ES2240856T3 - 6h- dibenzo (c,h) cromen0s sustituidos, como agentes estrogenicos. - Google Patents

Abstract

Compuesto de fórmula I que tiene la estructura en la que R1 y R2 se seleccionan, cada uno independientemente, a partir de hidrógeno, hidroxilo, alquilo de 1-6 átomos de carbono, alquenilo de 2-7 átomos de carbono, alquinilo de 2-7 átomos de carbono, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, o halógeno; en el que los grupos alquilo o alquenilo de R1 o R2 pueden estar opcionalmente sustituidos con hidroxilo, -CN, halógeno, trifluoroalquilo, trifluoroalcoxi, -NO2 o fenilo; y con la salvedad de que por lo menos uno de R1 o R2 es hidroxilo; R3, R4, R5, R6 y R7 son, cada uno independientemente, hidrógeno, alquilo de 1-6 átomos de carbono, halógeno, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, -CN, alquenilo de 2-7 átomos de carbono, alquinilo de 2-7 átomos de carbono, - CHO, fenilo, o un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros que tiene 1 a 4 heteroátomos seleccionados a partir de O, N o S; en el que los grupos alquilo o alquenilo de R4, R5, R6 ó R7 pueden estar opcionalmente sustituidos con hidroxilo, -CN, halógeno, trifluoroalquilo, trifluoroalcoxi, -NO2 o fenilo; en el que el grupo fenilo de R4 ó R5 puede estar opcionalmente monosustituido, disustituido o trisustituido con un sustituyente, igual o distinto, seleccionado a partir de alquilo de 1-6 átomos de carbono, alquenilo de 2-7 átomos de carbono, halógeno, hidroxilo, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, -CN, -NO2, amino, alquilamino de 1-6 átomos de carbono, dialquilamino de 1-6 átomos de carbono por cada grupo alquilo, tio, alquiltio de 1-6 átomos de carbono, alquilsulfinilo de 1-6 átomos de carbono, alquilsulfonilo de 1-6 átomos de carbono, alcoxicarbonilo de 2-7 átomos de carbono, alquilcarbonilo de 2-7 átomos de carbono, o benzoílo; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

Description

6H-dibenzo[c,h]cromenos sustituidos, como agentes estrogénicos.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a 6H-dibenzo[c,h]cromenos sustituidos, que son útiles como agentes estrogénicos.

Los efectos pleiotrópicos de los estrógenos en tejidos de mamíferos están bien documentados, y se reconoce que los estrógenos ejercen efectos en muchos sistemas de órganos [Mendelsohn y Karas, New England Journal of Medicine 340: 1801-1811 (1999), Epperson, et al., Psychosomatic Medicine 61: 676-697 (1999), Crandall, Journal of Womens Health & Gender Based Medicine 8: 1155-1166 (1999), Monk y Brodaty, Dementia & Geriatric Cognitive Disorders 11: 1-10 (2000), Hurn y Macrae, Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 20: 631-652 (2000), Calvin, Maturitas 34: 195-210 (2000), Finking, et al., Zeitschrift fur Kardiologie 89: 442-453 (2000), Brincat, Maturitas 35: 107-117 (2000), Al-Azzawi, Postgraduate Medical Journal 77: 292-304 (2001)]. Los estrógenos pueden afectar a los tejidos de diversas maneras, y el mecanismo de acción mejor caracterizado es su interacción con receptores de estrógenos, que provoca alteraciones en la transcripción de genes. Los receptores de estrógenos son factores de transcripción activados por ligandos y pertenecen a la superfamilia de receptores nucleares de hormonas. Otros miembros de esta familia incluyen los receptores de progesterona, andrógenos, glucocorticoides y mineralocorticoides. Al unirse al ligando, estos receptores se dimerizan y pueden activar la transcripción de genes uniéndose directamente a secuencias específicas del ADN (conocidas como elementos de respuesta) o interaccionando con otros factores de transcripción con (tales como AP1), que, a su vez, se unen directamente a secuencias específicas del ADN [Moggs y Orphanides, EMBO Reports 2: 775-781 (2001), Hall, et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869-36872 (2001), McDonnell, Principles Of Molecular Regulation. p351-361 (2000)]. Una clase de proteínas "correguladoras" pueden interaccionar también con el receptor unido al ligando y modular de forma adicional su actividad transcripcional [McKenna, et al., Endocrine Reviews 20: 321-344 (1999)]. También se ha comprobado que los receptores de estrógenos pueden suprimir la transcripción mediada por NF\kappaB-tanto de forma dependiente como independiente de ligando [Quaedackers, et al., Endocrinology 142: 1156-1166 (2001), Bhat, et al., Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 67: 233-240 (1998), Pelzer, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 286: 1153-7 (2001)].

Los receptores de estrógenos también pueden activarse por fosforilación. Esta fosforilación está mediada por factores de crecimiento tales como EGF, y provoca cambios en la transcripción de genes en ausencia de ligando [Moggs y Orphanides, EMBO Reports 2: 775-781 (2001), Hall, et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869-36872 (2001)].

Un mecanismo, peor caracterizado, mediante el cual los estrógenos pueden afectar a las células es a través de un denominado receptor de membrana. La existencia de dicho receptor es controvertida, pero se ha documentado claramente que los estrógenos pueden provocar respuestas no genómicas muy rápidas en las células. La entidad molecular responsable de la transducción de estos efectos no ha sido definitivamente aislada, pero hay pruebas que indican que, al menos, está relacionada con las formas nucleares de los receptores de estrógenos [Levin, Journal of Applied Physiology 91: 1860-1867 (2001), Levin, Trends in Endocrinology & Metabolism 10: 374-377 (1999)].

Hasta el momento, se han descubierto dos receptores de estrógenos. El primer receptor de estrógenos se clonó aproximadamente hace 15 años, y se conoce ahora como ER\alpha [Green, et al., Nature 320: 134-9 (1986)]. La segunda forma del receptor de estrógenos se ha descubierto en fecha relativamente reciente y se denomina ER\beta [Kuiper, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 5925-5930 (1996)]. Los primeros estudios sobre ER\beta se centraron en definir su afinidad por diversos ligandos, y hay que reconocer que se observaron algunas diferencias con ER\alpha. La distribución tisular de ER\beta ha sido bien cartografiada en los roedores, y no coincide con la de ER\alpha. Tejidos tales como el útero de ratón y rata expresan predominantemente ER\alpha, mientras que el pulmón de ratón y rata expresan predominantemente ER\beta [Couse, et al., Endocrinology 138: 4613-4621 (1997), Kuiper, et al., Endocrinology 138: 863-870 (1997)]. Incluso dentro del mismo órgano, la distribución de ER\alpha y ER\beta puede estar separada en compartimentos. Por ejemplo, en el ovario de ratón el ER\beta se expresa a altos niveles en las células granulosas, mientras que el ER\alpha se limita a las células tecales y del estroma [Sar y Welsch, Endocrinology 140: 963-971 (1999), Fitzpatrick, et al., Endocrinology 140: 2581-2591 (1999)]. Sin embargo, hay ejemplos en los que los receptores aparecen coexpresados, y hay pruebas procedentes de estudios in vitro que indican que ER\alpha y ER\beta pueden formar heterodímeros [Cowley, et al., Journal of Biological Chemistry 272: 19858-19862
(1997)].

Se han descrito un gran número de compuestos que simulan o bloquean la actividad del 17\beta-estradiol. Los compuestos que ejercen aproximadamente los mismos efectos biológicos que el 17\beta-estradiol, el estrógeno endógeno más potente, se denominan "agonistas del receptor de estrógenos". Aquellos que, cuando se administran junto con 17\beta-estradiol, bloquean sus efectos se denominan "antagonistas del receptor de estrógenos". En realidad, existe un espectro continuo entre la actividad agonista del receptor de estrógenos y la actividad antagonista del receptor de estrógenos, y, de hecho, algunos compuestos se comportan como agonistas del receptor de estrógenos en algunos tejidos y como antagonistas del receptor de estrógenos en otros tejidos. Estos compuestos con actividad mixta se denominan moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERMS) y son agentes con utilidad terapéutica (por ejemplo EVISTA) [McDonnell, Journal of the Society for Gynecologic Investigation 7: S10-S15 (2000), Goldstein, et al., Human Reproduction Update 6: 212-224 (2000)]. La razón precisa por la que el mismo compuesto puede tener efectos específicos de células no ha sido determinada, pero se han propuesto diferencias en la conformación del receptor y/o en el medio de las proteínas correguladoras.

Se sabe desde hace tiempo que los receptores de estrógenos adoptan diferentes conformaciones cuando se unen a ligandos. Sin embargo, sólo recientemente se han puesto de manifiesto las consecuencias y sutilezas de estos cambios. Las estructuras tridimensionales ER\alpha y ER\beta han sido resueltas mediante cocristalización con varios ligandos, y demuestran claramente la reubicación de la hélice 12 en presencia de un antagonista del receptor de estrógenos, que supone un impedimento estérico para las secuencias de la proteína necesarias para la interacción entre el receptor y la proteína correguladora [Pike, et al., Embo 18: 4608-4618 (1999), Shiau, et al., Cell 95: 927-937 (1998)]. Además, se ha utilizado la técnica de expresión en genotecas de bacteriófagos para identificar péptidos que interaccionan con los receptores de estrógenos en presencia de diferentes ligandos [Paige, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 3999-4004 (1999)]. Por ejemplo, se identificó un péptido capaz de distinguir entre el ER\alpha unido a los agonistas puros del receptor de estrógenos 17\beta-estradiol y dietilestilbestrol. Se comprobó que un péptido diferente era capaz de distinguir entre el clomifeno unido a ER\alpha y a ER\beta. Estos datos indican que cada ligando es capaz de mantener el receptor en una conformación única e impredecible, y que estas conformaciones poseen probablemente diferentes actividades biológicas.

Como se ha mencionado anteriormente, los estrógenos afectan a múltiples procesos biológicos. Además, en los casos en que se han descrito diferencias entre sexos (por ejemplo, frecuencias de enfermedades, respuestas a provocaciones, etc.), es posible que la explicación resida en diferencias en los niveles de estrógeno entre machos y hembras.

Sathyamoorthy y Wang, European Joournal of Cancer 33: 2348-2389 (1997) describen los efectos diferenciales de los fitoestrógenos de la dieta daidzeina y equol en las células MCF-7 de cáncer de mamá humano. El documento US-A-5.696.127 se refiere, entre otros, a isocromenoquinoles y a moduladores del receptor de esteroides; y Lloyd y Meegan, Drugs 3: 632-642 (2000) presentan una revisión de los avances recientes en los antagonistas del receptor de estrógenos.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un compuesto estrogénico de fórmula I que tiene la estructura,

1

en la que

R_{1} y R_{2} se seleccionan, cada uno independientemente, a partir de hidrógeno, hidroxilo, alquilo de 1-6 átomos de carbono, alquenilo de 2-7 átomos de carbono, alquinilo de 2-7 átomos de carbono, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, o halógeno; en el que los grupos alquilo o alquenilo de R_{1} o R_{2} pueden estar opcionalmente sustituidos con hidroxilo, -CN, halógeno, trifluoroalquilo, trifluoroalcoxi, -NO_{2} o fenilo; y con la salvedad de que por lo menos uno de R_{1} o R_{2} es hidroxilo;

R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, y R_{7} son, cada uno independientemente, hidrógeno, alquilo de 1-6 átomos de carbono, halógeno, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, -CN, alquenilo de 2-7 átomos de carbono, alquinilo de 2-7 átomos de carbono, -CHO, fenilo, o un anillo heterocíclico de 5 ó 6 miembros que tiene 1 a 4 heteroátomos seleccionados a partir de O, N o S; en el que los grupos alquilo o alquenilo de R_{4}, R_{5}, R_{6} o R_{7} pueden estar opcionalmente sustituidos con hidroxilo, -CN, halógeno, trifluoroalquilo, trifluoroalcoxi, -NO_{2} o fenilo; en el que el grupo fenilo de R_{4} o R_{5} puede estar opcionalmente monosustituido, disustituido o trisustituido con alquilo de 1-6 átomos de carbono, alquenilo de 2-7 átomos de carbono, halógeno, hidroxilo, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, -CN, -NO_{2}, amino, alquilamino de 1-6 átomos de carbono, dialquilamino de 1-6 átomos de carbono por cada grupo alquilo, tio, alquiltio de 1-6 átomos de carbono, alquilsulfinilo de 1-6 átomos de carbono, alquilsulfonilo de 1-6 átomos de carbono, alcoxicarbonilo de 2-7 átomos de carbono, alquilcarbonilo de 2-7 átomos de carbono, o benzoílo;

o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

Las sales farmacéuticamente aceptables pueden formarse a partir de ácidos orgánicos e inorgánicos, por ejemplo, acético, propiónico, láctico, cítrico, tartárico, succínico, fumárico, maleico, malónico, mandélico, málico, ftálico, clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, metanosulfónico, naftalenosulfónico, bencenosulfónico, toluenosulfónico, canforsulfónico, y ácidos conocidos aceptables similares cuando un compuesto la presente invención contiene un grupo básico. Las sales también puede formarse a partir de bases orgánicas e inorgánicas, tales como sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio, litio o potasio), sales de metales alcalinotérreos, sales de amonio, sales de alquilamonio que contienen 1-6 átomos de carbono o sales de dialquilamonio que contienen 1-6 átomos de carbono en cada grupo alquilo, y sales de trialquilamonio que contienen 1-6 átomos de carbono en cada grupo alquilo, cuando un compuesto de la presente invención contiene un grupo ácido.

Los términos alquilo y alquenilo, como grupo o parte de un grupo (por ejemplo, alcoxi, alquiltio, alquilcarbonilo), incluyen grupos de cadenas ramificadas y lineales, por ejemplo, de 1-6 y 2-7 átomos de carbono, respectivamente. Los ejemplos incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, sec-butilo, ter-butilo, vinilo, alilo, 1-metilvinilo, y similares. Cuando los grupos alquilo o alquenilo están sustituidos, pueden estar típicamente monosustituidos, disustituidos, trisustituidos o persustituidos. Los ejemplos de un sustituyente halógeno incluyen 1-bromovinilo, 1-fluorovinilo, 1,2-difluorovinilo, 2,2-difluorovinilo, 1,2,2-trifluorovinilo, 1,2-dibromoetano, 1,2-difluoro-etano, 1-fluoro-2-bromoetano, CF_{2}CF_{3}, CF_{2}CF_{2}CF_{3}, y similares. El término halógeno incluye bromo, cloro, flúor y yodo.

Los anillos heterocíclicos preferidos de 5-6 miembros incluyen furano, tiofeno, pirrol, isopirrol, pirazol, imidazol, triazol, ditiol, oxatiol, isoxazol, oxazol, tiazol, isotiazol, oxadiazol, furazano, oxatriazol, dioxazol, oxatiazol, tetrazol, pirano, piridina, piridazina, pirimidina, pirazina, triazina, oxazina, oxatiazina u oxadiazina. Es más preferido que el anillo heterocíclico sea furano o tiofeno.

Tal y como se utiliza en la presente invención, el término "proporcionar", cuando se refiere a proporcionar un compuesto o sustancia cubiertos por la presente invención, significa bien la administración directa de dicho compuesto o sustancia, o la administración de un profármaco, derivado o análogo que se transformará en el interior del organismo en la cantidad eficaz del compuesto o sustancia.

En algunas realizaciones, R_{6} y R_{7} son, cada uno independientemente, hidrógeno o halógeno, por ejemplo R_{6} es hidrógeno o flúor.

R_{4} y R_{5} pueden seleccionarse cada uno independientemente, por ejemplo, a partir de hidrógeno, alquilo de 1-6 átomos de carbono, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, halógeno, alquenilo de 2-7 átomos de carbono, -CN, furilo y tienilo. En algunas realizaciones R_{4} no es hidrógeno, así, R_{4} se selecciona por ejemplo a partir de ciano, cloro, bromo, metilo, etilo, propilo, butilo, metoxi, vinilo, tien-2-ilo y tien-3-ilo.

Ejemplos de R_{5} son hidrógeno y halógeno, por ejemplo, cloro.

Ejemplos de R_{2} y R_{3} son, cada uno independientemente, hidrógeno, halógeno, por ejemplo, cloro, o hidroxilo.

Ejemplos de R_{1} son hidrógeno, hidroxilo y halógeno, por ejemplo, cloro.

En algunas realizaciones sólo uno de R_{1} y R_{2} es hidroxi.

Ejemplos de R_{3} son hidrógeno y halógeno, tal como cloro, por ejemplo, en la posición 4.

De los compuestos de la presente invención, es preferido que R_{6} y R_{7} sean, cada uno independientemente, hidrógeno o halógeno; y R_{4} y R_{5} sean, cada uno independientemente, hidrógeno, alquilo de 1-6 átomos de carbono, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, halógeno, alquenilo de 2-7 átomos de carbono, -CN, furilo, or tienilo. Es más preferido que R_{1}, R_{2} y R_{3} sean, cada uno independientemente, hidrógeno, halógeno o hidroxilo; y aún más preferido que R_{4} no sea hidrógeno.

También se proporcionan procedimientos para preparar los compuestos de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I que comprende una de las siguientes etapas:

a) desalquilar un compuesto de fórmula II:

2

en el que R es un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} son como se ha definido en la presente memoria, para dar lugar a un compuesto de fórmula I; o

b) desacilar un compuesto de fórmula III:

3

en el que R' es un grupo acilo, por ejemplo, alcanoílo de 2-7 átomos de carbono, tal como acetilo, R^{11} es R_{1} o un grupo aciloxi, por ejemplo, alcanoílo de 2-7 átomos de carbono, tal como acetilo, R^{12} es R_{2} o un grupo aciloxi, por ejemplo, alcanoílo de 2-7 átomos de carbono, tal como acetilo, y R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, son como se ha definido en la presente memoria, para dar lugar al correspondiente compuesto de fórmula I; o

c) hacer reaccionar un compuesto de 12-bromo de fórmula IV:

4

protegido si es necesario, en el que R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{6} y R_{7} son como se ha definido en la presente memoria, con un derivado reactivo apropiado de fórmula:

R_{4}-L

en el que R_{4} es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 7 átomos de carbono o un anillo heterocíclico de 5 ó 6 miembros que tiene 1 a 4 heteroátomos seleccionados a partir de O, N o S, y en el que L es un grupo saliente apropiado, por ejemplo, L es un ácido borónico (tal como ácido butilborónico o ácido 2-tiofenoborónico) o un derivado de butil-estaño (tal como aliltributil-estaño); y eliminar los grupos protectores, para dar lugar al correspondiente compuesto de fórmula (I); o

d) halogenar un compuesto de fórmula I:

5

según la reivindicación 1, protegido si es necesario, y en el que por lo menos uno de R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} es hidrógeno, con un agente halogenante, por ejemplo, N-bromosuccinimida, N-cloro-succinimida, seguido, si es necesario, por desprotección, para dar lugar a un compuesto de fórmula I en el que por lo menos uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} es halógeno; o

e) nitrilar (es decir, introducir un grupo CN) un compuesto de fórmula I:

6

como se ha definido en la presente memoria, protegido si es necesario, y en el que R_{4} es bromo, con un agente nitrilante, por ejemplo, cianuro de cinc, seguido, si es necesario, por desprotección, para dar lugar a un compuesto de fórmula I en el que R_{4} es ciano; o

f) convertir un compuesto básico de fórmula I en una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, o viceversa.

