ES2249782T3 - Produccion recombinante de nuevos poliquetidos. - Google Patents

Produccion recombinante de nuevos poliquetidos.

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Abstract

SE DESCRIBEN NUEVOS POLICETIDOS Y NUEVOS PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR DE FORMA EFICAZ POLICETIDOS NUEVOS Y CONOCIDOS, UTILIZANDO LA TECNOLOGIA RECOMBINANTE. EN PARTICULAR, SE DESCRIBE UN NUEVO SISTEMA DE HUESPED-VECTOR QUE SE UTILIZA PARA PRODUCIR POLICETIDO SINTASAS QUE A SU VEZ CATALIZAN LA PRODUCCION DE UNA DIVERSIDAD DE POLICETIDOS.

Description

Producción recombinante de nuevos poliquétidos.
Campo técnico
La presente invención se refiere generalmente a poliquétidos y poliquetido-sintasas. En particular, la invención se refiere a quimiotecas para la producción recombinante de una multiplicidad de poliquétidos.
Antecedentes de la invención
Los poliquétidos son una gran familia, estructuralmente diversa de productos naturales. Los poliquétidos poseen una extensa gama de actividades biológicas que incluyen propiedades antibióticas y farmacológicas. Por ejemplo, los poliquétidos están representados por antibióticos tales como tetraciclinas y eritromicina, agentes anticancerosos que incluyen daunomicina, inmunosupresores, por ejemplo FK506 y rapamicina, y productos veterinarios tales como monensina y avermectina.
Los poliquétidos existen en la mayoría de los grupos de organismos y son especialmente abundantes en una clase de bacterias miceliales, los actinomicetos, que producen diversos poliquétidos.
Las poliquetido-sintasas (PKSs) son enzimas multifuncionales afines a las sintasas de ácidos grasos (FASs). Las PKSs catalizan la biosíntesis de poliquétidos por condensaciones de Claisen repetidas (descarboxilantes) entre aciltioésteres, usualmente acetil-, propionil-, malonil- o metilmalonil-tioésteres. Después de cada condensación, aquéllas introducen variabilidad estructural en el producto por catalizar la totalidad, parte, o nada de un ciclo reductor que comprende cetorreducción, deshidratación, y enoil-reducción en el grupo \beta-ceto de la cadena de poliquétido en crecimiento. Las PKSs incorporan una diversidad estructural enorme en sus productos, además de variación del ciclo de condensación, por controlar la longitud global de la cadena, la elección de las unidades iniciadoras y extendedoras y, particularmente en el caso de los poliquétidos aromáticos, ciclaciones regioespecíficas de la cadena de poliquétido naciente. Después que la cadena de carbonos ha crecido hasta una longitud característica de cada producto específico, la misma se libera de la sintasa por tiólisis o acetiltransferencia. Así pues, las PKSs están constituidas por familias de enzimas que actúan juntamente para producir un poliquétido dado. Es la variación controlada en la longitud de cadena, la elección de las unidades de construcción de la cadena, y el ciclo reductor, genéticamente programado en cada PKS, lo que contribuye a la variación observada entre los poliquétidos existentes naturalmente.
Existen dos clases naturales de PKSs. Una clase, conocida como las PKSs de Tipo I, está representada por las PKSs para macrólidos tales como eritromicina. Estas PKSs "complejas" o "modulares" incluyen ensamblajes de varias proteínas funcionales grandes que llevan, entre ellas, una serie de sitios activos separados para cada paso de ensamblaje y modificación de la cadena de carbonos (Cortes, J. et al. Nature 1990 348: 176; Donadio, S. et al. Science (1991) 252: 675; MacNeil, D.J. et al. Gene (1992) 115: 119). La diversidad estructural se produce en esta clase debido a variaciones en el número y tipo de sitios activos en las PKSs. Esta clase de PKSs presenta una correlación de uno-a-uno entre el número y la agrupación de sitios activos en la secuencia primaria de la PKS y la estructura de la cadena principal del poliquétido.
La segunda clase de PKSs, denominada PKSs de Tipo II, está representada por las sintasas para compuestos aromáticos. Las PKSs de Tipo II tienen una serie única de sitios activos utilizados iterativamente (Bibb, M.J. et al. EMBO J. (1989) 8: 2727; Sherman, D.H. et al. EMBO J. (1989) 8: 2717; Fernández-Moreno, M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 277: 19278).
En contraste, las PKSs fúngicas, tales como la PKS del ácido 6-metilsalicílico, están constituidas por un solo polipéptido multi-dominio que incluye todos los sitios activos requeridos para la biosíntesis del ácido 6-metilsalicílico (Beck, J. et al. Eur. J. Biochem. (1990) 192: 487-498; Davis, R. et al. Abstr. of the Genetics of Industrial Microorganism Meeting, Montreal, abstr. P 288 (1994)).
Streptomyces es un actinomiceto que es un productor abundante de poliquétidos aromáticos. En cada PKS aromática de Streptomyces estudiada hasta ahora, el ensamblaje de la cadena de carbonos requiere los productos de tres marcos de lectura abiertos (ORFs). ORF1 codifica una cetosintasa (KS) y un sitio activo de aciltransferasa (AT); ORF2 codifica un factor determinante de la longitud de cadena (CLF) de PKS; y ORF3 codifica una proteína portadora de acilo discreta (ACP).
Streptomyces coelicolor produce el poliquétido pigmentado en azul, actinorrodina. La agrupación de genes de actinorrodina (act), ha sido clonada (Malpartida, F. y Hopwood, D.A. Nature (1984) 309: 462; Malpartida, F. y Hopwood, D.A. Mol. Gen. Genet. (1986) 205: 66) y secuenciada completamente (Fernández-Moreno, M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278; Hallam, S.E. et al. Gene (1988) 74: 305; Fernández-Moreno, M.A. et al. Cell (1991) 66: 769; Caballero, J. et al. Mol. Gen. Genet. (1991) 230: 401). La agrupación codifica las enzimas PKS arriba descritas, una ciclasa y una serie de enzimas adaptadoras implicadas en reacciones de modificación subsiguientes que conducen a actinorrodina, así como proteínas implicadas en la exportación del antibiótico y al menos una proteína que activa específicamente la transcripción de la agrupación de genes. Otros genes requeridos para la regulación global de la biosíntesis de antibióticos, así como para el suministro de unidades iniciadoras (acetil-CoA) y extendedoras (malonil-CoA) para la biosíntesis de poliquétidos, están localizadas en otros lugares del genoma.
La agrupación de genes act de S. coelicolor ha sido utilizada para producir actinorrodina en S. parvulus. Malpartida, F. y Hopwood, D.A. Nature (1984) 309: 462. Bartel et al. J. Bacteriol. (1990) 172: 4816-4826, produjeron recombinantemente aloesaponarina II utilizando S. galilaeus transformado con una agrupación de genes act de S. coelicolor constituida por cuatro loci genéticos, act I, act III, act IV y act VII. Han sido diseñadas también PKSs híbridas, con inclusión del conjunto de genes act básicos pero con genes ACP derivados de PKSs de granaticina, oxitetraciclina, tetracenomicina y frenolicina, que son capaces de expresar sintasas funcionales. Khosla, C. et al. J. Bacteriol. (1993) 175: 2197-2204. Hopwood, D.A. et al. Nature (1985) 314: 642-644, describen la producción de poliquétidos híbridos, utilizando técnicas recombinantes. Sherman, D.H. et al. J. Bacteriol (1992) 174: 6184-6190, informan de la transformación de diversos mutantes de S. coelicolor, que carecen de diferentes componentes de la agrupación de genes PKS act, con los genes correspondientes de granaticina (gra) de S. violaceoruber, en trans.
Sin embargo, nadie ha descrito hasta la fecha la producción recombinante de poliquétidos utilizando células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que carecen sustancialmente de sus agrupaciones de genes PKS nativas enteras.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona nuevos poliquétidos y nuevos métodos de producción eficiente de poliquétidos tanto nuevos como conocidos, utilizando tecnología recombinante. En particular, en un aspecto se proporciona una quimioteca para la síntesis de una multiplicidad de poliquétidos, quimioteca que comprende una multiplicidad de líneas de células individuales en las cuales cada línea de células produce una poliquetido-sintasa (PKS) funcional tal que cada una de dichas líneas de células produce un poliquétido diferente;
en donde cada PKS funcional comprende el producto de módulos de una agrupación de genes PKS modular, comprendiendo cada módulo la secuencia de nucleótidos que codifica una actividad de cetosintasa (KS), una secuencia de nucleótidos que codifica una actividad de proteína portadora de acilo (ACP), una secuencia de nucleótidos que codifica una actividad de acil-transferasa (AT), y opcionalmente una actividad de cetorreductasa (KR), y/o una actividad de deshidratasa (DH), y/o actividad de enoil-reductasa (ER), y/o una actividad de tioesterasa (TE).
En otro aspecto, se proporciona una quimioteca para la síntesis de una multiplicidad de poliquétidos, quimioteca que comprende una multiplicidad de líneas de células individuales en las cuales cada línea de células produce una poliquetido-sintasa (PKS) aromática funcional tal que dicha línea de células produce un poliquétido diferente;
en donde cada PKS funcional comprende los productos de:
un primer marco de lectura abierto (ORF) que codifica una cetosintasa/acetiltransferasa (KS/AT); un segundo ORF que codifica una proteína portadora de acilo (ACP); y un tercer ORF que codifica un factor determinante de la longitud de cadena (CLDF).
Los poliquétidos así obtenidos son útiles como antibióticos, agentes antitumorales, inmunosupresores y para una gran diversidad de otros propósitos farmacológicos.
La invención emplea células modificadas por ingeniería genética que expresan una agrupación de genes de poliquetido-sintasa (PKS) en su estado nativo no transformado, y que carecen sustancialmente de la agrupación de genes PKS nativa entera.
Una célula modificada por ingeniería genética de este tipo comprende:
(a) una agrupación de genes PKS de reemplazamiento que codifica una PKS capaz de catalizar la síntesis de un poliquétido; y
(b) una o más secuencias de control enlazadas operativamente a la agrupación de genes PKS, por lo que los genes en la agrupación de genes pueden estar transcritos y traducidos en la célula modificada por ingeniería genética,
con la salvedad de que, cuando la agrupación de genes PKS de reemplazamiento comprende un conjunto de genes PKS entero, al menos uno de los genes PKS o elementos de control es heterólogo a la célula.
En realizaciones particularmente preferidas, la célula modificada por ingeniería genética es Streptomyces coelicolor, la célula carece sustancialmente de la agrupación de genes PKS de actinorrodina nativa entera, y la agrupación de genes PKS de reemplazamiento comprende un primer gen que codifica un sitio activo de PKS cetosintasa y un sitio activo de PKS-aciltransferasa (KS/AT), un segundo gen que codifica un factor dependiente de la longitud de cadena (CLF) de la PKS, y un tercer gen que codifica una proteína PKS portadora de acilo (ACP).
\newpage
Un método para producir un poliquétido recombinante basado en la invención comprende:
(a) proporcionar una población de células como se ha descrito arriba; y
(b) cultivar la población de células en condiciones por las cuales se expresa la agrupación de genes PKS de reemplazamiento presente en las células.
Para la provisión de una quimioteca de acuerdo con la invención, la producción de poliquétidos recombinantes puede diseñarse por un método que comprende:
(a) insertar una primera porción de una agrupación de genes PKS de reemplazamiento en un plásmido donante e insertar una segunda porción de una agrupación de genes PKS de reemplazamiento en un plásmido receptor, en donde las porciones primera y segunda codifican colectivamente una agrupación de genes PKS de reemplazamiento completa, y adicionalmente en donde:
i.
el plásmido donante expresa un gen que codifica un primer marcador de selección y es capaz de replicación a una primera temperatura permisiva e incapaz de replicación a una segunda temperatura no permisiva;
ii.
el plásmido receptor expresa un gen que codifica un segundo marcador de selección; y
iii.
el plásmido donante comprende regiones de DNA complementarias a regiones de DNA en el plásmido receptor, de tal modo que puede producirse recombinación homóloga entre la primera porción de la agrupación de genes PKS de reemplazamiento y la segunda porción de la agrupación de genes de reemplazamiento, por lo cual puede generarse una agrupación de genes de reemplazamiento completa;
(b) transformar el plásmido donante y el plásmido receptor en una célula hospedadora y cultivar la célula hospedadora transformada a la primera temperatura permisiva y en condiciones que permiten el crecimiento de células hospedadoras que expresan los marcadores de selección primero y/o segundo, para generar una primera población de células;
(c) cultivar la primera población de células a la segunda temperatura no permisiva, y en condiciones que permiten el crecimiento de células que expresan los marcadores de selección primero y/o segundo, para generar una segunda población de células que incluye células hospedadoras que contienen un plásmido recombinante que comprende una agrupación de genes de reemplazamiento PKS completa;
(d) transferir el plásmido recombinante de la segunda población de células a la célula modificada por ingeniería genética arriba descrita para generar células modificadas por ingeniería genética transformadas; y
(e) cultivar las células modificadas por ingeniería genética transformadas en condiciones por las cuales se expresa la agrupación de genes PKS de reemplazamiento presente en las células.
En una realización adicional, la invención está orientada a un método para preparar una quimioteca combinatoria de poliquétidos que comprende:
(a) proporcionar una población de vectores en la cual los vectores comprenden una mezcla aleatoria de genes de poliquetido-sintasa (PKS), módulos, sitios activos, o porciones de los mismos y una o más secuencias de control enlazadas operativamente a dichos genes;
(b) transformar una población de células hospedadoras con dicha población de vectores;
(c) cultivar dicha población de células hospedadoras en condiciones por las cuales los genes de dicha agrupación de genes pueden transcribirse y traducirse, produciendo con ello una quimioteca de poliquétidos combinatoria.
Un método para producir una quimioteca de poliquétidos combinatoria de la invención puede comprender:
a) proporcionar uno o más plásmidos de expresión que contienen una mezcla aleatoria de uno o más primeros módulos de una agrupación de genes PKS modular en la cual los plásmidos de expresión expresan un gen que codifica un primer marcador de selección;
b) proporcionar un conjunto de plásmidos donantes que contiene una mezcla aleatoria de segundos módulos de una agrupación de genes PKS modular en la cual los plásmidos donantes expresan un gen que codifica un segundo marcador de selección y adicionalmente en la cual los plásmidos donantes comprenden regiones de DNA complementarias a regiones de DNA en los plásmidos de expresión, de tal modo que puede ocurrir recombinación homóloga entre los módulos primero y segundo;
c) transformar los plásmidos de expresión y los plásmidos donantes en una primera población de células hospedadoras para producir un primer conjunto de células hospedadoras transformadas;
d) cultivar el primer conjunto de células hospedadoras transformadas en condiciones que permiten que tenga lugar recombinación homóloga entre los módulos primero y segundo para producir plásmidos recombinantes que comprenden módulos de agrupaciones de genes PKS recombinadas;
e) transferir los plásmidos recombinados a una segunda población de células hospedadoras para generar un segundo conjunto de células hospedadoras transformadas; y
f) cultivar el segundo conjunto de células hospedadoras transformadas en condiciones por las cuales se produce la quimioteca de poliquétidos combinatoria.
La invención proporciona compuestos poliquétidos que tienen la fórmula estructural (I)
1
en la cual:
R^{1} se selecciona del grupo constituido por hidrógeno y alquilo inferior, y R^{2} se selecciona del grupo constituido por hidrógeno, alquilo inferior y alquil-éster inferior, o en la cual R^{1} y R^{2} forman juntos un puente de alquileno inferior sustituido opcionalmente con 1 a 4 grupos hidroxilo o alquilo inferior;
R^{3} y R^{5} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, amino, amino mono- o di-sustituido con alquilo inferior y nitro;
R^{4} se selecciona del grupo constituido por halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, amino, amino mono- o di-sustituido con alquilo inferior y nitro;
R^{6} se selecciona del grupo constituido por hidrógeno, alquilo inferior, y -CHR^{7}-(CO)R^{8}, donde R^{7} y R^{8} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno y alquilo inferior; e
i es 1, 2 ó 3.
Por ejemplo, se han obtenido poliquétidos que tienen las estructuras siguientes:
2
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
5
6
A modo de ejemplo adicional, se ha obtenido un compuesto poliquétido por ciclación catalítica de un quétido unido a enzima que tiene la estructura (II)
7
en donde:
R^{11} se selecciona del grupo constituido por metilo, -CH_{2}(CO)CH_{3} y -CH_{2}(CO)CH_{2}(CO)CH_{3};
R^{12} se selecciona del grupo constituido por -S-E y -CH_{2}(CO)-S-E, en donde E representa una poliquetido-sintasa producida por las células modificadas por ingeniería genética anteriores; y
uno de R^{13} y R^{14} es hidrógeno y el otro es hidroxilo, o R^{13} y R^{14} representan juntos carbonilo.
En otra realización adicional, la invención está dirigida a un método para producir un poliquétido aromático, que comprende efectuar la ciclación de un quétido unido a enzima que tiene la estructura (II), en donde la ciclación es inducida por la poliquetido-sintasa.
La invención proporciona también compuestos poliquétidos que tienen la fórmula estructural (III)
8
en donde R^{2} y R^{4} son como se define arriba e i es 0, 1 ó 2.
La invención proporciona adicionalmente compuestos poliquétidos que tienen la fórmula estructural (IV)
9
en donde R^{2}, R^{4} e i son como se define arriba para la fórmula estructural (III).
Se proporcionan también por la invención compuestos poliquétidos que tienen la fórmula estructural (V)
10
en la cual R^{2}, R^{4} e i son como se define arriba para la fórmula estructural (III).
Estas y otras realizaciones de la presente invención serán ideadas fácilmente por quienes poseen experiencia ordinaria en la técnica teniendo presente la exposición adjunta.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1A muestra las agrupaciones de genes para las PKSs y ciclasas act, gra y tcm. La Figura 1B muestra las agrupaciones de genes para las PKSs y ciclasas act, tcm, fren, gris, y whiE.
La Figura 2 muestra la estrategia para producir S. coelicolor CH999. La Figura 2A representa la estructura de la agrupación de genes act presente en el cromosoma CH1 de S. coelicolor. La Figura 2B muestra la estructura de pLRemEts y la Figura 2C muestra la porción del cromosoma de CH999 con la agrupación de genes act delecionada.
La Figura 3 es un diagrama del plásmido pRM5.
La Figura 4 ilustra esquemáticamente la formación de aloesaponarina II (2) y su análogo carboxilado, el ácido 3,8-dihidroxi-1-metilantraquinona-2-carboxílico (1) como se describe en el Ejemplo 3.
La Figura 5 proporciona las estructuras de actinorrodina (3), granaticina (4), tetracenomicina (5) y mutactina (6), a las que se hace referencia en el Ejemplo 4.
La Figura 6 ilustra esquemáticamente la preparación, por ciclación de los precursores poliquétidos, de aloesaponarina II (2), su análogo carboxilado, ácido 3,8-dihidroxi-1-metilantraquinona-2-carboxílico (1), tetracenomicina (5) y el nuevo compuesto RM20 (9), como se explica en el Ejemplo 4, parte (A).
La Figura 7 ilustra esquemáticamente la preparación, por ciclación de los precursores poliquétidos, de frenolicina (7), nanomicina (8) y actinorrodina (3).
\newpage
La Figura 8 ilustra esquemáticamente la preparación, por ciclación de los precursores poliquétidos, de los nuevos compuestos RM20 (9), RM18 (10), RM18b (11), SEK4 (12), SEK15 (13), RM20b (14), RM20c (15) y SEK15b (16).
La Figura 9 representa el modelo genético para la 6-desoxieritronolida-B-sintasa (DEBS).
La Figura 10 es una representación del camino biosintético global para un producto natural de poliquétido típico.
La Figura 11 muestra las estructuras de diversos poliquétidos de PKSs aromáticas, modulares y fúngicas.
La Figura 12 es un esquema para la biosíntesis de poliquétidos diseñada racionalmente.
La Figura 13 muestra los restos comunes observados en poliquétidos diseñados formados por reacciones no enzimáticas que implican las porciones no cicladas de la cadena de carbonos. Se forman hemicetales (a) y anillos de benceno (b) en los extremos metilo, mientras que se producen anillos de \gamma-pirona (c) y descarboxilaciones (d) en los extremos carboxilo. Los dos extremos de la cadena pueden co-ciclarse también por condensaciones aldólicas (e).
La Figura 14 ilustra las estructuras y los caminos propuestos de la biosíntesis de poliquétidos derivados de octaquétidos, que incluyen RM77 (19).
La Figura 15 ilustra las estructuras y caminos propuestos de biosíntesis de poliquétidos derivados de decaquétidos que incluyen RM80 (20) y RM80b (21).
La Figura 16 muestra las estructuras de SEK34 (22), los dos nuevos poliquétidos SEK43 (23) y SEK26 (24) y otros poliquétidos producidos por ingeniería genética en S. coelicolor CH999.
La Figura 17 es un diagrama de los caminos de biosíntesis propuestos para los poliquétidos diseñados racionalmente SEK43 (23) y SEK26 (24).
La Figura 18 muestra la estrategia para la construcción de las PKSs modulares recombinantes.
La Figura 19 es un diagrama del plásmido pCK7.
La Figura 20 ilustra esquemáticamente la preparación de la 6-desoxieritronolida B (17) a partir de propionato y 8,8a-desoxioleandolida (18) a partir de un iniciador acetato.
La Figura 21A muestra la biosíntesis de la \delta-lactona del ácido (2R,3S,4S,5R)-2,4-dimetil-3,5-dihidroxi-n-hepta-
noico (25) por DEBS1 en S. coelicolor CH299. La Figura 21B muestra la biosíntesis de (25), y de la \delta-lactona del ácido (2R,3S,4S,5R)-2,4-dimetil-3,5-dihidroxi-n-hexanoico (26) por la PKS "1+2+TE" en S. coelicolor CH299. La línea vertical entre ACP-2 y la TE representa la unión por fusión en este mutante de deleción.
La Figura 22 muestra la biosíntesis de (8R,9S)-8,9-dihidro-8-metil-9-hidroxi-10-desoximetonolida (27) por la PKS "1+2+3+4+5+TE" en S. coelicolor CH999. La línea vertical entre KR-5 y ACP-6 representa la unión por fusión en este mutante de deleción.
Descripción detallada de la invención
La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique otra cosa, métodos convencionales de química, microbiología, biología molecular y técnicas de DNA recombinante dentro de la experiencia de la técnica. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, v.g., Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (edición actual); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. 1 & II (D. Glover, compilador); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, compilador, Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, compiladores, edición actual); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, compiladores, edición actual).
Tal como se utilizan en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones del apéndice, las formas singulares "un", "una" y "el" o "la" incluyen referencias plurales a no ser que el contenido dicte claramente lo contrario. Así, la referencia a "un poliquétido" incluye mezclas de poliquétidos, la referencia a "una poliquetido-sintasa" incluye mezclas de poliquetido-sintasas, etcétera.
A. Definiciones
En la descripción de la presente invención, se emplearán los términos siguientes, que deben considerarse definidos como se indica a continuación.
