ES2240965T3

ES2240965T3 - Procedimientos para la produccion de polihidroxibutirato y de polihidroxialcanoatos relacionados en los plastidos de plantas superiores.

Info

Publication number: ES2240965T3
Application number: ES94926515T
Authority: ES
Inventors: Christopher Roland Somerville; Christiane Nawrath; Yves Poirier
Original assignee: Michigan State University MSU
Current assignee: Michigan State University MSU
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1994-08-17
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2014-08-17
Also published as: HK1013110A1; AU7633094A; WO1995005472A3; EP0719342B1; ATE295894T1; WO1995005472A2; EP0719342A1; US5610041A; DE69434377D1; JPH09501832A; DE69434377T2

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR ACIDO POLI-D-(-)-3-HIDROXIBUTIRICO (PHB) Y LOS POLIHIDROXIALCANOATOS RELACIONADOS (PHA) EN LOS PLASTIDOS DE PLANTAS. LA PRODUCCION DE PHB SE REALIZA TRANSFORMANDO GENETICAMENTE PLANTAS CON GENES MODIFICADOS DE MICROORGANISMOS. LOS GENES CODIFICAN LAS ENZIMAS REQUERIDAS PARA SINTETIZAR PHB A PARTIR DE ACETIL-COA O METABOLITOS RELACIONADOS Y SE FUNDEN CON SECUENCIAS DE PLANTAS ADICIONALES PARA OBJETIVAR LAS ENZIMAS PARA LOS PLASTIDOS.

Description

Procedimientos para la producción de polihidroxibutirato y de polihidroxialcanoatos relacionados en los plástidos de plantas superiores.

Referencia cruzada con la solicitud relacionada

Esta solicitud es continuación en parte de la solicitud de patente US nº de serie 08/108.193, presentada el 17 de agosto de 1993, que a su vez es una continuación en parte de la solicitud de patente US nº de serie 07/732.243, presentada el 19 de julio de 1991.

Derechos del gobierno

La invención descrita en la presente memoria fue realizada en el transcurso del trabajo realizado con la subvención nº DE-AC02-76ERO-1338 del Department of Energy de los Estados Unidos y nº DMB 9014037 de la National Science Foundation. El Gobierno de los Estados Unidos posee determinados derechos sobre la presente invención.

Antecedentes de la invención (1) Campo de la invención

La presente invención se refiere a las invenciones que mejoran la producción de una clase de material denominado polihidroxialcanoatos (PHA) en las plantas superiores. PHA es un grupo de material polimérico bacteriano compuesto de poliésteres lineales de hidroxiácidos y presenta propiedades termoplásticas. Anteriormente se ha demostrado un nivel bajo de producción de PHA en Arabidopsis thaliana transformada con los genes bacterianos implicados en la síntesis de PHA tal como se describe en la solicitud de patente US nº de serie 07/732.243, presentada el 19 de julio de 1991. A fin de producir grandes cantidades de PHA en las plantas superiores, se han de localizar las enzimas para la producción de PHA en un compartimento subcelular que posee una gran concentración de precursor para la síntesis de PHA que es el plástido. Se modificaron los tres genes de Alcaligenes eutrophus implicados en la síntesis de PHA a partir de acetil-CoA para dirigir las correspondientes enzimas al plástido de las células vegetales de Arabidopsis como un ejemplo específico de la presente invención.

(2) Descripción de la técnica relacionada

Los polihidroxialcanoatos (PHA), poliésteres de los 3-hidroxiácidos, son producidos como reservas de almacenamiento de carbono por una gran variedad de bacterias (Anderson, A.J. y Dawes, E.A., Microbiol. Rev. 54: 450-472, 1990). El poli-D-(-)-3-hidroxibutirato (PHB), el PHA más extendido y caracterizado a fondo, es un termoplástico biodegradable y biocompatible.

La investigación sobre la producción de PHA se ha concentrado por lo tanto en Alcaligenes eutrophus que produce los PHA de cadena corta (unidades C_{3} a C_{5}). En A. Eutrophus, PHB se sintetiza a partir del acetil-CoA mediante la acción consecutiva de tres enzimas (Figura 1) (Steinbüchel, A. y Schlegel, H.G., Mol. Microbiol. 5: 535-542, 1991). La primera enzima de la serie de reacciones, 3-cetotiolasa (E.C. 2.3.1.9), cataliza la condensación reversible de dos grupos de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA. La acetoacetil-CoA reductasa (E.C. 1.1.1.36) reduce posteriormente la acetoacetil-CoA a D-(-)-3-hidroxibutil-CoA, que se polimeriza a continuación mediante la acción de la PHB sintetasa para formar PHB. PHB se produce como un polímero de 10^{5} a 10^{6} unidades de monómero que se acumulan en los gránulos de 0,2 a 0,5 \mum de diámetro, conteniendo cada gránulo aproximadamente 1000 cadenas de polímero (Anderson, A.J. y Dawes, E.A., Microbiol. Rev. 54: 450-472, 1990). Cuando se cultiva en un medio que contiene glucosa, A. eutrophus acumula normalmente PHB hasta el 80% del peso en seco. Los genes que codifican las tres enzimas biosintéticas phb descritas anteriormente han sido clonadas a partir de A. eutrophus (Peoples, O.P. y Sinskey, A.J., J. Biol. Chem. 264: 15293-15297, 1989 y J. Biol. Chem. 264: 15298-15303, 1989; Slater, S.C., Volge W.H. y Dennis, D.E., J. Bacteriol. 170: 4431-4436, 1988, Schubert, P., Steinbüchel, A. y Schlegel, H.G., J. Bacteriol. 170: 5837-5847, 1988).

Además del homopolímero PHB, A. eutrophus y otras especies bacterianas pueden producir polímeros que contienen varias proporciones de numerosos monómeros C_{3} a C_{5} diferentes. La naturaleza y proporción de estos monómeros están influidas por la fuente de carbono suministrada en el medio de cultivo. Por ejemplo, cuando se suministra ácido propiónico o ácido pentanoico a la materia prima de fermentación, se produce un copolímero aleatorio que contiene monómeros tanto de 3-hidroxibutirato (3HB) como 3-hidroxivalerato (3HV) con un máximo del 43% molar al 90% molar de unidad 3HV, respectivamente (Anderson, A.J. y Dawes, E.A., Microbiol. Rev. 54: 450-472, 1990). Estos copolímeros de PHA son sintetizados por la misma PHB sintetasa que utiliza los derivados del tioéster de la coenzima A de los ácidos orgánicos de C_{3} a C_{5}.

Además de PHB y de los copolímeros que contienen PHB, existe otra clase general de PHA que contienen unidades de monómeros que oscilan entre C_{6} y C_{12}. Pseudomonas olevorans es la bacteria prototipo que sintetiza los PHA que contienen (D)-3-hidroxiácidos de cadena media cuando se proporcionan n-alcanos o ácidos n-alcanoicos en el medio de cultivo. El mejor estudiado de estos PHA es el polihidroxioctanoato, que se acumula cuando P. olevorans se cultiva en un medio que contiene octanoato (Huisman, G.W., de Leeuw, O., Eggink, C. y Witholt, B. Appl. Environ. Microbiol. 54: 2924, 1988). Además, los únicos polímeros que poseen monómeros insaturados o de cadena ramificada, así como que poseen grupos laterales cloruro o fluoruro, se pueden obtener por manipulación de la materia prima de fermentación (Doi, Y. (ed.), en: Microbial polyesters, cap. 3, VCH Publisher, Nueva York
(1990).

PHB es un termoplástico rígido y relativamente quebradizo (Doi, Y. (ed.), en: Microbial Polyesters, cap. 6, VCH Publisher, Nueva York (1990); Holmes, P.A. en: Developments in cristallyne polymers-2. Basset, D.C. (ed.), 1-65, 1988). La incorporación de monómeros 3HV en el polímero conduce a una disminución en la cristalinidad y en el punto de fusión en comparación con PHB, produciendo una disminución de la rigidez y un aumento de la dureza del polímero, haciendo a P(3HB-co-3HV) y otros copolímeros relacionados más adecuados para muchas aplicaciones comerciales. También es posible mezclar varios polímeros y plastificantes con PHB para mejorar sus características físicas (Holmes, P.A. en: Developments in cristallyne polymers-2. Basset, D.C. (ed.), 1-65, 1988). PHB presenta buena resistencia al UV pero generalmente escasa resistencia a los ácidos y bases así como a los disolventes orgánicos. PHB posee buena impermeabilidad al oxígeno y es resistente a la degradación hidrolítica en el aire húmedo. Estas propiedades le hacen atractivo a PHB como fuente de plástico para una amplia gama de productos de consumo, tal como recipientes domésticos, bolsas y papeles de envolver, en contraste con PHB, los PHA de cadena larga son elastómeros con punto de fusión que oscila entre 40 y 60ºC (Gross, R.A., De Mello, C., Lenz, R.W., Brandl, H. y Fuller, R.C., Macromolecules 22: 1106, 1989). Las propiedades físicas de estos PHA tienen que ser caracterizadas todavía completamente.

PHB y los copolímeros relacionados se degradan fácilmente en el suelo, lodos y agua del mar. Por ejemplo, en el suelo a 30ºC, las películas de copolímero P(3HB-co-4HB) y del homopolímero PHB se descomponen en dos y diez semanas, respectivamente (Doi, Y. (ed.), en: Microbial Polyesters, cap. 1, VCH Publishers, Nueva York (1990). Se demostró que numerosas bacterias y hongos eran capaces de degradar de forma activa estos polímeros (Dawes, E.A. y Senior, P.J., Adv. Microb. Physiol. 10: 135-266 (1973). Se han aislado polimerasas e hidrolasas extracelulares de PHB de varias bacterias, incluyendo Alcaligenes feacalis. PHB se puede degradar de este modo a unidades monoméricas de 3HB que se pueden utilizar como fuente de carbono para cultivos bacterianos y micóticos. Además, PHB es muy compatible, haciéndole potencialmente atractivo para aplicaciones médicas tales como filamentos de sutura y excipientes de fármacos (Koosa, F., Muller, R.H. y Davis, S.S. en: Critical reviews in therapeutic drug carrier system, 6: 117-129, 1989). La degradación de PHB produce ácido D-3-idroxubutídico, metabolito normalmente presente en la sangre. La biodegradación de PHB es un aspecto importante de su utilidad como plástico para productos disponibles en artículos de consumo, así como para utilizaciones especializadas tales como en cubiertas vegetales agrícolas o implantes sanitarios.

