ES2284521T3

ES2284521T3 - Polipeptido basb119 y polinucleotido de moraxella catarrhalis.

Info

Publication number: ES2284521T3
Application number: ES00958324T
Authority: ES
Inventors: Joelle Thonnard
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1999-08-03
Filing date: 2000-07-31
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2020-07-31
Also published as: CA2380822A1; JP2003506045A; EP1206549B1; DE60034463D1; US7691395B2; US20080254034A1; EP1206549A1; ATE360073T1; DE60034463T2; WO2001009336A1; GB9918302D0; CN1377411A; AU6988700A

Abstract

Una composición de vacuna que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 por toda la longitud de la SEQ ID NO:2 o un fragmento inmunogénico del mismo que (si es necesario cuando está acoplado a un vehículo) puede producir una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de SEQ ID NO:2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

Polipéptido BASB119 y polinucleótido de Moraxella catarrhalis.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polinucleótidos, (en el presente documento denominados "polinucleótido(s) BASB119"), a polipéptidos codificados por ellos (denominados en el presente documento "BASB119" o "polipéptido(s) BASB119"), materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para detectar la infección de determinados patógenos.

Antecedentes de la invención

Moraxella catarrhalis (también denominada Branhamella catarrhalis) es una bacteria Gram negativa aislada frecuentemente de las vías respiratorias altas humanas. Es responsable de varias patologías, siendo las principales otitis media en lactantes y niños, y neumonía en ancianos. También es responsable de la sinusitis, infecciones nosocomiales y menos frecuentemente de enfermedades invasivas.

La otitis media es una enfermedad infantil importante tanto por el número de casos como por sus posibles secuelas. Más de 3,5 millones de casos se registran cada año en los Estados Unidos, y se estima que el 80% de los niños han experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis 19:823). Si no se trata, o se vuelve crónica, esta enfermedad puede conducir a pérdidas de audición que pueden ser temporales (en el caso de acumulación de fluidos en el oído medio) o permanentes (si el nervio auditivo está dañado). En lactantes, tales pérdidas de audición pueden ser responsables de un aprendizaje del lenguaje retardado.

Tres especies bacterianas se aíslan principalmente del oído medio de niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza no tipificable (NTHi) y M. catarrhalis. Estas están presentes en del 60 al 90% de los casos. Una revisión de estudios recientes muestra que S. pneumoniae y NTHi representan ambas aproximadamente el 30%, y M. catarrhalis aproximadamente el 15% de los casos de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). Otras bacterias podrían aislarse del oído medio (H. influenza tipo B, S. pyogenes etc) pero con una frecuencia mucho menor (el 2% de los casos o menos).

Los datos epidemiológicos indican que para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización de las vías respiratorias altas es un requisito previo absoluto para el desarrollo de una otitis; sin embargo también se requieren otros para conducir a la enfermedad (Dickinson, DP et al. (1988) J. Infect. Dis. 158:205, Faden, HL et al. (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100:612). Éstos son importantes para desencadenar la migración de las bacterias al oído medio a través de las trompas de Eustaquio, seguida del inicio de un proceso inflamatorio. Estos factores son desconocidos hasta la fecha. Se ha postulado que una anomalía temporal del sistema inmunitario tras una infección viral, por ejemplo, podría provocar una incapacidad para controlar la colonización del aparato respiratorio (Faden, HL et al (1994) J. Infect. Dis. 169:1312). Una explicación alternativa es que la exposición a factores ambientales permite una colonización más importante de algunos niños, que posteriormente se vuelven susceptibles a desarrollar otitis media debido a la presencia sostenida de patógenos del oído medio (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267).

La respuesta inmunitaria frente a M. catarrhalis está poco caracterizada. El análisis de cepas aisladas secuencialmente de la nasofaringe de bebés seguidos desde los 0 hasta los 2 años de edad, indica que obtienen y eliminan frecuentemente cepas nuevas. Esto indica que una respuesta inmunitaria eficaz contra estas bacterias está aumentada en los niños colonizados (Faden, HL et al (1994) J. Infect. Dis. 169:1312).

En la mayoría de los adultos sometidos a prueba, se han identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, AJ et al. (1985) J. Infect. Dis. 151:878). Las cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad para resistir la actividad bactericida del suero: en general, los aislados de individuos enfermos son más resistentes que los que están simplemente colonizados (Hol, C et al. (1993) Lancet 341:1281, Jordan, KL et al. (1990) Am. J. Med. 88 (supl. 5A):28S). La resistencia al suero podría considerarse por tanto como un factor de virulencia de la bacteria. Se ha observado una actividad opsonizante en los sueros de niños que están recuperándose de otitis media.

Los antígenos seleccionados como diana por estas respuestas inmunitarias diferentes en seres humanos no se han identificado, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya expresión está regulada por el hierro, y que se reconoce por los sueros de pacientes con neumonía (Sethi, S, et al. (1995) Infect. Immun. 63:1516), y de UspA1 y UspA2 (Chen D. et al. (1999), Infect. Immun. 67:1310).

Otras pocas proteínas de membrana presentes en la superficie de M. catarrhalis se han caracterizado usando un procedimiento bioquímico, o por su posible implicación en la inducción de una inmunidad protectora (para revisión, véase Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). El documento US 5.725.862 describe composiciones que comprenden una proteína de membrana externa "CD". En un modelo de neumonía de ratón, la presencia de anticuerpos producidos contra algunos de ellos (UspA, CopB) favorece un aclaramiento más rápido de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) está altamente conservado entre las cepas de M. catarrhalis, y presenta homologías con una porina Pseudomonas aeruginosa, que ha demostrado ser eficaz contra esta bacteria en modelos animales.

El documento WO00/78968 describe las secuencias genómicas de una biblioteca de moléculas de ácido nucleico purificadas que comprenden el genoma de Moraxella catarrhalis.

La frecuencia de las infecciones por Moraxella catarrhalis ha aumentado drásticamente en las últimas décadas. Esto se ha atribuido a la aparición de cepas multirresistentes a antibióticos y una población creciente de gente con sistemas inmunitarios debilitados. Ya no es poco común aislar cepas de Moraxella catarrhalis que son resistentes a algunos o todos los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha creado una demanda y necesidad médica no satisfecha de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos, y pruebas diagnósticas para este microorganismo.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a BASB119, en particular a polipéptidos BASB119 y polinucleótidos BASB119, a materiales recombinantes y a procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo la prevención y el tratamiento de enfermedades microbianas, entre otras. En otro aspecto, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para detectar enfermedades asociadas a infecciones microbianas y estados asociados a tales infecciones, tales como ensayos para detectar la expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB119.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB119 tal como se describe con mayor detalle a continuación. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos de BASB119 de Moraxella catarrhalis, que no está relacionada mediante homología de secuencias de aminoácidos con ninguna de las secuencias de proteína conocidas. Se predice que es una lipoproteína porque tiene una secuencia señal característica de lipoproteína. La invención se refiere especialmente a BASB119 que tiene las secuencias de aminoácidos y nucleótidos expuestas en la SEQ ID NO: 1 ó 3 y SEQ ID NO: 2 ó 4 respectivamente. Se entiende que las secuencias enumeradas en la lista de secuencias a continuación como "ADN" representan un ejemplo de un aspecto de la invención, ya que los expertos ordinarios reconocerán que tales secuencias pueden emplearse de manera útil en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Polipéptidos

En un aspecto de la invención se describen polipéptidos de Moraxella catarrhalis denominados en el presente documento "BASB119" y "polipéptidos BASB119" así como variantes biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles de los mismos, y composiciones que comprenden los mismos.

La presente invención se refiere además a:

(a): un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, lo más preferiblemente al menos el 97-99% o identidad exacta, con la de la SEQ ID NO: 2 ó 4;

(b): un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97-99% o identidad exacta con respecto a la SEQ ID NO: 1 ó 3 por toda la longitud de la SEQ ID NO: 1 ó 3 respectivamente; o

(c): un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97-99% o identidad exacta, con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó 4.

Los polipéptidos BASB119 proporcionados en la SEQ ID NO: 2 ó 4 son los polipéptidos BASB119 de la cepa de Moraxella catarrhalis Mc2931 (ATCC 43617).

La invención también se refiere a un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB119, es decir, una parte contigua del polipéptido BASB119 que tiene la misma o sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó 4; es decir, el fragmento (si es necesario cuando está acoplado a un vehículo) puede producir una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido BASB119. Un fragmento inmunogénico de este tipo puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB119 que carece de una secuencia líder N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un domino de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido el fragmento inmunogénico de BASB119 según la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, lo más preferiblemente al menos el 97-99% de identidad, con respecto a la de la SEQ ID NO: 2 ó 4 por toda la longitud de la SEQ ID NO: 2.

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Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma que parte pero la totalidad de cualquier secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. Tal como con los polipéptidos BASB119, los fragmentos pueden ser "independientes," o estar comprendidos dentro de un polipéptido de mayor tamaño del que forman una parte o región, lo más preferiblemente como una única región continua en un único polipéptido de mayor tamaño.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos con truncamiento que tienen una parte de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó 4 o de variantes de la misma, tal como una serie continua de residuos que incluye una secuencia de aminoácidos amino- y/o carboxilo-terminal. También se prefieren formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidas mediante o en una célula huésped. Se prefieren además fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que comprenden regiones de hélice alfa y que forman hélice alfa, regiones de lámina beta y que forman lámina beta, regiones de giro o que forman giro, regiones de espiral o que forman espiral, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa antipáticas, regiones beta antipáticas, regiones flexibles, regiones que forman superficie, regiones de unión a sustrato y regiones de índice antigénico alto.

Otros fragmentos preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó 4, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o delecionados de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó 4.

Los fragmentos de los polipéptidos de la invención puede emplearse para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente mediante síntesis de péptidos; por tanto, estos fragmentos pueden emplearse como productos intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención.

Se prefieren particularmente variantes en los que varios, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ó 1 aminoácidos están sustituidos, delecionados o añadidos en cualquier combinación.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos de la invención pueden estar en forma de la proteína "madura" o pueden ser parte de una proteína de mayor tamaño tal como un precursor o una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir otra secuencia de aminoácidos que contenga secuencias líder o secretoras, prosecuencias, secuencias que ayudan en la purificación tales como múltiples residuos de histidina, u otra secuencia para la estabilidad durante la producción recombinante. Además, también se considera la adición de secuencias de polinucleótidos o cola lipídica o polipéptidos exógenos para aumentar el potencial inmunogénico de la molécula final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión solubles modificadas mediante ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento de la misma, y diversas porciones de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como inmunoglobulina se prefiere la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgG1, en la que tiene lugar la fusión en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc puede eliminarse simplemente mediante la incorporación de una secuencia de rotura que puede romperse con el factor de coagulación sanguíneo Xa.

Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética, y al uso de los mismos para selección de fármacos, diagnóstico y tratamiento. Otro aspecto de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Los ejemplos de tecnología de proteínas de fusión pueden encontrarse en las solicitudes de patente internacional números WO94/29458 y WO94/22914.

Las proteínas pueden conjugarse químicamente, o expresarse como proteínas de fusión recombinantes permitiendo que se produzcan niveles aumentados en un sistema de expresión en comparación con proteína no fusionada. El componente de fusión puede ayudar a proporcionar epítopos T cooperadores (componente de fusión inmunológico), preferiblemente epítopos T cooperadores reconocidos por seres humanos, o ayudar a expresar la proteína (potenciador de la expresión) a rendimientos mayores que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente el componente de fusión será tanto un componente de fusión inmunológico como un componente potenciador de la expresión.

Los componentes de fusión incluyen proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus influenzae, NS1 (hemaglutinina). Otro componente de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferiblemente se usa la porción C-terminal de la molécula. Lyta se deriva de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa, amidasa LytA, (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) páginas 265-272}) una autolisina que degrada específicamente determinados enlaces en la estructura principal del peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad a la colina o a algunos análogos de la colina tales como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan CLytA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su extremo aminoterminal {Biotechnology: 10, (1992) páginas 795-798}. Es posible usar la porción de repetición de la molécula LytA encontrada en el extremo C-terminal empezando en el residuo 178, por ejemplo residuos 188-305.

La presente invención también se refiere a variantes de los polipéptidos mencionados anteriormente, es decir, polipéptidos que varían de los referentes por sustituciones de aminoácidos conservativas, mediante las cuales se sustituye un residuo por otro con características similares. Las sustituciones típicas de este tipo son entre Ala, Val, Leu y Ile; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos Lys y Arg; o residuos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse de cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos que se producen de manera natural aislados, polipéptidos producidos de manera recombinante, polipéptidos producidos sintéticamente o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar tales polipéptidos se entienden bien en la técnica.