Por "agrupación de genes PKS de reemplazamiento" se entiende cualquier conjunto de genes PKS capaces de producir una PKS funcional cuando se encuentra bajo la dirección de uno o más elementos de control compatibles, como se definen más adelante, en una célula hospedadora transformada con ellos. Una PKS funcional es una que cataliza la síntesis de un poliquétido. La expresión "agrupación de genes PKS de reemplazamiento" abarca uno o más genes que codifican las diversas proteínas necesarias para catalizar la producción de un poliquétido. Una "agrupación de genes PKS de reemplazamiento" no precisa incluir la totalidad de los genes encontrados en la agrupación correspondiente en la naturaleza. En lugar de ello, la agrupación de genes precisa codificar únicamente los componentes PKS necesarios para catalizar la producción de un poliquétido activo. Así, como se explica con mayor detalle más adelante, si la agrupación de genes incluye, por ejemplo, ocho genes en su estado nativo y únicamente tres de estos genes son necesarios para proporcionar un poliquétido activo, únicamente precisan estar presentes estos tres genes. Adicionalmente, la agrupación puede incluir genes PKS derivados de una sola especie, o puede ser de naturaleza híbrida con, v.g., un gen derivado de una agrupación para la síntesis de un poliquétido particular reemplazado con un gen correspondiente de una agrupación para la síntesis de otro poliquétido. Las agrupaciones híbridas pueden incluir genes derivados de PKSs tanto del de Tipo I como del de Tipo II. Como se ha explicado arriba, las PKS del de Tipo I incluyen varias proteínas multifuncionales grandes que llevan, entre ellas, una serie de sitios activos separados para cada paso de ensamblaje y modificación de la cadena de carbonos. Por el contrario, las PKSs de Tipo II tienen una serie exclusiva de sitios activos utilizados iterativamente. Estas clasificaciones son bien conocidas. Véase, v.g., Hopwood, D.A. y Khosla, C. secondary metabolites: their function and evolution (1992) Wiley Chichester, Ciba Foundation Symposium 171) p. 88-112; Bibb, M.J. et al. EMBO J. (1989) 8: 2727; Sherman, D.H. et al. EMBO J. (1989) 8: 2717; Fernández-Moreno, M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278); Cortes, J. et al., Nature (1990) 348: 176; Donadio, S. et al. Science (1991) 252: 675; MacNeil, D.J. et al. Gene (1992) 115: 119. Agrupaciones de híbridos se ilustran en esta memoria y se describen con mayor detalle más adelante. Los genes incluidos en la agrupación de genes no precisan ser genes nativos, sino que pueden ser mutantes o análogos de los mismos. Mutantes o análogos pueden prepararse por deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos de la secuencia codificante. Técnicas para modificación de secuencias de nucleótidos, tales como mutagénesis orientada, se describen en, v.g., Sambrook et al., supra; DNA Cloning, Vols. I y II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Una "agrupación de genes PKS de reemplazamiento" puede contener también genes que codifican modificaciones al poliquétido de núcleo catalizadas por la PKS, que incluyen, por ejemplo, genes que codifican enzimas posteriores a la síntesis de poliquétidos derivadas de caminos de productos naturales tales como o-metil-transferasas y glicosiltransferasas. Una "agrupación de genes PKS de reemplazamiento" puede incluir adicionalmente genes que codifican hidroxilasas, metilasas u otras alquilasas, oxidasas, reductasas, glicotransferasas, liasas, éster- o amida-sintasas, y diversas hidrolasas tales como esterasas y amidasas.
Como se explica con mayor detalle más adelante, los genes incluidos en la agrupación de genes de reemplazamiento no precisan encontrarse en el mismo plásmido o, si están presentes en el mismo plásmido, pueden estar controlados por la misma o diferentes secuencias de control.
Una "quimioteca" o "quimioteca combinatoria" de poliquétidos tiene por objeto significar una colección de poliquétidos producidos catalíticamente por una agrupación de genes PKS capaces de catalizar la síntesis de un poliquétido. La quimioteca puede ser producida por una agrupación de genes PKS que contiene cualquier combinación de genes nativos, homólogos o mutantes de PKSs aromáticas, modulares o fúngicas. La combinación de genes puede derivarse de una sola agrupación de genes PKS, v.g., act, fren, gra, tcm, whiE, gris, o ery y puede incluir opcionalmente genes que codifican enzimas adaptadoras que son capaces de catalizar la modificación ulterior de un poliquétido. Alternativamente, la combinación de genes puede derivarse racional o estocásticamente de una mezcla de agrupaciones de genes PKS, v.g. puede construirse una agrupación de genes PKS mínima de modo que contenga el componente KS/AT de una PKS act, el componente CLF de una PKS tcm y un componente ACP de una PKS fren. La combinación de genes pude incluir asimismo opcionalmente componentes KR, CYC y ARO de agrupaciones de genes PKS. La quimioteca de poliquétidos así producida puede ensayarse o escrutarse en cuanto a actividad biológica, farmacológica o de otro tipo.
Por "mezcla aleatoria" debe entenderse cualquier combinación y/o orden de genes, homólogos o mutantes que codifican la diversidad de enzimas PKS, módulos, sitios activos o porciones de los mismos derivadas de agrupaciones de genes de PKS aromáticas, modulares o fúngicas.
Por "célula hospedadora modificada por ingeniería genética" se entiende una célula hospedadora en la cual la agrupación de genes PKS nativa se ha delecionado utilizando técnicas de DNA recombinante o una célula hospedadora en la cual se ha insertado una agrupación de genes PKS heteróloga. Así, el término podría no abarcar sucesos mutacionales que tienen lugar en la naturaleza. Una "célula hospedadora" es una célula derivada de un microorganismo procariota o una línea de células eucariotas cultivada como una entidad unicelular, que puede utilizarse, o se ha utilizado, como receptor para vectores recombinantes que llevan las agrupaciones de genes PKS de la invención. El término incluye la progenie de la célula original que se ha transfectado. Debe entenderse que la progenie de una sola célula parental puede no ser necesariamente idéntica por completo en morfología o en complemento de DNA genómico o total al progenitor original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula parental que es suficientemente similar al progenitor que debe caracterizarse por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica una PKS deseada, se incluyen en la definición, y están abarcadas por los términos que anteceden.
El término "heterólogo" cuando se refiere a secuencias de ácido nucleico tales como secuencias codificantes y secuencias de control, denota secuencias que no están asociadas normalmente con una región de una construcción recombinante, y/o no están asociadas normalmente con una célula particular. Así pues, una región "heteróloga" de una construcción de ácido nucleico es un segmento identificable de ácido nucleico dentro de o unido a otra molécula de ácido nucleico que no se encuentra en asociación con la otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una región heteróloga de una construcción podría incluir una secuencia codificante flanqueada por secuencias que no se encuentran en asociación con la secuencia codificante en la naturaleza. Otro ejemplo de una secuencia codificante heteróloga es una construcción en la cual la secuencia codificante propiamente dicha no se encuentra en la naturaleza (v.g., secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo). Análogamente, una célula hospedadora transformada con una construcción que no está presente normalmente en la célula hospedadora se consideraría heteróloga para los propósitos de esta invención. La variación alélica o sucesos mutacionales que ocurren naturalmente no dan lugar a DNA heterólogo, tal como se utiliza el término en esta memoria.
Una "secuencia codificante" o una secuencia que "codifica" una PKS particular, es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del DNA) y se traduce (en el caso de mRNA) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón inicial en el término 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el término 3' (carboxi). Una secuencia codificante puede incluir, pero sin carácter limitante, cDNA procedente de mRNA procariota o eucariota, secuencias de DNA genómico procedentes de DNA procariota o eucariota, e incluso secuencias de DNA sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción estará localizada usualmente 3' respecto a la secuencia codificante.
Una secuencia de "ácido nucleico" puede incluir, pero sin carácter limitante, secuencias procariotas, mRNA eucariota, cDNA procedente de mRNA eucariota, secuencias de DNA genómico procedentes de DNA eucariota (v.g., de mamífero), e incluso secuencias de DNA sintético. El término comprende también secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases de DNA y RNA conocidos tales como, pero sin carácter limitante, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, azirididinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxi-hidroximetil)-uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetil-aminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidro-uracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metil-citosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilamino-metiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, y 2,6-diaminopurina. Una secuencia de terminación de la transcripción estará localizada usualmente 3' respecto a la secuencia codificante.
La expresión "secuencias de control" de DNA se refiere colectivamente a secuencias promotoras, sitios de fijación de ribosoma, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores de aguas arriba, intensificadores, y análogos, que proporcionan colectivamente la transcripción y traducción de una secuencia codificante en una célula hospedadora. No todas estas secuencias de control precisan estar siempre presentes en un vector recombinante, con tal que el gen deseado sea capaz de transcribirse y traducirse.
La expresión "enlazada operativamente" hace referencia a una configuración de elementos en la cual los componentes así descritos están configurados de tal modo que realizan su función usual. Así, las secuencias de control enlazadas operativamente a una secuencia codificante son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificante. Las secuencias de control no precisan ser contiguas con la secuencia codificante, con tal que las mismas funcionen para dirigir la expresión de aquélla. Así, por ejemplo, secuencias interpuestas, no traducidas pero transcritas, pueden estar presentes entre una secuencia promotora y la secuencia codificante, y la secuencia promotora puede considerarse todavía "enlazada operativamente" a la secuencia codificante.
Por "marcador de selección" se entiende cualquier marcador genético que pueda utilizarse para seleccionar una población de células que lleva el marcador en su genoma. Ejemplos de marcadores de selección incluyen: marcadores auxótrofos por los cuales las células se seleccionan por su capacidad para crecer sobre medios mínimos con o sin un nutriente o suplemento, v.g., timidina, ácido diaminopimélico o biotina; marcadores metabólicos por los cuales las células se seleccionan por su capacidad para crecer sobre medios mínimos que contienen el azúcar apropiado como la única fuente de carbono o la capacidad de las células para formar colonias coloreadas que contienen los colorantes o sustratos cromógenos apropiados; y marcadores de resistencia a fármacos por los cuales las células se seleccionan por su capacidad para crecer sobre medios que contienen uno o más de los fármacos apropiados, v.g. tetraciclina, ampicilina, kanamicina, estreptomicina o ácido nalidíxico.
"Recombinación" es el reordenamiento de secciones de secuencias de DNA entre dos moléculas de DNA. "Recombinación homóloga" ocurre entre dos moléculas de DNA que se hibridan en virtud de secuencias de nucleótidos homólogas o complementarias presentes en cada molécula de DNA.
El término "alquilo", tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un grupo hidrocarbonado saturado, ramificado o no ramificado de 1 a 24 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, octilo, decilo, tetradecilo, hexadecilo, eicosilo, tetracosilo y análogos. Grupos alquilo preferidos en esta memoria contienen 1 a 12 átomos de carbono. El término "alquilo inferior" designa un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, preferiblemente 1 a 4 átomos de carbono.
El término "alquileno", tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a una cadena de hidrocarburo satu-
rado difuncional, ramificada o no ramificada, que contiene de 1 a 24 átomos de carbono, e incluye, por ejemplo, metileno (-CH_{2}-), etileno (-CH_{2}-CH_{2}-), propileno (-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-), 2-metilpropileno [-CH_{2}-CH(CH_{3})-CH_{2}-], hexileno
[-(CH_{2})_{6}-] y análogos. "Alquileno inferior" se refiere a grupo alquileno de 1 a 6, más preferiblemente 1 a 4, átomos de carbono.
El término "alcoxi", tal como se utiliza en esta memoria, designa un grupo alquilo unido a través de un enlace terminal éter individual; es decir, un grupo "alcoxi" puede definirse como -OR, donde R es alquilo como se ha definido arriba. Un grupo "alcoxi inferior" designa un grupo alcoxi que contiene 1 a 6, más preferiblemente 1 a 4, átomos de carbono.
"Halo" o "halógeno" se refiere a fluoro, cloro, bromo o yodo, y usualmente hace referencia a la sustitución por halógeno de un átomo de hidrógeno en un compuesto orgánico. De los grupos halo, se prefieren generalmente cloro y fluoro.
"Opcional" o "opcionalmente" significa que el suceso o circunstancia descrito a continuación puede ocurrir o no, y que la descripción incluye casos en los cuales ocurre dicho suceso o circunstancia y casos en los que no lo hace. Por ejemplo, la expresión "alquileno opcionalmente sustituido" significa que un resto alquileno puede estar sustituido o no y que la descripción incluye tanto grupos alquileno no sustituidos como grupos alquileno en los cuales existe sustitución.
B. Métodos generales
Esencial para la presente invención es el descubrimiento de un sistema hospedador-vector para la producción recombinante eficiente de poliquétidos tanto nuevos como conocidos. En particular, la invención hace uso de células modificadas por ingeniería genética que tienen sustancialmente delecionados sus genes PKS existentes naturalmente,. Estas células hospedadoras pueden transformarse con vectores recombinantes, que codifican una diversidad de agrupaciones de genes PKS, para la producción de poliquétidos activos. La invención proporciona la producción de cantidades importantes de producto en una etapa apropiada del ciclo de crecimiento. Los poliquétidos así producidos pueden utilizarse como agentes terapéuticos, para tratar numerosos trastornos, dependiendo del tipo de poliquétido en cuestión. Por ejemplo, varios de los poliquétidos producidos por el presente método encontrarán uso como inmunosupresores, como agentes antitumorales, así como para el tratamiento de infecciones víricas, bacterianas y parasitarias. La capacidad de producir poliquétidos recombinantemente proporciona también un instrumento poderoso para caracterizar PKSs y el mecanismo de sus acciones.
Más particularmente, células hospedadoras para la producción recombinante de los presentes poliquétidos pueden derivarse de cualquier organismo que tenga capacidad de alojar una agrupación de genes PKS recombinantes. Así, las células hospedadoras de la presente invención pueden derivarse de organismos procariotas o eucariotas. Sin embargo, células hospedadoras preferidas son las construidas a partir de los actinomicetos, una clase de bacterias miceliales que son productores abundantes de numerosos poliquétidos. Un género particularmente preferido para uso con el presente sistema es Streptomyces. Así, por ejemplo, S. ambofaciens, S. avermitilis, S. azureus, S. cinnamonensis, S. coelicolor, S. curacoi, S, erythraeus, S. fradiae, S. galilaeus, S. glaucescens, S. hygroscopicus, S. lividans, S. parvulus, S. peucetius, S. rimosus, S. roseofulvus, S. thermotolerans, S. violaceoruber, entre otros, proporcionarán células hospedadoras convenientes para la presente invención, siendo preferido S. coelicolor. (Véase, v.g., Hopwood, D.A. y Sherman, D.H. Ann. Rev. Genet. (1990) 24: 37-66; O'Hagan, D. The Polyketide Metabolites (Ellis Hopwood Limited, 1991), para una descripción de diversos organismos productores de poliquétidos y sus productos naturales.)
Las células arriba descritas se modifican por ingeniería genética por deleción de los genes PKS existentes naturalmente, utilizando técnicas estándar, tales como la recombinación homóloga. (Véase, v.g., Khosla, C. et al. Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237). En esta memoria se ilustra una célula hospedadora de S. coelicolor modificada por ingeniería genética. Las cepas nativas de S. coelicolor producen una PKS que cataliza la biosíntesis del poliquétido aromático actinorrodina (estructura 3, Figura 5). La nueva cepa, S. coelicolor CH999 (como se describe en los ejemplos), se construyó por deleción, mediante recombinación homóloga, de la agrupación act natural entera del cromosoma de S. coelicolor CH1 (Figura 2) (Khosla, C. Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237), una cepa que carece de plásmidos endógenos y que lleva una mutación estable que bloquea la biosíntesis de otro antibiótico de pigmentado S. coelicolor, la undecilprodigiosina.
Las células hospedadoras arriba descritas pueden transformarse con uno o más vectores, que modifican colectivamente un conjunto funcional de PKS, o un cóctel que comprende una colección aleatoria de genes PKS, módulos, sitios activos, o porciones de los mismos. El o los vectores pueden incluir combinaciones nativas o híbridas de subunidades PKS o componentes de cóctel, o mutantes de los mismos. Como se ha explicado arriba, la agrupación de genes de reemplazamiento no precisa corresponder a la agrupación de genes nativa completa sino que precisa codificar solamente los componentes PKS necesarios para catalizar la producción de un poliquétido. Por ejemplo, en cada PKS aromática de Streptomyces estudiada hasta ahora, el ensamblaje de la cadena de carbonos requiere los productos de tres marcos de lectura abiertos (ORFs). El ORF1 codifica un sitio activo de cetosintasa (KS) y un sitio activo de aciltransferasa (AT) (KS/AT); como se elucida en esta memoria, ORF2 codifica un factor determinante de la longitud de cadena (CLF), una proteína similar al producto de ORF1 pero que carece de los motivos KS y AT; y ORF3 codifica una proteína discreta portadora de acilo (ACP). Algunas agrupaciones de genes codifican también una cetorreductasa (KR) y una ciclasa, implicada en la ciclación de la cadena principal de poliquétido naciente. (Véanse las Figuras 1A y 1B para representaciones esquemáticas de seis agrupaciones de genes PKS.)
Sin embargo, se ha encontrado que únicamente KS/AT, CLF, y ACP precisan estar presentes a fin de producir un poliquétido identificable. Así, en el caso de PKSs aromáticas derivadas de Streptomyces, estos tres genes, sin los otros componentes de las agrupaciones nativas, pueden incluirse en uno o más vectores recombinantes, para constituir una agrupación de genes PKS de reemplazamiento "mínima".
Adicionalmente, el o los vectores recombinantes pueden incluir genes procedentes de una sola agrupación de genes PKS, o pueden comprender agrupaciones de genes PKS de reemplazamiento híbridas con, v.g., un gen para una agrupación reemplazado por el gen correspondiente procedente de otra agrupación de genes. Por ejemplo, se ha encontrado que las ACPs son fácilmente intercambiables entre diferentes sintasas sin un efecto sobre la estructura del producto. Adicionalmente, una KR dada puede reconocer y reducir cadenas de poliquétidos de longitudes de cadena diferentes. De acuerdo con ello, estos genes son libremente intercambiables en las construcciones descritas en esta memoria. Así, las agrupaciones de reemplazamiento de la presente invención pueden derivarse de cualquier combinación de conjuntos de genes PKS que funcione finalmente para producir un poliquétido identificable.
Ejemplos de agrupaciones de reemplazamiento híbridas incluyen agrupaciones con genes derivados de dos o más de la agrupación de genes act, la agrupación de genes whiE, frenolicina (fen), granaticina (gra), tetracenomicina (tcm), ácido 6-metilsalicílico (6-msas), oxitetraciclina (otc), tetraciclina (tet), eritromicina (ery), griseusina (gris), nanaomicina, medermicina, daunorrubicina, tilosina, carbomicina, espiramicina, avermectina, monensina, nonactina, curamicina, rifamicina y agrupaciones de genes de candicidina-sintasa, entre otras.
(Para una exposición de diversas PKSs, véase, v.g., Hopwood, D.A. y Sherman, D.H. Ann. Rev. Genet. (1990) 24: 37-66; O'Hagan, D. The Polyketide Metabolites (Ellis Horwood Limited, 1991)).
Más particularmente, se han construido en esta memoria varias agrupaciones de genes híbridos, que tienen componentes derivados de las agrupaciones de genes act, fren, tcm, gris y gra, como se representa en las Tablas 1, 2, 5 y 6. Varias de las agrupaciones híbridas eran capaces de expresar funcionalmente poliquétidos tanto nuevos como conocidos en S. coelicolor CH999 (arriba descrito). Sin embargo, otras agrupaciones de genes híbridos, como se han descrito arriba, pueden producirse y escrutarse fácilmente utilizando la exposición de esta memoria, para la producción de poliquétidos identificables.
Adicionalmente, podría construirse una quimioteca de ORF1, ORF2, ORF3 y homólogos o mutantes de los mismos, clonados aleatoriamente, así como otros genes PKS y homólogos o mutantes de los mismos con inclusión de cetorreductasas, ciclasas y aromatasas procedentes de una colección de agrupaciones de genes PKS aromáticos, y escrutarse respecto a poliquétidos identificables utilizando métodos descritos e ilustrados en esta memoria. Por otra parte, existe un grado considerable de variabilidad tanto para las unidades iniciadoras (v.g., acetil-CoA, maloamil-CoA, propionil-CoA, acetato, butirato, isobutirato y análogos) como para las unidades extendedoras entre ciertas PKSs aromáticas existentes naturalmente; así pues, estas unidades pueden utilizarse también para obtener nuevos poliquétidos por ingeniería genética.
Adicionalmente, podría construirse una quimioteca de marcos de lectura abierta clonados aleatoriamente u homólogos a partir de una colección de agrupaciones de genes PKS modulares y escrutarse respecto a poliquétidos identificables. Tales agrupaciones de genes se describen con mayor detalle más adelante. Vectores recombinantes pueden incluir opcionalmente genes de una agrupación de genes PKS aromática y una modular.
Los vectores recombinantes, que alojan las agrupaciones de genes o colecciones aleatorias de genes PKS, módulos, sitios activos o porciones de los mismos arriba descritas, pueden generarse convenientemente utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las subunidades PKS de interés pueden obtenerse a partir de un organismo que expresa las mismas, utilizando métodos recombinantes, por ejemplo por escrutinio de quimiotecas de cDNA o genómicas, derivadas de células que expresan el gen, o por derivación del gen a partir de un vector conocido que incluye las mismas. El gen puede aislarse o combinarse luego con otras subunidades PKS deseadas, utilizando técnicas estándar. Si el gen en cuestión está presente ya en un vector de expresión adecuado, el mismo puede combinarse in situ, con, v.g., otras subunidades PKS, en caso deseado. El gen de interés puede producirse también sintéticamente, en lugar de clonarse. La secuencia de nucleótidos puede diseñarse con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos particular deseada. En general, se seleccionarán codones preferidos para el hospedador propuesto en el que se expresará la secuencia. La secuencia completa puede ensamblarse a partir de polinucleótidos solapantes preparados por métodos estándar y ensamblados en una secuencia codificante completa. Véase , v.g., Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair et al. (1984) Science 223: 1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 6311.