El copolímero P(3HB-co-3HV) sintetizado por A. eutrophus es producido industrialmente por Imperial Chemical Industries y comercializado bajo la marca registrada BIOPOL. El coste estimado basado en la producción de 500.000 kg de polímero al año es aproximadamente de 15 dólares por kg, en contraste con aproximadamente 1 dólar por kg para los plásticos de artículos de consumo procedentes del petróleo tales como polipropileno (Poole, R., Science 245: 1187-1189, 1989). Los dos contribuyentes principales al coste de producción son la fuente de carbono añadido a la materia prima (p. ej., sacarosa, glucosa, propionato) y la recogida del polímero de las bacterias. Se están explorando numerosas estrategias para reducir el coste de producción (Poirier, Y., Dennis, D.E., Nawrath, C. y Somerville, C. Adv. Mater. 5: 30-36, 1993). Por ejemplo, algunas bacterias son capaces de producir PHB cuando se cultivan en fuentes de azúcar sin refinar económicas tales como las molasas y el jarabe de maíz. Algunas cepas de Pseudomonas y Rhodococcus son capaces de producir numerosos copolímeros de PHA cuando se cultivan en glucosa, impidiendo de este modo la adición de sustratos costosos, como propionato, requeridos normalmente para la producción del copolímero. Así mismo es de esperar que la ingeniería genética de las bacterias, que comprende la utilización de E. coli que sintetiza PHB, tenga un impacto sobre el coste de producción del PHB. Sin embargo, a pesar de estas mejoras potenciales, en general se está de acuerdo en que debido a los costes inherentes relacionados con la fermentación bacteriana y el tratamiento corriente abajo, el coste de PHA producido por bacterias probablemente no sea menor de aproximadamente 3 a 5 dólares por kg. Es poco probable que alguna vez sea posible producir biomasa bacteriana a un coste comparable al de la producción de biomasa a partir de plantas superiores. Por ejemplo, la patata puede rendir aproximadamente 20.000 kg de almidón por hectárea, acumulando el tubérculo de la patata almidón hasta el 80% de su peso en seco (Martin, J.H., Leonard, W.H. y Stamp, D.L. (eds.), capítulo 36, en: Principles of Field Crop Production, 898-932, Macmillan, Nueva York, 1976). El almidón es uno de los artículos de precio más bajo (aproximadamente 0,2 dólares/kg) y el más abundante del mundo. Asimismo, los cultivos que producen aceite, tal como rabina, producen 1.000 kg de aceite por hectárea con un contenido de aceite de semilla hasta el 44% del peso en seco (Downey, R.K. y Röbbelen, G., en: Oil crops of the world, Röbbelen, G., Downey, R.K. y Ashri, A. (eds.), capítulo 16, McGraw-Hill, Nueva York, 1989). Se ha demostrado que las plantas, además de ser muy productivas, son muy eficaces en la producción de numerosas proteínas extrañas biológicamente activas, tales como los anticuerpos (Hiatt, A., Cafferkey, R. y Bowdish, K., Nature 342: 76-78, 1989). Existe creciente interés en hacer uso de la gran productividad y flexibilidad de las plantas que producen una variedad de materiales orgánicos, incluyendo proteínas y otros diversos polímeros (Moffat, A.S., Science 256: 770-771,
1992).

La producción de poli D-(-)-3-hidroxibutirato, un elemento de la familia de los PHA, se ha demostrado anteriormente en la planta superior Arabidopsis thaliana (Poirier, Y., Dennis, E., Klomparens, K. y Somerville, C., Science 256: 520-523, 1992 y la solicitud de patente nº de serie 07/732.243). De estas tres enzimas necesarias para producir PHB a partir de acetil-CoA, la 3-cetotiolasa está presente de forma endógena en las plantas. En los experimentos iniciales, los genes de la bacteria Alcaligenes eutrophus que codifica a 3-cetotiolasa (phbA), la acetoacetil-CoA reductasa (phbB) y la PHB sintetasa (phbC), se transfirieron y expresaron en Arabidopsis bajo el control de la transcripción del activador 35S de CaMV (Figura 1). En estos experimentos, las enzimas se dirigieron al citoplasma, debido a la ausencia de señales que se dirigen al orgánulo en los productos génicos. Mediante cruces genéticos apropiados, se obtuvo una planta híbrida que contenía todas las enzimas requeridas para la síntesis de PHB. El análisis de los compuestos solubles en cloroformo presentes en la planta híbrida por cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC-MS) puso de manifiesto la presencia de PHB. Se podría detectar entre 20 y 100 \mug de PHB por gramo de peso fresco de material vegetal. El examen por microscopía electrónica de secciones finas de tejidos vegetales que producen PHB puso de manifiesto la presencia de aglomeraciones de gránulos radiantes a los electrones. Estos gránulos eran muy similares en tamaño y aspecto a los gránulos encontrados en A. eutrophus y otras bacterias que acumulan PHB. Sorprendentemente, los gránulos de PHB se encontraron en varios compartimentos, a saber el núcleo, las vacuolas y el citoplasma. No se pudo detectar ningún gránulo de PHB en los mitocondrias o el cloroplasto. La base para esta distribución de gránulos es desconocida.

La demostración de la producción de PHB en plantas de Arabidopsis modificadas genéticamente puso de manifiesto varios problemas. Uno de los problemas es el bajo rendimiento de PHB. Un segundo problema es el efecto desfavorable de la expresión de los genes phb en el crecimiento de la planta. La expresión de grandes cantidades de actividad de acetoacetil-CoA reductasa en plantas transgénicas produjo una reducción significativa en el crecimiento y en la producción de semillas en comparación con las plantas naturales. Por ejemplo, en una línea transgénica que expresa aproximadamente 9 unidades de actividad de acetoacetil-CoA reductasa por mg de proteína (estando definida una unidad como un \mumol de acetoacetil-CoA reducida por min), el peso en fresco de brotes de 22 días se redujo al 19% del tipo natural (Poirier, Y., Dennis, D. E., Klomparens, K., Nawrath C. y Somerville, C., FEMS Microbiol. Lett., 103: 237-246, 1992). La producción de semillas se redujo aproximadamente en la misma proporción. Este fenotipo podría ser el resultado de la desviación de una cantidad significativa de acetil-CoA y/o acetoacetil-CoA lejos de las vías bioquímicas esenciales que conducen a una disminución de la producción de compuestos tales como fitohormonas, carotenoides, esteroles, quinonas, flavonoides y lípidos (Figura 2). Por otra parte, la acumulación de \beta-hidroxibutiril-CoA o de un producto procedente de ella, puede ser perjudicial para las células vegetales. El destino de D-\beta-hidroxibutiril-CoA producido en las plantas transgénicas es desconocido. La expresión de la PHB sintetasa, por sí misma, no presentó efecto aparente sobre el crecimiento o el vigor de las plantas transgénicas. Sin embargo, en las plantas híbridas que contienen ambos genes se atrofió más severamente el crecimiento que en las plantas que contienen únicamente la actividad de la acetoacetil-CoA reductasa. Esto podría ser debido bien a una eliminación más severa del sustrato en la serie de reacciones del mevalonato o al efecto nocivo de los gránulos de PHB, particularmente a los gránulos que se acumulan en el núcleo.

Descripción de las formas de realización preferidas

La presente invención se refiere a un material vegetal transgénico que tiene plástidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extraño que codifica un polipéptido bacteriano que se selecciona de entre el grupo constituido por 3-cetotiolasa, acetoacetil-CoA reductasa y polihidroxialcanoato (PHA) sintetasa y mezclas de las mismas que conducen a la producción de un polihidroxialcanoato en el plástido en la planta.

La presente invención se refiere asimismo a un material vegetal transgénico que tiene plástidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extraño que codifica un péptido que presenta actividad de 3-cetotiolasa en el plástido en la planta.

La presente invención se refiere asimismo a un material vegetal transgénico que tiene plástidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extraño que codifica un péptido que presenta actividad de acetoacetil-CoA-reductasa en el plástido en la planta.

La presente invención se refiere asimismo a un material vegetal transgénico que tiene plástidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extraño que codifica un polipéptido que presenta actividad de PHA sintetasa en el plástido en la planta.

La presente invención se refiere asimismo a un material vegetal transgénico que tiene plástidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extraño que codifica uno o más enzimas que conducen a la síntesis de polihidroxialcanoato (PHA) a partir de hidroxiacil-CoA en el plástido de la planta.

La presente invención se refiere asimismo a un material vegetal transgénico que tiene plástidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extraño que codifica uno o más enzimas que catalizan la síntesis de hidroxiacil-CoA en el plástido de la planta.

La presente invención se refiere asimismo a un vegetal transgénico que tiene plástidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extraño que codifica una o más enzimas que conducen a la producción de acetoacetil-CoA, a partir de los productos codificados por el ADN extraño, en el plástido de la planta.

La presente invención se refiere asimismo a un material vegetal transgénico que tiene plástidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extraño que codifica una o más enzimas que conducen a la producción de 3-hidroxibutiril-CoA, a partir de los productos codificados por el ADN extraño, en el plástido de la planta.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento para la introducción del ADN extraño que codifica polipéptidos que conducen a la síntesis de un polihidroxialcanoato (PHA) en el plástido en una planta que comprende el cruzamiento por fertilización sexual de dos plantas que no producen PHA, conteniendo cada una ADN extraño procedente de una bacteria que codifica una o más enzimas diferentes en una serie de reacciones que conduce a la polimerización de hidroxiacil-CoA por PHA sintetasa para producir el vegetal que sintetiza el PHA en un plástido de la planta.

Objetivos

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una o más de las enzimas que conducen a la acumulación de PHA, particularmente PHB, en el plástido. Un objetivo de la presente invención consiste además en proporcionar plantas que presentan buen crecimiento y formación de semillas. Estos y otros objetivos se pondrán de manifiesto cada vez más en relación con la descripción y los dibujos siguientes.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama de flujo que presenta la serie de reacciones de la síntesis de PHB en A. eutrophus. Los genes que codifican las tres enzimas se presentan entre paréntesis.

La Figura 2 es un diagrama de flujo que presenta la serie de reacciones metabólicas que utilizan acetil-CoA y acetoacetil-CoA en plantas transgénicas que producen PHB. Los productos finales principales de la serie de reacciones metabólicas endógenas de la planta que utilizan acetil-CoA y acetoacetil-CoA como precursores se presentan en la parte superior del diagrama. La serie de reacciones adicional creada en las plantas transgénicas mediante la expresión de los genes phbB y phbC procedentes de A. eutrophus está indicada en el recuadro.

La Figura 3 es un diagrama esquemático de las fusiones del génicas TPSS-phb. a) fusión génica TPSS-3-cetotiolasa, b) fusión génica TPSS-acetoacetil-CoA reductasa y c) fusión génica TPSS-PHB sintetasa.

Todos estos constructos están compuestos por cuatro zonas distintas indicadas en los recuadros, a saber el péptido de tránsito de 55 aminoácidos y los primeros 23 aminoácidos de la proteína madura codificada por el gen 3,6 de la subunidad pequeña de Rubisco del guisante, una secuencia de enlace corta y la zona de codificación completa de los genes phbA (A), phbB (B) y phbC (C) de A. eutrophus con excepción de las metioninas iniciales. Las secuencias de aminoácidos (código de una sola letra) están indicadas en negrita así como las secuencias de ADN presentes en las uniones de cada zona. Los tramos de aminoácidos entre las uniones, indicadas por guiones, se han publicado anteriormente (Cashmore, A.R. en: Genetic engineering of plants (ed. Kosuge, T., Meredith, C.P. y Hollaender, A.) 29-38, Plenum Press NY, 1983; Janes, B., Hollar, J. y Dennis, D., E.A. Dawes (ed.), Novel Biodegradable Microbial Polymers 175-190 (1990)). Los asteriscos indican codones de terminación. Se indican los puntos de restricción de endonucleasa que fueron introducidos mediante PCR durante los procedimientos de subclona-
ción.

La Figura 4 es un diagrama esquemático de los plásmidos Ti que albergan al promotor 35S de CaMV y de la fusión génica TPSS-phb. Se presentan las cartografías de pBI-TPSS-Thio (A), pBI-TPSS-Red (B) y pBI-TPSS-Syn (C). Los componentes físicos de cada constructo son, de izquierda a derecha: LB, secuencia del borde izquierdo; Kan, gen de neomicin fosfotransferasa II; CaMV-35S, activador 35S del virus del mosaico de la coliflor; TPSS, péptido de tránsito de la subunidad pequeña (3,6 genes) de Rubisco del guisante; recuadro sombreado, enlazador sintético; gen de 3-cetotiolasa (A), gen de acetoacetil-CoA reductasa (B), o gen de PHB sintetasa (C); poli A, punto de poliadenilación; RB, secuencia del borde derecho. Se indican las posiciones de los puntos de restricción importantes de endonu-
cleasa.