Lo más preferido es que un polipéptido de la invención se derive de Moraxella catarrhalis, sin embargo, puede obtenerse preferiblemente de otros organismos del mismo género taxonómico. Un polipéptido de la invención también puede obtenerse, por ejemplo, de organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

La invención describe polinucleótidos que codifican polipéptidos BASB119, particularmente polinucleótidos que codifican el polipéptido en el presente documento denominado BASB119.

El polinucleótido preferentemente comprende una región que codifica polipéptidos BASB119 que comprenden una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: o 3 que incluye un gen de longitud completa, o una variante del mismo.

Los polinucleótidos BASB119 proporcionados en la SEQ ID NO: 1 ó 3 son los polinucleótidos BASB119 de la cepa de Moraxella catarrhalis Mc2931 (ATCC 43617).

Como otro aspecto de la invención se describen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB119, particularmente polipéptidos y polinucleótidos BASB119 de Moraxella catarrhalis, incluyendo, por ejemplo, ARN sin procesar, ARN de ribozima, ARNm, ADNc, ADN genómicos, ADN de banda Z. Otros aspectos de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles, y variantes de los mismos, y composiciones que comprenden los mismos.

Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, incluyendo al menos un gen de longitud completa, que codifica un polipéptido BASB119 que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ ID NO: 2 ó 4 y polinucleótidos relaciones estrechamente con la misma y variantes de los mismos.

La invención describe además un polipéptido BASB119 de Moraxella catarrhalis que comprende o está constituido por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó 4 o una variante de la misma.

Usando la información proporcionada en el presente documento, tal como una secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 ó 3, puede obtenerse un polinucleótido de la invención que codifica polipéptido BASB119 usando procedimientos de clonación y selección convencionales, tales como aquellos para clonar y secuenciar fragmentos de ADN cromosómico de bacterias usando células de Catlin de Moraxella catarrhalis como material de partida, seguido de la obtención de un clon de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia de polinucleótidos de la invención, tal como una secuencia de polinucleótidos indicada en la SEQ ID NO: 1 ó 3, se sondea normalmente una biblioteca de clones de ADN cromosómico de Moraxella catarrhalis de Catlin en E. coli o algún otro huésped adecuado con un oligonucleótido radiomarcado, preferiblemente un 17-mero o más largo, derivado de una secuencia parcial. Los clones que portan ADN idéntico al de la sonda pueden distinguirse entonces usando condiciones de hibridación estrictas. Secuenciando los clones individuales así identificados mediante hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir de la secuencia de polipéptidos o polinucleótidos inicial es posible entonces extender la secuencia de polinucleótidos en ambas direcciones para determinar una secuencia de genes de longitud completa. Convenientemente, tal secuenciación se realiza, por ejemplo, usando ADN bicatenario desnaturalizado preparado a partir de un clon de plásmido. Se describen técnicas adecuadas por Maniatis, T., Fritsch, E.F. y Sambrook et al.,
MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). (véase en particular Screening By Hybridization 1.90 y Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). La secuenciación directa de ADN genómico puede realizarse también para obtener una secuencia de genes de longitud completa. A modo ilustrativo de la invención, cada polinucleótido expuesto en la SEQ ID NO: 1 ó 3 se descubrió en una biblioteca de ADN derivada de Moraxella catarrhalis.

Además, cada secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID NO: 1 ó 3 contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de residuos de aminoácidos expuestos en la SEQ ID NO: 2 ó 4 con a un peso molecular deducido que puede calcularse usando valores de peso molecular de residuos de aminoácidos bien conocidos por los expertos en la técnica.

El polinucleótido de la SEQ ID NO: 1, entre el codón de iniciación en el nucleótido número 1 y el codón de finalización que comienza en el nucleótido número 514 de la SEQ ID NO: 1, codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2. El polinucleótido de SEQ ID NO: 3, entre el codón de iniciación en el nucleótido número 1 y el último codón que comienza en el nucleótido número 511 de la SEQ ID NO: 3, codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 4.

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En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende o está constituido por:

(a): una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97-99% o identidad exacta con respecto a la SEQ ID NO: 1 ó 3 por toda la longitud de la SEQ ID NO: 1 ó 3 respectivamente; o

(b): una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97-99% o el 100% exacto, con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó 4, por toda la longitud de la SEQ ID NO: 2 ó 4 respectivamente.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos de especies distintas de Moraxella catarrhalis, puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende las etapas de seleccionar una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación estrictas (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo de 45-65ºC y una concentración de SDS del 0,1% - 1%) con una sonda marcada o detectable constituida por o que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 ó 3 o un fragmento de la misma; y aislar un gen de longitud completa y/o clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótidos.

La invención describe una secuencia de polinucleótidos idéntica por toda su longitud a una secuencia codificante (marco de lectura abierto) en la SEQ ID NO: o 3. También se describe una secuencia codificante para un polipéptido maduro o un fragmento del mismo, por sí mismo así como una secuencia codificante para un polipéptido maduro o un fragmento en marco de lectura con otra secuencia codificante, tal como una secuencia que codifica una secuencia líder o secretora, una secuencia de pre-, o pro- o preproproteína. El polinucleótido de la invención puede contener también al menos una secuencia no codificante, incluyendo por ejemplo, pero sin limitarse a al menos una secuencia 5' y 3' no codificante, tal como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como señales de terminación dependientes de rho e independientes de rho), sitios de unión a ribosomas, secuencias Kozak, secuencias que estabilizan el ARNm, intrones y señales de poliadenilación. La secuencia de polinucleótidos puede comprender también otra secuencia codificante que codifica otros aminoácidos. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En determinados aspectos de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 86:821-824 (1989), o una etiqueta peptídica HA (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984), ambas de las cuales pueden ser útiles para purificar una secuencia de polipéptidos fusionada a ellas. Los polinucleótidos de la invención también incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas de manera natural que controlan la expresión génica.

La secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido BASB119 de la SEQ ID NO: 2 ó 4 puede ser idéntica a la secuencia que codifica el polipéptido contenida en los nucleótidos 1 a 513 de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia que codifica el polipéptido contenida en los nucleótidos 1 a 513 de la SEQ ID NO: 3 respectivamente. Como alternativa puede ser una secuencia, que como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2 ó 4.

La expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" tal como se usa en el presente documento abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido del BASB119 de Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 ó 4. La expresión también abarca polinucleótidos que incluyen una única región continua o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vector integrado, una secuencia de transposón integrado, o debido a corrección de ARN o reorganización de ADN genómico) junto con otras regiones, que también pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.

La invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos en el presente documento que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ ID NO: 2 ó 4. Pueden usarse fragmentos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para sintetizar los polinucleótidos de longitud completa de la invención.

Otros aspectos particularmente preferidos son polinucleótidos que codifican variantes de BASB119, que tienen la secuencia de aminoácidos de polipéptido BASB119 de la SEQ ID NO: 2 ó 4 en la que varios, unos pocos, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1 o ningún residuo de aminoácidos está sustituido, modificado, delecionado y/o añadido, en cualquier combinación. Se prefieren especialmente entre éstas las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB119.

Otros aspectos preferidos de la invención son polinucleótidos que son al menos idénticos al 85% por toda su longitud con respecto a un polinucleótido que codifica un polipéptido BASB119 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 ó 4, y polinucleótidos que son complementarios a tales polinucleótidos. Como alternativa, los más altamente preferidos son los polinucleótidos que comprenden una región que es al menos idéntica al 90% por toda su longitud con respecto a un polinucleótido que codifica un polipéptido BASB119 y polinucleótidos complementarios al mismo. A este respecto, los polinucleótidos al menos idénticos al 95% por toda su longitud al mismo se prefieren particularmente. Además, aquellos con al menos el 97% se prefieren altamente entre aquellos con al menos el 95%, y entre aquellos con al menos el 98% y se prefiere especialmente al menos el 99%, siendo lo más preferido al menos el 99%.

Los aspectos preferidos son polinucleótidos que codifican polipéptidos que conservan sustancialmente la misma actividad o función biológica que el polipéptido maduro codificado por un ADN de SEQ ID NO: 1 ó 3.

Según determinados aspectos preferidos de esta invención se proporcionan polinucleótidos que se hibridan, particularmente en condiciones estrictas, con secuencias de polinucleótidos BASB119, tal como aquellos polinucleótidos en la SEQ ID NO: 1 ó 3.

La invención se refiere además a polinucleótidos que se hibridan con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en el presente documento. A este respecto, la invención se refiere especialmente a polinucleótidos que se hibridan en condiciones estrictas con los polinucleótidos descritos en el presente documento. Tal como se usan en el presente documento, las expresiones "condiciones estrictas" y "condiciones de hibridación estrictas" significan que la hibridación sólo se produce si hay al menos el 95% y preferiblemente al menos el 97% de identidad entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación estrictas es la incubación durante la noche a 42ºC en una disolución que comprende: formamida al 50%, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x disolución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón triturado, desnaturalizado, seguido de lavar el soporte de hibridación en 0,1x SSC a aproximadamente 65ºC.

Las condiciones de hibridación y lavado se conocen bien y se muestran a modo de ejemplo en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularmente Capítulo 11 en él. La hibridación en disolución también puede usarse con la secuencia de polinucleótidos proporcionada por la invención.

La invención también proporciona un polinucleótido constituido por o que comprende una secuencia de polinucleótidos obtenida seleccionando una biblioteca apropiada que contiene el gen completo para una secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 ó 3 en condiciones de hibridación estrictas con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 ó 3 o un fragmento de la misma; y aislar dicha secuencia de polinucleótidos. Los fragmentos útiles para obtener un polinucleótido de este tipo incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores descritos completamente en otra parte en el presente documento.

Tal como se trata en otra parte en el presente documento con respecto a los ensayos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención, pueden usarse como una sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican BASB119 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que tienen una elevada identidad, particularmente elevada identidad de secuencia, con respecto al gen de BASB119. Tales sondas comprenderán generalmente al menos 15 residuos de nucleótido o pares de bases. Preferiblemente, tales sondas tendrán al menos 30 residuos de nucleótido o pares de bases y pueden tener al menos 50 residuos de nucleótido o pares de bases. Las sondas particularmente preferidas tendrán al menos 20 residuos de nucleótido o pares de bases y tendrán menos de 30 residuos de nucleótido o pares de bases.

Puede aislarse una región codificante de un gen de BASB119 mediante selección usando una secuencia de ADN proporcionada en la SEQ ID NO: 1 ó 3 para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Se usa entonces un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la invención para seleccionar una biblioteca de ADNc, ADN genómico o ARNm para determinar con qué elementos de la biblioteca se hibrida la sonda.

Hay varios procedimientos disponibles y bien conocidos para los expertos en la técnica para obtener ADN de longitud completa, o alargar ADN de longitud corta, por ejemplo aquellos basados en el procedimiento amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE, Rapid Amplification of cDNA ends) (véase, por ejemplo, Frohman, et al., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Las modificaciones recientes de la técnica, mostradas a modo de ejemplo mediante la tecnología Marathon^{TM} (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología Marathon^{TM}, se han preparado ADNc a partir de ARNm extraído de un tejido elegido y una secuencia "adaptadora" ligada sobre cada extremo. Se lleva entonces a cabo la amplificación de ácido nucleico (PCR) para amplificar el extremo 5' "que falta" del ADN usando una combinación de cebadores de oligonucleótidos específicos de gen y específicos de adaptador. Se repite entonces la reacción de PCR usando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para aparearse dentro del producto amplificado (normalmente un cebador específico de adaptador que se aparea además en 3' en la secuencia adaptadora y un cebador específico de gen que se aparea además en 5' en la secuencia génica seleccionada). Los productos de esta reacción pueden entonces analizarse mediante secuenciación de ADN y un ADN de longitud completa construido uniendo el producto directamente con el ADN existente para dar una secuencia completa, o bien llevando a cabo una PCR de longitud completa usando la nueva información de secuencia para el diseño del cebador 5'.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención pueden emplearse, por ejemplo, como materiales y reactivos de investigación para el descubrimiento de tratamientos de y diagnósticos para enfermedades, particularmente enfermedades humanas, tal como se trata además en el presente documento en relación a los ensayos de polinucleótidos.

Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos derivados de una secuencia de la SEQ ID NOS: 1 ó 3 pueden usarse en los procedimientos en el presente documento tal como se describe, pero preferiblemente para PCR, para determinar si se transcriben o no los polinucleótidos identificados en el presente documento en su totalidad o en parte en bacterias en tejido infectado. Se reconoce que tales secuencias tendrán también una utilidad en el diagnóstico del estadio de la infección y el tipo de infección que ha logrado el patógeno.

