ES2240259T3 - Produccion recombinante de poliquetidos aromaticos. - Google Patents
Produccion recombinante de poliquetidos aromaticos.Info
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Abstract
Una célula transformada por ingeniería genética, célula que, en su estado nativo y no transformado, expresa una agrupación de genes de poliquétido-sintasa (PKS), careciendo dicha célula transformada por ingeniería genética de la agrupación de genes PKS nativos entera.
Description
Producción recombinante de poliquétidos
aromáticos.
La presente invención se refiere en general a
poliquétidos y poliquétido-sintasas. En particular,
la invención concierne a la producción recombinante de poliquétidos
utilizando un nuevo sistema hospedador-vector.
Los poliquétidos son una gran familia
estructuralmente diversa de productos naturales. Los poliquétidos
poseen una extensa gama de actividades biológicas que incluyen
propiedades antibióticas y farmacológicas. Por ejemplo, los
poliquétidos están representados por antibióticos tales como las
tetraciclinas y la eritromicina, agentes anticáncer que incluyen
daunomicina, inmunosupresores, por ejemplo FK506 y rapamicina, y
productos veterinarios tales como monensina y avermectina. Los
poliquétidos existen en la mayoría de los grupos de organismos y son
especialmente abundantes en una clase de bacterias miceliales, los
actinomicetos, que producen diversos poliquétidos.
Las poliquétido-sintasas (PKSs)
son enzimas multifuncionales relacionadas con sintasas de ácidos
grasos (FASs). Las PKSs catalizan la biosíntesis de poliquétidos a
través de condensaciones de Claisen (descarboxilantes) repetidas
entre aciltioésteres, usualmente acetil-, propionil-, malonil- o
metilmalonil-tioésteres. Después de cada
condensación, aquéllas introducen variabilidad estructural en el
producto por catalizar la totalidad, una parte, o nada de un ciclo
de reducción que comprende una cetorreducción, deshidratación, y
enoilreducción del grupo \beta-ceto de la cadena
de poliquétido en crecimiento. Después que la cadena de carbono ha
crecido hasta una longitud característica de cada producto
específico, la misma se libera de la sintasa por tiólisis o
transferencia de acilo. Así pues, las PKSs están constituidas por
familias de enzimas que trabajan juntas para producir un poliquétido
dado. Es la variación controlada en longitud de cadena, elección de
las unidades de construcción de las cadenas, y el ciclo de
reducción, programados genéticamente en cada PKS, lo que contribuye
a la variación observada entre los poliquétidos existentes
naturalmente.
Existen dos clases generales de PKSs. Una clase,
conocida como PKSs Tipo I, está representada por las PKSs para
macrólidos tales como eritromicina. Estas PKSs "complejas" o
"modulares" incluyen ensamblajes de varias proteínas
multifuncionales grandes que llevan, entre ellas, una serie de
sitios activos separados para cada paso de ensamblaje y modificación
de la cadena de carbono (Cortes, J. et al., Nature
(1990), 348: 176; Donadio, S. et al. Science
(1991), 252: 675; MacNeil, D.J. et al. Gene
(1992) 115: 119). En esta clase de variaciones en el número y
tipo de sitios activos en las PKSs se produce diversidad
estructural. Esta clase de PKSs exhibe una correlación de
uno-a-uno entre el número y la
agrupación de sitios activos en la secuencia primaria de la PKS y la
estructura de la cadena principal del poliquétido.
La segunda clase de PKSs, denominadas PKSs Tipo
II, está representada por las sintasas para compuestos aromáticos.
Las PKSs Tipo II tienen una serie única de sitios activos utilizados
de modo iterativo (Bibb, M.J. et al. EMBO J. (1989) 8:
2727; Sherman, D.H. et al. EMBO J. (1989) 8:
2717; Fernández-Moreno, M.A. et al. J.
Biol. Chem. (1992) 267: 19278).
Streptomyces es un actinomiceto que es un
productor abundante de poliquétidos aromáticos. En cada PKSs
aromática de Streptomyces estudiada hasta ahora, el
ensamblaje de la cadena de carbono requiere los productos de tres
marcos de lectura abierta (ORFs). ORF1 codifica un sitio activo de
cetosintasa (KS) y un sitio activo de aciltransferasa (AT); ORF2
codifica una proteína similar al producto de ORF1, pero que carece
de los restos KS y AT; y ORF3 codifica una proteína discreta
portadora de acilo (ACP).
Streptomyces coelicolor produce el
poliquétido pigmentado en azul, actinorrodina. La agrupación de
genes de actinorrodina (act) ha sido clonada (Malpartida, F.
y Hopwood, D.A. Nature (1984) 309: 462; Malpartida, F.
y Hopwood, D.A. Mol. Gen. Genet. (1986) 205: 66) y ha
sido secuenciada por completo (Fernández-Moreno,
M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278;
Hallamet, S.E. et al. Gene (1988) 74: 305;
Fernández-Moreno, M.A. et al. Cell
(1991) 66: 769; Caballero, J. et al. Mol. Gen.
Genet. (1991) 230: 401). La agrupación codifica las
enzimas PKS arriba descritas, una ciclasa y una serie de enzimas
elaboradoras implicadas en reacciones de modificación subsiguientes
que conducen a actinorrodina, así como proteínas implicadas en la
exportación del antibiótico y al menos una proteína que activa
específicamente la transcripción de la agrupación de genes. Otros
genes requeridos para la regulación global de la biosíntesis de
antibióticos, así como para el suministro de unidades iniciadoras
(acetil-CoA) y extendedoras
(malonil-CoA) para la biosíntesis de poliquétidos,
están localizados en otros lugares del genoma.
La agrupación de genes act de S.
coelicolor se ha utilizado para producir actinorrodina en S.
parvulus. Mal-partida, F. y Hopwood, D.A.
Nature (1984) 309: 462, Bartel et al. J.
Bacteriol. (1990) 172: 4816-4826,
produjeron recombinantemente aloesaponarina II utilizando S.
galilaeus transformado con una agrupación de genes act de
S. coelicolor constituida por cuatro loci genéticos,
actI, actIII, actIV y actVII. Se han
diseñado también PKSs híbridas, que incluyen el conjunto de genes
act básico pero con genes ACP derivados de granaticina,
oxitetraciclina, tetracenomicina y frenolicina, que son capaces de
expresar sintasas funcionales. Khosla, C. et al. J.
Bacteriol. (1993) 175: 2197-2204.
Hopwood, D.A. et al. Nature (1985) 314:
642-644, describen la producción de poliquétidos
híbridos utilizando técnicas recombinantes. Sherman, D.H. et
al. J. Bacteriol. (1992) 174:
6184-6190, consigna la transformación de diversos
mutantes de S. coelicolor, que carecen de diferentes
componentes de la agrupación de genes PKS act, con los genes
correspondientes de granaticina (gra) de S.
violaceoruber, en trans.
Sin embargo, hasta la fecha nadie ha descrito la
producción recombinante de poliquétidos utilizando células
hospedadoras transformadas por ingeniería genética que carecen
sustancialmente de sus agrupaciones de genes PKS nativas
enteras.
La presente invención proporciona nuevos
poliquétidos y nuevos métodos de producción eficiente de
poliquétidos tanto nuevos como conocidos, utilizando tecnología
recombinante. En particular, se utiliza un nuevo sistema
hospedador-vector para producir PKSs que catalizan a
su vez la producción de una diversidad de poliquétidos. Tales
poliquétidos son útiles como antibióticos, agentes antitumorales,
inmunosupresores y para una gran diversidad de otros propósitos
farmacológicos.
De acuerdo con ello, en una realización, la
invención está dirigida a una célula transformada por ingeniería
genética que expresa una agrupación de genes de
poliquétido-sintasa (PKS) en su estado nativo, sin
transformar, careciendo la célula transformada por ingeniería
genética de la agrupación de genes PKS nativa entera.
En otra realización, la invención está dirigida a
la célula transformada por ingeniería genética como se ha descrito
arriba, en la cual la célula comprende:
(a) una agrupación de genes PKS de
reemplazamiento que codifica una PKS capaz de catalizar la síntesis
de un poliquétido; y
(b) una o más secuencias de control enlazadas
operativamente a la agrupación de genes PKS, con lo cual los genes
en la agrupación de genes pueden transcribirse y traducirse en la
célula transformada por ingeniería genética,
con la salvedad de que, cuando la agrupación de
genes PKS de reemplazamiento comprende un conjunto de genes PKS
entero, al menos uno de los genes PKS o elementos de control es
heterólogo a la célula.
En realizaciones particularmente preferidas, la
célula transformada por ingeniería genética es Streptomyces
coelicolor, y la célula carece sustancialmente de la agrupación
de genes PKS de actinorrodina entera nativa y la agrupación de genes
PKS de reemplazamiento comprende un primer gen que codifica un sitio
activo de PKS cetosintasa y un sitio activo de PKS aciltransferasa
(KS/AT), un segundo gen que codifica un factor PKS determinante de
la longitud de cadena (CLF), y un tercer gen que codifica una
proteína PKS portadora de acilo(ACP).
En otra realización, la invención está dirigida a
un método para producir un poliquétido recombinante que
comprende:
(a) proporcionar una población de células como se
ha descrito arriba; y
(b) cultivar la población de células en
condiciones por las cuales se expresa la agrupación de genes PKS de
reemplazamiento presentes en las células.
Se describe también en esta memoria un método
para producir un poliquétido recombinante utilizando células de la
invención que comprende:
a. insertar una primera porción de una agrupación
de genes PKS de reemplazamiento en un plásmido donante e insertar
una segunda porción de una agrupación de genes PKS de
reemplazamiento en un plásmido receptor, en donde las porciones
primera y segunda codifican colectivamente una agrupación de genes
PKS de reemplazamiento completa, y adicionalmente en donde:
- i.
- el plásmido donante expresa un gen que codifica un primer marcador de selección y es capaz de replicación a una primera temperatura permisiva e incapaz de replicación a una segunda temperatura no permisiva;
- ii.
- el plásmido receptor expresa un gen que codifica un segundo marcador de selección; y
- iii.
- el plásmido donante comprende regiones de DNA complementarias para regiones de DNA en el plásmido receptor, de tal modo que puede producirse recombinación homóloga entre la primera porción de la agrupación de genes PKS de reemplazamiento y la segunda porción de la agrupación de genes de reemplazamiento, con lo cual puede generarse una agrupación de genes de reemplazamiento completa;
b. transformar el plásmido donante y el plásmido
receptor en una célula hospedadora y cultivar la célula hospedadora
transformada a la primera temperatura permisiva y en condiciones que
permiten el crecimiento de células hospedadoras que expresan los
marcadores de selección primero y/o segundo, para generar una
primera población de células;
c. cultivar la primera población de células a la
segunda temperatura no permisiva y en condiciones que permiten el
crecimiento de células que expresan los marcadores de selección
primero y/o segundo, para generar una segunda población de células
que incluye células hospedadoras que contienen un plásmido
recombinante que comprende una agrupación de genes de
reemplazamiento PKS completa;
d. transferir el plásmido recombinante de la
segunda población de células a la célula modificada por ingeniería
genética de la reivindicación 1 para generar células modificadas por
ingeniería genética transformadas; y
e. cultivar las células modificadas por
ingeniería genética transformadas en condiciones en las cuales se
expresa la agrupación de genes PKS de reemplazamiento presentes en
las células.
Como se describe en esta memoria, un compuesto
poliquétido puede tener la fórmula estructural (I)
en la
cual:
R^{1} se selecciona del grupo constituido por
hidrógeno y alquilo inferior, y R^{2} se selecciona del grupo
constituido por hidrógeno, alquilo inferior y alquil-éster inferior,
o en la cual R^{1} y R^{2} juntos forman un puente de alquileno
inferior sustituido opcionalmente con uno a cuatro grupos hidroxilo
o alquilo inferior;
R^{3} y R^{5} se seleccionan
independientemente del grupo constituido por hidrógeno, halógeno,
alquilo inferior, alcoxi inferior, amino, amino mono- o
di-sustituido con alquilo inferior, y nitro;
R^{4} se selecciona del grupo constituido por
halógeno, acilo inferior, alcoxi inferior, amino, amino mono- o
di-sustituido con alquilo inferior, y nitro;
R^{6} se selecciona del grupo constituido por
hidrógeno, alquilo inferior, y -CHR^{7}-(CO)R^{8}, donde
R^{7} y R^{8} se seleccionan independientemente del grupo
constituido por hidrógeno y alquilo inferior; e
i es 1, 2, ó 3.
Otros poliquétidos pueden tener las
estructuras
Un compuesto poliquétido puede formarse por
ciclación catalítica de un quétido unido a una enzima que tiene la
estructura (II)
en la
cual:
R^{11} se selecciona del grupo constituido por
metilo, -CH_{2}(CO)CH_{3} y
-CH_{2}(CO)CH_{2}(CO)CH_{3};
R^{12} se selecciona del grupo constituido por
-S-E y
-CH_{2}(CO)-S-E, en donde E
representa una poliquétido-sintasa producida por las
células transformadas genéticamente arriba indicadas; y
uno de R^{13} y R^{14} es hidrógeno y el otro
es hidroxilo, o R^{13} y R^{14} representan juntos
carbonilo.
En otra realización adicional, la invención está
dirigida a un método para producir un poliquétido aromático, que
comprende efectuar la ciclación de un quétido unido a una enzima que
tiene la estructura (II), en la cual la ciclación es inducida por la
poliquétido-sintasa.
