respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías, las principales son otitis media en infantes y niños, y neumonía en mayores. También es responsable de sinusitis, infecciones nosocomiales y, menos frecuentemente, de enfermedades invasivas.

La otitis media es una importante enfermedad infantil tanto por el número de casos como por sus secuelas potenciales. Más de 3,5 millones de casos se registran cada año en los Estados Unidos, y se estima que el 80% de los niños han experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis. 19:823). Dejada sin tratar, o llegando a ser crónica, esta enfermedad puede conducir a pérdidas de oído que pueden ser temporales (en el caso de acumulación de fluido en el oído medio) o permanentes (si el nervio auditivo se daña). En infantes, tales pérdidas de oído pueden ser responsables de un retraso en el aprendizaje del habla.

Tres especies bacterianas se aíslan primariamente del oído medio de niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae no identificada (NTHi) y M. catarrhalis. Están presentes en el 60-90% de los casos. Una revisión de estudios recientes muestra que S. pneumoniae y NTHi representan ambos aproximadamente 30% y M. catarrhalis aproximadamente 15% de los casos de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). Se pueden aislar otras bacterias del oído medio (H. influenzae de tipo B, S. pyogenes, etc.) pero a mucha menor frecuencia (2% de los casos o menos).

Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto respiratorio superior es un prerrequisito absoluto para el desarrollo de una otitis; sin embargo se requieren otros también para conducir a la enfermedad (Dickinson, DP y col. (1988) J. Infect. Dis. 158: 205, Faden, HL y col. (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100: 612). Éstos son importantes para activar la migración de las bacterias dentro del oído medio por medio de las trompas de Eustaquio, seguidas por la iniciación de un procedimiento inflamatorio. Estos factores son desconocidos hasta la fecha. Se ha postulado que una anomalía transitoria del sistema inmune seguida de una infección viral, por ejemplo, pudo causar una incapacidad para controlar la colonización del tracto respiratorio (Faden, HL, y col. (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312). Una explicación alternativa es que la exposición a factores ambientales permite una colonización muy importante de algunos niños, quienes llegan a ser subsiguientemente susceptibles del desarrollo de otitis media debido a la presencia sostenida de patógenos del oído medio (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267).

La respuesta inmune a M. catarrhalis está pobremente caracterizada. El análisis continuado de cadenas aisladas secuencialmente de la nasofaringe de bebés de 0 a 2 años de edad, indica que consiguen y eliminan frecuentemente nuevas cepas. Esto indica que una se monta respuesta inmune eficaz contra estas bacterias por los niños colonizados (Faden, HL y col. (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312).

En la mayoría de los adultos probados, se han identificado los anticuerpos bactericidas (Chapman AJ y col. (1985) J. Infect. Dis. 151: 878). Las cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad para resistir la actividad bactericida del suero: en general, los aislados de individuos enfermos son más resistentes que aquellos de quienes están simplemente colonizados (Hol, C y col. (1993) Lancet 341: 1281, KL y col. (1990) Am. J. Med. 88 (supl. 5A): 28S). La resistencia al suero se puede considerar por lo tanto como un factor de virulencia de las bacterias. Se ha observado una actividad de opsonización en los sueros de niños que se recuperan de otitis media.

Los antígenos marcados mediante estas respuestas inmunes diferentes en humanos no se han identificado, con la excepción de OMP B1, una proteína 84 kDa cuya expresión se regula por hierro, y que se reconoce mediante los sueros de los pacientes con neumonía (SEIT, S, y col. (1995) Infect. Immun. 63: 1516), y de UspA1 y UspA2 (Chen D. y col. (1999), Infect. Immun. 67: 1310).

Unas pocas proteínas de membrana diferentes presentes en la superficie de M. catarrhalis se han caracterizado usando procedimiento bioquímico, o durante su implicación potencial en la inducción de una inmunidad protectora (para revisar, véase Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). En un modelo de neumonía en ratón, la presencia de anticuerpos dirigidos contra algunos de ellos (UspA, CopB) favorece una eliminación más rápida de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) se conserva altamente entre las cepas de M. catarrhalis, y presenta homologías con una porina de Pseudomonas aeruginosa, la cual se ha demostrado eficaz contra esta bacteria en modelos animales. El documento WO97/32980 describe proteínas del receptor de transferina de Moraxella.

La frecuencia de las infecciones por Moraxella catarrhalis se han elevado dramáticamente en las últimas décadas pasadas. Esto se ha atribuido a la aparición de cepas resistentes a múltiples antibióticos y una población creciente de gente con sistemas inmunes debilitados. Ya no es poco común aislar cepas de Moraxella catarrhalis que son resistentes a algunos o todos los antibióticos estándar. Este fenómeno ha creado una necesidad y demanda médica de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de rastreo de fármacos, y pruebas de diagnóstico para este organismo.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a BASB120, en particular a polipéptidos BASB120 y polinucleótidos BASB120, materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo la prevención y tratamiento de enfermedades microbianas, entre otras. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y afecciones asociadas con tales infecciones, tales como ensayos para detectar expresión o actividad de polinucleótidos BASB120 o polipéptidos.

Diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y el alcance de la invención discutida llegarán a ser patentes para los expertos en la técnica a partir de la lectura de las siguientes descripciones y de la lectura de las otras partes de la presente discusión.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB120 según se describen en detalle más abajo. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos de BASB120 de Moraxella catarrhalis, los cuales no están relacionados por homología de secuencia de aminoácidos con ninguna de las proteínas conocidas. Se predice que es una lipoproteína por que tiene una secuencia señal característica de lipoproteínas. La invención se refiere especialmente a BASB120 que tiene el nucleótido y las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID Nº.:1 y SEQ ID Nº.:2 respectivamente. Se entiende que las secuencias expuestas en detalle en el listado de secuencias más adelante como "DNA" representan una ejemplificación de una realización de la invención, dado que aquellos de habilidad ordinaria reconocerán que tales secuencias se pueden usar útilmente en polinucleótidos en general, incluyendo polirribonucleótidos.

Polipéptidos

En un aspecto de la invención hay polipéptidos proporcionados de Moraxella catarrhalis referidas en el presente documento como "BASB120" y "polipéptidos BASB120", así como variantes de los mismos útiles biológicamente, diagnósticamente, profilácticamente, clínicamente o terapéuticamente, y composiciones que comprenden los mismos.

La presente invención proporciona adicionalmente:

a) un polipéptido aislado el cual comprende una secuencia de aminoácidos el cual tiene al menos una identidad del 85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una identidad del 95%, lo más preferible una identidad del 97-99% o identidad exacta, a aquel de la SEQ ID Nº.: 2.

b) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica la cual tiene al menos una identidad del 85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una identidad del 95%, incluso más preferiblemente una identidad del 97-99% o identidad exacta, a aquel de la SEQ ID Nº.: 1; o

c) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido el cual tiene al menos una identidad del 85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una identidad del 95%, incluso más preferiblemente una identidad del 97-99% o identidad exacta, a aquel de la SEQ ID Nº.: 2.

El polipéptido de BASB120 proporcionado en SEQ ID Nº.:2 es el polipéptido BASB120 de la cepa Moraxella catarrhalis MC2931 (ATCC 43617).

La invención proporciona también un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB120, es decir, una porción contigua del polipéptido BASB120 la cual tiene la misma o sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.:2; es decir, el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un transportador) es capaz de estimular una respuesta inmune la cual reconoce el polipéptido BASB120. Tal fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB120 careciendo de una secuencia líder N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un dominio ancla C-terminal. En un aspecto preferido el fragmento inmunogénico de BASB120 de acuerdo con la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido con al menos una identidad del 85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una identidad del 97-99%, a aquel de SEQ ID Nº.:2 a lo largo de la longitud entera de la SEQ ID Nº.:2.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es enteramente la misma que parte, pero no que toda, de cualquier secuencia de cualquier polipéptido de la invención. Como con los polipéptidos BASB120, los fragmentos pueden ser "de permanencia libre", o comprendidos con un polipéptido mayor del cual forman una parte o región, más preferiblemente como una región continua individual en un polipéptido individual mayor.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos truncados que tienen una función de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.:2 o de una variante de la misma, tal como una serie continua de residuos que incluye una secuencia de aminoácidos aminoterminal y/o carboxiterminal. Se prefieren también las formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidos por o en una célula hospedadora. Se prefieren adicionalmente fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que comprenden regiones de hélice alfa y regiones formadoras de hélice alfa, regiones de lámina beta y regiones formadoras de lámina beta, giros y regiones formadoras de giros, bucles y regiones formadoras de regiones formadoras de bucles, regiones hidrofílicas, regiones hidrofóbicas, regiones alfa antipáticas, región de unión a sustrato, y regiones de alto índice antigénico.

Fragmentos adicionalmente preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o eliminados de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.:2.

Los fragmentos de los polipéptidos de la invención se pueden emplear para producir el polipéptido en su entera longitud mediante síntesis de péptidos; por lo tanto, estos fragmentos se pueden emplear como intermediarios para producir los polipéptidos en su entera longitud de la invención.

Particularmente preferidas son las variantes en las cuales varias, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ó 1 aminoácidos se sustituyen, eliminan, o añaden en cualquier combinación.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de la invención pueden estar en la forma de la proteína "madura" o ser una parte de una proteína mayor tal como un precursor o una proteína de fusión. Es a menudo ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional la cuan contiene secuencias de secreción o secuencias líder, pro-secuencias, secuencias las cuales ayudan a la purificación tales como múltiples residuos de histidina, o una secuencia adicional para estabilidad durante la producción recombinante. Además, también se considera la adición de polipéptido exógeno o cola de lípidos o secuencias de polinucleótidos para incrementar el potencial inmunogénico de la molécula final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión solubles modificadas mediante ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento de la misma, y diversas partes de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de varias subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Preferida como una inmunoglobulina es la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, particularmente la IgG1, donde la fusión tiene lugar en la región de articulación. En una realización particular, la parte Fc se puede eliminar simplemente mediante incorporación de una secuencia de escisión la cual se puede escindir con el factor de coagulación de la sangre Xa.

Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética, y para el uso de la misma para el rastreo de fármacos, diagnosis y terapia. Un aspecto adicional de la invención se refiere también a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Ejemplos tecnología de proteínas de fusión se pueden encontrar en las solicitudes internacionales de patentes Nº^{s}. WO94/29458 y WO94/22914.

Las proteínas se pueden conjugar químicamente, o expresar como proteínas de fusión recombinante permitiendo que se produzcan niveles incrementados en un sistema de expresión comparado con la proteína no fusionada. El compañero de fusión puede ayudar en proporcionar epítopos T-ayudantes (compañeros de fusión inmunológica), preferiblemente epítopos T ayudantes reconocidos por humanos o ayudar en expresar la proteína (potenciador de expresión) a producciones más elevadas que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente el compañero de fusión será tanto un compañero de fusión inmunológico y un compañero potenciador de expresión.

Los socios de fusión incluyen proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Otro socio de fusión es la proteína conocida como LytA. Se usa preferiblemente la parte C-terminal de la molécula Lyta se deriva de Steptococcus pneumoniae, el cual sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa LytA (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) página 265-272}) una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en el armazón del peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína Lyta es responsable de la afinidad a la colina o a algunos análogos de colina tales como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de los plásmidos que expresan Lyta en E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su extremo aminoterminal {Biotecnología: 10, (1992) página 795-798}. Es posible usar la parte repetida de la molécula LytA encontrada en el extremo C-terminal que comienza en el residuo 178, por ejemplo residuos 188-305.

La presente invención también incluye variantes de los polipéptidos mencionados, que son polipéptidos que varían a partir de los referentes mediante sustituciones de aminoácidos conservativos, como resultado de lo cual un residuo se sustituye por otro con características similares. Tales sustituciones típicas están entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr, entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos Lys y Arg; o residuos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar en cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos que se dan en la naturaleza aislados, polipéptidos que se producen recombinantemente, polipéptidos que se producen sintéticamente, o polipéptidos que se producen mediante una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar tales polipéptidos son bien comprendidos en la técnica.

Lo más preferido es que un polipéptido de la invención se derive de Moraxella catarrhalis, sin embargo, se puede obtener preferiblemente a partir de otros organismos del mismo género taxonómico. Un polipéptido de la invención se puede obtener, por ejemplo, de organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

Es un objeto de esta invención proporcionar polinucleótidos que codifican polipéptidos BASB120, particularmente polinucleótidos que codifican el polipéptido designado en el presente documento como BASB120.

En una realización particularmente preferida de esta invención el polinucleótido comprende una región que codifica polipéptidos BASB120 que comprenden una secuencia expuesta en SEQ ID Nº.: 1 la cual incluye un gen en su entera longitud, o una variante de la misma.

El polinucleótido BASB120 proporcionado en la SEQ ID Nº.: 1 es el polinucleótido BASB120 de la cepa MC2931 Moraxella catarrhalis (ATCC 43617).

Como en un aspecto adicional de la invención se han proporcionado moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican y/o expresan polipéptidos BASB120 y polinucleótidos, que incluyen, por ejemplo, RNA no procesados, RNA de ribozimas, mRNA, cDNA, DNA genómicos, B-DNA y Z-DNA. Realizaciones adicionales de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos útiles biológicamente, diagnósticamente, profilácticamente, clínicamente o terapéuticamente, y variantes de los mismos, y composiciones que comprenden la misma.

Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, incluyendo al menos un gen en su entera longitud, que codifica un polipéptido BASB120 que tiene una secuencia de aminoácido reducida de SEQ ID Nº.:2 o una variante del mismo.

En otra realización particularmente preferida de la invención hay un polipéptido BASB120 de Moraxella catarrhalis que comprende o consta de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 o una variante de los mismos.