La invención se refiere también a polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más otros aminoácidos amino- o carboxilo-terminales, o aminoácidos dentro del polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena de polipéptidos, por ejemplo). Tales secuencias pueden desempeñar un papel en el procesamiento de una proteína de un precursor para dar una forma madura, pueden permitir el transporte de proteínas, pueden alargar o acortar la vida media de una proteína o pueden facilitar la manipulación de una proteína para un ensayo o producción, entre otras cosas. Tal como es generalmente el caso in vivo, los otros aminoácidos pueden eliminarse mediante procesamiento de la proteína madura mediante enzimas celulares.

Para cada uno y todos los polinucleótidos de la invención se proporciona un polinucleótido complementario a él. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean completamente complementarios a cada polinucleótido con el que son complementarios.

Una proteína precursora, que tiene una forma madura del polipéptido fusionada a una o más prosecuencias puede estar en una forma inactiva del polipéptido. Cuando se eliminan las prosecuencias generalmente se activan tales precursores inactivos. Algunas o todas las prosecuencias pueden eliminarse antes de la activación. Generalmente, tales precursores se denominan proproteínas.

Además de las representaciones A, G, C, T/U convencionales para los nucleótidos, el término "N" puede usarse también para describir determinados polinucleótidos de la invención. "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN puede aparecer en una posición designada de este tipo en la secuencia de ADN o ARN, excepto que se prefiere que N no sea un ácido nucleico que cuando se toma en combinación con posiciones de nucleótidos adyacentes, cuando se leen en el marco de lectura correcto, tendrían el efecto de generar un codón de terminación prematura en tal marco de lectura.

En resumen, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia líder (que puede denominarse preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que no son las secuencias líder de una preproteína, o una preproproteína, que es un precursor de una proproteína, que tiene una secuencia líder y una o más prosecuencias, que generalmente se eliminan durante las etapas de procesamiento que producen formas maduras y activas del polipéptido.

Según un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para fines terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización genética.

El uso de un polinucleótido de la invención en inmunización genética empleará preferiblemente un procedimiento de administración adecuado tal como inyección directa del ADN de plásmido en los músculos (Wolff et al., Hum Mol Genet (1992) 1:363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4:419), administración de ADN complejado con vehículos proteínas específicos (Wu et al., J Biol Chem.(1989) 264:16985), coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (Benvenisty & Reshef, PNAS USA, (1986) 83:9551), encapsulación de ADN en diversas formas de liposomas (Kaneda et al., Science (1989) 243:375), bombardeo de partículas (Tang et al., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol (1993) 12:791) e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger et al., PNAS USA (1984) 81:5849).

Vectores, células huésped, sistemas de expresión

La invención también se refiere a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, células huésped que están modificadas mediante ingeniería genética con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir tales proteínas usando ARN derivados de los constructos de ADN de la invención.

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica a partir de células huésped modificadas mediante ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células huésped que están modificadas mediante ingeniería genética con tales sistemas de expresión, y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, las células huésped pueden modificarse mediante ingeniería genética para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido en la célula huésped puede efectuarse mediante procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2º ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), tales como, transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, carga de raspaduras, introducción balística e infección.

Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, estreptomices, cianobacterias, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis; células fúngicas, tales como células de una levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, un basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células de melanoma de Bowes; y células vegetales, tales como células de una gimnosperma o angiosperma.

Puede usarse una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Tales vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de cromosoma, epitoma o virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófago, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, virus papova, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruelas en aves, virus de la pseudorrabia, virus picorna, retrovirus, y alfavirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de elementos genéticos de bacteriófago o de plásmido, tales como cósmidos y fagémidos. Los constructos de sistema de expresión pueden contener regiones control que regulan así como producen la expresión. Generalmente, puede usarse cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido en un huésped para la expresión a este respecto. La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el sistema de expresión mediante cualquiera de una variedad de técnicas rutinarias y bien conocidas, tales como, por ejemplo, aquellas expuestas en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (citado anteriormente).

En sistemas de expresión recombinantes en eucariotas, pueden incorporarse para la secreción de una proteína traducida en la luz del retículo endoplasmático, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la presente invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos bien conocidos que incluyen precipitación con etanol o sulfato de amonio, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxilapatita y cromatografía con lectina. Lo más preferiblemente, se emplea la cromatografía de afinidad con iones metálicos (IMAC) para la purificación. Pueden emplearse técnicas bien conocidas para replegar proteínas para regenerar la conformación activa cuando se desnaturaliza el polipéptido durante la síntesis intracelular, aislamiento y/o purificación.

El sistema de expresión puede ser también un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o una bacteria. El gen de interés puede insertarse en el genoma de una bacteria o virus recombinante vivo. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo conducirá a la expresión in vivo del antígeno y la inducción de respuestas inmunitarias. Los virus y bacterias usados para este fin son por ejemplo: virus de la viruela (por ejemplo; vaccinia, viruela de las aves, viruela del canario), alfavirus (virus Sindbis, virus Semliki Forest, virus de la encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus adenoasociados, virus picorna (virus de la polio, virus del resfriado común), virus de la herpes (virus varicella zóster, etc), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Estos virus o bacterias pueden ser virulentos, estar atenuados en diversas maneras con el fin de obtener vacunas vivas. Tales vacunas vivas también forman parte de la invención.

Ensayos diagnósticos, pronósticos, de serotipificación y de mutación

Esta invención se refiere también al uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB119 de la invención para su uso como reactivos diagnósticos. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB119 en un eucariota, particularmente un mamífero, y especialmente un ser humano, proporcionará un procedimiento diagnóstico para el diagnóstico de la enfermedad, estadificación de la enfermedad o respuesta de un organismo infeccioso a los fármacos. Los eucariotas, particularmente los mamíferos, y especialmente los seres humanos, particularmente aquellos infectados o que se sospecha que están infectados por un organismo que comprende la proteína o gen de BASB119, puede detectarse a nivel de ácido nucleico o aminoácido mediante una variedad de técnicas bien conocidas así como mediante procedimientos proporcionados en el presente documento.

Los polipéptidos y polinucleótidos para el pronóstico, diagnóstico u otros análisis pueden obtenerse a partir de materiales corporales de un individuo infectado y/o supuestamente infectado. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente ADN o ARN, pueden usarse directamente para la detección o puede amplificarse enzimáticamente usando PCR o cualquier otra técnica de amplificación antes del análisis. El ARN, particularmente ARNm, ADNc y ADN genómico pueden usarse también de las mismas maneras. Usando la amplificación, puede realizarse la caracterización de las especies y cepas de organismo infeccioso o residente presente en un individuo, mediante un análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Las deleciones e inserciones pueden detectase mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada de un organismo relacionado, preferiblemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Las mutaciones puntuales pueden identificarse hibridando ADN amplificado con secuencias de polinucleótido BASB119 marcadas. Las secuencias que coinciden perfecta o significativamente pueden distinguirse de dúplex que coinciden de forma errónea imperfecta o más significativamente mediante digestión con ADNasa o ARNasa, para ADN o ARN respectivamente, o detectando diferencias en las temperaturas de fusión o la cinéticas de renaturalización. También pueden detectarse las diferencias en las secuencias de polinucleótidos mediante alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de polinucleótido en geles en comparación con una secuencia de referencia. Esto puede llevarse a cabo con o sin agentes desnaturalizantes. Las diferencias de polinucleótido pueden detectarse también mediante secuenciación de ADN o ARN directa. Véase, por ejemplo, Myers et al., Science, 230:1242 (1985). Los cambios de secuencia en ubicaciones específicas pueden revelarse también mediante ensayos de protección de nucleasa, tales como ensayo de protección de ARNasa, V1 y S 1 o un procedimiento de rotura química. Véase, por ejemplo, Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:4397-4401 (1985).

En otro aspecto, puede construirse una red de sondas de oligonucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos BASB119 o fragmentos de los mismos para efectuar una selección eficaz de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación taxonómica o identificación. Los procedimientos de tecnología de red son bien conocidos y tienen aplicabilidad general y pueden usarse para tratar una variedad de preguntas en genética molecular incluyendo la expresión génica, ligamiento genético, y variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee et al., Science. 274:610 (1996)).

Por tanto en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:

(a): un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 ó 3, o un fragmento de la misma;

(b): una secuencia de nucleótidos complementaria a la de (a);

(c): un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de SEQ ID NO: 2 ó 4 o un fragmento de la misma; o

(d): un anticuerpo frente a un polipéptido de la presente invención, preferiblemente frente al polipéptido de la SEQ ID NO: 2 ó 4.

Se apreciará que en cualquier kit de este tipo, (a), (b), (c) o (d) pueden comprender un componente sustancial. Un kit de este tipo será de utilidad para diagnosticar una enfermedad o la susceptibilidad a una enfermedad, entre otros.

Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos diagnósticos. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferiblemente SEQ ID NO: 1 ó 3, que está asociada a una enfermedad o patogenicidad proporcionará una herramienta diagnóstica que puede contribuir a, o definir, un diagnóstico de una enfermedad, un pronóstico de una evolución de la enfermedad, una determinación de un estadio de la enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad, que resulta de la subexpresión, sobreexpresión o expresión alterada del polinucleótido. Los organismos, particularmente los organismos infecciosos, que portan mutaciones en tal polinucleótido pueden detectarse a nivel de polinucleótido mediante una variedad de técnicas, tales como las descritas en otra parte en el presente documento.

Las células de un organismo que porta mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención pueden detectarse también a nivel de polinucleótido o polipéptido mediante una variedad de técnicas, para permitir una serotipificación, por ejemplo. Por ejemplo, puede usarse RT-PCR para detectar mutaciones en el ARN. Se prefiere particularmente usar RT-PCR junto con sistemas de detección automatizados, tales como, por ejemplo, GeneScan. El ARN, ADNc o ADN genómico pueden usarse también para el mismo fin, PCR. Como ejemplo, pueden usarse cebadores de PCR complementarios a un polinucleótido que codifica un polipéptido BASB119 para identificar y analizar mutaciones.

La invención describe además cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o el 3'. Estos cebadores pueden usarse para, entre otras cosas, amplificar ADN y/o ARN de BASB119 aislado de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal. Los cebadores pueden usarse para amplificar un polinucleótido aislado de un individuo infectado, de tal modo que el polinucleótido puede someterse entonces a diversas técnicas para aclarar la secuencia de polinucleótidos. De esta manera, pueden detectarse las mutaciones en la secuencia de polinucleótidos y usarse para diagnosticar y/o pronosticar la infección o su estadio o evolución, o para serotipificar y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención se refiere además a un procedimiento para diagnosticar una enfermedad, preferiblemente infecciones bacterianas, más preferiblemente infecciones provocadas por Moraxella catarrhalis, que comprende determinar a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal, un nivel aumentado de expresión de polinucleótido que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 1 ó 3. El aumento o la disminución en la expresión de un polinucleótido BASB119 puede medirse usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT-PCR, protección de ARNasa, inmunotransferencia de tipo Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.

Además, puede usarse un ensayo diagnóstico según la invención para detectar la sobreexpresión de polipéptido BASB119 en comparación con muestras de tejido control normales para detectar la presencia de una infección, por ejemplo. Las técnicas de ensayo que pueden usarse para determinar los niveles de un polipéptido BASB119, en una muestra derivada de un huésped, tal como un material corporal, se conocen bien por los expertos en la técnica. Tales procedimientos de ensayo incluyen radioinmunoanálisis, ensayos de unión competitiva, análisis de inmunotransferencia de tipo Western, ensayos de intercalación de anticuerpos, detección de anticuerpos y ensayos de ELISA.

Los polinucleótidos de la invención pueden usarse como componentes de matrices de polinucleótidos, preferiblemente redes o matrices de alta densidad. Estas matrices de alta densidad son particularmente útiles para fines diagnósticos y pronósticos. Por ejemplo, puede usarse un conjunto de puntos comprendiendo cada uno un gen diferente, y comprendiendo además un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, para sondear, tal como usar hibridación o amplificación de ácido nucleico, usar una sonda obtenida de o derivada de una muestra corporal, para determinar la presencia de una secuencia de polinucleótidos particular o secuencia relacionada en un individuo. Una presencia de este tipo puede indicar la presencia de un patógeno, particularmente Moraxella catarrhalis, y puede ser útil para diagnosticar y/o pronosticar una enfermedad o una evolución de una enfermedad. Se prefiere una red que comprende varias variantes de la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1 ó 3. También se prefiere una que comprende varias variantes de una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 2 ó 4.

Anticuerpos

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención o variantes de los mismos, o células que expresan los mismos pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para tales polipéptidos o polinucleótidos respectivamente. El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen sustancialmente una mayor afinidad por los polipéptidos de la invención que su afinidad para otros polipéptidos relacionados en la técnica anterior.