La Figura 5 es un diagrama esquemática de los plásmidos Ti que albergan el activador específico de la semilla y de la fusión génica TPSS-phb. Se presentan las cartografías de pBIB-CNN-Thio (A), pBIB-KCN-Red (B), y pBIB-HCN-Syn (C). En todos los constructos, el activador específico de la semilla del gen CRB de la proteína de almacenamiento de la semilla 12S de A. thaliana se colocó corriente arriba de la fusión génica TPSS-phb. Se utilizaron los marcadores selectivos siguientes: ALS que codifica la acetolactato sintetasa (A), Kan, que codifica la neomicin fosfotransferasa II; Hyg, higromicin fosfotransferasa. La Figura 4 presenta una descripción más detallada.

La Figura 6 es una autorradiografía de un análisis por transferencia Western de las plantas transgénicas A. thaliana que expresan al plásmido pBI-TPSS-Thio y de plantas de referencia. Se separaron alícuotas de extractos de proteína de la hoja en bruto que contenían 1,2 \mug de proteína en una SDS-PAGE al 10%. Las proteínas electrotransferidas sobre celulosa se incubaron con anticuerpo anti-3-cetotiolasa. Los extractos de proteína analizados fueron T4-3A (banda C; Somerville, C.R., Poirier, Y. y Dennis, D.E., solicitud de patente nº de serie 07/732.243), TPSS-Thio GHI 1 (banda 1), TPSS-Thio L (banda 2), TPSS-Thio STU4 (banda 3) y TPSS-Red STU (banda U).

La Figura 7 es una autorradiografía de un análisis por transferencia Western de las plantas transgénicas A. thaliana que expresan al plásmido pBI-TPSS-Red y de plantas de referencia. Se separaron alícuotas de extractos de proteína de la hoja en bruto que contenían 1,2 \mug de proteína en una SDS-PAGE al 12%. Las proteínas electrotransferidas sobre celulosa se incubaron con anticuerpo anti-acetoacetil-CoA reductasa. Los extractos de proteína analizados fueron RedB-2B (banda C; Somerville, C.R., Poirier, Y. y Dennis, D.E., solicitud de patente nº de serie 07/732.243),
TPSS-Red DEF (banda 1), TPSS-Red GHI1 (banda 2), TPSS- Red GHI2 (banda 3), TPSS-Red MNO1 (banda 4), TPSS-Red MNO2 (banda 5), TPSS-Red STU (banda 6), TPSS-Red VXY (banda 7) y TPSS-Syn VXY (banda U).

La Figura 8 es una autorradiografía de un análisis por transferencia Western de las plantas transgénicas A. thaliana que expresan al plásmido pBI-TPSS-Syn y de plantas de referencia. Se separaron alícuotas de extractos de proteína de la hoja en bruto que contenían 50 \mug de proteína en una SDS-PAGE al 8%. Las proteínas electrotransferidas sobre celulosa se incubaron con anticuerpo anti-PHB sintetasa. Los extractos de proteína analizados fueron S8-1-2C (banda C; Somerville, C.R., Poirier, Y. y Dennis, D.E., solicitud de patente nº de serie 07/732.243), TPSS-Red STU (banda U), TPSS-Syn GHI1 (banda 1), TPSS- Syn GHI2 (banda 2), TPSS-Syn JKL (banda 3) y TPSS-Syn VXY
(banda 4).

La Figura 9 es una autorradiografía de un análisis por transferencia Western de las plantas transgénicas A. thaliana que expresan al plásmido pBIB-CCN-Thio y de plantas de referencia. Se separaron alícuotas de extractos de proteína de semillas en bruto que contenían 50 \mug de proteína en una SDS-PAGE al 12%. Las proteínas electrotransferidas sobre celulosa se incubaron con anticuerpo anti-3-cetotiolasa. Los extractos de proteína analizados fueron CN-Red 17-1 (banda C), CN-Thio 13-3 (banda 1) y CN-Thio 14-1 (banda 2).

La Figura 10 es una autorradiografía de un análisis por transferencia Western de las plantas transgénicas A. thaliana que expresan pBIB-KCN-Red y de plantas de referencia. Se separaron alícuotas de extractos de proteínas en bruto que contenían 50 \mug de proteína en una SDS-PAGE al 12%. Las proteínas electrotransferidas sobre celulosa se incubaron con anticuerpo anti-acetoacetio-CoA reductasa. Los extractos de proteína analizados fueron RedB-2B (banda LR; Somerville, C.R., Poirier, Y. y Dennis, D.E., solicitud de patente nº de serie 07/732.243), los extractos de proteínas de semillas fueron CN-Syn 34-1H1 (banda U), CN-Red 17-3K (banda 1) CN-Red 17-1 (banda 2).

La Figura 11 es una autorradiografía de un análisis por transferencia Western de las plantas transgénicas A. thaliana que expresan al plásmido pBIB-HCN-Syn y de plantas de referencia. Se separaron alícuotas de extractos de proteínas en bruto que contenían 50 \mug de proteína en una SDS-PAGE al 12%. Las proteínas electrotransferidas sobre celulosa se incubaron con anticuerpo anti-PHB sintetasa. Los extractos de proteína analizados fueron S8-1-2C (banda LS; Somerville, C.R., Poirier, Y. y Dennis, D.E., solicitud de patente nº de serie 07/732.243), RedB-2B (banda LR; Somerville, C.R., Poirier, Y. y Dennis, D.E., solicitud de patente nº de serie 07/732.243), CN-Red 17-1 (banda C), CN-Syn 35-1 (banda 1), CN-Syn 35-1aA (banda 2), CN-Syn 35-G1 (banda 3), CN-Syn 34-1 Hb (banda 4), CN-Syn 34-1 Hc (banda 5), CN-Syn 34-1bA (banda 6), CN-Syn 34-1bA2 (banda 7), CN-Syn 34-1bB (banda 8), CN-Syn 34-1B (banda 9) y CN-Syn 34-1G (banda 10).

La Figura 12 es una autorradiografía de un análisis por transferencia Southern de plantas de A. thaliana de referencia no transformadas y transgénicas transformadas con los constructos pBI-TPSS-phb del plásmido. Un \mug de ADN genómico procedente de A. thaliana no transformada de la especie Rschew y procedente de plantas transgénicas se digirieron con el enzima de restricción HindIII, se separaron los fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa y se transfirieron a membranas de nilón. Se hibridaron los filtros a fragmentos de ADN marcados con ^{32}P procedentes de los genes (A) phbA, (B) phbB y (C) phbC. Los ADN genómicos analizados fueron TPSS-Thio GHI1 (banda Thio 1), TPSS-Thio L (banda Thio 2), TPSS-Thio STU4 (banda Thio 3), TPSS-Red DEF (banda Red 1), TPSS-Red GHI1 (banda Red 2), TPSS-Red GHI2 (banda Red 3), TPSS-Red MNO1 (banda Red 4), TPSS-Red MNO2 (banda Red 5), TPSS-Red STU (banda Red 6), TPSS-Red VWX (banda Red 7), TPSS-Syn GHI1 (banda Syn 1), TPSS-Syn GHI2 (banda Syn 2), TPSS-Syn JKL (banda Syn 3), TPSS-Syn VWX (banda Syn 4) y natural no transformado
(banda C).

La Figura 13 es una autorradiografía de un análisis por transferencia Southern de plantas de A. thaliana de referencia no transformadas y transgénicas transformadas con los constructos pBIB-CN-phb del plásmido. Los ADN genómicos analizados fueron CN-Thio 13-3 (banda Thio 1), CN-Thio 14-1 (banda Thio 2), CN-Red 17-2 (banda Red 1), CN-Red 17-3 (banda Red 2), CN-Red 17-1dA (banda Red 3), CN-Red 17-1dB (banda Red 4), CN-Red 17-3K (banda Red 5), CN-Red 17-2K (banda Red 6), CN-Syn 34-1bA (banda Syn 1), CN-Syn 34-1bB (banda Syn 2), CN-Syn 34-1Hb (banda Syn 3), CN-Syn 34-1G1 (banda Syn 4), CN-Syn 35-1 (banda Syn 5), CN-Syn 35-1A (banda Syn 6) y natural no transformado (banda C). Refiérase a la leyenda 12 de la figura para una descripción más detalla-
da.

La Figura 14 representa el análisis por cromatografía de gases (GC) de extractos purificados de PHB y de plantas. (A) Cromatograma de ggases de PHB transesterificad adquirido en Sigma Chemical Company; (B) Cromatograma de gases de extractos en cloroformo de hojas de A. thaliana natural no transformada de la especie Rschew. La flecha muestra la posición en la que se eluiría el hidroxibutirato de etilo del cromatograma; (C) Cromatograma de gases de extractos en cloroformo de hojas del híbrido TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1. La flecha indica la posición del pico hidroxibutirato de etilo.

La Figura 15 representa el análisis por cromatografía de gases-espectrometría de masas del hidroxibutirato de etilo preparado a partir de un patrón de PHB y de PHB de extractos vegetales. (A) Espectro de masas de PHB transesterificado comercial; (B) Espectro de masas del pico de GC del extracto de hojas en cloroformo de un híbrido TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1 que presenta un tiempo de residencia idéntico al del hidroxibutirato de etilo (tal como se muestra en la Figura 14 C).

La Figura 16 representa gráficos de barras que muestran la acumulación de PHB en las hojas de diferentes híbridos TPSS-Thio/TPSS-Red/TPSS-Syn vegetales. (A) mediciones realizadas en hojas en desarrollo (de 20 a 30 días); (B) mediciones realizadas en hojas maduras (de 50 a 60 días).

La Figura 17 representa fotografías de rositas naturales (WT) completamente desarrolladas y de plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan las enzimas biosintéticas de PHB en el plástido (A) y en el citoplasma (B). Las hojas del híbrido TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn-GHI1 que producen PHB en el plástido contenían aproximadamente 1,2 mg de PHB/g de peso en fresco (A, PHB+). El híbrido Red/Syn que expresa las enzimas de PHB en el citoplasma contenía aprox. 100 \mug de PHB/g de peso en fresco (B/PHB+). Las plantas naturales y transgénicas se cultivaron en idénticas condiciones.

La Figura 18 representa una fotografía que ilustra el efecto de acumulación en gran concentración de PHB en el plástido en la pigmentación de la hoja. (A) Hoja de una planta natural de 50 días; (B) Hoja de un híbrido transgénico de Arabidopsis de 50 días que produce 700 \mug de PHB/g de peso en fresco en el plástido de hojas en desarrollo.

La Figura 19 representa micrografías por transmisión electrónica (TEM) de secciones finas de un trihíbrido productor de PHB que expresa las enzimas de PHB en el plástido (TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1). (A) La aglomeración de gránulos translúcidos a electrones en el cloroplasto de una célula mesófila está indicada mediante flechas. Se colocó la planta en la oscuridad durante 48 h antes de la toma de muestras para el análisis por EM a fin de eliminar el almidón. La barra representa 1 \mum. (B) Micrografías por transmisión electrónica de secciones finas de hojas naturales recogidas después de 4 horas de iluminación en un fotoperiodo de 12 h. La acumulación de almidón en los plástidos en forma de gránulos individuales ovulares está indicada por flechas grandes en el tipo natural; (C) Micrografías por transmisión electrónica de secciones finas de hojas híbridas TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1 ositivas a PHB recogidas después de 4 horas de iluminación en un fotoperiodo de 12 h. La acumulación de almidón en los plástidos en forma de gránulos individuales ovulares está indicada por flechas grandes. La aglomeración de gránulos de PHB translúcidos a electrones en el plástido del trihíbrido está indicada mediante flechas pequeñas. La barra representa 1 \mum.