Los reactivos utilizados en la preparación de los compuestos de la presente invención están disponibles en el mercado o pueden prepararse mediante procedimientos estándar descritos en la literatura. En cualquiera de las reacciones descritas en la presente memoria, los grupos o sitios sustituyentes reactivos pueden protegerse antes de llevar a cabo la reacción, y el grupo protector puede eliminarse después.

En el procedimiento a) anterior en el que cualquiera de R_{1} y R_{2} es también alcoxi, este grupo puede desalquilarse después en la misma reacción, para dar lugar al correspondiente compuesto de fórmula I en el que R_{1} y/o R_{2} es hidroxi.

La preparación de varios ejemplos representativos de la presente invención siguiendo los procedimientos anteriores se describe en los Esquemas 1 a 10 siguientes.

Esquema 1

7

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Esquema 2

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Esquema 3

9

Esquema 4

10

Esquema 5

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Esquema 6

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Esquema 7

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Esquema 8

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Esquema 9

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Esquema 10

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Se conocen varios procedimientos estándar de análisis farmacológico para determinar el perfil de actividad de un compuesto de prueba dado. A continuación, se resumen brevemente varios procedimientos de prueba representativos y se incluyen datos para los compuestos representativos de la invención. Todos los ensayos, excepto el ensayo de fijación de radioligandos, pueden utilizarse para detectar la actividad agonista o antagonista en el receptor de estrógenos presentada por los compuestos. En general, la actividad agonista en el receptor de estrógenos se mide comparando la actividad del compuesto con la de un estrógeno de referencia (por ejemplo 17\beta-estradiol, 17\alpha-etinil,17\beta-estradiol, estrona, dietilestilbestrol etc.). La actividad antagonista en el receptor de estrógenos se mide generalmente administrando al mismo tiempo el compuesto de prueba y el estrógeno de referencia, y comparando el resultado con el obtenido cuando se utiliza solo el estrógeno de referencia. También se proporcionan procedimientos estándar de análisis farmacológico para SERM en las patentes U.S. 4.418.068 y 5.998.402, que se incorporan en la presente memoria a título de referencia.

Evaluación de las afinidades de unión a ER\alpha y ER\beta

Se evaluó la capacidad de ejemplos representativos de la invención de competir con la unión de 17\beta-estradiol a ER\alpha y ER\beta en un ensayo convencional de fijación de radioligandos. Este procedimiento de prueba proporciona la metodología para determinar las afinidades relativas de unión a los receptores ER\alpha o ER\beta. El procedimiento utilizado se describe brevemente a continuación.

Preparación de extractos de receptores para la caracterización de la selectividad de la unión. Los dominios de unión al ligando, definidos por convención en la presente memoria como todas las secuencias corriente abajo del dominio de unión al ADN, se obtuvieron por PCR utilizando ADNc de longitud completa como moldes, y cebadores que contenían los sitios de restricción apropiados para la subclonación, manteniendo al mismo tiempo el marco de lectura apropiado para la expresión. Estos moldes contenían los aminoácidos M_{250}-V_{595} del ER\alpha humano [Green, et al., Nature 320: 134-9 (1986)] y M_{214}-Q_{530} del ER\beta humano [Ogawa, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 243: 122-6 (1998)]. El ER\beta humano se clonó en pET15b (Novagen, Madison WI) en forma de fragmento de Nco1-BamH1 que portaba un marcador Flag en el extremo C-terminal. El ER\alpha humano se clonó como en el caso del ER\beta, con la salvedad de que se añadió un marcador His en el extremo N-terminal. Las secuencias de todas las construcciones utilizadas se verificaron por secuenciación completa de ambas cadenas.

Se utilizaron células BL21(DE3) para expresar las proteínas humanas. Típicamente, se utilizaron 10 ml de medio cultivado durante toda la noche para inocular un cultivo de 1 l de medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina. Tras incubar durante toda la noche a 37ºC, se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM y se continuó la incubación a 25ºC durante 2 horas. Las células se recogieron por centrifugación (1500 x g), y los sedimentos se lavaron y se resuspendieron en 100 ml de Tris-CI 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM. Las células se lisaron haciéndolas pasar dos veces a través de una prensa de French a 12.000 psi. El lisado se clarificó por centrifugación a 12.000 x g durante 30 minutos a 4ºC, y se conservó a -70ºC.

Evaluación de la capacidad de fijación específica de [^{3}H]-estradiol de los extractos. Como tampón de ensayo se utilizó solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (Gibco, concentración final 1x) a la que se había añadido EDTA 1 mM. Para optimizar la cantidad de receptor utilizada en el ensayo, se añadieron [^{3}H]-17\beta-estradiol (New England Nuclear; concentración final = 2 nM) \pm dietilestilbestrol 0,6 \muM y 100 \mul de varias diluciones del lisado de E. coli a cada pocillo de una placa de microvaloración enmascarada para la fijación a alto nivel (EG&G Wallac). El volumen final del ensayo fue 120 \mul y la concentración de DMSO fue \leq 1%. Tras incubar a temperatura ambiente durante 5-18 horas, el material no unido fue aspirado y la placa se lavó tres veces con aproximadamente 300 \mul de tampón de ensayo. Tras el lavado, se añadieron 135 \mul de líquido de centelleo (Optiphase Supermix, EG&G Wallac) a los pocillos, y la placa se selló y agitó durante por lo menos 5 minutos, para mezclar el líquido de centelleo con el tampón de lavado restante. La radioactividad unida se evaluó por recuento de centelleo líquido (EG&G Wallac Microbeta Plus).

Tras determinar la dilución de cada preparación de receptores que proporcionaba la máxima unión específica, el ensayo se optimizó, además, calculando la CI_{50} del 17\beta-estradiol no marcado utilizando varias diluciones de la preparación de receptores. Para cada preparación de receptores se escogió una dilución final de trabajo a la que la CI_{50} del 17\beta-estradiol no marcado era 2-4 nM.

Procedimiento de prueba de competición por la unión de ligandos. Los compuestos de prueba se solubilizaron inicialmente en DMSO y la concentración final de DMSO en el ensayo de fijación fue \leq 1%. Se utilizaron ocho diluciones de cada compuesto de prueba como competidor no marcado del [^{3}H]-17\beta-estradiol. Típicamente, un grupo de diluciones del compuesto se analizaban simultáneamente en los ER\alpha y ER\beta humanos. Los resultados se representaron gráficamente en forma de DPM medidas frente a la concentración de compuesto de prueba. Para el ajuste de la curva dosis-respuesta, se ajustó un modelo logístico de cuatro parámetros a los datos ponderados y transformados, y la CI_{50} se definió como la concentración de compuesto que disminuía la unión máxima del [^{3}H]-estradiol en un 50%.

Las afinidades de unión por el ER\alpha y el ER\beta (medidas como CI_{50}) para ejemplos representativos de la invención se muestran en la Tabla (1).

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Los resultados obtenidos en el procedimiento estándar de análisis farmacológico descrito anteriormente demuestran que los compuestos de la presente invención se unen a ambos subtipos del receptor de estrógenos. Las CI_{50} son generalmente menores para el ER\beta, lo que indica que estos compuestos son preferentemente ligandos selectivos del ER\beta, pero siguen siendo considerados activos en el ER\alpha. Los compuestos de la presente invención presentarán una gama de actividad basada, al menos en parte, en sus perfiles de selectividad en la afinidad por el receptor. Dado que los compuestos de la invención se unen a ER\beta con mayor afinidad que a ER-\alpha, serán útiles para el tratamiento o la inhibición de enfermedades que pueden modularse a través del ER-\beta. Además, dado que cada complejo de receptor-ligando es único, y, por tanto, su interacción con varias proteínas correguladoras es única, los compuestos de la presente invención presentarán actividades diferentes e impredecibles en función del contexto celular. Por ejemplo, en algunos tipos celulares, es posible que un compuesto se comporte como un agonista del receptor de estrógenos, mientras que en otros tejidos se comporte como un antagonista del receptor de estrógenos. Los compuestos con dicha actividad se han denominado a veces SERM (Moduladores selectivos del receptor de estrógenos). Sin embargo, a diferencia del caso de muchos estrógenos, muchos SERM no provocan aumentos en el peso húmedo uterino. Estos compuestos son antiestrogénicos en el útero, y pueden antagonizar completamente los efectos tróficos de los agonistas del receptor de estrógenos en el tejido uterino. Sin embargo, estos compuestos, actúan como agonistas del receptor de estrógenos en los sistemas óseo, cardiovascular, y en el sistema nervioso central. Debido a esta característica selectiva de tejido de estos compuestos, resultan útiles para el tratamiento o la inhibición de trastornos patológicos o síndromes en un mamífero causados por, o asociados a, la insuficiencia de estrógenos (en algunos tejidos tales como los tejidos óseos o cardiovasculares) o a un exceso de estrógeno (en el útero o las glándulas mamarias). Además, los compuestos de la presente invención presentan también la capacidad de comportarse como agonistas del receptor de estrógenos en un tipo de receptor, comportándose al mismo tiempo como antagonistas del receptor de estrógenos en el otro. Por ejemplo, se ha demostrado que los compuestos pueden antagonizar la acción del 17\beta-estradiol a través de su acción en el ER\beta, presentando el mismo tiempo actividad agonista del receptor de estrógenos en el ER\alpha [Sun, et al., Endocrinology 140: 800-804 (1999)]. Dicha actividad ERSAA (Agonista-antagonista selectivo del receptor de estrógenos) proporciona actividades estrogénicas farmacológicamente distintas dentro de esta serie de compuestos.

Regulación del ARNm de la metalotioneina II

Los estrógenos que actúan a través de ER\beta, pero no ER\alpha, pueden regular al alza los niveles del ARNm de la metalotioneina II en las células Saos-2, como se ha descrito por Harris [Endocrinology 142: 645-652 (2001)]. Los resultados de este procedimiento de prueba pueden combinarse con los resultados del procedimiento de prueba descrito más adelante (procedimiento de análisis indicador de ERE) para generar un perfil de selectividad para los compuestos de la presente invención (véase también el documento WO 00/37681).

Evaluación del compuesto de prueba utilizando un procedimiento de análisis indicador de ERE en células MCF-7 de cáncer de mama

Se preparan soluciones de reserva de los compuestos de prueba (generalmente de 0,1 M) en DMSO y después se diluyen 10 a 100 veces con DMSO para obtener soluciones de trabajo de 1 ó 10 mM. Las soluciones de reserva en DMSO se conservan a 4ºC (0,1 M) o a -20ºC (<0,1 M). Las células MCF-7 se propagan por pases dos veces a la semana con medio de cultivo [medio D-MEM/F-12 que contenía suero bovino fetal termoinactivado al 10% (v/v), penicilina-estreptomicina al 1% (v/v), y glutaMAX-1 2 mM]. Las células se mantienen en matraces ventilados a 37ºC dentro de un incubador con 5% de CO_{2}/95% de aire húmedo. Un día antes del tratamiento, las células se siembran con medio de cultivo a una densidad de 25.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se incuban a 37ºC durante toda la noche.

Las células se infectan durante 2 h a 37ºC con 50 \mul/pocillo de una dilución 1:10 de adenovirus 5-ERE-tk-luciferasa en medio experimental [medio D-MEM/F-12 exento de rojo fenol, que contenía suero bovino fetal termoinactivado, tratado con carbón, al 10% (v/v), penicilina-estreptomicina al 1% (v/v), glutaMAX-1 2 mM, piruvato de sodio 1 mM]. Los pocillos se lavan después una vez con 150 \mul de medio experimental. Finalmente, las células se tratan durante 24 h a 37ºC en series de 8 pocillos/tratamiento con 150 \mul/pocillo de vehículo (\leq 0,1% de DMSO, v/v) o compuesto diluido \geq 1000 veces en medio experimental.

El cribado inicial de los compuestos de prueba se realiza a una dosis única de 1 \muM que se analiza por separado (modo de agonista del receptor de estrógenos) o en combinación 17\beta-estradiol 0,1 nM (CE_{80}; modo antagonista del receptor de estrógenos). Cada placa de 96 pocillos incluye también un grupo testigo con vehículo (DMSO al 0,1%, v/v) y un grupo testigo con un agonista del receptor de estrógenos (17\beta-estradiol 0,1 ó 1 nM). Los experimentos de dosis-respuesta se realizan en el modo agonista del receptor de estrógenos y/o antagonista del receptor de estrógenos de los compuestos activos en incrementos logarítmicos de 10^{-14} a 10^{-5} M. A partir de estas curvas de dosis-respuesta se calculan los valores de CE_{50} y CI_{50}, respectivamente. El pocillo final en cada grupo de tratamiento contiene 5 \mul de ICI-182.780 3 x 10^{-5} M (concentración final de 10^{-6} M) como testigo antagonista del receptor de estrógenos.

Después del tratamiento, las células se lisan en un agitador durante 15 min con 25 \mul/pocillo de reactivo de lisis de cultivo celular 1X (Promega Corporation). Los lisados celulares (20 \mul) se transfieren a una placa de luminómetro de 96 pocillos, y se mide la actividad de la luciferasa en un luminómetro MicroLumat LB 96 P (EG & G Berthold) utilizando 100 \mul/pocillo de sustrato de luciferasa (Promega Corporation). Antes de la inyección de sustrato, se hace una lectura del fondo durante 1 segundo para cada pocillo. Tras la inyección del sustrato, se mide la actividad luciferasa durante 10 segundos, tras un retardo de 1 segundo. Los datos se transfieren del luminómetro a un ordenador personal Macintosh y se analizan con el software JMP (SAS Institute), que resta los valores de la lectura del fondo de las mediciones de luciferasa para cada pocillo, y después determina la media y la desviación típica de cada tratamiento.

Se realiza la transformación logarítmica de los datos de la luciferasa, y se utiliza el estimador M de Huber para infraponderar las observaciones transformadas de los extremos. El software JMP se utiliza para analizar los datos transformados y ponderados con un ANOVA unidireccional (prueba de Dunnett). Los tratamientos con compuesto se comparan con los resultados del testigo con vehículo en el modo agonista del receptor de estrógenos, o con los resultados del testigo positivo del agonista del receptor de estrógenos (17\beta-estradiol 0,1 nM) en el modo antagonista del receptor de estrógenos. Para el experimento con una dosis única inicial, si los resultados del tratamiento con compuesto difieren significativamente de los del testigo apropiado (p < 0,05), los resultados se notifican después como porcentaje relativo del testigo con 17\beta-estradiol [es decir, ((compuesto - testigo con vehículo)/(testigo con 17\beta-estradiol - testigo con vehículo)) x 100]. El software JMP se utiliza también para determinar los valores de CE_{50} y/o CI_{50} a partir de las curvas no lineales de dosis-respuesta.

Evaluación de la actividad uterotrófica

La actividad uterotrófica de un compuesto de prueba puede medirse siguiendo los siguientes procedimientos estándar de análisis farmacológico.

Procedimiento 1

Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley sexualmente inmaduras (de 18 días de edad) de Taconic, y se les permitió acceso ilimitado a una dieta a base de caseína (Purina Mills 5K96C) y agua. En los días 19, 20 y 21 se administra a las ratas, por vía subcutánea, 17\alpha-etinil-17\beta-estradiol (0,06 \mug/rata/día), compuesto de prueba o vehículo (DMSO al 50%/PBS de Dulbecco al 50%). Para la evaluación de antagonistas del receptor de estrógenos, los compuestos se administran junto con 17\alpha-etinil-17\beta-estradiol (0,06 \mug/rata/día). Hay seis ratas/grupo y se sacrifican aproximadamente 24 horas después de la última inyección mediante asfixia con CO_{2} y neumotórax. Los úteros se extraen y se pesan tras eliminar la grasa asociada y evacuar todo el líquido interno. También puede congelarse rápidamente una muestra de tejido para el análisis de la expresión de genes (por ejemplo, ARNm del factor de complemento 3).

Procedimiento 2

Se obtuvieron ratones 129 SvE sexualmente inmaduros (de 18 días de edad) de Taconic, y se les permitió acceso ilimitado a una dieta a base de caseína (Purina Mills 5K96C) y agua. En los días 22, 23, 24 y 25 se administró a los ratones, por vía subcutánea, un compuesto o vehículo (aceite de maíz). Había seis ratones/grupo y se sacrificaron aproximadamente 6 horas tras la última inyección mediante asfixia con CO_{2} y neumotórax. Los úteros fueron extraídos y pesados tras eliminar la grasa asociada y evacuar todo el líquido interno. Se obtuvieron los siguientes resultados (Tabla (2)) para los compuestos representativos de la invención.

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Evaluación de la osteoporosis y de la modulación lipídica (cardioprotección)

Se obtienen ratas Sprague-Dawley hembras, ovariectomizadas o con operación simulada, 1 día después de la intervención quirúrgica de Taconic Farms (intervalo de pesos: 240 - 275 g). Se alojan 3 ó 4 ratas/jaula en una habitación sometida a un programa 12/12 (luz/oscuridad) con alimentos (pienso Purina 5K96C para ratas) y agua ad libitum. El tratamiento en todo los estudios comienza 1 día después de la llegada de los animales, y las ratas reciben dosis 7 días por semana, según proceda, durante 6 semanas. Un grupo de ratas de edad equivalente y con operación simulada que no recibió ningún tratamiento servía como grupo testigo intacto de reposición de estrógeno en cada estudio.

Todos los compuestos de prueba se preparan en un vehículo compuesto de DMSO al 50% (JT Baker, Phillipsburg, NJ)/solución salina con fosfato de Dulbecco 1x (GibcoBRL, Grand Island, NY) a concentraciones definidas, de modo que el volumen de tratamiento es 0,1 ml/100 g de peso corporal. El 17\beta-estradiol se disuelve en aceite de maíz (20 \mug/ml) y se administra por vía subcutánea, 0,1 ml/rata. Todas las dosis se ajustan a intervalos de tres semanas en función de la media de las medidas de peso corporal del grupo, y se administran por vía subcutánea.

Cinco semanas antes del comienzo del tratamiento y una semana antes del final del estudio se evalúa la densidad mineral ósea (DMO) de cada una de las ratas. Se evalúan la densidad total y trabecular de la porción proximal de la tibia en ratas anestesiadas, utilizando un aparato XCT-960M (pQCT; Stratec Medizintechnik, Pforzheim, Alemania). Las medidas se realizan de la siguiente manera: Quince minutos antes de la tomografía, se anestesia cada rata mediante una infección intraperitoneal de 45 mg/kg de ketamina, 8,5 mg/kg de xilazina y 1,5 mg/kg de acepromazina.

La pata trasera derecha se hace pasar a través de un tubo de policarbonato con un diámetro de 25 mm y se fija a un marco acrílico manteniendo la articulación del tobillo a un ángulo de 90 grados, y la articulación de la rodilla a 180 grados. El tubo de policarbonato se fija a una plataforma deslizante que lo mantiene perpendicular a la apertura del aparato de pQCT. La plataforma se ajusta de modo que el extremo distal del fémur y el extremo proximal de la tibia se encuentren en el campo de la tomografía. Se realiza una exploración bidimensional preliminar de una longitud de 10 mm y una resolución lineal de 0,2 mm. Una vez visualizada la exploración preliminar en el monitor, se localiza el extremo proximal de la tibia. La tomografía con pQCT se inicia en un lugar a 3,4 mm en posición distal de este punto. La tomografía con pQCT tiene un grosor de 1 mm y un tamaño de vóxel (píxel tridimensional) de 0,140 mm, que consta de 145 proyecciones a través del corte.