Un compuesto poliquétido puede tener la fórmula
estructural (III)
en la cual R^{2} y R^{4} son
como se define arriba e i es 0, 1 ó
2.
Un compuesto poliquétido puede tener la fórmula
estructural (IV)
en la cual R^{2}, R^{4} e i son
como se define arriba para la fórmula estructural
(III).
Un compuesto poliquétido puede tener la fórmula
estructural (V)
en la cual R^{2}, R^{4} e i son
como se define arriba para la fórmula estructural
(III).
Estas y otras realizaciones de la presente
invención se reconocerán fácilmente por quienes poseen una
experiencia ordinaria en la técnica teniendo en cuenta la exposición
hecha en esta memoria.
La Figura 1 muestra las agrupaciones de genes
para las PKSs y ciclasas act, gra y tcm.
La Figura 2 muestra la estrategia para la
producción de S. coelicolor CH999. La Figura 2A representa la
estructura de la agrupación de genes act presente en el
cromosoma de S. coelicolor CH1.La Figura 2B muestra la
estructura de pLRemEts y la Figura 2C muestra la porción del
cromosoma CH999 con la agrupación de genes act
delecionada.
La Figura 3 es un diagrama del plásmido pRM5.
La Figura 4 ilustra esquemáticamente la formación
de aloesaponarina II (2) y su análogo carboxilado, ácido
3,8-dihidroxi-1-metilantraquinona-2-carboxílico
(1) como se describe en el Ejemplo 3.
La Figura 5 proporciona las estructuras de
actinorrodina (3), granaticina (4), tetracenomicina (5) y mutactina
(6), a las que se hace referencia en el Ejemplo 4.
La Figura 6 ilustra esquemáticamente la
preparación, por ciclación de los precursores poliquétidos, de
aloesaponarina II (2), su análogo carboxilado, ácido
3,8-dihidroxi-1-metilantraquinona-2-carboxílico
(1), tetracenomicina (5) y el nuevo compuesto RM20 (9), como se
explica en el Ejemplo 4, parte (A).
La Figura 7 ilustra esquemáticamente la
preparación, por ciclación de los precursores poliquétidos, de
frenolicina (7), nanomicina (8) y actinorrodina (3).
La Figura 8 ilustra esquemáticamente la
preparación, por ciclación de los precursores poliquétidos, de los
nuevos compuestos RM20 (9), RM18 (10), RM18b (11), SEK4 (12), SEK15
(13), RM20b (14), RM20c (15) y SEK15b (16).
La Figura 9 representa el modelo genético para la
6-desoxieritronolida B-sintasa
(DEBS).
La Figura 10 muestra la estrategia para la
construcción de PKSs recombinantes modulares.
La Figura 11 es un diagrama del plásmido
pCK7.
La práctica de la presente invención empleará, a
no ser que se indique otra cosa, métodos convencionales de química,
microbiología, biología molecular y técnicas de DNA recombinante
comprendidas dentro de la experiencia en la técnica. Dichas técnicas
se explican plenamente en la bibliografía. Véase, v.g.,
Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (edición actual); DNA Cloning, A Practical
Approach, vol. I & II, (D. Glover, compilador;
Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, compilador, edición
actual); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S.
Higgins, compiladores, edición actual); Transcription and
Translation (B. Hames & S. Higgins, compiladores, edición
actual).
Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y
en las reivindicaciones del apéndice, las formas singulares
"un" y "el" incluyen referencias plurales a no ser que el
contexto dicte claramente lo contrario. Así, la referencia a "un
poliquétido" incluye mezclas de poliquétidos, la referencia a
"una poliquétido-sintasa" incluye mezclas de
poliquétido-sintasas, etcétera.
En la descripción de la presente invención, se
emplearán los términos siguientes, debiendo entenderse que se
definen como se indica a continuación.
Por "agrupación de genes PKS de
reemplazamiento" se entiende cualquier conjunto de genes PKS
capaces de producir una PKS funcional cuando se encuentran bajo la
dirección de uno o más elementos de control compatibles, como se
define más adelante, en una célula hospedadora transformada con
ellos. Una PKS funcional es una que cataliza la síntesis de un
poliquétido. La expresión "agrupación de genes PKS de
reemplazamiento" abarca uno o más genes que codifican las
diversas proteínas necesarias para catalizar la producción de un
poliquétido. Una "agrupación de genes PKS de reemplazamiento"
no precisa incluir la totalidad de los genes encontrados en la
agrupación correspondiente en la naturaleza. En lugar de ello, la
agrupación de genes precisa codificar únicamente los componentes de
PKS necesarios para catalizar la producción de un poliquétido
activo. Así, como se explica adicionalmente más adelante, si la
agrupación de genes incluye, por ejemplo, ocho genes en su estado
nativo y únicamente son necesarios tres de estos genes para
proporcionar un poliquétido activo, únicamente precisan estar
presentes estos tres genes. Adicionalmente, la agrupación puede
incluir genes PKS derivados de una sola especie, o puede ser híbrida
en la naturaleza con, v.g., un gen derivado de una agrupación para
la síntesis de un poliquétido particular reemplazado con un gen
correspondiente de una agrupación para la síntesis de otro
poliquétido. Las agrupaciones híbridas pueden incluir genes
derivados tanto de PKSs Tipo I como de Tipo II. Como se ha explicado
anteriormente, las PKSs de Tipo I incluyen varias proteínas
multifuncionales grandes que llevan, entre ellas, una serie de
sitios activos separados para cada paso de ensamblaje y modificación
de la cadena de carbono. Por el contrario, las PKSs de Tipo II
tienen una sola serie de sitios activos utilizados iterativamente.
Estas clasificaciones son bien conocidas. Véase, v.g., Hopwood, D.A.
y Khosla C. Secondary metabolites: their function and
evolution (1992), Wiley Chichester, Ciba Foundation Symposium
171) p. 88-112; Bibb, M.J. et al. EMBO
J. (1989) 8: 2727; Sherman, D.H. et al. EMBO
J. (1989) 8: 2717; Fernández-Moreno, M.A. et
al. J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278); Cortes, J.
et al. Nature (1990) 348: 176; Donadio, S.
et al. Science (1991) 252: 675; Macneil D.J.
et al. Gene (1992) 115: 119. En esta memoria se
ilustran agrupaciones híbridas y se describen adicionalmente más
adelante. Los genes incluidos en la agrupación de genes no precisan
ser genes nativos, sino que pueden ser mutantes o análogos de los
mismos. Los mutantes o análogos se pueden preparar por la deleción,
inserción o sustitución de uno o más nucleótidos de la secuencia
codificante. Técnicas para modificar secuencias de nucleótidos,
tales como la mutagénesis orientada, se describen, v.g., en Sambrook
et al., supra; DNA Cloning, Vols. I y II,
supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Una "agrupación de genes PKS de
reemplazamiento" puede contener también genes codificantes de
modificaciones para el poliquétido de núcleo catalizado por la PKS,
que incluyen, por ejemplo, genes codificantes de hidroxilasas,
metilasas u otras alquilasas, oxidasas, reductasas,
glicotransferasas, liasas, éster o amida-sintasas, y
diversas hidrolasas tales como esterasas y amidasas.
Como se explica con mayor detalle más adelante,
los genes incluidos en la agrupación de genes de reemplazamiento no
precisan encontrarse en el mismo plásmido o, si están presentes en
el mismo plásmido, pueden estar controlados por la misma o
diferentes secuencias de control.
Por "célula hospedadora transformada
genéticamente" se entiende una célula hospedadora en la cual la
agrupación de genes PKS nativa se ha delecionado utilizando técnicas
de DNA recombinante. Así, el término no abarcaría sucesos
mutacionales que ocurren en la naturaleza. Una "célula
hospedadora" es una célula derivada de un microorganismo
procariota o una línea de células eucariotas cultivada con una
entidad unicelular, la cual puede ser, o ha sido, utilizada como
receptor para vectores recombinantes que llevan las agrupaciones de
genes PKS de la invención. El término incluye la progenie de la
célula original que se ha transfectado. Se entenderá que puede no
ser necesario que la progenie de una sola célula parental sea
completamente idéntica en morfología o en complemento de DNA
genómico o total a la célula paterna original, debido a mutación
accidental o deliberada. La progenie de la célula parental que es
suficientemente similar a la célula originaria para ser
caracterizadas por la propiedad relevante, tal como la presencia de
una secuencia de nucleótidos codificante de una PKS deseada, se
incluye en la definición, y está abarcada por los términos
anteriores.
El término "heterólogo" como tal se refiere
a secuencias de ácido nucleico tales como secuencias codificantes y
secuencias de control, denota secuencias que no están asociadas
normalmente con una región de una construcción recombinante, y/o no
están asociadas normalmente con una célula particular. Así, una
región "heteróloga" de una construcción de ácido nucleico es un
segmento identificable de ácido nucleico dentro de o unido a otra
molécula de ácido nucleico que no se encuentra en asociación con la
otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una región heteróloga
de una construcción podría incluir una secuencia codificante
flanqueada por secuencias que no se encuentran en asociación con la
secuencia codificante en la naturaleza. Otro ejemplo de una
secuencia codificante heteróloga es una construcción en la cual la
secuencia codificante propiamente dicha no se encuentra en la
naturaleza (v.g., secuencias sintéticas que tienen codones
diferentes del gen nativo). Análogamente, una célula hospedadora
transformada con una construcción que no está presente normalmente
en la célula hospedadora podría considerarse heteróloga para los
propósitos de esta invención. Los sucesos de variación alélica o
mutacionales existentes naturalmente no dan lugar a DNA heterólogo,
tal como se utiliza en esta memoria.
Una "secuencia codificante" o una secuencia
que "codifica" una PKS particular, es una secuencia de ácido
nucleico que se transcribe (en el caso del DNA) y se traduce (en el
caso de mRNA) en un polipéptido in vitro o in vivo
cuando está puesta bajo el control de secuencias reguladoras
apropiadas. Los límites de la secuencia codificante están
determinados por un codón de partida en el término 5' "amino" y
un codón de parada de la traducción en el término 3' (carboxi). Una
secuencia codificante puede incluir, pero sin carácter limitante,
cDNA procedente de mRNA procariota o eucariota, secuencias de DNA
genómico procedentes de DNA procariota o eucariota, e incluso
secuencias de DNA sintéticas. Una secuencia de terminación de la
transcripción estará localizada usualmente en posición 3' respecto a
la secuencia codificante.
Una secuencia de "ácido nucleico" puede
incluir, pero sin carácter limitante, secuencias procariotas, mRNA
eucariota, cDNA procedente de mRNA eucariota, secuencias de DNA
genómico procedentes de DNA eucariota (v.g., de mamífero), e incluso
secuencias de DNA sintéticas. El término abarca también secuencias
que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de DNA y
RNA tales como, pero sin carácter limitante,
4-acetilcitosina,
8-hidroxi-N6-metiladenosina,
aziridinilcitosina, pseusoisocitosina,
5-(carboxihidroximetil)-uracilo,
5-fluorouracilo,
5-bromo-uracilo,
5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo,
5-carboxi-metilaminometiluracilo,
dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina,
1-metiladenina,
1-metilpseudouracilo,
1-metilguanina, 1-metilinosina,
2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina,
2-metilguanina, 3-metilcitosina,
5-metil-citosina,
N6-metiladenina, 7-metilguanina,
5-metilamino-metiluracilo,
5-metoxiaminometil-2-tiouracilo,
\beta-D-manosilqueosina,
5'-metoxicarbonilmetiluracilo,
5-metoxiuracilo,
2-metiltio-N6-isopenteniladenina,
éster metílico del ácido
uracil-5-oxiacético, ácido
uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina,
pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metiluracilo, éster metílico del ácido
N-uracil-5-oxiacético,
ácido uracil-5-oxiacético,
pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, y
2,6-diaminopurina. Una secuencia de terminación de
la transcripción está localizada usualmente en posición 3' respecto
a la secuencia codificante.
La expresión "secuencias de control" de DNA
hace referencia colectivamente a secuencias promotoras, sitios de
fijación de ribosoma, señales de poliadenilación, secuencias de
terminación de la transcripción, dominios reguladores situados aguas
arriba, intensificadores, y análogos, que proporcionan
colectivamente la transcripción y traducción de una secuencia
codificante en una célula hospedadora. No todas estas secuencias de
control precisan estar presentes siempre en un vector recombinante
con tal que el gen deseado sea susceptible de ser transcrito y
traducido.
La expresión "enlazado operativamente" hace
referencia a una disposición de elementos en la cual los componentes
así descritos están configurados de tal modo que realizan su función
usual. Así, las secuencias de control enlazadas operativamente a una
secuencia codificante son capaces de efectuar la expresión de la
secuencia codificante. Las secuencias de control no precisan ser
contiguas a la secuencia codificante, con tal que sean capaces de
actuar para dirigir la expresión de la misma. Así, por ejemplo,
secuencias interpuestas no traducidas pero transcritas pueden estar
presentes entre una secuencia promotora y una secuencia codificante,
y la secuencia promotora puede considerarse todavía "enlazada
operativamente" a la secuencia codificante.
Por "marcador de selección" se entiende
cualquier marcador genético que pueda utilizarse para seleccionar
una población de células que llevan el marcador en su genoma.