En determinados aspectos preferidos de la invención se describen anticuerpos contra polipéptidos o polinucleótidos BASB119.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención pueden obtenerse administrando los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos que portan epítopo de cualquiera o ambos, análogos de cualquiera o ambos, o células que expresan cualquiera o ambos, a un animal, preferiblemente uno distinto del ser humano, usando protocolos de rutina. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica conocida en la técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, tales como aquellas en Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., págs. 77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente estadounidense nº 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla contra los polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. Además, pueden usarse ratones transgénicos u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos para los polipéptidos o polinucleótidos de la invención.

Como alternativa, puede utilizarse tecnología de exposición en fago para seleccionar genes de anticuerpo con actividades de unión a un polipéptido de la invención desde repertorios de genes v amplificados mediante PCR de linfocitos de seres humanos seleccionados por tener anti-BASB119 o bien de bibliotecas vírgenes (McCafferty, et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos puede mejorarse también mediante, por ejemplo, transposición de cadena (Clackson et al., (1991) Nature 352:628).

Los anticuerpos descritos anteriormente pueden emplearse para aislar o para identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad.

Por tanto, entre otros, pueden emplearse los anticuerpos contra polipéptido BASB119 o polinucleótido BASB119 para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.

Las variantes de polipéptido incluyen variantes antigénica, epitópica o inmunológicamente equivalentes de un aspecto particular de esta invención.

Preferiblemente, el anticuerpo o la variante del mismo se modifica para hacerlo menos inmunogénico en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es humano el anticuerpo puede estar lo más preferiblemente "humanizado", cuando la región o regiones que determinan complementariedad del anticuerpo derivado de hibridoma se ha trasplantado a un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo tal como se describe en Jones et al. (1986), Nature 321, 522-525 o Tempest et al., (1991) Biotechnology 9, 266-273.

Antagonistas y agonistas - Ensayos y moléculas

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden usarse también para evaluar la unión de ligandos y sustratos de molécula pequeña en, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales o pueden ser miméticos estructurales o funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2): capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de selección pueden medir simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o a células o membranas que portan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión del polipéptido por medio de una marca asociada directa o indirectamente con el compuesto candidato. Como alternativa, el método de selección puede suponer la competición con un competidor marcado. Además, estos procedimientos de selección pueden someter a prueba si el compuesto candidato da como resultado una señal generada mediante activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para las células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Los inhibidores de activación se someten a ensayo generalmente en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación mediante el agonista por la presencia del compuesto candidato. Puede emplearse el polipéptido constitutivamente activo y/o los polipéptidos y polinucleótidos expresados constitutivamente en procedimientos de selección para inhibidores o agonistas inversos, en ausencia de un inhibidor o agonista, sometiendo a prueba si el compuesto candidato da como resultado la inhibición de la activación del polipéptido o polinucleótido, tal como puede ser el caso. Además, los procedimientos de selección pueden comprender simplemente las etapas de mezclar un compuesto candidato con una disolución que contiene un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, para formar una mezcla, medir la actividad de polipéptido y/o polinucleótido BASB119 en la mezcla, y comparar la actividad de polipéptido y/o polinucleótido BASB119 de la mezcla con un patrón. Las proteínas de fusión, tales como aquellas preparadas a partir de la porción Fc y el polipéptido BASB119, tal como se describió anteriormente en el presente documento, pueden usarse también para ensayos de selección de alto rendimiento, para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como de polipéptidos filogenética y/o funcionalmente relacionados (véase D. Bennett et al., J Mol Recognition, 8:52-58 (1995); y K. Johanson et al., J Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995)).

Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a y/o interaccionan con un polipéptido de la presente invención pueden usarse también para configurar procedimientos de selección para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de ARNm y/o polipéptido en células. Por ejemplo, puede construirse un ensayo de ELISA para medir niveles asociados a célula o secretados de polipéptido usando anticuerpos monoclonales y policlonales mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Esto puede usarse para descubrir agentes que pueden inhibir o aumentar la producción de polipéptido (también denominados antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o tejidos manipulados de manera adecuada.

La invención también se refiere a un procedimiento de selección de compuestos para identificar aquellos que potencian (agonistas) o bloquean (antagonistas) la acción de polipéptidos o polinucleótidos BASB119, particularmente aquellos compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de selección puede suponer técnicas de alto rendimiento. Por ejemplo, para detectar agonistas o antagonistas, se incuba una mezcla de reacción sintética, un compartimento celular, tal como una membrana, envuelta celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de ellos, que comprende polipéptido BASB119 y un ligando o sustrato marcado de tal polipéptido en ausencia o presencia de una molécula candidata que puede ser un agonista o antagonista de BASB119. La capacidad de la molécula candidata para agonizar o antagonizar el polipéptido BASB119 se refleja en la disminución en la unión del ligando marcado o la disminución en la producción del producto a partir de tal sustrato. Las moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido BASB119 es lo más probable que sean buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien y, tal como puede ser el caso, aumentan la tasa de producción de producto a partir de sustrato, aumentan la transducción de señales o aumentan la actividad de canal químico con agonistas. La detección de la tasa o el nivel de, tal como puede ser el caso, producción de producto a partir de sustrato, transducción de señales o actividad de canal químico puede potenciarse usando un sistema indicador. Los sistemas indicadores que pueden ser útiles a este respecto incluyen pero no se limitan a sustrato marcado, colorimétrico, convertido en producto, un gen indicador que responde a los cambios en la actividad de polinucleótido o polipéptido BASB119, y ensayos de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de un ensayo para agonistas de BASB119 es un ensayo competitivo que combina BASB119 y un agonista potencial con moléculas que se unen a BASB119, moléculas que se unen a BASB119 recombinantes, ligandos o sustratos naturales, o miméticos de ligando o sustrato, en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. El BASB119 puede marcarse, tal como mediante radioactividad o un compuesto colorimétrico, de modo que el número de moléculas de BASB119 unidas a la molécula que se une o convertidas en producto puede determinarse de manera precisa para evaluar la eficacia del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen, entre otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la invención y de este modo inhiben o extinguen su actividad o expresión. También pueden ser antagonistas potenciales moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como un anticuerpo o proteína relacionada estrechamente que se une a los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir actividades inducidas por BASB119, evitando de este modo la acción o expresión de polipéptidos y/o polinucleótidos BASB119 excluyendo los polipéptidos y/o polinucleótidos BASB119 de la unión.

Los antagonistas potenciales incluyen una molécula pequeña que se une a y ocupa el sitio de unión del polipéptido evitando de este modo la unión a moléculas de unión celular, de modo que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen pero no se limitan a moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o moléculas similares a péptidos. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido (véase Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionado con y variantes de BASB119.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a proteínas de fusión solubles modificadas mediante ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento de la misma, y diversas porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgG1, en la que tiene lugar la fusión en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc puede eliminarse simplemente mediante la incorporación de una secuencia de rotura que puede romperse con factor de coagulación sanguíneo Xa. Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética, y al uso de las mismas para la selección de fármacos, diagnóstico y tratamiento. Otro aspecto de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Los ejemplos de tecnología de proteína de fusión pueden encontrarse en las solicitudes de patente internacional números WO94/29458 y WO94/22914.

Cada una de las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en el presente documento puede usarse en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, tras la expresión, puede usarse como una diana para la selección de fármacos antibacterianos. Adicionalmente, las secuencias de polinucleótidos que codifican las regiones aminoterminales de la proteína codificada o Shine-Delgarno u otras secuencias que facilitan la traducción del ARNm respectivo pueden usarse para construir secuencias antisentido para controlar la expresión de la secuencia codificante de interés.

La invención también se refiere al uso del polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención para interferir en la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un huésped eucariota, preferiblemente mamífero, responsable de las secuelas de la infección. En particular, las moléculas de la invención pueden usarse: en la prevención de la adhesión de bacterias, en particular bacterias Gram positivas y/o Gram negativas, a proteínas de matriz extracelular eucariotas, preferiblemente de mamífero, en dispositivos permanentes o proteínas de matriz extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de matriz extracelular eucariotas, preferiblemente de mamífero, y proteínas BASB119 bacterianas que median en el daño tisular y/o; para bloquear la progresión de la patogénesis en infecciones iniciadas por otro distinto del implante de dispositivos permanentes o mediante otras técnicas quirúrgicas.

Según todavía otro aspecto de la invención, se describen agonistas y antagonistas de BASB119, preferiblemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.

Los antagonistas y agonistas pueden emplearse, por ejemplo, para prevenir, inhibir y/o tratar enfermedades.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a mimótopos del polipéptido de la invención. Un mimótopo es una secuencia de péptidos, suficientemente similar al péptido nativo (secuencial o estructuralmente), que puede reconocerse por anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o puede producir anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando está acoplado a un vehículo adecuado.

Los mimótopos peptídicos pueden diseñarse para un fin particular mediante adición, deleción o sustitución de aminoácidos elegidos. Por tanto, los péptidos pueden modificarse para los fines de facilitar la conjugación a un vehículo proteico. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de conjugación química incluir una cisteína terminal. Además puede ser deseable que los péptidos conjugados a un vehículo proteico incluyan un extremo terminal hidrófobo distal con respecto al extremo terminal conjugado del péptido, de modo que el extremo no conjugado libre del péptido permanece asociado a la superficie de la proteína vehículo. Presentando de este modo el péptido en una conformación que se asemeja de la manera más próxima a la del péptido tal como se encuentra en el contexto de la molécula nativa completa. Por ejemplo, los péptidos pueden alterarse para que tengan una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrófoba C-terminal. Como alternativa, la adición o substitución de una forma D-estereoisómera de uno o más de los aminoácidos puede realizarse para crear un derivado beneficioso, por ejemplo para potenciar la estabilidad del péptido.

Como alternativa, los mimótopos peptídicos pueden identificarse usando anticuerpos que pueden por sí mismos unirse a los polipéptidos de la presente invención usando técnicas tales como tecnología de exposición en fago (documento EP 0 552 267 B1). Esta técnica genera un gran número de secuencias peptídicas que imitan la estructura de los péptidos nativos y pueden, por tanto, unirse a anticuerpos peptídicos anti-nativos, pero no necesariamente comparten por sí mismos una homología de secuencia significativa con el polipéptido nativo.

Vacunas

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente seres humanos, que comprende inocular el individuo con polinucleótido y/o polipéptido BASB119, o un fragmento o variante del mismo, adecuado para producir una respuesta inmunitaria de células T y/o antígeno para proteger dicho individuo de una infección, particularmente infección bacteriana y lo más particularmente infección por Moraxella catarrhalis. También se proporcionan procedimientos mediante los cuales tal respuesta inmunológica ralentiza la replicación bacteriana. Todavía otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de inducción de la respuesta inmunológica en un individuo que comprende administrar a tal individuo un vector de ácido nucleico, secuencia o ribozima para dirigir la expresión de polinucleótido y/o polipéptido BASB119, o un fragmento o una variante del mismo, para expresar polinucleótido y/o polipéptido BASB119, o un fragmento o una variante del mismo in vivo con el fin de inducir una respuesta inmunológica, tal como, para producir una respuesta inmunitaria de células T y/o anticuerpo, incluyendo, por ejemplo, células T que producen citocina o células T citotóxicas, para proteger dicho individuo, preferiblemente un ser humano, de una enfermedad, tanto si esta enfermedad está ya establecida en el individuo como si no. Un ejemplo de administrar el gen es acelerándolo en las células deseadas como un revestimiento sobre partículas o de otra manera. Tal vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, un ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido de ADN/ARN, un complejo de ADN-proteína o un complejo de ARN-proteína.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferiblemente un ser humano, que puede tener inducida dentro de sí una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en tal individuo frente a un polinucleótido y/o polipéptido BASB119 codificado a partir del mismo, en la que la composición comprende un polinucleótido y/o polipéptido BASB119 recombinante codificado a partir del mismo y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido, polipéptido BASB119 codificado a partir del mismo, u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica puede usarse terapéutica o profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad de anticuerpo y/o inmunidad celular, tal como inmunidad celular que procede de células CTL o CD4+T.

Un polipéptido BASB119 o un fragmento del mismo puede estar fusionado con una coproteína o resto químico que producir o no por sí mismo anticuerpos, pero que puede estabilizar la primera proteína y producir una proteína fusionada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferiblemente propiedades protectoras. La proteína recombinantes así fusionada, comprende además preferiblemente una coproteína antigénica, tal como lipoproteína D de Haemophilus influenzae, glutatión-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína relativamente grande que solubiliza la proteína y facilita la producción y purificación de la misma. Más aún, la coproteína puede actuar como adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmunitario del organismo que recibe la proteína. La coproteína puede estar unida al extremo aminoterminal o bien carboxi-terminal de la primera proteína.

En una composición de vacuna según la invención, un polipéptido y/o polinucleótido BASB119, o un fragmento, o un mimótopo, o una variante del mismo puede estar presente en un vector, tal como los vectores recombinantes vivos descritos anteriormente, por ejemplo, vectores bacterianos vivos.