La Figura 20 representa un análisis por transferencia Western de extractos de proteína de plantas TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1 transgénicas incubadas con el anticuerpo anti-PHB sintetasa. Extractos de proteínas solubles (bandas 1 y 2) y de proteínas solubilizadas de la fracción de la membrana y de partículas (bandas 3 y 4) de dos plantas diferentes TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1. La banda C presenta el extracto de proteínas solubles de una planta TPSS-Syn GHI1.

Es útil indicar las definiciones de determinados términos que se han de utilizar a continuación.

Transformación significa el procedimiento para cambiar el genotipo de un organismo receptor mediante la introducción estable del ADN por cualquier medio.

Una planta transgénica es una planta que contiene secuencias de ADN que normalmente no están presentes en la especie, pero que se introdujeron mediante transformación.

Transcripción significa la formación de una cadena de ARN según la información genética contenida en el ADN.

Traducción significa el proceso mediante el cual la información genética en una molécula de ARNm dirige la orden de los aminoácidos específicos durante la síntesis de la proteína.

Un activador es un fragmento de ADN que origina la transcripción del material genético. Para los fines descritos en la presente memoria, activador se utiliza para indicar los fragmentos de ADN que permiten la transcripción en las células vegetales.

Un punto de adición de poli-A es una secuencia de nucleótidos que da lugar a que determinados enzimas escindan el ARNm en un punto específico y añadan una secuencia de restos de ácido adenílico al terminal 3' del ARNm.

phbC, phbA, phbB son los símbolos génicos dados a los genes de A. eutrophus para PHB polimerasa, 3-cetotiolasa y acetoacetil-CoA reductasa, respectivamente (Peoples, O.P. y Sinskey, A.J., J. Biol. Chem. 264: 15289-15303,
1989).

Un plástido es un orgánulo autorreplicador que está situado en múltiples copias en el citoplasma de diferentes tipos de células vegetales. Este orgánulo está rodeado por una membrana de doble capa y contiene su propio ADN. Las proteínas situadas en el plástido son codificadas por su propio ADN y sintetizadas en el plástido o son codificadas por el núcleo de la célula vegetal, sintetizadas en el citoplasma y transportadas al interior del plástido.

Al describir la descendencia de vegetales transgénicos, es útil adoptar un convenio que designe cuántas generaciones de autopolinización han transcurrido desde la introducción del ADN. En la presente memoria se diseña el original que transforma la generación T0. La descendencia resultante de la autopolinización de esta generación se denomina generación T1 y así sucesivamente.

En el caso de polinización cruzada entre dos plantas precursoras distintas, la descendencia resultante procedente del episodio de polinización cruzada inicial se denomina generación F1.

La invención descrita en esta exposición se refiere al alivio de la interrupción del crecimiento y de la producción baja de PHB relacionado con la primera generación de plantas productoras de PHB cambiando la localización celular de las enzimas biosintéticas de PHB y regulando la especificidad del tejido y el ritmo de la expresión.

A fin tanto de aumentar la producción de PHB como de impedir la eliminación potencial de los productos esenciales procedentes del acetil-CoA y/o acetoacetil-CoA, se dirigieron enzimas biosintéticas de PHB bacteriano al compartimento subcelular que presenta un alto flujo metabólico a través de acetil-CoA y/o acetoacetil-CoA, es decir el plástido. Al ser el punto de síntesis de ácidos grasos en las plantas, el plástido posee un elevado nivel de producción de acetil-CoA (Harwood, J.L., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39: 101-138, 1988). En los tejidos de almacenamiento, la desviación de algo de este acetil-CoA del plástido fuera de la biosíntesis de ácidos grasos hacia la producción de PHB no debería ser perjudicial para el crecimiento de la planta. El almidón, un biopolímero de elevado peso molecular sintetizado de manera natural en las plantas, se acumula en grandes cantidades en los plástidos de muchos tejidos de almacenamiento (amiloplastos) (Preiss, J., Ann. Rev. Plant Physiol. 33: 431-454, 1982). En los cloroplastos fotosintéticos, se acumula también el almidón transitoriamente durante el periodo diario de fijación de CO_{2}. El plástido es por consiguiente un compartimento que puede variar sus dimensiones y tiene una gran capacidad de almacenamiento. Por lo tanto, la acumulación de PHB en el plástido no es de esperar que interfiera con la función del plástido o cause alguna interrupción mecánica. Además, la expresión de la serie de reacciones biosintéticas del PHB en el citoplasma produjo la acumulación de gránulos de PHB en el citoplasma, el núcleo y vacuolas, pero no en el plástido (Poirier, Y., Dennis, E., Klomparens, K. y Somerville, C. Science 256: 520-523, 1992). Esto aumenta la posibilidad de que la envoltura del plástido sea impermeable a la penetración por los gránulos de PHB. Por consiguiente, una ventaja añadida de la producción de PHB del plástido es que los gránulos de PHB pueden acumularse y permanecer exclusivamente en el plástido, impidiendo la interrupción mecánica potencial de otros orgánulos por los
gránulos.

En la invención descrita en la presente memoria, se introdujeron en el interior de las células vegetales los genes phbA, phbB y phbC de Alcaligenes eutrophus modificados para el direccionamiento del plástido de las enzimas codificadas. Se expresaron bajo control de transcripción del activador 35S de CaMV, el mismo activador que se había utilizado anteriormente para construir plantas productoras de PHB. Este método permite una comparación directa del plástido, de la expresión citoplásmica de las enzimas y de los niveles de producción de PHB.

En una segunda parte de la invención descrita en la presente memoria, la producción de PHB se limitó a un tejido específico y a una etapa específica del ciclo vital de la planta para reducir la posibilidad de efectos perjudiciales en el desarrollo general de las plantas. Ya que el flujo de acetil-CoA en los plástidos es particularmente elevado en los tejidos que normalmente acumulan una gran cantidad de aceite, tales como las semillas de una planta oleosa, la semilla en desarrollo constituye un tejido adecuado para la producción de PHB. El desvío de algo de este acetil-CoA fuera de la síntesis de ácidos grasos utilizado para almacenar lípidos hacia la síntesis de PHB no debería ser perjudicial para el crecimiento de la planta. Por consiguiente, las enzimas phb dirigidas al plástido se expresaron específicamente en el desarrollo de las semillas que utilizan el activador de un gen de la proteína de almacenamiento de la semilla de Arabidopsis thaliana.

La producción de PHA a escala agrícola requiere que las plantas productoras de PHA tengan un vigor normal y que el nivel de PHA producido esté por encima de un determinado nivel mínimo que no ha sido todavía alcanzado en las generaciones anteriores de plantas transgénicas. La presente invención es por consiguiente de gran importancia para el desarrollo con éxito de plantas productoras de PHA. A causa de la estrecha relación de Arabidopsis y Brassica napus, los constructos descritos en los siguientes apartados deberían utilizarse directamente para la producción de PHB en Brassica. Además, debido a la similitud de los mecanismos de la expresión génica y del metabolismo del carbono primario en diferentes especies de plantas superiores, es también evidente que la esencia de la presente invención, la producción de PHA en plástidos, sea aplicable a otras especies vegetales. La producción de PHB en otras plantas productoras de aceite, tales como las semillas de colza y girasol o en el mesocarpio del aguacate o en el aceite de palma, es particularmente atractiva ya que estos órganos vegetales están especializados en proporcionar el acetil-CoA precursor para la biosíntesis de los ácidos grasos.

Aunque los experimentos expuestos a continuación se refieren a la especie vegetal Arabidopsis thaliana (L.)
Heynhold, el procedimiento descrito es generalmente aplicable a cualquier planta superior para la que haya disponible un procedimiento de transformación. Asimismo, aunque el procedimiento descrito en la presente memoria se refiere a la utilización de genes de A. eutrophus, el procedimiento descrito es generalmente aplicable a la utilización de genes de cualquier organismo que sean capaces de la síntesis de PHB. También es evidente que, aunque el procedimiento descrito se refiere a la producción de PHB, el procedimiento es generalmente aplicable a la producción de cualquier polihidroxialcanoato que sea producido normalmente en microorganismos mediante la actividad de PHA sintetasa (que incluye la PHB sintetasa), y para la que el sustrato hidroxiacil-CoA apropiado se produzca en una planta determinada.

La producción de PHB en los plástidos en las plantas transgénicas requiere la confirmación de la secuencia de las etapas siguientes:

1.) la construcción de uno o más plásmidos que contienen fusiones de los genes bacterianos para la síntesis de PHB en las secuencias de direccionamiento del plástido expresadas bajo el control de un activador vegetal en E. coli, 2.) la introducción de estos plásmidos en el interior de Agrobacterium tumefaciens, 3.) la infección de plantas con Agrobacterium tumefaciens transformado a fin de transformar las células vegetales con los genes modificados (es decir, A. thaliana en este ejemplo) 4.) la selección de plantas transformadas con los genes modificados, 5.) la selección de plantas que son homozigóticas para los genes ectópicos, 6.) análisis de las plantas transformadas respecto a la integración del plásmido y a la expresión de los genes ectópicos para asegurar que son activos y que los productos génicos se dirigen al plástido, procesados y operativos, 7.) la producción de plantas híbridas que contienen dos o más genes ectópicos diferentes por cruces sexuales, 8.) el análisis de la presencia de PHB en el material
híbrido.

1. Construcción de los plásmidos que contienen la secuencia de direccionamiento al plástido-fusiones génicas de phb bajo el control de un activador vegetal en E. coli 1.1. Fusión de una secuencia señal a las zonas de codificación de los genes phb

A fin de dirigir una proteína al estroma del plástido en las células vegetales, la proteína debe contener un péptido de tránsito en su extremo N-terminal (Keegstra, K. y Olsen, L.J., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40: 471-501, 1989; Archer, E.K. y Keegstra, K., J. Bioenerg. Biomem., 22: 789-810, 1990). Por consiguiente, una secuencia señal que codifica el péptido de tránsito ha de estar fusionada en el marco de lectura correcto al terminal 5' de la secuencia de codificación de la proteína. El péptido de tránsito de la subunidad pequeña de la ribulosa 1-5 bifosfato carboxilasa (rubisco) (TPSS) ha sido bien caracterizado (Robinson, C. y Ellis, R.J., Eur. J. Biochem., 142: 343-346, 1984, Wasmann, C.C., Reiss, B., Barlett, S. G., y Bohnert, H.J., Mol. Gen. Genet. 205: 446-453, 1986; Friedmann, A.L. y Keegstra, K., Plant Physiol. 89: 993-999, 1988; Lubben, T.H., Gatenby, A.A., Ahlquist, P., y Keegstra, K., Plant Mol. Biol. 12: 13-18, 1989; Schnell, D.J., Biobel, G. y Pain, D., J. Biol. Chem. 266: 3335-3342, 1991) y se ha utilizado anteriormente con éxito en numerosos experimentos de direccionamiento (van de Broeck, G., Timko, M.P., Kausch, A.P., Cashmore, A.R., Van Montagu, M. y Herrera-Estrella, L., Nature 313: 358-363, 1985; Schreier, P. H., Seftor, E.A., Schnell, J., y Bohnert, H.J., EMBO J. 4: 25-32, 1985; Boutry, M., Nagy, F., Poulsen, C., Aoyagi, K. y Chua N.-H., Nature 328: 340-342, 1987; Lubben, T.H., y Keegstra, K., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 5502-5506, 1986; Lamppa, G.K., J. Biol. Chem., 263: 14996-14999, 1988; Gatenby, A.A., Lubben, T.H., Ahlquist, P., y Keegstra, K., EMBO J. 7: 1307-1314, 1988; Cheung, A.Y., Bogorad, L., Van Montagu, M., y Schell, J., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 391-395, 1988; Lubben, T.H., Theg, S.M. y Keegstra, K., Photosyn. Res. 17: 173-194, 1988). Por consiguiente se utilizó el TPSS de guisante en los siguientes experimentos. Sin embargo, también podrían utilizarse de manera análoga numerosos péptidos de tránsito diferentes implicados en el direccionamiento del plástido.