Ejemplos de marcadores de selección incluyen: marcadores
auxotróficos por los cuales las células se seleccionan por su
capacidad para crecer en medios mínimos con o sin un nutriente o
suplemento, v.g., timidina, ácido diaminopimélico o biotina;
marcadores metabólicos por los cuales las células se seleccionan por
su capacidad para crecer en medios mínimos que contienen el azúcar
apropiado como la única fuente de carbono o la capacidad de las
células para formar colonias coloreadas que contienen los colorantes
o sustratos cromógenos apropiados; y marcadores de resistencia a
fármacos por los cuales las células se seleccionan por su capacidad
para crecer en medios que contienen uno o más de los fármacos
apropiados, v.g., tetraciclina, ampicilina, kanamicina,
estreptomicina o ácido nalidíxico.
"Recombinación" es el reordenamiento de
secciones de secuencias de DNA entre dos moléculas de DNA. La
"recombinación homóloga" ocurre entre dos moléculas de DNA que
se hibridan en virtud de secuencias de nucleótidos homólogas o
complementarias presentes en cada molécula de DNA.
El término "alquilo" tal como se utiliza en
esta memoria hace referencia a un grupo de hidrocarburo saturado
ramificado o no ramificado de 1 a 24 átomos de carbono, tal como
metilo, etilo, n-propilo, isopropilo,
n-butilo, isobutilo, t-butilo,
octilo, decilo, tetradecilo, hexadecilo, eicosilo, tetracosilo y
análogos. Grupos alquilo preferidos en esta memoria contienen 1 a 12
átomos de carbono. El término "alquilo inferior" hace
referencia a un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono,
preferiblemente 1 a 4 átomos de carbono.
El término "alquileno", tal como se utiliza
en esta memoria, hace referencia a una cadena de hidrocarburo
difuncional saturada, ramificada o no ramificada, que contiene de 1
a 24 átomos de carbono, e incluye, por ejemplo, metileno
(-CH_{2}-), etileno (-CH_{2}-CH_{2}-),
propileno
(-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-),
2-metilpropileno
[-CH_{2}-CH(CH_{3})-CH_{2}-],
hexileno [-(CH_{2})_{6}-] y análogos. "Alquileno
inferior" hace referencia a un grupo alquileno de 1 a 6, más
preferiblemente 1 a 4, átomos de carbono.
El término "alcoxi", tal como se utiliza en
esta memoria, se refiere a un grupo alquilo unido a través de un
solo enlace éter terminal; es decir, un grupo "alcoxi" puede
definirse como -OR, donde R es alquilo tal como se define arriba. Un
grupo "alcoxi inferior" se refiere a un grupo alcoxi que
contiene 1 a 6, más preferiblemente 1 a 4, átomos de carbono.
"Halo" o "halógeno" hace referencia a
fluoro, cloro, bromo o yodo, y usualmente se refiere a sustitución
de un átomo de hidrógeno por halo en un compuesto orgánico. De los
halos, generalmente se prefieren cloro y fluoro.
"Opcional" u "opcionalmente" significa
que el suceso o circunstancia descrito a continuación puede ocurrir
o no, y que la descripción incluye casos en los cuales dicho suceso
o circunstancia ocurre y casos en que no lo hace. Por ejemplo, la
expresión "alquileno opcionalmente sustituido" significa que un
resto alquileno puede estar sustituido o no y que la descripción
incluye tanto alquileno no sustituido como alquileno en el cual
existe sustitución.
Fundamental para la presente invención es el
descubrimiento de un sistema hospedador-vector para
la producción recombinante eficiente tanto de poliquétidos nuevos
como de poliquétidos conocidos. En particular, la invención hace uso
de células transformadas por ingeniería genética que tienen sus
genes PKS existentes naturalmente, sustancialmente delecionados.
Estas células hospedadoras pueden estar transformadas con vectores
recombinantes, que codifican una diversidad de agrupaciones de genes
PKS, para la producción de poliquétidos activos. La invención
proporciona la producción de cantidades significativas de producto
en una etapa apropiada del ciclo de crecimiento. Los poliquétidos
así producidos pueden utilizarse como agentes terapéuticos, para
tratar cierto número de trastornos, que dependen del tipo de
poliquétido en cuestión. Por ejemplo, varios de los poliquétidos
producidos por el presente método encontrarán uso como
inmunosupresores, como agentes anti-tumor, así como
para el tratamiento de infecciones víricas, bacterianas y
parasitarias. La capacidad para producir recombinantemente
poliquétidos proporciona también una herramienta potente para
caracterización de PKSs y el mecanismo de sus acciones.
De un modo más particular, células hospedadoras
para la producción recombinante de los presentes poliquétidos pueden
derivarse de cualquier organismo que tenga capacidad de alojar una
agrupación de genes PKS recombinantes. Así, las células hospedadoras
de la presente invención pueden derivarse de organismos tanto
procariotas como eucariotas. Sin embargo, las células hospedadoras
preferidas son las construidas a partir de los actinomicetos, una
clase de bacterias miceliales que son productores abundantes de
cierto número de poliquétidos. Un género particularmente preferido
para uso con el presente sistema es Streptomyces. Así, por
ejemplo, S. ambofaciens, S. avermitilis, S.
azureus, S. cinnamonensis, S. coelicolor, S. curacoi,
S. erythraeus, S. fradiae, S. galilaeus. S. glaucescens, S.
hygroscopicus, S. lividans, S. parvulus, S. peucetius, S. rimosus,
S. roseofulvus, S. thermotolerans, S. violaceoruber, entre
otros, que proporcionarán células hospedadoras convenientes para la
presente invención, siendo preferido S. coelicolor. (Véase,
v.g., Hopwood, D.A. y Sherman, D.H. Ann. Rev. Genet. (1990)
24: 37-66; O'Hagan, D. The Polyketide
Metabolites (Ellis Horwood Limited, 1991), para una descripción
de diversos organismos productores de poliquétidos y sus productos
naturales.).
Las células arriba descritas se transforman
genéticamente por deleción de los genes PKS existentes naturalmente
de las mismas, utilizando técnicas estándar, por ejemplo por
recombinación homóloga. (Véase, v.g., Khosla, C. et al.
Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237). EN esta memoria se
ilustra una célula hospedadora de S. coelicolor transformada
por ingeniería genética. Las cepas nativas de S. coelicolor
producen una PKS que cataliza la biosíntesis del poliquétido
aromático actinorrodina (estructura 3, Figura 5). La nueva cepa,
S. coelicolor CH999 (Figura 2C y descrita en los ejemplos),
se construyó por deleción, mediante recombinación homóloga, de la
agrupación act entera natural del cromosoma de S.
coelicolor CH1 (Khosla, C. Molec. Microbiol. (1992)
6: 3237), una cepa que carece de plásmidos endógenos y que
lleva una mutación estable que bloquea la biosíntesis de otro
antibiótico pigmentado de S. coelicolor,
undecil-prodigiosina.
Las células hospedadoras descritas arriba pueden
transformarse con uno o más vectores, que codifican colectivamente
una serie PKS funcional. El o los vectores pueden incluir
combinaciones nativas o híbridas de subunidades PKS, o mutantes de
las mismas. Como se ha explicado arriba, la agrupación de genes de
reemplazamiento no precisa corresponder a la agrupación de genes
completa nativa, sino que precisa codificar únicamente los
componentes PKS necesarios para catalizar la producción de un
poliquétido. Por ejemplo, en cada PKS aromática de
Streptomyces estudiada hasta ahora, el ensamblaje de la
cadena de carbono requiere los productos de tres marcos de lectura
abiertos (ORFs). ORF1 codifica un sitio activo de cetosintasa (KS) y
un sitio activo de aciltransferasa (AT) (KS/AT); tal como se ilustra
en esta memoria, ORF2 codifica un factor determinante de la longitud
de cadena (CLF), una proteína similar al producto de ORF1 pero que
carece de los restos KS y AT; y ORF3 codifica una proteína discreta
portadora de acilo (ACP). Algunas agrupaciones de genes codifican
también una cetorreductasa (KR) y una ciclasa, implicadas en la
ciclación de la cadena principal de poliquétido naciente. (Véase la
Figura 1 para una representación esquemática de tres agrupaciones de
genes PKS.) Sin embargo, se ha encontrado que únicamente precisan
estar presentes KS/AT, CLF, y ACP para producir un poliquétido
identificable. Así, en el caso de PKSs aromáticas derivadas de
Streptomyces, estos tres genes, sin los otros componentes de
las agrupaciones nativas, pueden estar incluidos en uno o más
vectores recombinantes, para constituir una agrupación de genes PKS
de reemplazamiento "mínima".
Adicionalmente, el o los vectores recombinantes
pueden incluir genes de una sola agrupación de genes PKS, o pueden
comprender agrupaciones de genes PKS de reemplazamiento híbridas
con, v.g., un gen para una sola agrupación reemplazado por el gen
correspondiente de otra agrupación de genes. Por ejemplo, se ha
encontrado que las ACPs son fácilmente intercambiables entre
sintasas diferentes sin que se produzca efecto alguno sobre la
estructura del producto. Adicionalmente, una KR dada puede reconocer
y reducir cadenas de poliquétido de diferentes longitudes de cadena.
De acuerdo con ello, estos genes son libremente intercambiables en
las construcciones descritas en esta memoria. Así, las agrupaciones
de reemplazamiento de la presente invención pueden derivarse de
cualquier combinación de series de genes PKS que funcione
últimamente para producir un poliquétido identificable.
Ejemplos de agrupaciones de reemplazamiento
híbridas incluyen agrupaciones con genes derivados de dos o más de
la agrupación de genes act y agrupaciones de genes de
frenolicina (fren), granaticina (gra), tetracenomicina
(tcm), ácido 6-metilsalicílico
(6-msas), oxitretraciclina (otc),
tetraciclina (tet), eritromicina (ery), griseusina,
nanaomicina, medermicina, daunorrubicina, tilosina, carbomicina,
espiramicina, avermectina, monensina, nonactina, curamicina,
rifamicina y candicidina-sintasa, entre otras. (Para
una exposición de diversas PKSs, véase, v.g., Hopwood, D.A. y
Sherman, D.H. Ann. Rev. Genet. (1990) 24:
37-66; O'Hagan, D. The Polyketide Metabolites
(Ellis Horwood Limited, 1991.)
Más particularmente, se han construido en esta
invención varias agrupaciones de genes híbridos, que tienen
componentes derivados de las agrupaciones de genes act, fren,
tcm y gra, como se representa en las Tablas 1 y 2.
Varias de las agrupaciones híbridas eran capaces
de expresar funcionalmente poliquétidos tanto nuevos como conocidos
en S. coelicolor CH999 (descrito arriba). Sin embargo, otras
agrupaciones de genes híbridas, como se han descrito arriba, pueden
producirse y escrutarse fácilmente utilizando la descripción de esta
memoria, para la producción de poliquétidos identificables. Por
ejemplo, una genoteca de homólogos de ORF1 y 2 clonados
aleatoriamente, a partir de una colección de actinomicetos, podría
construirse y escrutarse respecto a poliquétidos identificables.
Poliquétidos más largos podrían ciclarse también reemplazando, v.g.,
un gen de ciclasa act, gra, fren o tcm con un
homólogo de una agrupación de genes PKS que produce una cadena de la
longitud correcta. Finalmente, existe un grado considerable de
variabilidad para unidades iniciales distintas de acetato entre
ciertas PKSs aromáticas existentes naturalmente; así, estas unidades
pueden utilizarse también para obtener nuevos poliquétidos por
ingeniería genética.
Adicionalmente, los vectores recombinantes pueden
incluir genes de una agrupación de genes PKS modular. Tales
agrupaciones de genes se describen con mayor detalle más
adelante.
Los vectores recombinantes, que alojan las
agrupaciones de genes arriba descritas, pueden generarse
convenientemente utilizando métodos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, las subunidades PKS de interés pueden obtenerse a partir de
un organismo que expresa las mismas, utilizando métodos
recombinantes, por ejemplo por escrutinio de genotecas de cDNA o
genómicas, derivadas de células que expresan el gen, o por
derivación del gen a partir de un vector conocido que incluye el
mismo. El gen puede aislarse y combinarse luego con otras
subunidades PKS deseadas, utilizando técnicas estándar. Sí el gen en
cuestión está ya presente en un vector de expresión adecuado, el
mismo puede combinarse in situ con, v.g., otras subunidades
PKS, en caso deseado. El gen de interés puede producirse también
sintéticamente, en lugar de clonarse. La secuencia de nucleótidos
puede diseñarse con los codones apropiados para la secuencia de
aminoácidos particular deseada. En general, se seleccionarán codones
preferidos para el hospedador propuesto en el cual se expresará la
secuencia. La secuencia completa se ensambla a partir de
oligonucleótidos solapantes preparados por métodos estándar y
ensamblados en una secuencia codificante completa. Véase, v.g., Edge
(1981) Nature 292: 756; Nambair et al. (1984)
Science 223: 1299; Jay et al. (1984) J.
Biol. Chem. 259: 6311.