Pueden hacerse mutaciones en las secuencias de las subunidades PKS nativas, y utilizarse tales mutantes en lugar de la secuencia nativa, con tal que los mutantes sean susceptibles de funcionar con otras subunidades PKS para catalizar colectivamente la síntesis de un poliquétido identificable. Tales mutaciones pueden hacerse en las secuencias nativas utilizando técnicas convencionales por ejemplo por preparación de oligonucleótidos sintéticos que incluyen las mutaciones e inserción de la secuencia mutada en el gen que codifica una subunidad PKS utilizando digestión con endonucleasas de restricción. (Véase, v.g., Kunkel, D.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 448; Geisselsoder et al. BioTechniques (1987) 5: 786.). Alternativamente, las mutaciones pueden efectuarse utilizando un iniciador desapareado (generalmente de 10 a 20 nucleótidos de longitud) que se hibrida a la secuencia de nucleótidos nativa (generalmente cDNA correspondiente a la secuencia de RNA), a una temperatura inferior a la temperatura de fusión del dúplex desapareado. El iniciador puede hacerse específico manteniendo la longitud del iniciador y la composición de las bases dentro de límites relativamente estrechos y manteniendo la base mutante localizada centralmente. Zoller y Smith, Methods Enzymol. (1983) 100: 468. La extensión de iniciador se efectúa utilizando DNA-polimerasa, el producto se somete a clonación y se seleccionan los clones que contienen el DNA mutado, derivados por segregación de la cadena extendida del iniciador. La selección puede realizarse utilizando el iniciador mutante como sonda de hibridación. La técnica es aplicable también para generar mutaciones puntuales múltiples. Véase, v.g., Dalbie-McFarland et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 6409. La mutagénesis PCR encontrará uso también para efectuar las mutaciones deseadas.
La mutagénesis aleatoria de las secuencias de nucleótidos obtenidas como se ha descrito arriba puede realizarse por varios métodos diferentes conocidos en la técnica, por ejemplo por alteración de secuencias dentro de sitios de endonucleasas de restricción, inserción de un enlazador oligonucleotídico aleatoriamente en un plásmido, por irradiación con rayos X o luz ultravioleta, por incorporación de nucleótidos incorrectos durante la síntesis de DNA in vitro, por mutagénesis PCR propensa a errores, por preparación de mutantes sintéticos o por deterioro in vitro de DNA plasmídico con productos químicos. Mutágenos químicos incluyen, por ejemplo, bisulfito de sodio, ácido nitroso, hidroxilamina, agentes que deterioran o eliminan bases previniendo con ello el apareamiento de bases normal tales como hidrazina o ácido fórmico, análogos de precursores nucleotídicos tales como nitrosoguanidina, 5-bromouracilo, 2-aminopurina, o agentes de intercalación de acridina tales como proflavina, acriflavina, quinacrina, y análogos. Generalmente, DNA o fragmentos de DNA plasmídico se tratan con productos químicos, se transforman en E. coli y se propagan como un conjunto o quimioteca de plásmidos mutantes.
Grandes poblaciones de variantes aleatorias de enzimas pueden construirse in vivo utilizando "mutagénesis mejorada por recombinación". Este método emplea dos o más conjuntos de, por ejemplo, 10^{6} mutantes cada uno de la secuencia de nucleótidos codificante de tipo salvaje que se generan utilizando cualquier técnica de mutagénesis conveniente, descrita con mayor detalle anteriormente, y se insertan luego en vectores de clonación.
Una vez que se han generado las secuencias mutantes, el DNA se inserta en un vector de clonación apropiado, utilizando métodos bien conocidos en la técnica (véase, v.g. Sambrook et al., supra). La elección del vector depende del conjunto de secuencias mutantes, es decir, donantes o receptoras, con las cuales han de emplearse los mismos. Adicionalmente, la elección del vector determina la célula hospedadora a emplear en pasos subsiguientes del método reivindicado. Como vector de clonación para el conjunto de mutantes donantes puede utilizarse cualquier vector de clonación transducible. No obstante, es preferible utilizar fagémidos, cósmidos, o vectores de clonación similares para clonar el conjunto donante de secuencias nucleotídicas codificantes de mutantes en la célula hospedadora. Fagémidos y cósmidos, por ejemplo, son vectores ventajosos debido a la posibilidad de insertar y propagar de manera estable en ellos fragmentos mayores de DNA que en el fago M13 y el fago \lambda, respectivamente. Fagémidos que encontrarán uso en este método incluyen por lo general híbridos entre plásmidos y vehículos de clonación de fago filamentosos. Cósmidos que encontrarán uso en este método incluyen por lo general vectores basados en el fago \lambda en los cuales se han insertado sitios cos. Los vectores de clonación de conjuntos receptores pueden ser cualesquiera plásmidos adecuados. Los vectores de clonación en los cuales se insertan conjuntos de mutantes pueden ser idénticos o pueden construirse de modo que alojen y expresen marcadores genéticos diferentes (véase, v.g., Sambrook et al., supra). La utilidad de emplear tales vectores que tienen genes marcadores diferentes puede aprovecharse para facilitar una determinación de la transducción con éxito.
Así, por ejemplo, el vector de clonación empleado puede ser un fagémido y la célula hospedadora puede ser E. coli. Después de la infección de la célula hospedadora que contiene un fagémido, se produce DNA monocatenario de fagémido, se empaqueta y se extruye de la célula en la forma de un fago transductor de una manera similar a otros vectores de fago. Así, la amplificación clonal de secuencias nucleotídicas codificantes de mutantes realizada por fagémidos se realiza por propagación de los fagémidos en una célula hospedadora adecuada.
Después de la amplificación clonal, el conjunto de mutantes donantes clonados se infecta con un fago adyuvante para obtener una mezcla de partículas de fago que contienen el genoma del fago adyuvante o fagémidos que mutan alelos de la secuencia nucleotídica codificante de tipo salvaje.
La infección, o transfección, de células hospedadoras con fago adyuvante se realiza generalmente por métodos bien conocidos en la técnica (véase, v.g., Sambrook et al., supra; y Russell et al. (1986) Gene 45: 333-338).
El fago adyuvante puede ser cualquier fago que pueda utilizarse en combinación con el fago de clonación para producir un fago transductor infeccioso. Por ejemplo, si el vector de clonación en un cósmido, el fago adyuvante será necesariamente un fago \lambda. Preferiblemente, el vector de clonación es un fagémido y el fago adyuvante es un fago filamentoso, y preferente el fago M13.
Si se desea, después de la infección del fagémido con fago adyuvante y obtención de una mezcla de partículas de fago, el fago de transducción puede separarse del fago adyuvante basándose en diferencias de tamaño (Barnes et al. (1983) Methods Enzymol. 101: 98-122), u otra técnica análogamente eficaz.
El espectro completo de mutaciones donantes clonadas puede transducirse ahora a células receptoras amplificadas clonalmente en las cuales se ha transducido o transformado un conjunto de secuencias nucleotídicas codificantes mutantes. Células receptoras que pueden emplearse en el método expuesto y reivindicado en esta memoria pueden ser, por ejemplo, E. coli, u otros sistemas de expresión bacterianos que no son deficientes en recombinación. Una célula deficiente en recombinación es una célula en la cual los sucesos recombinatorios se han reducido notablemente, tales como los mutantes rec^{-} de E. coli (véase, Clark et al. (1965) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53: 451-459).
Por mantenimiento de una multiplicidad de infección alta (MOI) y una relación de [unidades formadoras de transductantes (tfu)]: [unidades formadoras de placas (pfu)] mayor que 1, puede asegurarse que virtualmente cada célula receptora recibe al menos un gen mutante del conjunto de donantes. La MOI se ajusta por manipulación de la relación de partículas transductoras a densidad de células. Por la expresión "multiplicidad de infección alta" se entiende una multiplicidad de infección mayor que 1, preferiblemente entre 1 y 100, más preferiblemente entre 1 y 10.
Se prefiere que la relación tfu:pfu, que refleja la relación de fagos transductores a fagos adyuvantes, sea lo mayor posible, al menos mayor que uno, más preferiblemente mayor que 100 o más. Por ejercer la opción de separar el fago de transducción del fago adyuvante, como se ha descrito arriba, puede maximizarse la relación tfu:pfu.
Estos transductantes pueden seleccionarse ahora por la propiedad o característica de la proteína expresada deseada y, en caso necesario o deseable, amplificarse. Opcionalmente, si los fagémidos en los cuales se clona cada conjunto de mutantes se construyen de modo que expresen marcadores genéticos diferentes, como se ha descrito arriba, los transductantes pueden seleccionarse por medio de su expresión tanto de marcadores de plásmidos donantes como de marcadores de plásmidos receptores.
Los recombinantes generados por los métodos arriba descritos pueden someterse luego a selección o escrutinio por cualquier método apropiado, por ejemplo, enzimático u otra actividad biológica.
El ciclo de amplificación, infección, transducción, y recombinación anterior puede repetirse cualquier número de veces utilizando conjuntos de donantes adicionales clonadas en fagémidos. Como anteriormente, los fagémidos en los cuales se clona cada conjunto de mutantes pueden construirse para expresar un gen marcador diferente. Cada ciclo podría incrementar el número de mutantes distintos por un factor de hasta 10^{6}. Así, si la probabilidad de aparición de un suceso de recombinación inter-alélico en cualquier célula individual es f (un parámetro que es de hecho función de la distancia entre las mutaciones de recombinación), el cultivo transducido a partir de dos agrupaciones de 10^{6} mutantes alélicos expresará hasta 10^{12} mutantes distintos en una población de 10^{12}/f células.
Las secuencias génicas, nativas o mutantes, que codifican colectivamente una agrupación de genes PKS de reemplazamiento, pueden insertarse en uno o más vectores de expresión, utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. A fin de incorporar una colección aleatoria de genes PKS, módulos, sitios activos o porciones de los mismos en un vector de expresión, puede prepararse un cóctel de los mismos y utilizarse para generar el vector de expresión por métodos bien conocidos en la técnica y descritos en detalle más adelante. Los vectores de expresión incluirán secuencias de control enlazadas operativamente a la secuencia codificante de PKS deseada. Sistemas de expresión adecuados para uso con la presente invención incluyen sistemas que funcionan en células hospedadoras eucariotas y procariotas. Sin embargo, como se ha explicado anteriormente, se prefieren los sistemas procariotas, siendo particularmente interesantes sistemas compatibles con Streptomyces spp. Elementos de control para uso en tales sistemas incluyen promotores, que contienen opcionalmente secuencias operadoras, y sitios de fijación de ribosoma. Promotores particularmente útiles incluyen secuencias de control derivadas de agrupaciones de genes PKS que dan como resultado la producción de poliquétidos como metabolitos secundarios, tales como uno o más promotores act, promotores tcm, promotores espiramicina, y análogos. Sin embargo, otros promotores bacterianos, tales como los derivados de enzimas metabolizantes de azúcares, tales como galactosa, lactosa (lac) y maltosa, encontrarán uso también en las presentes construcciones. Ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp), el sistema promotor de \beta-lactamasa (bla), PL del bacteriófago \lambda, y T5. Adicionalmente, promotores sintéticos, tales como el promotor tac (patente U.S. No. 4.551.433), que no existen en la naturaleza, funcionan también en células hospedadoras bacterianas.
Pueden ser también deseables otras secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión de las secuencias de reemplazamiento PKS con relación al crecimiento de la célula hospedadora. Las secuencias reguladoras son conocidas por los expertos en la técnica, y ejemplos incluyen aquéllas que hacen que la expresión de un gen se ponga en marcha o se pare en respuesta a un estímulo químico o físico, con inclusión de la presencia de un compuesto regulador. Otros tipos de elementos reguladores pueden estar presentes también en el vector, por ejemplo, secuencias intensificadoras.
También pueden incluirse marcadores seleccionables en los vectores de expresión recombinantes. Se conocen una diversidad de marcadores que son útiles en la selección de líneas de células transformadas y comprenden por regla general un gen cuya expresión confiere un fenotipo seleccionable en células transformadas cuando las células se dejan crecer en un medio selectivo apropiado. Tales marcadores incluyen, por ejemplo, genes que confieren resistencia a antibióticos o sensibilidad al plásmido. Alternativamente, varios poliquétidos están coloreados naturalmente y esta característica proporciona un marcador incorporado para seleccionar células transformadas satisfactoriamente por las presentes construcciones.
Las diversas subunidades PKS de interés, o el cóctel de genes, módulos, sitios activos, o porciones PKS de los mismos, pueden clonarse en uno o más vectores recombinantes como casetes individuales, con elementos de control separados, o bajo control de, v.g., un solo promotor. Las subunidades PKS o los componentes de cóctel pueden incluir sitios de restricción flanqueantes para permitir la fácil deleción e inserción de otras subunidades PKS o componentes de cóctel de tal modo que puedan generarse PKSs híbridas. El diseño de tales sitios de restricción singulares es conocido por los expertos en la técnica y puede realizarse utilizando las técnicas arriba descritas, tales como mutagénesis orientada y PCR.
Utilizando estas técnicas, se construyó un nuevo plásmido, pRM5, (Figura 3 y Ejemplo 2) como un vector lanzadera para la producción de los poliquétidos descritos en esta memoria. El plásmido pRM5 incluye los genes act que codifican las subunidades KS/AT (ORF1), CLF (ORF3) y ACP (ORF3), flanqueadas por sitios de restricción PacI, NsiI y XbaI. Así, subunidades PKS análogas, codificadas por otros genes PKS, pueden emplearse fácilmente en sustitución de los genes act existentes. (Véase, v.g., Ejemplo 4, que describe la construcción de vectores híbridos utilizando pRM5 como el plásmido progenitor. El plásmido lanzadera contiene también el gen de KR act (actIII), el gen de ciclasa (actVII), y un gen supuesto de deshidratasa (actIV), así como un replicón ColEI (para permitir la transformación de E. coli), un replicón de Streptomyces SCP2* (de bajo número de copias) truncado adecuadamente, y el gen activador actII-ORF4 procedente de la agrupación act, que induce transcripción por promotores act durante la transición desde la fase de crecimiento a la fase estacionaria en el micelio vegetativo. pRM5 lleva el par de promotores divergente actI/actIII.
Métodos para la introducción de los vectores recombinantes de la presente invención en hospedadores adecuados son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen típicamente el uso de CaCl_{2} u otros agentes, tales como cationes bivalentes y DMSO. También puede introducirse DNA en células bacterianas por electroporación. Una vez que están expresadas las PKSs, las colonias productoras de poliquétidos pueden identificarse y aislarse utilizando técnicas conocidas. Los poliquétidos producidos pueden caracterizarse luego adicionalmente.
Como se ha explicado anteriormente, los métodos recombinantes arriba descritos encuentran también utilidad en la biosíntesis catalítica de poliquétidos por grandes PKSs modulares. Por ejemplo, la 6-desoxieritronolida B-sintasa (DEBS) cataliza la biosíntesis de la aglicona de eritromicina, 6-desoxieritronolida B (17). Tres marcos de lectura abiertos (eryAI, eryAII, y eryAII) codifican los polipéptidos DEBS y abarcan 32 kb en la agrupación de genes ery del genoma de Saccharopolispora erythraea. Los genes están organizados en 6 unidades repetidas, cada una de las cuales designa un "módulo". Cada módulo codifica una serie de sitios activos que, durante la biosíntesis de los poliquétidos, cataliza la condensación de un monómero adicional a la cadena en crecimiento. Cada módulo incluye una aciltransferasa (AT), proteína-sintasa portadora de \beta-cetoacilo (KS), y proteína portadora de acilo (ACP), así como un subconjunto de sitios activos reductores (\beta-cetorreductasa (KR), deshidratasa (DH), enoil-reductasa (ER)) (Figura 9). El número de sitios reductores dentro de un módulo corresponde a la extensión de la reducción del grupo \beta-ceto en cada ciclo de condensación. La tioesterasa (TE) codificada al final del módulo parece catalizar la formación de lactona.
Debido a los grandes tamaños de eryAI, eryAII, y eryAII, y la presencia de sitios activos múltiples, estos genes pueden clonarse convenientemente en un plásmido adecuado para expresión en una célula hospedadora modificada por ingeniería genética, tal como CH999, utilizando una técnica de recombinación in vivo. Esta técnica, descrita en el Ejemplo 7 y resumida en la Figura 10, utiliza derivados del plásmido pMAK605 (Hamilton et al, (1989) J. Bacteriol. 171: 4617) para permitir la recombinación in vivo entre un plásmido donante sensible a la temperatura, que es capaz de replicación a una primera temperatura permisiva e incapaz de replicación a una segunda temperatura, no permisiva, y el plásmido receptor. Los genes eryA así clonados daban pCK7, un derivado de pRM5 (McDaniel et al. (1993). Science 262: 1546). Se construyó un plásmido de control, pCK7f, para transportar una mutación de desplazamiento de marco en eryAI. pCK7 y pCK7f poseen un replicón ColEI para manipulación genética en E. coli así como un replicón de Streptomyces SCP2* truncado (de bajo número de copias). Estos plásmidos contienen también el par de promotores divergentes actI/actIII y actII-ORF4, un gen activador, que se requiere para transcripción a partir de estos promotores y activa la expresión durante la transición desde el crecimiento a la fase estacionaria en el micelio vegetativo. La expresión de alto nivel de genes PKS ocurre al comienzo de la fase estacionaria del crecimiento micelial; las cepas recombinantes producen por tanto poliquétidos "informadores" como metabolitos secundarios de una manera cuasi-natural.
Vectores recombinantes que alojan PKSs modulares pueden generarse también utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la PKS de interés puede obtenerse a partir de un organismo que expresa la misma utilizando técnicas recombinantes como se ha descrito arriba y como se ilustra en los Ejemplos 7 y 8. Por ejemplo, el gen puede aislarse, someterse a protocolos productores de mutación y reexpresarse (véase Ejemplo 8).
El método arriba descrito para producir poliquétidos sintetizados por grandes PKSs modulares puede utilizarse para producir otros poliquétidos como metabolitos secundarios tales como azúcares, \beta-lactamas, ácidos grasos, aminoglicósidos, terpinoides, péptidos no ribosómicos, hormonas prostanoides y análogos. De esta manera, los poliquétidos pueden producirse después que la célula hospedadora ha madurado, reduciéndose con ello cualquier potencial tóxico u otros efectos bioactivos del poliquétido sobre la célula hospedadora.
Como en el caso de las PKSs aromáticas (Tipo II) y modulares (Tipo I) en los métodos arriba descritos encuentran utilidad también en la biosíntesis catalítica de poliquétidos utilizando los genes PKS procedentes de hongos. Las PKSs fúngicas, tales como la PKS del ácido 6-metilsalicílico están constituidas por un solo polipéptido multi-dominio que incluye todos los sitios activos requeridos para la biosíntesis del ácido 6-metilsalicílico.
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Utilizando los métodos recombinantes anteriores, se han producido cierto número de poliquétidos. Estos compuestos tienen la estructura general (I)
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en la cual R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} e i son como se ha definido arriba. Un grupo de tales compuestos son aquéllos en los cuales: R^{1} es alquilo inferior, preferiblemente metilo; R^{2}, R^{3} y R^{6} son hidrógeno; R^{6} es -CHR^{7}-(CO)-R^{8}; e i es 0. Un segundo grupo de tales compuestos son aquéllos en los cuales: R^{1} y R^{6} son alquilo inferior, preferiblemente metilo; R^{2}, R^{3} y R^{5} son hidrógeno; e i es 0. Todavía un tercer grupo de tales compuestos son aquéllos en los cuales: R^{1} y R^{2} están unidos uno a otro formando un puente de alquileno inferior-CHR^{9}-CHR^{10} en el cual R^{9} y R^{10} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, hidroxilo y alquilo inferior, v.g., -CH_{2}-CHOH-; R^{3} y R^{5} son hidrógeno; R^{6} es -CHR^{7}-(CO)-R^{8}, en donde R^{8} es hidrógeno o alquilo inferior, v.g., -CH_{2}-(CO)-CH_{3}; e i es 0. Compuestos específicos de este tipo incluyen los compuestos siguientes 9, 10 y 11 indicados a continuación:
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Otros nuevos poliquétidos comprendidos dentro del alcance de la invención son aquéllos que tienen la estructura
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La preparación de los compuestos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 16 se efectúa por ciclación de un poliquétido unido a enzima que tiene la estructura (II)
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en la cual R^{11}, R^{12}, R^{13} y R^{14} son E como se define anteriormente en esta memoria. Ejemplos de tales compuestos incluyen: un primer grupo en el cual R^{11} es metilo y R^{12} es -CH_{2}(CO)-S-E; un segundo grupo en el cual R^{11} es -CH_{2}(CO)CH_{3} y R^{12} es -S-E; un tercer grupo en el cual R^{11} es -CH_{2}(CO)CH_{3} y R^{12} es -CH_{2}(CO)-S-E; y un cuarto grupo en el cual R^{11} es -CH_{2}(CO)CH_{2}(CO)CH_{3} y R^{12} es -CH_{2}(CO)-S-E (véase Figura 8 para ilustración estructural).
Las estructuras restantes abarcadas por la fórmula genérica (I) - es decir estructuras distintas de 9, 10 y 11 - pueden prepararse a partir de las estructuras 9, 10 ó 11 utilizando métodos de síntesis orgánica rutinarios bien conocidos por los expertos en la técnica de la química orgánica, v.g., como se describe por H.O. House, Modern Synthetic Reactions, Segunda Edición, Menlo Park, CA: The Benjamin/Cummings Publishing Company,1972) o por J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, 4th Ed. (Nueva York: Wiley-Interscience, 1992).
Típicamente, como será apreciado por los expertos en la técnica, la incorporación de sustituyentes en los anillos aromáticos implicará reacciones de adición aromática electrófila simples. Las estructuras 12 y 13 pueden modificarse de una manera similar para producir poliquétidos que deben considerarse también comprendidos dentro del alcance de la presente invención.
Adicionalmente, los métodos recombinantes anteriores se han utilizado para producir compuestos poliquétidos que tienen la estructura general (III)
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estructura general (IV)
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y estructura general (V)
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Compuestos particularmente preferidos de las fórmulas estructurales (III), (IV) y (V) son aquéllos en los cuales: R^{2} es hidrógeno e i es 0.
Como se describe anteriormente en esta memoria y en los ejemplos que siguen, se ha desarrollado un sistema para expresar funcionalmente PKSs recombinantes y producir nuevos poliquétidos aromáticos (Ejemplos 1-6). Esta tecnología se ha extrapolado para agrupaciones mayores de genes utilizando una estrategia de recombinación in vivo (Kao et al. Science (1994) 265: 509-512; véanse los ejemplos 7 y 8). Estos sistemas pueden utilizarse para manipular genéticamente la biosíntesis de poliquétidos a fin de generar quimiotecas de productos sintéticos.
Un camino típico para la biosíntesis de poliquétidos se muestra en la Figura 10. Generalmente, la síntesis de poliquétidos ocurre en tres etapas. En la primera etapa, catalizada por la PKS, se genera una cadena principal de poliquétido naciente a partir de tioésteres de CoA monómeros. En la segunda etapa, esta cadena principal se somete a ciclación regioespecíficamente. Si bien algunas reacciones de ciclación están controladas por la PKS propiamente dicha, otras son resultado de actividades de enzimas situadas agua abajo. En la etapa final, el compuesto intermedio ciclado se modifica ulteriormente por la acción de "enzimas adaptadoras" mecanísticamente diversas, dando lugar al producto natural.