Tras completar la tomografía con pQCT, la imagen se visualiza en el monitor. Se resalta una región de interés que incluye la tibia pero excluye el peroné. El tejido blando se elimina matemáticamente utilizando un algoritmo iterativo. La densidad del hueso restante (densidad total) se notifica en mg/cm^{3}. El 55% de la zona exterior del hueso se elimina matemáticamente en una espiral concéntrica. La densidad del hueso restante (densidad trabecular) se notifica en mg/cm^{3}.

Una semana después de la evaluación de la DMO, las ratas se sacrifican mediante asfixia con CO_{2} y neumotórax, y se extrae sangre para la determinación de colesterol. También se extraen los úteros y se pesan tras eliminar la grasa asociada y evacuar todo el líquido interno. El colesterol total se determina con un analizador clínico Hitachi 911 de Boehringer-Mannheim, utilizando el kit Cholesterol/HP. Los valores estadísticos se compararon utilizando análisis de la varianza unidireccional con la prueba de Dunnet.

Evaluación de la actividad antioxidante

Se obtienen aortas porcinas de un matadero, se lavan y se transportan en PBS enfriada, y se extraen las células endoteliales aórticas. Para la extracción de las células, se atan los vasos intercostales de la aorta y se pinza un extremo de la aorta. Se coloca colagenasa (Sigma, tipo I) al 0,2%, recién preparada, esterilizada por filtración, en un vaso, y el otro extremo del vaso se pinza después para formar un sistema cerrado. La aorta se incuba a 37ºC durante 15-20 minutos, y después se recoge la solución de colagenasa y se centrifuga durante 5 minutos a 2000 x g. Cada sedimento se resuspende en 7 ml de medio de cultivo de células endoteliales, que constaba de medio DMEM/F12 de Ham exento de rojo fenol, enriquecido con FBS tratado con carbón (5%), NuSerum (5%), L-glutamina (4 mM), penicilina-estreptomicina (1000 U/ml, 100 \mug/ml) y gentamicina (75 \mug/ml), se siembra en placas de Petri de 100 mm y se incuba a 37ºC en CO_{2} al 5%. Tras 20 minutos, las células se lavan con PBS y se añade medio nuevo, y se repite esta operación otra vez a las 24 horas. Las células son confluentes tras aproximadamente 1 semana. Las células endoteliales reciben aporte nutritivo de forma sistemática dos veces a la semana y, cuando son confluentes, se tratan con tripsina y se siembran en una relación 1:7. Se deja transcurrir la oxidación, mediada por células, de 12,5 g/ml de LDL en presencia del compuesto evaluado (5 \muM) durante 4 horas a 37ºC. Los resultados se expresan como porcentaje de la inhibición del procedimiento oxidativo, medido por el método TBARS (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico) para el análisis de aldehídos libres [Yagi, Biochemical Medicine 15: 212-6 (1976)].

Procedimiento estándar de análisis farmacológico de la regulación del ARNm del receptor de progesterona

Este procedimiento de prueba puede utilizarse para evaluar la actividad estrogénica o antiestrogénica de compuestos de la presente invención [Shughrue, et al., Endocrinology 138: 5476-5484 (1997)]. Los datos para compuestos representativos de la invención se muestran en la Tabla (3).

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Procedimiento de prueba de sofocos en rata

El efecto de los compuestos de prueba en los sofocos puede evaluarse mediante un procedimiento estándar de análisis farmacológico que mide la capacidad de un compuesto de prueba para contrarrestar el incremento en la temperatura de la piel de la cola que sobreviene cuando ratas adictas a la morfina son sometidas a abstinencia aguda de la droga debida a la administración de naloxona [Merchenthaler, et al., Maturitas 30: 307-16 (1998)]. También puede utilizarse para detectar la actividad antagonista en el receptor de estrógenos mediante la administración conjunta del compuesto de prueba con el estrógeno referencia.

Evaluación de la función vasomotora en anillos aórticos de rata aislados

Se dividen ratas Sprague-Dawley (240-260 gramos) en 4 grupos:

1.

Ratas normales no ovariectomizadas (intactas)

2.

Ratas ovariectomizadas (ovex) tratadas con vehículo

3.

Ratas ovariectomizadas tratadas con 17\beta-estradiol (1 mg/kg/día)

4.

Ratas ovariectomizadas tratadas con compuesto de prueba (varias dosis).

Los animales son sometidos a ovariectomía aproximadamente 3 semanas antes del tratamiento. Cada animal recibe sulfato de 17\beta-estradiol (1 mg/kg/día) o compuesto de prueba resuspendido en agua desionizada y destilada, con Tween-80 al 1% a través de sonda nasogástrica. Los animales tratados con vehículo recibieron un volumen apropiado del vehículo utilizado en los grupos tratados con fármaco.

Los animales se sacrifican por inhalación de CO_{2} y sangrado. Se extraen rápidamente las aortas torácicas y se colocan en solución fisiológica a 37ºC que tenía la siguiente composición (mM): NaCl (54,7), KCl (5,0), NaHCO_{3} (25,0), MgCl_{2} 2H_{2}O (2,5), D-glucosa (11,8) y CaCl_{2} (0,2) burbujeada con gas CO_{2}-O_{2}, 95%/5%, para obtener un pH final de 7,4. Se elimina la túnica adventicia de la superficie externa y el vaso se corta en anillos de 2-3 mm de anchura. Los anillos se resuspende en un baño de tejidos de 10 ml con un extremo atado al fondo del baño y el otro extremo a un transductor de fuerza. Se ejerce una tensión en reposo de 1 gramo sobre los anillos. Los anillos se equilibran durante 1 hora, y las señales se miden y se analizan.

Tras el equilibrado, los anillos exponen a concentraciones crecientes de fenilefrina (10^{-8} a 10^{-4} M) y se registra la tensión. Después se lavan los baños 3 veces con tampón nuevo. Tras el lavado, se añade L-NAME 200 mM al baño de tejidos y se equilibra durante 30 minutos. A continuación se repite la curva de respuesta a la concentración de fenilefrina.

Evaluación de la actividad cardioprotectora

Se obtuvieron ratones C57/B1J carentes de apolipoproteína E (apo E KO) de Taconic Farms. Todo los procedimientos con animales se realizan con arreglo estricto a las directrices del IACUC. Los ratones hembras ovariectomizados apo E KO, de 4-7 semanas de edad, se mantienen en jaulas del tamaño de una caja de zapatos con acceso libre a alimentos y agua. Los animales se asignan a varios grupos de modo aleatorio por peso (n=12-15 ratones por grupo). Se administra a los animales compuestos de prueba o estrógeno (sulfato de 17\beta-estradiol a una dosis de 1 mg/kg/día) en la dieta, utilizando un protocolo de dosificación precisa, de modo que la cantidad de alimentos consumidos se mide semanalmente, y la dosis se ajusta como corresponda, en función del peso del animal. La dieta utilizada es una dieta de tipo occidental (57U5) preparada por Purina y contienen 0,50% de colesterol, 20% de manteca de cerdo y 25 UI/kg de vitamina E. Los animales reciben dosis o se alimentan utilizando este esquema durante un periodo de 12 semanas. Los animales testigo se alimentan con la dieta de estilo occidental y no reciben ningún compuesto. Al final del período del período, los animales se sacrifican y se obtienen muestras de plasma. Los corazones se perfunden in situ, primero con solución salina, y después con solución neutra tamponada de formol al 10%.

Para la determinación de lípidos y lipoproteínas plasmáticas, se determinan el colesterol y los triglicéridos totales utilizando métodos enzimáticos con kits comerciales obtenidos de Boehringer Mannheim y Wako Biochemicals, respectivamente, y se analizan utilizando el analizador Hitachi 911 de Boehringer Mannheim. La separación y cuantificación de lipoproteínas plasmáticas se realiza utilizando tamizado molecular por FPLC. Brevemente, se filtran 50-100 ml de suero y se inyectan en columnas de Superose 12 y Superose 6 conectadas en serie, y se eluyen a caudal constante con EDTA sódico 1 mM y NaCl 0,15 M. Las áreas de cada curva que representan VLDL, LDL y HDL se integran utilizando el software Waters Millennium™, y cada fracción de lipoproteínas se cuantifica multiplicando el valor del colesterol total por el porcentaje relativo del área de cada pico respectivo en el cromatograma.

Para la cuantificación de la aterosclerosis aórtica, se aíslan con cuidado las aortas y se colocan en fijador de formol durante 48-72 horas antes de su manipulación. Las lesiones ateroscleróticas se identifican utilizando tinción con Aceite Rojo O. Los vasos se destiñen brevemente y sus imágenes se analizan después utilizando un microscopio Nikon SMU800 equipado con una cámara de vídeo Sony 3CCD sincronizada con la herramienta informática de configuración IMAQ (National Instrument) como software de captura de imágenes. Las lesiones se cuantifican de frente a lo largo del cayado aórtico utilizando un paquete de herramientas informáticas de umbral a medida (Coleman Technologies). La valoración automática de las lesiones de los vasos se lleva a cabo utilizando la función de umbral del programa, específicamente en la región, contenida en el interior del cayado aórtico, que va del borde proximal del tronco braquiocefálico hasta el borde distal de la arteria subclavia izquierda. Los datos de aterosclerosis aórtica se expresan como porcentaje de la lesión situada estrictamente dentro de esta área nominal definida.

Evaluación de la mejora de la capacidad cognitiva

Se habitúan ratas ovariectomizadas (n=50) a un laberinto radial de 8 brazos durante períodos de 10 min en cada uno de 5 días consecutivos. Los animales están privados de agua antes de la habituación y la realización de las pruebas. Una parte alícuota de 100 \mul de agua colocada en los extremos de cada brazo sirve como recompensa. La adquisición de una tarea de resolución correcta en el laberinto de brazos radiales se logra dejando que el animal tenga acceso a un tramo con cebo. Tras beber, el animal desaloja el brazo y vuelve a entrar en el compartimento central, desde el que tiene acceso ahora al brazo visitado previamente o a un nuevo brazo. Se registra una respuesta correcta cuando el animal escoge entrar en un nuevo brazo. A cada animal se le permiten 5 intentos por día durante 3 días. Tras el último intento de adquisición, los animales se asignan a uno de los 4 grupos siguientes:

1.

Testigos negativos: recibieron inyecciones de vehículo de DMSO al 10%/aceite de sésamo una vez al día durante 6 días (1 ml/kg, SC).

2.

Testigos positivos: recibieron inyecciones de benzoato de 17\beta-estradiol durante 2 días y se sometieron a la prueba 4 días después de la segunda inyección (17\beta-benzoato de estradiol a 10 \mug/0,1 ml por rata).

3.

Estradiol: recibieron inyecciones de 17\beta-estradiol cada día durante 6 días (20 \mug/kg, SC).

4.

Compuesto de prueba: inyectado cada día durante 6 días (dosis variables).

Todas las inyecciones comienzan tras la prueba en el último día de la adquisición. La última inyección de los grupos 1, 3 y 4 tiene lugar 2 horas antes de la prueba de memoria de trabajo.

La prueba de memoria de trabajo es una prueba demorada sin ajuste a la muestra (DNMS, delayed non-matching-to-sample task) utilizando demoras de 15, 30 ó 60 segundos. Esta tarea es una variante de la tarea de adquisición, en la que se coloca la rata en la cámara central, y se le permite entrar en un brazo, como en el caso anterior. Un segundo brazo se abre una vez que la rata alcanza la mitad del primer brazo, y, una vez más, se obliga a la rata a escoger este brazo. Cuando el animal ha avanzado hasta la mitad de este segundo brazo, se cierran ambas puertas y se instaura la demora. Una vez finalizada la demora, se abren simultáneamente tanto las dos puertas originales como una tercera puerta, nueva. Se registra una respuesta correcta cuando el animal avanza hacia la mitad del tercer brazo, el nuevo brazo. Se registra una respuesta incorrecta cuando el animal avanza hasta la mitad de los brazos primero o segundo. Se permitirán a cada animal 5 intentos en cada uno de los tres intervalos de demora durante un total de 15 intentos por animal.

Evaluación del efecto sobre la pleuresía

La capacidad de reducir los síntomas de la pleuresía provocada experimentalmente en ratas puede evaluarse siguiendo el procedimiento de Cuzzocrea [Endocrinology 141: 1455-63 (2000)].

Evaluación de la actividad protectora de la citotoxicidad inducida por glutamato (neuroprotección)

La actividad neuroprotectora de los compuestos de la presente invención puede evaluarse en un procedimiento estándar de análisis farmacológico in vitro utilizando una prueba de provocación con glutamato [Zaulyanov, et al., Cellular & Molecular Neurobiology 19: 705-18 (1999); Prokai, et al., Journal of Medicinal Chemistry 44: 110-4 (2001)].

Evaluación en el procedimiento de prueba con yemas terminales mamarias

Los estrógenos son necesarios para la elongación y ramificación completas de los conductos mamarios, y para el desarrollo posterior de las yemas terminales lóbulo-alveolares bajo la influencia de la progesterona. En este procedimiento de prueba, se evaluó la actividad mamotrófica de compuestos seleccionados de la invención con arreglo al siguiente procedimiento estándar de análisis farmacológico. Se practicó la ovariectomía en ratas Sprague-Dawley de veintiocho días de edad (Taconic Farms, Germantown, NY), a las que se permitió reposar durante nueve días. Los animales se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, y recibieron una dieta a base de caseína, la dieta 5K96 para roedores de Purina Laboratory (Purina, Richmond, IN), y tuvieron acceso libre al agua. A continuación, las ratas recibieron durante seis días dosis subcutáneas de vehículo (DMSO al 50% (JT Baker, Phillipsburg, NJ)/1x solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco al 50% (GibcoBRL, Grand Island, NY), 17\beta-estradiol (0,1 mg/kg) o compuesto de prueba (20 mg/kg). En los últimos tres días, las ratas recibieron también dosis subcutáneas de progesterona (30 mg/kg). En el séptimo día, se sacrificaron las ratas y se extrajo una almohadilla de grasa mamaria. Esta almohadilla de grasa se analizó en busca del ARNm de la caseína-quinasa II, como marcador de la proliferación de las yemas terminales. El ARNm de la caseína-quinasa II se analizó por RT-PCR en tiempo real. Brevemente, se aisló el ARN tras el tratamiento con Trizol (GibcoBRL, Grand Island, NY) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se trataron con DNAsa I utilizando un kit DNA-free (Ambion), y los niveles de ARNm de la caseína-quinasa II se midieron por RT-PCR en tiempo real utilizando el procedimiento Taqman Gold (PE Applied Biosystems). Se analizó un total de 50 ng de ARN por triplicado, utilizando un par de cebadores específicos de la caseína-quinasa II (cebador 5', CACACGGATGGCGCATACT; cebador 3', CTCGGGATGCACCATGAAG) y una sonda a medida (TAMRA-CGGCACTGGTTTCCCTCACATGCT-FAM). Los niveles del ARNm de la caseína-quinasa II se normalizaron respecto a los del ARN de la subunidad 18s ribosómica incluida en cada reacción de muestra, utilizando cebadores y sonda proporcionados por PE Applied Biosystems. Se obtuvieron los siguientes resultados para un ejemplo de la invención (Tabla (4)).

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Evaluación en el procedimiento estándar de análisis farmacológico de la enfermedad inflamatoria intestinal en ratas HLA

Se evaluaron compuestos representativos de la invención en el procedimiento estándar de análisis farmacológico de ratas HLA que simula la enfermedad inflamatoria intestinal en los seres humanos. A continuación se describe brevemente el procedimiento utilizado y los resultados obtenidos. Se obtuvieron ratas HLA-B27 machos de Taconic y se les permitió acceso ilimitado a alimentos (PMI LabDiet 5001) y agua. Se administró a las ratas una dosis diaria (por vía oral) de vehículo (Tween-80 al 2%/metilcelulosa al 0,5%) o del compuesto del Ejemplo 1d (10 mg/kg) durante 26 días. Se observó la calidad de las heces diariamente y se puntuó de acuerdo con la siguiente escala: diarrea = 3; heces blandas = 2; heces normales = 1. La Tabla (5) demuestra que la calidad de las heces mejoró tras la administración de dosis del compuesto del Ejemplo 1d. Al final del estudio se extrajo suero y se conservó a -70ºC. Se preparó un corte del colon para el análisis histológico y se analizó la actividad mieloperoxidasa de un segmento adicional.

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Análisis histológico. Se sumergió el tejido colónico en formol neutro tamponado al 10%. Cada espécimen de colon se separó en cuatro muestras para su evaluación. Los tejidos fijados con formol se procesaron en un aparato de infiltración por vacío Tissue Tek (Miles, Inc; West Haven, Connecticut) para su inclusión en parafina. Las muestras se cortaron en secciones de 5 \mum y después se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para evaluaciones histológicas con enmascaramiento de la muestra, utilizando una escala modificada siguiendo el modelo de Boughton-Smith. Una vez obtenidas las puntuaciones, se desenmascararon las muestras y los datos se tabularon y se analizaron con un modelo de ANOVA lineal con comparaciones múltiples de las medias. Los cortes de tejido colónico se evaluaron para detectar diversos indicadores de enfermedades y recibieron puntuaciones relativas. Como se muestra en la Tabla (6), el compuesto del Ejemplo 1d es capaz de reducir eficazmente diversas medidas de la lesión tisular.

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Evaluación en dos modelos de artritis

Ensayo de la artritis inducida por adyuvantes en ratas Lewis. Se alojan sesenta ratas Lewis hembras, de 12 semanas de edad, siguiendo procedimientos normalizados de trabajo. Los animales reciben un régimen estándar de alimentos y agua ad libitum. Cada animal se identifica por medio de una tarjeta de jaula que indica el grupo del proyecto y el número del animal. Cada número de rata figura escrito en la cola con rotulador de tinta indeleble. Por lo menos 10-21 días antes del estudio, los animales se anestesian y se someten a ovariectomía siguiendo técnicas quirúrgicas asépticas normalizadas.

Se utiliza el adyuvante completo de Freund (Sigma Immuno Chemicals, St. Louis, MO) para inducir la artritis, conteniendo cada mililitro 1 mg de Mycobacterium tuberculosis termoinactivada y desecada, 0,85 ml de aceite mineral y 0,15 ml de monooleato de dianhidromanitol, número de lote 084H8800.

A continuación se presentan ejemplos de dos procedimientos de prueba. Procedimiento de prueba de inhibición: Se inyectan a treinta ratas, por vía intradérmica, 0,1 ml de adyuvante completo de Freund en la base de la cola. Los animales se asignan de forma aleatoria a cuatro grupos, conteniendo cada grupo seis ratas. Cada día, los grupos reciben vehículo (DMSO al 50% (JT Baker, Phillipsburg, NJ)/1x solución salina con fosfato de Dulbecco (GibcoBRL, Grand Island, NY)) o compuesto de prueba (10 mg/kg, administrado por vía subcutánea). Toda las ratas comienzan del tratamiento en el día 1. Los datos correspondientes a un compuesto representativo de la invención se muestran en la Tabla (7).