Pueden hacerse mutaciones a las secuencias de
subunidades PKS nativas, y tales mutantes pueden utilizarse en lugar
de la secuencia nativa, con tal que los mutantes sean capaces de
funcionar con otras subunidades PKS para catalizar colectivamente la
síntesis de un poliquétido identificable. Tales mutaciones pueden
hacerse a las secuencias nativas utilizando técnicas convencionales
tales como por preparación de oligonucleótidos sintéticos que
incluyen las mutaciones e inserción de la secuencia mutada en el gen
que codifica una subunidad PKS utilizando digestión con
endonucleasas de restricción. (Véase, v.g., Kunkel, T.A.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 448;
Geisselsoder et al. Biotechniques (1987) 5:
786.) Alternativamente, las mutaciones pueden efectuarse utilizando
un iniciador desapareado (generalmente de 10 a 20 nucleótidos de
longitud) que se hibrida a la secuencia nucleotídica nativa
(generalmente cDNA correspondiente a la secuencia de RNA), a una
temperatura inferior a la temperatura de fusión del dúplex
desapareado. El iniciador puede hacerse específico por mantenimiento
de la longitud de iniciador y la composición de bases dentro de
límites relativamente estrechos y mantenimiento de la base mutante
localizada centralmente. Zoller y Smith, Methods Enzymol.
(1983) 100: 468. La extensión con iniciadores se efectúa
utilizando DNA-polimerasa, el producto clonado y
clones que contienen el DNA mutado, derivados por segregación de la
cadena extendida con iniciadores, seleccionada. La selección puede
realizarse utilizando el iniciador mutante como la sonda de
hibridación. La técnica es aplicable también para generar mutaciones
de puntos múltiples. Véase, v.g.,
Dalbie-McFarland et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1982) 79: 6409. La mutagénesis por PCR
encontrará uso también para efectuar las mutaciones deseadas.
Las secuencias de genes que codifican
colectivamente una agrupación de genes PKS de reemplazamiento,
pueden insertarse en uno o más vectores de expresión, utilizando
métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los vectores de
expresión incluirán secuencias de control enlazadas operativamente a
la secuencia codificante PKS deseada. Sistemas de expresión
adecuados para uso con la presente invención incluyen sistemas que
funcionan en células hospedadoras eucariotas y procariotas. Sin
embargo, como se ha explicado anteriormente, se prefieren los
sistemas procariotas, y en particular, son especialmente
interesantes sistemas compatibles con Streptomyces spp.
Elementos de control para uso en tales sistemas incluyen promotores,
que contienen opcionalmente secuencias operadoras, y sitios de
fijación de ribosoma. Productores particularmente útiles incluyen
secuencias de control derivadas de agrupaciones de genes PKS, tales
como uno o más promotores act. Sin embargo, otros promotores
bacterianos, tales como los derivados de enzimas metabolizantes de
azúcares, tales como galactosa, lactosa (lac) y maltosa,
encontrarán uso también en las presentes construcciones. Ejemplos
adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas
biosintéticas tales como triptófano (trp), el sistema
promotor de \beta-lactamasa (bla), PL del
bacteriófago lambda, y T5. Adicionalmente, promotores sintéticos,
tales como el promotor tac (Patente U.S. No. 4.551.433), que
no existen en la naturaleza funcionan también en células
hospedadoras bacterianas.
Pueden ser deseables también otras secuencias
reguladoras que permiten la regulación de la expresión de las
secuencias de reemplazamiento PKS con relación al crecimiento de la
célula hospedadora. Secuencias reguladoras son conocidas por los
expertos en la técnica, y ejemplos incluyen aquéllas que hacen que
la expresión de un gen se encienda o se apague en respuesta a un
estímulo químico o físico, con inclusión de la presencia de un
compuesto regulador. Otros tipos de elementos reguladores pueden
estar presentes también en el vector, por ejemplo, secuencias
intensificadoras.
Pueden incluirse también marcadores
seleccionables en los vectores de expresión recombinantes. Se
conocen una diversidad de marcadores que son útiles en la selección
de líneas de células transformadas, y comprenden generalmente un gen
cuya expresión confiere un fenotipo seleccionable a las células
transformadas cuando las células crecen en un medio selectivo
apropiado. Marcadores de este tipo incluyen, por ejemplo, genes que
confieren resistencia a antibióticos o sensibilidad al plásmido.
Alternativamente, varios poliquétidos están coloreados naturalmente,
y esta característica proporciona un marcador incorporado para
seleccionar células transformadas con éxito por las presentes
construcciones.
Las diversas subunidades PKS de interés pueden
clonarse en uno o más vectores recombinantes como casetes
individuales, con elementos de control separados, o bajo el control
de, v.g., un solo promotor. Las subunidades PKS pueden incluir
sitios de restricción flanqueantes que permiten la deleción e
inserción fáciles de otras subunidades PKS de tal modo que puedan
generarse PKSs híbridas. El diseño de sitios de restricción
singulares de este tipo es conocido por los expertos en la técnica y
puede realizarse utilizando los métodos arriba descritos, tales como
mutagénesis orientada y PCR.
Utilizando estas técnicas, se construyó un
plásmido nuevo, pRM5 (Figura 3 y Ejemplo 2) como un vector lanzadera
para la producción de los poliquétidos descritos en esta memoria. El
plásmido pRM5 incluye los genes act que codifican las
subunidades PKS KS/AT (ORF1), CLF (ORF2) y ACP (ORF3), flanqueadas
por sitios de restricción PacI, NsiI y XbaI.
Así, pueden emplearse fácilmente subunidades PKS análogas,
codificadas por otros genes PKS, en sustitución de los genes
act existentes. (Véase, v.g., el Ejemplo 4, que
describe la construcción de vectores híbridos utilizando pRM5 como
el plásmido originario). El plásmido lanzadera contiene también el
gen KR act (actIII), el gen de ciclasa
(actVII), y un gen supuesto de deshidratasa (actIV),
así como un replicón ColEI (que permite la transformación de
E. coli), un replicón de Streptomyces SCP2'' truncado
adecuadamente (de número de copias bajo), y el gen activador
actII-ORF4 de la agrupación act, que
induce la transcripción de los promotores act durante la
transición desde la fase de crecimiento a la fase estacionaria en el
micelio vegetativo. pRM5 lleva el par de promotores divergente
actI/actIII.
Métodos para introducción de los vectores
recombinantes de la presente invención en hospedadores adecuados son
conocidos por los expertos en la técnica e incluyen típicamente el
uso de CaCl_{2} u otros agentes, tales como cationes bivalentes y
DMSO. También puede introducirse DNA en células bacterianas por
electroporación. Una vez que se han expresado las PKSs, las colonias
productoras de poliquétidos pueden identificarse y aislarse
utilizando métodos conocidos. Los poliquétidos producidos pueden
caracterizarse entonces adicionalmente.
Como se ha explicado arriba, los métodos
recombinantes arriba descritos encuentran también utilidad en la
biosíntesis catalítica de poliquétidos por PKSs modulares grandes.
Por ejemplo, la 6-desoxieritronolida
B-sintasa (DEBS) cataliza la biosíntesis de la
eritromicina-aglicona,
6-desoxieritronolida B (17). Tres marcos de lectura
abierta (eryAI, eryAII, y eryAIII) codifican los
polipéptidos DEBS y abarcan 32 kb en la agrupación de genes
ery del genoma de
Saccharopolyspora erythraea. Los genes están organizados en seis unidades repetitivas, designada cada una un "módulo". Cada módulo codifica una serie de sitios activos que, durante la biosíntesis del poliquétido, cataliza la condensación de un monómero adicional sobre la cadena en crecimiento. Cada módulo incluye una aciltransferasa (AT), proteína-sintasa portadora de \beta-cetoacilo (KS), y proteína portadora de acilo (ACP) así como una subserie de sitios activos reductores (\beta-cetorreductasa (KR), deshidratasa (DH), enoil-reductasa (ER)) (Figura 9). El número de sitios de reducción dentro de un módulo corresponde a la magnitud de \beta-cetorreducción en cada ciclo de condensación. La tioesterasa (TE) codificada al final del módulo parece catalizar la formación de lactona.
Saccharopolyspora erythraea. Los genes están organizados en seis unidades repetitivas, designada cada una un "módulo". Cada módulo codifica una serie de sitios activos que, durante la biosíntesis del poliquétido, cataliza la condensación de un monómero adicional sobre la cadena en crecimiento. Cada módulo incluye una aciltransferasa (AT), proteína-sintasa portadora de \beta-cetoacilo (KS), y proteína portadora de acilo (ACP) así como una subserie de sitios activos reductores (\beta-cetorreductasa (KR), deshidratasa (DH), enoil-reductasa (ER)) (Figura 9). El número de sitios de reducción dentro de un módulo corresponde a la magnitud de \beta-cetorreducción en cada ciclo de condensación. La tioesterasa (TE) codificada al final del módulo parece catalizar la formación de lactona.
Debido a los grandes tamaños de eryAI,
eryAII, y eryAIII, y a la presencia de sitios activos
múltiples, estos genes pueden clonarse convenientemente en un
plásmido adecuado para expresión en una célula hospedadora
transformada por ingeniería genética, tal como CH999, utilizando una
técnica de recombinación in vivo. Esta técnica, descrita en
el Ejemplo 5 y resumida en la Figura 10, utiliza derivados del
plásmido pMAK705 (Hamilton et al. (1989) J. Bacteriol.
171: 4617) que permiten la recombinación in vivo entre un
plásmido donante sensible a la temperatura, que es capaz de
replicación a una primera temperatura permisiva e incapaz de
replicación a una segunda temperatura no permisiva, y un plásmido
receptor. Los genes eryA así clonados dieron pCK7, un
derivado de pRM5 (McDaniel et al. (1993) Science 262:
1546). Se construyó un plásmido de control pCK7f, que llevaba una
mutación de cambio de marco en eryAI. pCK7 y pCK7f poseen un
replicón ColEI para manipulación genética en E. coli así como
un replicón de Streptomyces SCP2'' truncado (de número de
copias bajo). Estos plásmidos contienen también el par de promotores
divergente actI/actIII y
actII-ORF4, un gen activador, que se requiere
para transcripción de estos promotores y activa la expresión durante
la transición desde la fase de crecimiento a la fase estacionaria en
el micelio vegetativo. La expresión de alto nivel de los genes PKS
ocurre al comienzo de la fase estacionaria del crecimiento micelial;
las cepas recombinantes producen por consiguiente poliquétidos
"informadores" como metabolitos secundarios de una manera
cuasi-natural.
El método arriba descrito para producir
poliquétidos sintetizados por PKSs modulares grandes puede
utilizarse para producir otros poliquétidos como metabolitos
secundarios tales como azúcares, \beta-lactamas,
ácidos grasos, aminoglicósidos, terpinoides, péptidos no
ribosómicos, hormonas prostanoides, etcétera.
Utilizando los métodos recombinantes anteriores,
se han producido varios poliquétidos. Estos compuestos tienen la
estructura general (I)
en la cual R^{1}, R^{2},
R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} e i son como se
define arriba. Un grupo de tales compuestos son aquéllos en los
cuales:
R^{1} es alquilo inferior, preferiblemente
metilo; R^{2}, R^{3} y R^{5} son hidrógeno; R^{6} es
-CHR^{7}-(CO)-R^{8}; e i es 0. Un segundo grupo
de tales compuestos son aquéllos en los cuales R^{1} y R^{6} son
alquilo inferior, preferiblemente metilo; R^{2}, R^{3} y R^{5}
son hidrógeno; e i es 0. Todavía un tercer grupo de tales compuestos
son aquéllos en los cuales: R^{1} y R^{2} están unidos uno a
otro para formar un puente alquileno inferior
-CHR^{9}-CHR^{10} en el cual R^{9} y R^{10}
se seleccionan independientemente del grupo constituido por
hidrógeno, hidroxilo y alquilo inferior, v.g.,
-CH_{2}-CHOH-; R^{3} y R^{5} son hidrógeno;
R^{6} es -CHR^{7}-(CO)-R^{8} donde R^{8}
es hidrógeno o alquilo inferior, v.g.,
-CH_{2}-(CO)-CH_{3}; e i es 0. Compuestos
específicos de este tipo incluyen los compuestos 9, 10 y 11
siguientes, a saber:
\vskip1.000000\baselineskip
Otros poliquétidos nuevos son aquéllos que tienen
la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de los compuestos 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15 y 16 se efectúa por ciclación de un poliquétido unido a
enzima que tiene la estructura (II)
en la cual R^{11}, R^{12},
R^{13} y R^{14} y E son como se define anteriormente en esta
memoria. Ejemplos de tales compuestos incluyen: un primer grupo en
el cual R^{11} es metilo y R^{12} es
-CH_{2}(CO)-S-E; un segundo
grupo en el cual R^{11} es -CH_{2}(CO)CH_{3} y
R^{12} es -S-E; un tercer grupo en el cual
R^{11} es -CH_{2}(CO)CH_{3} y R^{12} es
-CH_{2}(CO)-S-E; y un
cuarto grupo en el cual R^{11} es
-CH_{2}(CO)CH_{2}(CO)CH_{3} y
R^{12} es -CH_{2}(CO)-S-E
(véase la Figura 8 para ilustración de las
estructuras).
Las estructuras restantes abarcadas por la
fórmula genérica (I) -es decir, estructuras distintas de 9, 10 y 11-
se pueden preparar a partir de las estructuras 9, 10 ó 11 utilizando
métodos rutinarios de síntesis orgánica bien conocidas por los
expertos en la técnica de la química orgánica, v.g., como se
describe por H.O. House, Modern Synthetic Reactions, Segunda
Edición (Menlo Park, CA: The Benjamin/Cummings Publishing Company,
1972), o por J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions,
Mechanisms and Structure, 4ª edición (Nueva York:
Wiley-Interscience, 1992), cuyas descripciones se
incorporan por la presente por referencia. Típicamente, como será
apreciado por los expertos en la técnica, la incorporación de
sustituyentes en los anillos aromáticos implicará reacciones de
adición electrófila aromática simples. Las estructuras 12 y 13
pueden modificarse de una manera similar para producir
poliquétidos.