Más particularmente, la biosíntesis de poliquétidos comienza con la carga de una unidad iniciadora en el sitio activo de la enzima condensante, \beta-ceto-acil-sintasa (KS). Se transfiere luego una unidad extendedora (usualmente malonato) al brazo pateteinilo de la proteína portadora de acilo (ACP). La KS cataliza la condensación entre el malonato fijado a ACP y la unidad inicial. Se añaden secuencialmente unidades extendedoras adicionales hasta que la cadena de poliquétido naciente ha crecido hasta una longitud de cadena deseada determinada por el factor de longitud de cadena de la proteína (CLF), quizás junto con la KS. Por ello, la KS, CLF y la ACP forman un conjunto mínimo para generar una cadena principal de poliquétido, y se conocen juntos como la "PKS mínima". La cadena de poliquétido naciente se somete luego a cetorreducción regioespecífica por una cetorreductasa (KR), si existe la misma. Las ciclasas (CYC) y aromatasas (ARO) catalizan más tarde sucesos de formación de anillo regioespecíficos por condensaciones aldólicas intramoleculares. El compuesto intermedio ciclado puede sufrir luego modificaciones regioespecíficas y/o estereoespecíficas adicionales (v.g., O-metilación, hidroxilación, glicosilación, etc.) controladas por enzimas adaptadoras situadas aguas abajo).
La acetil-CoA es la unidad inicial usual para la mayoría de los poliquétidos aromáticos. Sin embargo, la maloamil-CoA (Gatenbeck, S. Biochem. Biophy. Res. Commun. (1961) 6: 422-426 y propionil-CoA (Paulick, R.C. et al. J. Am. Chem. Soc. (1976) 98: 3370-3371) son iniciadores para muchos miembros de las clases de poliquétidos de tetraciclina y antraciclina, respectivamente (Figura 11). La daunorrubicina PKS puede aceptar también acetato, butirato, e isobutirato como unidades iniciales. (Oki, T. et al., J. Antibiot. (1981) 34: 783-790; Yoshimoto, A. et al. J. Antibiot. (1993) 46: 1758-1761).
La KR act puede interaccionar productivamente con todas las PKSs mínimas estudiadas hasta ahora y es no sólo necesaria sino también suficiente para catalizar una cetorreducción en C-9. Aunque se han encontrado KRs homólogas en otras agrupaciones de PKS, aquéllas catalizan la cetorreducción con la misma regioespecificidad. Sin embargo, las estructuras de frenolicina, griseusina y daunorrubicina (Figura 11), sugieren que en estos caminos de biosíntesis ocurre una cetorreducción adicional en C-17. Análogamente, varias anguciclinas sufren una cetorreducción en C-15, que ocurre antes que se cicle la cadena de poliquétido naciente (Gould, S.J. et al. J. Am. Chem. Soc. (1992) 1114: 10066-10068). Las cetorreductasas responsables de las reducciones en C-15 y C-17 no han sido identificadas todavía; sin embargo, se han encontrado dos KRs homólogas en la agrupación PKS de daunorrubicina (Grimm, A. et al. Gene (1994) 151: 1-10; Ye, J. et al. J. Bacteriol. (1994) 176: 6270-6280). Es probable que las mismas catalicen las reducciones en C-9 y C-17. Así, KRs responsables de la reducción regioespecífica de la columna vertebral de la cadena de carbonos en posiciones distintas de C-9 pueden ser dianas también para uso en la construcción de quimiotecas combinatorias.
La formación de los dos primeros anillos de seis miembros en la biosíntesis de la mayoría de los poliquétidos aromáticos bacterianos existentes naturalmente está controlada por subunidades PKS; adicionalmente, los cierres de anillo están controlados por ciclasas y enzimas modificantes adicionales. La diversidad estructural introducida por estas reacciones parece ser mayor que por la vía de las dos primeras ciclaciones. Sin embargo, se han observado ciertos patrones preferidos, lo que sugiere que al menos algunas de estas ciclasas situadas aguas abajo pueden ser útiles para la construcción de quimiotecas combinatorias. Por ejemplo, el anillo de pirano en las isocromanoquinonas (Figura 11) se forma invariablemente por ciclación entre C-3 y C-15; se observan dos clases estereoquímicamente distintas de productos (véanse, por ejemplo, las estructuras de actinorrodina y frenolicina en la Figura 11). En las antraciclinas y tetraciclinas, ocurre usualmente una tercera condensación aldólica entre C-3 y C-16, mientras que en las tetracenomicinas no reducidas (Figura 11) y compuestos afines ocurre aquélla entre C-5 y C-18, y en las anguciclinas (Figura 11) ocurre entre C-4 y C-17. Uno o más genes representativos codificantes de un pequeño número de estas enzimas han sido ya clonados (Fernández-Moreno, M. A. et al. J. Biol. Chem. (1994) 269: 24854-24863; Shen, B. et al., Biochemistry (1993) 32: 11149-11154). Al menos algunas ciclasas podrían reconocer cadenas de longitudes y/o grados de reducción alterados, aumentando con ello la diversidad de las quimiotecas combinatorias de poliquétidos aromáticos.
En la ausencia de ciclasas aguas abajo, las cadenas de poliquétidos sufren reacciones no enzimáticas. Recientemente, ha surgido cierto grado de predictibilidad dentro de este repertorio de posibilidades. Por ejemplo, los hemicetales y anillos de benceno son dos restos comunes observados en el extremo metilo. Los hemicetales se forman con un enol posicionado adecuadamente y pueden ir seguidos por una deshidratación. Los anillos de benceno se forman con un término metilo no ciclado más largo. En el término carboxilo, se observa frecuentemente un anillo de \gamma-pirona formado por tres unidades de quétido. En los extremos carboxilo libres activados por la existencia de un \beta-carbonilo ocurren descarboxilaciones espontáneas.
Un compuesto intermedio ciclado puede sufrir diversos tipos de modificaciones para generar el producto natural final. La recurrencia de ciertos motivos estructurales entre los poliquétidos aromáticos existentes naturalmente sugiere que algunas enzimas adaptadoras, particularmente transferasas de grupo, pueden ser combinatoriamente útiles. A continuación se exponen dos ejemplos.
La metilación en o es una modificación común aguas abajo. Aunque se han encontrado varios genes de o-metiltransferasa dependientes de SAM en agrupaciones de genes PKS (Decker, H. et al. J. Bacteriol. (1993) 175: 3876-3886), sus especificidades no se han estudiado sistemáticamente todavía. Quizás algunos de ellos podrían ser útiles para biosíntesis combinatoria. Por ejemplo, la metilación en O-11 ocurre en varios miembros de las clases de poliquétidos aromáticos de antraciclina, tetracenomicina, y anguciclina (Figura 11).
Tanto los poliquétidos aromáticos como los complejos están a menudo glicosilados. En muchos casos (v.g. doxorrubicina y eritromicina) la ausencia del o de los grupos azúcar da como resultado una bioactividad considerablemente más débil. Existe una diversidad tremenda tanto en los tipos como en los números de unidades azúcar unidos a agliconas de poliquétidos existentes naturalmente. En particular, se encuentran comúnmente desoxi- y aminoazúcares. Las preferencias regioquímicas pueden detectarse en muchos productos glicosilados naturales. Entre las antraciclinas, O-17 está frecuentemente glicosilado, mientras que entre las anguciclinas, está usualmente glicosilado C-10. Las glicosiltransferasas implicadas en la biosíntesis de eritromicina pueden tener especificidades relajadas para el resto aglicona (Donadio, S. et al. Science (1991) 252: 675-679). Una eloramicin-glicosiltransferasa puede ser capaz de reconocer una unidad NDP-azúcar no natural y fijar la misma regioespecíficamente a una poliquetido-aglicona aromática (Decker, H. et al Angew. Chem. (1995), en prensa). Estos resultados iniciales sugieren que las glicosiltransferasas derivadas de caminos metabólicos secundarios tienen propiedades exclusivas y pueden ser dianas atractivas para uso en la generación de quimiotecas combinatorias.
Aunque las PKSs modulares no han sido analizadas extensamente, la correspondencia de uno-a-uno entre sitios activos y estructura del producto (Figura 9), junto con la increíble diversidad química observada entre poliquétidos "complejos" existentes naturalmente, indica que el potencial combinatorio dentro de estos sistemas multienzimáticos podría ser considerablemente mayor que en el caso de las PKSs aromáticas. Por ejemplo, un campo más amplio de unidades iniciadoras con inclusión de monómeros alifáticos (acetato, propionato, butirato, isovalerato, etc.), aromáticos (ácido aminohidroxibenzoico), alicíclicos (ácido ciclohexanoico), y heterocíclicos (ácido pipecólico) se encuentran en diversos poliquétidos macrocíclicos. Estudios recientes han demostrado que las PKSs modulares tienen especificidad relajada para sus unidades iniciadoras (Kao et al. Science (1994), supra). El grado de \beta-cetorreducción después de una reacción de condensación puede alterarse también por manipulación genética (Donadio et al. Science (1991), supra; Donadio, S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 7119-7123). Análogamente, el tamaño del producto poliquétido puede modificarse por diseño de mutantes con el número de módulos apropiado (Kao, C.M. et al. J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 11612-11613). Las PKSs modulares exhiben también una variedad considerable en lo que respecta a la elección de unidades extendedoras en cada ciclo de condensación, aunque no se conoce todavía hasta qué grado puede manipularse esta propiedad. Por último, estas enzimas son particularmente bien conocidas por la generación de un campo espectacular de centros asimétricos en sus productos de una manera fuertemente controlada. Así pues, el potencial combinatorio dentro de los caminos de PKS modulares podría ser virtualmente ilimitado.
Como los actinomicetos, los hongos filamentosos son una fuente rica de productos de poliquétidos naturales. El hecho de que las PKSs fúngicas, tales como la sintasa del ácido 6-metilsalicílico (6-MSAS) y la mevinolin-sintasa, están codificadas por proteínas multi-dominio simples (Beck et al. Eur. J. Biochem. (1990), supra; Davis, R. et al. Abstr. Genet. Ind. Microorg. Meeting, supra) indica que las mismas pueden direccionarse también para mutagénesis combinatoria. Además, las PKSs fúngicas pueden expresarse funcionalmente en S. coelicolor CH999 utilizando la estrategia genética reseñada anteriormente. Se han encontrado longitudes de cadena no observadas en poliquétidos aromáticos bacterianos (v.g. tetraquétidos, pentaquétidos y hexaquétidos) entre los poliquétidos aromáticos fúngicos (O'Hagan, D. The Polyketide Metabolites (Ellis Horwood, Chichester, Reino Unido, 1991). Análogamente, los patrones de ciclación de los poliquétidos aromáticos fúngicos son muy diferentes de los observados en los poliquétidos aromáticos bacterianos (Id.). En contraste con las PKSs modulares de bacterias, se introducen grupos metilo ramificados en las cadenas principales de poliquétido fúngicas por metiltransferasas dependientes de S-adenosilmetionina; en el caso de la mevinolina PKS (Davis, R. et al. Abstr. Genet. Ind. Microorg. Meeting, supra), esta actividad está codificada como un solo dominio dentro de una PKS monocistrónica. Es posible ahora evaluar experimentalmente si estas y otras fuentes de diversidad química en los poliquétidos fúngicos son de hecho susceptibles de manipulación combinatoria.
Sobre la base del estado de la técnica expuesto anteriormente, y de los resultados presentados más adelante en los Ejemplos 1-8, los autores de la presente invención han desarrollado el conjunto de reglas de diseño siguientes para manipular racional o estocásticamente los pasos de biosíntesis iniciales en caminos de poliquétidos aromáticos que incluyen síntesis de la cadena, cetorreducción en C-9, y la formación de los dos primeros anillos aromáticos. Si cada grado de libertad de la biosíntesis fuese independiente de todos los demás, entonces sería posible diseñar una quimioteca combinatoria simple de N_{1} x N_{2} x ... N_{i} x ... N_{n-1} x N_{n} clones, donde N_{i} es el número de vías en las cuales puede explotarse el i-ésimo grado de libertad. En la práctica, sin embargo, no todos los grados de libertad enzimáticos son independientes. Por esta razón, a fin de minimizar la redundancia, es preferible diseñar varias sub-quimiotecas de clones productores de poliquétidos aromáticos.
(1) Longitud de cadena. La longitud de la cadena de carbonos del poliquétido está dictada por la PKS mínima (Figura 12). Dentro de la PKS mínima, la proteína portadora de acilo puede intercambiarse sin afectar a la especificidad, en tanto que el factor de longitud de cadena es crucial. Aunque algunas combinaciones cetosintasa/factor de longitud de cadena son funcionales, otras no lo son; por esta razón, la biosíntesis de una cadena de poliquétido de longitud especificada puede asegurarse con una PKS mínima en la cual tanto la cetosintasa como el factor de longitud de cadena son originados por la misma agrupación de genes PKS. Hasta ahora, longitudes de cadena de 16 (octaquétido), 18 (nonaquétido), 20 (decaquétido), y 24 carbonos (dodecaquétido) pueden generarse con PKSs mínimas procedentes de las agrupaciones act, tren, tcm, y whiE PKS, respectivamente (McDaniel et al. Science (1993), supra; McDaniel et al. J. Am. Chem. Soc. (1993), supra; McDaniel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), supra). La PKS whiE mínima puede generar también cadenas principales de 22 carbonos en presencia de una KR, lo que sugiere un grado de control de la longitud de cadena relajado como el encontrado para la PKS fren.
(2) Cetorreducción. La cetorreducción requiere una cetorreductasa (Figura 12). La KR act puede catalizar la reducción del carbonilo en C-9 (a contar desde el extremo carboxilo) de una cadena principal de poliquétido naciente de cualquier longitud estudiada hasta ahora. Adicionalmente, la KR act es compatible con todas las PKSs mínimas mencionadas anteriormente. Se han identificado cetorreductasas homólogas en otras agrupaciones de PKS (Sherman, D.H., et al. EMBO J. (1989) 8: 2717-2725; Yu, T.-W. et al. J. Bacteriol. (1994) 176: 2627-2534; Bibb, M.J. et al. Gene (1994) 142: 31-39). Estas enzimas pueden catalizar también cetorreducción en C-9, dado que todos los productos naturales correspondientes sufren esta modificación. En circunstancias excepcionales, se han observado también cetorreducciones en C-7 con la KR act.
(3) Ciclación del primer anillo. Aunque la PKS mínima por sí sola puede controlar la formación del primer anillo, el curso regioespecífico de esta reacción puede verse influenciado por otras proteínas PKS. Por ejemplo, la mayoría de las PKSs mínimas estudiadas hasta ahora producen poliquétidos con ciclaciones C-7/C-12 cuando están presentes solas (Figura 12). En contraste, la PKS mínima tcm sola genera tanto productos ciclados C-7/C-12 como C-9/C-14. La presencia de una cetorreductasa con cualquier PKS mínima restringe la cadena de poliquétido naciente para ciclarse exclusivamente con respecto a la posición de cetorreducción: ciclación C-7/C-12 para la cetorreducción en C-9 y ciclación C-5/C-10 para la cetorreducción en C-7 (McDaniel, R. et al. J. Am. Chem. Soc. (1993) 115: 11671-11675; McDaniel, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 11542-11546; McDaniel, R. et al. J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 10855-10859). Análogamente, el uso de la enzima TcmN altera la regioespecificidad a ciclaciones C-9/C-14 para poliquétidos no reducidos de longitudes diferentes, pero no tiene efecto alguno sobre moléculas reducidas (véase el Ejemplo 5 más adelante).
(4) Aromatización del primer anillo. El primer anillo en los poliquétidos no reducidos se aromatiza de modo no catalítico. En contraste, se requiere una subunidad de aromatización para los poliquétidos reducidos (Figura 12). Parece existir una jerarquía en la especificidad de longitud de cadena de estas subunidades procedentes de agrupaciones PKS diferentes. Por ejemplo, la ARO act reconocerá únicamente cadenas de 16 carbonos (McDaniel, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) supra), la ARO fren reconoce tanto cadenas de 16 como de 18 carbonos, mientras que la ARO gris reconoce cadenas de 16, 18, y 20 carbonos.
(5) Ciclación del segundo anillo. La ciclación C-5/C-14 del segundo anillo de poliquétidos reducidos puede realizarse con una ciclasa apropiada (Figura 12). Si bien la CYC act puede ciclar octa- y nonaquétidos, la misma no reconoce cadenas más largas. No se ha identificado ciclasa equivalente C-5/C-14 alguna con especificidad para decaquétidos o cadenas más largas, aunque las estructuras de productos naturales tales como griseusina implican su existencia. En el caso de cadenas no reducidas suficientemente largas con un primer anillo C-9/C-14, la formación de un segundo anillo C-7/C-16 está catalizada por la PKS mínima (Figura 12) (McDaniel, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) supra).
(6) Ciclaciones adicionales. Las subunidades KS, CLF, ACP, KR, ARO y CYC de la PKS catalizan juntas la formación de un compuesto intermedio con una longitud de cadena, patrón de reducción, y las dos primeras ciclaciones definidas. Si bien la biosíntesis de poliquétidos existentes naturalmente requiere por regla general la actividad de ciclasas situadas aguas abajo y otras enzimas modificadoras para generar el producto biológicamente activo característico, reacciones subsiguientes en la biosíntesis de poliquétidos modificados por ingeniería genética descritas en esta memoria y en un trabajo anterior de los autores de la presente invención ocurren en ausencia de enzimas específicas y están determinadas por las diferentes propiedades físicas y químicas de las moléculas individuales. Reflejando presumiblemente tales posibilidades y limitaciones químicas, se han observado patrones consistentes, que conducen a cierto grado de predictibilidad. Dos restos comunes formados por el término metilo no ciclado de cadenas de poliquétidos son hemicetales y anillos de benceno. La formación de un hemicetal ocurre en presencia de un enol posicionado adecuadamente y puede ir seguida por una deshidratación, dado que se aíslan a menudo formas tanto hidratadas como deshidratadas (Figura 13 (a)) (McDaniel, R. et al. Science (1993) 262: 1546-1550; McDaniel, R. et al. J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 10855-10859; Fu, H. et al. J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 4166-4170), mientras que la formación de anillos de benceno ocurre con extremos metilo no procesados más largos (Figura 13(b)) (Fu et al. J. Am. Chem. Soc. (1994), supra). El resto observado más frecuentemente en el término carboxilo de la cadena es un anillo de \gamma-pirona formado por tres unidades de quétido (Figura 13 (c)) (McDaniel, R. et al. J. Am. Chem. Soc. (1994) supra); Fu et al. J. Am. Chem. Soc. (1994), supra; Fu, H., et al. Biochemistry (1994) 33: 9321-9326; Fu, H. et al. Chem. & Biol. (1994), 1: 205-210; Zhang, H.-L. et al. J. Org. Chem. (1990) 55: 1662-1684; si queda un ácido carboxílico libre, se produce típicamente descarboxilación si existe un grupo \beta-carbonilo (Figura 13(d)) (McDaniel et al. Science (1993), supra; McDaniel, R., Ebert-Khosla, S., Hopwood, D.A. & Khosla, C. J. Am. Chem. Soc. (1993), supra; Kao, C.A. et al. J. AM. Chem. Soc. (1994) 116: 11612-11613). Pueden predecirse también muchas condensaciones aldólicas, teniendo en cuenta que los extremos metilo y carbonilo tienden preferentemente a ciclarse de modo independiente pero se co-ciclarán si no existe alternativa (Figura 13(e)) (McDaniel, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) supra). Estos patrones de ciclación no enzimáticos observados in vivo son también consistentes con estudios biomiméticos previos (Griffin, D. A. et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. (1994) 1: 1035-1042).
Consideradas junto con las estructuras de otros poliquétidos aromáticos bacterianos existentes naturalmente, las reglas de diseño presentadas anteriormente, pueden extrapolarse para estimar la extensión de diversidad molecular que podría generarse por biosíntesis combinatoria in vivo de, por ejemplo, poliquétidos reducidos y no reducidos. Para poliquétidos reducidos, los grados de libertad identificados incluyen longitud de cadena, aromatización del primer anillo, y ciclación del segundo anillo. Para los poliquétidos no reducidos, éstos incluyen longitud de cadena y regioespecificidad de la ciclación del primer anillo. El número de estructuras accesibles es el producto del número de vías por las cuales puede modificarse cada grado de libertad. Hasta ahora se han manipulado cadenas de cinco longitudes diferentes (longitudes de 16, 18, 20, 22 y 24 carbonos). A partir de la estructura y los caminos de biosíntesis deducidos de la dinemicin-antraquinona (Tokiwa, Y. et al. J. Am. Chem. Soc. (1992) 114: 4107-4110), simaomicina (Carter, G.T. et al. J. Org. Chem. (1989) 54: 4321-4323), y benastatina (Aoyama, T. et al. J. Antibiot. (1992) 45: 1767-1772), se anticipa el aislamiento de PKSs mínimas que generan cadenas principales de 14, 26, y posiblemente 28 carbonos, respectivamente, llevando el número potencial a 8. La clonación de tales PKSs mínimas puede realizarse utilizando los genes para PKSs mínimas que han sido aislados previamente, tales como los genes actI (Sherman et al. EMBO J. (1989), supra; Yu et al. J. Bacterial. (1994) supra; Bibb et al. Gene (1994), supra; Malpartida, F. et al. Nature (1987) 325: 818-821). Las cadenas reducidas pueden estar o no aromatizadas; una segunda ciclasa anular es opcional en los casos en que el primer anillo está aromatizado (Figura 12). La regioespecificidad de la primera ciclación de una cadena no reducida puede modificarse, dependiendo de la presencia de una enzima como TcmN.
Por ejemplo, para poliquétidos reducidos, los grados de libertad relevantes incluyen la longitud de cadena (que pueden manipularse al menos de dos maneras), la aromatización del primer anillo (que puede manipularse al menos de dos maneras), y la ciclación del segundo anillo (que puede manipularse al menos de dos maneras para los compuestos intermedios aromatizados únicamente). Para poliquétidos no reducidos, puede manipularse también la regioespecificidad de la primera ciclación. Así, el potencial combinatorio para poliquétidos reducidos es al menos 7 x 3 = 21; para los poliquétidos no reducidos el potencial combinatorio es al menos 7 x 2 = 14. Además, estos números no incluyen productos menores adicionales, del orden de 5 a 10 por cada producto principal, que se producen en las cepas recombinantes por pasos catalizados no enzimáticamente o catalizados por enzimas inespecíficas. Así, el número de poliquétidos que puede generarse por manipulación combinatoria de sólo los dos primeros pasos en la biosíntesis de los poliquétidos aromáticos es del orden de varios centenares. Por tanto, la biosíntesis modificada por ingeniería genética representa una fuente potencialmente ilimitada de diversidad química para descubrimiento de
fármacos.
El número de nuevos poliquétidos potenciales aumenta geométricamente a medida que se explotan nuevos grados de libertad y/o que se desarrollan estrategias de ingeniería de proteínas para intervenir en el trabajo de creación de subunidades enzimáticas con especificidades no observadas en la naturaleza. Por ejemplo, pueden incorporarse unidades iniciales distintas de acetato en las cadenas principales de poliquétidos (v.g. propionato en la daunorrubicina y malonamida en la oxitetraciclina). Adicionalmente, enzimas que catalizan ciclaciones aguas abajo y modificaciones del último paso, tales como reacciones de transferencia de grupos y oxidorreducciones observadas comúnmente en los poliquétidos existentes en la naturaleza, pueden estudiarse a lo largo de las líneas presentadas en esta memoria y en otros lugares. Por tanto, es posible que al menos algunos de estos grados de libertad puedan explotarse combinatoriamente para generar quimiotecas de productos sintéticos con diversidad estructural que es comparable a la observada en la naturaleza.