Procedimiento de prueba de tratamiento: Se inyectan a treinta ratas, por vía intradérmica, 0,1 ml de adyuvante completo de Freund en la base de la cola. Los animales se asignan de forma aleatoria a cuatro grupos, conteniendo cada grupo seis ratas. Cada día, los grupos reciben vehículo (50% DMSO (JT Baker, Phillipsburg, NJ)/1x solución salina con fosfato de Dulbecco (GibcoBRL, Grand Island, NY)) o compuesto de prueba (10 mg/kg administrado por vía subcutánea). Toda las ratas comienzan el tratamiento el día 8 tras la inyección de adyuvante. Los datos correspondientes a un compuesto representativo de la invención se muestran en las Tablas (8), (9) y (10).

El análisis estadístico se realizó utilizando Abacus Concepts Super ANOVA (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA). Todos los parámetros de interés se sometieron a análisis de la varianza, aplicándose a posteriori la prueba de comparaciones múltiples entre grupos de Duncan. Los datos se expresan siempre como media \pm desviación típica (DT), y las diferencias se consideran significativas si p < 0,05.

La gravedad de la artritis se controla a diario y se puntúa con arreglo a los siguientes índices patológicos: eritema de la zarpa trasera, hinchazón de la zarpa trasera, dolor al palpar las articulaciones, y movimientos y postura. Se utiliza una escala en números enteros de 0 a 3 para cuantificar el nivel de eritema (0= zarpa normal, 1= eritema leve, 2= eritema moderado, 3= eritema intenso) y la hinchazón (0= zarpa normal, 1= hinchazón leve, 2= hinchazón moderada, 3= hinchazón intensa de la zarpa trasera). La máxima puntuación por día es 12.

Al final del estudio se sacrifican las ratas con CO_{2}, se separan las patas traseras durante la necropsia y se fijan con formol tamponado al 10%, y las articulaciones del tarso se descalcifican y se incluyen en parafina. Los cortes histológicos se tiñen con hematoxilina y eosina, o con tinción de safranina O-verde rápido.

Los portaobjetos se codifican de modo que el técnico no pueda conocer los grupos de tratamiento. Se evalúa el tejido sinovial de las articulaciones del tarso teniendo en cuenta la hiperplasia sinovial, la infiltración de células inflamatorias y la formación de paño sinovial [Poole y Coombs, International Archives of Allergy & Applied Immunology 54: 97-113 (1977)] como se indica a continuación.

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Además, el cartílago articular y el hueso se evalúan utilizando el sistema de clasificación histológica de Mankin [Mankin, et al., Journal of Bone & Joint Surgery-American Volume 53: 523-37 (1971)] como se muestra a continuación.

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Evaluación en el modelo de artritis en ratas HLA-B27. Se evaluaron compuestos representativos de la invención en un procedimiento estándar de análisis farmacológico en ratas HLA-B27 que simula la artritis en los seres humanos. A continuación se describe brevemente el procedimiento utilizado y los resultados obtenidos. Se obtuvieron ratas HLA-B27 machos (de 8-10 semanas de edad) de Taconic, y se les permitió acceso ilimitado a alimentos (PMI LabDiet 5001) y agua. Se administró a las ratas una vez al día una dosis de vehículo (Tween-80 al 2%/metilcelulosa al 0,5%) o compuesto de prueba (10 mg/kg) durante 26 días. Se evaluaron las puntuaciones de la articulación y los resultados histológicos como se ha descrito anteriormente para el modelo de artritis inducida por adyuvantes en ratas de Lewis. En la Tabla (11) se muestran los resultados correspondientes a un compuesto representativo de la invención.

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Evaluación en modelos de carcinogénesis in vivo

La capacidad de los compuestos de la presente invención para tratar e inhibir varias neoplasias malignas o trastornos de hiperproliferación puede evaluarse mediante procedimientos estándar de análisis farmacológico que pueden consultarse en la literatura y que incluyen los dos procedimientos siguientes.

Cáncer de mama. Se obtienen ratones atímicos nu/nu (desnudos) ovariectomizados de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Un día antes de la inyección de células tumorales, los animales reciben implantes de miniesferas de liberación controlada que contenían 0,36-1,7 mg de 17\beta-estradiol (liberación durante 60 ó 90 días, Innovative Research of America, Sarasota, FL) o un placebo. La miniesfera se introduce por vía subcutánea en la región intraescapular utilizando un trocar de precisión de calibre 10. A continuación, los ratones reciben inyecciones subcutáneas en el tejido mamario de 1x10^{7} células MCF-7 o 1x10^{7} células BG-1. Las células se mezclan con un volumen igual de Matrigel, una preparación de matriz de membranas basales para fomentar el arraigo del tumor. Los compuestos de prueba pueden evaluarse administrando dosis un día después de la implantación de células tumorales (régimen de inhibición) o después de que los tumores hayan alcanzado un cierto tamaño (régimen de tratamiento). Los compuestos se administran cada día por vía intraperitoneal u oral en un vehículo compuesto por Tween-80 al 1% en solución salina. El tamaño de los tumores se evalúa cada tres o siete días.

Cáncer de colon. La capacidad de tratar o inhibir el cáncer de colon puede evaluarse con el procedimiento de prueba de Smirnoff [Oncology Research 11: 255-64 (1999)].

Evaluación de la neuroprotección en dos procedimientos de prueba in vivo

Isquemia global transitoria en el jerbo de Mongolia. Los efectos de los compuestos de prueba en la prevención o el tratamiento de las lesiones cerebrales provocadas por hipoxia/reperfusión puede medirse utilizando el siguiente procedimiento de prueba.

Se mantienen jerbos de Mongolia hembras (60-80 g; Charles River Laboratories, Kingston, NY) en el animalario de Wyeth-Ayerst (certificado por el AAALAC) en un régimen de 12 horas de luz, 12 horas de oscuridad y acceso libre a agua corriente y dieta de caseína baja en estrógenos (Purina; Richmond, IN). Tras la aclimatación (3-5 días), los jerbos se anestesian con isoflurano (mezcla al 2-3% con O_{2}) y se someten a ovariectomía (día 0). A partir de la mañana siguiente (día 1), los jerbos se tratan por vía subcutánea cada día con vehículo (ETOH al 10%/aceite de maíz), 17\beta-estradiol (1 mg/kg, sc) o un compuesto experimental. En el día 6, los jerbos (n=4-5/grupo) se anestesian con isoflurano, y las arterias carótidas comunes se sacan a la luz mediante una incisión en la vía media del cuello y ambas arterias se ocluyen simultáneamente durante 5 minutos con grapas no traumáticas para microaneurismas. Tras la oclusión, se retiran las capas para permitir la reperfusión cerebral y se cierra la incisión del cuello con grapas quirúrgicas. Todos los animales se someten a ayuno durante toda la noche antes de la intervención quirúrgica para provocar isquemia global, facilitándose así una lesión isquémica uniforme. En el día 12, los jerbos se exponen a una dosis letal de CO_{2}, y los cerebros se congelan en hielo seco y se conservan a -80ºC. Los protocolos para la manipulación de animales utilizados en estos estudios han sido revisados y autorizados por el comité de cuidado y manejo de animales de Radnor/Collegeville (RACUC/CACUC) en el centro de investigación de Wyeth-
Ayerst.

El grado de neuroprotección se evalúa mediante análisis de hibridación in situ del ARNm de la neurogranina. Brevemente, se preparan criosecciones de la corona de 20 \mum en portaobjetos recubiertos de gelatina, se secan y se conservan a -80ºC. En el momento de su preparación, las cajas con portaobjetos desecados se calientan hasta la temperatura ambiente, y los portaobjetos se fijan después en paraformaldehído al 4%, se tratan con anhídrido acético y después se deslipidizan y deshidratan con cloroformo y etanol. Los cortes preparados montados en portaobjetos se hibridan después con 200 \mul (6x10^{6} DPM/portaobjetos) de una ribosonda antisentido o con sentido (testigo) para la neurogranina (NG-241 marcada con ^{35}S-UTP; bases 99-340) en una mezcla de hibridación de formamida al 50%, y se incuban durante toda la noche a 55ºC en una cámara de portaobjetos húmeda sin cubreobjetos. En la siguiente mañana, se recogen los portaobjetos en gradillas, se sumergen en SSC 2x (NaCl 0,3 M, citrato de sodio 0,03 M; pH 7,0)/DTT 10 mM, se tratan con RNasa A (20 \mug/ml) y se lavan (2 x 30 min) a 67ºC en SSC 0,1x para eliminar el marcado no específico. Tras la deshidratación, los portaobjetos se cubren con una placa radiográfica BioMax (BMR-1; Kodak) durante toda la noche.

El nivel de la señal de hibridación de neurogranina se utiliza para hacer una valoración cuantitativa del grado de pérdida neuronal en la región CA1 tras la lesión, y para evaluar la eficacia del 17\beta-estradiol y de los compuestos experimentales. Se selecciona el ARNm de la neurogranina para estos estudios debido a que su nivel de expresión es elevado en las neuronas del hipocampo, incluida la región CA1, pero está ausente de las células gliales y de otros tipos celulares presentes en esta región cerebral. Por consiguiente, la medida observada de la cantidad de ARNm de neurogranina representa neuronas supervivientes. Las mediciones de densidad óptica relativa de la señal de hibridación de neurogranina se obtuvieron a partir de los autorradiogramas con un sistema de análisis de imágenes por ordenador (C-Imaging Inc., Pittsburgh, PA). Los resultados de 6 cortes (distantes 40 \mum) por animal se promedian y se evalúan sus características estadísticas. Los valores numéricos se notificaron como media + ETM. Se utiliza el análisis de la varianza unidireccional para verificar las diferencias en el nivel de ARNm de la neurogranina, y toda las aseveraciones que indican falta de diferencias en los resultados implican que p > 0,05.

Oclusión de la arteria cerebral media en ratones. La neuroprotección puede evaluarse siguiendo los procedimientos de prueba descritos por Dubal [véase, Dubal, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98: 1952-1957 (2001), Dubal, et al., Journal of Neuroscience 19: 6385-6393 (1999)].

Procedimiento estándar de análisis farmacológico de inhibición de la ovulación

Este procedimiento de análisis se utiliza para determinar si los compuestos de prueba son capaces de inhibir o cambiar el desarrollo cronológico de la ovulación. También puede utilizarse para determinar el número de oocitos ovulados [Lundeen, et al., J Steroid Biochem Mol Biol 78: 137-143 (2001)].

Sobre la base de los resultados obtenidos en los procedimientos estándar de análisis farmacológico, los compuestos de la presente invención son moduladores del receptor de estrógenos útiles para el tratamiento o la inhibición de afecciones, trastornos o enfermedades mediadas, al menos en parte, por una insuficiencia o un exceso de estrógenos, o que pueden tratarse o inhibirse utilizando un agente estrogénico. Los compuestos de la presente invención son particularmente útiles para el tratamiento de una paciente cercana a la menopausia, menopáusica o posmenopáusica, en la que los niveles de estrógenos endógenos producidos están considerablemente disminuidos. La menopausia se define generalmente como el último período menstrual natural y se caracteriza por el cese de la función ovárica, que da lugar a una disminución sustancial de los niveles de estrógenos circulantes en el torrente sanguíneo. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la menopausia incluye asimismo trastornos que cursan con disminución de la producción de estrógenos, que pueden ser de origen quirúrgico, químico, o estar causados por un trastorno patológico que da lugar al cese o a la disminución prematura de la función ovárica.

Los compuestos de la presente invención también son útiles para inhibir o tratar otros efectos de la insuficiencia de estrógenos, incluidos sofocos, atrofia vaginal o vulvar, vaginitis atrófica, sequedad vaginal, prurito, dispareunia, disuria, aumento en la frecuencia de micción, incontinencia urinaria, infecciones de las vías urinarias. Otras utilizaciones en el aparato reproductor incluyen el tratamiento o la inhibición de la metrorragia funcional. Los compuestos también son útiles para el tratamiento o la inhibición de la endometriosis.

Los compuestos de la presente invención también actúan en el cerebro, y son, por tanto, útiles para inhibir o tratar la enfermedad de Alzheimer, empeoramiento de la capacidad cognitiva, disminución de la libido, demencia senil, trastornos neurodegenerativos, depresión, ansiedad, insomnio, esquizofrenia e infertilidad. Los compuestos de la presente invención también son útiles para el tratamiento o la inhibición de la hiperplasia anómala benigna o maligna, incluidas glomeruloesclerosis, hipertrofia prostática, leiomiomas uterinos, cáncer de mama, escleroderma, fibromatosis, cáncer de endometrio, síndrome de ovario poliquístico, pólipos del endometrio, enfermedad benigna de la mama, adenomiosis, cáncer de ovarios, melanoma, cáncer de próstata, cánceres del colon y cánceres del SNC tales como glioma o astroblastoma.

Los compuestos de la presente invención son cardioprotectores y antioxidantes, y son útiles para disminuir los niveles de colesterol, triglicéridos, Lp(a) y LDL; para inhibir o tratar la hipercolesteremia, hiperlipidemia, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, insuficiencia venosa periférica, reestenosis y vasoespasmo, y para inhibir las lesiones en las paredes vasculares derivadas de acontecimientos celulares que dan lugar a trastornos vasculares de origen inmunitario.

Los compuestos de la presente invención también son útiles para el tratamiento de trastornos asociados con inflamación o enfermedades autoinmunitarias, incluidas la enfermedad inflamatoria intestinal (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis indeterminada), artritis (artritis reumatoide, espondiloartropatías, artrosis), pleuresía, trastorno por isquemia/reperfusión (por ejemplo ictus, rechazo de trasplantes, infarto de miocardio, etc.), asma, arteritis de células gigantes, prostatitis-cistitis intersticial, uveítis, psoriasis, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico y septicemia.

Los compuestos de la presente invención también son útiles para el tratamiento o la inhibición de trastornos oculares, incluidos cataratas, uveítis y degeneración macular, así como el tratamiento de afecciones de la piel tales como envejecimiento, alopecia y acné.

Los compuestos de la presente invención también son útiles para el tratamiento o la inhibición de trastornos metabólicos tales como la diabetes de tipo II, trastornos del metabolismo lipídico y trastornos del apetito (por ejemplo anorexia nerviosa y bulimia).

Los compuestos de la presente invención también son útiles para el tratamiento o la inhibición de trastornos hemorrágicos, tales como telangiectasia hemorrágica hereditaria, metrorragia funcional, y para combatir el choque hemorrágico.

Los compuestos de la presente invención son útiles en trastornos patológicos en los que es ventajosa la amenorrea, tales como leucemia, ablaciones del endometrio, enfermedad crónica renal o hepática, o enfermedades o trastornos de la coagulación.

Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse como agentes anticonceptivos, particularmente cuando se combinan con un progestágeno.

Cuando se administran para el tratamiento o la inhibición de un trastorno o enfermedad particular, deberá entenderse que la dosis eficaz variará en función del compuesto particular utilizado, la forma de administración, el trastorno en cuestión y su gravedad, o el trastorno tratado, así como de varios factores físicos relacionados con el individuo tratado. La administración eficaz de los compuestos de la presente invención puede realizarse con una dosis por vía oral de aproximadamente 0,1 mg/día hasta aproximadamente 1,000 mg/día. Preferiblemente, la administración será de aproximadamente 10 mg/día hasta aproximadamente 600 mg/día, más preferiblemente de aproximadamente 50 mg/día hasta aproximadamente 600 mg/día, en una dosis única o en dos o más dosis divididas. Se espera que las dosis diarias previstas varíen con la ruta de administración.

Dichas dosis pueden administrarse de cualquier forma útil para suministrar los compuestos activos de la presente memoria al torrente sanguíneo del paciente, incluidas la vía oral, por medio de implantes, parenteral (incluidas las inyecciones intravenosas, intraperitoneales, intraarticulares y subcutáneas), rectal, intranasal, tópica, ocular (mediante colirios), vaginal y transdérmica.

Las formulaciones orales que contienen los compuestos activos de la presente invención pueden comprender cualquiera de las formas orales utilizadas habitualmente, entre ellas comprimidos, cápsulas, formas para administración bucofaríngea, tabletas, pastillas para chupar y líquidos, suspensiones o disoluciones orales. Las cápsulas pueden contener mezclas del compuesto o compuestos activos con rellenos inertes y/o diluyentes tales como almidones farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, almidón de maíz, de patata o de tapioca), azúcares, edulcorantes artificiales, celulosas en polvo, tales como celulosas cristalinas y microcristalinas, harinas, gelatinas, gomas, etc. Pueden prepararse formulaciones útiles para comprimidos por métodos convencionales de compresión, granulación por vía húmeda y granulación por vía seca, utilizando diluyentes, aglutinantes, lubricantes, disgregantes, agentes modificadores de la actividad superficial (incluidos los tensioactivos) dispersantes o estabilizantes, farmacéuticamente aceptables, que incluyen, sin limitarse a los mismos, estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, lauril sulfato de sodio, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa calcio, polivinilpirrolidona, gelatina, ácido algínico, goma arábiga, goma xantana, citrato de sodio, silicatos complejos, carbonato de calcio, glicina, dextrina, sacarosa, sorbitol, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, lactosa, caolín, manitol, cloruro de sodio, talco, almidones secos y azúcar en polvo. Los agentes preferidos modificadores de la actividad superficial incluyen agentes modificadores de la actividad superficial no iónicos e iónicos. Ejemplos representativos de agentes modificadores de la actividad superficial incluyen, sin limitarse a los mismos, polaxamer 188, cloruro de benzalconio, estearato de calcio, alcohol cetoestearílico, cera emulsionante de cetomacrogol, ésteres de sorbitán, dióxido de silicio coloidal, fosfatos, dodecilsulfato de sodio, silicato de magnesio y aluminio, y trietanolamina. Las formulaciones orales descritas en la presente memoria pueden utilizar formulaciones estándar de retardo o de liberación controlada para alterar la absorción del compuesto o compuestos activos. La formulación oral también puede consistir en la administración del principio activo en agua o el zumo de frutas, que contiene solubilizantes o emulsionantes apropiados, según convenga.

En algunos casos puede ser deseable administrar los compuestos directamente en las vías respiratorias en forma de aerosol.

Los compuestos de la presente invención también pueden administrarse por vía parenteral o intraperitoneal. Las soluciones o suspensiones de estos compuestos activos en forma de base libre o de sal farmacológicamente aceptable pueden prepararse en agua mezclada de forma adecuada con un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y utilización, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir la proliferación de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para su uso en inyecciones incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser líquida, para que pueda administrarse fácilmente con jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe protegerse de la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El excipiente puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales.

Para los efectos de la presente descripción, se entiende que las administraciones transdérmicas incluyen todas las administraciones a través de la superficie corporal y los revestimientos interiores de los conductos corporales, incluidos los tejidos epiteliales y las mucosas. Dichas administraciones pueden llevarse a cabo utilizando los presentes compuestos, o las sales de los mismos farmacéuticamente aceptables, en lociones, cremas, espumas, parches, suspensiones, disoluciones y supositorios (por vía rectal y vaginal).

La administración por vía transdérmica puede realizarse por medio de un parche transdérmico que contiene el compuesto activo y un excipiente que es inerte para el compuesto activo, no es tóxico para la piel y permite el suministro del agente por absorción sistémica en el torrente sanguíneo a través de la piel. El excipiente puede adoptar diversas formas tales como cremas y ungüentos, pastas, geles y dispositivos oclusivos. Las cremas y ungüentos pueden ser emulsiones líquidas viscosas o semisólidas del tipo aceite en agua o agua en aceite. También pueden ser adecuadas las pastas que comprenden polvos absorbentes dispersos en petróleo o petróleo hidrófilo, que contienen el principio activo. Pueden usarse diversos dispositivos oclusivos para liberar el principio activo en el torrente sanguíneo, tales como una membrana semipermeable que cubra un reservorio que contiene el principio activo, con o sin excipiente, o una matriz que contiene el principio activo. Otros dispositivos oclusivos se conocen por la literatura.