Usando la información proporcionada en el presente documento, tal como una secuencia de polinucleótidos expuesta en SEQ ID Nº.: 1, un polinucleótido de la invención que codifica polipéptido BASB120 se puede obtener usando clonación estándar y procedimientos de rastreo, tales como para clonar y secuenciar fragmentos de DNA cromosómico a partir de bacterias usando células de Moraxella catarrhalis Catlin como material de partida, seguidos por obtener un clon en su entera longitud. Por ejemplo, para obtener una secuencia polinucleotídica de la invención, tal como una secuencia polinucleotídica dada en SEQ ID Nº. 1, típicamente una biblioteca de clones de DNA cromosómico de Moraxella catarrhalis Catlin en E. coli o algún otro hospedador adecuado se sondea mediante un oligonucleótido marcado radiactivamente, preferiblemente uno de 17 mer o más largo, derivado de una secuencia parcial. Los clones que llevan DNA idéntico a al de la sonda se pueden distinguir usando condiciones astringentes de hibridación. Secuenciando los clones individuales así identificados mediante hibridación con cebadores de secuenciación diseñados de polipéptido original en ambas direcciones es entonces posible extender la secuencia de polinucleótidos en ambas direcciones para determinar una secuencia génica en su entera longitud. Convenientemente, tal secuenciación se lleva a cabo, por ejemplo, usando DNA desnaturalizado de doble cadena preparado a partir de un clon plasmídico. Las técnicas adecuadas se describen en Maniatis T., Fritsch, E.F. y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2º edición; Cloe Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) (véase en particular Screening By Hibridation 1.90 y Sequencing Denatured Double-Stranade DNA Templates 13.70). La secuenciación directa del DNA puede también llevarse a cabo para obtener una secuencia génica en su entera longitud. Lo ilustrativo de la invención, el polinucleótido expuesto en SEQ ID Nº.: 1 se descubrió en una biblioteca de DNA derivada de Moraxella catarrhalis.

Además, la secuencia de DNA expuesta en la SEQ ID Nº.: 1 contiene una fase de lectura abierta que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de residuos de aminoácido expuesto en SEQ ID Nº.: 2 con un peso molecular deducido que se puede calcular usando residuo aminoácido de valores de peso molecular bien conocidos para los expertos en la técnica.

El polinucleótido de SEQ ID Nº: 1, entre el codón de iniciación y el nucleótido Nº. 1 y el codón de parada el cual empieza en el número de nucleótidos 751 de SEC ID Nº:1, que codifica el polipéptido de SEQ ID Nº.: 2.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende o consta de:

a) una secuencia de polinucleótido la cual tiene al menos un 85% de identidad, preferiblemente al menos un 90% de identidad, más preferiblemente al menos un 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97-99% o exacta, a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 a lo largo de la longitud entera de SEQ ID Nº.: 1; o

b) una secuencia de polinucleótido la cual codifica un polipéptido el cual tiene al menos un 85% de identidad, preferiblemente al menos un 90% de identidad, más preferiblemente al menos un 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97-99% o exacta al 100%, a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2 a lo largo de la longitud entera de SEQ ID Nº.: 2.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos de especies distintas de Moraxella catarrhalis, se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de escanear una librería apropiada bajo condiciones restrictivas de hibridación (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo de 45-65ºC y una concentración de SDS de 0,1-1%) con una sonda marcada o detectable que consta de o comprende la secuencia de SEQ ID Nº.: 1 o un fragmento de la misma, por sí misma igual que una secuencia codificante para polipéptido maduro o un fragmento en fase de lectura con otra región codificante, tal como una secuencia codificante líder o secretora, una secuencia pre, o pro, o prepro-proteína. El polinucleótido de la invención puede contener al menos una secuencia no codificante, incluyendo por ejemplo, pero no limitada a al menos una secuencia no codificante 5' y 3', tal como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como señales de terminación rho-dependientes y rho-independientes), sitios de unión a ribosoma, secuencias Kozak, secuencias que estabilizan el RNAm, intrones, y señales de poliadenilación. La secuencia de polinucleótidos puede comprender también una secuencia codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, se puede codificar una secuencia marcadora que facilita purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones de la invención, la secuencia marcadora es un polipéptido hexa-histidina, como se proporciona en el vector pQE (QiaGen, Inc.) como se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 821-824 (1989), o un péptido tag HA (Wilson, y col., Cell 37: 767 (1984), ambos de los cuales pueden ser útiles en purificar secuencia de polipéptidos fusionada a ellos. Los polinucleótidos de la invención incluyen también, pero no se limitan a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas naturalmente que controlan la expresión génica.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido BASB120 de SEQ ID Nº.: 2 puede ser idéntica al polipéptido que codifica la secuencia contenida en nucleótidos del 1 al 750 de SEQ ID Nº.: 1. Alternativamente puede ser una secuencia, a cual como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de SEQ ID Nº:2.

El término "polinucleótido que codifica un polipéptido" como se usa en el presente documento abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido de la BASB120 de Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID Nº.: 2. El término comprende también polinucleótidos que incluyen una región individual continua o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por fago integrado, una región de inserción integrada, un vector de secuencia integrada, una secuencia de trasposón integrada, o debido a la edición de RNA o reorganización del DNA genómnico) conjuntamente con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias codificantes o no codificantes.

La invención se refiere adicionalmente a variaciones de los polinucleótidos descritos en el presente documento que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de SEQ ID Nº:2.

Se pueden usar fragmentos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de la invención en su entera longitud.

Realizaciones adicionales particularmente preferidas son polinucleótidos que codifican variantes de BASB120, que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB120 de la SEQID Nº.: 2 en la cual varios, unas pocos, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1, o ningún residuo aminoácido está sustituido, modificado, eliminado y/o añadido, en cualquier combinación. Especialmente preferidas entre estas son sustituciones, adiciones o deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB120.

Realizaciones adicionales particularmente preferidas de la invención son polinucleótidos que son al menos idénticos en un 85% a lo largo de toda su longitud a un polinucleótido que codifica polipéptido BASB120 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nº:2, y polinucleótidos que son complementarios a tales polinucleótidos. Alternativamente, los más altamente preferidos son polinucleótidos que comprenden una región que es al menos idéntica en un 90% a lo largo de toda su longitud a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB120 y polinucleótidos que son complementarios a los mismos. A este respecto, los polinucleótidos al menos idénticos en un 95% a lo largo de toda su longitud al mismo son particularmente preferidos. Además, aquellos con al menos un 97% son altamente preferidos entre aquellos con al menos un 95%, y entre ellos aquellos con al menos un 98% y al menos un 99% son particularmente altamente preferidos, con al menos un 99% siendo los más preferidos.

Las realizaciones preferidas son polinucleótidos que codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado mediante un DNA de SEQ ID Nº.:1.

De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas de esta invención se proporcionan polinucleótidos que se hibridan, particularmente bajo condiciones restrictivas, a las secuencias de polinucleótidos BASB120, tales como los polinucleótidos en la SEQ ID Nº.: 1.

La invención se refiere adicionalmente a polinucleótidos los cuales se hibridan a las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en el presente documento. A este respecto, la invención se refiere especialmente a polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones restrictivas a los polinucleótidos descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, los términos "condiciones restrictivas" y "condiciones de hibridación restrictiva" significan que la hibridación ocurre sólo si hay al menos un 95% y preferiblemente al menos un 97% de identidad entre las secuencias. Un ejemplo específico de las condiciones de hibridación restrictiva es la incubación durante toda la noche a 42ºC en una disolución que comprende: 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), disolución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramos/ml de DNA de esperma de salmón troceado, seguida por lavar el soporte de de hibridación en SCC 0,1x a aproximadamente 65ºC. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y ejemplificadas en Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularmente el capítulo 11 en éste. La disolución de hibridación se puede usar también con las secuencias polinucleotídicas proporcionadas mediante la invención.

La invención proporciona también un polinucleótido que consta de una secuencia de polinucleótidos obtenida rastreando una biblioteca apropiada que contiene el gen completo para una secuencia de polinucleótidos expuesta en SEQ ID Nº: 1 bajo condiciones de hibridación restrictiva con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencia polinucleotídica expuesta en la SEQ ID Nº: 1 o un fragmento de la misma; y aislar dicha secuencia de polinucleótidos. Los fragmentos útiles para obtener un polinucleótido tal incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores descritos en el presente documento en otra parte.

Como se discute en el presente documento en otra parte con respecto a los ensayos de polinucleótidos de esta invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención, se pueden usar como una sonda de hibridación para RNA, cDNA y DNA genómico para aislar cDNA en su entera longitud y clones genómicos que codifican BASB120 y para aislar cDNA y clones genómicos de otros genes que tienen una identidad elevada, particularmente alta identidad de secuencia, al gen BASB120. Tales sondas generalmente comprenderán al menos 15 residuos nucleotídicos de pares de bases. Preferiblemente, tales sondas tendrán al menos 30 residuos de nucleótidos de pares de bases y pueden tener al menos 50 residuos de nucleótidos o pares de bases. Las sondas particularmente preferidas tendrán al menos 20 residuos nucleotídicos o pares de bases y tendrán menos de 30 residuos nucleotídicos o pares de bases.

Una región codificante de un gen BASB120 se puede aislar mediante rastreo usando una secuencia de DNA proporcionada en SEQ ID Nº 1 para sintetizar una sonda oligonucleotídica. Un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a aquella de un gen de la invención se usa después para rastrear una librería de cDNA, DNA genómico o mRNA para determinar cuales miembros de la biblioteca hibrida la sonda.

Hay varios procedimientos disponibles y bien conocidos para los expertos en la técnica para obtener cDNA en su entera longitud, o DNA cortos extendidos, por ejemplo aquellos basados en el procedimiento de amplificación rápida de extremos de cDNA (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman, y col., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Modificaciones recientes de la técnica, ejemplificadas mediante la tecnología de Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de cDNA más largos. En la tecnología de Marathon™, los cDNA se han preparado a partir de mRNA extraído a partir de un tejido elegido y una secuencia "adaptador" ligada sobre cada extremo. La amplificación de ácidos nucleicos (PCR) se lleva a cabo después para amplificar el extremo 5' "perdido" del DNA usando una combinación de cebadores oligonucleotídicos específicos de adaptadora y específicos de gen. La reacción de PCR se repite después usando cebadores "anidados", es decir, bebedores diseñados para fusionarse en el producto amplificado (típicamente un cebador específico de adaptador que se fusiona más hacia el extremo 3' en la secuencia adaptador y un cebador específico de gen que se fusiona más hacia el extremo 5' en la secuencia génica seleccionada). Los productos de la reacción se pueden analizar después mediante secuenciación de DNA y un DNA en su entera longitud construida construido tanto uniéndose al producto directamente al DNA existente para dar una secuencia completa, o llevando a cabo una PCR de toda la longitud usando la información de la nueva secuencia para el diseño del cebador 5'.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención se pueden emplear, por ejemplo, como agentes de la investigación y materiales para el descubrimiento de tratamientos de y diagnósticos de enfermedades, particularmente enfermedades humanas, como se discute adicionalmente en el presente documento en relación a ensayos con polinucleótidos.

Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos derivados de una secuencia de la SEQ ID Nº: 1 se pueden usar en los procedimientos como se describen en el presente documento, pero preferiblemente para PCR, para determinar si los polinucleótidos identificados en el presente documento en todo o en parte se transcriben o no en bacterias en tejidos infectados. Se reconoce que tales secuencias también tendrán utilidad en la diagnosis del estado de la infección o tipo de la infección que el patógeno ha alcanzado.

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos adicionales aminoterminales o carboxiterminales, o aminoácidos interiores al polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica, por ejemplo). Tales secuencias pueden jugar un papel en el procesamiento de una proteína a partir de una forma precursora a una forma madura, pueden permitir el transporte de proteína, pueden alargar o acortar la vida media de una proteína o pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Como es generalmente el caso in vivo, los aminoácidos adicionales se pueden procesar más a partir de la proteína madura mediante enzimas celulares.

Para todos y cada uno de los polinucleótidos de la invención se proporciona un polinucleótido complementario a ellos. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean totalmente complementarios a cada polinucleótido con el cual son complementarios.

Una proteína precursora, que tiene un forma madura del polipéptido fusionada a una o más prosecuencias puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando las prosecuencias se eliminan tales precursores inactivos generalmente se activan. Algunas o todas las prosecuencias se pueden eliminar antes de la activación. Generalmente, tales precursores se llaman proproteínas.

Además de las representaciones para nucleótidos estándar A, G, C, T/U, el término "N" puede usarse también en describir ciertos polinucleótidos de la invención. "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de DNA o RNA pueden aparecer en una posición tal designada en la secuencia de DNA o RNA, excepto si se prefiere que N no sea un ácido nucleico que cuando se toma en combinación con posiciones adyacentes de polinucleótidos, cuando se lee en la fase de lectura correcta, tendría el efecto de generar un codón de terminación prematuro en tal fase de
lectura.

En suma, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia líder (la cual puede referirse como una preproteína), o una preproteína, la cual es un precursor para una proproteína, que tiene una secuencia líder y una o más prosecuencias, las cuales generalmente se eliminan durante las etapas de procesamiento que producen formas activas y maduras del polipéptido.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para propósitos terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización genética.

El uso de un polinucleótido en la invención en inmunización genética empleará preferiblemente un procedimiento adecuado de administración tal como inyección directa de DNA plasmídico en músculos (Wolf y col, Hum. Mol. Genet. (1992) 1: 363, Manthorpe y col., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), administración de DNA formando un complejo con proteínas transportadoras específicas (Wu y col., J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985), coprecipitación del DNA con fosfato de calcio (Benvenisty & Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), encapsulación de DNA en diversas formas de liposomas (Kaneda y col., Science (1989) 243: 375), bombardeo de partículas (Tang y col., Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun y col., DNA Cell Biol. (1993) 12: 791) e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger y col., PNAS USA, (1984) 81: 5849).

Vectores, células hospedadoras, sistemas de expresión

La invención también se refiere a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, las células hospedadoras que se modifican mediante ingeniería genética con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. Los sistemas de traducción libres de células se pueden emplear también para producir tales proteínas usando RNA derivados de las construcciones de la invención.