C. Experimental
A continuación se dan ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen únicamente para propósitos ilustrativos, y no deben considerarse limitantes del alcance la presente invención en modo alguno.
Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (v.g., cantidades, temperaturas, etc.) pero, por supuesto, debe tolerarse algún error y desviación experimental.
Materiales y métodos
Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de cultivo. Se utilizó S. coelicolor CH999 como hospedador para transformación por todos los plásmidos. La construcción de esta cepa se describe a continuación. Las manipulaciones de DNA se llevaron a cabo en Escherichia coli MC1061. Los plásmidos se pasaron a través de E. coli ET12567 (dam dcm hsdS Cm^{r}) (MacNeil, D.J. J. Bacteriol. (1988) 170: 5607) para generar DNA no metilado antes de la transformación de S. coelicolor. Las cepas de E. coli se dejaron crecer en condiciones estándar. Las cepas de S. coelicolor se dejaron crecer sobre placas de agar R2YE (Hopwood, D.A. et al. Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratory manual. The John Innes Foundation: Norwich, 1985).
Manipulación de DNA y organismos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó utilizando polimerasa Taq (Perkin Elmer Cetus) en condiciones recomendadas por el fabricante de la enzima. Se utilizaron técnicas estándar in vitro para las manipulaciones del DNA (Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (edición actual)). Se transformó E. coli con un aparato pulsante Bio-Rad de E. coli, utilizando protocolos proporcionados por Bio-Rad. Se transformó S. coelicolor por procedimientos estándar (Hopwood, D.A. et al. Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratory manual. The John Innes Foundation: Norwich, 1985) y los transformantes se seleccionaron utilizando 2 ml de una capa superior de tioestreptona de 500 mg/ml).
Construcción de plásmidos que contienen PKSs recombinantes. Todos los plásmidos son derivados de pRM5, descrito a continuación. Los genes PKS fren se amplificaron por PCR con sitios de restricción 5' y 3' que flanqueaban los genes de acuerdo con la localización de los sitios de clonación en pRM5 (a saber, PacI-NsiI para ORF1, NsiI-XbaI para ORF2, y XbaI-PstI para ORF3). Después de subclonación y secuenciación, los fragmentos amplificados se clonaron en lugar de los fragmentos correspondientes en pRM5 para generar los plásmidos para transformación.
Producción y purificación de los poliquétidos. Para el escrutinio inicial, todas las cepas se dejaron crecer a 30ºC en forma de céspedes confluentes sobre 10-30 placas, cada una de las cuales contenía aproximadamente 30 ml de medio agar durante 6-8 días. Se prepararon placas adicionales en caso necesario para obtener material suficiente para la caracterización completa. CH999 era un control negativo cuando se escrutó para poliquétidos potenciales. El agar se desmenuzó finamente y se extrajo con acetato de etilo/ácido acético al 1% o acetato de etilo:metanol ((4:1)/ácido acético al 1%. El extracto concentrado se sometió luego a vaporización súbita a través de una columna de cromatografía con gel de sílice (Baker 40 nm) en acetato de etilo/ácido acético al 1%. Alternativamente, el extracto se aplicó a una columna Florisil (Fisher Scientific) y se eluyó con acetato de etilo:etanol:ácido acético (17:2:1). La fracción amarilla primaria se purificó ulteriormente por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando un gradiente 20-60% de acetonitrilo/agua/ácido acético al 1% en una columna preparativa de fase inversa (E-18) (Beckman). Se observó la absorbancia a 280 nm y 410 nm. En general, el rendimiento de producto purificado a partir de estas cepas era aproximadamente 10 mg/l para los compuestos 1 y 2 (Figura 4), y 5 mg/l para los compuestos 7 y 8 (Figura 7).
SEK4, (12), se produjo y purificó como sigue. Se dejó crecer CH999/pSEK4 sobre placas de agar 90 (\sim 34 ml/placa) a 30ºC durante 7 días. El agar se desmenuzó y se extrajo con acetato de etilo/metanol (4:1) en presencia de ácido acético al 1% (3 x 1000 ml). Después de la eliminación del disolvente a vacío, se añadieron 200 ml de acetato de etilo que contenía 1% de ácido acético. El precipitado se separó por filtración y se desechó, después de lo cual se evaporó el disolvente a sequedad. La mezcla de productos se aplicó a una columna Florisil (Fisher Scientific), y se eluyó con acetato de etilo que contenía 3% de ácido acético. La primera fracción de 100 ml se recogió, y se concentró hasta 5 ml. Se añadió 1 ml de metanol, y la mezcla se mantuvo a 4ºC durante una noche. El precipitado se recogió por filtración, y se lavó con acetato de etilo para dar 850 mg de producto puro. R_{f} = 0,48 (acetato de etilo con 1% de ácido acético). Los resultados de la espectroscopia NMR sobre SEK4 se consignan en la Tabla 4. FAB HRMS (NBA), M+H^{+}, m/e calculada 319,0818, m/e observada 319,0820.
Para producir SEK15 (13) y SEK15b (16), se dejó crecer CH999/pSEK15 sobre placas de agar 90, y el producto se extrajo de la misma manera que SEK4. la mezcla se aplicó a una columna Florisil (acetato de etilo con 5% de ácido acético), y las fracciones que contenían los productos principales se combinaron y evaporaron a sequedad. Los productos se purificaron ulteriormente utilizando HPLC preparativa de fase inversa con C-18 (Beckman) (fase móvil: acetonitrilo/agua = gradiente 1/10 a 3/5 en presencia de 1% de ácido acético). El rendimiento de SEK15, (13), fue 250 mg. R_{f} = 0,41 (acetato de etilo con 1% de ácido acético). Los resultados de la espectroscopia NMR sobre SEK4 se consignan en la Tabla 4. FAB HRMS (NBA), M+H^{+}, m/e calculada 385,0923, m/e observada 385,0920.
Experimentos de cebado con [1,2-^{13}C_{2}]-acetato. Dos matraces de 2 l, cada uno de los cuales contenía 400 ml de medio NMP modificado (Strauch, E. et al. Mol. Microbiol. (1991) 5: 289) se inocularon con esporas de S. coelicolor CH999/pRM18, CH999/pSEK4 o CH999/pSEK15, y se incubaron en una máquina de sacudidas a 30ºC y 300 rpm. Se añadieron a cada matraz 50 mg de [1,2-^{13}C_{2}]-acetato de sodio (Aldrich) al cabo de 72 y 96 horas. Después de 120 horas, los cultivos se reunieron y se extrajeron con 2 volúmenes de 500 ml de acetato de etilo/1% ácido acético. La fase orgánica se mantuvo y la purificación transcurrió como se ha descrito arriba. Los datos NMR con ^{13}C indican aproximadamente un enriquecimiento de 2-3% para el producto CH999/pRM18; un enriquecimiento de 0,5-1% para SEK4 y un enriquecimiento de 1-2% para SEK15.
Espectroscopia NMR. Todos los espectros se registraron en un equipo Varian XL-400 excepto para el análisis HETCOR de RM18 (10) (Figura 8), que se realizó en un equipo Nicolet NT-360. Los espectros ^{13}C se adquirieron con desacoplamiento de protones continuo de banda ancha. Para los estudios NOE de RM18 (10), se empleó el método de la diferencia unidimensional. Todos los compuestos se disolvieron en DMSO-d_{6} (Sigma, 99+% atómico D) y los espectros se referenciaron internamente al disolvente. Las resonancias del hidroxilo se identificaron por adición de D_{2}O (Aldrich, 99% atómico D) y comprobación para la desaparición de señal.
Ejemplo 1 Producción de S. coelicolor CH999
Una célula hospedadora de S. coelicolor, modificada por ingeniería genética para eliminar la agrupación de genes act nativa, y denominada CH999, se construyó utilizando S. coelicolor CH1 (Khosla, C. Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237), utilizando la estrategia representada en la Figura 2. (CH1 se deriva de S coelicolor B385 (Rudd, B.A.M. Genetics of Pigmented Secondary Metabolites in Streptomyces coelicolor (1978) Ph. D. Thesis, Universidad de East Anglia, Norwich, Inglaterra). CH1 incluye la agrupación de genes act que codifica enzimas implicadas en la biosíntesis y exportación del antibiótico poliquétido actinorrodina. La agrupación está constituida por los genes PKS, flanqueados por varios genes biosintéticos post-PKS que incluyen los implicados en ciclación, aromatización, y elaboración química subsiguiente (Figura 2A). Están presentes también los genes responsables de la activación de la transcripción de los genes act. La agrupación de genes act se delecionó de CH1 utilizando recombinación homóloga como se describe en Khosla, C. et al. Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237.
En particular, se construyó el plásmido pLRermEts (Figura 2B) con las características siguientes: un replicón ColEI de pBR322, el replicón sensible a la temperatura de pSG5 (Ruth, G. et al. Mol. Gen. Genet. (1989) 219: 341), marcadores de resistencia a ampicilina y tioestreptona, y una casete de interrupción que incluía un fragmento BamHI/XhoI de 2 kb desde el extremo 5' de la agrupación act, un fragmento ermE de 1,5 kb (Khosla, C. et al. Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237), y un fragmento SphI/PstI de 1,9 kb desde el extremo 3' de la agrupación act. El fragmento 5' se extendía desde el sitio 1 de BamHI (Malpartida, F. y Hopwood, D.A. Nature (1984) 309: 462; Malpartida, F. y Hopwood, D.A. Mol. Gen. Genet. (1986) 205: 66) aguas abajo hasta un sitio XhoI. El fragmento 3' se extendía desde el sitio 20 de PstI aguas arriba hasta el sitio 19.2 de SphI (Fernández-Moreno, M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278). Los fragmentos 5' y 3' (representados como DNA sombreado con rayas en la Figura 2) se clonaron en la misma orientación relativa que en la agrupación act. CH1 se transformó con pLRermEts. El plásmido se curó subsiguientemente de transformantes candidatos por aplicación en bandas no selectiva a 39ºC. Se aislaron varias colonias que eran resistentes a lincomicina, sensibles a tioestreptona, e incapaces de producir actinorrodina, y se comprobaron por transferencia Southern. Una de ellas se designó CH999.
Ejemplo 2 Producción del Vector Recombinante pRM5
Se utilizan plásmidos lanzadera para expresar PKSs recombinantes en CH999. Tales plásmidos incluyen típicamente un replicón colEI, un replicón SCP2* de Streptomyces truncado adecuadamente, dos promotores act para permitir la clonación bidireccional, el gen codificante del activador actII-ORF4 que induce transcripción desde los promotores act durante la transición desde la fase de crecimiento a la fase estacionaria, y genes marcadores apropiados. En estos vectores se han diseñado sitios de restricción para facilitar la construcción combinatoria de agrupaciones de genes PKS partiendo de casetes que codifican subunidades individuales (o dominios) de PKSs existentes naturalmente. Las ventajas principales de este método son que (i) todos los genes biosintéticos relevantes son transportados por el plásmido y por consiguiente susceptibles de manipulación fácil y mutagénesis en E. coli, (ii) la quimioteca entera de las agrupaciones de genes PKS puede expresarse en el mismo hospedador bacteriano que está bien caracterizado genética y fisiológicamente y presumiblemente contiene la mayor parte, si no la totalidad, de las actividades auxiliares requeridas para producción de poliquétidos in vivo, (iii) los poliquétidos se producen de una manera semejante a metabolitos secundarios, aminorando con ello los efectos tóxicos de la síntesis de compuestos potencialmente bioactivos in vivo, y (iv) las moléculas así producidas sufren menos reacciones secundarias que si se expresaran los mismos caminos en organismos de tipo salvaje o mutantes bloqueados.
pRM5 (Figura 3) fue el plásmido lanzadera utilizado para expresar PKSs en CH999. El mismo incluye un replicón ColEI para permitir la ingeniería genética en E. coli, un replicón SCP2* truncado adecuadamente (de número de copias bajo) de Streptomyces, y el gen activador actII-ORF4 de la agrupación act, que induce transcripción desde los promotores act durante la transición desde la fase de crecimiento a la fase estacionaria en el micelio vegetativo. Como se muestra en la Figura 3, pRM5 lleva el par de promotores actI/actIII divergentes, junto con sitios de clonación convenientes para facilitar la inserción de una diversidad de genes PKS diseñados aguas abajo de ambos promotores. pRM5 carece del locus par de SCP2*; como resultado, el plásmido es ligeramente inestable (aproximadamente 2% de pérdida en ausencia de tioestreptona). Esta característica se introdujo deliberadamente a fin de permitir una confirmación rápida de que podría asignarse inequívocamente un fenotipo de interés a la PKS mutante transportada por el plásmido. Las PKSs recombinantes de pRM5 se expresan aproximadamente en la transición desde la fase de crecimiento exponencial a la fase estacionaria, con rendimientos satisfactorios.
Se construyó pRM5 como sigue. Un fragmento SphI/HindIII de 10,5 kb de pIJ903 (que contenía una porción del locus de fertilidad y el origen de replicación de SCP2* así como el origen de replicación de colEI y el gen de \beta-lactamasa de pBR327) (Lydiate, D.J. Gene (1985) 35: 223) se ligó con una casete del gen HindIII/SphI tsr de 1,5 kb para producir pRM1. Se construyó pRM5 por inserción de los dos fragmentos siguientes entre los sitios singulares HindIII y EcoRI de pRM1: un fragmento HindIII/HpaI (romo) de 0,3 kb que llevaba un terminador de la transcripción del fago fd (Khosla, C. et al. Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237), y un fragmento de 10 kb de la agrupación act que se extendía desde el sitio NcoI (1 kb aguas arriba del gen activador actII-ORF4) (Hallam, S.E. et al. Gene (1988) 74: 305; Fernández-Moreno, M.A. et al. Cell (1991) 66: 769; Caballero, G.L. Mol. Gen. Genet. (1991) 230: 401) hasta el sitio PstI aguas abajo de los genes actI-VII-IV (Fernández-Moreno, M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278).
Para facilitar la expresión de cualquier PKS recombinante deseada bajo el control del promotor actI (que está activado por el producto del gen actII-ORF4), se diseñaron sitios de restricción para PacI, NsiI, XbaI, y PstI en el DNA de act en posiciones intercistrónicas. En pRM5, así como en todos los restantes plásmidos de expresión de PKS descritos en esta memoria, se clonaron alelos ORF1, 2, y 3 entre estos sitios como casetes diseñadas con sus propios RBSs.
En particular, en la mayoría de las agrupaciones de genes de poliquetido-sintasas aromáticas existentes naturalmente en actinomicetos, ORF1 y ORF2 están acoplados por traducción. A fin de facilitar la construcción de PKSs recombinantes, los alelos ORF1 y ORF2 utilizados en esta memoria se clonaron como casetes independientes (desacopladas). Para el ORF1 de act, se diseñó la secuencia siguiente en pRM5: CCACCGGACGAACGCATCGATTAATTAAGGAG
GACCATCATG, donde la secuencia en negrita corresponde al DNA aguas arriba de la región actI, TTAATTAA es el sitio de reconocimiento de PacI, y ATG es el codón de partida del ORF1 de act. Se diseñó la secuencia siguiente entre ORF1 y ORF2 de act: NTGAATGCATGGAGGAGCCATCATG, donde TGA y ATG son los codones de parada e inicio de ORF1 y ORF2, respectivamente, ATGCAT es el sitio de reconocimiento de NsiI, y el reemplazamiento de N (A en el DNA de act, A o G en los alelos de otras PKSs) con un C da como resultado el desacoplamiento de traducción. Se diseñó la secuencia siguiente aguas abajo del ORF2 de act: TAATCTAGA, donde TAA es el codón de parada, y TCTAGA es el sitio de reconocimiento de XbaI. Esto permitió la fusión de ORF1 y ORF2 de act (diseñados como anteriormente) a un sitio XbaI que se había diseñado aguas arriba del ORF3 de act (Khosla, C. et al. Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237). Como control, se construyó pRM2, idéntico a pRM5, pero que carecía de cualquiera de las secuencias diseñadas. ORF1 y ORF2 en pRM2 están acoplados por traducción. La comparación de los perfiles de producto de CH999/pRM2 y CH999/pRM5 reveló que la estrategia de desacoplamiento aquí descrita no tenía influencia detectable alguna sobre la distribución de los productos o los niveles de producto.
Ejemplo 3 Poliquétidos Producidos Utilizando CH999 Transformado con pRM5
Se introdujo el plásmido pRM5 en S. coelicolor CH999 utilizando técnicas estándar. (Véase, v.g. Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Edición actual). CH999 transformado con pRM5 produjo una gran cantidad de material de color amarillento-pardo. Los dos productos más abundantes se caracterizaron por NMR y espectroscopia de masas como aloesaponarina II (2) (Bartel, P.L. et al. J. Bacteriol. (1990) 172: 4816) y su análogo carboxilado, ácido 3,8-dihidroxi-1-metilantraquinona-2-carboxílico (1) (Cameron, D.W. et al. Liebigs Ann. Chem. (1989) 7: 699) (Figura 4). Se supone que 2 se deriva de 1 por descarboxilación no enzimática (Bartel, P.L. et al. J. Bacteriol. (1990) 172: 4816). Los compuestos 1 y 2 estaban presentes en una relación molar de aproximadamente 1:5. Aproximadamente 100 mg de la mezcla pudieron purificarse fácilmente a partir de 1 l de cultivo. El sistema hospedador-vector CH999/pRM5 estaba funcionando por tanto como era de esperar para producir cantidades importantes de un metabolito poliquétido estable, modificado sólo mínimamente. La producción de 1 y 2 es consistente con el camino propuesto de la biosíntesis de actinorrodina (Bartel, P.L. et al. J. Bacteriol. (1990) 172: 4816). Ambos metabolitos, como la cadena principal de actinorrodina, se derivan de un poliquétido de 16 carbonos con una sola cetorreducción en C-9.
Cuando se transformó CH999 con pSEK4, idéntico a pRM5 excepto en lo referente al reemplazamiento de un fragmento SphI/SalI de 140 pb dentro del gen KR act por el fragmento SphI/SalI de pUC19, la cepa resultante produjo cantidades abundantes del poliquétido aromático SEK4 (12). La estructura exacta de este producto es ligeramente diferente de la desoxieritrolaccina (Bartel, P.L. et al. J. Bacteriol. (1990) 172: 4816). Sin embargo, estudios de marcación isotópica in vivo utilizando acetato marcado con 1,2-^{13}C_{2} confirmaron que la cadena principal del poliquétido se deriva de 8 acetatos. Además, la región aromática del espectro ^{1}H, así como el espectro ^{13}C NMR de este producto, son consistentes con una estructura tricíclica similar a 1, pero que carece de cualquier cetorreducción (véase Tabla 4).
Ejemplo 4 Construcción y Análisis de Poliquetido-Sintasas Híbridas a. Construcción de PKSs híbridas que incluyen componentes de las PKSs act, gra y tcm
La Figura 1A muestra las PKSs responsables de la síntesis de las columnas vertebrales de la cadena de carbono de actinorrodina (3), granaticina (4), y tetracenomicina (5) (estructuras que se muestran en la Figura 5) que contienen subunidades homólogas supuestas KS/AT y ACP, así como el producto de ORF2. Las PKSs act y gra tienen también KRs, que faltan en la PKS tcm. Las proteínas correspondientes de cada agrupación exhiben un alto grado de identidad de secuencia. Las identidades porcentuales entre las proteínas PKS correspondientes en las tres agrupaciones son como sigue: KS/AT: act/gra 76, act/tcm 64, gra/tcm 70; CLF: act/gra 60, atc/tcm 58, gra/tcm 54; ACP: act/gra 60, act/tcm 43, gra/tcm 44. Las PKSs act y gra sintetizan cadenas principales de 16 carbonos idénticas derivadas de 8 residuos acetato con una cetorreducción en C-9 (Figura 6). En contraste, como se muestra también en la Figura 6, la cadena principal del poliquétido tcm difiere en longitud total de cadena de carbonos (20 carbonos en lugar de 16), carencia de cualquier cetorreducción, y regioespecificidad de la primera ciclación, que ocurre entre los carbonos 9 y 14, en lugar de los carbonos 7 y 12 para act y gra.
En un intento de generar nuevos poliquétidos que difieran en una gama de propiedades, y para elucidar aspectos de la programación de PKSs aromáticas, una serie sistemática de agrupaciones de genes PKS mínimas, utilizando diversas permutaciones de los productos génicos de ORF1 (que codifica la subunidad KS/AT), ORF2 (que codifica la subunidad CLF) y ORF3 (que codifica la subunidad ACP) de las agrupaciones de genes act, gra y tcm se clonaron en pRM5 en lugar de los genes act existentes, como se muestra en la Tabla 1. Los plásmidos resultantes se utilizaron para transformar CH999 como anteriormente.
El análisis de los productos de las PKSs recombinantes que contenían diversas permutaciones entre las subunidades KS/AT, producto de ORF2, y ACP de las PKSs (conteniendo también todas las construcciones los genes act KR, ciclasa, y deshidratasa) indicó que las sintasas podrían agruparse en tres categorías (Tabla 1): aquéllas que no producían poliquétido alguno, aquéllas que producían el compuesto 1 (además de una pequeña cantidad de 2); y aquéllas que producían un nuevo poliquétido 9 (designado RM20) (Figura 6). La estructura de 9 sugiere que el precursor de la cadena principal de poliquétido de esta molécula se deriva de 10 residuos acetato con una sola cetorreducción en la posición C-9.
A fin de investigar la influencia de actKR en los patrones de reducción y ciclación de una cadena de poliquétido heteróloga, se construyó también pSEK15, que incluía los ORFs 1-3 de tcm, pero carecía de la act KR. (La deleción en el gen act KR en esta construcción era idéntica a la existente en pSEK4.). El análisis de CH999/pSEK15 mostró el producto de la cadena de 20 carbonos, SEK15 (13) que se asemejaba, pero no era idéntico, a la tetracenomicina C o sus productos de derivación. La espectroscopia NMR era consistente también con una cadena principal de decaquétido sin reducción alguna (véase Tabla 4).
Todos los híbridos act/gra producían el compuesto 1, consistente con las estructuras idénticas de los poliquétidos supuestos de actinorrodina y granaticina. En todos los casos en que pudo aislarse un producto a partir de un híbrido tcm/act, la longitud de cadena del poliquétido era idéntica a la del producto natural correspondiente a la fuente de ORF2. Esto implica que el producto de ORF2, y no las ACP o KS/AT, controla la longitud de la cadena de carbonos. Adicionalmente, dado que todos los poliquétidos producidos por los híbridos descritos en esta memoria, excepto aquéllos que carecían de la KR (CH999/pSEK4 y CH999/pSK15), sufrían una sola cetorreducción, puede llegarse a la conclusión de que: (i) la KR es no sólo necesaria sino también suficiente para que se produzca cetorreducción; (ii) esta reducción ocurre siempre en la posición C-9 en la cadena principal del poliquétido final (a contar desde el extremo carboxilo de la cadena); y (iii) si bien los poliquétidos no reducidos pueden experimentar patrones de ciclación alternativos, en las cadenas de poliquétido nacientes que han sufrido cetorreducción, la regioquímica de la primera ciclación viene dictada por la posición del hidroxilo resultante, con indiferencia del modo en que ocurre esta ciclación en el producto no reducido. Dicho de otro modo, la PKS de tcm podría diseñarse para exhibir nueva especificidad de ciclación incluyendo una cetorreductasa.