Las formulaciones de supositorios pueden prepararse con materiales tradicionales, entre ellos manteca de cacao, con o sin adición de ceras para alterar el punto de fusión del supositorio, y glicerina. También pueden utilizarse las bases hidrosolubles de supositorios, tales como polietilenglicoles de varios pesos moleculares.

La preparación de ejemplos representativos de la presente invención se describe a continuación.

Intermediario 2

6-metoxi-1-naftol

Una mezcla de 6-metoxi-1-tetralona (20,84 g, 118,3 mmol), Pd al 10%/C (10,1 g), y p-cimeno (500 ml) se calentó en condiciones de reflujo durante 60 horas. La suspensión se enfrió hasta la temperatura ambiente y se filtró a través de Celite. El sólido se lavó con acetato de etilo hasta que resultó transparente a la luz ultravioleta, y la solución orgánica combinada se extrajo con hidróxido de sodio 1 N (3x 200 ml). Las capas acuosas combinadas se acidificaron con HCl 6 N y se extrajeron con acetato de etilo (3 x 300 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato de magnesio y se filtraron. La evaporación del disolvente y la purificación en una columna de sílice (acetato de etilo al 25%-hexanos) dio lugar a 17,02 g (83%) del compuesto del título en forma de sólido de color marrón claro. Una muestra analítica se preparó por purificación en una segunda columna de sílice (diclorometano al 40-60%-hexanos), para dar lugar a un sólido blanco: p.f. 73-75ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 3,85 (3H, s), 6,70-6,74 (1H, m), 7,06 (1H, dd, J= 2,34 Hz, J= 9,15 Hz), 7,20-7,27 (3H, m), 8,02 (1H, d, J=9,12Hz), 10,01 (1H, s); EM (ESI) m/z 174 (M-H)^{-}.

Análisis de C_{11}H_{10}O_{2}:

Calculado: C: 75,84 H: 5,79

Encontrado: C: 75,56 H: 5,39.

Intermediario 5

1-[(2-bromo-5-metoxibencil)oxi]-6-metoxinaftaleno

A una solución de 6-metoxinaftol (12,9 g, 74,1 mmol), alcohol 5-metoxi-2-bromo-bencílico (17,7 g, 81,6 mmol) y trifenilfosfina (31,1 g, 119 mmol) en THF (400 ml) se le añadió lentamente una solución de DEAD (20,6 g, 119 mmol) en THF (50 ml). La solución se agitó durante toda la noche, se concentró en sílice y se purificó en una columna de sílice (acetato de etilo al 10% - hexanos), para dar lugar a 16,38 g (59%) del compuesto del título en forma de sólido blanco: p.f. 83-84ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 3,78 (3H, s), 3,92 (3H, s), 5,25 (2H, s), 6,75-6,77 (2H, m), 7,12 (1H, d, J= 2,44 Hz), 7,15 (1H, dd, J= 2,44 Hz, J= 9,28 Hz), 7,24 (1H, d, J= 2,93 Hz), 7,32-7,36 (2H, m), 7,48 (1H, d, J= 8,79 Hz), 8,27 (1H, d, J= 9,23 Hz); EM (ESI) m/z 373/375 ([M+H]+);

Análisis de C_{19}H_{17}BrO_{3}:

Calculado: C: 61,14 H: 4,59

Encontrado: C: 60,97 H: 4,49.

Intermediario 6

1-[(2-bromo-5-metoxibencil)oxi]naftaleno

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 1-naftol (5,7 g, 39,6 mmol) con alcohol 5-metoxi-2-bromobencílico, como se describe para el intermediario 5, para dar lugar a 5,94 g (44%) de un sólido blanco: p.f. 74-75ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 3,78 (3H, s), 5,28 (2H, s), 6,77 (1H, dd, J= 2,93 Hz, J= 8,79 Hz), 6,88 (1H, d, J= 7,69 Hz), 7,27 (1H, d, J= 3,30 Hz), 7,36-7,39 (1H, m), 7,47-7,53 (4H, m), 7,81-7,83 (1H, m), 8,37-8,39 (1H, m); EM (ESI) m/z 343/345 ([M+H]+);

Análisis de C_{18}H_{15}BrO_{2}:

Calculado: C: 62,99 H: 4,41

Encontrado: C: 63,19 H: 4,30.

Intermediario 8

4-bromo-2-fluoro-5-metilfenol

A una solución de 2-fluoro-5-metilfenol (20,27 g, 160,7 mmol) en acetonitrilo (500 ml) a 0ºC se le añadió NBS (30,0 g, 168,7 mmol). La mezcla se agitó durante 1 hora a 0ºC. Se eliminó el disolvente de la solución resultante y se filtró a través una columna corta de sílice con diclorometano, para dar lugar a 29,6 g (90%) de un sólido oleaginoso de color naranja. Una muestra analítica se preparó por purificación en columna de sílice (acetato de etilo al 5% - hexanos), para dar lugar al compuesto del título en forma de sólido blanco: p.f. 44-46ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 2,22 (3H, s), 6,93 (1H, d, J= 9,28 Hz), 7,40 (1H, d, J= 10,74 Hz), 10,05 (1H, s); EM (ESI) m/z 203/205 ([M-H]-);

Análisis de C_{7}H_{6}BrFO:

Calculado: C: 41,01 H: 2,95

Encontrado: C: 40,69 H: 2,80.

Intermediario 9

1-bromo-5-fluoro-4-metoxi-2-metilbenceno

A una mezcla de 4-bromo-2-fluoro-5-metilfenol (29,6 g, 144,2 mmol) y carbonato de potasio (30,0 g, 218 mmol) en acetona (500 ml) se le añadió yodometano (69,0 g, 486 mmol). La suspensión resultante se agitó en condiciones de reflujo durante 4 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente, se vertió en HCl (250 ml de una solución 1 N) y se extrajo con acetato de etilo (3x250 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución de bicarbonato de sodio, se secaron con sulfato de sodio y se filtraron. La evaporación del disolvente y la purificación en una columna de sílice (acetato de etilo al 5% - hexanos) dio lugar a 29,50 g (93%) del compuesto del título en forma de aceite transparente incoloro: ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 2,33 (3H, s), 3,85 (3H, s), 6,82 (1H, d, J= 8,79 Hz), 7,23 (1H, d, J= 10,25 Hz); EM m/z;

Análisis de C_{8}H_{8}BrFO \cdot 0,3 H_{2}O:

Calculado: C: 42,81 H: 3,86

Encontrado: C: 42,38 H: 3,44.

Intermediario 11

1-[(2-bromo-4-fluoro-5-metoxibencil)oxi]-6-metoxinaftaleno

Una mezcla de 1-bromo-5-fluoro-4-metoxi-2-metilbenceno (29,50 g, 134,7 mmol), NBS (25,18 g, 141,4 mmol) y peróxido de benzoílo (8,14 g, 33,7 mmol) en tetracloruro de carbono (500 ml) se agitó en condiciones de reflujo durante 1 hora. La reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente y se filtró a través de sílice con diclorometano. La evaporación del disolvente dio lugar al intermediario de bromuro de bencilo. Este sólido de color amarillo claro se combinó con 6-metoxi-1-naftol (23,4 g, 134,7 mmol) y carbonato de potasio (37,2 g, 269 mmol) en acetona (500 ml) y se agitó en condiciones de reflujo durante 12 horas. La mezcla de reacción enfriada se filtró a través de sílice con acetona, el disolvente se eliminó, y se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (acetato de etilo al 10%-30% - hexanos), seguido por trituración con acetato de etilo, para dar lugar a 20,3 g (39%) del compuesto del título en forma de sólido blanco: p.f. 138-142ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 3,85 (3H, s), 3,92 (3H, s), 5,22 (2H, s), 7,75 (1H, dd, J= 2,07 Hz, J= 6,50 Hz), 7,12 - 7,17 (2H, m), 7,25 - 7,38 (4H, m), 8,22 (1H, d, J= 8,80 Hz); EM (ESI) m/z 391/393 ([M+H]+);

Análisis de C_{19}H_{16}BrFO_{3}:

Calculado: C: 58,33 H: 4,12

Encontrado: C: 58,15 H: 3,98.

Intermediario 12

2,8-dimetoxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno

Método A

Una mezcla de 1-[(2-bromo-5-metoxibencil)oxi]-6-metoxinaftaleno (13,03 g, 34,93 mmol), acetato de sodio (10,3 g, 105 mmol) y diclorobis(trifenilfosfina)-paladio(II) (3,68 g, 5,25 mmol) en DMA (600 ml) se agitó durante 12 horas a 120ºC. La mezcla de reacción enfriada se vertió en 1500 ml agua. El producto sólido crudo se recogió por filtración y se purificó por cromatografía en gel de sílice (acetato de etilo al 5% - 10% - hexanos), para dar lugar a 5,76 g (56%) del compuesto del título en forma de sólido blanco: p.f. 175-178ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 3,85 (3H, s), 3,92 (3H, s), 5,25 (2H, s), 6,75 (1H, d, J= 2,20 Hz), 6,93 (1H, dd, J= 2,56 Hz, J= 8,42 Hz), 7,10 (1H, d, J= 2,56 Hz), 7,13 (1H, dd, J= 2,56 Hz, J= 9,15 Hz), 7,41 (1H, d, J= 8,79 Hz), 7,63 (1H, d, J= 8,42 Hz), 7,74 (1H, d, J= 8,79 Hz), 8,14 (1H, d, J= 9,15 Hz); EM (ESI) m/z 293 ([M+H]+);

Análisis de C_{19}H_{16}O_{3}:

Calculado: C: 78,06 H: 5,52

Encontrado: C: 78,01 H: 5,41.

Intermediario 13

8-metoxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 1-[(2-bromo-5-metoxibencil)-oxi]naftaleno (3,05 g, 8,89 mmol) siguiendo el método A, para dar lugar a 0,94 g (40%) de un sólido blanco: p.f. 128-130ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}):] \delta 3,82 (3H, s), 5,31 (2H, s), 6,96 - 7,02 (2H, m), 7,47-7,53 (2H, m), 7,60 (1H, d, J= 8,55 Hz), 7,82 (1H, d, J= 8,48 Hz), 7,86 - 7,91 (1H, m), 7,94 (1H, d, J= 8,65 Hz), 8,12-8,15 (1H, m); EM (ESI) m/z 263 ([M+H]+);

Análisis de C_{18}H_{14}O_{2}:

Calculado: C: 82,42 H: 5,38

Encontrado: C: 81,98 H: 5,07.

Intermediario 14

9-fluoro-2,8-dimetoxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 1-[(2-bromo-4-fluoro-5-metoxibencil)oxi]-6-metoxinaftaleno (10,3 g, 26,3 mmol) siguiendo el método A, para dar lugar a 4,51 g (55%) de un sólido blanco: p.f. 201-206ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 3,93 (3H, s), 3,94 (3H, s), 5,23 (2H, s), 6,84 (1H, d, J= 8,24 Hz), 7,11 - 7,13 (2H, m), 7,40 - 7,443 (2H,m), 7,64 (1H, d, J= 8,60 Hz), 8,11 - 8,13 (1H, m); EM (ESI) m/z 311 ([M+H]+);

Análisis de C_{19}H_{15}FO_{3}:

Calculado: C: 73,54 H: 4,87

Encontrado: C: 73,84 H: 4,60.

Ejemplo 1a 6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

Método D

A HCl de piridinio (11 g) a 190ºC se le añadió 2,8-dimetoxi-H-dibenzo[c,h]-cromeno (2,48 g, 8,49 mmol). La solución resultante se agitó a 190ºC durante 3 horas. La reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente y se recogió en agua (400 ml). El producto sólido se recogió por filtración y se purificó en una columna de sílice, para dar lugar a 2,09 g (93%) de un sólido de color amarillo claro. Este material se purificó adicionalmente por HPLC preparativa en fase inversa, para dar lugar al compuesto del título en forma de sólido blanco: p.f. 248-252ºC (d);

^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 5,19 (2H, s), 6,70 (1H, d, J= 2,44 Hz), 6,80 (1H, dd, J= 2,44 Hz, J= 8,30 Hz), 7,04 (1H, dd, J= 2,44 Hz, J= 8,79 Hz), 7,08 (1H, d, J= 2,44 Hz), 7,34 (1H, d, J= 8,79 Hz), 7,62 (1H, d, J= 8,30 Hz), 7,76 (1H, d, J= 8,79 Hz), 7,96 (1H, d, J= 9,28 Hz), 9,63 (1H, s), 9,78 (1H, s); EM (ESI) m/z 265 ([M+H]+); EM (ESI) m/z 263 ([M-H]-);

Análisis de C_{17}H_{12}O_{3} \cdot 0,1 H_{2}O:

Calculado: C: 76,74 H: 4,62

Encontrado: C: 76,57 H: 4,25.

Ejemplo 1b 9-fluoro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 9-fluoro-2,8-dimetoxi-H-dibenzo[c,h]cromeno (1,29 g, 4,16 mmol) con HCl de piridinio (30 g) siguiendo el método D, para dar lugar a 1,01 g (86%) de un sólido de color canela. Este material se purificó adicionalmente por HPLC preparativa en fase inversa, para dar lugar al compuesto del título en forma de sólido blanco: p.f. 230-231ºC (desc.); ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 5,19 (2H, s), 6,89 (1H, d, J= 8,73 Hz), 7,04-7,10 (2H, m), 7,35 (1H, d, J= 8,65 Hz), 7,64 (1H, d, J= 12,48 Hz), 7,77 (1H, d, J= 8,75 Hz), 7,97 (1H, d, J= 8,90 Hz), 9,89 (1H, bs), 10,01 (1H, bs); EM (ESI) m/z 283 ([M+H]+); EM (ESI) m/z 281 ([M-H]-);

Análisis de C_{17}H_{11}FO_{3} \cdot 0,75 H_{2}O:

Calculado: C: 69,03 H: 4,26

Encontrado: C: 69,34 H: 3,70.

Ejemplo 1c 6H-dibenzo[c,h]cromen-8-ol

Método D

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 8-metoxi-H-dibenzo[c,h]-cromeno (0,73 g, 2,79 mmol) con HCl de piridinio (10 g) siguiendo el método D, para dar lugar a 0,63 g (91%) de un sólido blanco: p.f. 192-194ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 5,25 (2H, s), 6,73 (1H, bs), 6,83 (1H, dd, J= 2,38 Hz, J= 8,40 Hz), 7,45 - 7,52 (2H, m), 7,58 (1H, d, J= 8,58 Hz), 7,70 (1H, d, J= 8,34 Hz), 7,84 - 7,93 (2H, m), 8,10 - 8,12 (1H, m), 9,73 (1H, s); EM (ESI) m/z 247 ([M-H]-);

Análisis de C_{17}H_{12}O_{2}:

Calculado: C: 82,24 H: 4,87

Encontrado: C: 81,85 H: 4,86.

Intermediario 15

12-bromo-2,8-dimetoxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno

Método B

A una mezcla de 2,8-dimetoxi-H-dibenzo[c,h]cromeno (1,97 g, 6,75 mmol) en acetonitrilo (70 ml) a ºC se le añadió NBS (1,44 g, 8,10 mmol). La mezcla se agitó a 0ºC durante 15 minutos, se vertió en 300 ml de agua y se extrajo con acetato de etilo (3 x 150 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua, se secaron con sulfato de sodio y se filtraron. La evaporación del disolvente y la purificación por cromatografía en gel de sílice dio lugar a un sólido blanco que se recristalizó en 50 ml de isopropanol, para dar lugar a 1,77 g (71%) del compuesto del título en forma de sólido cristalino blanco: p.f. 96-98ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 3,86 (3H, s), 3,98 (3H, s), 5,24 (2H, s), 6,74 (1H, d, J= 2,444 Hz), 6,93 (1H, dd, J= 2,68 Hz, J= 8,54 Hz), 7,15 (1H, dd, J= 2,44 Hz, J= 9,28 Hz), 7,43 (1H, d, J= 2,41 Hz), 7,59 (1H, d, J= 8,79 Hz), 8,04 (1H, s), 8,16 (1H, d, J= 9,28 Hz); EM m/z;

Análisis de C_{19}H_{15}BrO_{3}:

Calculado: C: 61,47 H: 4,07

Encontrado: C: 61,66 H: 3,89.

Intermediario 16

12-bromo-9-fluoro-2,8-dimetoxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 9-fluoro-2,8-dimetoxi-H-dibenzo[c,h]cromeno (1,47 g, 4,74 mmol) con NBS (1,01 g, 5,69 mmol) siguiendo el método B, para dar lugar a 1,14 g (62%) de un sólido de color canela: p.f. 139-143ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 3,98 (3H, s), 3,98 (3H, s), 5,22 (2H, s), 6,78 (1H, d, J= 8,24 Hz), 7,16 (1H, dd, J= 2,56 Hz, J= 9,15 Hz), 7,37 (1H, d, J= 12,08 Hz), 7,43 (1H, d, J= 2,56 Hz), 7,92 (1H, s), 8,14 (1H, dd, J= 0,37 Hz, J= 9,15 Hz); EM (ESI) m/z 387/389 ([M+H]+);

Análisis de C_{19}H_{14}BrFO_{3}:

Calculado: C: 58,63 H: 3,63

Encontrado: C: 58,82 H: 3,58.

Intermediario 17

2,8-dimetoxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno-12-carbonitrilo

Método C

Una mezcla de 12-bromo-2,8-dimetoxi-H-dibenzo[c,h]cromeno (8,33 g, 22,45 mmol), cianuro de cinc (3,15 g, 26,9 mmol) y tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (1,30 g, 1,12 mmol) en DMF (100 ml) se agitó a 120ºC durante toda la noche. La mezcla de reacción enfriada se vertió en solución de cloruro de amonio (600 ml de solución 1 N) y se extrajo con acetato de etilo (4 x 300 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución de cloruro de amonio, se filtraron a través de un tapón de sílice, el disolvente se eliminó, y se purificó en una columna de sílice (diclorometano al 40% - 60% - hexanos), para dar lugar a un sólido de color amarillo, que se trituró con acetato de etilo, para dar lugar a 5,43 g (76%) del compuesto del título en forma de sólido de color amarillo: p.f. 161-165ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 3,86 (3H, s), 3,98 (3H, s), 5,32 (2H, s), 6,73 (1H, d, J= 2,56 Hz), 6,96 (1H, dd, J= 2,56 Hz), J= 8,42 Hz), 7,19 (1H, dd, J= 2,56 Hz, J= 9,15 Hz), 7,37 (1H, d, J= 2,20 Hz), 7,60 (1H, d, J= 8,42 Hz), 8,16 (1H, s), 8,18 (1H, d, J= 9,52 Hz); EM (ESI) m/z 317 ([M+H]+);

Análisis de C_{20}H_{15}NO_{3}:

Calculado: C: 75,70 H: 4,76 N: 4,41

Encontrado: C: 75,53 H: 4,48 N: 4,32.