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica a partir de células modificadas mediante ingeniería genética con tales sistemas de expresión. De acuerdo con ello, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, para las células hospedadoras las cuales están modificadas mediante ingeniería genética con tales sistemas de expresión, y a la producción de polipéptidos de la invención con técnicas recombinantes.

Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, las células hospedadoras se pueden modificar mediante ingeniería genética para incorporar sistemas de expresión o partes de los mismos o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido dentro de la célula hospedadora se puede llevar a cabo mediante procedimientos descritos en muchos manuales estándar de laboratorio, tales como Davis y col., BASIC METHODS IN MOLECUALR BIOLOGY, (1986) Y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª EDICIÓN, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), tales como, transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga mediante raspado, introducción balística e infección.

Ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de streptococos, estafilicocos, enterococos, E. coli, estreptomices, cianobacterias, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis; células fúngicas tales como células de una levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, un basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, células animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK-293, CV-1 y células de melanoma de Bowes; y células vegetales, tales como células de una gimnosperma o angiosperma.

Una gran variedad de sistemas de expresión se puede usar para producir los polipéptidos de la invención. Tales vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de cromosomas, episomas y virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de trasposones, de epitomas bacterianos, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia, picornavirus, retrovirus, y alfavirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de elementos genéticos plasmídicos y bacteriofágicos, tales como cósmicos y fagémidos. Las construcciones del sistema de expresión pueden contener regiones de control que se regulan igual que la expresión originada. Generalmente, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido en una forma de huésped se usa para la expresión a este respecto. La secuencia apropiada de DNA se puede insertar dentro del sistema de expresión mediante cualquiera de una diversidad de técnicas de rutina, tales como, por ejemplo, aquellas expuestas en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (supra).

En sistemas de expresión recombinantes en eucariotas, para la secreción de una proteína traducida en el lúmen del retículo endoplásmico, dentro del espacio periplásmico o dentro del ambiente extracelular, se pueden incorporar señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos celulares mediante procedimientos bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Lo más preferible, la cromatografía de afinidad de iones metálicos (IMAC) se emplea para purificación. Las técnicas bien conocidas para replegar proteínas se pueden emplear para regenerar conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis, aislamiento y purificación intracelular.

El sistema de expresión puede ser también un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o bacteria. El gen de interés se puede insertar dentro del genoma de un virus o bacteria vivo recombinante. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo conducirá a la expresión in vivo del antígeno e inducción de respuestas inmunes. Los virus o bacterias usados para este propósito son por ejemplo: poxvirus (por ejemplo, vaccinia, virus de la viruela aviar, virus de la viruela del canario), alfavirus (virus Sindbis, virus del bosque de Semliki, virus de la encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus adenoasociado, picornavirus (poliovirus, rinovirus), herpesvirus (virus varicela-zóster), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos, o atenuados en diversas formas con el fin de obtener vacunas vivas. Tales vacunas vivas también forman parte de la invención.

Ensayos de diagnóstico, pronóstico, serotipado y mutación

Esta invención se refiere también al uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB120 de la invención para usar como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos en un eucariota, particularmente un mamífero, y especialmente un humano, proporcionará un procedimiento diagnóstico para la diagnosis de enfermedad, permaneciendo en enfermedad o en enfermedad o respuesta de un organismo infeccioso a fármacos. Los eucariotas, particularmente mamíferos, y especialmente humanos, particularmente aquellos infectados o sospechosos de estar infectados con un organismos que comprende el gen o la proteína BASB120, se puede detectar a nivel del ácido nucleico o nivel de aminoácido mediante una variedad de técnicas bien conocidas igual que mediante procedimientos proporcionados en el presente documento.

Los polipéptidos y polinucleótidos para pronóstico, diagnóstico u otro análisis se pueden obtener a partir de unos materiales corporales de individuos teóricamente infectados y/o infectados. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente DNA o RNA, se pueden usar directamente para detección o se pueden amplificar enzimáticamente usando PCR o cualquier otra técnica de amplificación previa al análisis. RNA, en particular mRNA, cDNA y DNA genómico se pueden usar también de las mismas formas. Usando amplificación, la caracterización de las especies y las cepas de organismos infecciosos o residentes presentes en un individuo, se pueden hacer mediante un análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Las deleciones e inserciones se pueden detectar mediante un cambio en tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada a partir de un organismo relacionado, preferiblemente una especie diferente del mismos género o una cepa diferente de la misma especie. Las mutaciones puntuales se pueden identificar hibridando DNA amplificado con secuencias de polinucleótido BASB120 marcadas. Las secuencias que se aparean perfectamente o significativamente se pueden distinguir de los duplicados imperfectamente apareadas o más significativamente mal apareadas mediante digestión con DNasa o RNasa, para DNA o RNA respectivamente, o detectando diferencias en temperaturas de fusión o cinéticas de renaturalización. Las diferencias de secuencia de polinucleótido también se pueden detectar mediante alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos polinucleotídicos en geles según se comparan con una secuencia de referencia. Esto se puede llevar a cabo con o sin agentes desnaturalizantes. Las diferencias de polinucleóticos se pueden detectar también mediante secuenciación directa de DNA o RNA. Véase, por ejemplo, Myers y col., Science, 230: 1242 (1985). Los cambios en secuencia en localizaciones específicas también se pueden revelar mediante ensayos de protección de nucleasas, tales como ensayo de protección de RNasa, V1 y S1, o un ensayo de escisión química. Véase, por ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401
(1985).

En otra realización, una disposición de sondas de oligonucleótidos que comprenden secuencia de nucleótidos BABS120 o fragmentos de la misma se puede construir para dirigir eficientemente el rastreo de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación taxonómica o identificación. Los procedimientos de disposición de la tecnología se conocen bien y tienen aplicabilidad general y se pueden usar para dirigir una diversidad de cuestiones en genética molecular incluyendo expresión génica, ligazón genética, y variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee y col., Science, 274: 610 (1996).

Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit diagnóstico que comprende:

(a) un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº: 1, o un fragmento de la misma;

(b) una secuencia de nucleótidos complementaria a aquella de (a);

(c) un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de la SEQ ID Nº.: 2 o un fragmento del mismo; o

(d) un anticuerpo contra un polipéptido de la presente invención, preferiblemente al polipéptido de SEQ ID Nº: 2.

Se apreciará que en cualquier kit tal, (a), (b), (c) o (d) pueden comprender un componente sustancial. Un kit tal será de uso en diagnosticar una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad, entre otras cosas.

Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos de la presente invención tales como reactivos diagnósticos. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferible SEQ ID Nº.: 1, la cual está asociada con una enfermedad o patogenicidad proporcionará una herramienta diagnóstica que se puede añadir a, o definir, un diagnóstico de una enfermedad, una prognosis de una fuente de enfermedad, una determinación de un estado morboso, o una susceptibilidad a una enfermedad, lo cual resulta de infraexpresión, sobreexpresión o expresión alterada del polinucleótido. Los organismos, particularmente los organismos infecciosos, llevando mutaciones en tal polinucleótido se pueden detectar al nivel de polinucleótido o polipéptido mediante una diversidad de técnicas, tales como aquellas descritas en otro lugar en el presente documento.

Las células de un organismo que lleva mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención se pueden detectar también a nivel de polinucleótido o polipéptido mediante una diversidad de técnicas, para permitir el serotipado, por ejemplo. Por ejemplo, RT-PCR se puede usar para detectar mutaciones en el RNA. Se prefiere particularmente usar RT-PCR en conjunción con sistemas de detección automática, tales como, por ejemplo, GeneScan. RNA, cDNA, o DNA genómico se pueden usar también para el mismo propósito, PCR. Como un ejemplo, los cebadores de PCR complementarios a un polinucleótido que codifican polipéptido BASB120 se pueden usar para identificar y analizar mutaciones.

La invención proporciona adicionalmente cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o del 3'. Estos cebadores se pueden usar para, entre otras cosas, amplificar el DNA y/o RNA de BASB120 aislado de una muestra derivada de un material individual, tal como un material corporal. Los cebadores se pueden usar para amplificar un polinucleótido aislado de un individuo infectado, tal que el polinucleótido puede estar sujeto después a varias técnicas de elucidación de la secuencia de polinucleótidos. De esta forma, las mutaciones en la secuencia del polinucleótido se pueden detectar y usar para diagnosticar y/o pronosticar la infección o su estado o curso, o para serotipar y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención proporciona adicionalmente un procedimiento para diagnosticar enfermedad, preferiblemente infecciones bacterianas, más preferiblemente infecciones causadas por Moraxella catarrhalis, comprendiendo determinar a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como una material corporal, un nivel incrementado de expresión de polinucleótido que tiene una secuencia de SEQ ID Nº: 1. La expresión incrementada o disminuida de un polinucleótido BASB120 se puede medir usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT-PCR, protección de RNasa, prueba de manchas de Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.

Además, se puede usar un ensayo diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar la sobreexpresión de polipéptido BASB120 comparado con las muestras de tejido control normales para detectar la presencia de una infección, por ejemplo. Las técnicas de ensayo que se pueden usar para determinar niveles de un polipéptido BASB120, en una muestra derivada de un hospedador, tal como un material corporal, se conocen bien por los expertos en la técnica. Tales procedimientos de ensato incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de manchas de western, ensayos sándwich de anticuerpos, detección de anticuerpos y ensayos ELISA.

Los polinucleótidos de la invención se pueden usar como componentes de disposiciones polinucleotídicas, preferiblemente disposiciones de alta densidad o rejillas. Estas disposiciones de alta densidad son particularmente útiles para propósitos de diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, un grupo de manchas comprendiendo cada una un gen diferente, y comprendiendo adicionalmente un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, se puede usar para sondear, tal como usando hibridación o amplificación de ácido nucleico, usando sondas obtenidas o derivadas de una muestra corporal, para determinar la presencia de un polinucleótido particular secuenciado o secuencia relacionada en un individuo. Una presencia tal puede indicar la presencia de un patógeno, particularmente Moraxella catarrhalis, y puede ser útil en diagnosticar y/o pronosticar enfermedad o un curso de enfermedad. Se prefiere una rejilla que comprenda un número de variantes de la secuencia polinucleotídica SEQ ID Nº: 1. También se prefiere una rejilla que comprenda un número de variantes de la secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de SEQ ID Nº.: 2.

Anticuerpos

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención o variantes de la misma, o células que expresan la misma se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para tales polipéptidos o polinucleótidos respectivamente. El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen sustancialmente mayor afinidad por los polipéptidos de la invención que su afinidad por otros polipéptidos relacionados en la técnica previa.

En ciertos polipéptidos preferidos de la invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos BASB120 o polinucleótidos.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención se pueden obtener administrando los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o epítopos que llevan fragmentos de cualquiera de los dos o de ambos, análogos de cualquiera de los dos o de ambos, o células que expresan cualquiera de los dos o ambos, a un animal no humano, usando procedimientos de rutina. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica conocida en la técnica que proporciona anticuerpos producidos mediante cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, tales como aquellas en Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor y col., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole y col., páginas 77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena simple (patente de los Estados Unidos Nº.: 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena simple a polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. Además, los ratones transgénicos, u otros organismos no humanos o animales no humanos, tales como otros mamíferos no humanos, se pueden usar para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos a los polipéptidos o polinucleótidos de la invención.

Alternativamente, la tecnología de mostrar fagos se puede utilizar para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión a un polipéptido de la invención tanto a partir de repertorios de genes v de linfocitos de humanos rastreados acerca de la posesión de anti-BASB120 o de bibliotecas no modificadas amplificados por PCR (McCafferty, y col., (1990), Nature 348, 552-554; Marks y col., (1992) Biotecnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos se pueden incrementar también mediante, por ejemplo, mezclando cadenas (Clackson y col., (1991) Nature 352: 628).

Los anticuerpos anteriormente descritos se pueden emplear parar aislar o para identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad.

Así, entre otros, los anticuerpos frente al polipéptido BASB120 o al polinucleótido BASB120 se pueden emplear para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.

Las variantes polipeptídicas incluyen variantes antigénicamente, epitópicamente o inmunológicamente equivalentes que forman un aspecto particular de esta invención.

Preferiblemente, el anticuerpo o variante del mismo se modifica para hacerlo menos inmunógeno en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es humano lo más preferible puede ser "humanizar" el anticuerpo, del anticuerpo derivado de hibridoma se ha trasplantado dentro de un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo como se describe en Jones y col. (1986), Nature 321, 522-525 o Tempest y col., (1991) Biotechnology 9, 266-273.

Antagonistas y agonistas - Ensayos y Moléculas

Los polipéptidos y los polinucleótidos de la invención se pueden usar también para valorar la unión de sustratos y ligandos moleculares pequeños por ejemplo, en células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas, y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales o pueden ser imitadores estructurales o funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan y col., Current Protocols in Inmunology 1(2): capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de rastreo pueden medir simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o a células o membranas que llevan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión del polipéptido por medio de una marca directamente o indirectamente asociada con el compuesto candidato. Alternativamente, el procedimiento de escaneo puede implicar competición con un competidor marcado. Adicionalmente, estos procedimientos de rastreo pueden probar si el compuesto candidato da como resultado una señal generada mediante activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para las células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Los inhibidores de activación se ensayan generalmente en la presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación mediante el agonista mediante la presencia del compuesto candidato. El polipéptido constitutivamente activo y/o los polipéptidos y polinucleótidos expresados constitutivamente se pueden emplear en procedimientos de rastreo para inhibidores o agonistas inversos, en la ausencia de un agonista o inhibidor, probando si el compuesto candidato da como resultado inhibición de la activación del polipéptido o polinucleótido, como puede ser el caso. Adicionalmente, los procedimientos de rastreo pueden comprender simplemente las etapas de mezclar un compuesto candidato con una disolución que contienen un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, para formar una mezcla, midiendo la actividad del polipéptido BASB120 y/o del polinucleótido BASB120 en la mezcla, y comparando la actividad del polipéptido BASB120 y/o del polinucleótido BASB120 de la mezcla con un estándar. Las proteínas de fusión, tales como aquellas hechas a partir de la parte Fc y el polipéptido BASB120, como se describe anteriormente en el presente documento, se puede usar también para ensayos de rastreo de salida elevada con respecto a la entrada para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, igual que de polipéptidos filogenéticamente y/o funcionalmente relacionados (véase D. Bennett y col., J. Mol. Recognition, 8: 52-58 (1995); y K. Johanson y col., J. Biol. Chem., 270 (16): 9459-9471 (1995)).

Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a y/o interaccionan con un polipéptido de la presente invención pueden también usarse para configurar procedimientos de rastreo para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de RNAm y/o polipéptidos en células. Por ejemplo, un ensayo de ELISA se puede construir para medir niveles de polipéptido segregados o asociados a células que usan anticuerpos monoclonales o policlonales mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica. Esto puede ser para descubrir agentes los cuales pueden inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también llamado antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o tejidos manipulados adecuadamente.

La invención también proporciona un procedimiento de rastrear compuestos para identificar aquellos los cuales potencian (agonistas) o bloquean (antagonistas) la acción de polipéptidos BASB120 o polinucleótidos BASB120, particularmente aquellos compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de rastrear puede implicar técnicas de salida elevada con respecto a la entrada. Por ejemplo para rastrear en busca de agonistas o antagonistas, una mezcla de reacción sintética, un compartimento celular, tal como una membrana, envoltura celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de ellas, que comprende polipéptido BASB120 y un sustrato o ligando marcado de tal polipéptido se incuba en la ausencia o la presencia de una molécula candidata que puede ser un agonista o antagonista de BASF120. La capacidad de la molécula candidato para agonizar o antagonizar el polipéptido BASB120 se refleja en la unión disminuida del ligando marcado o producción disminuida del producto a tal sustrato. Las moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido BASB120 son las más probables para ser buenas antagonistas. Las moléculas que unen bien y, como puede ser el caso, incrementan la velocidad de producción de producto a partir de sustrato, transducción de señales, o actividad química de de los canales son agonistas. La detección de la velocidad o nivel de, como puede ser el caso, producción de producto a partir de sustrato, transducción de señales, o actividad de química de canales se pueden potenciar usando un sistema notificador. Los sistemas notificadores que pueden ser útiles a este respecto incluyen pero no se limitan a sustrato colorimétrico marcado usado convertido en producto, un gen notificador que es responsable de los cambios en el polinucleótido BASB120 o actividad polipétídica, y ensayos de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de un ensayo para agonistas BASB120 es un ensayo competitivo que combina BASB120 y un agonista potencial con moléculas de unión a BASB120, moléculas recombinantes de unión a BASB120, sustratos o ligandos naturales, o imitadores de sustrato o ligando, bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. El BASB120 puede marcarse tal como mediante un compuesto de radiactividad o colorimétrico, tal como el número de moléculas de BASB120 unidas a una molécula de unión o convertidas en producto se puede determinar con seguridad para valorar la eficacia del agonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen, entre otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos, y antibióticos que unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la invención y por lo tanto inhiben o extinguen su actividad o expresión. Los antagonistas potenciales también pueden ser moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína o anticuerpo cercanamente relacionado que une los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir actividades inducidas por BASB120, previniendo de este modo la acción o expresión de polipéptidos BASB120 y/o polinucleótidos BASB120 excluyendo los polipéptidos BASB120 y/o polinucleótidos BASB120 de la unión.

Los antagonistas potenciales incluyen una molécula orgánica pequeña que une y ocupa el sitio de unión del polipéptido previniendo de este modo la unión de moléculas de unión celular, de tal forma que se previene la actividad biológica normal. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen pero no se limitan a pequeñas moléculas orgánicas, péptidos o moléculas similares a péptidos. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido (véase Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXINUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales incluyen compuestos relacionados con y variantes de BASB120.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a proteínas de fusión solubles modificadas genéticamente que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas partes de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de las inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). La parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, particularmente la IgG1, donde la fusión tiene lugar en la región de articulación, se prefiere como inmunoglobulina. En una realización particular, la parte Fc se puede eliminar simplemente mediante la incorporación de una secuencia de escisión la cual se puede escindir con el factor de coagulación de la sangre Xa.

Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética, y al uso de la misma para rastreo de fármacos, diagnosis y terapia. Un aspecto adicional de la invención se refiere también a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Ejemplos de proteínas de fusión se pueden encontrar en las solicitudes de patente internacional Nº^{s}. WO94/29458 y WO94/22914.

Cada una de las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en el presente documento se pueden usar en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, en la expresión, se puede usar como una diana para el rastreo de fármacos antibacterianos. Adicionalmente, las secuencias polinucleotídicas codifican las regiones aminoterminales de la proteína codificada o Shine-Delgarno u otras secuencias que facilitan la traducción del RNAm respectivo se pueden usar para construir secuencias antisentido para controlar la expresión de la secuencia codificante de interés.

La invención también proporciona el uso del polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un hospedador eucariota, preferiblemente mamífero, responsable de secuela o infección. En particular, las moléculas de la invención se pueden usar: en la prevención de la adhesión de bacterias, en particular bacterias gram positivas y/o gram negativas, a las proteínas de la matriz extracelular o dispositivos de fijación en ellos o a proteínas de la matriz extracelular en heridas, de eucariotas, preferiblemente de mamífero; para bloquear la adhesión bacteriana entre las proteínas de la matriz extracelular eucariota, preferiblemente de mamífero, y las proteínas bacterianas BASB120 que median el daño de los tejidos y/o; para bloquear la progresión normal de la patogénesis en infecciones iniciados diferentes que mediante implantación de dispositivos de fijación en ellos o mediante otras técnicas quirúrgicas.

De acuerdo con aún otro aspecto adicional de la invención se han proporcionado agonistas y antagonistas de BASB120, preferiblemente agonistas o antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.

Los antagonistas y agonistas de la invención se pueden emplear, por ejemplo, para prevenir, inhibir y/o tratar enfermedades.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a mimotopos del polipéptido de la invención. Un mimotopo es una secuencia peptídico, suficientemente similar al péptido sin modificar (secuencialmente o estructuralmente), la cual es capaz de reconocerse por los anticuerpos los cuales reconocen el péptido sencillo cuando se acopla a un transportador apropiado.

Los mimotopos de péptidos se pueden diseñar para un propósito particular mediante adición, deleción o sustitución de aminoácidos elegidos. Así, los péptidos se pueden modificar para los propósitos de facilidad de conjugación a una proteína transportadora. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de conjugación química incluir una cisteína terminal. Además, puede ser deseable para péptidos conjugados a una proteína transportadora incluir un término distal hidrofóbico, tal que el extremo no conjugado libre del péptido permanece asociado con la superficie de la proteína transportadora. De este modo el péptido se presenta en una conformación la cual es la que más cercanamente se asemeja al péptido como se encuentra en el contexto de la molécula nativa completa. Por ejemplo, los péptidos se pueden alterar para tener una cisterna N-terminal y una cola amidada hidrofóbica C-terminal. Alternativamente, la adición o sustitución de una forma D-estereoisómero de uno o más de los aminoácidos se puede llevar a cabo para crear un derivado benéfico, por ejemplo para potenciar la estabilidad del péptido.

Alternativamente, los mimotopos del péptido se pueden identificar usando anticuerpos los cuales son capaces por sí mismos de unirse a los polipéptidos de la presente invención usando técnicas tales como tecnología para mostrar fagos (EP 0 552 267 B1). Esta técnica, genera un gran número de secuencias de péptidos las cuales imitan la estructura de los péptidos nativos y son, por lo tanto, capaces de unir a los anticuerpos contra péptidos nativos, pero no necesariamente pueden por sí mismos abundar en homología de secuencia al polipéptido nativo.

Vacunas

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente humanos, los cuales comprenden inocular al individuo con polinucleótido y/o polipéptido BASB120, o un fragmento o una variante del mismo, adecuada para producir anticuerpo y/o respuesta inmune de células T para proteger a dicho individuo contra la infección, particularmente infección bacteriana y más particularmente infección con Moraxella catarrhalis. También se proporcionan procedimientos por los cuales tal respuesta inmunológica ralentiza la replicación bacteriana. Aún otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de inducir respuesta inmunológica en un individuo el cual comprende administrar a tal individuo un vector de ácido nucleico, secuencia o ribozima para la expresión directa de polinucleótido y/o polipéptido BASB120, o un fragmento o una variante del mismo in vivo con el fin de inducir una respuesta inmunológica tal como para producir anticuerpo y/o respuesta inmune de células T, incluyendo, por ejemplo, células T que producen citoquinas o células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo, preferiblemente un humano, de la enfermedad, si esa enfermedad está ya establecida en el individuo o no. Un ejemplo de administrar el gen es acelerándolo dentro de las células deseadas como un recubrimiento de partículas o de otro modo. Tal vector de ácido nucleico puede comprender DNA, RNA, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido DNA/RNA, un complejo proteína-DNA o un complejo proteína-RNA.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferiblemente un humano, capaz de haber inducido en el una respuesta inmune, induce una respuesta inmunológica en tal individuo frente a un polinucleótido y/o polipéptido BASB120 codificado de ahí, en el que la composición comprende un polinucleótido y/o polipéptido BASB120 recombinante codificado de ahí y/o comprende DNA y/o RNA los cuales codifican y expresan un antígeno de dicho polinucleótido BASB120, polipéptido codificado de ahí, u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica se puede usar terapéuticamente o profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad de anticuerpos y/ inmunidad celular, tal como inmunidad celular que surge de las células T CTL o CD4^{+}.

Un polipéptido BASB120 o un fragmento del mismo se puede fusionar con co-proteína o resto químico el cual puede o no puede producir anticuerpos por sí mismo, pero el cual es capaz de estabilizar la primera proteína y producir una proteína fundida o modificada la cual tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferiblemente propiedades protectoras. Así la proteína recombinante fusionada, preferiblemente comprende adicionalmente una coproteína antigénica, tal como lipoproteína D a partir de Haemophilus influenzae, glutation-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína relativamente grande la cual solubiliza la proteína y facilita la producción y purificación de la misma. Además, la coproteína puede actuar como un coadyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que recibe la proteína. La coproteína se puede anclar bien al extremo aminoterminal como al extremo carboxiterminal de la primera proteína.

En una composición de vacuna de acuerdo con la invención, un polipéptido y/o polinucleótido BASB120, o un fragmento o un mimotopo o una variante del mismo se puede presentar en un vector, tal como vectores recombinantes vivos descritos anteriormente, por ejemplo vectores bacterianos vivos.

También son adecuados vectores no vivos para el polipéptido BASB120, por ejemplo vesículas bacterianas de la membrana externa o "ampollas". Las ampollas OM se derivan de la membrana externa de la membrana de dos capas de membrana de bacterias gram-negativas y se ha documentado en muchas bacterias gram-negativas (Zhou, L. y col., 1998, FEMS Microbiol. Lett. 163: 223-228) incluyendo C. trachomatis y C. psittaci. Una lista no exhaustiva de patógenos bacterianos que se han notificado que producen ampollas incluyen también: Bordetella pertussis, Borrelia bugdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Escherichia coli, Haemophilus Influenzae, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolitica.

Las ampollas tienen la ventaja de proporcionar proteínas de membrana externa en su conformación nativa y son así particularmente útiles para vacunas. Las burbujas pueden también mejorarse para uso en vacunas alterando la bacteria tal como para modificar la expresión de una o más moléculas en la membrana externa. Así por ejemplo la expresión de una proteína inmunógena en la membrana externa, tal como el polipéptido BASB120, se puede introducir o sobrerregularse (por ejemplo, alterado el promotor). En cambio o además, la expresión de las moléculas de la membrana externa las cuales son bien no relevantes (por ejemplo antígenos no protectores o proteínas inmunodominantes pero variables) o decrementantes (por ejemplo, moléculas tóxicas tales como LPS, o inductores potenciales de una respuesta autoinmune) se pueden regular a la baja. Estas aproximaciones se discuten en más detalle más adelante.

Las regiones no codificantes flanqueantes del gen BASB120 contienen elementos regulatorios importantes en la expresión del gen. Esta regulación tiene lugar tanto a nivel transcripcional como a nivel traduccional. La secuencia de estas regiones, bien cadena arriba o cadena debajo de la fase de lectura abierta del gen, se puede obtener mediante secuenciación del DNA. Esta información de secuencia permite la determinación de motivos regulatorios potenciales tales como los diferentes elementos promotores, secuencias de terminación, elementos de secuencia inducible, represores, elementos responsables de la variación de fase, la secuencia de shine-dalgarno, regiones con estructura secundaria potencial implicada en regulación, igual que otros tipos de restos regulatorios o secuencias. Esta secuencia es un aspecto adicional de la invención.

La información de secuencia permite la modulación de la expresión natural del gen BASB120. La sobrerregulación de la expresión génica se puede acomplejar alterando el promotor, la secuencia de shine-dalgarno, los elementos potenciales represor y operados, o cualesquiera otros elementos implicados. Asimismo, la regulación a la baja de la expresión se puede poner bajo control de variación de fase, o se puede desacoplar de esta regulación. En otra aproximación, la expresión del gen se puede poner bajo el control de uno o más elementos inducibles que permiten la expresión regulada. Ejemplos de tal regulación incluyen, pero no se limitan a, inducción mediante variación de temperatura, adición de sustratos inductores como carbohidratos seleccionados o sus derivados, elementos traza, vitaminas, cofactores, iones metálicos, etc.