Una característica notable de RM20 (9) es el patrón de ciclaciones que siguen a la primera ciclación. El aislamiento de la mutactina (6) a partir de un mutante actVII sugería que el producto actVII y su homólogo tcm catalizan la ciclación del segundo anillo en la biosíntesis de actinorrodina (3) y tetracenomicina (5), respectivamente (Sherman, D.H. et al. Tetrahedron (1991) 47: 6029; Summers, R.G. et al. J. Bacteriol. (1992) 174: 1810). El patrón de ciclación de RM20 (9) es diferente del de 1 y de la tetracenomicina F1, a pesar de la presencia del gen actVII en pRM20 (9). Por consiguiente, parece ser que la ciclasa act no puede ciclar cadenas de poliquétido más largas.
Inesperadamente, la cepa que contenía la PKS tcm mínima sola (CH999/pSEK33) producía dos poliquétidos, SEK15 (13) y SEK15b (16), como se representa en la Figura 8, en cantidades aproximadamente iguales. Los compuestos (13) y (16) se aislaron también de CH999, pSEK15; sin embargo, en esta construcción se aislaron mayores cantidades de compuesto (13) de que del compuesto (16).
SEK15b es un compuesto nuevo, cuya estructura se elucidó por una combinación de espectroscopia NMR, experimentos de cebado con [1,2-^{13}C_{2}]-acetato de sodio y espectroscopia de masas. Los resultados de ^{1}H y ^{13}C NMR indicaron que SEK15b estaba constituido por un resto antraquinona no reducido y un resto pirona. Los experimentos de cebado con [1,2-^{13}C_{2}]-acetato de sodio confirmaron que la cadena de carbonos de SEK15b se derivaba de 10 unidades acetato. Las constantes de acoplamiento calculadas a partir del espectro ^{13}C NMR de la muestra de SEK15b enriquecida facilitaron la asignación de picos. La espectroscopia de masas con bombardeo de átomos rápidos (FAB) dio un peso molecular de 381 (M+H^{+}), consistente con C_{20}H_{12}O_{8}. Se utilizó intercambio de deuterio para confirmar la presencia de cada hidroxilo en SEK15b.
A fin de identificar los grados de libertad disponibles in vivo para una cadena de poliquétido naciente para ciclación en ausencia de una ciclasa activa, se analizaron los poliquétidos producidos por S. coelicolor CH999/pRM37 recombinante (McDaniel et al. (1993), supra). Las enzimas biosintéticas codificadas por pRM37 son la cetosintasa/aciltransferasa tcm (KS/AT), el factor determinante de la longitud de cadena (CLF) tcm, la proteína portadora de acilo (ACP) tcm y la cetorreductasa (KR) act.
Dos nuevos compuestos, RM20b (14) y RM20c (15) (Figura 8) se descubrieron en el medio de cultivo de CH999/
pRM37, que había producido previamente RM20 (9). Las cantidades relativas recuperadas de los tres compuestos eran 3:7:1 (RM20:RM20b:RM20c). Las estructuras de (14) y (15) se elucidaron por una combinación de espectroscopia de masas, espectroscopia NMR y experimentos de marcación con isótopos. Los espectros ^{1}H y ^{13}C NMR sugirieron que RM20b y RM20c eran diastereoisómeros, cada uno de los cuales contenía un resto pirona. Se encontró que las rotaciones ópticas ([\alpha]_{D}^{20}) eran +210,8º para RM20b (EtOH, 0,55%) y +78,0º para RM20c (EtOH, 0,33%). Los experimentos de cebado con [1,2-^{13}C_{2}]-acetato de sodio confirmaron que la cadena de carbonos de RM20b (y por inferencia RM20c) se derivaba de 10 unidades acetato. Se realizaron estudios de intercambio de deuterio a fin de identificar los picos ^{1}H NMR correspondientes a grupos hidroxilo potenciales tanto en RM20b como en RM20c. Se calcularon las constantes de acoplamiento de protones a partir de los resultados de los experimentos ^{1}H NMR y de desacoplamiento unidimensional. En particular, el patrón de acoplamiento en la región situada campo arriba del espectro indicaba un sistema de espín de 5 protones de dos grupos metileno que rodeaban un protón metino central de carbinol. La espectroscopia de masas con bombardeo de átomos rápidos (FAB) de alta resolución daba pesos moleculares de (519,0056) (M=Cs^{+}) para RM20b y 387,1070 (M+H^{+}) para RM20c, lo cual es consistente con C_{20}H_{18}O_{8} (M+Cs^{+}, 519,0056; M+H^{+}, 387,1080). Basándose en estos datos, se asignaron las estructuras (14) y (15) (Figura 8) a RM20b y RM20c, respectivamente.
Los datos de ^{1}H y ^{13}C NMR indicaron que las constantes de acoplamiento entre H-9 y los protones geminales en C-8 eran 12,1 ó 12,2 y 2,5 ó 2,2 Hz para RM20b o RM20c, respectivamente. Las constantes de acoplamiento entre H-9 y los protones geminales en C-10 eran 9,6 ó 9,7 y 5,7 ó 5,8 Hz para RM20b o RM20c, respectivamente. Estos valores son típicos de un patrón de acoplamiento J_{a,a} (J_{9a,8a} o J_{9a,10a}) y J_{a,e} (J_{9a,8e} o J_{9a,10e}), e indican una posición axial para H-9 tanto en RM20b como en RM20c. En contraste, los desplazamientos químicos de los hidroxilos C-7 en las dos moléculas eran 16,18 y 6,14 ppm para RM20b y RM20c, respectivamente. Estos valores indican un enlace de hidrógeno entre el hidroxilo C-7 y un átomo aceptor posicionado adecuadamente en RM20b, pero no en RM20c. Los átomos aceptores candidato más probables para dicho enlace de hidrógeno son el oxígeno de carbonilo C-13 en el sistema de anillos conjugados de pirona, o el oxígeno puente en el anillo de pirona aislado. El primero parece probable, dado que sería imposible discriminar entre (14) y (15) en el último caso. Adicionalmente, la comparación de los espectros ^{13}C NMR de RM20b y RM20c reveló que las mayores diferencias entre (14) y (15) se encontraban en los desplazamientos químicos de los carbonos que forman el anillo conjugado de pirona (+5,9, -6,1, +8,9, -7,8 y +2,0 ppm para C-11, C-12, C-13, C-14 y C-15, respectivamente). Un patrón de este tipo de desplazamientos alternantes campo arriba y campo abajo puede explicarse por el hecho de que el hidroxilo C-7 está unido por hidrógeno al carbonilo C-13, dado que sería de esperar que el enlace de hidrógeno reduzca la densidad electrónica alrededor de C-11, C-13 y C-15, pero aumente la densidad electrónica alrededor de C-12 y C-14. Para confirmar la asignación de enlaces de hidrógeno C-7/C-13, los protones intercambiables RM20b y RM20c se reemplazaron con deuterio (por incubación en presencia de D_{2}O), y las muestras se analizaron por ^{13}C NMR. El pico C-13 en RM20b, pero no en RM20c, sufrió un desplazamiento campo arriba (1,7 ppm), que puede explicarse por una unión no covalente C-7/C-13 más débil en RM20b cuando se reemplaza el hidrógeno con deuterio. A fin de formar un enlace de hidrógeno con el carbonilo C-13, el hidroxilo C-7 de RM20b tiene que ocupar la posición ecuatorial. Por tanto, puede inferirse que los hidroxilos C-7 y C-9 se encuentran en la misma cara (sin) del sistema de anillos conjugado en el isómero principal (RM20b), en tanto que se encuentran en caras opuestas (anti) en el isómero menor
(RM20c).
No pudo detectarse poliquétido alguno en CH999/pRM15, /pRM35, y /pRM36. Así pues, únicamente son funcionales algunas combinaciones ORF1-ORF2. Dado que cada subunidad era funcional en al menos una sintasa recombinante, es improbable que la causa sean problemas de expresión/plegamiento de proteínas. En lugar de ello, son explicaciones plausibles la asociación imperfecta o inhibidora entre las diferentes subunidades de estos complejos enzimáticos, o la biosíntesis de productos de cadena corta (abortados) que se degradan rápidamente.
b. Construcción de PKS s híbridas que incluyen componentes de las PKS s act y fren
Streptomyces roseofulvus produce a la vez frenolicina B (7) (Iwai, Y. et al. J. Antibiot. (1978) 31: 959) y nanaomicina A (8) (Tsuzuki, K. et al. J. Antibiot. (1986) 39: 1343). Un fragmento de DNA de 10 kb (al que se hace referencia en lo sucesivo como el locus fren) se clonó a partir de una quimioteca genómica de S. roseofulvus (Bibb, M.J. et al. presentado) utilizando DNA codificante de los componentes KS/AT y KR de la PKS act de S. coelicolor A3 (2) como sonda (Malpartida, F. et al. Nature (1987) 325: 818). (Véase la Figura 7 para representaciones estructurales). La secuenciación del DNA del locus fren reveló la existencia de (entre otros) genes con un alto grado de identidad a los que codificaban las KS/AT, CLF, ACP, KR y ciclasa de act.
Para producir los nuevos poliquétidos, los genes act de ORF1, 2 y 3 presentes en pRM5 se reemplazaron con los genes fren correspondientes, como se muestra en la Tabla 2. S. coelicolor CH999, construido como se ha descrito arriba, se transformó con estos plásmidos. (Los genes codificantes de la KR act y la act ciclasa estaban presentes también en cada una de estas construcciones genéticas). Basándose en los resultados de experimentos similares con las PKS s act y tcm, arriba descritas, era de esperar que la KR act fuera capaz de reducir los productos de todas las PKS s recombinantes funcionales, mientras que la capacidad de la ciclasa act para catalizar la segunda ciclación dependería de la longitud de cadena del producto de la PKS fren.
Los resultados que se resumen en la Tabla 2 indican que la mayoría de los transformantes expresaban PKS s funcionales, como se ensayó por su capacidad para producir poliquétidos aromáticos. El análisis estructural de los productos principales reveló que las cepas productoras podían agruparse en dos categorías: aquéllas que sintetizaban el compuesto 1 (junto con una cantidad menor de su producto secundario descarboxilado (2), y aquéllas que sintetizaban una mezcla de compuestos 1, 10 y 11 en una relación aproximada 1:2:2. (Se encontraban también pequeñas cantidades de 2 en todas las cepas que producían 1.) Los compuestos 1 y 2 se habían observado antes como productos naturales, y eran los metabolitos producidos por una PKS constituida enteramente por subunidades act, como se describe en el Ejemplo 3. Los compuestos 10 y 11 (designados RM18 y RM18b, respectivamente) son estructuras nuevas cuya síntesis química o aislamiento como productos naturales no ha sido consignada previamente.
Las estructuras de 10 y 11 se elucidaron por una combinación de espectroscopia de masas, espectroscopia NMR, y experimentos de marcación con isótopos. Las asignaciones espectrales ^{1}H y ^{13}C se muestran en la Tabla 3, junto con las constantes de acoplamiento ^{13}C-^{13}C para 10 obtenidas por experimentos de cebado con [1,2-^{13}C_{2}]-acetato de sodio (descritos a continuación). Las asignaciones inequívocas para el compuesto 10 se establecieron con estudios del efecto nuclear 1D de Overhauser (NOE) y la correlación heteronuclear (HETCOR) de largo alcance. El intercambio de deuterio confirmó la presencia de hidroxilos en C-15 del compuesto 10 y C-13 del compuesto 11. La espectrometría de masas con desorción en campo (FD-MS) de 2 reveló un peso molecular de 282, consistente con C_{17}H_{14}O_{4} (282,2952).
Estudios anteriores demostraron que la cadena principal del poliquétido de 2 (Bartel, P.L. et al. J. Bacteriol. (1990) 172: 4816) (y, por inferencia, 1) se deriva de condensaciones iterativas de 8 residuos acetato con una sola cetorreducción en C-9. Puede argumentarse también que la nanaomicina (8) procede de una columna vertebral de cadena de carbonos idéntica. Por esta razón, es muy probable que la nanaomicina sea un producto de los genes PKS de fren en S. roseofulvus. La regioespecificidad de la primera ciclación que conduce a la formación de 1 está guiada por la posición de la cetorreducción, mientras que la de la segunda ciclación está controlada por la ciclasa act (Zhang, H.L. et al. J. Org. Chem. (1990) 55: 1682).
A fin de trazar la columna vertebral de cadena de carbonos de RM18 (10), experimentos de cebado in vivo utilizando [1,2-^{13}C_{2}]-acetato en CH999/pRM18, seguidos por análisis NMR de RM18 marcado (10). Los datos de acoplamiento ^{13}C (resumidos en la Tabla 3) indican que la cadena principal de poliquétido de RM18 (10) se deriva de 9 residuos acetato, seguidos por una descarboxilación terminal (la resonancia de ^{13}C en C-2 aparece como un singulete intensificado), que ocurre presumiblemente de modo no enzimático. Adicionalmente, la ausencia de un grupo hidroxilo en la posición C-9 sugiere que en este carbono tiene lugar una cetorreducción. Dado que podría esperarse que estas dos características ocurrieran en la cadena principal supuesta de frenolicina (7), los resultados sugieren que, además de la síntesis de nanaomicina, los genes PKS de fren son responsables de la biosíntesis de frenolicina en S. roseofulvus. Éste parece ser el primer caso inequívoco de una PKS con especificidad de longitud de cadena relajada. Sin embargo, al contrario que la cadena principal supuesta de frenolicina, el carbonilo C-17 de RM18 (10), no está reducido. Esto podría, o bien reflejar la ausencia de pRM18 de una cetorreductasa y deshidratasa específica, y una enoilreductasa (presente en la agrupación de genes fren en S. roseofulvus), o podría reflejar un origen diferente para los carbonos 15-18 en la frenolicina.
La regioespecificidad de la primera ciclación que conduce a la formación de RM18 (10) está guiada por la posición de la cetorreducción; sin embargo, la segunda ciclación ocurre de modo diferente que lo hace en 7 ó 1, y es similar al patrón de ciclación observado en RM20 (9), un decaquétido producido por la PKS tcm, como se ha descrito arriba. Por esta razón, como en el caso de RM20 (9), podría argumentarse que la ciclasa act no puede catalizar la segunda ciclación del precursor RM18, y que sus ciclaciones subsiguientes, que ocurren presumiblemente de modo no enzimático, vienen dictadas por diferencias temporales en la liberación de porciones diferentes de la cadena de poliquétido naciente en un entorno acuoso. En vista de la capacidad de CH999/pRM18 (y CH999/pRM34) para producir 1, puede excluirse la posibilidad de que la ciclasa no pueda asociarse con la PKS fren (KS/AT, CLF y ACP). Una explicación más probable es que la ciclasa act no pueda reconocer sustratos de longitudes de cadena alteradas. Esto sería consistente también con el esquema de biosíntesis supuesto para RM20 (9),
Una comparación de los perfiles de producto de las sintasas híbridas consignadas en la Tabla 2 con híbridos análogos entre los componentes PKS act y tcm (Tabla 1) respalda la hipótesis de que el producto ORF2 es el factor determinante de la longitud de cadena (CLF). La preparación de los compuestos 9, 10 y 11 por ciclación de quétidos unidos por enzimas se ilustra esquemáticamente en la Figura 8.
Ejemplo 5 El Papel de tcmJ y tcmN en la Síntesis de Poliquétidos
Para valorar los papeles catalíticos específicos de las enzimas PKS codificadas por tcmJ y tcmN, se expresaron tcmJ y tcmN en presencia de componentes adicionales PKS act y tcm en el sistema hospedador-vector de S. coelicolor CH999, descrito en los Ejemplos 1 a 3. El aislamiento de tres nuevos poliquétidos a partir de estas construcciones genéticas ha permitido la asignación de dos funciones catalíticas distintas a tcmN.
Se construyó la serie de agrupaciones de genes recombinantes que se muestran en la Tabla 5. Cada plásmido contenía tcmJ, tcmN, o ambos además de los genes PKS mínimos responsables de la biosíntesis de 16 (act) o cadenas principales de 20 carbonos (tcm). La mitad de los plásmidos contenían también el gen codificante de la cetorreductasa act (KR, actIII), que cataliza la cetorreducción en la posición C-9 de la cadena principal de poliquétido naciente. Los plásmidos se introdujeron por transformación en S. coelicolor CH999. Los poliquétidos principales producidos por las cepas transformadas se aislaron y se caracterizaron estructuralmente utilizando una combinación de NMR, marcación con isótopos y experimentos de espectroscopia de masas. La totalidad de los poliquétidos aislados han sido caracterizados estructuralmente con anterioridad, con la excepción de los nuevos poliquétidos RM77 (19) (Figura 14), RM80 (20), y RM80b (21) (Figura 15).
Un análisis comparativo de los patrones de ciclación de estas moléculas, junto con los consignados anteriormente, revela dos funciones para tcmN. La primera puede ilustrarse por diferencias en los caminos propuestos para RM77 (19; producido por la PKS mínima act + tcmN; pRM77) y SEK4 (12; producido por la PKS mínima act sola; pSEK24). Como se muestra en la Figura 14, tcmN influye en la regioespecificidad de la ciclación del primer anillo. En SEK4 (12), ocurre una condensación aldólica intramolecular entre el carbonilo C-7 y el metileno C-12. En contraste, una reacción similar ocurre entre el carbonilo C-9 y el metileno C-14 en RM77 (19); esto representa un desplazamiento de una unidad acetato en la cadena principal del poliquétido. Por tanto, si bien los resultados anteriores indicaban que el curso de esta reacción está controlado primariamente por la PKS mínima, RM77 (19) ilustra claramente el efecto de tcmN sobre la PKS mínima act, que en caso contrario cataliza exclusivamente ciclaciones C-7/C-12 en ausencia de tcmN. La ausencia de cualquier cantidad significativa de SEK15 (13) u otras moléculas cíclicas C-7/C-12 en CH999/pRM80 y CH999/pRM81 respalda también la conclusión de que la regioespecificidad de la primera condensación aldólica puede estar controlada por enzimas situadas aguas abajo de la PKS mínima.
Una consecuencia importante de la designación de la función de tcmN es la relación temporal entre la cetorreducción catalítica y la ciclación del primer anillo. En todos los poliquétidos existentes naturalmente y recombinantes que sufren una cetorreducción en C-9 estudiados hasta la fecha, tiene lugar una ciclación inicial entre los carbonos 7 y 12. Por esta razón, la incapacidad de las cepas que expresan tcmN para producir cantidades importantes de un poliquétido con una ciclación C-9/C-14 en presencia de la KR act (pRM71, pRM72, pRM74, pRM75; Tabla 5) indica que la cetorreducción ocurre antes de la formación del primer anillo (Figura 14).
La segunda función de tcmN resulta evidente por comparación entre los caminos de ciclación propuestos de RM80 (20, producido por la PKS mínima tcm + tcmN; pRM80) y SEK16b (16; producida por la PKS mínima de tcm sola; pSEK33). La producción de estas dos moléculas es mutuamente excluyente en estas cepas. Como se ve en la figura 15, las regioespecificidades de las condensaciones aldólicas intramoleculares primera y segunda en ambas moléculas son idénticas. Sin embargo, en SEK15b (16), el tercer anillo se forma por la vía de una condensación aldólica entre C-6 y C-19, mientras que en RM80 (20) aquél se forma por hemicetalización entre C-15 y C-19. La diferencia en estos dos caminos de ciclación puede atribuirse a la enolización del carbonilo C-15 en RM80 (20), pero no en SEK15b (16). Esto es una reminiscencia de los poliquétidos afines SEK34 (22) y mutactina (6), productos de derivación de las etapas iniciales de la biosíntesis de la actinorrodina que condujeron a la hipótesis de que la aromatasa (ARO) act cataliza la enolización del carbonilo C-11. Por esta razón, no es sorprendente que tcmN, un homólogo de la ARO act, pudiera catalizar la misma reacción; sin embargo, las especificidades de las dos proteínas difieren. Mientras que la ARO act actúa sobre el primer anillo, tcmN parece actuar sobre el segundo anillo.
TcmN proporciona un instrumento adicional para el diseño y la biosíntesis de nuevos poliquétidos por la manipulación genética de PKS s. RM77 (19) representa el primer ejemplo de un poliquétido de 16 carbonos con una primera ciclación modificada por ingeniería genética diferente de la del poliquétido "natural" esperado. Por esta razón, es probable que otros complejos PKS heterólogos que contengan tcmN (u homólogos) junto con diversas PKS s mínimas produzcan poliquétidos de longitud de cadena diferente con la primera ciclación alternativa. Este grado de libertad biosintético puede limitarse a moléculas no reducidas.
Ejemplo 6 Poliquétidos Aromáticos Diseñados Racionalmente
Todas las agrupaciones de genes identificadas para poliquétidos aromáticos de actinomicetos contienen una serie de tres genes que codifican una denominada "PKS mínima" que está constituida por una cetosintasa (KS) que lleva también un dominio supuesto de aciltransferasa (AT), un factor de longitud de cadena (CLF), y una proteína portadora de acilo (ACP) (Figura 1). Una molécula de 16 carbonos, por ejemplo SEK4 (11) puede sintetizarse a partir de la PKS mínima act sola. Para producir el análogo de SEK4 reducido en C-9, SEK34 (22) (Figura 16), son necesarias dos actividades adicionales: una cetorreductasa (KR) y una subunidad de aromatización (ARO) (compárense los genes presentes en pSEK24 y pSEK34; Tabla 6). Se diseñaron los experimentos siguientes para determinar si podrían generarse pares de moléculas análogos a partir de cadenas principales de longitud de cadena alternativa, por ejemplo, 20 carbonos utilizando una combinación adecuada de una PKS mínima, una KR, y una ARO.
La PKS mínima tcm (en pSEK33; Tabla 6) es no sólo necesaria sino también suficiente para la síntesis de una cadena principal de 20 carbonos no reducida (McDaniel, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), 91: 11542-11546), que forma SEK15 (13). Adicionalmente, la KR act puede reducir el carbonilo C-9 existente en dicha cadena principal a un hidroxilo, que se pierde subsiguientemente por aromatización espontánea del primer anillo carbocíclico (Fu, H. et al, J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 4166-4170. En contraste, la aromatización del anillo reducido, requiere una ARO (McDaniel, R. et al. J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 10855-10859). Sin embargo, la ARO act no puede aromatizar cadenas de 20 carbonos (McDaniel, R., et al. Science (1994) 262: 1546-1550); McDaniel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), supra). Adicionalmente, la agrupación de PKS tcm (que carece de un gen KR), no parece codificar una ARO de primer anillo que sería un candidato adecuado. De acuerdo con ello, un gen ARO homólogo al existente en la agrupación act se seleccionó a partir de la agrupación de genes que codifica la PKS para el poliquétido griseusina (gris) de 20 carbonos (Yu, T.-W. et al. J. Bacteriol. (1994) 176: 2627-2534).