Intermediario 18

9-fluoro-2,8-dimetoxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno-12-carbonitrilo

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 9-fluoro-2,8-dimetoxi-H-dibenzo[c,h]cromeno (0,99 g, 2,55 mmol) con cianuro de cinc (0,45 g, 3,8 mmol) siguiendo el método C, para dar lugar a 0,55 g (64%) de un sólido blanco: p.f. > 220ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 3,92 (3H, s), 3,97 (3H, s), 5,29 (2H, s), 6,77 (1H, d, J= 8,05 Hz), 7,19 (1H, dd, J= 2,47 Hz, J= 9,24 Hz), 7,36 - 7,39 (2H, m), 8,04 (1H, s), 8,17 (1H, d, J= 9,15 Hz); EM m/z;

Análisis de C_{20}H_{14}FNO_{3} \cdot 0,1 H_{2}O:

Calculado: C: 71,25 H: 4,25 N: 4,16

Encontrado: C: 70,87 H: 3,91 N: 4,31.

Ejemplo 1d 2,8-dihidroxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno-12-carbonitrilo

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 2,8-dimetoxi-H-dibenzo[c,h]-cromeno-12-carbonitrilo (5,43 g, 17,1 mmol) con HCl de piridinio (50 g) siguiendo el Método D, para dar lugar a 3,43 g (69%) de un sólido de color amarillo: p.f. > 250ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 5,34 (2H, s), 6,71 (1H, d, J= 2,36 Hz), 6,82 (1H, dd, J= 2,48 Hz, J= 8,41 Hz), 7,19 (1H, dd, J= 2,32 Hz, J= 9,11 Hz), 7,30 (1H, d, J= 2,26 Hz), 7,78 (1H, d, J= 8,56 Hz), 8,11 (1H, d, J= 9,14 Hz), 8,50 (1H, s), 9,81 (1H, s), 10,46 (1H, bs); EM (ESI) m/z 288 ([M-H]-);

Análisis de C_{18}H_{11}NO_{3} \cdot 0,25 H_{2}O:

Calculado: C: 73,59 H: 3,95 N: 4,77

Encontrado: C: 73,69 H: 3,84 N: 4,53.

Ejemplo 1e 9-fluoro-2,8-dihidroxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno-12-carbonitrilo

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 9-fluoro-2,8-dimetoxi-H-dibenzo[c,h]cromeno-12-carbonitrilo (0,40 g, 1,19 mmol) con HCl de piridinio (15 g) siguiendo el método D, para dar lugar a 0,32 g (88%) de un sólido blanco: p.f. > 250ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 5,29 (2H, s), 6,86 (1H, d, J= 8,69 Hz), 7,16 (1H, dd, J= 2,32 Hz, J= 9,15 Hz), 7,28 (1H, d, J= 2,32 Hz), 7,80 (1H, d, J= 12,40 Hz), 8,08 (1H, d, J= 9,04 Hz), 8,49 (1H, s), 10,16 (1H, s), 10,4 (1H, s); EM (ESI) m/z 306 ([M-H]-);

Análisis de C_{18}H_{10}FNO_{3} \cdot 0,3 H_{2}O:

Calculado: C: 69,14 H: 3,42 N: 4,48

Encontrado: C: 68,91 H: 3,10 N: 4,30.

Ejemplo 1f 1-cloro-2,8-dihidroxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno-12-carbonitrilo

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 2,8-dihidroxi-H-dibenzo[c,h]-cromeno-12-carbonitrilo (0,20 g, 0,70 mmol) con NCS (0,11 g, 0,83 mmol) en THF (10 ml) a temperatura ambiente siguiendo el método B, para dar lugar a 0,10 g (45%) de un sólido de color amarillo: p.f. > 250ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 5,34 (2H, s), 6,72 (1H, d, J= 2,35 Hz), 6,83 (1H, dd, J= 2,43 Hz, J= 8,44 Hz), 7,37 (1H, d, J= 9,22 Hz), 7,84 (1, d, J= 8,57 Hz), 8,14 (1H, d, J= 9,20 Hz), 8,53 (1H, s), 9,87 (1H, bs), 1,12 (1H, bs); EM (ESI) m/z 322/324 ([M-H]-);

Análisis de C_{18}H_{10}ClNO_{3} 0,75 H_{2}O:

Calculado: C: 64,11 H: 3,44 N: 4,33

Encontrado: C: 64,45 H: 3,05 N: 4,03.

Ejemplo 1g 1-cloro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol (0,218 g, 0,83 mmol) con NCS (0,13 g, 0,99 mmol) en THF (10 ml) siguiendo el método B, para dar lugar a 0,17 g (67%) del compuesto del título junto con 0,025 g (10%) del isómero 12-cloro-H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol. Estos isómeros fueron separados por HPLC preparativa. P.f. 216-218ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 5,24 (2H, s), 6,72 (1H, d, J= 2,29 Hz), 6,82 (1H, dd, J= 2,40 Hz, J= 8,39 Hz), 7,25 (1H, d, J= 9,11 Hz), 7,67 (2H, d, J= 8,69 Hz), 7,94-7,99 (2H, m), 9,72 (1H, bs), 10,50 (1H, bs); EM (ESI) m/z 297/299 ([M-H]-);

Análisis de C_{17}H_{11}ClO_{3} \cdot 0,25 H_{2}O:

Calculado: C: 67,34 H: 3,82

Encontrado: C: 67,25 H: 3,89.

Intermediario 19

Acetato de 2-(acetiloxi)-6H-dibenzo[c,h]cromen-8-ilo

Método E

Una mezcla de H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol (1,82 g, 6,49 mmol), piridina (25 ml) y anhídrido acético (25 ml) se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente y se vertió en agua (300 ml). El producto sólido blanco se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó en vacío a 105ºC, para dar lugar a 2,11 g (88%) del compuesto del título en forma de sólido blanco: p.f. 172-173ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 2,31 (3H, s), 2,34 (3H, s), 5,36 (2H, s), 7,17 (1H, d, J= 2,44 Hz), 7,21 (1H, dd, J= 2,43 Hz, J= 8,29 Hz), 7,21 (1H, dd, J= 2,44 Hz, J= 9,28 Hz), 7,63 (1H, d, J= 8,30 Hz), 7,68 (1H, d, J= 2,44 Hz), 7,94 ( 1H, d, J= 8,30 Hz), 8,04 (1H, d, J= 8,79 Hz), 8,18 (1H, d, J= 9,28 Hz); EM (ESI) m/z 349 ([M+H]+);

Análisis de C_{21}H_{16}O_{5}:

Calculado: C: 72,41 H: 4,63

Encontrado: C: 72,20 H: 4,67.

Intermediario 20

Acetato de 2-(acetiloxi)-9-fluoro-6H-dibenzo[c,h]cromen-8-ilo

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 9-fluoro-H-dibenzo[c,h]-cromeno-2,8-diol (0,84 g, 2,98 mmol) con piridina (10 ml) y anhídrido acético (10 ml) siguiendo el método E, para dar lugar a 0,93 g (86%) de un sólido blanco: p.f. 206-212ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 2,30 (3H, s), 2,33 (3H, s), 5,30 (2H, s), 7,28 - 7,32 (2H, m), 7,59 (1H, d, J= 8,61 Hz), 7,64 (1H, d, J= 2,38 Hz), 7,92 (1H, d, J= 11,54 Hz), 8,01 (1H, d, J= 8,79 Hz), 8,15 (1H, d, J= 9,16 Hz); EM (ESI) m/z 367 ([M+H]+);

Análisis de C_{21}H_{15}FO_{5}:

Calculado: C: 68,85 H: 4,13

Encontrado: C: 68,41 H: 4,06.

Intermediario 21

Acetato de 2-(acetiloxi)-12-bromo-6H-dibenzo[c,h]cromen-8-ilo

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar acetato de 2-(acetiloxi)-H-dibenzo[c,h]-cromen-8-ilo (1,63 g, 4,68 mmol) con NBS (1,00 g, 5,62 mmol) en acetonitrilo (100 ml) a temperatura ambiente siguiendo el método B, para dar lugar a 2,00 g (rendimiento cuantitativo) de un sólido blanco: p.f. 192-194ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 2,33 (3H, s), 2,38 (3H, s), 5,28 (2H, s), 6,99 (1H, d, J= 2,20 Hz), 7,14 (1H, dd, J= 2,34 Hz, J= 8,42 Hz), 7,29 (1H, dd, J= 2,26 Hz, J= 9,11 Hz), 7,69 (1H, d, J= 8,47 Hz), 7,86 (1H, d, J= 2,17 Hz), 8,09 (1H, s), 8,28 (1H, d, J= 9,05 Hz); EM m/z;

Análisis de C_{21}H_{15}BrO_{5}:

Calculado: C: 59,04 H: 3,54

Encontrado: C: 58,95 H: 3,43.

Intermediario 22

Acetato de 2-(acetiloxi)-12-cloro-6H-dibenzo[c,h]cromen-8-ilo

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar acetato de 2-(acetiloxi)-H-dibenzo[c,h]-cromen-8-ilo (0,26 g, 0,75 mmol) con NCS (0,12 g, 0,90 mmol) en acetonitrilo (10 ml) en condiciones de reflujo durante 3 horas, siguiendo el método B, para dar lugar a 0,24 g (84%) de un sólido blanco: p.f. 183-184ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 2,33 (3H, s), 2,38 (3H, s), 5,28 (2H, s), 6,99 (1H, d, J= 2,27 Hz), 7,14 (1'H, dd, J= 2,34 Hz, J= 8,42 Hz), 7,30 (1H, dd, J= 2,27 Hz, J= 9,07 Hz), 7,68 (1H, d, J= 8,49 Hz), 7,88-7,89 (2H, m), 8,29 (1H, d, J= 9,06 Hz); EM m/z;

Análisis de C_{21}H_{15}ClO_{5} \cdot 0,1 H_{2}O:

Calculado: C: 65,58 H: 3,98

Encontrado: C: 65,37 H: 3,55.

Intermediario 23

Acetato de 2-(acetiloxi)-12-bromo-9-fluoro-6H-dibenzo[c,h]cromen-8-ilo

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar acetato de 2-(acetiloxi)-9-fluoro-H-dibenzo[c,h]cromen-8-ilo (0,47 g, 1,28 mmol) con NBS (0,27 g, 1,54 mmol) en acetonitrilo (25 ml) a temperatura ambiente, siguiendo el método B, para dar lugar a 0,57 g (rendimiento cuantitativo) de un sólido blanco. Se obtuvo una muestra analítica por trituración con acetato de etilo, para dar lugar al compuesto del título en forma de sólido blanco: p.f. 190-193ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 2,36 (3H, S), 2,37 (3H, s), 5,34 (2H, s), 7,34 (1H, d, J= 7,69 Hz), 7,46 (1H, dd, J= 2,23 Hz, J= 9,05 Hz), 7,81 (1H, d, J= 2,18 Hz), 8,09 (1H, d, J= 11,65 Hz), 8,28 (1H, d, J= 9,08 Hz), 8,47 (1H, s); EM (ESI) m/z 462/464 ([M+NH4]+);

Análisis de C_{21}H_{14}BrFO_{5}:

Calculado: C: 56,65 H: 3,17

Encontrado: C: 56,59 H: 3,16.

Intermediario 24

Acetato de 2-(acetiloxi)-12-cloro-9-fluoro-6H-dibenzo[c,h]cromen-8-ilo

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar acetato de 2-(acetiloxi)-9-fluoro-H-dibenzo[c,h]cromen-8-ilo (0,47 g, 0,1, 28 mmol) con NCS (0,21 g, 1,54 mmol) en acetonitrilo (15 ml) en condiciones de reflujo durante 4 horas siguiendo el método B, para dar lugar a 0,55 g (rendimiento cuantitativo) de un sólido de color amarillo. Se obtuvo una muestra analítica por trituración con acetato de etilo, para dar lugar al compuesto del título en forma de sólido blanco: p.f. 194-198ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 2,36 (3H, s), 2,37 (3H, s), 5,37 (2H, s), 7,34 (1H, d, J= 7,66 Hz), 7,48 (1H, dd, J= 2,16 Hz, J= 9,06 Hz), 7,85 (1H, d, J= 2,07 Hz), 8,08 (1H, d, J= 11,61 Hz), 8,28 (1H, d, J= 9,10 Hz), 8,32 (1H, s); EM (ESI) m/z 399/401 ([M-H]-);

Análisis de C_{21}H_{14}ClFO_{5}:

Calculado: C: 62,93 H: 3,52

Encontrado: C: 62,53 H: 3,53.

\newpage

Ejemplo 1h 12-bromo-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

Método F

Una solución de acetato de 2-(acetiloxi)-12-bromo-H-dibenzo[c,h]cromen-8-ilo (1,40 g, 3,28 mmol) en metóxido de sodio (40 ml de solución 1 N en metanol) se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La solución se vertió en 100 ml de HCl 1 N y se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución de bicarbonato de sodio y con salmuera, se secaron con sulfato de sodio y se filtraron. La evaporación del disolvente y la purificación por cromatografía en gel de sílice (acetato de etilo al 40% - hexanos) dio lugar a 0,91 g (81%) del compuesto del título en forma de sólido blanco: p.f. 178-180ºC (descompuesto), se decolora por encima de 160ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 5,23 (2H, s), 6,71 (1H, d, J= 2,32 Hz), 6,80 (1H, dd, J= 2,43 Hz, J= 8,39 Hz), 7,12 (1H, dd, J= 2,32 Hz, J= 9,03 Hz), 7,34 (1H, d, J= 2,28 Hz), 7,58 (1H, d, J= 8,53 Hz), 8,04 (1H, d, J= 9,07 Hz), 8,14 (1H, s), 9,73 (1H, bs), 10,20 (1H, bs); EM (ESI) m/z 341/343 ([M-H]-);

Análisis de C_{17}H_{11}BrO_{3}:

Calculado: C: 59,50 H: 3,23

Encontrado: C: 59,33 H: 3,26.

Ejemplo 1i 12-cloro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar acetato de 2-(acetiloxi)-12-cloro-H-dibenzo[c,h]cromen-8-ilo (0,18 g, 0,47 mmol) con solución de metóxido de sodio (75 ml de solución 1 N en metanol) siguiendo el método F, para dar lugar a 0,13 g (93%) de un sólido de color canela. Este material se purificó adicionalmente por HPLC preparativa en fase inversa, para dar lugar al compuesto del título en forma de sólido de color rosado claro: p.f. 212-216ºC (d); ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 5,23 (2H, s), 6,71 (1H, d, J= 2,33 Hz), 6,80 (1H, dd, J= 2,44 Hz, J= 8,39 Hz), 7,14 (1H, dd, J= 2,34 Hz, J= 9,09 Hz), 7,35 (1H, d, J= 2,31 Hz), 7,68 (1H, d, J= 8,54 Hz), 7,98 (1H, s), 8,05 (1H, d, J= 9,07 Hz), 9,74 (1H, bs), 10,19 (1H, bs); EM (ESI) m/z 299/301 ([M+H]+); EM (ESI) m/z 297/299 ([M-H]-);

Análisis de C_{17}H_{11}ClO_{3} \cdot 0,1 H_{2}O:

Calculado: C: 67,94 H: 3,76

Encontrado: C: 67,77 H: 3,67.

Ejemplo 1j 12-bromo-9-fluoro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar acetato de 2-(acetiloxi)-12-bromo-9-fluoro-H-dibenzo[c, h]cromen-8-ilo (0,48 g, 1,08 mmol) con solución de metóxido de sodio (40 ml de solución 1 N en metanol) siguiendo el método F. La purificación por HPLC preparativa en fase inversa dio lugar a 0,20 g (53%) del compuesto del título en forma de sólido blanco: p.f. 194-197ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 5,22 (2H, s), 6,89 (1H, d, J= 8,68 Hz), 7,13 (1H, dd, J= 2,31 Hz, J= 9,05 Hz), 7,35 (1H, d, J= 2,27 Hz), 7,75 (1h, D, J= 12,46 Hz), 8,04 (1H, d, J= 9,06 Hz), 8,19 (1H, s), 10,21 (2H, bs); EM (ESI) m/z 359/361 ([M-H]-);

Análisis de C_{17}H_{10}BrFO_{3} \cdot 0,75 H_{2}O:

Calculado: C: 54,50 H: 3,09

Encontrado: C: 54,85 H: 2,89.

Ejemplo 1k 12-cloro-9-fluoro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar acetato de 2-(acetiloxi)-12-cloro-9-fluoro-H-dibenzo[c, h]cromen-8-ilo (0,44 g, 1,10 mmol) con solución de metóxido de sodio (40 ml de solución 1 N en metanol) siguiendo el método F, para dar lugar a 0,30 g (86%) de un sólido de color canela. Este material se purificó adicionalmente por HPLC preparativa en fase inversa, para dar lugar al compuesto del título en forma de sólido blanco: p.f. 215-220ºC (desc.); ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 5,22 (2H, s), 6,89 (1H, d, J= 8,68 Hz), 7,15 (1H, dd, J= 2,22 Hz, J= 9,05 Hz), 7,35 (1H, d, J= 2,13 Hz), 7,74 (1H, d, J= 12,42 Hz), 8,03 - 8,06 (2H, m), 10,21 (2H, bs); EM (ESI) m/z 315/317 ([M-H]-);

Análisis de C_{17}H_{10}ClFO_{3} \cdot 0,25 H_{2}O:

Calculado: C: 63,57 H: 3,29

Encontrado: C: 63,22 H: 3,27.

Ejemplo 1l 12-metoxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

Una mezcla de acetato de 2-(acetiloxi)-12-metoxi-H-dibenzo[c,h]cromen-8-ilo (2,06 g, 6,00 mmol), CuBr (0,86 g, 6,00 mmol), metóxido de sodio (15 ml de solución al 25% en metanol) y DMF (30 ml) se calentó en condiciones de reflujo durante 3 horas. La reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente, se vertió en solución de HCl (200 ml de solución 2 N) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 250 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución de bicarbonato de sodio, se secaron con sulfato de sodio y se filtraron. La evaporación del disolvente y la purificación por cromatografía en columna (acetato de etilo al 40% - hexanos) dio lugar a 1,11 g (63%) del compuesto del título en forma de sólido de color canela: p.f. 224ºC (d); ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 3,98 (3H, s), 5,12 (2H, s), 6,70 (1H, d, J= 2,47 Hz), 6,81 (1H, dd, J= 2,47 Hz, J= 8,24 Hz), 7,05 (1H, dd, J= 2,47 Hz, J= 9,06 Hz), 7,18 (1H, s), 7,35 (1H, d, J= 2,47 Hz), 7,68 (1H, d, J= 8,51 Hz), 7,92 91H, d, J= 9,06 Hz), 9,63 (1H, s), 9,80 (1H, s); EM (ESI) m/z 293 ([M-H]-; EM (ESI) m/z 295 ([M+H]+);

Análisis de C_{18}H_{14}O_{4} \cdot 0,3 H_{2}O:

Calculado: C: 72,14 H: 4,90

Encontrado: C: 71,88 H: 4,74.

Intermediario 25

Acetato de 2-(acetiloxi)-12-metoxi-6H-dibenzo[c,h]cromen-8-ilo

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 12-metoxi-H-dibenzo[c,h]-cromeno-2,8-diol (1,11 g, 3,78 mmol) con piridina y anhídrido acético, siguiendo el método E, para dar lugar a 1,11 g (78%) de un sólido de color amarillo claro: p.f. 126-134ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 2,31 (3H, s), 2,33 (3H, s), 4,05 (3H, s), 5,28 (2H, s), 7,16 (1H, d, J= 2,32 Hz), 7,22 (1H, dd, J= 2,44 Hz, J= 8,34 Hz), 7,35 (1H, dd, J= 2,32 Hz, J= 9,04 Hz), 7,42 (1H, s), 7,80 (1H, m), 8,01 (1H, d, J= 8,58 Hz), 8,14 (1H, dd, J= 0,35 Hz, J= 9,04 Hz);

Análisis de C_{22}H_{18}O_{6} \cdot 0,25 H_{2}O:

Calculado: C: 69,01 H: 4,87

Encontrado: C: 69,08 H: 4,88.