Tales modificaciones como se describen anteriormente se pueden introducir mediante varios medios diferentes. La modificación de secuencias implicadas en expresión génica se puede llevar a cabo in vivo mediante mutagénesis aleatoria seguida por selección para el fenotipo deseado. Otra aproximación consiste en aislar la región de interés y modificarla mediante mutagénesis aleatoria, o mutagénesis mediante reemplazamiento, inserción o deleción dirigidos a sitio. La región modificada se puede reintroducir entonces dentro del genoma bacteriano mediante combinación homóloga, y se puede desear el efecto de una expresión génica. En otra aproximación, el conocimiento de secuencia de la región de interés se puede usar para reemplazar o eliminar todas o parte de las secuencias regulatorias naturales. En este caso, la región regulatoria diana se aísla y modifica tal como para contener los elementos regulatorios de otro gen, una combinación de elementos regulatorios de genes diferentes, una región reguladora sintética, o cualquier otra región regulatoria, o para borrar partes seleccionadas de las secuencias regulatorias de tipo natural. Estas secuencias modificadas se pueden reintroducir dentro de la bacteria por medio de recombinación homóloga dentro del genoma. Una lista no exhaustiva de promotores preferidos que se pueden usar para la sobrerregulación de expresión génica incluye los promotores porA, porB, lbpB, tbpB, p110, 1st, hpuAB de N. meningitidis o N. gonorroheae; ompCD, copB, lbpB, ompE, UspA1, UspA2, TbpB de M. catarrhalis; p1, p2, p4, p5, p6, lpD, tbpB, D15, Hia, Hmw1, Hmw2 de H. influenzae.

En un ejemplo, la expresión del gen se puede modular intercambiando su promotor con un promotor más fuerte (a través de aislar la secuencia cadena arriba del gen, modificación in Vitro de esta secuencia, y reintroducción dentro del genoma mediante recombinación homóloga). La expresión sobrerregulada se puede obtener tanto en la bacteria como en las vesículas de la membrana externa esparcidas (o elaboradas) a partir de la bacteria.

En otros ejemplos, las aproximaciones descritas se pueden usar para generar cepas bacterianas recombinantes con características incrementadas para aplicaciones de vacunas. Estas pueden ser, pero no limitarse a, cepas atenuadas, cepas con expresión incrementada de antígenos seleccionados, cepas con expresión anulada de genes (knock-outs de genes) (o expresión disminuida) de genes que interfieren con la respuesta inmune, cepas con expresión modulada de proteínas inmunodominantes, cepas con esparcimiento modulado de vesículas de membrana externa.

Así, se proporciona también por la invención una región cadena arriba modificada del gen BASB120, la cual región cadena arriba modificada contiene un elemento regulatorio heterólogo el cual altera el nivel de expresión de la proteína BASB120 localizada en la membrana externa. La región cadena arriba de acuerdo con este aspecto de la invención incluye la secuencia cadena arriba del gen BASB120. La región cadena arriba comienza inmediatamente cadena arriba del gen BASB120 y continua usualmente hasta una posición no más de aproximadamente 1.000 pares de bases cadena arriba del gen a partir del codón de iniciación ATG. En el caso de un gen situado en una secuencia policistrónica (operón) las región cadena arriba puede empezar precediendo inmediatamente el gen de interés, o precediendo el primer gen en el operón. Preferiblemente, una región cadena arriba modificada de acuerdo con este aspecto de la invención contiene un promotor heterólogo en una posición entre 500 y 700 pares de bases cadena arriba del ATG.

Así, la invención proporciona un polipéptido BASB120, en una ampolla de bacteria modificada. La invención proporciona adicionalmente células hospedadoras capaces de producir los vectores de ampollas basadas en membrana no vivos. La invención proporciona adicionalmente vectores de ácidos nucleicos que comprenden el gen BASB120 que tiene una región modificada corriente arriba que contiene un elemento regulador heterólogo.

Se proporcionan adicionalmente por la invención procedimientos para preparar las células hospedadoras y ampollas de bacterias de acuerdo con la invención.

También se proporcionan por esta invención composiciones, particularmente composiciones de vacunas, y procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias inmunoestimulatorias de DNA, tales como aquellas descritas en Sato, Y. y col., Science 273: 352 (1996).

Además, hay procedimientos proporcionados por esta invención que usan el polinucleótido descrito o fragmentos particulares del mismo, el cual ha mostrado codificar regiones no variables de proteínas de la superficie de las células bacterianas, en construcciones polinucleotídicas usadas en tales experimentos de inmunización genética en modelos animales de infección con Moraxella catarrhalis. Tales experimentos serán particularmente útiles para identificar epítopos de proteína capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Se cree que esta aproximación permitirá la subsiguiente preparación de anticuerpos monoclonales de valor particular, derivados del órgano requerido del animal que resiste o elimina exitosamente la invención, para el desarrollo de agentes preventivos o tratamientos terapéuticos de la infección bacteriana, en particular infección con Moraxella catarrhalis, en mamíferos, particularmente humanos.

La invención también incluye una formulación de vacuna la cual comprende un polipéptido y/o polinucleótido inmunogénico recombinante de la invención junto con un transportador adecuado, tal como un transportador farmacéuticamente aceptable. Dado que los polipéptidos y polinucleótidos se pueden romper en el estómago, cada vez es preferible administrar parenteralmente, incluyendo, por ejemplo, administración que es subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen disoluciones de inyección estériles acuosas o no acuosas las cuales pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos los cuales vuelven a la formulación isotónica con el fluido corporal, preferiblemente la sangre, del individual; y suspensiones estériles acuosas o no acuosas las cuales pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de una dosis o recipientes multidosis, por ejemplo, ampollas selladas y viales y se pueden almacenar en condiciones de secado en frío requiriendo sólo la adición del transportador líquido estéril inmediatamente antes de usar.

La formulación de vacunas de la invención puede incluir también sistemas coadyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente el sistema coadyuvante sube preferencialmente un tipo de respuesta TH1.

Una respuesta inmune se puede distinguir ampliamente en dos categorías extremas, siendo una respuesta inmune humoral o una respuesta inmune mediada por células (caracterizadas tradicionalmente por anticuerpos y mecanismos efectores celulares de protección respectivamente). Estas categorías de respuesta pueden llamarse respuestas inmunes de tipo TH1 (respuesta mediada por células) y respuestas inmunes de tipo TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunes de tipo TH1 extremas se pueden caracterizar mediante la generación de respuestas de linfocitos T citotóxicos de haplotipo restringido específicas de antígeno, y respuestas de células natural killer. En ratones las respuestas tipo TH1 se caracterizan a menudo por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras en los humanos estas corresponden al tipo de anticuerpos IgG1, Las respuestas inmunes de tipo TH2 se caracterizan por la generación de una amplio rango de isotipos de inmunoglobulina incluyendo en las IgG1, IgA, e IgM de ratón.

Se puede considerar que la fuerza directora detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son las citoquinas. Altos niveles de citoquinasa de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células para dar antígeno, mientras que altos niveles de citoquinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmunes humorales al antígeno.

La distinción de las respuestas inmunes TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad un individuo soportará una respuesta inmune la cual se describe como que es predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente considerar las familias de citoquinas en términos de lo que se describe de clones de células T CD4+ve murinas por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of limphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, páginas 145-173). Tradicionalmente, las respuestas tipo TH1 están asociadas con la producción de las citoquinas INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citoquinas a mentido asociadas directamente con la inducción de respuestas inmunes de tipo TH1 no se producen por células T, tales como IL-12. En contraste, las respuestas de tipo TH2 están asociadas con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se sabe que ciertos coadyuvantes de vacunas son particularmente adecuados para la estimulación bien de respuestas inmunes de tipo TH1 o bien de respuestas inmunes de tipo TH2. Tradicionalmente los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune después de una vacunación o infección incluye medida directa de la producción de citoquinas de TH1 o TH2 mediante linfocitos T in vitro después de reestimulación con antígeno, y/o la medida de la razón IgG1:IgG2a de las respuestas de anticuerpo específicas de antígeno.

Así, un coadyuvante de tipo TH1 es uno el cual estimula preferencialmente las poblaciones aisladas de células T para producir altos niveles de citoquinas de tipo TH1 cuando se reestimulan con antígeno in vitro y promueve el desarrollo tanto de linfocitos T citotóxicos CD8+ y respuestas de inmunoglobulinas antígenos específicas asociadas con el isotipo del tipo TH1.

Los coadyuvantes los cuales son capaces de estimulación preferencial de la respuesta celular TH1 se describen en la solicitud de patente internacional N^{os}. WO 94/00153 y WO 95/17209.

El 3-de-O-acilado-monofosforil-lípido A (D-MPL) es un coadyuvante tal. Este se conoce a partir de GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de 3-de-O-acilado-monofosforil-lípido A con cadenas aciladas 4, 5 ó 6 y se elabora por Ribi Inmunochem, Montana. Una forma preferida de 3-de-O-acilado-monofosforil-lípido A se describe en la patente europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicas, S.A.).

Preferiblemente, las partículas de 3D-MPL son suficientemente pequeñas para filtrarse de forma estéril a través de una membrana de 0,22 micrones (patente europea nº. 0 689 454). ED-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug-100 \mug preferiblemente 25-50 \mug por dosis en el que el antígeno estará típicamente presente en un intervalo 2-50 \mug por dosis.

Otro coadyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada de Hplc derivada de corteza de Quijalla saponaria Molina. Opcionalmente esto se puede mezclar con 3-de-O-aciladomonofosforil-lípido A (3D-MPL), opcionalmente de forma conjunta con un transportador.

El procedimiento de producción de QS21 se describe en la patente de los Estados Unidos Nº. 5.057.540.

El procedimiento de producción de QS21 se ha descrito previamente (documento WO 96/3379). Tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han mostrado ser exitosas estimulando coadyuvantes cuando se formulan conjuntamente con un antígeno.

Los coadyuvantes adicionales los cuales son estimuladores preferenciales de la respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias no metiladas CpG como se describe en el documento WO 96/02555.

Las combinaciones de diferentes coadyuvantes estimuladores TH1, tales como aquellos mencionados anteriormente en el presente documento, se contemplan también como que proporcionan un coadyuvante el cual es un estimulador preferencial de la respuesta celular TH1. Por ejemplo, QS21 se puede formular conjuntamente con 3D-MPL. La razón de QS21: 3D-MPL será típicamente del orden de 1: 10 a 10: 1; preferiblemente de 1: 5 a 5: 1 y a menudo sustancialmente 1: 1. El intervalo preferido para la sinergia óptima es 2,5: 1 a 1: 1 de 3D-MPL: QS21.

Preferiblemente un transportador también está presente en la composición de la vacuna de acuerdo con la invención. El transportador puede ser un aceite en emulsión acuosa, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión de aceite-en-agua preferida comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa-tocoferol y tween 80. En un aspecto particularmente preferido los antígenos en la composición de la vacuna de acuerdo con la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en una emulsión tal. Adicionalmente la emulsión de aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprylina.

Típicamente para administración humana QS21 y 3D-MPL estarán presentes en una vacuna en el intervalo de 1 \mug-200 \mug, tal como 10-100 \mug, preferiblemente 10 \mug-50 \mug por dosis. Típicamente el aceite en agua comprenderá de un 2 a un 10% de escualeno, de un 2 a un 10% de alfa-tocoferol y de un 0,3 a un 3% de tween 80. Preferiblemente la razón de escualeno: alfa-tocoferol es igual a o menor de 1 según esto proporciona una emulsión más estable. Span 85 puede también estar presente a un nivel del 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan adicionalmente un estabilizador.

El aceite no tóxico en emulsiones acuosas contiene preferiblemente un aceite no tóxico, por ejemplo escualano o escualeno, un emulsificador, por ejemplo tween 80, en un transportador acuoso. El transportador acuoso puede ser, por ejemplo, disolución salina tamponada con fosfato.

Una formulación coadyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

La presente invención también proporciona una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunes y afecciones relacionadas. Tal composición polivalente de de vacuna puede incluir un coadyuvante que induce TH-1 como se describe anteriormente en este documento.

Mientras la invención se ha descrito con referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB120, se entiende que esto cubre fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos que se dan en la naturaleza, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, deleciones o sustituciones los cuales no afectan sustancialmente las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes.

Composiciones, kits y administración

En un aspecto adicional de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido
BASB120 y/o un polipéptido BASB120 para administración a una célula o a un organismo pluricelular.

La invención se refiere también a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido discutido en el presente documento o sus agonistas y antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención se pueden emplear en combinación con un transportador o transportadores no estéril(es) o estéril(es) para usar con células, tejidos u organismos, tales como un transportador farmacéutico adecuado para administración a un individuo. Tales composiciones comprenden, por ejemplo, medios aditivos o una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un transportador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales transportadores pueden incluir, pero no se limitan a, disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación se adecuaría al modo de administración. La invención se refiere adicionalmente a lotes de elementos y kits diagnósticos y farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes rellenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención anteriormente mencionadas.

Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención se pueden emplear solos o en conjunción con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en cualquier manera efectiva, conveniente, incluyendo, por ejemplo, administración por las vías tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular subcutánea, intranasal o intradérmica, entre otras.

En terapia o como un profiláctico, el agente activo se puede administrar a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión estéril acuosa, preferiblemente isotónica.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido y/o polinucleótido, tal como la forma soluble de un polipéptido y/o un polinucleótido de la presente invención, péptido agonista o antagonista o pequeño componente molecular, en combinación con un transportador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales transportadores incluyen, pero no se limitan a, disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. La invención se refiere adicionalmente a lotes de elementos y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes rellenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención anteriormente mencionadas. Polipétidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención se pueden solos o en combinación con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptará a la vía de administración, por ejemplo mediante una vía sistémica u oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, típicamente mediante inyección intravenosa. Se pueden usar otras vías de inyección tales como subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Medios alternativos para administración sistémica incluyen administración transmucosal y transdérmica usando agentes penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención se pueden formular en una formulación entérica o encapsulada, la administración oral puede también ser posible. La administración de estos compuestos puede ser también tópica y/o localizada, en la forma de pomadas balsámicas, pastas, geles, disoluciones, polvos y similares.