Como el péptido de tránsito está normalmente escindido durante la importación al plástido, la estructura tridimensional en la unión entre el péptido de tránsito y la proteína puede ser importante para la eficacia del transporte (Wasmann, C.C., Reiss, B., Barlett, S.G. y Bohnert, H.J., Mol. Gen. Genet. 205: 446-453, 1986; Lubben, T.H., Gatenby, A.A., Ahlquist, P., y Keegstra, K., Plant Mol. Biol. 12: 13-18, 1989). Por consiguiente, la secuencia de gen que codifica los primeros 23 aminoácidos de la subunidad pequeña de rubisco se incluyeron en el péptido de tránsito que se fusionó con los genes bacterianos de A. eutrophus implicados en la producción de PHB, a saber los genes phbA, phbB y phbC.

Para obtener la fusión exacta entre las secuencias señal y los genes bacterianos, se amplificaron por reacción en cadena de polimerasa (PCR) las secuencias que codifican al TPSS así como a los genes phb utilizando cebadores de oligonucleótido que crearon nuevos puntos de restricción sintéticos en uno de los dos extremos de la secuencia. Los cebadores diseñados para amplificación se presentan en la Tabla 1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Amplificaciones de PCR

1

a) Zona de restricción introducida utilizando el oligonucleótido para la reacción PCR.

b) Tamaño del fragmento amplificado de ADN utilizando los oligonucleótidos y la fuente de ADN.

c) Somerville, C.R., Poirier, Y. y Dennis, D.E. Solicitud de patente nº de serie 07/732.243.

d) Wasmann, C.C., Reiss. B., Barlett, S.G., y Bohnert, H.J., Mol. Gen. Genet. 205: 446-453, 1986.

e) Pang, P.P., Pruitt, R.E. y Meyerowitz, E.M. Plant Mol. Biol. 11: 805-820, 1988.

La Tabla 1 incluye también la fuente del ADN a partir de la cual se amplificaron los fragmentos y el tamaño del fragmento amplificado. Se purificaron los fragmentos por PCR, se escindieron con enzimas que reconocen las zonas de restricción introducidas y se separaron por electroforesis en gel de agarosa.

El fragmento XbaI-SmaI de 0,27 kbp purificado que contiene el fragmento de ADN de la secuencia señal se ligó al vector pUC18 escindido con las mismas enzimas de restricción para producir el plásmido pUC-TPSS.

El fragmento SmaI-SacI de 1,3 kbp purificado del gen phbA y el fragmento de 0,8 kbp de los genes phbB se ligaron en el interior del plásmido cortado con pUC-TPSS SmaI y SacI para crear los plásmidos pUC-TPSS-Thio y pUC-TPSS-Red. El fragmento SmaI de 1,9 kbp del gen phbC se ligó a pUC-TPSS cortado con SmaI. Se seleccionó un clon en el cual se clonó la sintetasa en la orientación correcta detrás de la secuencia señal y se denominó pUC-TPSS-Syn.

En resumen, cada uno de los plásmidos creados, a saber pUC-TPSS-Thio, pUC-TPSS-Red y pUC-TPSS-Syn, contiene una parte de una zona de codificación de un gen vegetal y de un gen bacteriano fusionado conjuntamente de manera que codifican un polipéptido sintético. En la unión entre la planta y la secuencia bacteriana se formó una secuencia sintética que codifica los tres aminoácidos serina-arginina-valina (S-R-V). En la Figura 3 se presentan las secuencias de aminoácidos y de ADN presentes en las uniones entre las secuencias señal y los genes bacterianos. Cuando se expresan en una célula vegetal, estos polipéptidos es de esperar que sean reconocidos por el sistema de importación de la proteína de los plástidos y se transporte al estroma de los plástidos.

1.2. Adición de un activador vegetal corriente arriba de los genes phb modificados

Para obtener la transcripción de las zonas de codificación sintéticas en plantas superiores, las zonas de codificación han de estar bajo el control de un activador vegetal localizado cerca del terminal 5' de la zona de codificación. Además, es práctica frecuente añadir un punto de poliadenilación al terminal 3' de la zona de codificación a fin de asegurar la expresión apropiada del gen en las plantas superiores. Además, para la selección de las plantas transformadas, ha de estar presente un gen que permita sobrevivir únicamente a las plantas transformadas en las condiciones de selección. Dicho gen se denomina marcador seleccionable. Se utilizaron dos activadores diferentes para expresar los genes phb modificados: el activador 35S de CaMV y el activador CRB.

El activador 35S de CaMV (del virus del mosaico de la coliflor) es considerado un activador constituyente que produce niveles relativamente elevados de transcripción en una amplia variedad de tejidos en dichas especies de plantas superiores (Benfey, P.N. y Chua, N.-H., Science 250: 959-966, 1990). En cambio, el activador CRB aislado del gen CRB de la proteína de almacenamiento de semillas 12S de Arabidopsis thaliana favorece altos niveles de transcripción casi exclusivamente en el embrión de las semillas en desarrollo (Pang, P.P., Pruitt, R.E., y Meyerowitz, E.M., Plant Mol. Biol. 11: 805-820, 1988).

1.2.1. Adición del activador 35S de CaMV corriente arriba de los genes phb modificados

A fin de colocar el activador 35S de CaMV corriente arriba de los genes phbA, phbB y phbC modificados y para satisfacer los demás requisitos de la expresión de una zona de codificación en las plantas superiores, se utilizó el vector del plásmido pBI121 (Clonetech, CA). Este vector contiene el gen de la neomicina II fosfotransferasa como marcador seleccionable.

Para construir las fusiones de los genes 35S-TPSS-phbA de CaMV y 35S-TPSS-phbB de CaMV, se digirieron los plásmidos pUC-TPSS-Thio y pUC-TPSS-Red con las enzimas de restricción XbaI y SacI. El fragmento de restricción de 1,6 kbp del pUC-TPSS-Thio y el fragmento de 1,1 kbp del pUC-TPSS-Red se separaron de los demás fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN purificados se ligaron a pBI121 escindido con los mismos enzimas y se clonaron en el interior de E. coli. Los plásmidos recién creados pBI-TPSS-Thio y pBI-TPSS-Red contienen el gen phbA y el gen phbB, respectivamente, modificados para el direccionamiento al plástido y situados corriente debajo de un activador vegetal (Figura 4).

Para construir la fusión del gen 35S-TPSS-phbC de CaMV, se digirió el plásmido pUC-TPSS-Syn con EcoRI y los extremos alternados se rellenaron con T4 ADN polimerasa. El plásmido se digirió posteriormente con XbaI. El fragmento de ADN de 2,2 kbp se separó de los demás fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de ADN purificado se clonó en el interior de pBI121 escindido por el enzima de restricción SmI/XbaI. El plásmido resultante, denominado pBI-TPSS-Syn (Figura 4), tiene el gen phbC procedente de A. eutrophus modificado para el direccionamiento de plástido clonado en la orientación correcta, en comparación con el activador de CaMV y el punto de adenilación de pBI121, así que es de esperar que se exprese en las plantas superiores.

Estos constructos es de esperar que satisfagan todos los requisitos para la expresión elevada de los genes y el direccionamiento de las proteínas correspondientes, es decir la 3-cetotiolasa modificada, la acetoacetil-CoA reductasa modificada y la phb sintetasa modificada, al estroma del plástido.

1.2.2. Adición del activador específico de la semilla corriente arriba de los genes phb modificados

Para la clonación de las zonas de codificación modificadas de phb corriente abajo del activador de CRB, se utilizaron los vectores pBIB (Becker, D., Nucleic Acids Res. 18: 203, 1990). Estos vectores contienen todas las funciones que se necesitan para la transformación de la planta. Existen dos versiones del vector: pBIB-Kan lleva el gen de neomicina II fosfotransferasa como marcador seleccionable, pBIB-Hyg el gen de higromicina fosfotransferasa.

A fin de simplificar el procedimiento de clonación posterior, el activador CRB debería de estar ligeramente modificado mediante la eliminación del punto de restricción XbaI en la posición 993. Por consiguiente el plásmido nAt4011 (Pang, P.P., Pruitt, R.E. y Meyerowitz, E.M., Plant Mol. Biol. 11: 805-820, 1988) se digirió con BamHI y EcoRI y tras la purificación del fragmento de 3,5 kbp se clonó en el interior de pBR322 (Bolívar, F., Rodríguez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heyneker, H.L. y Boyer, H.W., Gene 2: 95-113, 1977) para producir pBR322-CRB. Tras el corte del único sitio XbaI de pBR322-CRB, se rellenaron los extremos alternos con desoxirribonucleótidos mediante incubación con T4 ADN polimerasa y se volvió a ligar el plásmido. El plásmido resultante no contenía el sitio XbaI en la zona del activador CRB.

A fin de obtener el activador CRB con los puntos de restricción adecuados en uno de los extremos de la secuencia, se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa utilizando los cebadores de oligonucleótidos indicados en la Tabla 1. Se clonó el fragmento XbaI de 1,1 kbp en pK19 (Pridmore, R.D., Gene 56: 309-312, 1987) para crear

\hbox{pK-CRB.}

A fin de clonar la zona de codificación de TPSS-phbA detrás del activador CRB, se digirió el plásmido pUC-TPSS-Thio con las enzimas de restricción XbaI y SacI y el fragmento de ADN de 1,6 kbp se purificó por electroforesis en gel de agarosa. Este fragmento se ligó al vector pBIB-Hyg escindido por XbaI y SacI. Ya que sería muy útil tener un marcador seleccionable diferente combinado con cada uno de los tres genes phb, el gen de higromicina II fosfotransferasa del vector pBIB-Hyg se sustituyó posteriormente por el gen de la acetolactato sintetasa, que proporciona resistencia a la clorsulforona en las plantas transformadas (Haughn, G.W., Smith, J., Mazur, B. y Somerville, C.R., Mol. Gen. Genet. 211: 266-271, 1988). Para realizar esto, se escindió el plásmido resultante mediante HindIII y BamHI para eliminar el gen de higromicina II fosfotransferasa. Los extremos alternos del plásmido se rellenaron con desoxirribonucleótidos mediante T4 ADN polimerasa. El fragmento XbaI de 5,8 kbp del plásmido pGH1 (Haughn, G.W., Smith, J., Mazur, B. y Somerville, C.R., Mol. Gen. Genet. 211: 266-271, 1988) se insertó posteriormente en el plásmido preparado. El constructo resultante se denominó pBIB-C-TPSS-Thio. El activador CRB se añadió a continuación al constructo clonando el fragmento XbaI de 1,1 kbp de pK-CRB en el interior del único punto XbaI de pBIB-C-TPSS-Thio. Un clon que contiene el activador en la orientación correcta para la expresión apropiada del phbA modificado se denominó pBIB-CCN-Thio (Figura 5).