Se construyó el plásmido pSEK43 (Tabla 6), que contenía la PKS mínima tcm, la KR act, y la ARO gris, y se introdujo en el hospedador CH999. El análisis de la cepa transformada reveló el poliquétido SEK43 (23) anticipado, cuya estructura se determinó por NMR, espectroscopia de masas, y estudios de marcación con isótopos.
La biosíntesis de SEK43 (23) (Figura 17) reafirma la conclusión de que la ARO act y sus homólogos aromatizan el primer anillo (McDaniel et al. J. Am. Chem. Soc. (1994), supra). Sin una ARO funcional, la PKS mínima tcm y KR act (pSEK23; Tabla 6) producen RM20b (14) (Figura 16), que contiene un primer anillo no aromatizado. El reemplazamiento de la PKS mínima tcm en pSEK43 con las PKS s mínimas act o fren (pSEK41 y pSEK42; Tabla 6) dio como resultado la producción del compuesto aromatizado de 16 carbonos SEK34 (22), demostrando que la ARO gris puede reconocer también cadenas de carbono más cortas. Resultó inesperado, sin embargo, que no se detectaba un poliquétido de 18 carbonos correspondiente en la construcción que contenía la PKS mínima fren, que se ha demostrado sintetiza cadenas tanto de 18 como de 16 carbonos (McDaniel et al. J. Am. Chem. Soc. (1993), supra). Esto es debido probablemente a la descomposición de la molécula, dado que CH999/pSEK42 producía cantidades pequeñas de una molécula no identificada que no está presente en CH999/pSEK34. Más significativamente, se describe a continuación la evidencia de un compuesto intermedio aromatizado de 18 carbonos.
Un segundo ensayo del concepto de diseño racional dimanó del aislamiento previo del poliquétido de 16 carbonos DMAC (28) (Figura 16). Las subunidades PKS requeridas para la biosíntesis de DMAC (28) son una PKS mínima de "16 carbonos", una KR y componentes ARO y CYC adecuados (pRM5; Tabla 6). CYC cataliza la ciclación del segundo anillo entre los carbonos 4 y 15, que conduce finalmente a la formación de una antraquinona (McDaniel et al. J. Am. Chem. Soc. (1994), supra). Estas observaciones sugirieron que podría generarse una antraquinona análoga, con 18 carbonos. Para conseguir esto, se construyó el plásmido pSEK26 (Tabla 6) que contenía la PKS mínima fren con la KR act, la ARO fren, y la CYC act. La PKS mínima fren y la KR act se seleccionaron por su capacidad para producir una cadena principal de 18 carbonos, reducida en C-9 (McDaniel et al. J. Am. Chem. Soc. (1993), supra; McDaniel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), supra). Se seleccionó la ARO fren dado que la ARO act no puede aromatizar cadenas de 18 carbonos (McDaniel et al. J. Am. Chem. Soc. (1993), supra; McDaniel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), supra).
La introducción del plásmido en CH999 dio como resultado la producción tanto de DMAC (28) como de SEK26 (24). La última es una antraquinona nueva de 18 carbonos cuya estructura se confirmó por NMR, espectroscopia de masas, y estudios de marcación con isótopos. La formación de SEK26 (24) (Figura 17) ocurre por una ciclación de segundo anillo en C-5/C-14 catalizada supuestamente por la CYC act. Asimismo la producción de DMAC (28) es consistente con la especificidad de longitud de cadena relajada de la PKS mínima fren (McDaniel et al. J. Am. Chem. Soc. (1993), supra).
Con objeto de evaluar ulteriormente la especificidad de las subunidades ARO y CYC para cadenas de carbono de diversas longitudes, se construyeron varias otras combinaciones PKS (Tabla 6). Por ejemplo, pSEK25 y pSEK26 demuestran que la ARO fren puede aromatizar tanto canales de 16 como de 18 carbonos. Sin embargo, la ARO fren no puede manipular cadenas de 20 carbonos; en lugar de ello, la combinación de la ARO fren con la PKS mínima tcm, KR act, y CYC act (pSEK27) dio como resultado la biosíntesis de RM20b (14), el poliquétido no aromatizado de 20 carbonos (Figura 16). Como era de esperar, el reemplazamiento de la ARO fren con la ARO gris (pRM51) en pSEK26 produjo DMAC (28) y SEK26 (24). Sin embargo, los intentos de generar un poliquétido reducido de 20 carbonos con una ciclación de segundo anillo C-5/C-14 fueron infructuosos; el reemplazamiento de la PKS mínima fren en pRM51 con la PKS mínima tcm (pRM52) dio como resultado la producción de SEK43 (23), indicando que la CYC act no puede ciclar cadenas de 20 carbonos. Finalmente, los plásmidos pSEK44-47, pRM51, y pRM52 (Tabla 6), todos los cuales carecían de KRs, no lograron causar la producción de poliquétidos diferentes de los producidos por la PKS mínima sola (McDaniel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), supra), a pesar de la presencia de los componentes ARO y CYC. Esto es consistente con observaciones previas según las cuales las subunidades ARO y CYC no alteran los caminos de biosíntesis de poliquétidos no reducidos (McDaniel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), supra; Fu, H. McDaniel, R. Hopwood, D.A. & Khosla, C. Biochemistry 33: 9321-9326 (1994)).
Ejemplo 7 Construcción y Análisis de Poliquetido-Sintasas Modulares
Se construyeron plásmidos de expresión que contenían genes DEBS PKS modulares recombinantes por transferencia incremental de DNA desde un plásmido "donante" sensible a la temperatura, es decir, un plásmido capaz de replicación a una primera temperatura permisita e incapaz de replicación a una segunda temperatura no permisiva, a un vector lanzadera "receptor" por la vía de un suceso de doble recombinación, como se representa en Fig. 18. Se construyó como sigue pCK7 (Figura 12), un plásmido lanzadera que contenía los genes eryA completos, que se clonaron originalmente a partir de pS1 (Tuan et al. (1990) Gene 90: 21). Se insertó un fragmento SphI de pS1 de 25,6 kb en el sitio SphI de pMAK705 (Hamilton et al. (1989) J. Bacteriol. 171: 4617) para dar pCK6 (Cm^{R}), un plásmido donante que contenía eryAII, eryAIII, y el extremo 3' de eryAI. La replicación de este derivado de pSC101 sensible a la temperatura ocurre a 30ºC, pero se detiene a 44ºC. El plásmido receptor, pCK5 (Ap^{R}Tc^{R}), incluye un fragmento eryA de 12,2 kb desde el codón inicial eryAI (Caffrey et al. (1992) FEBS Lett. 304: 225) al sitio XcmI cerca del comienzo de eryAII, un fragmento EcoRI-BsmI de pBR322 de 1,4 kb que codifica el gen de resistencia a la tetraciclina (Tc), y un fragmento NotI-EcoRI de 4,0 kb desde el extremo de eryAIII. Se diseñaron PacI, NdeI, y sitios de fijación de ribosoma en el codón inicial de eryAI en pCK5. pCK5 es un derivado de pRM5 (McDaniel et al. (1993), supra). Las regiones de homología 5' y 3' (Figura 18, áreas rayadas y no sombreadas) son de 4,1 kb y 4,0 kb, respectivamente. Se transformó E. coli MC1061 (véase, Sambrook et al., supra) con pCK5 y pCK6 y se sometió a selección con carbenicilina y cloranfenicol a 30ºC. Las colonias que alojaban ambos plásmidos (Ap^{R}, Cm^{R}) se aplicaron luego en bandas nuevamente a 44ºC sobre placas de carbenicilina y cloranfenicol. Únicamente los cointegrados formados por un solo suceso de recombinación entre los dos plásmidos eran viables. Las colonias supervivientes se propagaron a 30ºC bajo selección con carbenicilina, forzando la resolución de los cointegrados por un segundo suceso de recombinación. Para enriquecimiento respecto a recombinantes pCK7, las colonias se aplicaron luego en bandas nuevamente sobre placas de carbenicilina a 44ºC. Aproximadamente el 20% de las colonias resultantes exhibían el fenotipo deseado (Ap^{R}, Tc^{S}, Cm^{S}). Los candidatos pCK7 finales se comprobaron concienzudamente por mapeado de restricción. Se construyó de manera similar un plásmido de control, pCK7f, que contiene un error de desplazamiento de marco en eryAI. Se transformaron pCK7 y pCK7f en E. coli ET12567 (MacNeil (1988) J. Bacteriol. 170: 5607) para generar ADN plasmídico no metilado y se desplazaron subsiguientemente a Streptomyces coelicolor CH999 utilizando protocolos estándar (Hopwood et al (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. The John Innes Foundation: Norwich).
Después del crecimiento de CH999/pCK7 sobre medio R2YE, el organismo producía cantidades abundantes de dos poliquétidos (Figura 20). La adición de propionato (300 mg/l) al medio de crecimiento dio como resultado un aumento aproximadamente al doble en el rendimiento del producto poliquétido. La espectroscopia NMR del protón y ^{13}C, en asociación con experimentos de cebado con ácido propiónico-1-^{13}C, confirmaron el producto principal como 6dEB (17) (> 40 mg/l). El producto menor se identificó como 8,8a-desoxioleandolida (18) (> 10 mg/l), que se origina aparentemente a partir de una unidad inicial acetato en lugar de propionato en el camino biosintético de 6dEB. Los experimentos de cebado con acetato de sodio ^{13}C_{2} confirmaron la incorporación de acetato en (18). Se observaron también tres proteínas de peso molecular alto (> 200 kDa), presumiblemente DEBS1, DEBS2, y DEBS3 (Caffrey et al. (1992) FEBS Lett. 304: 225), en extractos brutos de CH999/pCK7 por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. No se observó producto poliquétido alguno a partir de CH999/pCK7f. Los autores de la invención agradecen por la presente el respaldo proporcionado por la American Cancer Society (IRG-32-34).
Ejemplo 8 Manipulación del Tamaño del Anillo de los Macrólidos por Mutagénesis Orientada deDEBS
A fin de investigar la relación entre la estructura y la función en las PKSs modulares y aplicar este conocimiento para el diseño racional y estocástico de nuevos poliquétidos, se diseñó un sistema de expresión hospedador-vector para estudiar DEBS (Kao, C.M. et al. Science (1994) 265: 509-512). Utilizando este sistema de expresión, la expresión de DEBS1 sola, en ausencia de DEBS2 y DEBS3, dio como resultado la producción de \delta-lactona del ácido (2R,3S,4S,5R)-2,4-dimetil-3,5-dihidroxi-n-heptanoico ("la \delta-lactona del ácido heptanoico" (25)) (1-3 mg/l), el producto triquétido esperado de los dos primeros módulos (Figura 21A), (Kao, C.M. et al J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 11612-11613). La síntesis de la \delta-lactona del ácido heptanoico (25) proporcionó evidencia bioquímica ulterior para el modelo de PKS modular de Katz y colaboradores (Donadio, S. et al. Science (1991), supra) y demostró que una tioesterasa no es esencial para la liberación de un triquétido por el complejo enzimático.
En este ejemplo, el papel del dominio de tioesterasa (TE) en la DEBS se analizó por construcción de dos PKSs mutantes adicionales de deleción que están constituidas por diferentes subconjuntos de los módulos DEBS y la TE. La primera PKS contenía DEBS1 fusionada a la TE, mientras que la segunda PKS incluía los cinco primeros módulos de DEBS con la TE; los plásmidos pCK12 y pCK15 contenían los genes codificantes de las PKSs bimodulares ("1+2+TE") y pentamodulares ("1+2+3+4+5+TE").
La PKS 1+2+TE contenía una fusión del extremo carboxi-terminal de la proteína portadora de acilo de módulo 2 (ACP-2) al extremo del terminal carboxi de la proteína portadora de acilo del módulo 6 (ACP-6). Así pues, ACP-2 está esencialmente intacta en esta PKS y va seguida por la secuencia de aminoácidos encontrada naturalmente entre ACP-6 y la TE (Figura 21B). El plásmido pCK12 contenía DNA de eryA originario de pS1 (Tuan, J.S. et al. Gene (1990) 90: 21). PCK12 es idéntico a PCK7 (Kao et al. Science (1994) supra) con la excepción de una deleción entre los extremos carboxi-terminales de ACP-2 y ACP-6. La fusión ocurre entre los residuos L3455 de DEBS1 y Q2891 de DEBS3. Un sitio SpeI está presente entre estos dos residuos, de tal modo que la secuencia de DNA en la fusión es CTCACTAGTCAG.
La PKS 1+2+3+4+5+TE contenía una fusión de 76 aminoácidos aguas abajo de la \beta-cetorreductasa de módulo 5 (KR-5) y cinco aminoácidos aguas arriba de ACP-6. Así, la fusión tiene lugar hacia el extremo carboxi-terminal de la región no conservada entre KR-5 y ACP-5, y el módulo recombinante 5 era esencialmente un híbrido entre los módulos de tipo salvaje 5 y 6 (Figura 22). El plásmido pCK15 contenía eryA DNA originario de pS1 (Tuan et al. Gene (1990) supra). pCK es un derivado de pCK7 (Kao et al. Science (1994), supra) y se construyó utilizando una estrategia de recombinación in vivo descrita anteriormente (Kao et al. Science (1994), supra). pCK15 es idéntico a pCK7 con las excepciones de una deleción entre KR-5 y ACP-6, que ocurre entre los residuos G1372 y A2802 de DEBS3, y la inserción de un fragmento romo SalI que contenía un gen de resistencia a la kanamicina (Oka A. et al. J. Mol. Biol. (1981) 147: 217) en el sitio romo HindIII de pCK7. Está presente un residuo arginina entre G1372 y A2802 de tal modo que la secuencia de DNA en la fusión es GGCCGCGCC.
Los plásmidos pCK12 y pCK15 se introdujeron en S. coelicolor CH999 y los productos poliquétidos se purificaron a partir de las cepas transformadas de acuerdo con métodos descritos previamente (Kao et al. Science (1994), supra).
CH999/pCK12 producía la \delta-lactona del ácido heptanoico (25) (20 mg/l) tal como se determinó por espectroscopia NMR ^{1}H y ^{13}C. Este producto triquétido es idéntico al producido por CH999/pCK9, que expresa la proteína DEBS1 sin modificar sola (Kao, J. Am. Chem. Soc. (1994) supra). Sin embargo, CH999/pCK12 producía la \delta-lactona del ácido heptanoico (25) en cantidades significativamente mayores que CH999/pCK9 (>10 mg/l frente a \sim 1 mg/l), lo que indicaba la capacidad de la TE para catalizar la tiólisis de una cadena de triquétido fijada al dominio ACP del módulo 2. CH999/pCK12 producía también cantidades significativas de un nuevo análogo de \delta-lactona del ácido (2R,3S,4S,5R)-2,4-dimetil-3,5-dihidroxi-n-hexanoico (la "\delta-lactona del ácido hexanoico" (26)) (10 mg/l), que era resultado de la incorporación de una unidad inicial acetato en lugar de propionato. Esto es una reminiscencia de la capacidad de CH999/pCK7, que expresa DEBS intactas, para producir 8,8a-desoxioleandolida (18) además de 6dEB (17) (Kao et al. Science (1994), supra).
Dado que la \delta-lactona del ácido hexanoico (26) no se detectaba en CH999/pCK9, su aislamiento fácil a partir de CH999/pCK12 proporciona una evidencia adicional de la tasa de renovación incrementada de DEBS1 debida a la presencia de la TE. Dicho de otro modo, la TE puede reconocer eficazmente un enlace intermedio a un módulo "extraño" que es cuatro unidades acilo más corto que su sustrato natural, 6dEB (17). Sin embargo, dado que los productos triquétidos pueden ciclarse probablemente de modo espontáneo a la \delta-lactona del ácido heptanoico (25) y la \delta-lactona del ácido hexanoico (26) en condiciones de fermentación típicas (pH 7), no es posible discriminar entre un modelo de biosíntesis que implica lactonización catalizada por enzimas y uno que implica hidrólisis catalizada por enzimas seguida por lactonización espontánea. Así pues, la capacidad de la PKS 1+2+TE para reconocer el hidroxilo C-5 de un triquétido como nucleófilo de entrada no está clara.
La segunda cepa recombinante, CH999/pCK15, producía cantidades abundantes de (8R,9S)-8,9-dihidro-8-metil-9-hidroxi-10-desoximetonolida (``la 10-desoximetonolida (27); la Figura 22) (10 mg/l), demostrando que la PKS pentamodular es activa. La 10-desoximetonolida (27) se caracterizó utilizando espectroscopia NMR ^{1}H y ^{13}C de material de abundancia natural y material enriquecido en ^{13}C, espectroscopia de correlación homonuclear (COSY), espectroscopia de correlación heteronuclear (HETCOR) espectroscopia de masas, y modelización molecular. La 10-desoximetonolida (27) es un análogo de la 10-desoximetonolida (Lambalot, R.H. et al. J. Antibiotics (1992) 45: 1981-1982, la aglicona del antibiótico macrólido metimicina. La producción de la 10-desoximetonolida (27) por una enzima pentamodular demuestra que los dominios de sitios activos en los módulos 5 y 6 en DEBS pueden unirse sin pérdida de actividad. Si se demuestra que ésta es una característica general de las proteínas multimodulares que constituyen PKSs modulares, entonces cualquier modelo estructural para ensamblaje de módulos debe dar cuenta del hecho de que los módulos individuales así como los sitios activos son entidades independientes que no dependen de la asociación con los módulos vecinos para ser funcionales. Es sumamente notable que el anillo de lactona de 12 miembros, formado por esterificación del carboxilo terminal con el hidroxilo C-11 del producto hexaquétido, indicaba la capacidad de la PKS 1+2+3+4+5+TE, y posiblemente de la TE propiamente dicha, para catalizar la lactonización de una cadena de poliquétido una unidad acilo más corta que el producto natural de DEBS, 6dEB (17). De hecho, la formación de la 10-desoximetonolida (27) puede mimetizar la biosíntesis del macrólido hexaquétido de 12 miembros estrechamente afín, metimicina, que se presenta frecuentemente con los macrólidos heptaquétidos homólogos de 14 miembros, picromicina y/o narbomicina (Cane, D.E. et al. J. Am. Chem. Soc. (1993) 115: 522-566). Una PKS modular tal como DEBS podría utilizarse por tanto para generar una extensa gama de macrolactonas con longitudes de cadena más cortas y más largas. Los últimos productos requerirían la introducción de módulos heterólogos adicionales en DEBS.
La construcción de la PKS 1+2+3+4+5+TE dio como resultado la biosíntesis de una macrolactona de 12 miembros no caracterizada con anterioridad que se asemeja estrechamente, pero es distinta de, la aglicona de un macrólido biológicamente activo. La independencia aparente estructural y funcional de los dominios y módulos de sitios activos, así como la especificidad de la lactonización relajada sugieren la existencia de muchos grados de libertad para manipular estas enzimas a fin de producir nuevas PKSs modulares. Pueden generarse quimiotecas de nuevos macrólidos alterando la asociación de dominios de sitios activos y módulos enteros, el subconjunto de dominios reductores dentro de cada módulo, la actividad de la TE, y posiblemente incluso reacciones de modificación aguas abajo tales como hidroxilación y glicosilación. Tales quimiotecas podrían demostrar ser fuentes ricas de nuevas cabezas de serie para descubrimiento de fármacos.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1
24 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2
240
25
26
27
TABLA 5
28 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 * La PKS mínima contiene la
cetosintasa/acil-transferasa supuesta, factor de 
longitud de cadena, y\cr  proteína  portadora de acilo
 act .\cr}
TABLA 6
29 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 * La PKS mínima contiene la
cetosintasa/acil-transferasa supuesta, factor de
longitud de cadena, y\cr   proteína portadora de acilo
 act .\cr}

Claims (7)

1. Una quimioteca para síntesis de una multiplicidad de poliquétidos, quimioteca que comprende una multiplicidad de líneas de células individuales en donde cada línea de células produce una poliquetido-sintasa (PKS) funcional tal que cada una de dichas líneas de células produce un poliquétido diferente;
en donde cada PKS funcional comprende el producto de módulos de una agrupación de genes PKS modular, comprendiendo cada módulo la secuencia de nucleótidos que codifica una actividad de cetosintasa (KS), una secuencia de nucleótidos que codifica una actividad de proteína portadora de acilo (ACP), una secuencia de nucleótidos que codifica una actividad de aciltransferasa (AT), y opcionalmente una actividad de cetorreductasa (KR), y/o una actividad de deshidratasa (DH), y/o actividad de enoil-reductasa (ER), y/o una actividad de tioesterasa (TE).
2. Uso de la quimioteca de la reivindicación 1, para producir poliquetido-sintasas modulares funcionales.
3. Uso de la quimioteca de la reivindicación 1, para síntesis de una multiplicidad de poliquétidos macrólidos.
4. Una quimioteca para síntesis de una multiplicidad de poliquétidos, comprendiendo dicha quimioteca una multiplicidad de líneas de células individuales en donde cada línea de células produce una poliquetido-sintasa (PKS) aromática funcional tal que dicha línea de células produce un poliquétido diferentes;
en donde cada PKS funcional comprende los productos de:
un primer marco de lectura abierto (ORF) que codifica una cetosintasa/aciltransferasa (KS/AT); un segundo ORF que codifica una proteína portadora de acilo (ACP); y un tercer ORF que codifica un factor determinante de longitud de cadena (CLDF).
5. La quimioteca de la reivindicación 4, que incluye colonias en donde la PKS funcional comprende el producto de cualquiera de las combinaciones 1-12 como sigue:
30
6. Uso de la quimioteca de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, para producir poliquetido-sintasas aromáticas funcionales.