Ejemplo 1m 11-cloro-12-metoxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar acetato de 2-(acetiloxi)-12-metoxi-H-dibenzo[c,h]cromen-8-ilo (0,41 g, 1,08 mmol) con NCS (0,17 g, 1,30 mmol) en acetonitrilo (10 ml) siguiendo el método B, seguido por desacilación según el método F, para dar lugar a 0,050 g (14%) de un sólido rosado: p.f. se decolora > 230ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 3,87 (3H, s), 5,06 (2H, s), 6,80 (1H, d, J= 2,35 Hz), 6,84 (1H, dd, J= 2,55 Hz, J= 8,63 Hz), 7,11 (1H, dd, J= 2,34 Hz, J= 9,06 Hz), 7,23 (1H, d, J= 2,30 Hz), 8,01 (1H, d, J= 9,05 Hz), 8,11 (1H, d, J= 8,60 Hz), 9,81 (1H, bs), 10,14 (1H, bs); EM (ESI) m/z 329/331 ([M+H]+); EM (ESI) m/z 327/329 ([M-H]-);

Análisis de C_{18}H_{13}ClO_{4} \cdot 0,25 H_{2}O:

Calculado: C: 64,87 H: 4,08

Encontrado: C: 64,90 H: 4,09.

Ejemplo 1n 12-metil-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

Una mezcla de 12-bromo-H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol (3,05 g, 8,89 mmol), tetrametil-estaño (2,39 g, 13,3 mmol) y diclorobis(tri-O-tolilfosfina)paladio(II) (0,70 g, 0,9 mmol) en DMF (100 ml) se agitó a 80ºC en atmósfera de nitrógeno durante 16 horas. La reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente, se vertió en agua (250 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3x 250 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución de cloruro de amonio (50 ml), se secaron con sulfato de sodio y se filtraron. La evaporación del disolvente y la purificación por cromatografía en columna (acetato de etilo al 40% - hexanos) dio lugar a 2,28 g (92%) de un sólido de color marrón claro. Una muestra se purificó adicionalmente por HPLC preparativa en fase inversa, para dar lugar al compuesto del título en forma de sólido blancuzco: p.f. 220-224ºC (d); ^{1}H RMN (acetona-d_{6}): \delta 2,56 (3H, s), 5,20 (2H, s), 6,78 (1H, d, J= 2,74 Hz), 6,89 (1H, dd, J= 2,74 Hz, J= 8,24 Hz), 7,12 (1H, dd, J= 2,47 Hz, J= 9,06 Hz), 7,25 (1H, d, J= 2,20 Hz), 7,64-7,66 (2H, m), 8,09 (1H, d, J= 8,79 Hz), 8,46 (1H, s), 8,60 (1H, s); EM (ESI) m/z 279 ([M+H]+); EM (ESI) m/z 277 ([M-H]-);

Análisis de C_{18}H_{14}O_{3} \cdot 0,30 H_{2}O:

Calculado: C: 76,20 H: 5,19

Encontrado: C: 75,90 H: 4,75.

Ejemplo 1o 12-vinil-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

A una mezcla de 12-bromo-H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol (0,63 g, 1,84 mmol) y diclorobis(tri-o-tolilfosfina)paladio(II) (0,07 g, 0,09 mmol) en dietoxietano (10 ml) se le añadió tributilvinil-estaño (0,87 g, 2,76 mmol). La mezcla se agitó durante 12 horas a 110ºC. La reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente, se vertió en solución de cloruro de amonio (100 ml de solución 1 N) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución de cloruro de amonio (100 ml), se secaron con sulfato de sodio y se filtraron. La evaporación del disolvente y la purificación por cromatografía en columna (acetato de etilo al 30% - hexanos) dio lugar a 0,40 g (75%) del compuesto del título en forma de sólido de color amarillo claro: p.f. > 220ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 5,20 (2H, s), 5,40 (1H, dd, J= 1,65 Hz, J= 10,99 Hz), 5,87 (1H, dd, J= 1,65 Hz, J= 17,58 Hz), 6,71 (1H, d, J= 2,75 Hz), 6,81 (1H, dd, J= 2,47 Hz, J= 8,51 Hz), 7,08 (1H, dd, J= 2,47 Hz, J= 9,06 Hz), 7,26 - 7,31 (2H, m), 7,72 (1H, d, J= 8,79 Hz), 7,94 (1H, s), 8,01 (1H, d, J= 9,34 Hz), 9,63 (1H, s), 9,85 (1H, s); EM (ESI) m/z 291 ([M+H]+); EM (ESI) m/z 289 ([M-H]-);

Análisis de C_{19}H_{14}O_{3} \cdot 0,25 H_{2}O:

Calculado: C: 77,41 H: 4,96

Encontrado: C: 77,34 H: 4,77.

Ejemplo 1p 12-etil-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

A una solución de 12-vinil-H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol (0,19 g, 0,66 mmol) en acetato de etilo (30 ml) se le añadió paladio en carbono (0,23 g). El matraz se acopló a un globo llenado con hidrógeno y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La reacción se filtró a través de Celite y se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (acetato de etilo al 40% - hexanos), para dar lugar a 0,11 g (58%) de un sólido de color marrón claro, que se purificó adicionalmente por HPLC preparativa en fase inversa, para dar lugar al compuesto del título en forma de sólido de color morado claro: p.f. 184-192ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 1,31 (3H, t, J= 7,48 Hz), 2,89 - 2,95 (2H, m), 5,16 (2H, s), 6,69 (1H, d, J= 2,55 Hz), 6,80 (1H, dd, J= 2,49 Hz, J= 8,40 Hz), 7,04 (1H, dd, J= 2,32 Hz, J= 9,04 Hz), 7,20 (1H, d, J= 2,21 Hz), 7,61 - 7,63 (2H, m), 8,00 (1H, d, J= 9,04 Hz), 9,58 (1H, s), 9,74 (1H, s); EM (ESI) m/z 291 ([M-H]-);

Análisis de C_{19}H_{16}O_{3} \cdot 0,10 H_{2}O:

Calculado: C: 77,59 H: 5,55

Encontrado: C: 77,37 H: 5,58.

Ejemplo 1q 12-tien-3-il-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

Método G

Una mezcla de 12-bromo-H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol (0,51 g, 1,49 mmol), ácido 3-tiofenoborónico (0,38 g, 3 mmol), tetrakis(trifenilfosfina) paladio (0,17 g, 0,15 mmol), solución de carbonato de sodio (1,5 ml de solución 2 N), agua (1 ml) y DME (5 ml) se agitó durante toda la noche a 85ºC. La reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente, se vertió en agua (100 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con sulfato de sodio y se filtraron. La evaporación del disolvente y la purificación en sílice (acetato de etilo al 40% - hexanos) dio lugar a 0,43 g (84%) de un sólido de color canela. Este material se purificó adicionalmente por HPLC preparativa en fase inversa, para dar lugar al compuesto del título en forma de sólido de color canela: p.f. 179-182ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 5,23 (2H, s), 6,72 (1H, d, J= 2,38 Hz), 6,78 (1H, dd, J= 2,38 Hz, J= 8,33 Hz), 7,06 (1H, dd, J= 2,38 Hz, J= 8,92 Hz), 7,21 (1H, d, J= 2,38 Hz), 7,63-7,67 (2H, m), 7,72 - 7,73 (2H, m), 8,05 (1H, d, J= 8,93 Hz), 9,63 (1H, s), 9,75 (1H, s); EM (ESI) m/z 345 ([M-H]-);

Análisis de C_{21}H_{14}O_{3}S \cdot 0,25 C_{2}H_{3}N \cdot 0,50 H_{2}O:

Calculado: C: 70,62 H: 4,34 N: 0,96

Encontrado: C: 70,34 H: 4,41 N: 1,39.

Intermediario 26

12-tien-2-il-2,8-dimetoxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno

Una mezcla de 12-bromo-2,8-dimetoxi-H-dibenzo[c,h]cromeno (0,53 g, 1,43 mmol), ácido 2-tiofenoborónico (0,2 g, 1,57 mmol), tetrakis(trifenilfosfina) paladio (0,08 g, 0,07 mmol), solución de carbonato de sodio (2 ml de solución 2 N), agua (1 ml) y DME (20 ml) se hizo reaccionar durante toda la noche a 85ºC, siguiendo el método G, para dar lugar a 0,48 g (90%) de un sólido de color canela: p.f. 110-112ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 3,80 (3H, s), 3,81 (3H, s), 5,33 (2H, s), 6,95-6,99 (2H, m), 7,22-7,27 (2H, m), 7,39-7,40 (1H, m), 7,48 (1H, d, J=2,44 Hz), 7,70 (1H, dd, J=0,98, 5,37 Hz), 7,76 (1H, d, J=8,3 Hz), 7,92 (1H, s), 8,16 (1H, d, J=9,28 Hz); EM (ESI) m/z 345
([M-H]-).

Análisis de C_{23}H_{18}O_{3}S:

Calculado: C: 73,77 H: 4,85

Encontrado: C: 74,43 H: 4,78.

Ejemplo 1r 12-tien-2-il-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar el intermediario 26 y HCl de piridinio (2,85 g) siguiendo el Método D, para dar lugar a 0,3 g (88%) de un sólido de color amarillo-verdoso claro: p.f. 191-193ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 5,25 (2H, s), 6,72 (1H, d, J=2,75 Hz), 6,80 (1H, dd, J=2,75, 8,24 Hz), 7,90 (1H, dd, J=2,20, 9,06 Hz), 7,24-7,29 (2H, m), 7,37 (1H, d, J=2,20 Hz), 7,65-7,68 (2H, m), 7,79 (1H, s), 8,07 (1H, d, J=8,79 Hz), 9,66 (1H, bs), 9,85 (1H, bs). Valor de HRMS calculado para C_{23}H_{18}O_{3}S+H (M+1): 375,10495; observado: 375,10497.

Análisis de C_{21}H_{14}O_{3}S \cdot 0,65 H_{2}O:

Calculado: C: 70,43 H: 4,30

Encontrado: C: 70,02 H: 3,85.

Ejemplo 1s 12-butil-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 12-bromo-H-dibenzo[c,h]-cromeno-2,8-diol (1,07 g, 3,12 mmol) con ácido butilborónico (0,46 g, 4,55 mmol) siguiendo el método G, para dar lugar a 0,12 g (12%) de un sólido de color amarillo claro, que se purificó adicionalmente por HPLC preparativa en fase inversa, para dar lugar a un sólido de color morado claro: p.f. 118-121ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 0,96 (3H, t, J= 7,30 Hz), 1,38 - 1,47 (2H, m), 1,62 - 1,69 (2H, m), 2,90 (2H, t, J= 7,59 Hz), 5,16 (2H, s), 6,69 (1H, d, J= 2,09 Hz), 6,80 (1H, dd, J= 2,38 Hz, J= 8,39 Hz), 7,04 (1H, dd, J= 2,20 Hz, J= 9,04 Hz), 7,20 (1H, d, J= 2,09 Hz), 7,60 - 7,62 (2H, m), 7,99 (1H, d, J= 9,04 Hz), 9,58 (1H, s), 9,73 (1H, s); EM (ESI) m/z 321 ([M+H]+); EM (ESI) m/z 319 ([M-H]-);

Análisis de C_{21}H_{20}O_{3} 0,10 H_{2}O:

Calculado: C: 78,29 H: 6,32

Encontrado: C: 78,13 H: 6,30.

\newpage

Intermediario 27

8-dimetoxi-12-propenil-6H-dibenzo[c,h]cromeno

Una mezcla de 12-bromo-2,8-dimetoxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno (1,4 g, 3,78 mmol) aliltributil-estaño (1,76 ml, 5,68 mmol) y diclorobis(trifenilfosfina) paladio (II) (133 mg, 0,19 mmol) en m-xileno (38 ml) se calentó a 130ºC con agitación durante 1 h. El análisis por TLC y CL-EM indicó que la reacción no se había completado. La mezcla se filtró a través de Celite y se añadió nuevamente catalizador de diclorobis(trifenilfosfina) paladio (II) (133 mg, 0,19 mmol) a la reacción, y la mezcla se calentó a 130ºC durante 2 h. El análisis por TLC y CL-EM indicó que la reacción aún no se había completado. Por tanto, se repitió la filtración y la adición de nuevo catalizador dos veces más. La mezcla se filtró a través de Celite, el disolvente se eliminó, y se purificó por cromatografía en gel de sílice (diclorometano al 20%-40% - hexano), para dar lugar a 0,84 g (67%) del compuesto del título en forma de sólido amarillento: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 2,02 (3H, dd, J= 6,57 Hz, J= 1,73 Hz), 3,86 (3H, s), 3,96 (3H, s), 5,24 (2H, s), 6,17-6,18 (1H, m), 6,75 (1H, d, J= 2,52 Hz), 6,94 (1H, dd, J= 8,57 Hz, J= 2,61 Hz), 7,01 (1H, J= 15,43 Hz, J =1,54 Hz), 7,14 (1H, dd, J= 9,14 Hz, J= 2,52 Hz), 7,31 (1H, d, J = 2,44 Hz), 7,69 (1H, d, J= 8,57 Hz), 7,81 (1H, s), 8,17 (1H, d, J= 9,16 Hz); EM (ESI) m/z 333 (M+H)^{+}.

Intermediario 28

2,8-dimetoxi-12-propil-6H-dibenzo[c,h]cromeno

Una mezcla de 2,8-dimetoxi-12-propenil-6H-dibenzo[c,h]cromeno (460 mg, 1,38 mmol) y paladio (92 mg, solución al 10% en carbón activado) en 36 ml de acetato de etilo se agitó en atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite y se concentró, para dar lugar a 430 mg (94%) del compuesto del título en forma de sólido de color marrón claro. Se obtuvo una muestra analítica mediante purificación adicional con HPLC preparativa en fase inversa: p.f. 88-90ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 1,01 (3H, t, J= 7,31 Hz), 1,68-1,80 (2H, m), 2,98 (2H, t, J= 7,29 Hz), 3,81 (3H, s), 3,91 (3H, s), 5,25 (2H, s), 6,93 (1H, d, J= 2,53 Hz), 6,98 (1H, dd, J= 8,46 Hz, J= 2,04 Hz), 7,17 (1H, dd, J= 9,20 Hz, J= 2,38 Hz), 7,28 (1H, d, J= 2,36 Hz), 7,72 (1H, s), 7,77 (1H, d, 8,57 Hz), 8,08 (1H, d, J= 9,14 Hz); EM (ESI) m/z 335 (M+H)^{+}.

Análisis de C_{22}H_{22}O_{3}:

Calculado: C: 79,02 H: 6,63

Encontrado: C: 78,48 H: 6,75.

Ejemplo 1t 12-propil-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol

A una mezcla de 2,8-dimetoxi-12-propil-6H-dibenzo[c,h]cromeno (220 mg, 0,658 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (33 ml) a 0ºC se le añadió lentamente tribromuro de boro (3,95 ml de solución 1 N en CH_{2}Cl_{2}, 3,95 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 3 h. Se inyectaron 4 ml de agua a la mezcla, agitando en un baño de hielo-agua. El CH_{2}Cl_{2} de la mezcla se eliminó a baja presión. La mezcla resultante se extrajo con acetato de etilo (x3). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con sulfato de sodio, se filtraron, y el disolvente se eliminó, para dar lugar a 120 mg (60%) del compuesto del título en forma de sólido blanco. Se obtuvo una muestra analítica por purificación con cromatografía en columna de gel de sílice (acetato de etilo al 20%-30% - hexano) y después recristalización con acetato de etilo - hexano: p.f. 86-95ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 1,00 (3H, t, J= 7,24 Hz), 1,63-1,76 (2H, m), 2,87 (2H, t, J= 7,22 Hz), 5,16 (2H, s), 6,69 (1H, d, J= 2,28 Hz), 6,79 (1H, dd, J= 8,39 Hz, J= 2,28 Hz), 7,03 (1H, dd, J= 9,02 Hz, J= 2,18 Hz), 7,20 (1H, d, J= 2,10 Hz), 7,60 (1H, s), 7,62 (1H, d, J= 7,85 Hz), 7,99 (1H, d, J= 9,01 Hz), 9,61 (1H, s), 7,76 (1H, s); EM (ESI) m/z 305 (M-H)^{-}, 307 (M+H)^{+}; HRMS: Calculado para C_{20}H_{18}O_{3}, 306,1256; encontrado (ESI), 305,11827.

Análisis de C_{20}H_{18}O_{3}:

Calculado: C: 78,41 H: 5,92

Encontrado: C: 72,79 H: 6,62.

Intermediario 30

5-metoxi-1-naftol

En un matraz de 2000 ml se sometió a reflujo una mezcla de 5-metoxi-1-tetralona (30,0 g, 170,2 mmol) y Pd al 10%/C (40 g) en 1000 ml de p-cimeno, y se controló el transcurso de la reacción por CL-EM hasta que se agotó todo el material de partida (aprox. 24 h). La mezcla se enfrió después hasta la temperatura ambiente y se hizo pasar a través de un tapón de gel de sílice /Celite y se concentró en vacío, para dar lugar a 26,6 g (90%) de un sólido blancuzco: ^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 3,90 (3H, s), 6,83 (1H, doblete aparente, J= 7,5 Hz), 6,89 (1H, doblete aparente, J= 7,7 Hz), 7,24 (1H, triplete aparente), 7,30 (1H, triplete aparente), 7,54 (1H, doblete aparente, J= 8,5 Hz), 7,65 (1H, d, J= 8,5 Hz), 9,98 (1H, s).

Intermediario 31

1-[(2-bromo-5-metoxibencil)oxi]-5-metoxinaftaleno

A una mezcla de 5-metoxi-1-naftol (26,0 g, 149 mmol), trifenilfosfina (43,3 g, 165 mmol), (2-bromo-5-metoxifenil)metanol (36,0 g, 166 mmol) y THF (500 ml) se le añadió DEAD (28,7 g en 50 ml de THF, 165 mmol) gota a gota. Después se agitó la reacción durante toda la noche, se concentró, se disolvió en una cantidad mínima de éter, y se enfrió a aproximadamente -30ºC, hasta formar un precipitado blanco (PPh_{3}O y DEAD reducido) que se eliminó por filtración. El filtrado se concentró y se disolvió en una cantidad mínima de diclorometano y se enfrió hasta -30ºC. El precipitado se eliminó por filtración a través de un tapón de sílice y el filtrado se concentró hasta obtener 28,7 g (51,5%) de un sólido blanco. P.f. 120-121ºC; ^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 3,77 (3H, s), 3,96 (3H, s), 5,26 (2H, s), 6,94 (1H, dd, J=8,8Hz, 3,1 Hz), 7,01 (1H, d, J= 7,6 Hz), 7,11 (1H, d, J=7,6 Hz), 7,28 (1H, d, J= 3,1 Hz), 7,42 (2H, m), 7,61 (1H, d, J= 8,8 Hz), 7,75 (2H, doblete aparente); EM m/z 373/275 (patrón del Br) (M + H^{+}).