A fin de clonar la zona de codificación TPSS-phbB detrás del activador CRB, se digirió el plásmido pUC-TPSS-Red con XbaI y se insertó el fragmento XbaI de 1,1 kbp del plásmido pk-CRB. Se seleccionó un clon con el activador en la orientación correcta y se denominó pK-CN-Red. El plásmido pK-CN-Red se digirió con EcoRI y PstI para obtener el fragmento de activador/gen y los extremos se rellenaron con desorribonucleótidos mediante T4-ADN polimerasa. Se purificó el fragmento de 2,2 kbp por electroforesis en gel de agarosa y se ligó en el vector pBIB-Kan digerido con SmaI. Un clon que posee el fragmento en la orientación correcta para una expresión génica apropiada en vegetales se denominó pBIB-KCN-Red (Figura 5).

A fin de clonar la zona de codificación TPSS-phbC detrás del activador CRB en el vector pBIB-Hyg, se digirió el plásmido pUC-TPSS-Syn con EcoRI, los extremos alternos se rellenaron con T4 ADN polimerasa y el plásmido linealizado se cortó posteriormente con XbaI. Se separó un fragmento de ADN de 2,2 kbp de los demás fragmentos por electroforesis en gel de agarosa. Se clonó el fragmento de ADN purificado en el interior de pBIB-Hyg digerido con las enzimas de restricción XbaI y SmaI. En este plásmido resultante digerido con XbaI, se clonó el fragmento XbaI de 1,1 kbp que contiene el activador CRB obtenido escindiendo el plásmido pk-CRB. Un clon que poseía el activador en la orientación correcta para una expresión apropiada del gen phbC modificado se denominó pBIB-HCN-Syn
(Figura 5).

En resumen, los plásmidos pBIB-CCN-Thio, pBIB-KCN-Red, pBIB-HCN-Syn se construyen de modo que cuando se transforman en el interior de las plantas, los genes modificados se expresarán de manera específica en las semillas en desarrollo con las proteínas que se dirigen al estroma de un plástido en la semilla.

2. Introducción de los constructos dentro de Agrobacterium tumefaciens

Para permitir la utilización de un método de transformación de vegetales que está mediado por Agrobacterium tumefaciens, los plásmidos de ambas series de constructos se transfirieron al interior de la cepa pGV3101 de Agrobacterium tumefaciens por electroporación (Koncz, C. y Schell, J., Mol. Gen. Genet. 204: 383-396, 1986; Sambrook, J. Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Las colonias bacterianas transformadas con los diversos plásmidos se recubrieron por selección para la expresión bacteriana de un gen con resistencia a la kanamicina presente en el plásmido pBI121 y pBIB.

3. Transformación de las células vegetales con Agrobacterium tumefaciens

En los experimentos expuestos, se utilizó Arabidopsis thaliana como planta modelo para mostrar la producción de PHB en el plástido. A. thaliana puede ser transformada por un método de transformación del meristemo mediado por Agrobacterium tumefaciens (Chang, S.S., Perk, S.K. y Nam, H.-G., Abstract en: Fourth International Conference on Arabidopsis Research, Viena, 1990).

Se cultivaron plantas Rschew de la especie Arabidopsis thaliana en condiciones de luz hasta que las plantas comenzaron a brotar (aproximadamente 3 semanas). Los brotes (aprox. 2 cm) se eliminaron en su base junto con los brotes auxiliares. El sitio de la herida fue infectado por Agrobacterium llevando el plásmido deseado. Se cultivaron las plantas hasta que salieron nuevos brotes (aprox. 1 semana). De nuevo se eliminaron los brotes y el sitio de la herida se infectó con Agrobacterium. Se cultivaron las plantas hasta la madurez total y se recogieron las semillas.

4. Selección de plantas transformadas

Se seleccionaron plantas T0 transformadas distribuyendo las semillas obtenidas en las plantas infectadas con varias cepas de Agrobacterium en medio vegetal solidificado de agar-agar que contenía el compuesto de selección apropiado. Para la selección de las plantas transformadas que llevan el T-ADN de pBI-TPSS-Thio, -Red y -Syn de pBIB-KCN-Red, se añadió 50 \mug/ml de Kanamicina al medio. Para la selección de las plantas transformadas que llevan el T-ADN de pBIB-CCN-Thio, se añadió 30 ng/ml de Clorsulforona al medio y 30 \mug/ml de Higromicina para la selección de plantas que llevan pBIB-HCN-Syn. Las concentraciones anteriores de los compuestos de la selección impiden el crecimiento de A. thaliana no transformada pero permiten el crecimiento normal de las plantas transformadas. Por término medio, se podría aislar un supuesto transformante a partir de las semillas de aprox. 40 plantas infectadas con Agrobacterium. Las plantas resistentes a Kanamicina se denominaron con una combinación de letras y números.

Se recuperaron un total de 14 plantas resistentes a kanamicina procedentes de las semillas de las plantas que fueron infectadas con A. tumefaciens que lleva el plásmido pBI-TPSS-Thio. Estas se denominaron TPSS-Thio GHI1, -GHI2, -GHI3, -GHI4, -L, -STU1, -STU2, -STU3, -STU4, -STU5, -STU6, -YZAA1, -YZAA2 y -YZAA3.

Se recuperaron un total de 10 líneas vegetales resistentes a kanamicina procedentes de las semillas de las plantas que fueron infectadas con A. tumefaciens que lleva el plásmido pBI-TPSS-Red. Estas se denominaron TPSS-Red DEF, -GHI1, -GHI2, -MNO1, -MNO2, -P1, -P2, -QR, -STU, y -VWX.

Se recuperaron un total de 6 líneas vegetales resistentes a kanamicina procedentes de las semillas de las plantas que fueron infectadas con A. tumefaciens que lleva el plásmido pBI-TPSS-Syn. Estas se denominaron TPSS-Syn-ABC, -GHI1, -GHI2, -JKL, -PQR y -VWX.

Se recuperaron un total de dos plantas resistentes a clorosulfona procedentes de las semillas de las plantas que fueron infectadas con A. tumefaciens que lleva el plásmido pBI-CCN-Thio. Estas se denominaron CN-Thio 13-3 y -14-1.

Se recuperaron un total de 6 plantas resistentes a kanamicina procedentes de las semillas de las plantas que fueron infectadas con A. tumefaciens que lleva el plásmido pBI-KCN-Red. Estas se denominaron CN-Red 17-1, -17-3, -17-1dA, -17-1dB, -17-2K, y -17-3K.

Se recuperaron un total de 17 plantas resistentes a higromicina procedentes de las semillas de las plantas que fueron infectadas con A. tumefaciens que lleva el plásmido pBI-HCN-Syn. Estas se denominaron CN-Syn-34-1bA, -34-1bB, -34-2A, -34-2B, -34-1 Ha, -34-1 Hb, -34-1 Hc, -34-1G1, -34-1G2, -35-1, -351aA; -35-1aB, -35-2A, -35-2B, -35-2C, -35-3, y -35-1G1.

5. Aislamiento de supuestas líneas transgénicas homozigóticas

Un criterio mínimo utilizado para producir líneas transgénicas homozigóticas fue que toda la descendencia de un vegetal homozigótico es de esperar que sea resistente al marcador de la selección. Debido a la presencia de múltiples copias ectópicas del T-ADN insertado en diferentes posiciones en el genoma pueden producir un fenotipo similar, este criterio es el más útil cuando el escenario de la transformación principal implica la inserción de T-ADN únicamente en una posición del cromosoma.

A fin de identificar supuestas líneas homozigóticas, las plantas T0 resistentes se cultivaron hasta la madurez en aislamiento reproductivo. Posteriormente varias plantas T1 que demostraron que eran resistentes al medio de selección se cultivaron de nuevo hasta la madurez. Se determinó a continuación la secuencia de la resistencia al marcador seleccionable en muestras de aproximadamente 100 semillas de T2 de cada línea. Si todas las semillas de T2 de una determinada planta eran resistentes al marcador seleccionable, la línea se consideraba provisionalmente que era homozigótica.

6. Análisis de las plantas transgénicas obtenidas 6.1. Análisis de la expresión y del direccionamiento del plástido de las enzimas phb y de su direccionamiento al plástido 6.1.1. Análisis de supuestas plantas transgénicas obtenidas tras la transformación con pBI-TPSS-Thio, pBI-TPSS-Red y pBI-TPSS-Syn

A fin de determinar si las plantas transgénicas transformadas con pBI-TPSS-Thio, pBI-TPSS-Red y pBI-TPSS-Syn producían enzimas operativas localizadas en los cloroplastos, se analizaron las proteínas de las plantas transgénicas resistentes a kanamicina mediante análisis por transferencia Western. Se incubaron las transferencias Western de las proteínas de las plantas transgénicas transformadas con pBl-TPSS-Thio con anticuerpos producidos contra la 3-cetotiolasa de A. eutrophus. Las transferencias Western de proteínas de plantas transgénicas transformadas con pBl-TPSS-Red se incubaron con anticuerpos producidos contra la acetoacetil-CoA reductasa y las proteínas de las plantas transgénicas transformadas con pBl-TPSS-Syn se incubaron con anticuerpos policlonales de ratones obtenidos contra la PHB sintetasa. Como referencia negativa, se incubó un análisis de un extracto de proteínas de una planta transgénica que no contenía la enzima supuestamente producida en el análisis. Como referencia positiva, se incubó un extracto de una planta transgénica que produce la enzima en el citoplasma.

De las 14 supuestas plantas transgénicas transformadas con el pBI-TPSS-Thio, los extractos de proteínas de las 3 plantas, a saber TPSS-Thio GHI1, -L y -STU4 presentaban una señal acusada para la producción de las 3-cetotiolasas (Figura 6). La enzima apareció en la transferencia Western como un triplete de bandas de 45, 46,5 y 48 kDa. Estas bandas representan la proteína correctamente procesada y los productos procesados de manera imprecisa. La 3-cetotiolasa no modificada localizada en el citoplasma aparece a 44 kDa. Por consiguiente, el cloroplasto dirigido, la TPSS-3-cetotiolasa procesada correctamente es de esperar que presente un peso molecular de aproximadamente 47 kDa, debido a los 23 aminoácidos añadidos procedentes de la subunidad pequeña de rubisco. La proteína no procesada, que alberga todavía el péptido de tránsito completo presentaría un peso molecular de aprox. 53 kDa.

De las 10 supuestas plantas transgénicas transformadas con pBI-TPSS-Red, todas las plantas excepto P1 y P2 presentaban una señal para la producción de acetoacetil-CoA reductasa. La intensidad de estas señales variaba y era la más acusada en TPSS-Red-DEF y -STU (Figura 7). La señal aparecía siempre como un triplete de bandas de 28,5, 29,0 y 30,5 kDa que representan las formas procesadas correctamente y las procesadas de manera imprecisa de la proteína. La proteína no modificada migra a 26,5 kDa. Por consiguiente, sería de esperar que una TPSS-acetoacetil-CoA reductasa no procesada presentase un peso molecular de 35 kDa y una forma procesada correctamente de la proteína presentase un peso molecular de aproximadamente 29 kDa.

Las 6 supuestas plantas transgénicas transformadas con pBI-TPSS-Syn excepto TPSS-Syn-ABC y -PQR presentaban una señal. La intensidad de estas señales variaba y era la más acusada en la planta TPSS-Syn-VWX (Figura 8). La señal aparecía siempre como un triplete de bandas en el tamaño de la proteína TPSS-Syn (63 kDa) procesada correctamente y una versión ligeramente más corta que la esperada (60 y 61 kDa). La PHB sintetasa no modificada migra a 60 kDa.