7. Uso de la quimioteca de la reivindicación 4, para sintetizar una multiplicidad de poliquétidos.
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Families Citing this family (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6063561A (en) * 1991-01-17 2000-05-16 Abbott Laboratories Polyketide derivatives and recombinant methods for making same
US6060234A (en) * 1991-01-17 2000-05-09 Abbott Laboratories Polyketide derivatives and recombinant methods for making same
US5712146A (en) * 1993-09-20 1998-01-27 The Leland Stanford Junior University Recombinant combinatorial genetic library for the production of novel polyketides
CA2171629A1 (en) * 1993-09-20 1995-03-30 Chaitan Khosla Recombinant production of novel polyketides
US6066721A (en) * 1995-07-06 2000-05-23 Stanford University Method to produce novel polyketides
US6558942B1 (en) 1994-05-06 2003-05-06 The Leland Stanford Junior University Combinatorial polyketide libraries produced using a modular PKS gene cluster as scaffold
US6927057B2 (en) 1993-09-20 2005-08-09 Kosan Biosciences Macrolide analogs
US6500960B1 (en) 1995-07-06 2002-12-31 Stanford University (Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University) Method to produce novel polyketides
US20030170725A1 (en) * 1993-09-20 2003-09-11 Chaitan Khosla Combinatorial polyketide libraries produced using a modular PKS gene cluster as scaffold
US6495348B1 (en) 1993-10-07 2002-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mitomycin biosynthetic gene cluster
US6268140B1 (en) * 1994-02-03 2001-07-31 Neugenesis Combinatorial metabolic libraries
ATE286133T1 (de) * 1995-07-06 2005-01-15 Univ Leland Stanford Junior Zellfreie synthese von polyketiden
US6168919B1 (en) * 1996-07-17 2001-01-02 Diversa Corporation Screening methods for enzymes and enzyme kits
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
US6489145B1 (en) 1996-07-09 2002-12-03 Diversa Corporation Method of DNA shuffling
US6600029B1 (en) * 1995-12-19 2003-07-29 Regents Of The University Of Minnesota Metabolic engineering of polyhydroxyalkanoate monomer synthases
ES2244001T3 (es) * 1996-07-05 2005-12-01 Biotica Technology Limited Eritromicinas y procedimiento para su preparacion.
US6271255B1 (en) 1996-07-05 2001-08-07 Biotica Technology Limited Erythromycins and process for their preparation
US6960453B1 (en) 1996-07-05 2005-11-01 Biotica Technology Limited Hybrid polyketide synthases combining heterologous loading and extender modules
US6399789B1 (en) * 1996-12-18 2002-06-04 Kosan Biosciences, Inc. Multi-plasmid method for preparing large libraries of polyketides and non-ribosomal peptides
US6033883A (en) * 1996-12-18 2000-03-07 Kosan Biosciences, Inc. Production of polyketides in bacteria and yeast
JP2008169226A (ja) * 1997-04-30 2008-07-24 Kosan Biosciences Inc 足場としてモジュラー性ｐｋｓ遺伝子クラスターを使用して生成されるコンビナトリアルなポリケチドライブラリー
US6503741B1 (en) 1998-05-28 2003-01-07 Kosan Biosciences, Inc. Polyketide synthase genes from Streptomyces venezuelae
US6117659A (en) * 1997-04-30 2000-09-12 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant narbonolide polyketide synthase
US20040209322A1 (en) * 1997-04-30 2004-10-21 Chaitan Khosla Combinatorial polyketide libraries produced using a modular PKS gene cluster as scaffold
US6902913B2 (en) * 1997-04-30 2005-06-07 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant narbonolide polyketide synthase
US20080003648A1 (en) * 1997-04-30 2008-01-03 Chaitan Khosla Method to prepare macrolide analogs
NZ500693A (en) * 1997-04-30 2004-01-30 Kosan Biosciences Inc Combinatorial polyketide libraries produced using a modular PKS gene cluster as scaffold
US6969584B2 (en) * 1997-06-12 2005-11-29 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Combinatorial enzymatic complexes
WO1999002669A2 (en) * 1997-07-10 1999-01-21 Kosan Biosciences, Inc. Production of polyketides in plants
US6261842B1 (en) 1997-10-23 2001-07-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Microorganism genomics, compositions and methods related thereto
US6280999B1 (en) 1998-01-23 2001-08-28 Kosan Bioscience Sorangium polyketide synthases and encoding DNA therefor
US6090601A (en) * 1998-01-23 2000-07-18 Kosan Bioscience Sorangium polyketide synthase
US6143526A (en) * 1998-03-09 2000-11-07 Baltz; Richard H. Biosynthetic genes for spinosyn insecticide production
WO1999061599A2 (en) * 1998-05-28 1999-12-02 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant narbonolide polyketide synthase
US6121029A (en) 1998-06-18 2000-09-19 Novartis Ag Genes for the biosynthesis of epothilones
US6265202B1 (en) 1998-06-26 2001-07-24 Regents Of The University Of Minnesota DNA encoding methymycin and pikromycin
GB9814006D0 (en) * 1998-06-29 1998-08-26 Biotica Tech Ltd Polyketides and their synthesis
CA2341640A1 (en) 1998-07-02 2000-01-13 Chaitan Khosla Methods for making polyketides using altered pks
US6150513A (en) * 1998-09-16 2000-11-21 Kosan Biosciences, Inc. Polyketide synthase enzymes and recombinant DNA constructs therefor
US6177262B1 (en) 1998-09-22 2001-01-23 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant host cells for the production of polyketides
MXPA01003376A (es) * 1998-10-02 2002-11-07 Kosan Biosciences Inc Enzimas policetido sintetasa y construcciones de acido desoxirribonucleico recombinante para las mismas.
AU1447700A (en) 1998-10-28 2000-05-15 Kosan Biosciences, Inc. Library of novel "unnatural" natural products
US6388099B2 (en) 1998-10-29 2002-05-14 Kosan Biosciences, Inc. Production of 8,8a-dihydroxy-6-deoxyerythronolide B
US6303767B1 (en) 1998-11-05 2001-10-16 Kosan Biosciences, Inc. Nucleic acids encoding narbonolide polyketide synthase enzymes from streptomyces narbonensis
WO2000031247A2 (en) 1998-11-20 2000-06-02 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant methods and materials for producing epothilone and epothilone derivatives
US6410301B1 (en) 1998-11-20 2002-06-25 Kosan Biosciences, Inc. Myxococcus host cells for the production of epothilones
WO2000037608A2 (en) * 1998-12-07 2000-06-29 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Micromonospora echinospora genes encoding for biosynthesis of calicheamicin and self-resistance thereto
US6358712B1 (en) 1999-01-05 2002-03-19 Trustee Of Boston University Ordered gene assembly
US20040005673A1 (en) * 2001-06-29 2004-01-08 Kevin Jarrell System for manipulating nucleic acids
CA2360011A1 (en) * 1999-01-05 2000-07-13 Trustees Of Boston University Ordered gene assembly
US6753173B1 (en) 1999-02-09 2004-06-22 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods to mediate polyketide synthase module effectiveness
US7001748B2 (en) * 1999-02-09 2006-02-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of making polyketides using hybrid polyketide synthases
US6590083B1 (en) 1999-04-16 2003-07-08 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Ketolide antibacterials
CA2370743A1 (en) 1999-04-16 2000-10-26 Dennis Hlasta Ketolide antibacterials
ATE331028T1 (de) * 1999-04-16 2006-07-15 Kosan Biosciences Inc Multi-plasmid verfahren zur herstellung von grossen bibliotheken von polyketiden und nicht- ribosomalen peptiden
GB9913694D0 (en) * 1999-06-11 1999-08-11 Simper Adrian M DNA manipulation methods and applications for synthetic enzymes
US6709852B1 (en) * 1999-06-22 2004-03-23 Invitrogen Corporation Rapid growing microorganisms for biotechnology applications
US7217557B1 (en) * 1999-07-27 2007-05-15 The Salk Institute For Biological Studies Three-dimensional structure of polyketide synthases
ATE362980T1 (de) * 1999-08-19 2007-06-15 Omniscience Pharmaceuticals Genklonierung
US6569867B2 (en) 1999-10-01 2003-05-27 Kosan Biosciences, Inc. Polyketide derivatives
US6524841B1 (en) 1999-10-08 2003-02-25 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant megalomicin biosynthetic genes and uses thereof
US7033818B2 (en) * 1999-10-08 2006-04-25 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant polyketide synthase genes
ES2335385T3 (es) 1999-10-13 2010-03-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biosintesis de sustratos de policetido sintasa.
EP1224317B1 (en) * 1999-10-25 2006-03-08 Kosan Biosciences, Inc. Production of polyketides
CA2388422A1 (en) * 1999-10-27 2001-05-03 Kosan Biosciences, Inc. Heterologous production of polyketides
DE60033965T2 (de) * 1999-10-29 2008-01-10 Kosan Biosciences, Inc., Hayward Rapamycin analoge
NZ539430A (en) 1999-12-10 2006-09-29 Invitrogen Corp Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning
US7141660B2 (en) 2000-02-08 2006-11-28 Sinvent As Genes encoding a nystatin polyketide synthase and their manipulation and utility
WO2001060833A2 (en) 2000-02-18 2001-08-23 Kosan Biosciences, Inc. Motilide compounds
US20030045710A1 (en) * 2000-04-06 2003-03-06 Bruice Thomas C. Methods for identifying, obtaining and using new polyketide compounds
AU4858801A (en) * 2000-04-13 2001-10-30 Biotica Tech Ltd Hybrid glycosylated products and their production and use
DE10021267A1 (de) * 2000-04-26 2002-01-24 Actinodrug Pharmaceuticals Gmb Verfahren zur Herstellung modularer Enzymsysteme durch Synthese ihrer Gene in zyklisch wiederholbaren Syntheseschritten
US6838265B2 (en) 2000-05-02 2005-01-04 Kosan Biosciences, Inc. Overproduction hosts for biosynthesis of polyketides
WO2001092991A2 (en) 2000-05-30 2001-12-06 Kosan Biosciences, Inc. Design of polyketide synthase genes
CA2348145C (en) * 2001-05-22 2005-04-12 Surface Engineered Products Corporation Protective system for high temperature metal alloys
AU2001283275A1 (en) * 2000-08-09 2002-02-18 Kosan Biosciences, Inc. Bio-intermediates for use in the chemical synthesis of polyketides
US20020132308A1 (en) * 2000-08-24 2002-09-19 Mpep @ Page 300-M Novel constructs and their use in metabolic pathway engineering
EP1326892A2 (en) 2000-10-12 2003-07-16 University of Rochester Compositions that inhibit proliferation of cancer cells
US20040018597A1 (en) * 2000-12-12 2004-01-29 Chaitan Khosla Methods for making polyketides
US20030077759A1 (en) * 2000-12-28 2003-04-24 Zhihao Hu Plasmids for polyketide production
US20050080247A1 (en) * 2001-03-26 2005-04-14 Ben Shen Leinamycin biosynthesis gene cluster and its components and their uses
WO2002082116A1 (en) * 2001-04-09 2002-10-17 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for high resolution ex-situ nmr spectroscopy
US20030194784A1 (en) * 2001-04-17 2003-10-16 Sherman David H. DNA encoding methymycin and pikromycin
JP2004535175A (ja) * 2001-04-26 2004-11-25 エコピア バイオサイエンシーズ インク ポリケチド生合成用遺伝子及びタンパク質
KR100526770B1 (ko) * 2001-07-16 2005-11-08 서주원 스트렙토마이세스 속 균주 유래의 아데노실메치요닌 생합성 효소, 이를 코딩하는 유전자 염기서열 및 항생제를 포함하는 유용한 이차대사산물의 대량 생산방법
US20050009743A1 (en) * 2001-07-26 2005-01-13 Sundquist Wesley I In vitro assays for inhibitors of hiv capsid conformational changes and for hiv capsid formation
AU2002355157A1 (en) * 2001-07-26 2003-02-17 Ecopia Biosciences Inc. Genes and proteins for the biosynthesis of rosaramicin
WO2003014311A2 (en) * 2001-08-06 2003-02-20 Kosan Biosciences, Inc. Methods for altering polyketide synthase genes
US20040161839A1 (en) * 2001-10-05 2004-08-19 Hung-Wen Liu Method to alter sugar moieties
GB0125043D0 (en) * 2001-10-17 2001-12-12 Biotica Tech Ltd Production, detection and use of transformant cells
EP1321517A3 (en) * 2001-12-19 2003-11-19 Bristol-Myers Squibb Company Gluconobacter oxydans 2-ketoreductase enzyme and applications thereof
US7189549B2 (en) * 2002-06-14 2007-03-13 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant polynucleotides encoding pro-geldanamycin producing polyketide synthase and accessory proteins, and uses thereof
WO2003065997A2 (en) 2002-02-06 2003-08-14 Vicor Technologies, Inc. Anti-infarction molecules
AU2003253580A1 (en) * 2002-02-26 2003-11-17 University Of Minnesota Variants of nedd4l associated with hypertension and viral budding
AU2003213757A1 (en) * 2002-03-04 2003-09-22 Brown University Research Foundation Methods to mediate polyketide synthase module effectiveness
US6989131B2 (en) * 2002-03-12 2006-01-24 Uop Llc Catalytic reactor with integral evaporator
AU2003248694A1 (en) * 2002-06-13 2003-12-31 Kosan Biosciences, Inc. Methods and cells for improved production of polyketides
US7427493B2 (en) 2002-06-28 2008-09-23 Kosan Biosciences Incorporated Recombinant genes for polyketide modifying enzymes
WO2004024744A2 (en) * 2002-07-31 2004-03-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Production of glycosylated macrolides in e. coli
EP1575992A4 (en) 2002-08-05 2007-02-21 Univ Rochester CHEMICAL PROTEINS FROM PROTEIN TRANSDUCATING DOMAIN / DEAMINASE, RELATED COMPOUNDS AND THEIR USES
US20040214232A1 (en) * 2002-08-16 2004-10-28 Burke Martin D. Generation of skeletal diversity within a combinatorial library
SI1532131T1 (sl) * 2002-08-29 2009-04-30 Pfizer Motilidne spojine
US7067290B2 (en) * 2002-11-12 2006-06-27 Kosan Biosciences Incorporated Method for production of polyketides
EP1566436A4 (en) * 2002-11-21 2006-04-19 Genomidea Inc METHOD FOR ISOLATING A NUCLEIC ACID HAVING A FUNCTIONAL PROPERTY REQUIRED AND KIT THEREOF
WO2004053065A2 (en) * 2002-12-06 2004-06-24 Kosan Biosciences, Inc. Disorazole polyketide synthase encoding polynucleotides
US7151116B2 (en) * 2003-01-13 2006-12-19 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Apoptolidin analogs and derivatives for inducing apoptosis in transformed cells
US20040214306A1 (en) * 2003-01-23 2004-10-28 Bloom Fredric R. Rapid growing microorganisms for biotechnology applications
US7459294B2 (en) * 2003-08-08 2008-12-02 Kosan Biosciences Incorporated Method of producing a compound by fermentation
KR100549690B1 (ko) 2003-10-23 2006-02-07 상하이 지아오통 대학 에프알-008 폴리케타이드 합성에 관여하는 유전자
DE102004062386B4 (de) * 2003-12-24 2010-06-24 Food Industry Research And Development Institute Monacolin K-Biosynthese-Gene
WO2005084349A2 (en) * 2004-03-02 2005-09-15 Kosan Biosciences, Inc. Compounds useful for the synthesis of (+)-discodermolide and methods therefor
WO2005116200A2 (en) 2004-05-05 2005-12-08 Regents Of The University Of Minnesota Nucleic acids and polypeptides involved in the production of cryptophycin
US7217523B2 (en) 2004-07-02 2007-05-15 Regents Of The University Of Minnesota Nucleoside phosphoramidates and nucleoside phosphoramidases
US8076090B2 (en) 2005-04-05 2011-12-13 Corning Incorporated Label free biosensors and cells
AU2005332058B2 (en) 2005-05-19 2011-12-01 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Functional epitopes of Streptococcus pneumoniae PsaA antigen and uses thereof
DE102005031201A1 (de) * 2005-07-01 2007-01-25 Kettenbach Gmbh & Co. Kg Zu formstabilen Formkörpern aushärtendes kondensationsvernetzendes Dentalmaterial
US8080534B2 (en) * 2005-10-14 2011-12-20 Phigenix, Inc Targeting PAX2 for the treatment of breast cancer
EP2392645A1 (en) 2005-10-14 2011-12-07 MUSC Foundation For Research Development Targeting PAX2 for the induction of DEFB1-mediated tumor immunity and cancer therapy
KR100784478B1 (ko) * 2005-12-05 2007-12-11 한국과학기술원 기능요소의 동시 삽입에 의한 신기능을 갖는 단백질을제조하는 방법
US7566558B2 (en) * 2006-07-28 2009-07-28 Regents Of The University Of Michigan Nucleic acids and polypeptides involved in the production of cryptophycin
US20080233628A1 (en) * 2006-09-14 2008-09-25 The Salk Institute For Biological Studies Incorporation of type III polyketide synthases into multidomain proteins of the type I and III polyketide synthase and fatty acid synthase families
EP2560001B1 (en) 2006-09-21 2016-04-13 University of Rochester Compositions and methods related to protein displacement therapy for myotonic distrophy
US8999317B2 (en) 2006-11-01 2015-04-07 University Of Rochester Methods and compositions related to the structure and function of APOBEC3G
JP2010514839A (ja) 2007-01-03 2010-05-06 バーナム インスティテュート フォー メディカル リサーチ クロット結合化合物に関連する方法および組成物
WO2008098182A1 (en) 2007-02-08 2008-08-14 University Of Utah Research Foundation Methods and compositions related to inhibition of viral entry
US8759031B2 (en) * 2007-04-12 2014-06-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Type I polyketide synthase extender units
BRPI0909839A2 (pt) 2008-03-28 2017-06-13 Univ California produção de ácidos dicarboxílicos usando policetídeo sintases
BRPI0909059A2 (pt) * 2008-04-29 2019-09-24 Univ California produção de biocombustíveis usando sintases de policetídeo.
US20120058105A1 (en) 2008-06-27 2012-03-08 Martin Kean Chong Ng Method of treatment of vascular complications
WO2010019963A2 (en) * 2008-08-15 2010-02-18 Georgetown University Na channels, disease, and related assays and compositions
US20120070443A1 (en) 2008-12-02 2012-03-22 University Of Utah Research Foundation Pde1 as a target therapeutic in heart disease
WO2011022502A1 (en) 2009-08-18 2011-02-24 Georgetown University Boronic acid compositions and methods related to cancer
JP2013507365A (ja) 2009-10-07 2013-03-04 サンフォード−バーナム メディカル リサーチ インスティテュート 血餅結合脂質化合物に関する方法および組成物
CN102695792B (zh) 2009-10-08 2015-02-18 加利福尼亚大学董事会 对辛伐他汀合成表现出改善性质的LovD突变体
CA2784145A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Sanford-Burnham Medical Research Institute Methods and compositions related to clot-binding compounds
BR112012019458B8 (pt) * 2010-01-26 2022-08-02 Mmag Co Ltd construção de ácidos nucleicos, transformante, e métodos para produzir piripiropenos
CN102791871A (zh) * 2010-01-26 2012-11-21 明治制果药业株式会社 通过酶法生产啶南平衍生物的方法
US8852902B2 (en) 2010-11-22 2014-10-07 The Regents Of The University Of California Producing a trimethylpentanoic acid using hybrid polyketide synthases
CA2868735C (en) 2011-03-28 2020-02-25 University Of Utah Research Foundation D-peptide conjugates comprising a membrane localizing potency-enhancing cargo molecule for inhibiting hiv entry
GB201312318D0 (en) * 2013-07-09 2013-08-21 Isomerase Therapeutics Ltd Novel methods and compounds
US10233431B2 (en) 2014-02-26 2019-03-19 The Regents Of The University Of California Producing 3-hydroxycarboxylic acid and ketone using polyketide synthases
US11781128B2 (en) 2016-07-29 2023-10-10 Isomerase Therapeutics Limited Methods for producing hybrid polyketide synthase genes and polyketides
US12025615B2 (en) 2017-09-15 2024-07-02 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Methods of classifying response to immunotherapy for cancer
WO2020060948A1 (en) 2018-09-17 2020-03-26 Levadura Biotechnology, Inc. Production of cannabinoids in yeast using a fatty acid feedstock
WO2020161354A1 (en) * 2019-02-08 2020-08-13 Pili Recombinant host cells to produce anthraquinone derivatives
WO2021067550A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Methods and compositions for identifying neoantigens for use in treating and preventing cancer
CN110484576B (zh) * 2019-10-18 2020-01-17 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种提高榴菌素和榴菌素b产量的方法

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0092388B2 (en) 1982-04-16 1994-10-26 Eli Lilly And Company Cloning vectors
US4713337A (en) * 1985-01-03 1987-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Method for deletion of a gene from a bacteria
US4935340A (en) * 1985-06-07 1990-06-19 Eli Lilly And Company Method of isolating antibiotic biosynthetic genes
US5168052A (en) 1988-03-28 1992-12-01 Eli Lilly And Company Method for producing 20-deoxotylosin
WO1993013663A1 (en) 1992-01-17 1993-07-22 Abbott Laboratories Method of directing biosynthesis of specific polyketides
US6060234A (en) 1991-01-17 2000-05-09 Abbott Laboratories Polyketide derivatives and recombinant methods for making same
US5824513A (en) 1991-01-17 1998-10-20 Abbott Laboratories Recombinant DNA method for producing erythromycin analogs
US6063561A (en) 1991-01-17 2000-05-16 Abbott Laboratories Polyketide derivatives and recombinant methods for making same
US5672491A (en) * 1993-09-20 1997-09-30 The Leland Stanford Junior University Recombinant production of novel polyketides
CA2171629A1 (en) 1993-09-20 1995-03-30 Chaitan Khosla Recombinant production of novel polyketides
US6066721A (en) * 1995-07-06 2000-05-23 Stanford University Method to produce novel polyketides
US6500960B1 (en) * 1995-07-06 2002-12-31 Stanford University (Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University) Method to produce novel polyketides
US5712146A (en) 1993-09-20 1998-01-27 The Leland Stanford Junior University Recombinant combinatorial genetic library for the production of novel polyketides
US6558942B1 (en) * 1994-05-06 2003-05-06 The Leland Stanford Junior University Combinatorial polyketide libraries produced using a modular PKS gene cluster as scaffold
ATE286133T1 (de) * 1995-07-06 2005-01-15 Univ Leland Stanford Junior Zellfreie synthese von polyketiden
CA2197160C (en) 1996-02-22 2007-05-01 Stanley Gene Burgett Platenolide synthase gene
CA2197524A1 (en) 1996-02-22 1997-08-22 Bradley Stuart Dehoff Polyketide synthase genes
ES2244001T3 (es) 1996-07-05 2005-12-01 Biotica Technology Limited Eritromicinas y procedimiento para su preparacion.
US6271255B1 (en) 1996-07-05 2001-08-07 Biotica Technology Limited Erythromycins and process for their preparation
US6399789B1 (en) * 1996-12-18 2002-06-04 Kosan Biosciences, Inc. Multi-plasmid method for preparing large libraries of polyketides and non-ribosomal peptides
CA2341640A1 (en) * 1998-07-02 2000-01-13 Chaitan Khosla Methods for making polyketides using altered pks
AU1447700A (en) * 1998-10-28 2000-05-15 Kosan Biosciences, Inc. Library of novel "unnatural" natural products
AU2002323061A1 (en) * 2001-08-07 2003-02-24 Kosan Biosciences, Inc. Alteration of acyltransferase domain substrate specificity

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Publication number Publication date
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US6215007B1 (en) 2001-04-10
US20020034797A1 (en) 2002-03-21
WO1996040968A1 (en) 1996-12-19
EP0871760A4 (en) 2000-08-23
AU6157596A (en) 1996-12-30
US20050032176A1 (en) 2005-02-10
EP0871760A1 (en) 1998-10-21

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