Análisis de C_{19}H_{17}BrO_{3}:

Calculado: C: 61, 14 H: 4,59

Encontrado: C: 60,86 H: 4,42.

Intermediario 32

1,8-dimetoxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno

A un matraz de recuperación de 2000 ml se le añadieron 1-[(2-bromo-5-metoxibencil)oxi]-5-metoxinaftaleno (3,0 g, 8,03 mmol), acetato de potasio (2,4 g, anhidro, 24,10 mmol), PdCl_{2}(PPh_{3})_{2} (1,12 g, 1,60 mmol) y N,N-dimetilacetamida (500 ml, 99%). El matraz se purgó con nitrógeno, se calentó hasta 130ºC durante 12 h, y se concentró en alto vacío. Después se disolvieron los sólidos oscuros en éter/CH_{2}Cl_{2} (1/1 300 ml) y se hicieron pasar a través de un tapón de gel de sílice /Celite. La evaporación a baja presión dio lugar a 2,32 g (99%) de producto en forma de sólido de color canela. P.f. 166-167ºC; ^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 3,82 (3H, s), 3,97 (3H, s), 5,30 (2H, s), 6,98 (3H, m), 7,42 (1H, t, J= 8,1 Hz), 7,69 (1H, d, J= 8,5 Hz), 7,81 (2H, doblete aparente, J= 8,6 Hz), 7,91 (1H, d, J= 8,9 Hz); EM m/z 293 (M + H^{+}).

Análisis de C_{19}H_{16}O_{3}:

Calculado: C: 78,06 H: 5,52

Encontrado: C: 77,67 H: 5,28.

Ejemplo 1u 6H-dibenzo[c,h]cromeno-1,8-diol

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 1,8-dimetoxi-6H dibenzo[c,h]-cromeno (1,0 g, 3,42 mmol) con clorhidrato de piridina (5,0 g, 43,3 mmol) siguiendo el método D, para dar lugar a 0,93 g (99%) de una espuma blanca. P.f. 213-214ºC; ^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 5,21 (2H, s), 6,72 (1H, d, J= 1,9 Hz), 6,82 (2H, m), 7,27 (1H, t, J= 7,9 Hz), 7,54 (1H, d, J= 8,3 Hz), 7,68 (1H, d, J= 8,4 Hz), 7,78 (2H, brs), 9,72 (1H, s), 10,09 (1H, s); EM m/z 263 (M - H^{+});

Análisis de C_{17}H_{12}O_{3}:

Calculado: C: 77,26 H: 4,58

Encontrado: C: 76,62 H: 4,42.

Intermediario 33

Acetato de 1-(acetiloxi)-6H-dibenzo[c,h]cromen-8-ilo

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 6H-dibenzo[c,h]cromeno-1,8-diol (1,5 g, 5,68 mmol), anhídrido acético (25 ml) y piridina (25 ml) siguiendo el método E, para dar lugar a 1,88 g (95%) de producto en forma de sólido blanco. P.f. 142-143ºC; ^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 2,31 (3H, s), 2,47 (3H, s), 5,38 (2H, s), 7,18 (1H, d, J= 2,0 Hz), 7,22 (1H, dd, J=8,4Hz, 2,3 Hz), 7,33 (1H, d, J= 7,1 Hz), 7,55 (1H, t, J= 8,0 Hz), 7,60 (1H, d, J= 8,9 Hz), 7,95 (1H, d, J= 8,4 Hz), 8,06 (2H, triplete aparente); EM m/z 349 (M + H^{+});

Análisis de C_{21}H_{16}O_{5}:

Calculado: C: 72,41 H: 4,63

Encontrado: C: 72,06 H: 4,72.

Ejemplo 1v 12-cloro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-1,8-diol

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar acetato de 1-(acetiloxi)-6H-dibenzo[c,h]-cromen-8-ilo (360 mg, 1,03 mmol) con NCS (210 mg, 1,57 mmol) y DMF anhidra (20 ml) siguiendo el método B durante 2,0 h a temperatura ambiente, seguido por calentamiento hasta 100ºC durante 1 h. La reacción se concentró a baja presión y los sólidos se disolvieron en MeOH (30 ml). Se burbujeó NH_{3} durante 0,5 h mientras se controlaba la eliminación del acetato por CL-EM. La reacción se concentró hasta formar un sedimento oscuro, que se disolvió en EtOAc y se hizo pasar a través de un tapón de sílice, para dar lugar a 200 mg (65%) de una espuma. Se obtuvo una muestra analítica por cromatografía en gel de sílice (EtOAc:hexanos, 1:1). P.f. \sim185ºC desc.; ^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 5,23 (2H, s), 6,72 (1H, d, J= 2,3 Hz), 6,81 (1H, dd, J= 8,6 Hz, 2,6 Hz), 6,92 (1H, dd, J= 7,5 Hz, 1,0 Hz), 7,33 (1H, triplete aparente), 7,62 (1H, dd, J= 8,5 Hz, 1,0 Hz), 7,69 (1H, d, J= 8,6 Hz), 7,79 (1H, s), 9,78 (1H, s), 10,11 (1H, s); EM m/z 297/399 (patrón del Cl) (M - H^{+}).

Análisis de C_{17}H_{11}ClO_{3}:

Calculado: C: 68,35 H: 3,71

Encontrado: C: 67,85 H: 3,61.

Ejemplo 1w 12-bromo-6H-dibenzo[c,h]cromeno-1,8-diol

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar acetato de 1-(acetiloxi)-6H-dibenzo-[c,h]cromen-8-ilo (510 mg, 1,46 mmol), NBS (315 mg, 1,77 mmol) y DMF anhidra (30 ml) a temperatura ambiente durante 1,5 horas, siguiendo el método B. La reacción se concentró a baja presión, se disolvió en MeOH (30 ml) y se burbujeó NH_{3} durante 1,5 h mientras se controlaba la eliminación del acetato por CL-EM. La reacción se concentró hasta obtener un sedimento oscuro, que se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc:hexanos, 1:1), para dar lugar a 340 mg (68%) de producto en forma de sólido de color canela. P.f.: se descompone por encima de 130ºC; ^{1}H RMN (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 5,23 (2H, s), 6,72 (1H, d, J= 1,9 Hz), 6,81 (1H, dd, J= 8,2 Hz, 2,5 Hz), 6,92 (1H, dd, J= 7,7 Hz, 1,1 Hz), 7,33 (1H, t, J= 8,0 Hz), 7,64 (1H, dd, J= 8,5 Hz, 1,1 Hz), 7,68 (1H, d, J= 8,5 Hz), 8,01 (1H, s), 9,78 (1H, s), 10,15 (1H, s); EM m/z 341/343 (patrón del Br) (M - H^{+}).

Análisis de C_{17}H_{11}BrO_{3}:

Calculado: C: 59,50 H: 3,23

Encontrado: C: 59,23 H: 3,34.

Ejemplo 1x 1,8-dihidroxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno-12-carbonitrilo

A un matraz de 10 ml se le añadió bromuro (165 mg, 0,48 mmol), Pd(PPh_{3}) (28 mg, 0,024 mmol), cianuro de cinc (68 mg, 0,58 mmol) y DMF (5 ml). La mezcla se calentó hasta 120ºC durante 12 h, después de lo cual no hubo reacción. A continuación se añadió cianuro de cobre (43 mg, 0,48 mmol) y la reacción se completó en 1 h por CL-EM. Una vez enfriada la reacción, se diluyó con EtOAc, se hizo pasar a través de un tapón de sílice, se concentró y se purificó por HPLC preparativa en fase inversa (agua/CH_{3}CN en TFA al 0,1%) y se concentró a baja presión hasta obtener un sólido blanco. Los sólidos se secaron en una pistola de secado (100ºC durante toda la noche) para dar lugar a 30 mg de producto (21%) en forma de sólido blanco. P.f. se descompone por encima de 260ºC; ^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 2,06 (2H, m), 2,60 (2H, t, J= 6,5 Hz), 2,99 (2H, t, J= 5,9 Hz), 6,87 (2H, d, J= 8,6 Hz), 7,57 (4H, m), 7,86 (1H, d, J= 8,7 Hz), 9,74 (1H, s); EM m/z 237 (M - H^{+}).

Análisis de C_{16}H_{14}O_{2}:

Calculado: C: 80,65 H: 5,92

Encontrado: C: 79,04 H: 5,60.

\newpage

Ejemplo 1y y Ejemplo 1z

2-cloro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-1,8-diol (Ej. 1y) y 4-cloro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-1,8-diol (Ej. 1z)

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 6H-dibenzo[c,h]cromeno-1,8-diol (150 mg, 0,57 mmol), NCS (84 mg, 0,63 mmol) y THF (8 ml) durante 3 h a temperatura ambiente y durante 5 h a 60ºC, siguiendo el método B. La reacción se purificó por HPLC preparativa, para dar lugar a 35 mg del compuesto 2-cloro y 10 mg del compuesto 4-cloro (27% global). Compuesto 2-cloro: p.f. 181-182ºC desc.; ^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 5,24 (2H, s), 6,72 (1H, d, J= 2,3 Hz), 6,83 (1H, dd, J= 8,4 Hz. 2,4 Hz), 7,40 (1H, d, J= 9,0 Hz), 7,61 (1H, d, J= 9,0 Hz), 7,71 (1H, d, J= 8,5 Hz), 7,64 (1H, d, J= 8,9) 7,91 (1H, d, J= 9,0 Hz), 9,77 (1H, s), 10,01 (1H, s); HRMS Exacto: 297,03239 (M - H^{+}) Encontrado: 297,03240 (0,02 ppm);

Análisis de C_{17}H_{11}ClO_{3}:

Calculado: C: 68,35 H: 3,71

Encontrado: C: 67,66 H: 3,68.

Compuesto 4-cloro: p.f.; ^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 5,14 (2H, s), 6,73 (1H, d, J= 2,4 Hz), 6,77 (1H, d, J= 8,2 Hz), 6,84 (1H, dd, J= 8,5 Hz, 2,5 Hz), 7,31 (1H, d, J= 8,2 Hz), 7,70 (1H, d, J= 8,5 Hz), 7,87 (2H, cuarteto aparente) 9,78 (1H, s), 9,77 (1H, s), 10,40 (1H, s); HRMS Exacto: 297,03239 (M - H^{+}) Encontrado: 297,03236 (-0,11 ppm)

Análisis de C_{17}H_{11}OCl_{3}:

Calculado: C: 68,35 H: 3,71

Encontrado: C: 66,12 H: 3,57.

Claims (31)

1. Compuesto de fórmula I que tiene la estructura

30

en la que

R_{1} y R_{2} se seleccionan, cada uno independientemente, a partir de hidrógeno, hidroxilo, alquilo de 1-6 átomos de carbono, alquenilo de 2-7 átomos de carbono, alquinilo de 2-7 átomos de carbono, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, o halógeno; en el que los grupos alquilo o alquenilo de R_{1} o R_{2} pueden estar opcionalmente sustituidos con hidroxilo, -CN, halógeno, trifluoroalquilo, trifluoroalcoxi, -NO_{2} o fenilo; y con la salvedad de que por lo menos uno de R_{1} o R_{2} es hidroxilo;

R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} son, cada uno independientemente, hidrógeno, alquilo de 1-6 átomos de carbono, halógeno, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, -CN, alquenilo de 2-7 átomos de carbono, alquinilo de 2-7 átomos de carbono, -CHO, fenilo, o un anillo heterocíclico de 5 ó 6 miembros que tiene 1 a 4 heteroátomos seleccionados a partir de O, N o S; en el que los grupos alquilo o alquenilo de R_{4}, R_{5}, R_{6} ó R_{7} pueden estar opcionalmente sustituidos con hidroxilo, -CN, halógeno, trifluoroalquilo, trifluoroalcoxi, -NO_{2} o fenilo; en el que el grupo fenilo de R_{4} ó R_{5} puede estar opcionalmente monosustituido, disustituido o trisustituido con un sustituyente, igual o distinto, seleccionado a partir de alquilo de 1-6 átomos de carbono, alquenilo de 2-7 átomos de carbono, halógeno, hidroxilo, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, -CN, -NO_{2}, amino, alquilamino de 1-6 átomos de carbono, dialquilamino de 1-6 átomos de carbono por cada grupo alquilo, tio, alquiltio de 1-6 átomos de carbono, alquilsulfinilo de 1-6 átomos de carbono, alquilsulfonilo de 1-6 átomos de carbono, alcoxicarbonilo de 2-7 átomos de carbono, alquilcarbonilo de 2-7 átomos de carbono, o benzoílo;

o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R_{6} y R_{7} son, cada uno independientemente, hidrógeno o halógeno.

3. Compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que R_{6} es hidrógeno o flúor.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R_{4} y R_{5} son, cada uno independientemente, hidrógeno, alquilo de 1-6 átomos de carbono, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, halógeno, alquenilo de 2-7 átomos de carbono, -CN, furilo o tienilo.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que R_{4} no es hidrógeno.

6. Compuesto según la reivindicación 5, en el que R_{4} se selecciona a partir de ciano, cloro, bromo, metilo, etilo, propilo, butilo, metoxi, vinilo, tien-2-ilo y tien-3-ilo.

7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que R_{5} es hidrógeno o halógeno.

8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que R_{2} y R_{3} son, cada uno independientemente, hidrógeno, halógeno o hidroxilo.

9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que R_{2} es hidroxilo o halógeno.

10. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que R_{2} es hidroxi.

11. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que R_{3} es hidrógeno o halógeno.

12. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que R_{1} es hidrógeno, hidroxilo o halógeno.

13. Compuesto según la reivindicación 1, que es uno de los siguientes:

a) 6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

b) 9-fluoro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

c) 2,8-dihidroxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno-12-carbonitrilo;

d) 9-fluoro-2,8-dihidroxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno-12-carbonitrilo;

e) 1-cloro-2,8-dihidroxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno-12-carbonitrilo;

f) 1-cloro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

g) 12-bromo-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

h) 12-cloro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

i) 12-bromo-9-fluoro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

j) 12-cloro-9-fluoro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

k) 12-metoxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

l) 11-cloro-12-metoxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

m) 12-metil-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

n) 12-vinil-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

o) 12-etil-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

p) 12-tien-3-il--6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

q) 12-tien-2-il-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

r) 12-butil-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

s) 12-propil-6H-dibenzo[c,h]cromeno-2,8-diol;

t) 6H-dibenzo[c,h]cromeno-1,8-diol;

u) 12-cloro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-1,8-diol;

v) 12-bromo-6H-dibenzo[c,h]cromeno-1,8-diol;

w) 1,8-dihidroxi-6H-dibenzo[c,h]cromeno-12-carbonitrilo;

x) 2-cloro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-1,8-diol;

y) 4-cloro-6H-dibenzo[c,h]cromeno-1,8-diol;

o una sal de los mismos farmacéuticamente aceptable.

14. Compuesto que es el 6H-dibenzo[c,h]cromen-8-ol, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

15. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento o la inhibición de la prostatitis o la cistitis intersticial en un mamífero.

16. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento o la inhibición de la enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, proctitis ulcerosa, o colitis en un mamífe-
ro.

17. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento o la inhibición de hipertrofia prostática, leiomiomas uterinos, cáncer de mama, cáncer de endometrio, síndrome de ovario poliquístico, pólipos del endometrio, enfermedad mamaria benigna, adenomiosis, cáncer de ovarios, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de colon, glioma o astroblastoma en un mamífero.

18. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento para reducir los niveles de colesterol, triglicéridos, Lp(a) o LDL; inhibir o tratar la hipercolesterolemia, hiperlipidemia, enfermedad cardiovascular; aterosclerosis, hipertensión; insuficiencia venosa periférica, reestenosis o vasoespasmo; o para inhibir las lesiones en las paredes vasculares derivadas de acontecimientos celulares que dan lugar a trastornos vasculares de origen inmunitario en un mamífero.

19. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento para mejorar la capacidad cognitiva, o para proporcionar neuroprotección, o para tratar o inhibir demencias seniles, enfermedad de Alzheimer, disminución de la capacidad cognitiva, ictus, ansiedad, o trastornos neurodegenerativos en un mamífero.

20. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento o la inhibición de trastornos patológicos provocados por radicales libres en un mamífero.

21. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento o la inhibición de la atrofia vaginal o vulvar, vaginitis atrófica, sequedad vaginal; prurito, dispareunia; disuria, aumento de la frecuencia de micción, incontinencia urinaria e infecciones de las vías urinarias en un mamífero.

22. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento o la inhibición de síntomas vasomotores en un mamífero.

23. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento para la inhibición de la concepción en un mamífero.

24. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento o la inhibición de la artritis en un mamífero.

25. Utilización según la reivindicación 24, en la que la artritis es artritis reumatoide, artrosis o espondiloartropatías.

26. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento o la inhibición de la hinchazón o la erosión articular; o para el tratamiento o la prevención de lesiones articulares derivadas de procedimientos artroscópicos o quirúrgicos en un mamífero.

27. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento o la inhibición de psoriasis o dermatitis en un mamífero.

28. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento o la inhibición de la isquemia, lesión por reperfusión, asma, pleuresía, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, uveítis, septicemia, choque hemorrágico, degeneración macular o diabetes de tipo II en un mamífero.

29. Utilización de un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento o la inhibición de la endometriosis en un mamífero.

30. Composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y un excipiente farmacéutico.

31. Procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, que comprende una de las siguientes etapas:

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a) desalquilar un compuesto de fórmula II:

31

en el que R es un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} son como se ha definido en la reivindicación 1, para dar lugar a un compuesto de fórmula I; o

b) desacilar un compuesto de fórmula III:

32

en el que R' es un grupo acilo, por ejemplo, alcanoílo de 2-7 átomos de carbono, tal como acetilo, R^{11} es R_{1} o un grupo aciloxi, por ejemplo, alcanoílo de 2-7 átomos de carbono, tal como acetilo, R^{12} es R_{2} o un grupo aciloxi, por ejemplo, alcanoílo de 2-7 átomos de carbono, tal como acetilo, y R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, son como se ha definido en la reivindicación 1, para dar lugar al correspondiente compuesto de fórmula I; o

c) hacer reaccionar un compuesto de 12-bromo de fórmula IV:

33

protegido si es necesario, en el que R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{6} y R_{7} son como se ha definido en la reivindicación 1, con un derivado reactivo de fórmula:

R_{4}-L

por ejemplo, en el que L es un ácido borónico o un derivado butiltino y en el que R_{4} es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 7 átomos de carbono, o un anillo heterocíclico de 5 ó 6 miembros que tiene 1 a 4 heteroátomos seleccionados a partir de O, N o S; y eliminar los grupos protectores, para dar lugar al correspondiente compuesto de fórmula (I); o

d) halogenar un compuesto de fórmula I:

34

según la reivindicación 1, protegido si es necesario, y en el que por lo menos uno de R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} es hidrógeno, con un agente halogenante, seguido, si es necesario, de desprotección, para dar lugar a un compuesto de fórmula I en el que por lo menos uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} es halógeno; o

d) nitrilar un compuesto de fórmula I:

35

según la reivindicación 1, protegido si es necesario, y en el que R_{4} es bromo, con un agente nitrilante, por ejemplo, cianuro de cinc, seguido, si es necesario, por desprotección, para dar lugar a un compuesto de fórmula I en el que R_{4} es ciano; o

e) convertir un compuesto básico de fórmula I en una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, o viceversa.