Adicionalmente, los métodos recombinantes
anteriores se han utilizado para producir compuestos poliquétidos
que tienen la estructura general (III)
la estructura general
(IV)
y la estructura general
(V)
Compuestos particularmente preferidos de las
fórmulas estructurales (III), (IV) y (V) son aquéllos en los cuales:
R^{2} es hidrógeno e i es 0.
A continuación se dan ejemplos de realizaciones
específicas para llevar a la práctica la presente invención. Los
ejemplos se ofrecen únicamente para propósitos ilustrativos, y no
tienen por objeto limitar en modo alguno el alcance de la presente
invención.
Se han realizado esfuerzos para asegurar
exactitud con respecto a los números utilizados (v.g., cantidades,
temperaturas, etc.), pero, por supuesto, debe tolerarse cierto
margen de error y desviación experimental.
Cepas bacterianas, plásmidos, y condiciones de
cultivo. Se utilizó S. coelicolor CH999 como hospedador
para transformación por todos los plásmidos. La construcción de esta
cepa se describe a continuación. Las manipulaciones de DNA se
realizaron en Escherichia coli MC1061. Los plásmidos se
sometieron a pasos en E. coli ET12567 (dam dcm hsds
Cm^{R}) (MacNeil, D.J. J. Bacteriol. (1988) 170:
5607) para generar DNA no metilado antes de la transformación de
S. coelicolor. Las cepas de E. coli se cultivaron en
condiciones estándar. Las cepas de S. coelicolor se
cultivaron sobre placas de agar R2YE (Hopwood, L.A. et al.
Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratory
manual. The John Innes Foundation: Norwich, 1985).
Manipulación de DNA y organismos. Se
realizó la reacción en cadena la polimerasa (PCR) utilizando
polimerasa Taq (Perkin Elmer Cetus) en condiciones recomendadas por
el fabricante de la enzima. Se utilizaron técnicas estándar in
vitro para las manipulaciones de DNA (Sambrook, et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (edición actual)). Se
transformó E. coli con un aparato de pulsación de E.
coli Bio-Rad utilizando protocolos
proporcionados por Bio-Rad. Se transformó S.
coelicolor por procedimientos estándar (Hopwood, D.A. et
al. Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratory
manual. The John Innes Foundation: Norwich, 1985) y se
seleccionaron los transformantes utilizando 2 ml de una capa
superpuesta de 500 mg/ml de tioestreptona.
Construcción de los plásmidos que contienen
PKSs recombinantes. Todos los plásmidos son derivados de pRM5,
descrito más adelante. Los genes PKS fren se amplificaron por
PCR con sitios de restricción 5' y 3' flanqueantes de los genes de
acuerdo con la localización de los sitios de clonación en pRM5 (es
decir, PacI-NsiI para ORF1, NsiI-XbaI para
ORF2, y XbaI-PstI para ORF3). Después de
la subclonación y secuenciación, se clonaron los fragmentos
amplificados en lugar de los fragmentos correspondientes en pRM5
para generar los plásmidos para transformación.
Producción y purificación de poliquétidos.
Para el escrutinio inicial, se dejaron crecer todas las cepas a 30ºC
como céspedes confluentes sobre 10-30 placas, cada
una de las cuales contenía aproximadamente 30 ml de agar como medio
durante 6-8 días. Se prepararon placas adicionales
en caso necesario para obtener material suficiente para la
caracterización completa. CH999 era un control negativo cuando se
escrutaba para poliquétidos potenciales. El agar se desmenuzó
finamente y se extrajo con acetato de etilo/1% ácido acético o
acetato de etilo:metanol (4:1)/1% ácido acético. El extracto
concentrado se sometió luego a evaporación súbita a través de una
columna de cromatografía con gel de sílice (Baker 40 mm) en acetato
de etilo/1% ácido acético. Alternativamente, el extracto se aplicó
a una columna Florisil (Fisher Scientific) y se eluyó con acetato de
etilo:etanol:ácido acético (17:2:1). La fracción primaria de color
amarillo se purificó ulteriormente por cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) utilizando un gradiente de acetonitrilo/agua/1%
ácido acético 20-60% en una columna preparativa de
fase inversa (C-18) (Beckman). La absorbancia se
monitorizó a 280 nm y 410 nm. En general, el rendimiento de producto
purificado a partir de estas cepas era aproximadamente 10 mg/l para
los compuestos 1 y 2 (Figura 4), y 5 mg/l para los compuestos 7 y 8
(Figura 7).
Se produjo y purificó SEK4 (12) como sigue. Se
cultivó CH999/pSEK4 en placas de agar 90 (-34 ml/placa) a 30ºC
durante 7 días. El agar se desmenuzó y se extrajo con acetato de
etilo/metanol (4/1) en presencia de 1% de ácido acético (3 x 1000
ml). Después de la eliminación del disolvente a vacío, se añadieron
200 ml de acetato de etilo que contenía 1% de ácido acético. El
precipitado se filtró y se desechó, y el disolvente se evaporó a
sequedad. La mezcla de productos se aplicó a una columna Florisil
(Fisher Scientific), y se eluyó con acetato de etilo que contenía 3%
de ácido acético. Se recogió la primera fracción de 100 ml, y se
concentró hasta 5 ml. Se añadió 1 ml de metanol, y la mezcla se
mantuvo a 4ºC durante una noche. El precipitado se recogió por
filtración, y se lavó con acetato de etilo para dar 850 mg de
producto puro. R_{f} = 0,48 (acetato de etilo con 1% de ácido
acético). Los resultados de la espectroscopia NMR sobre SEK4 se
consignan en la Tabla 4. FAB HRMS (NBA), M + H^{+}, m/e calculada
319,0818, m/e observada 319,0820.
Para producir SEK15 (13) y SEK15b (16), se
cultivó CH999/pSEK15 en placas de agar 90, y el producto se extrajo
de la misma manera que SEK4. La mezcla se aplicó a una columna
Florisil (acetato de etilo con 5% de ácido acético), y las
fracciones que contenían los productos principales se combinaron y
evaporaron a sequedad. Los productos se purificaron ulteriormente
utilizando HPLC preparativa de fase inversa C-18
(Beckman) (fase móvil: acetonitrilo/agua = gradiente 1/10 a 3/5 en
presencia de 1% de ácido acético). El rendimiento de SEK15, (13),
fue 250 mg. R_{f} = 0,41 (acetato de etilo con 1% de ácido
acético). Los resultados de la espectroscopia NMR sobre SEK4 se
consignan en la Tabla 4. FAB HRMS (NBA), M + H^{+}, m/e calculada
385,0923, m/e observada 385,0920.
Procedimientos de alimentación de
[1,2-^{13}C_{2}]-acetato. Se
inocularon dos matraces de 2 l, cada uno de los cuales contenía 400
ml de medio NMP modificado (Strauch, E. et al. Mol.
Microbiol. (1991) 5: 289) con esporas de S. coelicolor
CH999/pRM18, CH999/pSEK4 o CH999/pSEK15, y se incubaron en un
agitador de sacudidas a 30ºC y 300 rpm. Se añadieron a cada matraz
50 mg de
[1,2-^{13}C_{2}]-acetato de
sodio (Aldrich) al cabo de 72 y 96 horas. Después de 120 horas, se
agruparon los cultivos y se extrajeron con dos volúmenes de 500 ml
de acetato de etilo/1% ácido acético. Se retuvo la fase orgánica y
se realizó la purificación como se ha descrito arriba. Los datos de
^{13}C NMR indican aproximadamente un enriquecimiento de
2-3% para el producto de CH999/pRM18; un
enriquecimiento de 0,5-1% para SEK4 y un
enriquecimiento de 1-2% para SEK15.
Espectroscopia NMR. Todos los espectros se
registraron en un equipo Varian XL-400 excepto en lo
que se refiere al análisis HETCOR de RM18 (10) (Figura 8), que se
realizó en un equipo Nicolet NT-360. Los espectros
^{13}C se adquirieron con desacoplamiento continuo de protones de
banda ancha. Para los estudios NOE de RM18 (10), se empleó el método
de diferencia unidimensional. Todos los compuestos se disolvieron en
DMSO-d_{6} (Sigma, 99+ D % atómico) y los
espectros se referenciaron internamente al disolvente. Las
resonancias de hidroxilo se identificaron por adición de D_{2}O
(Aldrich, 99 D % atómico) y se comprobaron en cuanto a la
desaparición de señal.
Se construyó una célula hospedadora de S.
coelicolor, transformada genéticamente para eliminar la
agrupación de genes act nativa, y denominada CH999,
utilizando S. coelicolor CH1 (Khosla, C. Molec.
Microbiol. (1992) 6: 3237), utilizando la estrategia
representada en la Figura 2. (CH1 se deriva de S. coelicolor
B385 (Rudd, B.A.M. Genetics of Pigmented Secondary Metabolites in
Streptomyces coelicolor (1978), Ph. D. Thesis, Universidad de East
Anglia, Norwich, Inglaterra). CH1 incluye la agrupación de genes
act que codifica las enzimas implicadas en la biosíntesis y
exportación del poliquétido antibiótico actinorrodina. La agrupación
está constituida por los genes PKS, flanqueados por varios genes
biosintéticos post-PKS que incluyen los implicados
en la ciclación, aromatización, y adaptación química subsiguiente
(Figura 2A). Están presentes también los genes responsables de la
activación de la transcripción de los genes act. La
agrupación de genes act se delecionó de CH1 utilizando
recombinación homóloga como se describe en Khosla, C. et al.
Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237.
En particular, se construyó el plásmido pLRermEts
(Figura 2B) con las características siguientes: un replicón
ColEI procedente de pBR322, el replicón sensible a la
temperatura de pSG5 (Muth, G. et al. Mol. Gen. Genet.
(1989) 219: 341), marcadores de resistencia a ampicilina y
tioestreptona, y una casete de interrupción que incluía un fragmento
BamHI/XhoI de 2 kb desde el extremo 5' de la
agrupación act, un fragmento ermE de 1,5 kb (Khosla C.
et al. Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237), y un
fragmento SphI/PstI de 1,9 kb desde el extremo 3' de la
agrupación act. El fragmento 5' se extendía desde el sitio 1
de BamHI (Malpartida, F. y Hopwood D.E. Nature (1984)
309: 462; Malpartida, F. y Hopwood D.A. Mol. Gen. Genet.
(1986) 205: 66) aguas abajo a un sitio XhoI. El
fragmento 3' se extendía desde el sitio 20 de PstI aguas
arriba al sitio 19.2 de SphI
(Fernández-Moreno, M.A. et al. J. Biol.
Chem. (1992) 267: 19278). Los fragmentos 5' y 3'
(representados como DNA sombreado en la Figura 2) se clonaron en la
misma orientación relativa que en la agrupación act. Se
transformó CH1 con pLRermEts. El plásmido se curó subsiguientemente
de los transformantes candidato por aplicación en bandas no
selectiva a 39ºC. Se aislaron varias colonias que eran resistentes a
la lincomicina, sensibles a tioestreptona, e incapaces de producir
actinorrodina, y se comprobaron por transferencia Southern. Una de
ellas se designó CH999.
pRM5 (Figura 3) era el vector lanzadera utilizado
para la expresión de PKSs en CH999. El mismo incluye un replicón
ColEI que permite la transformación por ingeniería genética
en E. coli, un replicón de Streptomyces SCP2''
truncado adecuadamente (de bajo número de copias) y el gen activador
actII-ORF4 procedente de la agrupación
act, que induce transcripción por los promotores act
durante la transición desde la fase de crecimiento a la fase
estacionaria en el micelio vegetativo. Como se muestra en la Figura
3, pRM5 lleva el par de promotores divergente
actI/actIII, junto con sitios de clonación
convenientes para facilitar la inserción de una diversidad de genes
de PKS transformados por ingeniería genética aguas abajo de ambos
promotores. pRM5 carece del locus par de SCP2''; como resultado, el
plásmido es ligeramente inestable (aproximadamente 2% de pérdida en
ausencia de tioestreptona). Esta característica se introdujo
deliberadamente a fin de permitir una confirmación rápida de que
podría asignarse inequívocamente un fenotipo de interés a la PKS
mutante transportada por el plásmido. Las PKS recombinantes de pRM5
se expresan aproximadamente en la transición desde la fase
exponencial a la fase estacionaria de crecimiento, con rendimientos
satisfactorios.
Se construyó pRM5 como sigue. Un fragmento
SphI/HindIII de 10,5 kb de pIJ903 (que contenía una
porción del locus de fertilidad y el origen de replicación de SCP2''
así como el origen de replicación de colEI y el gen de
\beta-lactamasa de pBR327) (Lydiate, D.J.