También son adecuados vectores no vivos para el polipéptido BASB119, por ejemplo vesículas de membrana externa bacterianas o "ampollas". Las ampollas ME se derivan de la membrana externa de la membrana de dos capas de bacterias Gram negativas y se han documentado en muchas bacterias Gram negativas (Zhou, L et al. 1998. FEMS Microbiol. Lett. 163:223-228) incluyendo C. trachomatis y C. psittaci. Una lista no exhaustiva de patógenos bacterianos que se ha notificado que producen ampollas también incluye: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolitica.

Las ampollas tienen la ventaja de proporcionar proteínas de membrana externa en su conformación nativa y son por tanto particularmente útiles para vacunas. Las ampollas también pueden mejorarse para su uso para vacunas modificando mediante ingeniería la bacteria para modificar la expresión de una o más moléculas en la membrana externa. Así por ejemplo la expresión de una proteína inmunogénica deseada en la membrana externa, tal como el polipéptido BASB119, puede introducirse o regularse por incremento (por ejemplo alterando el promotor). En lugar de o además, la expresión de moléculas de la membrana externa que no son relevantes (por ejemplo antígenos no protectores o proteínas inmunodominantes pero variables) o bien perjudiciales (por ejemplo moléculas tóxicas tales como LPS, o inductores potenciales de una respuesta autoinmunitaria) pueden regularse por disminución. Estos enfoques se tratan con más detalle a continuación.

Las regiones flanqueantes no codificantes del gen de BASB119 contienen elementos reguladores importantes para la expresión del gen. Esta regulación tiene lugar tanto a nivel transcripcional como traduccional. La secuencia de estas regiones, en el sentido 5' o bien en el sentido 3' del marco de lectura abierto del gen, puede obtenerse mediante secuenciación de ADN. Esta información de secuencia permite la determinación de motivos reguladores potenciales tales como los elementos de promotor diferentes, secuencias de terminación, elementos de secuencia inducibles, represores, elementos responsables de la variación de fase, la secuencia shine-dalgarno, regiones con estructura secundaria potencial implicada en la regulación, así como otros tipos de secuencias o motivos reguladores. Esta secuencia es otro aspecto de la invención.

Esta información de secuencia permite la modulación de la expresión natural del gen de BASB119. La regulación por incremento de la expresión génica puede efectuarse alterando el promotor, la secuencia shine-dalgarno, el represor potencial o elementos de operador, o cualquier otro elemento implicado. Igualmente, la regulación por disminución de la expresión puede conseguirse mediante tipos de modificación similares. Como alternativa, cambiando las secuencias de variación de fase, puede ponerse la expresión del gen bajo el control de la variación de fase, o puede desacoplarse de esta regulación. En otro enfoque, la expresión del gen puede ponerse bajo el control de uno o más elementos inducibles permitiendo una expresión regulada. Los ejemplos de tal regulación incluyen, pero no se limitan a, inducción mediante desplazamiento de la temperatura, adición de sustratos inductores tales como hidratos de carbono seleccionados o sus derivados, elementos traza, vitaminas, cofactores, iones metálicos, etc.

Tales modificaciones descritas anteriormente pueden introducirse mediante varios medios diferentes. La modificación de las secuencias implicadas en la expresión génica puede llevarse a cabo in vivo mediante mutagénesis al azar seleccionando el fenotipo deseado. Otro enfoque consiste en aislar la región de interés y modificarla mediante mutagénesis al azar, o mutagénesis por deleción, inserción o sustitución dirigida al sitio. La región modificada puede volverse a introducir entonces en el genoma bacteriano mediante recombinación homóloga, y puede evaluarse el efecto sobre la expresión del gen. En otro enfoque, puede usarse el conocimiento de la secuencia de la región de interés para sustituir o delecionar toda o parte de las secuencias reguladoras naturales. En este caso, la región reguladora seleccionada como objetivo se aísla y modifica de modo que contenga los elementos reguladores de otro gen, una combinación de elementos reguladores de diferentes genes, una región reguladora sintética, o cualquier otra región reguladora, o para delecionar partes seleccionadas de las secuencias reguladoras de tipo natural. Estas secuencias modificadas pueden volverse a introducir en la bacteria por recombinación homóloga en el genoma. Una lista no exhaustiva de promotores preferidos que podrían usarse para la regulación por incremento de la expresión génica incluye los promotores porA, porB, lbpB, tbpB, p110, 1st, hpuAB de N. meningitidis o N. gonorroheae; ompCD, copB, lbpb, ompE, UspA1; UspA2; TbpB de M. catarrhalis: p1, p2, p4, p5, p6, lpD, tbpB, D15, Hia, Hmw1, Hmw2 de H. influenzae.

En un ejemplo, puede modularse la expresión del gen intercambiando su promotor por un promotor más fuerte (a través del aislamiento de la secuencia hacia arriba' del gen, modificación in vitro de esta secuencia, y reintroducción en el genoma mediante recombinación homóloga). Puede obtenerse expresión regulada por incremento tanto en la bacteria así como en las vesículas de la membrana externa liberadas (o producidas) a partir de la bacteria.

En otros ejemplos, los enfoques descritos pueden usarse para generar cepas bacterianas recombinantes con características mejoradas para aplicaciones de vacuna. Éstas pueden ser, pero no se limitan a, cepas atenuadas, cepas con expresión aumentada de antígenos seleccionados, cepas con desactivaciones (o expresión reducida) de genes que interfieren con la respuesta inmunitaria, cepas con expresión modulada de proteínas inmunodominantes, cepas con liberación modulada de vesículas de la membrana externa.

Por tanto, la invención también proporciona una región modificada del gen de BASB 119, conteniendo la región hacia arriba modificada un elemento regulador heterólogo que altera el nivel de expresión de la proteína BASB 119 ubicada en la membrana externa. La región hacia arriba según este aspecto de la invención incluye la secuencia hacia arriba del gen de BASB119. La región hacia arriba comienza inmediatamente hacia arriba del gen de BASB 119 y continúa normalmente hasta una posición a no más de aproximadamente 1000 pb hacia arriba del gen del codón de inicio ATG. En el caso de un gen ubicado en una secuencia policistrónica (operón), la región hacia arriba puede comenzar precediendo inmediatamente al gen de interés, o precediendo al primer gen en el operón. Preferiblemente, una región hacia arriba modificada según este aspecto de la invención contiene un promotor heterólogo en una posición entre 500 y 700 pb hacia arriba del ATG.

Por tanto, la invención proporciona un polipéptido BASB 119, en una vesícula bacteriana modificada. La invención proporciona además células huésped modificadas que pueden producir los vectores de vesículas basados en membranas no vivos. La invención proporciona además vectores de ácido nucleico que comprenden el gen de BASB119 que tiene una región hacia arriba modificada que contiene un elemento regulador heterólogo.

La invención proporciona además procedimientos para preparar las células huésped y las vesículas bacterianas según la invención.

La invención también proporciona composiciones, particularmente composiciones de vacuna, y procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de ADN inmunoestimuladoras, tales como las descritas en Sato, Y. et al. Science 273:352 (1996).

También, esta invención proporciona procedimientos que usan el polinucleótido descrito o fragmentos particulares del mismo, que se ha mostrado que codifican regiones no variables de proteínas de la superficie celular bacteriana, en constructos de polinucleótido usados en tales experimentos de inmunización genética en modelos animales de infección con Moraxella catarrhalis. Tales experimentos serán particularmente útiles para identificar epítopos proteicos que pueden provocar una respuesta inmunitaria profiláctica o terapéutica. Se cree que este enfoque permitirá la preparación posterior de anticuerpos monoclonales de valor particular, derivados del órgano requerido del animal que resiste o elimina de manera satisfactoria la infección, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de la infección bacteriana, particularmente infección por Moraxella catarrhalis, en mamíferos, particularmente seres humanos.

La invención también incluye una formulación de vacuna que comprende un polipéptido y/o polinucleótido inmunogénico recombinante de la invención junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ya que los polipéptidos y polinucleótidos pueden descomponerse en el estómago, cada uno se administra preferiblemente por vía parenteral, incluyendo, por ejemplo, la administración que es subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen disoluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que convierten la formulación en isotónica con el fluido corporal, preferiblemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o múltiples dosis, por ejemplo, viales y ampollas selladas y pueden almacenarse en un estado liofilizado que requiere sólo la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su uso.

La formulación de vacuna de la invención puede incluir también sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente el sistema adyuvante produce preferentemente un tipo de respuesta TH1.

Una respuesta inmunitaria puede distinguirse ampliamente en dos categorías extremas, siendo una respuesta inmunitaria humoral o mediada por células (caracterizadas tradicionalmente por mecanismos efectores de protección de anticuerpo y celulares respectivamente). Estas categorías de respuesta se han denominado respuestas inmunitarias tipo TH1 (respuesta mediada por células), y tipo TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunitarias tipo TH1 extremas puede caracterizarse por la generación de respuestas específicas de antígeno, de linfocitos T citotóxicos restringidos a haplotipo y de linfocitos citolíticos naturales. En ratones, las respuestas tipo TH1 se caracterizan con frecuencia por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en el ser humano estos corresponden a los anticuerpos tipo IgG 1. Las respuestas inmunitarias tipo TH2 se caracterizan por la generación de un amplio intervalo de isotipos de inmunoglobulina incluyendo en ratones IgG1, IgA e IgM.

Puede considerarse que la fuerza impulsora detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuesta inmunitaria son las citocinas. Los niveles altos de citocinas tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por células frente al antígeno dado, mientras que niveles altos de citocinas tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales frente al antígeno.

La distinción de las respuestas inmunitarias tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad un individuo soportará una respuesta inmunitaria que se describe como que es predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente considerar las familias de citocinas en cuanto a lo que se describe en clones de células T CD4 murinas por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, págs. 145-173). Tradicionalmente, las respuestas tipo TH1 están asociadas a la producción de las citocinas INF-g e IL-2 mediante los linfocitos T. Otras citocinas asociadas a menudo directamente con la inducción de respuestas inmunitarias tipo TH1 no se producen por las células T, tales como IL-12. Por el contrario, las respuestas tipo TH2 están asociadas a la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se sabe que determinados adyuvantes de vacuna son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citocina tipo TH1 o bien TH2. Tradicionalmente los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmunitaria tras una vacunación o infección incluye la medición directa de la producción de citocinas TH1 o TH2 por linfocitos T in vitro tras la estimulación de nuevo con antígeno, y/o la medición de la proporción IgG1:IgG2a de las respuestas de anticuerpo específico de antígeno.

Por tanto, un adyuvante tipo TH1 es uno que preferentemente estimula las poblaciones de células T aisladas para producir niveles altos de citocinas tipo TH1 cuando se estimulan de nuevo con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo de tanto respuestas de linfocitos T citotóxicos CD8+ como de inmunoglobulina específica de antígeno asociadas al isotipo tipo TH1.

Los adyuvantes que pueden estimular de manera preferencial la respuesta celular TH1 se describen en las solicitudes de patente internacional números WO 94/00153 y WO 95/17209.

El monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) es un adyuvante de este tipo. Esto se conoce del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 3-O-desacilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y se fabrica por Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida de monofosforil lípido A 3-O-desacilado se describe en la patente europea 0 689 454 B 1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

Preferiblemente, las partículas de 3D-MPL son suficientemente pequeñas para filtrarse de manera estéril a través de una membrana de 0,22 micrómetros (patente europea número 0 689 454). El 3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug - 100 \mug preferiblemente 25-50 \mug por dosis en la que el antígeno estará normalmente presente en un intervalo de 2-50 \mug por dosis.

Otro adyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada mediante HPLC derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente ésta puede mezclarse con monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento de producción de QS21 se describe en la patente estadounidense nº 5.057.540.

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Previamente se han descrito formulaciones de adyuvantes no reactogénicos que contienen QS21 (documento WO 96/33739). Tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han mostrado ser adyuvantes que estimulan la TH1 satisfactoriamente cuando se formulan junto con un antígeno.

Otros adyuvantes que son estimuladores preferenciales de la respuesta de las células TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo, secuencias CpG no metiladas tal como se describe en el documento WO 96/02555.

Las combinaciones de diferentes adyuvantes que estimulan la TH1, tales como aquellos mencionados anteriormente en el presente documento, se contemplan también ya que proporcionan un adyuvante que es un estimulador preferencial de la respuesta de las células TH1. Por ejemplo, puede formularse QS21 junto con 3D-MPL. La proporción de QS21:3D-MPL estará normalmente en el orden de 1:10 a 10:1; preferiblemente de 1:5 a 5:1 y con frecuencia sustancialmente 1:1. El intervalo preferido para la sinergia óptima es de 3D-MPL:QS21 2,5:1 a 1:1.