Para administración a mamíferos, y particularmente humanos, se espera que el nivel de dosificación diaria del agente activo será de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, típicamente alrededor de 1 mg/kg. El médico en cualquier caso determinará la dosificación real la cual será más adecuada para un individuo y variará con la edad, peso y respuesta del individuo en particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplares en el caso promedio. Puede haber, por supuesto, ejemplos individuales donde intervalos de dosis mayores o menores sean de calidad, y tales están dentro del alcance de esta invención.

El intervalo de dosificación dependerá de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la afección del sujeto y el juicio del practicante que atiende. Las dosis adecuadas, sin embargo, están en el intervalo de 0,1-100 \mug/kg del sujeto.

Una composición de vacuna está convenientemente en forma inyectable. Los coadyuvantes convencionales se pueden emplear para potenciar la respuesta inmune. Una unidad de dosificación adecuada para la vacunación des de 0,5 a 5 microgramos/kg de antígeno, y tal dosis se administra preferiblemente 1-3 veces y con un intervalo de 1-3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado, no se observarán efectos adversos toxicológicos que se observarán con los compuestos de la invención los cuales precluirían su administración a individuos adecuados.

Variaciones amplias en la dosificación necesitada, sin embargo, se esperan en vista de la variedad de los compuestos disponibles y las eficiencias diferentes de diversas vías de administración. Por ejemplo, la administración oral se esperará que requiera dosificaciones mayores que administración mediante inyección intravenosa. Variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar usando rutinas empíricas estándar para optimización, como se conoce bien en la técnica.

Bases de datos de secuencias, secuencias en un medio tangible, y algoritmos

Las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas forman un recurso de información valioso con el cual determinar sus estructuras de 2 y 3 dimensiones igual que para identificar secuencias adicionales de homología similar. Estas aproximaciones se facilitan con la mayor facilidad almacenando la secuencia en un medio legible mediante ordenador y usando después los datos empleados en un programa conocidos de estructura macromolecular o para buscar una base de datos de secuencias usando herramientas de búsqueda bien conocidas, tales como el programa de empaquetamiento GCC.

También se proporcionan mediante la invención procedimientos para el análisis de secuencias o cadenas distintivas, particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencia incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencia, tales como análisis de identidad y similitud, análisis de estructura de DNA, RNA y proteínas, ensamblaje de secuencia, análisis cladístico, secuencia de análisis de restos, determinación de fase de lectura abierta, realización de un listado de bases de ácidos nucleicos, análisis de uso de codones, puesta en orden de bases de ácidos nucleicos, y análisis de picos de cromatograma de secuenciación.

Un procedimiento basado en ordenador se proporciona también para llevar a cabo identificación de homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia de polinucleótidos con al menos una segunda secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar homología.

Un procedimiento basado en el ordenador se proporciona también para llevar a cabo la identificación de homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia polinucleotídica que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia polipeptídica con al menos una segunda secuencia polinucleotídica o polipétídica para identificar homología.

Todas las publicaciones y referencias, incluyendo pero no limitadas a las patentes y solicitudes de patente, citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad como si cada publicación o referencia individual se indicara específicamente e individualmente para incorporarse por referencia en el presente documento como se expone en su totalidad. Cualquier solicitud de patente a la cual esta solicitud reivindique prioridad se incorpora también por referencia en el presente documento en su totalidad en la manera anteriormente descrita para publicaciones y referencias.

Definiciones

"Identidad" como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, como puede ser el caso, según se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" significa también el grado de relación de secuencia entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, como puede ser el caso, según se determina mediante la combinación entre cadenas de tales secuencias. La "identidad" se puede calcular fácilmente mediante procedimientos conocidos, incluyendo pero no limitados a aquellos descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith D.W., ed., Academia Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academia Press, 1987; y Sequence Análisis Primer, Gribskov, M. y Deveroux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D. SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos para determinar identidad se diseñan para dar la combinación entre las secuencias probadas. Además, los procedimientos para determinar identidad se diseñan para dar el ajuste más largo entre las secuencias probadas. Además, los procedimientos para determinar identidad se codifican en programas de ordenador públicamente disponibles. Los procedimientos de programas de ordenador para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el programa GAP en el paquete de programas GCG (Deveraux, J., y col, Nucleics Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTIN (Altschul S.F., y col., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), y FASTA (Pearson y Limpian Proc. Matl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1998). La familia BLAST de programas está públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., y col., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El algoritmo bien conocido Smith Waterman se puede usar para determinar identidad.

Los parámetros para comparación de secuencias de polipéptidos incluyen lo siguiente:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: BLOSSUM62 a partir de Henikoff y Henikoff,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919 (1992).

Penalización de discontinuidad: 8

Penalización de longitud de discontinuidad: 2

Un programa útil con estos parámetros está disponible públicamente como el programa "de discontinuidad" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros citados son los parámetros por defecto de las comparaciones de péptidos (junto con ninguna penalización para las discontinuidades de los extremos).

Los parámetros para la comparación de polinucleótidos incluyen lo siguiente:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: apareamientos = +10, desapareamientos = 0

Penalización de discontinuidad: 50

Penalización de longitud de discontinuidad: 3

Disponible como: el programa "de discontinuidad" de Genetics Computer Group, Madison WI. Éstos son los parámetros por defecto de las comparaciones de ácidos nucleicos.

Un significado preferido para "identidad" para polinucleótidos y polipéptidos, como puede ser el caso, se proporciona en (1) y (2) más adelante.

(1) Las realizaciones polinucleotídicas incluyen adicionalmente un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 0 100% de identidad a la secuencia de referencia de SEQ ID Nº.: 1, en las que dicha secuencia polinucleotídica puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID Nº.: 1 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos según se comparan con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consta de a menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción nucleotídica, y en la que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones 5' terminal y 3' terminal de la secuencia del nucleótido de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, interdispersas bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en el que dicho número de alteraciones nucleotídicas se determina multiplicando el número total de nucleótidos en la SEQ ID Nº.: 1 mediante el número entero que define la identidad porcentual dividida por 100 y después restando ese producto del número total de nucleótidos en SEQ ID Nº.: 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones nucleotídicas, x_{n} es el número total de nucleótidos en la SEQ ID Nº.: 1, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en el que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo al número entero más cercano antes de sustraerlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia polinucleotídica que codifican el polipéptido de la SEQ ID Nº.: 2 pueden crear mutaciones sin sentido, con sentido erróneo o que cambian la fase de lectura en esta secuencia codificante y por lo tanto alteran el polipéptido codificado por el polinucleótido siguiendo tales alteraciones.

A modo de ejemplos, una secuencia de polinucleótido de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID Nº.: 1, es decir que puede ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de ácidos nucleicos comparadas con la secuencia de referencia de tal forma que el porcentaje de identidad es menos que el 100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan del grupo que consta de al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de ácido nucleico, y en la que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones 5' terminal y 3' terminal de la secuencia del polinucleótido de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, interdispersas bien individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos con la secuencia de referencia. El número de alteraciones de los ácidos nucleicos en la SEQ ID Nº.: 1 se determina mediante el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después sustrayendo ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en la SEQ ID Nº.: 1 mediante el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después sustrayendo ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en la SEQ ID Nº.: 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en la SEQ ID Nº.: 1, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 85 para el 85%, etc., \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en el que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo al número entero más cercano antes de sustraerlo de x_{n}.

(2) Las realizaciones de polipéptidos incluyen adicionalmente un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 o 100% de identidad a una secuencia polipéptídica de referencia de SEQ ID Nº.: 2, en las que dicha secuencia polinucleotídica puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID Nº.: 2 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos según se compara con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consta de al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de aminoácido, incluyendo sustitución, o inserción, conservadora o no conservadora, y en el que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones aminoterminal o carboxiterminal de la secuencia del polipéptido de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, interdispersas bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos con la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones aminoacídicas se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEQ ID Nº.: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después sustrayendo ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en la SEQ ID Nº.: 2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEQ ID Nº: 2, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en el que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo al número entero más cercano antes de sustraerlo de x_{a}.

A modo de ejemplo, una secuencia de polipéptidos de la presente invención pueden ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID Nº: 2; es decir que puede ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número de alteraciones aminoacídicas según se compara con la secuencia de referencia tal que el porcentaje de identidad es menos del 100%. Tales alteraciones se seleccionan del grupo que consta de al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de aminoácido, incluyendo sustitución, o inserción, conservadora o no conservadora, y en el que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones aminoterminal o carboxiterminal de la secuencia del polipéptido de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, interdispersas bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos con la secuencia de referencia. El número de alteraciones aminoacídicas para una identidad porcentual dada se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEQ ID Nº.: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después sustrayendo ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en la SEQ ID Nº.: 2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEQ ID Nº: 2, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc., y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en el que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo al número entero más cercano antes de sustraerlo de x_{a}.

"Individuo(s)", cuando se usa en el presente documento en referencia a un organismo, significa un eucariota pluricelular, incluyendo, pero no limitado a, un metazoo, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate, y un humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural, es decir, si se da en la naturaleza, ha sido cambiado o retirado de su ambiente original, o ambas cosas. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de sus materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", según se emplea el término en este documento. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce dentro de un organismo en transformación, manipulación genética o mediante otro procedimiento recombinante está "asilado" incluso si está todavía presente en dicho organismo, organismo el cual puede estar vivo o no vivo.

"Polinucleótido(s)" generalmente se refiere a cualquier poliribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, el cual puede ser RNA o DNA no modificado o RNA o DNA modificado incluyendo regiones de cadena simple y de cadena doble.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que se difererencia de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero retiene propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido se diferencia en la secuencia de nucleótidos de otro, polinucleótido de referencia.

Cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o no pueden alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios en el nucleótido pueden resultar en sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncaciones de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se discute más adelante. Una variante típica de un polipéptido se diferencia en la secuencia de aminoácidos de otro, polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan a que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son cercanamente similares en general y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y el polipéptido de referencia se pueden diferenciar mediante una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Un residuo aminoácido sustituido o insertado puede o no puede ser uno codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser una que se dé naturalmente tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce que se dé en la naturaleza. Las variantes que ocurren de forma no natural de polinucleótidos y polipéptidos pueden hacerse mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

"Enfermedad(es)" significa cualquier enfermedad causada por o relativa a infección mediante una bacteria, incluyendo, por ejemplo, otitis media en infantes y niños, neumonía en personas mayores, sinusitis, infecciones nosocomiales y enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de audición, acumulación de fluidos en el oído medio, daño en el nervio auditivo, aprendizaje del habla retrasado, infección del tracto respiratorio superior e inflamación del oído medio.

Ejemplos

Los ejemplos dados a continuación se llevan a cabo usando técnicas estándar, las cuales son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica, excepto donde se describa lo contrario en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no se limitan a la invención.

Ejemplo 1 Secuenciación de DNA del gen BASB120 de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis

La secuencia de DNA del gen BASB120 de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis (referida también como cepa MC2931) se muestra en SEQ ID Nº.: 1. La traducción de la secuencia del polinucleótido BASB120 se muestra en la SEQ ID Nº.: 2.

Ejemplo 2 Construcción de plásmido para expresar BASB120 recombinante A: Clonación del BASB120

Los sitios de restricción EcoRI y SalI modificados en los cebadores de amplificación inversa MC-Lip 12-Fn/t-RI (5'-AGG CAG AGG GAA TTC ATG AAA AAT TTT AAT CAA TAC TTT A-3') [SEQ ID Nº:3] en sentido correcto y MC-Lip12RCh/t-Sal (5'-AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG TAG CTT ATT TTT TGG TAA GAC ATG-3') [SEQ ID Nº: 4], respectivamente, permitieron la clonación direccional de un producto de PCR dentro del plásmido de expresión de E. coli pTLZ2 tal que una proteína madura BASB120 se pudo expresar como una proteína de fusión que contiene una marca de cromatografía de afinidad (His)6 en el extremo C-terminal. El producto de PCR BASB120 se purificó a partir de la reacción de amplificación usando columnas giratorias de gel de sílice (QiaGen) de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes. Para producir los extremos requeridos EcoRI y SalI necesarios para la clonación, el producto purificado de PCR se digirió secuencialmente por completo con enzimas de restricción EcoRI y SalI como se recomienda por el fabricante (Life Technologies).

Siguiendo la primera digestión de restricción, el producto de PCR se purificó por medio de columna giratoria como anteriormente para eliminar sales y se eluye en agua estéril antes de la digestión con la segunda enzima. El fragmento de DNA digerido se purificó de nuevo usando columnas giratorias de gel de sílice antes de la ligazón con el plásmido pTZ2.