Gene (1985) 35: 223) se ligó con una casete
HindIII/SphI del gen tsr de 1,5 kb para
producir pRM1. Se construyó pRM5 por inserción de los dos fragmentos
siguientes entre los sitios singulares HindIII y EcoRI
de pRM1: un fragmento HindIII/HpaI (romo) de 0,3 kb
que llevaba un terminador de la transcripción procedente del fago fd
(Khosla, C. et al. Molec. Microbiol. (1992) 6:
3237), y un fragmento de 10 kb de la agrupación act que se
extendía desde el sitio NcoI (1 kb aguas arriba del gen
activador actII-ORF4) (Hallam, S.E. et
al. Gene (1988) 74: 305;
Fernández-Moreno, M.A. et al. Cell
(1991) 66: 769; Caballero, J.M. Mol. Gen. Genet.
(1991) 230: 401) hasta el sitio PstI aguas abajo de
los genes actI-VII-IV
(Fernández-Moreno, M.A. et al. J. Biol.
Chem. (1992) 267: 19278).
Para facilitar la expresión de cualquier PKS
recombinante deseada bajo el control del promotor actI (que
es activado por el producto del gen
actII-ORF4), se incorporaron por ingeniería
genética sitios de restricción para PacI, NsiI,
XbaI, y PstI en el DNA de act en posiciones
intercistrónicas. En pRM5, así como en todos los restantes plásmidos
de expresión de PKS descritos en esta memoria, se clonaron los
alelos ORF1, 2, y 3 entre estos sitios como casetes transformadas
por ingeniería genética con sus propios RBSs.
En particular, en la mayoría de las agrupaciones
de genes de poliquétido-sintasas aromáticas
existentes naturalmente en actinomicetos, ORF1 y ORF2 están
acoplados por traducción. Con objeto de facilitar la construcción de
PKSs recombinantes, los alelos ORF1 y ORF2 utilizados en esta
memoria se clonaron como casetes independientes (desacopladas). Para
ORF1 de act, se transformó por ingeniería genética la
secuencia siguiente en pRM5:
CCACCGGACGAACGCATCGATTAATTAAGGAGGACCATCATG, donde la
secuencia escrita con negrita corresponde al DNA aguas arriba de la
región actI, TTAATTAA es el sitio de reconocimiento de
PacI, y ATG es el codón de partida de ORF1 act.
Se transformó por ingeniería genética la secuencia siguiente entre
ORF1 y ORF2 de act: NTGAATGCATGGAGGAGCCATCATG, donde
TGA y ATG son los codones de parada e iniciación de
ORF1 y ORF2, respectivamente, ATGCAT es el sitio de reconocimiento
por NsiI, y el reemplazamiento de N (A en DNA de act,
A o G en alelos de otras PKSs) con una C da como resultado el
desacoplamiento de traducción. Se modificó por ingeniería genética
la secuencia siguiente aguas abajo de ORF2 act: TAATCTAGA,
donde TAA es el codón de parada, y TCTAGA es el sitio de
reconocimiento por XbaI. Esto hizo posible la fusión de ORF1
y ORF2 de act (modificados por ingeniería genética como
anteriormente) a un sitio XbaI que había sido modificado por
ingeniería genética aguas arriba de ORF de act (Khosla, C.
et al., Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237). Como
control, se construyó pRM2, idéntico a pRM5, pero que carecía de
cualquiera de las secuencias incorporadas por ingeniería genética.
ORF1 y ORF2 en pRM2 están acoplados por traducción. La comparación
de los perfiles de producto de CH999/pRM2 y CH999/pRM5 reveló que la
estrategia de desacoplamiento aquí descrita no tenía influencia
detectable alguna sobre la distribución de productos o los niveles
de productos.
Se introdujo el plásmido pRM5 en S.
coelicolor CH999 utilizando técnicas estándar. (Véase, v.g.,
Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (edición actual.) CH999 transformado con pRM5 producía
una gran cantidad de material de color
pardo-amarillento. Los dos productos más abundantes
se caracterizaron por NMR y espectroscopia de masas como
aloesaponarina II (2) (Bartel, P.L. et al. J.
Bacteriol. (1990) 172: 4816) y su análogo carboxilado,
ácido
3,8-dihidroxi-1-metilantraquinona-2-carboxílico
(1) (Cameron, D.W. et al. Liebigs Ann. Chem. (1989)
7: 699) (Figura 4). Se supone que 2 se deriva de 1 por
descarboxilación no enzimática (Bartel, P.L. et al. J.
Bacteriol. (1990) 172: 4816). Los compuestos 1 y 2
estaban presentes en aproximadamente una relación molar 1:5.
Pudieron purificarse con facilidad aproximadamente 100 mg de la
mezcla a partir de 1 l de cultivo. El sistema
hospedador-vector CH999/pRM5 funcionaba por
consiguiente como era de esperar para producir cantidades
significativas de un metabolito de poliquétido estable, modificado
sólo mínimamente. La producción de 1 y 2 es consistente con el
camino propuesto de la biosíntesis de actinorrodina (Bartel, P.L.
et al. J. Bacteriol. (1990) 172: 4816). Ambos
metabolitos, como la cadena principal de actinorrodina, se derivan
de un poliquétido de 16 carbonos con una sola cetorreducción en
C-9.
Cuando se transformó CH999 con pSEK4, idéntico a
pRM5 excepto en lo referente al reemplazamiento de un fragmento
SphI/SalI de 140 pb dentro del gen KR act por el
fragmento SphI/SalI de pUC19, la cepa resultante
producía cantidades abundantes del poliquétido aromático SEK4 (12).
La estructura exacta de este producto es ligeramente diferente de la
desoxieritrolaccina (Bartel, P.L. et al. J. Bacteriol.
(1990) 172: 4816). Sin embargo, estudios de marcación con
isótopos in vivo utilizando acetato marcado con
1,2-^{13}C_{2} confirmaron que la cadena
principal del poliquétido se deriva de 8 acetatos. Además, la región
aromática del espectro ^{1}H, así como el espectro ^{13}C NMR de
este producto, son consistentes con una estructura tricíclica
similar a 1, pero que carece de cualquier cetorreducción (véase
Tabla 4).
La Figura 1 muestra las PKSs responsables de la
síntesis de las columnas vertebrales de la cadena de carbono de
actinorrodina (3), granaticina (4), y tetracenomicina (5)
(estructuras que se muestran en la Figura 5) que contienen
subunidades homólogas supuestas KS/AT y ACP, así como el producto de
ORF2. Las PKSs act y gra tienen también KRs, que están
ausentes en la PKS tcm. Proteínas correspondientes de cada
agrupación exhiben un alto grado de identidad de secuencia. Las
identidades porcentuales entre las proteínas PKS correspondientes en
las tres agrupaciones son como sigue: KS/AT: act/gra 76,
act/tcm 64, gra/tcm 70; CLF: act/gra 60,
act/tcm 58, gra/tcm 54; ACP: act/gra 60,
act/tcm 43, gra/tcm 44. Las PKSs act y
gra sintetizan cadenas principales idénticas de 16 carbonos
derivadas de 8 residuos acetato con una cetorreducción en
C-9 (Figura 6). En contraste, como se muestra
también en la Figura 6, la cadena principal de poliquétido
tcm difiere en la longitud total de la cadena de carbono (20
carbonos en lugar de 16), la falta de cualquier cetorreducción, y
regioespecificidad de la primera ciclación, que ocurre entre los
carbonos 9 y 14, en lugar de los carbonos 7 y 12 para act y
gra.
En un intento de generar nuevos poliquétidos, que
difieran en varias propiedades, así como para elucidar aspectos de
la programación de las PKSs aromáticas, se clonaron en pRM5 una
serie sistemática de agrupaciones de genes PKS mínimos, utilizando
diversas permutaciones de los productos génicos de ORF1 (codificante
de la subunidad KS/AT), ORF2 (codificante de la subunidad CLF) y
ORF3 (codificante de la subunidad ACP) de las agrupaciones de genes
act, gra y tcm en lugar de los genes act
actuales, como se muestra en la Tabla 1. Los plásmidos resultantes
se utilizaron para transformar CH999 como anteriormente.
El análisis de los productos de las PKSs
recombinantes que contenían diversas permutaciones entre KS/AT, el
producto ORF2, y subunidades ACP de las PKSs (conteniendo también
todas las construcciones los genes de act KR, ciclasa, y
deshidratasa) indicó que las sintasas podían agruparse en tres
categorías (Tabla 1): las que no producían poliquétido alguno; las
que producían el compuesto 1 (además de una pequeña cantidad de 2);
y las que producían un nuevo poliquétido 9 (designado RM20) (Figura
6). La estructura de 9 sugiere que el precursor de la cadena
principal de poliquétido de esta molécula se deriva de 10 residuos
acetato con una sola cetorreducción en la posición
C-9.
Con objeto de investigar la influencia de la
act KR sobre los patrones de reducción y ciclación de una
cadena de poliquétido heteróloga, se construyó también pSEK15, que
incluía los ORFs de tcm 1-3, pero carecía de
la act KR. (La deleción en el gen act KR en esta
construcción era idéntica a la indicada en pSEK4). El análisis de
CH999/pSEK15 dio como resultado el producto de la cadena de 20
carbonos, SEK15 (13) que se asemejaba, pero no era idéntico, a la
tetracenomicina C o sus productos de derivación. La espectroscopia
NMR era consistente también con una cadena principal de decaquétido
totalmente carente de reducción (véase la Tabla 4).
Todos los híbridos act/gra producían el
compuesto 1, consistente con las estructuras idénticas de los
poliquétidos de actinorrodina y granaticina supuestos. En todos los
casos en que pudo aislarse un producto a partir de un híbrido
tcm/act, la longitud de cadena del poliquétido era idéntica a
la del producto natural correspondiente a la fuente de ORF2. Esto
implica que el producto de ORF2, y no el ACP o KS/AT, controla la
longitud de la cadena de carbono. Adicionalmente, dado que todos los
poliquétidos producidos por los híbridos descritos en esta memoria,
excepto aquéllos que carecían de la KR (CH999/pSEK4 y CH999/pSEK15),
sufrían una sola cetorreducción, puede llegarse a la conclusión de
que: (i) la KR es no sólo necesaria sino también suficiente para que
ocurra la cetorreducción; (ii) esta reducción ocurre siempre en la
posición C-9 de la cadena principal del poliquétido
final (a contar desde el extremo carboxilo de la cadena); y (iii) si
bien los poliquétidos no reducidos pueden sufrir patrones de
ciclación alternativos, en las cadenas de poliquétido nacientes que
han sufrido cetorreducción, la regioquímica de la primera ciclación
esta dictada por la posición del hidroxilo resultante, con
indiferencia del modo en que ocurra esta ciclación en el producto no
reducido. Dicho de otro modo, la PKS tcm podía transformarse
por ingeniería genética para exhibir nueva especificidad de
ciclación por inclusión de una cetorreductasa.
Una característica notable de RM20 (9) es el
patrón de ciclaciones que siguen a la primera ciclación. El
aislamiento de mutactina (6) a partir de un mutante actVII
sugería que el producto actVII y su homólogo tcm
catalizan la ciclación del segundo anillo en la biosíntesis de la
actinorrodina (3) y la tetracenomicina (5), respectivamente
(Sherman, D.H. et al. Tetrahedron (1991) 47:
6029; Summers, R.G. et al. J. Bacteriol. (1992)
174: 1810). El patrón de ciclación de RM20 (9) es diferente
del de 1 y tetracenomicina F1, a pesar de la presencia del gen
actVII en pRM20 (9). Por consiguiente, parece ser que la
ciclasa act no puede ciclar cadenas de poliquétido más
largas.
Inesperadamente, la cepa que contenía la PKS
tcm mínima sola (CH999/pSEK33) producía dos poliquétidos,
SEK15 (13) y SEK15b (16), como se representa en la Figura 8, en
cantidades aproximadamente iguales. Los compuestos (13) y (16) se
aislaron también de CH999/pSEK15; sin embargo, se aislaron
cantidades mayores de compuesto (13) de esta construcción que del
compuesto (16).
SEK15b es un compuesto nuevo, cuya estructura se
dilucidó por una combinación de espectroscopia NMR, experimentos de
alimentación con
[1,2-^{13}C_{2}]-acetato de
sodio y espectroscopia de masas. Los resultados de ^{1}H y
^{13}C NMR indicaron que SEK15b estaba constituido por un resto
antraquinona no reducido y un resto pirona. Los experimentos de
alimentación con
[1,2-^{13}C_{2}]-acetato de
sodio confirmaron que la cadena de carbono de SEK15b se derivaba de
10 unidades acetato. Las constantes de acoplamiento calculadas a
partir del espectro ^{13}C NMR de la muestra enriquecida en SEK15b
facilitaron la asignación de picos. La espectroscopia de masas por
bombardeo de átomos rápidos (FAB) dio un peso molecular de 381 (M +
H^{+}), consistente con C_{20}H_{12}O_{8}. Se utilizó
intercambio de deuterio para confirmar la presencia de cada
hidroxilo en SEK15b.
Con objeto de identificar los grados de libertad
disponibles in vivo para una cadena de poliquétido naciente
para ciclación en ausencia de una ciclasa activa, se analizaron los
poliquétidos producidos por S. coelicolor recombinante
CH999/pRM37 (McDaniel et al. (1993), supra). Las
enzimas biosintéticas codificadas por pRM37 son la
cetosintasa/aciltransferasa tcm (KS/AT), el factor
determinante de la longitud de cadena (CLF) tcm, la proteína
portadora de acilo tcm (ACP), y la cetorreductasa de
act (KR).