Preferiblemente, está presente también un vehículo en la composición de vacuna según la invención. El vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite que puede metabolizarse, tal como escualeno, alfa tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido, los antígenos en la composición de vacuna según la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en una emulsión de este tipo. Adicionalmente, la emulsión de aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Normalmente, para la administración humana estarán presentes QW21 y 3D-MPL en una vacuna en el intervalo de 1 \mug - 200 \mug, tal como 10 - 100 \mug, preferiblemente 10 \mug - 50 \mug por dosis. Normalmente, el aceite en agua comprenderá desde el 2% hasta el 10% de escualeno, desde el 2% hasta el 10% de alfa tocoferol y desde el 0,3 hasta el 3% de tween 80. Preferiblemente, la proporción de escualeno : alfa tocoferol es igual a, o inferior a 1, ya que ésta proporciona una emulsión más estable. También puede estar presente Span 85 a un nivel del 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además un estabilizante.

Las emulsiones de aceite en agua no tóxicas contienen preferiblemente un aceite no tóxico, por ejemplo, escualano o escualeno, un emulsionante, por ejemplo Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

Una formulación de adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

La presente invención proporciona también una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunitarias y estados relacionados. Una composición de vacuna polivalente de este tipo puede incluir un adyuvante que induce TH-1 tal como se describe anteriormente en el presente documento.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a determinados polinucleótidos y polipéptidos BASB119, ha de entenderse que cubre fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos que se producen de manera natural, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, deleciones o sustituciones que no afectan sustancialmente a las propiedades inmunogénicas de los polinucleótidos y polipéptidos recombinantes.

Composiciones, kits y administración

En otro aspecto de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido BASB119 y/o un polipéptido BASB119 para la administración a una célula o a un organismo multicelular.

La invención se refiere también a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido tratado en el presente documento o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden emplearse en combinación con un vehículo o vehículos no estériles o estériles para su uso con células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un individuo. Tales composiciones comprenden, por ejemplo, un aditivo del medio o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos pueden incluir, pero no limitarse a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe ser apta para el modo de administración. La invención se refiere además a kits y paquetes farmacéuticos y de diagnóstico que comprenden uno o más recipientes rellenos con uno o más de los componentes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente.

Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención pueden emplearse solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de cualquier manera eficaz, conveniente, incluyendo, por ejemplo, la administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica, entre otras.

En el tratamiento o como un profiláctico, el principio activo puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, tal como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, péptido agonista o antagonista o compuesto de molécula pequeña, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. La invención se refiere además a kits y paquetes farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes rellenos con uno o más de los componentes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente. Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención pueden emplearse solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptará a la vía de administración, por ejemplo, por una vía sistémica o una oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, normalmente por inyección intravenosa. Pueden usarse otras vías de inyección, tales como subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Los medios alternativos para la administración sistémica incluyen la administración transmucosa y transdérmica usando penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención pueden formularse en una formulación entérica o una formulación encapsulada, también puede ser posible la administración oral. La administración de estos compuestos puede ser también tópica y/o localizada, en forma de pomadas, pastas, geles, disoluciones, polvos y similares.

Para la administración a mamíferos, y particularmente seres humanos, se espera que el nivel de dosificación diario del principio activo sea desde 0,01 mg/kg hasta 10 mg/kg, normalmente alrededor de 1 mg/kg. En cualquier caso, el médico determinará la dosis real que será la más adecuada para un individuo y variará con la edad, el peso y la respuesta del individuo en particular. Las dosificaciones anteriores son a modo de ejemplo del caso medio. Puede haber, por supuesto, casos individuales en los que se merezcan intervalos de dosificación superiores o inferiores, y éstos están dentro del alcance de esta invención.

El intervalo de dosificación requerido depende de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza del estado del sujeto y la opinión del médico que lo atienda. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas están en el intervalo de 0,1-100 \mug/kg del sujeto.

Una composición de vacuna está convenientemente en forma inyectable. Pueden emplearse adyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmunitaria. Una dosis unitaria adecuada para la vacunación es de 0,5-5 microgramos/kg de antígeno, y tal dosis se administra preferiblemente de 1-3 veces y con un intervalo de 1-3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado, no se observará ningún efecto toxicológico con los compuestos de la invención que descartaría su administración a los individuos adecuados.

Sin embargo, han de esperarse amplias variaciones en la dosificación necesitada, en vista de la variedad de compuestos disponibles y las distintas eficacias de las diversas vías de administración. Por ejemplo, se esperará que la administración oral requiera dosificaciones más altas que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse usando rutinas empíricas convencionales para la optimización, tal como se entiende bien en la técnica.

Bases de datos de secuencias, secuencias en un medio tangible y algoritmos

Las secuencias de polipéptidos y polinucleótidos forman un recurso de información valioso con el que determinar sus estructuras 2 y 3-dimensionales así como identificar otras secuencias de similar homología. Estos enfoques se facilitan lo más fácilmente almacenando la secuencia en un medio que puede leerse por ordenador y usando luego los datos almacenados en un programa de estructura macromolecular conocido o para buscar una base de datos de secuencias usando herramientas de búsqueda bien conocidas, tales como el paquete de programas GCG.

También se describen por la invención procedimientos para el análisis de hebras o secuencias de rasgo, particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencias incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencia, tales como análisis de identidad y semejanza, ADN, ARN y análisis de la estructura proteica, montaje de la secuencia, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencia, determinación del marco de lectura abierto, lectura automática de ácidos nucleicos, análisis de utilización de codones, recorte de las bases de ácidos nucleicos y análisis de los picos del cromatograma de secuenciación.

Se describe un procedimiento basado en ordenador para realizar la identificación de la homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio que puede leerse por ordenador; y comparar dicha primera secuencia de polinucleótidos con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar la homología.

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Se describe también un procedimiento basado en ordenador para realizar la identificación de la homología, comprendiendo este procedimiento las etapas de: proporcionar una primera secuencia de polipéptidos que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio que puede leerse por ordenador; y comparar dicha primera secuencia de polipéptidos con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar la homología.

Definiciones

"Identidad," tal como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, según puede ser el caso, tal como se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" significa también el grado de relación entre las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según puede ser el caso, tal como se determina mediante la coincidencia entre las hebras de tales secuencias. La "identidad" puede calcularse fácilmente mediante procedimientos conocidos, incluyendo pero sin limitarse a los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Se diseñan procedimientos para determinar la identidad para dar la mayor coincidencia entre las secuencias sometidas a prueba. Además, se codifican procedimientos para determinar la identidad en programas informáticos disponibles al público. Los procedimientos de programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan al programa GAP en el paquete de programas GCG (Devercux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85; 2444-2448 (1988). La familia de programas BLAST está disponible al público de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Puede usarse también el algoritmo bien conocido de Smith Waterman para determinar la identidad.

Los parámetros para la comparación de secuencias polipeptídicas incluyen los siguientes:

: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

: Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff,

: Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:10915-10919 (1992)

: Penalización por hueco: 8

: Penalización por longitud de hueco: 2

Está disponible al público un programa útil con estos parámetros como el programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para las comparaciones peptídicas (junto con la no penalización para los huecos de los extremos).

Los parámetros para la comparación de polinucleótidos incluyen los siguientes:

: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

: Matriz de comparación: coincide = +10, no coincide = 0

: Penalización por hueco: 50

: Penalización por longitud de hueco: 3

: Disponible como: el programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros por defecto para las comparaciones de ácidos nucleicos.

Un significado preferido para "identidad" para polinucleótidos y polipéptidos, según puede ser el caso, se proporciona en (1) y (2) a continuación.

(1) Los polinucleótidos incluyen además un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% de identidad con respecto a la secuencia de referencia de la SEQ ID NO: 1, en la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEQ ID NO: o puede incluir hasta un determinado número entero de alteraciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de ácidos nucleicos, y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier sitio entre aquellas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en la SEQ ID NO: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido entre 100 y restándole después ese producto a dicho número total de nucleótidos en la SEQ IDNO: 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de nucleótidos en la SEQ ID NO: 1, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más próximo antes de restárselo a x_{n}. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 pueden crear mutaciones de desplazamiento del marco de lectura, sin sentido o sin sentido invertidas en esta secuencia codificante así alterar el polipéptido codificado por el polinucleótido tras tales alteraciones. A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEQ ID NO: 1, es decir, puede ser idéntica al 100%, o puede incluir hasta un determinado número entero de alteraciones de ácidos nucleicos en comparación con la secuencia de referencia de modo que el porcentaje de identidad es inferior al 100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de ácidos nucleicos, y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier sitio entre aquellas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en la SEQ ID NO: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido entre 100 y restándole después ese producto a dicho número total de ácidos nucleicos en la SEQ ID NO: 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en la SEQ ID NO: 1, y es, por ejemplo 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85% etc., \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más próximo antes de restárselo x_{n}.

(2) Los polipéptidos incluyen además un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% de identidad con respecto a una secuencia de referencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia de polipéptidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEQ ID NO: 2 o puede incluir hasta un determinado número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de aminoácidos, y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones amino o carboxi-terminales de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier sitio entre aquellas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido entre 100 y restándole después ese producto a dicho número total de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más próximo antes de restárselo a x_{a}.

A modo de ejemplo, una secuencia de polipéptidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEQ ID NO: 2, que puede ser idéntica al 100%, o puede incluir hasta un determinado número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de modo que el porcentaje de identidad es inferior al 100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa o no conservativa, o inserción de aminoácidos, y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones amino o carboxi-terminales de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier sitio entre aquellas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un % de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido entre 100 y restándole después ese producto a dicho número total de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2, o:

n_{n} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2, y es, por ejemplo 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85% etc., y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más próximo antes de restárselo a x_{a}.

"Individuo(s)", cuando se utiliza en el presente documento con respecto a un organismo, significa un eucariota multicelular, incluyendo, pero sin limitarse a un metazoario, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate y un ser humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" de su estado natural, es decir, si se produce en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presentes de manera natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", tal como se emplea el término en el presente documento. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introducen en un organismo mediante transformación, manipulación genética o mediante cualquier otro procedimiento recombinante está "aislado" incluso si está todavía presente en dicho organismo, organismo que puede estar vivo o no vivo.

"Polinucleótido(s)" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido que puede ser ARN o ADN no modificado ARN o ADN modificado incluyendo las regiones de cadena sencilla y doble.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero conserva las propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de otro, polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios en los nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, tal como se discute a continuación. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otra, polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias están limitadas de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son muy similares globalmente y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácidos insertado o sustituido puede ser o no ser uno codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser una que se produce de manera natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce que se produce de manera natural. Las variantes que no se producen de manera natural de polinucleótidos y polipéptidos pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

"Enfermedad(es)" significa cualquier enfermedad provocada por o relacionada con la infección por una bacteria, incluyendo, por ejemplo, otitis media en lactantes y niños, neumonía en ancianos, sinusitis, infecciones nosocomiales y enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de audición, acumulación de líquido en el oído medio, daño del nervio auditivo, aprendizaje del lenguaje retardado, infección de las vías respiratorias altas e inflamación del oído medio.

Ejemplos

Los ejemplos a continuación se llevan a cabo usando técnicas convencionales, que se conocen bien y son de rutina para los expertos en la técnica, excepto cuando se describa lo contrario en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1

Secuenciación de ADN del gen de BASB119 de la cepa de Moraxella catarrhalis ATCC 43617 A: BASB119 en la cepa de Moraxella catarrhalis

El gen de BASB119 de la SEQ ID NO: proviene de la cepa de Moraxella catarrhalis ATCC 43617. La traducción de la secuencia de polinucleótidos BASB119 se muestra en la SEQ ID NO: 2.

B: BASB119 en la cepa de Moraxella catarrhalis 43617

Se confirmó la secuencia del gen de BASB119 en la cepa de Moraxella catarrhalis ATCC 43617. Para este fin, el ADN del plásmido (véase el ejemplo 2A) que contenía la región génica que codifica la BASB119 madura de la cepa de Moraxella Catarrhalis ATCC 43617 se usó como plantilla de la PCR. Luego se sometió este material a la amplificación del ADN por la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores pTLZ F 5' TGA CAA TTA ATC ATC GGC TCG-3' [SEQ ID NO: 5] e inversos pTLZRV.2 5' GGC TGA AAA TCT TCT CTC ATC C-3' [SEQ ID NO: 6]. Luego se sometió el amplímero de la PCR a la secuenciación del ADN usando el kit Big Dyes (Applied biosystems) y se analizó en un secuenciador de ADN ABI 373/A en las condiciones descritas por el proveedor. Como resultado se obtuvieron el polinucleótido y las secuencias de polipéptidos deducidas, denominadas SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 respectivamente. Estas secuencias no comprenden la secuencia señal ya que la secuencia señal provenía del plásmido.