En todos los análisis por transferencia Western realizados, las proteínas de las plantas no transformadas no presentaban señal. Las plantas que expresan las enzimas phb en el citoplasma presentaban una señal acusada del tamaño esperado. Las enzimas PHB modificadas con un péptido de tránsito para el direccionamiento al plástido se procesaron hasta el tamaño esperado y por consiguiente se insertaron en su mayor parte dentro del plástido. Además, se produjeron las bandas con movilidad ligeramente mayor o menor también. Las proteínas con una movilidad ligeramente mayor que la que era de esperar podrían ser generadas por la actividad de la proteasa en los 23 aminoácidos de la proteína madura de la subunidad pequeña de rubisco que se añadieron a las enzimas bacterianas. La extensión creada artificialmente podría ser especialmente sensible a las proteasas.

Estos resultados indican que para cada constructo que contiene el activador CaMV, las plantas transformadas podrían obtenerse produciendo grandes concentraciones de las enzimas esperadas. El aspecto de cada una de estas enzimas en los análisis por transferencia Western como doblete o triplete de los tamaños esperados indica que las enzimas son transportadas hasta el plástido y tratadas de la manera esperada.

Se analizó la actividad de 3-cetotiolasa en las plantas transgénicas obtenidas por transformación con el pBI-TPSS-Thio por modificación secundaria del análisis descrito por Senior, P.J. y Dawes, E.A., Biochem. J. 134: 225-238, 1973. Se homogeneizaron tejidos congelados de hojas procedentes de plantas T1 heterozigóticas resistentes a la kanamicina en tampón Tris y se analizó la actividad de 3-cetotiolasa en los extractos en bruto purificados. Los resultados de estos experimentos se presentan en la Tabla 2.

TABLA 2 Niveles de actividad de 3-cetotiolasa en plantas transgénicas de A. thaliana

Muestra	Actividad de 3-cetotiolasa ^{a}
TPSS-Red	0,005
TPSS-Thio GHI1	0,32
TPSS-Thio L	0,30
TPSS-Thio STU4	0,27
^{a} \begin{minipage}[t]{130mm} Micromoles de acetoacetil-CoA degradados por minuto por miligramo de proteína. Los valores son un promedio de dos a cuatro mediciones.\end{minipage}

Los extractos de plantas no transformadas, plantas transgénicas transformadas con pBI-TPSS-Red y plantas transgénicas transformadas con pBI-TPSS-Thio que no expresaban el gen detectado mediante análisis por transferencia Western presentan concentraciones muy bajas de actividad de 3-cetotiolasa en las condiciones del análisis. En cambio, cada una de las plantas transgénicas obtenidas presentan una gran producción de 3-cetotiolasa en los análisis por transferencia Western y también un aumento de concentración de actividad de 3-cetotiolasa. Esto indica que la 3-cetotiolasa bacteriana modificada es operativa en las plantas. La actividad específica de la 3-cetotiolasa modificada fue tan activa como la de la 3-cetotiolasa bacteriana no modificada expresada en el citoplasma de las plantas de Arabidopsis.

Se analizó la actividad de acetoacetil-CoA reductasa en las plantas transgénicas obtenidas por transformación con el pBI-TPSS-Red por modificaciones secundarias del análisis descrito por Senior, P.J. y Dawes, E.A., Biochem. J. 134: 225-238, 1973. Se homogeneizaron hojas procedentes de plantas T1 heterozigóticas resistentes a la kanamicina en tampón de fosfato de potasio y se analizó la actividad de la aceoacetil-3 reductasa en los extractos en bruto purificados. Los resultados de estos experimentos se presentan en la Tabla 3.

TABLA 3 Niveles de actividad de acetoacetil-CoA reductasa en plantas transgénicas de A. thaliana

Muestra	Actividad de acetoacetil-CoA reductasa ^{a}
TPSS-Syn	0,047
TPSS-Red DEF	1,13
TPSS-Red GHI1	0,49
TPSS-ReD GHI2	0,75
TPSS-Red MNO1	1,07
TPSS-Red MNO2	0,31
TPSS-Red STU	3,39
TPSS-Red VWX	0,28
^{a} \begin{minipage}[t]{130mm}Micromoles de NADPH oxidados por minuto por miligramo de proteína. Los valores son un promedio de dos a cuatro mediciones. \end{minipage}

Los extractos de plantas no transformadas, de las transformadas con pBI-TPSS-Thio o de plantas transformadas que no expresaban el gen detectado mediante análisis por transferencia Western presentan niveles indetectables de actividad de acetoacetil-CoA reductasa. En cambio, cada una de las plantas transgénicas que se obtuvieron al producir la acetoacetil-CoA reductasa en el análisis por transferencia Western presentaba actividad de acetoacetil-CoA reductasa. El nivel de actividad se correlacionaba con el nivel de producción observado en la transferencia Western. Esto indica que la acetoacetil-CoA reductasa bacteriana modificada es operativa en las plantas.

En las plantas transgénicas obtenidas por transformación con el constructo pBI-TPSS-Syn no se analizó la presencia de actividad de PBH sintetasa debido a las dificultades técnicas en la medición de la actividad de esta enzima en ausencia de actividades de tiolasa y reductasa (Peoples, O.P. y Sinskey, A.J., J. Biol. Chem. 264: 15298-15303,
1989).

En resumen, los resultados de estos experimentos indican que las tres enzimas implicadas en la síntesis de PHB modificada por direccionamiento del plástido fueron producidas hasta niveles significativos en las plantas, se procesaron de la manera esperada para el transporte al plástido y eran enzimáticamente activas.

6.1.2. Análisis de supuestas plantas transgénicas obtenidas tras la transformación con pBIB-CCN-Thio, pBIB-KCN-Red y pBIB-HCN-Syn

A fin de determinar si las supuestas plantas transgénicas transformadas con pBIB-CCN-Thio, pBIB-KCN-Red y pBIB-HCN-Syn producen la enzima apropiada, se analizaron las proteínas en las semillas inmaduras. Dado que Pang et al. demostró que el activador específico de la semilla utilizado en estos experimentos dirige una gran expresión génica entre el día 6 el día 14 tras la fertilización de las flores, se recogieron las semillas en este periodo (Pang, P.P., Pruitt, R.E. y Meyerowitz, E.M., Plant Mol. Biol. 11: 805-820, 1988). Se homogeneizaron las semillas inmaduras congeladas en tampón y se separaron las proteínas presentes en la fase acuosa mediante electroforesis en gel de SDS poliacrilamida. Se transfirieron las semillas a nitrocelulosa y se incubaron con anticuerpos tal como se describió anteriormente.

Ambas plantas obtenidas tras la transformación con pBIB-CNN-Thio presentaban un nivel elevado de expresión de la enzima en la transferencia Western. La enzima aparecía como un cuadruplete en tamaños comprendidos entre 43 y 47 kDa. La banda a 47 kDa representa el tamaño esperado para la forma procesada correctamente de la enzima modificada (Figura 9).

En los análisis por transferencia Western de las 6 plantas resistentes a kanamicina únicamente el extracto de proteínas de la planta 17-3K reaccionó con el anticuerpo producido contra la acetoacetil-CoA reductasa. La señal aparecía como una banda doble en el tamaño de la forma correctamente procesada de la proteína (29 kDa) y de una proteína ligeramente mayor (31 kDa) (Figura 10).

Se analizaron trece de las 17 plantas obtenidas tras la transformación con pBIB-HCN-Syn. Entre éstas, 11 plantas presentaban expresión de bajo nivel de la sintetasa bacteriana modificada. La planta transgénica TPSS-Syn 34-1G1 presenta un nivel aproximadamente cinco veces mayor de expresión que las demás plantas transgénicas. La señal aparece como una banda única del tamaño de la enzima procesada (63 kDa) (Figura 11).

Los resultados preliminares de las enzimas PHB modificadas expresadas bajo control del activador específico de la semilla indican que están siendo sintetizados en las semillas y se procesan de la manera esperada para el direccionamiento al plástido.

Tras la obtención de las líneas homozigóticas de las plantas transformadas que expresan un gran nivel de las enzimas phb apropiadas, se emprenderán estudios de inmunolocalización para demostrar además que las enzimas están localizadas en los plástidos.

6.2. Análisis de la integración de los genes phb en plantas transgénicas

A fin de comprobar la integración apropiada de los genes phb en diversas líneas vegetales transgénicas producidas, se analizó el ADN genómico de las plantas transgénicas. Se aisló el ADN de alto peso molecular de las plantas no transformadas de referencia y de las plantas T2 transgénicas transformadas con los plásmidos pBI-TPSS-Thio, pBI-TPSS-Red y pBI-TPSS-Syn o pBIB-CCN-Thio, pBIB-KCN-Red y pBIB-HCN-Syn. Se digirieron los ADN con las enzimas de restricción HindIII, se separaron los fragmentos por electroforesis en gel de agarosa y se transfirieron a un filtro de nilón. En los constructos pBI-TPSS-Thio, pBI-TPSS-Red y pBI-TPSS-Syn, la enzima de restricción HindIII corta únicamente a uno en el terminal 5' del activador 35S de CaMV (Figura 4). En los constructos pBIB-CCN-Thio, pBIB-KCN-Red y pBIB-HCN-Syn, la enzima de restricción HindIII corta varias veces, pero únicamente en 5' de la zona de codificación de los genes phb. Los fragmentos detectados que utilizan sondas específicas del gen phb deberían representar por consiguiente los fragmentos de unión de los vectores Ti con el ADN genómico vegetal, o los fragmentos internos de los vectores Ti concatenados. Las inserciones en los plástidos pUC-THIO, pUC-RED y pUC-SYN se escindieron mediante el tratamiento con EcoRI y HindIII, se purificaron por electroforesis y se marcó con desoxirribonucleótidos con ^{32}P por cebado al azar. Se utilizaron a continuación los fragmentos del gen phb marcados para sondar los filtros de nilón. Se hibridaron los filtros y posteriormente se lavaron en condiciones de elevada restricción. El resultado de estas hibridaciones del filtro se presentan en la Figura 12 para los constructos pBI-TPSS-phb y en la Figura 13 para los constructos pBIB-CN-phb. No se puede detectar ninguno de los tres genes phb en las plantas de referencia no transformadas (Figuras 12 a, b, c y 13 a, b, c, banda C).

El gen phbA se detectó en las tres líneas transgénicas producidas por transformación por el plásmido pBI-TPSS-Thio (Figura 12a, banda Thio 1-3) y en las dos líneas transgénicas producidas por transformación con el plásmido pBIB-CCN-Thio (Figura 13 a, banda Thio 1-2).

El gen phbB se detectó en las tres líneas transgénicas producidas por transformación por el plásmido pBI-TPSS-Red (Figura 12b, bandas Red 1-7) y en 2 de las seis líneas transgénicas producidas por transformación con el plásmido pBIB-KCN-Red (Figura 13 b, bandas Red 1 y 5). Aunque las líneas celulares CN-Red 17-3, -17-1dA, -17-1dB y -17-2K eran resistentes a 50 \mug/ml de kanamicina, lo que sugiere la integración del gen NPTII, no se pudo detectar ningún gen phbB. Es probable que solamente el fragmento del vector Ti que alberga el gen NPTII y no el gen phbB, estuviera integrado en el ADN genómico de estas líneas (Figura 13 b, banda Red 2, 3, 4 y 6).