B: Producción de vector de expresión

Para preparar el plásmido de expresión pTZ2 para ligazón, se digirió de forma similar por completo tanto con EcoRI como con SalI y después se trató con fosfatasa intestinal de ternero (CIP, \simeq 0,02 unidades/pmol del extremo 5', Life Technologies) como se dirige por el fabricante para prevenir autoligazón. Un exceso molar de aproximadamente 5 veces del fragmento digerido con respecto al vector preparado se usó para programar la reacción de ligazón. Una reacción de ligazón estándar \simeq 20 \mul (\simeq 16ºC, \simeq 16 horas), usando procedimientos bien conocidos en la técnica, se llevó a cabo usando DNA ligasa T4 (\simeq 2,0 unidades/reacción, Life Technologies). Una alícuota de la ligazón (\simeq 5 \mul) se usó para transformar células JM109 electrocompetentes de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Siguiendo un periodo de sobrecrecimiento de \simeq 2-3 horas a 37ºC en \simeq 1,0 ml de caldo LB, las células transformadas se plaquearon en placas de agar LB que contienen ampicilina (100 \mug/ml). Los antibióticos se incluyeron en la selección. Las placas se incubaron durante toda una noche a 37ºC bien en un incubador estándar (placas) o bien en un baño de agua con agitación. Se empleó un análisis de PCR basado en la célula entera para verificar que los transformantes contenían el inserto de DNA BASB120. Aquí, el cultivo en \simeq 1,0 ml de caldo LB Ap durante toda una noche se transfirió a un tubo de polipropileno de 1,5 ml y las células se recolectaron mediante centrifugación en una microcentrífuga de Beckmann (\simeq 3 minutos, temperatura ambiente, \simeq 12.000 X g). El sedimento celular se suspendió en \simeq 200 \mul de agua estéril y una alícuota de \simeq 10 \mul usada para programar un volumen final de reacción de PCR de \simeq 50 \mul conteniendo tanto BASF120 en sentido correcto como cebadores de amplificación inversa. Las concentraciones finales de los componentes de la reacción de PCR fueron esencialmente los mismos que aquellos especificados en el ejemplo 2 excepto que se usaron \simeq 5,0 unidades de Taq polimerasa. La etapa de desnaturalización inicial a 95ºC se incrementó a 3 minutos para asegurar la disrupción técnica de las células bacterianas y liberación de DMNA plasmídico. Un ciclador térmico ABI modelo 9700 y un ciclo 32, perfil de amplificación térmica de tres etapas, es decir 95ºC, 45 segundos; 55-58ºC, 45 segundos, 72ºC, 1 minuto, se usaron para amplificar el fragmento BASB120 a partir de las muestras transformantes lisadas. Tras la amplificación térmica, una alícuota de \simeq 20 \mul de la reacción se analizó mediante electroforesis en gel de azarosa (0,8% de azarosa en un tampón de tris-acetato-EDTA (TAE)). Los fragmentos de DNA se visualizaron mediante iluminación UV después de la electroforesis en gel y la tinción con bromuro de etidio. Un DNA molecular de tamaño estándar (1 Kb en la escala, Life Technologies) se sometió a electroforesis en paralelo con las muestras prueba y se usó para estimar el tamaño de los productos de PCR. Los transformantes que produjeron el producto de PCR de tamaño esperado se identificaron como cepas que contienen una construcción de expresión de BSASB120. Las cepas que contienen plásmido de expresión se analizaron después para la expresión inducible de BASB120 recombinante.

C: análisis de expresión de transformantes PCR-positivos

Para cada transformante PCR-positivo anteriormente identificado, se inocularon \simeq 5,0 ml de caldo LB conteniendo ampicilina (100 \mug/ml) con células a partir de la placa de mancha y crece durante toda la noche a 37ºC con agitación (\simeq 250 rpm). Una alícuota del cultivo sembrado durante toda una noche (\simeq 1,0 ml) se inoculó dentro de un matraz erlenmeyer de 125 ml que contenía \simeq 25 de caldo LB Ap y se dejó crecer a 37ºC con agitación (\simeq 250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó D.O. 600 de \simeq 0,5, es decir, fase logarítmica media (usualmente aproximadamente 1,5-2,0 horas). En este momento aproximadamente la mitad del cultivo (\simeq 12,5 ml) se transfirió a un segundo matraz de 125 ml y la expresión de la proteína recombinante BASB120 inducida por la adición de IPTG (1,0 M de reserva preparado en agua estéril, Sigma) a una concentración final de 1,0 mM. La incubación de tanto los cultivos inducidos por IPTG y no inducidos por IPTG continuados por unas 4 horas adicionales a 37ºC con agitación. Muestras (\simeq 1,0 ml) de ambos cultivos inducidos o no inducidos se eliminaron después del periodo de inducción y las células se recogieron por centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante \simeq 3 minutos. Los sedimentos de células individuales se suspendieron en \simeq 50 \mul de agua estéril, se mezclaron después con un volumen igual de tampón de muestra SDS-PAGE Laernelli 2X que contenía 2-mercaptoetanol, y se situaron en baño de agua hirviendo durante \simeq 3 minutos para desnaturalizar la proteína. Los volúmenes iguales (\simeq 15 \mul) tanto de los lisados de células inducidos por los lisados de células en bruto como de los lisados de células no inducidos se cargaron sobre gel de poliacrilamida con tris/glicina al 12% duplicado (mini-geles de 1 mm de espesor, Novex). Las muestras de lisados inducidas y no inducidas se sometieron a electroforesis juntas con marcadores de peso molecular preteñidos (SeeBlue, Novex) bajo condiciones convencionales que usan un tampón para correr SDS/tris/glicina estándar (BioRad). Continuando con la electroforesis un gel se tiñó con azul brillante de Coomasie R250 (BioRad) y después se destiñó para visualizar proteína o proteínas inducibles por IPTG de BASB120 novedosas. El segundo gel se sometió a una prueba de manchas eléctrica en una membrana PVDF (tamaño de poro 0,45 micrones, Novex) durante \simeq 2 horas a 4ºC usando un aparato de prueba de manchas MiniProtean II de BioRad y un tampón de transferencia de metanol de Towbin (20%). El bloqueo de la membrana y las incubaciones con anticuerpos se llevaron a cabo de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Un anticuerpo monoclonal anti-RGS (His)3, seguido por un segundo anticuerpo antirratón de conejo conjugado con HRP (QiaGen), se usó para confirmar la expresión e identidad de la proteína recombinante. La visualización del patrón reactivo del anticuerpo anti-His se logró usando bien un sustrato de ABT insoluble o bien usando Hyperfilm con el sistema de quimioluminiscencia de Amersham ECL.

Ejemplo 3 Producción de BASB120 recombinante Cepa bacteriana

Una cepa de expresión recombinante de E. coli JM109 conteniendo un plásmido (pTLZ2) que codifica BASB120 de Moraxella catarrhalis, se usó para producir masa celular para la purificación de proteína recombinante. La cepa de expresión se cultivó en placas de agar que contenían 100 \mug/ml de ampicilina ("Ap") para asegurar que la pTLZ2 se mantuvo. Para la criopreservación a -80ºC, la cepa se propagó en caldo LB conteniendo la misma concentración de antibióticos mezclada después con un volumen equivalente de caldo LB conteniendo 30% (p/v) de glicerol.

Medios

El medio de fermentación usado para la producción de proteína recombinante consta de caldo 2X YT (Disco) conteniendo 100 \mug/ml de Ap. Se añadió antiespumante al medio para el fermentador a 0,25 ml/l (Antiespumante 204, sigma). Para inducir expresión de la proteína recombinante BASB120, se añadió IPTG (\beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo) al fermentador (1 mM, final).

Fermentación

Un matraz de siembra erlenmeyer de 500 ml, conteniendo 50 ml de volumen de trabajo, se inoculó con 0,3 ml de cultivo congelado rápidamente descongelado, o diversas colonias a partir de un cultivo en placa de agar selectivo, e incubadas durante aproximadamente 12 horas a 37\pm 1ºC en un plataforma de agitación a 150 rpm (Innova 2100, New Brunswick Scientific). Este cultivo de siembra se usó para inocular un fermentador de volumen de trabajo de 5 l conteniendo caldo 2X YT y ambos antibióticos Ap. El fermentador (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) se operó a 37\pm 1ºC, con chorro de aire 0,2-0,4 VVM, a 250 rpm en impulsores de Rushton. El pH no se controló bien en el cultivo de siembra en matraz o bien en el fermentador. Durante la fermentación, el pH varió de 6,5 a 7,3 en el fermentador. IPTG (reserva 1,0 M, preparado en agua estéril) se añadió al fermentador cuando el cultivo alcanzó el logaritmo medio de crecimiento (\simeq 0,7 D.O. 600 unidades). Las células se indujeron durante 2-4 horas después se recogieron mediante centrifugación usando bien una centrífuga superrrápida 28RS Heraeus (Sepatech) o bien una centrífuga superrrápida RC5C (Sorvall Instruments). La pasta celular se almacenó a -20ºC hasta que se procesó.

Materiales y productos químicos

Imidazol, clorhidrato de guanidina, tris(hidroximetilo), y EDTA (etilendiamina del ácido tetraacético) de calidad biotecnológica o mejor se obtuvieron todos de Ameresco Chemical, Solon, Ohio. El tritón X-100 (t-octilfenoxipolietoxietanol), el tritón-114, y el fosfato de sodio, monobásicos, fueron de calidad reactiva o mejor y se obtuvieron de Sigma Chemical Company, San Luís, Missouri. El ácido acético glacial y el ácido clorhídrico se obtuvieron a partir de Mallincrodt Baker Inc., Phillisburg, Nueva Jersey. El metanol se obtuvo a partir de Fisher Scientific, Fairlawn, Nueva Jersey. El Pefabloc®SC (4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilfluoruro), comprimidos de cóctel inhibidores de proteasa completa, y PMSF (sulfonilfluoruro de fenilmetilo) se obtuvieron de Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, Indiana. La Bestatina, Pepstatina A, e inhibidor de proteasa E-64 se obtuvieron de Calbiochem, Lajolla, California. La disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1 x PBS) se obtuvo de Quality Biologial, Inc., Gaithersburg, Maryland. . La disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (10 x PBS) se obtuvo de BioWhittaker, Walkersville, Maryland. El anticuerpo penta-His, libre de BSA, se obtuvo de QiaGen, Valencia, California. La IgG antirratón de cabra AffiniPure conjugada con peroxidasa se obtuvo de Jackson Immuno Research, West Grove, Penn. La disolución individual AEC se obtuvo a partir de Zymed, San Francisco Sur, California. Todos los otros productos químicos fueron de calidad reactiva o mejor.

La resina de flujo rápido de sefarosa quelada con Ni se obtuvo de Pharmacia, Suecia, California. Los geles de poliacrilamida al 10-20% y al 4-20% premoldeados, todos los tampones y disoluciones para correr geles, los estándares preteñidos con SeeBlue, los estándares multicoloreados multimarca y las membranas de transferencia de PVDF se obtuvieron a partir de Novex, San Diego, California. Los kits de tinción con plata SDS-PAGE se obtuvieron de Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokio, Japón. La disolución de tinción de Coomasie se obtuvo de BioRad laboratorios, Hércules, California. Los filtros de jeringuilla Acrodisc® PF 0,2 m se obtuvieron de Pall Gelman Sciences, Ann. Arbor, Michigan. Los filtros de jeringuilla disponibles de 25 mm GD/X se obtuvieron a partir de BioDesign Inc. Od Nueva York, Carmal Nueva York. Los reactivos de ensayo de proteína BCA y la funda de diálisis Snake Skin de 3.500 MWCO se obtuvieron a partir de Pierce Chemical Co., Rockford, Ilinois.

Ejemplo 4 Purificación de BASB120 a partir de E. coli Purificación de extracción

La pasta celular se descongeló a temperatura ambiente durante 30-60 minutos. Tras la disrupción de la pasta celular, el extracto se fraccionó con PBS enfriado con hielo que contenía tritón X-114 al 1%.

Los restos celulares se eliminaron, el extracto se calentó a 37ºC y las fases se fraccionaron mediante centrifugación.

La fracción de interés se hizo pasar después a través de una resina de flujo rápido de sefarosa quelada con níquel equilibrada en PBS (pH 7,5) que contiene glicerol al 19% y tritón X100 al 0,05%. La proteína se eluyó en el mismo tampón que contiene 200 mM de imidazol. La fracción que contiene la proteína eluída se diluyó con 4 volúmenes de tampón tris 50 mM (pH 7,5) conteniendo EDTA 2 mM, cloruro de sodio 10 mM y tritón X100 al 0,05% y se corrió a través de una resina DEAE-sefarosa FF. El flujo a través de ella se recogió y concentró en una celdilla de agitación aislante de 3 KDa, después se dializó frente a PBS (pH 7,4) conteniendo tritón X100 al 0,1%.

Como se muestra en la figura 1-A, la proteína BASB120 purificada apareció en el análisis de SDS-PAGE como una banda principal que migra a alrededor de 30 kDa (masa molecular relativa estimada). La pureza se estimó en más del 90%. La banda de la proteína BASB120 fue reactiva frente a un anticuerpo monoclonal de ratón estimulado contra el resto 6-histidina (figura 1-B).

Caracterizaciones bioquímicas Análisis de bandas de western y SDS-PAGE

La proteína recombinante purificada BASB120 se redisolvió en geles de poliacrilamida al 4-20% y se transfirió electroforéticamente a membranas PVDF a 100 V durante 1 hora como se describe previamente (Thebaine y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354). Las membranas PVDF se pretrataron después con 25 ml de disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contiene 5% de leche desnatada seca. Todas las incubaciones subsiguientes se llevaron a cabo usando este tampón de pretratamiento.

Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:500 de suero preinmune o inmune o un suero inmune anti-His durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas PVDF se lavaron después dos veces con tampón de lavado (20 mM de tampón tris, pH 7,5, que contiene cloruro de sodio 150 mM y tween-20 al 0,05%). Las membranas PVDF se lavaron después dos veces con tampón de lavado (tampón tris 20 mM, pH 7,5, que contienen cloruro de sodio a 150 mM y tween 20 al 0,05%). Las membranas PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:5000 de IgG de cabra antirratón o anticonejo marcada con peroxidasa (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove. PA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas PVDF se lavaron después 4 veces con tampón de lavado, y se desarrollaron con 3-amino-9-etilcarbazol y peróxido de urea como se suministraron por Zymed (San Francisco, CA) durante 10 minutos cada una.

Ejemplo 5 Producción de antisuero contra BASB120 recombinante

Los antisueros polivalentes dirigidos contra la proteína BASB120 se generaron vacunando dos conejos con la proteína purificada recombinante BASB120. A cada animal se dieron un total de tres inmunizaciones subcutáneamente de aproximadamente 10 \mug de proteína BASB120 por inyección con aproximadamente un intervalo de 21 días. Los animales se sangraron antes de la primera inmunización ("pre-sangrado") y en los días 49 y 56.