Usando el programa MegAlign del paquete de programas DNASTAR, se realizó una alineación de las secuencias de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1 y 3, y se presenta en la figura 1; una comparación por parejas de las identidades muestra que las dos secuencias génicas de polinucleótidos BASB119 son idénticas al 100% en la región que codifica la proteína madura. Usando el mismo programa MegAlign, se realizó una alineación de las secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 2 y 4, y se presenta en la figura 2; una comparación por parejas de las identidades muestra que las dos secuencias proteicas BASB119 son idénticas al 100% en la región de la proteína madura.

Ejemplo 2

Construcción del plásmido para expresar BASB119 recombinante A: Clonación de BASB119

Los sitios de restricción EcoRI y SalI modificados mediante ingeniería genética en los cebadores de amplificación directo MC-Lip11-Fn/t-RI (5'- AGG CAG AGG GAA TTC ATG ATG AGA TTT TTA TTG GTT GG -3') [SEQ ID NO: 7] e inverso MC-Lip11RCh/t-Sal (5'-AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG AAA CTG ACT TTC GTC AAT TAT GG-3') [SEQ ID NO: 8], respectivamente, permitían la clonación direccional de un producto de PCR en el plásmido de expresión de E. coli pTLZ2 de modo que la proteína madura de BASB119 podía expresarse como una proteína de fusión que contenía una etiqueta de cromatografía de afinidad (His)6 en el extremo C-terminal. Se purificó el producto de la PCR de BASB119 de la reacción de amplificación usando columnas giratorias a base de gel de sílice (QiaGen) según las instrucciones del fabricante. Para producir los extremos terminales EcoRI y SalI requeridos necesarios para la clonación, se digirió secuencialmente el producto de la PCR purificado hasta la finalización con las enzimas de restricción EcoRI y SalI tal como se recomienda por el fabricante (Life Technologies). Tras la primera digestión de restricción, se purificó el producto de la PCR por medio de una columna giratoria tal como anteriormente para eliminar las sales y se eluyó en agua estéril antes de la segunda disgestión enzimática. Se purificó de nuevo el fragmento de ADN digerido usando columnas giratorias a base de gel de sílice antes del acoplamiento con el plásmido pTLZ2.

B: Producción del vector de expresión

Para preparar el plásmido de expresión pTLZ2 para el acoplamiento, se digirió de manera similar hasta la finalización tanto con EcoRI como SalI y luego se trató con fosfatasa intestinal de ternero (CIP, \sim0,02 unidades/pmoles de extremo 5', Life Technologies) tal como se indica por el fabricante para evitar el autoacoplamiento. Se usó un exceso molar de 5 veces del fragmento digerido con respecto al vector preparado para programar la reacción de acoplamiento. Se realizó una reacción de acoplamiento convencional \sim20 \mul (\sim16ºC, \sim16 horas), usando procedimientos bien conocidos en la técnica, usando T4 ADN ligasa (\sim2,0 unidades/reacción, Life Technologies). Se usó una alícuota del acoplamiento (\sim5 \mul) para transformar las células electrocompetentes JM109 según procedimientos bien conocidos en la técnica. Tras un periodo de germinación de \sim2-3 horas a 37ºC en \sim1,0 ml de caldo LB, se cultivaron las células transformadas sobre placas de agar LB que contenía ampicilina (100 \mug/ml). Se incluyó el antibiótico en la selección. Se incubaron las placas durante la noche a 37ºC durante \sim16 horas. Se cogieron las colonias de ApR individuales con palillos de dientes estériles y se usaron para inocular "por zonas" las placas de ApR LB así como un caldo de cultivo de ApR LB de \sim1,0 ml. Se incubaron tanto las placas de zonas como el caldo de cultivo durante la noche a 37ºC en una incubadora convencional (placas) o bien en un baño de agua con agitación. Se empleó un análisis completo mediante PCR basado en células para verificar que los transformantes contenían el inserto de ADN de BASB119. En este momento, se transfirió el caldo de cultivo de Ap LB de \sim1,0 ml durante la noche a un tubo polipropileno de 1,5 ml y se recogieron las células mediante centrifugación en una microcentrífuga Beckmann (\sim3 min., temperatura ambiente, \sim12,000 X g). Se suspendió el sedimento celular en \sim200 \mul de agua estéril y se usó una alícuota de \sim10 \mul para programar una reacción de PCR de volumen final de \sim50 \mul que contenía cebadores de amplificación tanto directos como inversos de BASB119. Las concentraciones finales de los componentes de la reacción de la PCR fueron esencialmente las mismas que las especificadas en el ejemplo 2 excepto en que se usaron \sim5,0 unidades de Taq polimerasa. La etapa de desnaturalización inicial a 95ºC se incrementó hasta 3 minutos para garantizar la disrupción térmica de las células bacterianas y la liberación del ADN del plásmido. Se usaron un ciclador térmico ABI modelo 9700 y un perfil de amplificación térmica en tres etapas de 32 ciclos, es decir 95ºC, 45 s; 55-58ºC, 45 s, 72ºC, 1 min., para amplificar el fragmento de BASB119 de las muestras de transformante lisado. Tras la amplificación térmica, se analizó una alícuota de \sim20 \mul de la reacción mediante electroforesis en gel de agarosa (0,8% de agarosa en un tampón de Tris-acetato-EDTA (TAE)). Se visualizaron los fragmentos de ADN mediante iluminación UV tras la electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. Se sometió a electroforesis un patrón de tamaño molecular de ADN (1 Kb ladder, Life Technologies) en paralelo con las muestras de prueba y se usó para estimar el tamaño de los productos de la PCR. Los trasformantes que produjeron el producto de PCR de tamaño esperado se identificaron como cepas que contenían un constructo de expresión de BASB119. Luego se analizaron las cepas que contenían el plásmido de expresión para determinar la expresión inducible de BASB119 recombinante.

C: Análisis de la expresión de los transformantes positivos en PCR

Para cada transformante positivo en PCR identificado anteriormente, se inocularon \sim5,0 ml de caldo LB que contenía ampicilina (100 \mug/ml) con células de la placa en zonas y se hicieron crecer durante la noche a 37ºC con agitación (\sim250 rpm). Se inoculó una alícuota de cultivo sembrado durante la noche (\sim1,0 ml) en un matraz erlenmeyer de 125 ml que contenía \sim25 de caldo de Ap LB y se hizo crecer a 37ºC con agitación (\sim250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó D.O.600 de \sim0,5, es decir fase semilogarítmica (en general aproximadamente 1,5 - 2,0 horas). En este momento se transfirió aproximadamente la mitad del cultivo (\sim12,5 ml) a un segundo matraz de 125 ml y se indujo la expresión de la proteína BASB119 recombinante por la adición de IPTG (disolución madre 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) hasta una concentración final de 1,0 mM. La incubación de los cultivos inducidos por IPTG y no inducidos continuó durante \sim4 horas más a 37ºC con agitación. Se retiraron las muestras (\sim1,0 ml) de los cultivos tanto inducidos como no inducidos tras el periodo de inducción y se recogieron las células mediante centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante \sim3 minutos. Se suspendieron los sedimentos celulares individuales en \sim 50 \mul de agua estéril, luego se mezclaron con un volumen igual de tampón de muestra 2X Laemelli SDSPAGE que contenía 2-mercaptoetanol, y se colocaron en un baño de agua en ebullición durante \sim3 min. para desnaturalizar la proteína. Se cargaron volúmenes iguales (\sim15 \mul) de lisados celulares tanto inducidos por IPTG bruto como no inducidos en gel poliacrilamida Tris/glicina al 12% (mini-geles de 1 mm de espesor, Novex) por duplicado. Se sometieron a electroforesis las muestras de lisado inducido y no inducido junto con los marcadores de peso molecular teñidos previamente (SeeBlue, Novex) en condiciones convencionales usando un tampón de recorrido de SDS/Tris/glicina convencional (BioRad). Tras la electroforesis, se tiñó un gel con azul de commassie brillante R250 (BioRad) y luego se destiló para visualizar la(s) proteína(s) que podían inducirse por IPTG de BASB119. Se sometió a electroinmunotransferencia el segundo gel en una membrana de PVDF (tamaño de poro de 0,45 micras, Novex) durante \sim2 h a 4ºC usando un aparato de inmunotransferencia de BioRad Mini-Protean II y tampón de transferencia de metanol (al 20%) de Towbin. Se realizó el bloqueo de la membrana y las incubaciones de los anticuerpos según procedimientos bien conocidos en la técnica. Se usó un anticuerpo monoclonal anti-RGS (His)3, seguido de un segundo anticuerpo anti-ratón de conejo conjugado con HRP (QiaGen), para confirmar la expresión e identidad de la proteína recombinante BASB119. Se consiguió la visualización del patrón reactivo del anticuerpo anti-His usando un sustrato insoluble de ABT o bien usando Hyperfilm con el sistema de quimioluminiscencia ECL de Amersham.

Ejemplo 3

Producción de BASB119 recombinante Cepa bacteriana

Se usó una cepa de expresión recombinante de E. coli JM109 que contenía un plásmido (pTLZ2) que codifica BASB119 de M. catarrhalis, para producir masa celular para la purificación de la proteína recombinante. Se cultivó la cepa de expresión sobre placas de agar LB que contenían ampicilina 100 \mug/ml ("Ap") para garantizar que se mantenía el pTLZ2. Para la crioconservación a -80ºC, se propagó la cepa en el caldo LB que contenía la misma concentración de antibióticos, luego se mezcló con un volumen igual de caldo LB que contenía glicerol al 30% (p/v).

Medios

El medio de fermentación usado para la producción de proteína recombinante estaba constituido por caldo 2X YT (Difco) que contenía Ap 100 \mug/ml. Se añadió antiespumante al medio para el fermentador a 0,25 ml/l (Antifoam 204, Sigma). Para inducir la expresión de la proteína recombinante BASB119, se añadió IPTG (isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido) al fermentador (1 mM, final).

Fermentación

Se inoculó un matraz erlenmeyer de cultivo de 500 ml, que contenía 50 ml de volumen de trabajo, con 0,3 ml de cultivo congelado rápidamente descongelado, o varias colonias de un cultivo en placa de agar selectivo, y se incubó durante aproximadamente 12 horas a 37 \pm 1ºC en una plataforma de agitación a 150 rpm (Innova 2100, New Brunswick Scientific). Luego se usó este cultivo de siembra para inocular un fermentador de volumen de trabajo de 5 l que contenía caldo 2X YT y ambos antibióticos de Ap. Se hizo funcionar el fermentador (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) a 37 \pm 1ºC, 0,2-0,4 VVM de burbujeo de aire, 250 rpm en impulsores Rushton. No se controló el pH ni en el cultivo de siembra del matraz ni en el fermentador. Durante la fermentación, el pH oscilaba de 6,5 a 7,3 en el fermentador. Se añadió IPTG (disolución madre 1,0 M, preparada en agua estéril) al fermentador cuando el cultivo alcanzó el semilogaritmo del crecimiento (\sim0,7 D.O.600 unidades). Se indujeron las células durante 2-4 horas, luego se recogieron mediante centrifugación usando una centrífuga de alta velocidad 28RS Heraeus (Sepatech) o bien RC5C (Sorvall Instruments). Se almacenó la pasta celular a -20ºC hasta que se trató.

Productos químicos y materiales

Imidazol y Triton X-100 se adquirieron de Merck. Aprotinina y Triton X-114 se obtuvieron de Sigma Chemical Company. AEBSF provenía de ICN-Biochemicals. Todos los otros productos químicos eran de calidad reactivo o mejor. La resina Ni-NTA Superflow y el anticuerpo frente a Penta-His, BSA libre se obtuvieron de QiaGen. El ensayo de MicroBCA se obtuvo de Pierce; 3 filtros Amicon de Millipore. La membrana de diálisis (MWCO12-14000) provenía de MFPI, EE.UU. El marcador de masa molecular (BenchMark ladder) provenía de Life-technologies.

Ejemplo 4

Purificación de BASB119 recombinante a partir de E. coli Extracción-purificación

Se resuspendió la pasta celular del cultivo inducido con 500 ml de IPTG (\sim4 horas, DO620 = 0,5) en 40 ml de tampón fosfato, pH 7,5, que contenía AEBSF 1 mM y aprotinina 1 mM como inhibidores de la proteasa. Se lisaron las células en un disruptor celular. Se dividió el lisado con detergente con Triton X-114 al 1,5% durante 2 horas a 4ºC y se centrifugó a 3.000 g durante 30 minutos a 4ºC. Se calentó el extracto hasta 37ºC durante 15 minutos y se centrifugó a 1.000 g durante 10 minutos a 20ºC. Se diluyó la fase del Triton (fase inferior) hasta 15 ml con tampón fosfato, pH 7,5, que contenía NaCl 0,3 M, Triton X-100 al 0,005%, glicerol al 10% (tampón A) y se aplicó a la resina Ni-NTA Superflow en un modo continuo (incubación durante la noche). Se lavó la resina con tampón A. Se eluyeron las proteínas con tampón A que contenía sucesivamente imidazol 50 mM, 100 mM, y 200 mM. Se reunieron las fracciones que contenían proteína BASB119 y se dializaron frente a tampón PBS, pH 7,4, que contenía Triton X-100 al 0,1%.