Se descubrieron dos nuevos compuestos, RM20b (14)
y RM20c (15) (Figura 8) en el medio de cultivo de CH999/
pRM37, que había producido previamente RM20 (9). Las cantidades relativas de los tres compuestos recuperados fueron 3:7:1 (RM20:RM20b:RM20c). Las estructuras de (14) y (15) se dilucidaron por una combinación de espectroscopia de masas, espectroscopia NMR y experimentos de marcación de isótopos. Los espectros ^{1}H y ^{13}C NMR sugirieron que RM20b y RM20c eran diastereoisómeros, cada uno de los cuales contenía un resto pirona. Las rotaciones ópticas ([\alpha]_{D}^{20} se encontraban hacia +210,8º para RM20b (EtOH, 0,55%) y +78,0º para RM20c (EtOH, 0,33%). Los experimentos de alimentación con [1,2-^{13}C_{2}]-acetato de sodio confirmaron que la cadena de carbono de RM20b (y por inferencia la de RM20c) se derivaba de 10 unidades acetato. Se realizaron estudios de intercambio de deuterio a fin de identificar los picos ^{1}H-NMR correspondientes a los grupos hidroxilo potenciales tanto en RM20b como en RM20c. Las constantes de acoplamiento del protón se calcularon a partir de los resultados de experimentos ^{1}H NMR y de desacoplamiento unidimensional. En particular, el patrón de acoplamiento en la región situada campo arriba del espectro indicaba un sistema de espín de 5 protones de dos grupos metileno que rodeaban un protón de metino central de carbinol. La espectroscopia de masas por bombardeo de átomos rápidos (FAB) de alta resolución dio pesos moleculares de (519,0056) (M = Cs^{+}) para RM20b y 387,1070 (M + H^{+}) para RM20c, que es consistente con C_{20}H_{18}O_{8} (M + Cs^{+}, 519,0056; M + H^{+}, 387,1080). Sobre la base de estos datos, se asignaron las estructuras (14) y (15) (Figura 8) a RM20b y RM20c, respectivamente.
pRM37, que había producido previamente RM20 (9). Las cantidades relativas de los tres compuestos recuperados fueron 3:7:1 (RM20:RM20b:RM20c). Las estructuras de (14) y (15) se dilucidaron por una combinación de espectroscopia de masas, espectroscopia NMR y experimentos de marcación de isótopos. Los espectros ^{1}H y ^{13}C NMR sugirieron que RM20b y RM20c eran diastereoisómeros, cada uno de los cuales contenía un resto pirona. Las rotaciones ópticas ([\alpha]_{D}^{20} se encontraban hacia +210,8º para RM20b (EtOH, 0,55%) y +78,0º para RM20c (EtOH, 0,33%). Los experimentos de alimentación con [1,2-^{13}C_{2}]-acetato de sodio confirmaron que la cadena de carbono de RM20b (y por inferencia la de RM20c) se derivaba de 10 unidades acetato. Se realizaron estudios de intercambio de deuterio a fin de identificar los picos ^{1}H-NMR correspondientes a los grupos hidroxilo potenciales tanto en RM20b como en RM20c. Las constantes de acoplamiento del protón se calcularon a partir de los resultados de experimentos ^{1}H NMR y de desacoplamiento unidimensional. En particular, el patrón de acoplamiento en la región situada campo arriba del espectro indicaba un sistema de espín de 5 protones de dos grupos metileno que rodeaban un protón de metino central de carbinol. La espectroscopia de masas por bombardeo de átomos rápidos (FAB) de alta resolución dio pesos moleculares de (519,0056) (M = Cs^{+}) para RM20b y 387,1070 (M + H^{+}) para RM20c, que es consistente con C_{20}H_{18}O_{8} (M + Cs^{+}, 519,0056; M + H^{+}, 387,1080). Sobre la base de estos datos, se asignaron las estructuras (14) y (15) (Figura 8) a RM20b y RM20c, respectivamente.
Los datos de NMR ^{1}H y ^{13}C indicaron que
las constantes de acoplamiento entre H-9 y los
protones geminales en C-8 eran 12,1 ó 12,2 y 2,5 ó
2,2 Hz para RM20b o RM20c, respectivamente. Las constantes de
acoplamiento entre H-9 y los protones geminales en
C-10 eran 9,6 ó 9,7 y 5,7 ó 5,8 Hz para RM20b o
RM20c, respectivamente. Estos valores son típicos de un patrón de
acoplamiento J_{a,a} (J_{9a,8a} o J_{9a,10a}) y J_{a,e}
(J_{9a,8e} o J_{9a,10e}), e indican una posición axial para
H-9 tanto en RM20b como en RM20c. En contraste, los
desplazamientos químicos de los hidroxilos C-7 en
las dos moléculas eran 16,18 y 16,14 ppm para RM20b y RM20c,
respectivamente. Estos valores indican un enlace de hidrógeno entre
el hidroxilo C-7 y un átomo aceptor posicionado
convenientemente en RM20b, pero no en RM20c. Los átomos aceptores
candidatos más probables para tal enlace de hidrógeno son el oxígeno
de carbonilo C-13 en el sistema de anillo conjugado
de pirona, o el oxígeno puente en el anillo de pirona aislado. Lo
primero parece verosímil dado que sería imposible discriminar entre
(14) y (15) si ocurriera lo último. Adicionalmente, la comparación
de los espectros ^{13}C NMR de RM20b y RM20c reveló que las
diferencias máximas entre (14) y (15) se encontraban en los
desplazamientos químicos de los carbonos que forman el anillo de
pirona conjugado (+5,9, -6,1, +8,9, -7,8 y 2,0 ppm para
C-11, C-12, C-13,
C-14 y C-15, respectivamente). Un
patrón de este tipo de desplazamientos alternativos campo arriba y
campo abajo puede explicarse por el hecho de que el hidroxilo
C-7 está unido por hidrógeno al carbonilo
C-13, dado que podría esperarse que el enlace de
hidrógeno reduzca la densidad electrónica alrededor de
C-11, C-13 y C-15,
pero aumente la densidad electrónica alrededor de
C-12 y C-14. Para confirmar la
asignación del enlace de hidrógeno
C-7/C-13, los protones
intercambiables RM20b y RM20c se reemplazaron con deuterio (por
incubación en presencia de D_{2}O), y las muestras se analizaron
por ^{13}C NMR. El pico C-13 en RM20b, pero no en
RM20c, sufrió un desplazamiento campo arriba (1,7 ppm), lo que puede
explicarse por un enlace no covalente
C-7/C-13 más débil en RM20b cuando
se reemplaza el hidrógeno con deuterio. Para formar un enlace de
hidrógeno con el carbonilo C-13, el hidroxilo
C-7 de RM20b tiene que ocupar la posición
ecuatorial. Así, puede inferirse que los hidroxilos
C-7 y C-9 se encuentran en la misma
cara (syn) del sistema de anillos conjugado en el isómero
mayor (RM20b), mientras que se encuentran en caras opuestas
(anti) en el isómero menor (RM20c).
No pudo detectarse poliquétido alguno en
CH999/pRM15, /pRM35, y /pRM36. Así, solamente algunas combinaciones
ORF1-ORF2 son funcionales. Dado que cada subunidad
era funcional en al menos una sintasa recombinante, es improbable
que los problemas de expresión/plegamiento de proteínas sean la
causa. En lugar de ello, son explicaciones plausibles la asociación
imperfecta o inhibidora entre las diferentes subunidades de estos
complejos enzimáticos, o la biosíntesis de productos de cadena corta
(abortados) que se degradan rápidamente.
Streptomyces roseofulvus produce a la vez
frenolicina B (7) (Iwai, Y. et al. J. Antibiot. (1978)
31: 959) y nanaomicina A (8) (Tsuzuki, K. et al. J.
Antibiot. (1986) 39: 1343). Un fragmento de DNA de 10 kb
(al que se hace referencia como el locus fren en lo sucesivo)
se clonó a partir de una genoteca genómica de S. roseofulvus
(Bibb, M.J. et al. presentado) utilizando DNA que
codificaba los componentes KS/AT y KR de la PKS act de S.
coelicolor A3(2) como sonda (Malpartida, F. et al.
Nature (1987) 325: 818). (Véase la Figura 7 para las
representaciones estructurales.) La secuenciación de DNA del locus
fren reveló la existencia de (entre otros) genes con un alto
grado de identidad respecto a los que codificaban KS/AT, CLF, ACP,
KR y ciclasa act.
Para producir los nuevos poliquétidos, los genes
act de ORF1, 2 y 3 presentes en pRM5 se reemplazaron con los
genes fren correspondientes, como se muestra en la Tabla 2.
S. coelicolor CH999, construido como se ha descrito arriba,
se transformó con estos plásmidos. (Los genes codificantes de la KR
act, y la ciclasa act estaban presentes también en
cada una de estas construcciones genéticas.) Basándose en los
resultados de experimentos similares con PKSs act y
tcm, arriba descritos, era de esperar que la KR act
fuera capaz de reducir los productos de todas las PKSs recombinantes
funcionales, mientras que la capacidad de la ciclasa act para
catalizar al segunda ciclación dependería de la longitud de cadena
del producto de la PKS fren.
Los resultados resumidos en la Tabla 2 indican
que la mayoría de los transformantes expresaban PKSs funcionales,
como se ensayó por su capacidad para producir poliquétidos
aromáticos. El análisis estructural de los productos principales
reveló que las cepas productoras podían agruparse en dos categorías:
las que sintetizaban el compuesto 1 (junto con una pequeña cantidad
de su producto secundario descarboxilado (2), y las que sintetizaban
una mezcla de compuestos, 1, 10 y 11 en una relación aproximada de
1:2:2. (Pequeñas cantidades de 2 se encontraron también en todas las
cepas que producían 1). Los compuestos 1 y 2 se habían observado
antes como productos naturales, y eran los metabolitos producidos
por una PKS constituida enteramente por subunidades act, como
se describe en el Ejemplo 3. Los compuestos 10 y 11 (designados RM18
y RM18b, respectivamente) son estructuras nuevas cuya síntesis
química o cuyo aislamiento como productos naturales no se ha
consignado previamente.
Las estructuras de 10 y 11 se dilucidaron por una
combinación de espectroscopia de masas, espectroscopia NMR, y
experimentos de marcación de isótopos. Las asignaciones espectrales
^{1}H y ^{13}C se muestran en la Tabla 3, junto con las
constantes de acoplamiento ^{13}C-^{13}C para 10
obtenidas por experimentos de alimentación con
[1,2-^{13}C_{2}]-acetato de
sodio (descritos más adelante). Se establecieron asignaciones
inequívocas para el compuesto 10 con estudios del efecto nuclear 1D
de Overhauser (NOE) y correlación heteronuclear de largo alcance
(HETCOR). El intercambio de deuterio confirmó la presencia de
hidroxilos en C-15 del compuesto 10 y
C-13 del compuesto 11. La espectrometría de masas
con desorción de campo (FD-MS) de 2 reveló un peso
molecular de 282, consistente con C_{17}H_{14}O_{4}
(282,
2952).
2952).
Estudios previos indicaron que la cadena
principal de poliquétido de 2 (Bartel, P.L. et al. J.
Bacteriol (1990) 172: 4816) (y por inferencia, 1) se
deriva de condensaciones iterativas de 8 residuos acetato con una
sola cetorreducción en C-9. Puede argumentarse
también que la nanaomicina (8) se produce a partir de una columna
vertebral de cadena de carbonos idéntica. Por consiguiente, es muy
probable que la nanaomicina sea un producto de los genes PKS
fren en S. roseofulvus. La regioespecificidad de la
primera ciclación que conduce a la formación de 1 está guiada por la
posición de la cetorreducción, mientras que la de la segunda
ciclación está controlada por ciclasa act (Zhang, H.L. et
al. J. Org. Chem. (1990) 55: 1682).
Con objeto de rastrear la columna vertebral de la
cadena de carbonos de RM18 (10), se realizaron experimentos de
alimentación in vivo utilizando
[1,2-^{13}C_{2}]-acetato sobre
CH999/pRM18, seguidos por análisis NMR de RM18 marcado (10). Los
datos de acoplamiento ^{13}C (resumidos en la Tabla 3) indican que
la cadena principal del poliquétido de RM18 (10) se deriva de 9
residuos acetato, seguidos por una descarboxilación terminal (la
resonancia ^{13}C en C-2 aparece como un singulete
intensificado), que se produce probablemente de modo no enzimático.
Adicionalmente, la ausencia de un grupo hidroxilo en la posición
C-9 sugiere que tiene lugar una cetorreducción en
este carbono. Dado que podría esperarse que estas dos
características ocurrieran en la cadena principal supuesta de
frenolicina (7), los resultados sugieren que, además de la síntesis
de nanaomicina, los genes PKS de fren son responsables de la
biosíntesis de frenolicina en S. roseofulvus. Este parece ser
el primer caso inequívoco de una PKS con especificidad de longitud
de cadena relajada. Sin embargo, al contrario que la cadena
principal supuesta de frenolicina, el carbonilo C-17
de RM18 (10) no está reducido. Esto podría, o bien reflejar la
ausencia de pRM18 de una cetorreductasa específica, deshidratasa, y
una enoilreductasa (presente en la agrupación de genes fren
en S. roseofulvus), o podría reflejar un origen diferente
para los carbonos 15-18 en frenolicina.