Los antisueros polivalentes dirigidos contra la proteína BASB120 se generaron también vacunado seis ratones con la proteína purificada recombinante BASB120. A cada animal se dieron un total de tres inmunizaciones subcutáneamente de aproximadamente 10 \mug de proteína BASB120 por inyección con aproximadamente un intervalo de 14 días. Los animales se sangraron antes de la primera inmunización ("pre-sangrado") y una semana después de la última inmunización.

Las valoraciones de la proteína anti-BASB120 se midieron mediante un ELISA usando proteína BASB120 purificada recombinante (4 \mug/pocillo). La valoración se define como valoraciones del punto medio calculadas mediante un modelo logístico de 4 parámetros usando el software de ajuste XL. Los títulos obtenidos tras la inmunización fueron 1:9800 y 1:27800 para los sueros de conejos y ratones, respectivamente. Los antisueros se usaron como el primer anticuerpo para identificar la proteína en una prueba de bandas de western. La prueba de bandas de western muestra la presencia de un anticuerpo anti-BASB120 en los sueros de animales inmunizados (figuras 2a y 2b, vías indicadas mediante una flecha).

Ejemplo 6 Caracterización inmunológica: exposición a la superficie de BASB120

Las valoraciones de proteína anti-BASB120 se determinan mediante un ELISA usando células completas de Moraxella catarrhalis matadas con formalina. La valoración se define como valoraciones de punto medio calculadas mediante modelo lógicos de 4 parámetros usando el software de ajuste XL.

La valoración observada con los sueros inmunes de conejo o ratón demuestra que la proteína BASB120 está presente en la superficie de las células de M. catarrhalis.

Ejemplo 7 Caracterización inmunológica: análisis de bandas de Western

Diversas cepas de M. catarrhalis que incluyen la ATCC 43617, igual que aislados clínicos de diversas regiones geográficas, se dejan crecer en placas de agar Muller Hinton durante 24 horas a 36ºC. Se usan diversas colonias para inocular caldo. Los cultivos se dejaron crecer hasta que el A620 es aproximadamente 0,6 y las células se recogieron mediante centrifugación. Las células se concentraron y solubilizaron después en el tampón de ensayo PAGE. Las células solubilizadas se disolvieron después en geles de poliacrilamida al 4-20% y las proteínas separadas se transfirieron electroforéticamente a las membranas PVDF. Las membranas PVDF se pretrataron después con tampón de saturación. Todas las incubaciones subsiguientes se llevaron a cabo usando este tampón de pretratamiento.

Las membranas de PVDF se incubaron con suero preinmune o suero inmune de conejo o de ratón. Se lavaron las membranas PVDF.

Las membranas PVDF se incubaron con Ig antirratón o anticonejo de oveja marcada con biotina. Las membranas PVDF se lavaron después tres veces con tampón de lavado, y se incubaron con estreptavidina-peroxidasa. Las membranas PDF se lavaron después 3 veces con tampón de lavado y se desarrollaron con 4-cloro-1-naftol.

La detección de una proteína que corresponde a un peso molecular esperado de BASB120 que es reactivaron los antisueros se usa para demostrar que esta proteína se produce por y se conserva en todas las cepas probadas de Moraxella.

Ejemplo 8 Caracterización inmunológica: actividad bactericida

La actividad citotóxica mediada por complemento de los anticuerpos anti-BASB120 se examina para determinar el potencial de vacuna de la proteína antisuero BASB120 que se prepara como se describe anteriormente. Se examinan las actividades del suero preinmune y el antisuero anti-BASB120 en mediar la matanza por el complemento de M. catarrhalis. Las cepas de M. catarrhalis se dejan crecer en placas. Diversas colonias se añaden al medio líquido. Los cultivos de dejan crecer y se recogen hasta que la A260 es aproximadamente 0,4. Después de una etapa de lavado, el sedimento se pone en suspensión y se diluye.

Los sueros preinmunes y los sueros anti-BASB120 se depositan dentro del primer pocillo de una placa de 96 pocillos y las diluciones seriadas se depositan en los otros pocillos de la misma línea. La M. catarrhalis diluida in vivo se añadió subsiguientemente y la mezcla se incubó. Se añadió complemento en cada pocillo a una disolución de trabajo diferente por adelantado en un ensayo de toxicidad. Cada prueba incluye un control de complemento (pocillos sin suero conteniendo fuente de complemento activa o inactivada), un control positivo (pocillos que contienen suero con una valoración conocida de anticuerpos bactericidas), un control de cultivo (pocillos sin suero ni complemento) y un control de suero (pocillos sin complemento).

Se midió la actividad bactericida de antisuero de conejo o ratón (50% de matanza de la cepa homóloga).

Ejemplo 9 Presencia de anticuerpos contra BASB120 en suero de humano convaleciente

El análisis de bandas de western de BASB120 recombinante purificada se lleva a cabo como se describe en el ejemplo 7 anterior, excepto que se usó una reserva de sueros humanos de niños infectados con M. catarrhalis como la primera preparación de anticuerpos. Ésta se usó para mostrar que los antisueros de individuos infectados de forma natural reaccionan frente a la proteína purificada recombinante.

Ejemplo 10 Eficacia de vacuna BASB120: potenciación de limpieza de pulmones de M. catarrhalis en ratones

Este modelo de ratón se basa en el análisis de la invasión del pulmón por M. catarrhalis seguido de una prueba estándar intranasal a ratones vacunados.

Grupos de ratones se inmunizaron con vacuna BASB120. Después del amplificador, los ratones se probaron mediante instilación de suspensión bacteriana dentro del orificio nasal bajo anestesia. Los ratones se mataron entre 30 minutos y 24 horas después de la prueba y los pulmones se eliminaron asépticamente y se homogeneizaron individualmente. El logaritmo decimal de la media ponderada del número de CFU/pulmón se determina contando las colonias crecidas en placas de agar después del plaqueado de las diluciones del homogenado. La media aritmética del logaritmo decimal de la media ponderada del número de CFU/pulmón y las desviaciones estándar se calcularon para cada grupo. Los resultados se analizaron estadísticamente.

En estos grupos experimentales de ratones se inmunizaron bien con BASB120 o bien con una preparación de células completas matadas (kwc) de M. catarrhalis o se inmunizaron simuladamente.

Esto se usó para mostrar que la preparación kwc y la vacuna BASB120 inducen limpieza significativa del pulmón en comparación con el grupo control.

Ejemplo 11 Inhibición de la adhesión de M. catarrhalis sobre células mediante antisuero anti-BASB120

Este ensayo mide la capacidad de antisueros anti-BASB120 para inhibir la adhesión de bacterias de Moraxella a células epiteliales. Esta actividad pudo prevenir la colonización de f.i. la nasofaringe mediante Moraxella.

Un volumen de bacterias se incubaron sobre hielo con un volumen de dilución en suero preinmune o inmune anti-BASB120. Esta mezcla se añade subsiguientemente en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contiene un cultivo de células confluentes que se lavó una vez con medio de cultivo para eliminar los rastros de antibiótico. La placa se centrifugó e incubó.

Cada pocillo se lavó con cuidado. Después del último lavado, se añadió glicocolato de sodio a los pocillos. Después de la incubación, la capa de células se recoge mediante raspado y se homogeniza. Las diluciones del homogenado se plaquean en placas de agar y se incuban. Se contó el número de colonias en cada placa y se calculó el número de bacterias presentes en cada pocillo.

Esto se usó para mostrar que las bacterias incubadas con antisuero anti-BASB120 se inhiben en su capacidad de adherencia a las células Hep-2.

Materiales depositados

Un depósito que contiene una cepa Catlin de Moraxella catarrhalis se ha depositado en la American Type Culture Collection (en el presente documento "ATCC") el 21 de junio de 1997, y se le asignó número de depósito 43617. El depósito se describió como Banhamella catarrhalis (Frosch y Kolle) y es una biblioteca de insertos de 1,5-2,9 kb, secada en frío, construida a partir de un aislado de M. catarrhalis obtenido a partir de un aspirado transtraqueal de un minero del carbón con bronquitis crónica. El depósito se describe en Antimicrob. Agents Chemother. 21: 506-508 (1982).

El depósito de la cepa de Moraxella catarrhalis se refiere en el presente documento como "la cepa depositada" o como "el DNA de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen BASB120 en su entera longitud.

Un depósito de un vector pMC-ORF1/2 que consiste en DNA de Moraxella catarrhalis insertado en pQE30 se ha depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) el 12 de febrero de 1999 y se le asignó número de depósito 207118.

La secuencia de los polinucleótidos contenidos en la cepa/clon depositado, igual que la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado de este modo, se controlan en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencias en el presente documento.

El depósito de las cepas depositadas se ha hecho bajo los términos del tratado de Budapest en el Internacional Recognition of the Deposito f Micro-organisms for Purposes of Patent Procedure. Las cepas depositadas serán irrevocablemente y sin restricción o condición expuestas libremente al público en la expedición de una patente. Las cepas depositadas se proporcionan meramente como conveniencia para los expertos en la técnica y no son una admisión de que se requiera un depósito para la capacitación, tal como se requiere a tenor del 35 U.S.C. \oint 112.

1

\newpage

Información de secuencias

Secuencias del polinucleótido y polipéptido BASB120

SEQ ID Nº.: 1

Secuencia del polinucleótido BASB120 de la cepa ATCC43617 de Moraxella catarrhalis

2

SEQ ID Nº.: 2

Secuencia del polipéptido BASB120 deducida del polinucleótido de la SEQ ID Nº.: 1

3

SEQ ID Nº.: 3

AGG CAG AGG GAA TTC ATG AAA AAT TTT AAT CAA TAC TTT A

SEQ ID Nº.: 4

AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG TAG CTT ATT

TTT TGG TAA GAC ATG

<110> SmithKline Beecham Biologicals S.A.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Compuestos Novedosos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> BM45411

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows version 3.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 753

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcagaggg aattcatgaa aaattttaat caatacttta

\hfill

40

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcagaggg tcgacttaat ggtgatggtg atggtgtagc ttattttttg gtaagacatg

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (29)

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 a lo largo de la longitud entera de SEQ ID Nº.: 2.

2. Un polipéptido aislado según se reivindica en la reivindicación 1 en el cual la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 a lo largo de la longitud entera de SEQ ID Nº.: 2.

3. El polipéptido que se reivindica en la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2.

4. Un polipéptido aislado que consta de SEQ ID Nº.: 2.

5. Un fragmento inmunogénico del polipéptido según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, fragmento el cual (si es necesario cuando se acopla en un transportador) es capaz de estimular una respuesta inmune la cual reconoce el polipéptido de la SEQ ID Nº.: 2.

6. Un polipéptido o un fragmento inmunogénico según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicho polipéptido o dicho fragmento inmunogénico es parte de una proteína de fusión mayor.

7. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido o un fragmento inmunogénico como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 a lo largo de la longitud entera de SEQ ID Nº.: 2; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

9. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID Nº.: 2 a lo largo de la región codificante entera; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

10. Un polinucleótido aislado el cual comprende una secuencia nucleotídica la cual tiene al menos un 85% de identidad con aquella de SEQ ID Nº.: 1 a lo largo de la longitud completa de SEQ ID Nº.: 1; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

11. El polinucleótido aislado según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 en el cual la identidad es al menos el 95% de la SEQ ID Nº.: 1.

12. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la SEQ ID Nº.: 2, o el fragmento inmunogénico de la reivindicación 5 ó 6.

13. Un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de SEQ ID Nº: 1.

14. Un polinucleótido aislado de acuerdo a la reivindicación 12 obtenible rastreando una biblioteca apropiada bajo condiciones restrictivas de hibridación con una sonda etiquetada que tiene la secuencia de SEQ ID Nº: 1 o un fragmento de la misma.

15. Un vector de expresión o un microorganismo vivo recombinante que comprende un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-14.

16. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 15 o una fracción subcelular de dicha célula hospedadora cuya fracción subcelular comprende un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 85% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 a lo largo de la longitud entera de SEQ ID Nº.: 2; o una membrana de dicha célula hospedadora, membrana la cual comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 a lo largo de la longitud entera de SEQ ID Nº.: 2.

17. Un procedimiento para producir un polipéptido o un fragmento inmunogénico de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 16 bajo condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido o dicho fragmento inmunogénico y recuperar el polipéptido o el fragmento inmunogénico a partir del medio de cultivo.

18. Un procedimiento para expresar un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 7-14 que comprende transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y cultivar dicha célula hospedadora bajo condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

19. Una composición de vacuna que comprende una cantidad efectiva del polipéptido o el fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un transportador farmacéuticamente aceptable.

20. Una composición de vacuna que comprende una cantidad efectiva del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 y un transportador farmacéuticamente aceptable.

21. La composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 en la que dicha composición comprende al menos un antígeno diferente de Moraxella catarrhalis.

22. Un anticuerpo generado contra un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 a lo largo de la longitud entera de SEQ ID Nº.: 2 o un fragmento inmunogénico de la misma, fragmento el cual (si es necesario cuando se acopla a un hospedador) es capaz de estimular una respuesta inmune la cual reconoce el polipéptido de SEQ ID Nº.: 2.

23. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 22 en el que la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 a lo largo de la longitud entera de SEQ ID Nº.: 2.

24. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 22 en el que el polipéptido tiene la secuencia de SEQ ID Nº.: 2.

25. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 en el que el polipéptido o fragmento inmunogénico del mismo es parte de una proteína de fusión mayor.

26. Un procedimiento de diagnosticar una infección con Moraxella catarrhalis, que comprende identificar un polipéptido o un fragmento inmunogénico según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, presentes en una muestra biológica para aislarse a partir de un animal sospechoso de tener una infección tal.

27. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido o un fragmento inmunogénico del mismo según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la preparación de un medicamento para usar en generar una respuesta inmune en un animal.

28. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 7-14 en la preparación de un medicamento para usar en la generación de una respuesta inmune en un animal.

29. Una composición terapéutica útil en tratar humanos con enfermedad causada por Moraxella catarrhalis que comprende al menos un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 y un transportador farmacéutico adecuado.