Se cuantificó la proteína BASB119 purificada usando el reactivo de ensayo Micro BCA.

Se obtuvieron 2 mg de proteína purificada, a una concentración final de 130 \mug/ml.

Tal como se muestra en la figura 3-A, la proteína BASB119 purificada apareció en el análisis de SDS-PAGE como una banda principal que migraba a aproximadamente 21 kDa (peso molecular relativa estimada). Se estimó la pureza en más del 80%. La proteína BASB119 era reactiva frente a un anticuerpo monoclonal de ratón aumentado frente al motivo 6-histidina (figura 3-B).

Ejemplo 5

Producción de antisueros frente a BASB119 recombinante

Se generaron antisueros polivalentes frente a la proteína BASB119 vacunando seis ratones con la proteína
BASB119 recombinante purificada. Se suministra a cada animal un total de tres inmunizaciones por vía subcutánea de aproximadamente 10 \mug de proteína BASB119 por inyección a aproximadamente intervalos de 14 días. Se extrajo sangre a los animales antes de la primera inmunización ("pre-extracción") y una semana tras la última inmunización. Se midieron los títulos anti-proteína BASB119 mediante un ELISA usando proteína BASB119 recombinante purificada (4 \mug/pocillo). El título se define como títulos de punto medio calculados mediante el modelo logístico de 4 parámetros usando el programa XL Fit. Los títulos obtenidos tras la inmunización fueron 1:1300 para los sueros de ratones.

Ejemplo 6

Caracterización inmunológica: exposición superficial de BASB119

Se determinaron los títulos anti-proteína BASB119 mediante un ELISA usando células completas destruidas con formalina de cepas de Moraxella catarrhalis 2926 (20 \mug/pocillo). El título se define como los títulos de punto medio calculados mediante el modelo logístico de 4 parámetros usando el programa SoftMax Pro.

Los títulos observados con los sueros inmunitarios de conejo (1:100) demuestran que la proteína BASB119 se detecta en la superficie de las células de M. catarrhalis.

Ejemplo 7

Caracterización inmunológica: actividad bactericida

Se examinó la actividad citotóxica mediada por complemento de los anticuerpos anti-BASB119 para determinar el potencial de la vacuna de proteína BASB119, se preparó el antisuero tal como se describió anteriormente. Se examinaron las actividades del suero pre-inmunitario y del antisuero anti-BASB119 para la destrucción mediada por complemento de M. catarrhalis. Se hicieron crecer cepas de M. catarrhalis sobre placas Mueller Hinton durante 24 horas a 36ºC. Se añadieron varias colonias a 15 ml de BHI en el matraz de 125 ml. Se hicieron crecer los cultivos durante aproximadamente 4 horas a 200 rpm hasta que la A620 = 0,4. Tras una etapa de lavado, se suspendió el sedimento con HBSS y se diluyó la cepa hasta obtener 28500 UFC por mililitro. Se depositaron cincuenta (50) \mul de suero preinmunitario y el suero anti-BASB119 (inactivado a 56ºC durante 30 min.) en el primer pocillo de una placa de 96 pocillos y se depositaron diluciones seriadas dos veces en HBSS en los otros pocillos de la misma línea. Posteriormente se añadieron veinticinco (25) \mul de M. catarrhalis viva diluida y se incubó la mezcla durante 15 min. a temperatura ambiente. Se añadió complemento de conejo recién nacido (Pel freez, clinical systems, Brown Deer, WI, EE.UU.) en cada pocillo a una dilución de trabajo definida con antelación en un ensayo de toxicidad.

Se cubrieron y se incubaron las microplacas durante 1 hora a 37ºC a 200 rpm.

Cada prueba incluye un control del complemento (pocillos sin suero que contenía fuente de complemento activo o inactivado), un control positivo (pocillos que contenían suero con un título conocido de anticuerpos bactericidas), un control de cultivo (pocillos sin suero ni complemento) y control de suero (pocillos sin complemento).

El título bactericida de antisuero de ratones (destrucción del 50% de cepa homóloga) fue <1:25 (pre-inmunitario) y >1:100 (inmunitario).

Ejemplo 8

Eficacia de la vacuna de BASB119: potenciación del aclaramiento de pulmón de M. catarrhalis en ratones

Este modelo de ratón se basa en el análisis de la invasión del pulmón por M. catarrhalis tras una exposición intranasal convencional a los ratones vacunados. Se inmunizan grupos de 6 ratones BALB/c (hembras, 6 semanas de edad) por vía subcutánea con 100 \mul de vacuna correspondiente a una dosis de 10 \mug y se les administra una dosis de refuerzo 2 semanas después. Una semana tras la administración de refuerzo, se exponen los ratones a instilación de 50 \mul de suspensión bacteriana (5 10^{5} UFC/50 \mul) en el orificio nasal izquierdo bajo anestesia (se anestesian los ratones con una combinación de anestésicos ketamina y xilazina, 0,24 mg de xilazina (Rompun) y 0,8 mg de ketamina (Imalgene)/100 \mul). Se sacrifican los ratones 4 horas tras la exposición y se extirpan los pulmones de manera aséptica y se homogenizan individualmente. La media ponderada del log 10 de UFC/pulmón se determina contando las colonias que crecen sobre las placas de agar Mueller-Hinton tras cultivar 20 \mul de 5 diluciones seriadas del homogeneizado. Se calculan la media aritmética de la media ponderada del log 10 de UFC/pulmón y las desviaciones standard para cada grupo.

Los resultados se analizan estadísticamente aplicando ANOVA de una vía tras asumir la igualdad de la varianza (comprobado mediante la prueba de Brown y Forsythe) y la normalidad (comprobado usando la prueba de Shapiro-Wilk). Se analizaron las diferencias entre los grupos usando la prueba de Dunnet, la prueba de recorrido estudentizado de Tukey (HSD) y la prueba de Student-Newman-Keuls.

En este experimento, se inmunizaron los grupos de ratones con BASB119 adsorbida en AlPO4 (10 \mug de BASB119 en 100 \mug de AlPO4) o bien con una preparación de células completas destruidas (kwc, killed whole cells) de la cepa de M. catarrhalis ATCC 43617 adsorbida en AlPO4 (5 10^{8} células en 100 \mug de AlPO4) o con 100 \mug de AIPO4 sin antígeno. Se expusieron los ratones a 5 10^{5} UFC de bacterias de la cepa de M. catarrhalis viva ATCC 43617.

Se calcularon para cada grupo la media ponderada del log 10 de UFC/pulmón y la desviación standard 4 horas tras la exposición. Los ratones inmunizados de manera simulada tenían 5,41 (+/- 0,2) log10 UFC/pulmones 4 horas tras la exposición. La preparación de kwc indujo un aclaramiento del pulmón significativo en comparación con el grupo control (diferencia de 1,58 log). La vacuna de BASB119 indujo una diferencia de 1,34 log en el aclaramiento del pulmón en comparación con el grupo control, que era significativamente diferente del control.

Materiales depositados

Un depósito que contiene una cepa de Catlin de Moraxella catarrhalis se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (en el presente documento "ATCC", American Type Culture Collection) el 21 de junio de 1997 y número de depósito asignado 43617. El depósito se describió como Branhamella catarrhalis (Frosch y Kolle) y es una biblioteca de insertos de 1,5-2,9 kb, liofilizados, construida de aislados de M. catarrhalis obtenidos de una punción transtraqueal de minero del carbón con bronquitis crónica. El depósito se describe en Antimicrob. Agents Chemother. 21:506-508 (1982).

El depósito de la cepa de Moraxella catarrhalis se denomina en el presente documento como "la cepa depositada" o como "el ADN de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen de BASB119 de longitud completa.

Un depósito del vector pMC-D15 que está constituido por ADN de Moraxella catarrhalis insertado en pQE30 se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) el 12 de febrero de 1999 y se le ha asignado el número de depósito 207105.

La secuencia de los polinucleótidos contenida en la cepa/clon depositado, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificada de ese modo, están controlando en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de las secuencias en el presente documento.

El depósito de las cepas depositadas se ha realizado bajo los términos del tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para fines del procedimiento de patentes. Las cepas depositadas serán irrevocablemente y sin restricciones o condiciones accesibles al público tras la publicación de una patente. Las cepas depositadas se proporcionan simplemente como comodidad para los expertos en la técnica y no son una admisión de que requiere un depósito para el permiso, tal como el que requiere bajo 35 U.S.C. \NAK112.

Información de secuencias Polinucleótido BASB119 y secuencias de polipéptidos

SEQ ID NO: 1

Secuencia de polinucleótidos BASB119 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC43617

1

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SEQ ID NO: 2

Secuencia de polipéptidos BASB119 de Moraxella catarrhalis deducida del polinucleótido de SEQ ID NO: 1

2

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SEQ ID NO: 3

3

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SEQ ID NO: 4

Secuencia de polipéptidos BASB119 de Moraxella catarrhalis deducida del polinucleótido de SEQ ID NO: 3

4

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SEQ ID NO: 5

TGA CAA TTA ATC ATC GGC TCG

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SEQ ID NO: 6

GGC TGA AAA TCT TCT CTC ATC C

\newpage

SEQ ID NO: 7

AGG CAG AGG GAA TTC ATG ATG AGA TTT TTA TTG GTT GG

SEQ ID NO: 8

AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG AAA CTG ACT TTC GTC AAT TAT GG

<110> SmithKline Beecham Biologicals SA

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<120> Compuestos novedosos

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<130> BM45410

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<160> 8

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<170> FastSEQ para Windows versión 3,0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 516

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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100

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 2

5

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<210> 3

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<211> 513

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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6

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<210> 4

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<211> 171

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 4

7

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgacaattaa tcatcggctc g

\hfill

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggctgaaaat cttctctcat cc

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

aggcagaggg aattcatgat gagattttta ttggttgg

\hfill

38

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 59

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 8

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcagaggg tcgacttaat ggtgatggtg atggtgaaac tgactttcgt caattatgg

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Una composición de vacuna que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 por toda la longitud de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento inmunogénico del mismo que (si es necesario cuando está acoplado a un vehículo) puede producir una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de SEQ ID NO: 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. La composición según la reivindicación 1 en la que la secuencia de aminoácidos tiene al menos el 95% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 por toda la longitud de la SEQ ID NO: 2.

3. La composición según la reivindicación 1, en la que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

4. La composición según la reivindicación 1, en la que el polipéptido está constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

5. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho polipéptido o fragmento inmunogénico del mismo es parte de una proteína de fusión mayor.

6. Una composición de vacuna que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 por toda la longitud de SEQ ID NO: 2 o un fragmento inmunogénico del mismo que (si es necesario cuando está acoplado a un vehículo) puede producir una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. Una composición de vacuna que comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 por toda la longitud de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Una composición de vacuna que comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO: 2 por toda la región codificante; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Una composición de vacuna según la reivindicación 8, en la que el polinucleótido aislado comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad con respecto a la de la SEQ ID NO: 1 ó 3 por toda la longitud de la SEQ ID NO: 1 ó 3 respectivamente.

10. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que la identidad es al menos del 95% con respecto a SEQ ID NO: 1 ó 3.

11. Una composición de vacuna que comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento inmunogénico del mismo que (si es necesario cuando está acoplado a un vehículo) puede producir una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Una composición de vacuna según la reivindicación 9, en la que el polinucleótido aislado comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

13. Una composición de vacuna según la reivindicación 11, que puede obtenerse seleccionando una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación estrictas con una sonda etiquetada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. La composición de vacuna según cualquier reivindicación anterior, en la que dicha composición comprende al menos otro antígeno de Moraxella catarrhalis.

15. Una célula huésped de Moraxella catarrhalis que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13 o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula huésped que expresa un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

16. Un procedimiento para producir un polipéptido que comprende cultivar una célula huésped según la reivindicación 15 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido del medio de cultivo.

17. Un procedimiento para expresar un polinucleótido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, que comprende transformar una célula huésped de Moraxella catarrhalis con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y cultivar dicha célula huésped en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

18. El uso de una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la preparación de un medicamento para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad microbiana.

19. Una vesícula de membrana externa bacteriana que comprende un polipéptido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que puede obtenerse de una célula huésped que comprende un vector de ácido nucleico que comprende un polinucleótido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, que tiene una región hacia arriba modificada que contiene un elemento regulador heterólogo.

20. Una composición de vacuna que comprende la vesícula de membrana externa bacteriana según la reivindicación 19, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.