La regioespecificidad de la primera ciclación que
conduce a la formación de RM18 (10) está guiada por la posición de
la cetorreducción; sin embargo, la segunda ciclación ocurre de modo
diferente de lo que sucede en 7 ó 1, y es similar al patrón de
ciclación observado en RM20 (9), un decaquétido producido por la PKS
tcm, como se describe arriba. Por esta razón, como en el caso
de RM20 (9), podría argumentarse que la ciclasa act no puede
catalizar la segunda ciclación del precursor RM18, y que sus
ciclaciones subsiguientes, que se producen supuestamente por medios
no enzimáticos, están dictadas por diferencias temporales en la
liberación de porciones diferentes de la cadena naciente de
poliquétido en un ambiente acuoso. Teniendo en cuenta la capacidad
de CH999/pRM18 y CH999/pRM34) para producir 1, se puede descartar la
posibilidad de que la ciclasa no pueda asociarse con la PKS
fren (KS/AT, CLF, y ACP). Una explicación más probable es que
la ciclasa act no pueda reconocer sustratos de longitudes de
cadena alteradas. Esto podría ser consistente también con el esquema
biosintético supuesto para RM20
(9).
(9).
Una comparación de los perfiles de producto de
las sintasas híbridas consignadas en la Tabla 2 con híbridos
análogos entre los componentes PKS act y tcm (Tabla 1)
soporta la hipótesis de que el producto de ORF2 es el factor
determinante de la longitud de cadena (CLF). La preparación de los
compuestos 9, 10 y 11 por ciclación de quétidos unidos a enzimas se
ilustra esquemáticamente en la Figura 8.
Se construyeron plásmidos de expresión que
contenían genes PKS DEBS modulares recombinantes por transferencia
de DNA incrementalmente a partir de un plásmido "donante"
sensible a la temperatura, es decir, un plásmido capaz de
replicación a una primera temperatura permisiva e incapaz de
replicación a una segunda temperatura no permisiva, a un vector
"receptor" lanzadera por la vía de un suceso de doble
recombinación, como se representa en la Figura 10. Se construyó pCK7
(Figura 11), un plásmido lanzadera que contenía los genes
eryA completos, que se clonaron originalmente a partir de pS1
(Tuan et al. (1990) Gene 90: 21), como sigue.
Se insertó un fragmento SphI de 25,6 kb de pS1 en el sitio
SphI de pMAK705 (Hamilton et al. (1989) J.
Bacteriol. 171: 4617) para dar pCK6 (Cm^{R}), un
plásmido donante que contenía eryAII, eryAIII y el
extremo 3' de eryAI. La replicación de este derivado pSC101
sensible a la temperatura tiene lugar a 30ºC, pero se detiene a
44ºC. El plásmido receptor, pCK5 (Ap^{R}, Tc^{R}), incluye un
fragmento eryA de 12,2 kb desde el codón de partida de
eryAI (Caffrey et al. (1992) FEBS Lett.
304: 225) al sitio XcmI cerca del comienzo de
eryAII, un fragmento EcoRI-BsmI de 1,4 kb de
pBR322 que codifica el gen de resistencia a la tetraciclina
(Tc), y un fragmento NotI-EcoRI de 4,0 kb del
extremo de eryAIII. Se modificaron por ingeniería genética
PacI, NdeI y sitios de fijación de ribosoma en el codón
inicial de eryAI en pCK5. pCK5 es un derivado de pRM5
(McDaniel et al. (1993), supra). Las regiones de
homología (Figura 10, áreas rayadas y no sombreadas) tienen una
longitud de 4,1 kb y 4,0 kb, respectivamente. Se transformó E.
coli MC1061 (véase Sambrook et al., supra) con
pCK5 y pCK6, y se sometió a selección con carbenicilina y
cloranfenicol a 30ºC. Las colonias que albergaban ambos plásmidos
(Ap^{R}, Cm^{R}) se aplicaron luego nuevamente en bandas a 44ºC
sobre placas de carbenicilina y cloranfenicol. Únicamente los
materiales cointegrados formados por un solo suceso de recombinación
entre los dos plásmidos eran viables. Las colonias supervivientes se
propagaron a 30ºC bajo selección con carbenicilina, forzando la
resolución de los cointegrados por un segundo suceso de
recombinación. Para el enriquecimiento en recombinantes pCK7, las
colonias se aplicaron en bandas nuevamente sobre placas de
carbenicilina a 44ºC. Aproximadamente el 20% de las colonias
resultantes exhibían el fenotipo deseado (Ap^{R},
Tc^{S},Cm^{S}). Los candidatos pCK7 finales se comprobaron
concienzudamente por mapeado de restricción. Se construyó de una
manera similar un plásmido de control, pCK7f, que contiene un error
de cambio de marco en eryAI. pCK7 y pCK7f se transformaron en
E. coli ET12567 (MacNeil (1988) J. Bacteriol. 170:
5607) para generar DNA plasmídico no metilado y se desplazaron
subsiguientemente a Streptomyces coelicolor CH999 utilizando
protocolos estándar (Hopwood et al. (1985) Genetic
manipulation of Streptomyces. A laboratory manual. The John
Innes Foundation: Norwich).
Por crecimiento de CH999/pCK7 sobre medio R2YE,
el organismo produjo cantidades abundantes de dos poliquétidos
(Figura X). La adición de propionato (300 mg/l) al medio de
crecimiento dio como resultado un aumento aproximadamente al doble
en el rendimiento del producto poliquétido. La espectroscopia del
protón y ^{13}C NMR, en asociación con experimentos de
alimentación con ácido
propiónico-1-^{13}C, confirmaron
que el producto principal era 6dEB (17) (>40 mg/l). El producto
menor se identificó como 8,8a-desoxioleandolida (18)
(>10 mg/l), que se origina aparentemente a partir de una unidad
iniciadora acetato en lugar de propionato en el camino biosintético
de 6dEB. Los experimentos de alimentación con acetato de sodio
^{13}C_{2} confirmaron la incorporación de acetato en (18). Se
observaron también tres proteínas de peso molecular alto (>200
kDa), presumiblemente DEBS1, DEBS2, y DEBS3 (Caffrey et al.
(1992) FEBS Lett. 304: 225), en extractos brutos de
CH999/pKC7 por electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida. No se observó producto
poliquétido alguno a partir de CH999/pCK7f.
Así pues, se describen nuevos poliquétidos, junto
con métodos para producir recombinantemente los poliquétidos. Aunque
se han descrito con algún detalle realizaciones preferidas de la
presente invención, se entenderá que pueden hacerse variaciones
evidentes.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 900 Welch Road, Suite 650
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Palo Alto
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP) 94304-1850
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: JOHN INNES CENTRE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Colney Lane
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Norwich
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): NR4 7YH
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PRODUCCIÓN RECOMBINANTE DE NUEVOS POLIQUÉTIDOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco Flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: EP 94928169.5
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCACCGGACG AACGCATCGA TTAATTAAGG AGGACCATCA TG
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipNTGAATGCAT GGAGGAGCCA TCATG
\hfill25
Claims (18)
1. Una célula transformada por ingeniería
genética, célula que, en su estado nativo y no transformado, expresa
una agrupación de genes de poliquétido-sintasa
(PKS), careciendo dicha célula transformada por ingeniería genética
de la agrupación de genes PKS nativos entera.
2. La célula transformada por ingeniería genética
de la reivindicación 1, en la cual la célula es un actinomiceto.
3. La célula transformada por ingeniería genética
de la reivindicación 1, en la cual la célula es un
Streptomyces.
4. La célula transformada por ingeniería genética
de la reivindicación 1, en la cual la célula es un Streptomyces
coelicolor o Streptomyces lividans.
5. La célula de cualquiera de las
reivindicaciones 1-4 que contiene moléculas de ácido
nucleico, en la cual dichas moléculas comprenden una agrupación de
genes de poliquétido-sintasa (PKS) aromática
funcional como catalizadora de la síntesis de un poliquétido,
comprendiendo dicha agrupación de genes un primer marco de lectura
abierta (ORF) que codifica una PKS cetosintasa y una PKS
acetiltransferasa (KS/AT), un segundo ORF que codifica un factor
determinante de la longitud de cadena (CLF) de PKS, y un tercer ORF
que codifica una proteína PKS portadora de acilo (ACP), y uno o más
elementos de control enlazados operativamente a dicha agrupación de
genes PKS, con lo cual los ORFs pueden transcribirse y traducirse
para producir una PKS funcional,
en la cual al menos uno de los ORFs o elementos
de control es heterólogo a la célula.
6. La célula de la reivindicación 5, que
comprende adicionalmente un cuarto ORF que codifica una PKS
cetorreductasa (KR), o un cuarto ORF que codifica KR y un quinto ORF
que codifica una PKS ciclasa (CYC).
7. La célula de la reivindicación 5 ó 6, en la
cual la agrupación de genes PKS de reemplazamiento es una agrupación
de genes PKS híbrida, y en la cual los ORFs se derivan de al menos
dos series de genes PKS diferentes.
8. La célula de cualquiera de las
reivindicaciones 5-7, en la cual el ORF de PKS KS/AT
se selecciona del grupo constituido por un ORF KS/AT de
actinorrodina, un ORF KS/AT de granaticina, un ORF KS/AT de
tetracenomicina, un ORF KS/AT de frenolicina B, un ORF KS/AT de
oxitetraciclina, y un ORF KS/AT de griseusina; y/o
el ORF de PKS CLF se selecciona del grupo
constituido por un ORF CLF de actinorrodina, un ORF CLF de
granaticina, un ORF CLF de tetracenomicina, un ORF CLF de
frenolicina B, un ORF CLF de oxitetraciclina, y un ORF CLS de
griseusina; y/o
el ORF de PKS ACP se selecciona del grupo
constituido por un ORF ACP de actinorrodina, un ORF ACP de
granaticina, un ORF ACP de tetracenomicina, un ORF de ACP de
frenolicina B, un ORF ACP de oxitetraciclina, y un ORF ACP de
griseusina.
9. La célula de cualquiera de las
reivindicaciones 5-8, en la cual cada uno de dichos
ORFs primero, segundo y tercero están contenidos en casetes de
expresión separadas.
10. Un método para producir una PKS aromática
funcional que comprende:
(a) proporcionar una población de células de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-9;
y
(b) cultivar la población de células en
condiciones por las cuales se produce la PKS funcional.
11. Un método para producir un poliquétido,
método que comprende:
(a) proporcionar una población de células de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-9;
y
(b) cultivar la población de células en
condiciones por las cuales se produce una PKS funcional y en las
cuales dicha PKS funcional da como resultado la producción de un
poliquétido.
12. La célula de cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, que comprende adicionalmente
un plásmido recombinante que comprende:
un origen de replicación de
Streptomyces;
un promotor de una agrupación de genes de
poliquétido-sintasa (PKS) de Streptomyces;
y
un sitio de enzima de restricción enlazado al
promotor en una localización intercistrónica en donde un marco de
lectura abierto (ORF) insertado en el sitio de la enzima de
restricción puede transcribirse y traducirse en una célula
hospedadora,
en donde dicho plásmido recombinante comprende al
menos un ORF de un gen de PKS aromática insertado en dicho sitio de
enzima de restricción.
13. La célula de la reivindicación 12, en la cual
el origen de replicación de Streptomyces se selecciona del
grupo constituido por el origen de replicación de
Streptomyces SCP2* y el origen de replicación de
Streptomyces SCP2* que carece del locus par; y/o
en donde el promotor es un promotor de la
agrupación de genes PKSact; y/o
en donde el plásmido comprende adicionalmente un
gen activador.
14. La célula de la reivindicación 12 ó 13, en la
cual ORF se deriva de una agrupación de genes de actinorrodina, una
agrupación de genes de granaticina, una agrupación de genes de
oxitetraciclina, una agrupación de genes de tetracenomicina, una
agrupación de genes de frenolicina, una agrupación de genes de
tetraciclina, una agrupación de genes de griseusina, o una
agrupación de genes de daunorrubicina.
15. Un plásmido recombinante que comprende:
un origen de replicación de
Streptomyces;
un promotor de una agrupación de genes de
poliquetido-sintasa (PKS) de Streptomyces;
y
un sitio de enzima de restricción enlazado al
promotor en una localización intercistrónica en donde un marco de
lectura abierto (ORF) insertado en el sitio de la enzima de
restricción puede transcribirse y traducirse en una célula
hospedadora,
en donde dicho plásmido recombinante comprende al
menos un ORF de un gen de PKS aromática insertado en dicho sitio de
enzima de restricción.
16. El plásmido recombinante de la reivindicación
15, en el cual el origen de replicación de Streptomyces se
selecciona del grupo constituido por el origen de replicación de
Streptomyces SCP2* y el origen de replicación de
Streptomyces SCP2* que carece del locus par; y/o
en donde el promotor es un promotor de la
agrupación de genes PKS act; y/o
en donde el plásmido comprende adicionalmente un
gen activador.
17. El plásmido recombinante de la reivindicación
15 o la reivindicación 16, en el cual ORF se deriva de una
agrupación de genes de actinorrodina, una agrupación de genes de
granaticina, una agrupación de genes de oxitetraciclina, una
agrupación de genes de tetracenomicina, una agrupación de genes de
frenolicina, una agrupación de genes de tetraciclina, una agrupación
de genes de griseusina, o una agrupación de genes de
daunorrubicina.
18. El plásmido recombinante de cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17 que es pRM5, caracterizado por el
mapa de restricción que se muestra en la Figura 3.
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