El gen phbC fue detectado en las cuatro líneas vegetales transgénicas producidas por transformación con pBI-TPSS-Syn (Figura 12c, banda Syn 1-4) y en las seis plantas transgénicas producidas por transformación con el plásmido pBIB-HCN-TPSS-Syn, que se analizaron (Figura 13 c, banda Syn 1-6). Las líneas vegetales transgéncias CN-Syn 34-1bA y CN-Syn 34-1bB son idénticas ya que presentan el mismo modelo de bandas en la transferencia Southern (Figura 13 c, banda Syn 1 y 2). El mismo fenómeno se puede observar para las plantas CN-Syn 34-1Hb y CN-Syn 34-1G1 (Figuras 13 c, banda Syn 3 y 4) y las plantas CN-Syn 35-1 y CN-Syn 35-1a (Figura 13 c, banda Syn 5 y 6) y está en relación con el método de transformación.

Se utilizó una serie de cruzamientos sexuales para las líneas vegetales del constructo que contienen las tres enzimas phb en el plástido de todos los tejidos. Las tres líneas transgénicas que expresan grandes cantidades de acetoacetil-CoA reductasa en el plástido (líneas TPSS-Red DEF, MNO1 y STU) se polinizaron por cruzamiento con plantas transgénicas que producen grandes cantidades de PHB sintetasa en el plástido (líneas TPSS-Syn GHI1, GHI2 y VWX). Las plantas híbridas TPSS-Red/TPSS-Syn resultantes que expresan la acetoacetil-CoA reductasa y la PHB sintetasa en el plástido no produjeron cantidades mensurables de PHB en las hojas en desarrollo, analizadas por cromatografía de gases (<20 \mug/g de peso fresco de PHB). Por comparación, las plantas transgénicas que producen la acetoacetil-CoA reductasa y la PHB sintetasa en concentraciones similares en el citoplasma produjeron PHB (Poirier, Y., Dennis, D.E., Klomparens, K., y Somerville, C.R. Science 256, 520-523, 1992 y la solicitud de patente nº de serie 07/732.243). Una razón posible de esta diferencia es que los plástidos no presentan suficiente 3-cetotiolasa para soportar la producción de PHB. Esto es coherente con la prueba de que las etapas iniciales de la serie de reacciones del mevalonato que conducen desde el acetil-CoA hasta el pirofosfato de isopentenilo están ausentes en los plástidos diferenciados (Kreuz, K. y Kleinig, H. Eur. J. Biochem. 141, 531-535, 1984, Schultz, G. y Schulze-Siebert, D. en Biological Role of Plant Lipids, eds. Biacs P.A., Gruiz, K., y Kremmer, T. (Plenum Publishing Corporation, Nueva York, NY) págs. 313-319, 1989).

A fin de demostrar una secuencia de reacciones biosintéticas completa de PHB en los plástidos de todos los tejidos, se polinizó por cruzamiento A. thaliana transgénica con una gran cantidad de tiolasa (línea TPSS-Thio L) con los híbridos TPSS Red/TPSS-Syn. A partir de cinco combinaciones de cruzamientos, se obtuvieron numerosos híbridos que producen PHB y que presentan por consiguiente las tres enzimas necesarias para la producción de PHB (TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn GHI1, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn-GHI2, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn VWX, TPSS-Thio L/TPSS-Red MNO1/TPSS-Syn VWX). Se identificaron los híbridos que producen PHB en primer lugar por microscopía de epifluorescencia de los tejidos teñidos con azul Nilo A. Las plantas con grandes niveles de fluorescencia presentaban niveles mayores de PHB que las plantas con niveles de fluorescencia comparativamente menores. Se cuantificó a continuación el PHB producido en estos híbridos por cromatografía de gases y se identificó por análisis GC-MS (Figuras 14 y 15). La cantidad de PHB en las hojas en desarrollo de plantas de 20 a 30 días oscilaba entre 20 \mug de PHB/g de peso fresco y 700 \mug de PHB/g de peso fresco (Figura 16 A). Los híbridos triples siguieron acumulando PHB durante la vida de las plantas de modo que en las hojas de las plantas viejas las concentraciones de PHB fueron de 8 a 13 veces mayores que la cantidad en las hojas en desarrollo (es decir, hasta 7 mg de PHB/g de peso fresco) (Figura 16 B). Este aumento en la acumulación de PHB con el tiempo se observó en las plantas con un contenido inicial bajo de PHB (100 \mug/g de peso fresco en las hojas en crecimiento que alcanza 1,1 mg/g en las hojas presenescentes) así como en las plantas con un contenido elevado inicial de PHB (700 \mug/g de peso fresco en las hojas en crecimiento que alcanza 7 mg/g de peso fresco en las hojas presenescentes. En un híbrido TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1, la cantidad máxima de PHB medida en las hojas viejas fue aproximadamente el 14% de su peso en seco (10 mg/g de peso fresco).

Las plantas que producen PHB en el plástido presentaron crecimiento y fertilidad natural incluso al nivel mayor de acumulación de PHB (Figura 17). No se observaron diferencias con el tipo natural en la proporción de germinación de las semillas de híbridos que producen alta concentración de PHB. Sin embargo, las plantas que producen más de 300 a 400 \mug de PHB/g de peso fresco en las hojas en desarrollo podrían distinguirse de las naturales por inspección visual durante las etapas ulteriores de crecimiento. En estas plantas, las hojas presentaban ligera clorosis tras aproximadamente 50 a 60 días de crecimiento, lo que indica que a niveles muy altos de acumulación de PHB (>3 mg de PHB/g de peso fresco) puede estar afectado algún aspecto del metabolismo de los cloroplastos (Figura 18).

La microscopía de transmisión electrónica de las muestras de hojas de híbridos que producen PHB puso de manifiesto que los PHB acumulados como aglomeraciones de gránulos translúcidos a los electrones de aproximadamente 0,2 a 0,7 \mum, se rodeó de una capa fina de material denso en electrones (Figura 19A). Se han descrito gránulos de aspecto similar para el PHB bacteriano (Lundgren, D.G., Pfister, R.M., y Merrick, J.M. J. Gen. Microbiol. 34, 441-446, 1964) o para PHB en el citoplasma, núcleo y vacuolas de células vegetales (Poirier, Y., Dennis, D.E., Klomparens, K. y Somerville, C.R., Science 256, 520-523, 1992 y solicitud de patente nº de serie 07/732.243). En las plantas que expresan las enzimas phb dirigidas al plástido, estas aglomeraciones de gránulos se situaron exclusivamente en los plástidos. Esto está en contraste con las plantas transgénicas que expresan la serie de reacciones biosintéticas de PHB en citoplasmas con PHB acumulado en el núcleo, vacuolas y citoplasma, pero no en el plástido (Poirier, Y., Dennis, D.E., Klomparens, K. y Somerville, C.R., Science 256, 520-523, 1992 y en la solicitud de patente nº de serie 07/732.243). Los gránulos de PHB se distinguieron claramente de los gránulos de almidón en la forma, aspecto y organización de los gránulos como se observó mediante el protocolo de fijación de la microscopía electrónica convencional. Los gránulos de PHB son gránulos pequeños, redondos, translúcidos a los electrones que forman densas aglomeraciones (Figura 17a). En comparación, el almidón aparece en forma de gránulos singulares, más densos que el electrón de forma ovular, rodeados por un área difusa (Figura 19 B). En los trihíbridos que producen únicamente una cantidad de PHB en las hojas en desarrollo, parece por análisis de microscopía electrónica que no todos los cloroplastos acumulaban PHB. La razón de esto no es conocida. No existen indicaciones para la expresión diferencial de los transgenes en diferentes tejidos. Posiblemente, esto podría reflejar simplemente el hecho de que el análisis por microscopía electrónica permite únicamente la inspección de un área pequeña del volumen de plástido total. Ello podría también reflejar la acción de la supresión conjunta que puede conducir a un mosaico de expresión diferencial, tal como se observa en la Petunia (Jorgensen, R. Trends in Biotechnology 8, 340-344, 1990). En las hojas viejas de los trihíbridos que acumulan grandes concentraciones de PHB, casi todos los cloroplastos contenían PHB.

A fin de adquirir conocimientos en los mecanismos responsables de las diferentes cantidades de PHB producido en varios híbridos, se midió el nivel de actividad de la 3-cetotiolasa y de la acetoacetil-CoA reductasa presente en las plantas productoras de PHB en extractos proteicos purificados de la hoja en bruto. Se analizó la PHB sintetasa por análisis de transferencia Western. La actividad de la 3-cetotiolasa en plantas híbridas TPSS-Thio L/TPSS-Red/TPSS-Syn osciló entre 0,001 y 0,8 u/mg de proteína. En cambio, la actividad de la 3-cetotiolasa en las plantas TPSS-Thio L precursoras fue de 0,84\pm0,15 u/mg de proteína. El análisis por transferencia Southern de la línea TPSS-Thio L puso de manifiesto 4 bandas que se hibridaron con el gen phbA, que corresponde probablemente a varias integraciones independientes del constructo (Figura 12A, TPSS-Thio banda 2). Por consiguiente, la segregación de los constructos pBI-TPSS-Thio diferentes pueden haber producido el intervalo de actividades de 3-cetotiolasa en la generación F1. Dicha variación se puede eliminar fácilmente utilizando métodos de cultivo de plantas habituales para desarrollar las líneas de cultivo verdaderas que son homozigóticas para los diversos transgenes de interés. La actividad de la acetoacetil-CoA reductasa en plantas híbridas TPSS-Thio L/TPSS-Red TEF/TPSS-Syn GHI1 osciló entre 0,007 y 0,78 u/mg de proteína. La actividad de acetoacetil-CoA reductasa en el híbrido TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1 que sirvió como precursor en el cruzamiento con TPSS-Thio L fue de 2,09 \pm 0,23 u/mg de proteína. El análisis de transferencia Southern y el análisis de la proporción de segregación del marcador seleccionable en la generación F1 indicó que las plantas TPSS-Red TEF albergan el constructo pBI-TPSS-Red en un punto de integración único (Figura 12b, TPSS-Red banda 1). El análisis de transferencia Western indicó que la actividad reducida estaba correlacionada con una reducción de aproximadamente 10 veces de la cantidad de proteína en los extractos purificados de plantas productoras de PHB. Asimismo, las plantas híbridas productoras de PHB TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn GHI1, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn GHI2, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn VWX y TPSS-Thio L/TPSS-Red MNO1/TPSS-Syn VWX presentaban también amplia variación y actividades de reductasa inesperadamente bajas en comparación con sus plantas precursoras que estaban correlacionadas con las bajas cantidades de proteína en el análisis de transferencia Western. La razón para la cantidad variable e inusualmente baja de la actividad de la reductasa en los trihíbridos no se puede explicar por cambios en el número de copia del constructo pBI-TPSS-Red. Esta variabilidad se cree que es debida al hecho de que todos los transcritos de los genes phb modificados contienen una secuencia común de 243 bp, es decir la zona de codificación del péptido de tránsito (TPSS) (Figura 3). La ganancia de uno o más genes de tiolasa modificados con la zona de codificación del TPSS podría regular por disminución otros genes que contienen TPSS, tal como TPSS-Red, por el mecanismo de supresión conjunta (Jorgensen, R. Trends in Biotechnology 8, 340-344, 1990, Seymour, G.B., Fray, G.R., Hill, P. y Tucker G.A. Plant Mol. Biol. 23, 1-9, 1993). La supresión conjunta puede también proporcionar una explicación de por qué en el examen por microscopía de transmisión electrónica, algunas células parece que están llenas de PHB mientras que las células adyacentes no presentaban PHB. Por consiguiente, a fin de evitar la supresión conjunta y aliviar la expresión variable y baja de los genes phb en las plantas que producen PHB, todos los genes phb deberían estar modificados para el direccionamiento del plástido mediante la adición de un péptido de tránsito diferente para cada uno de los genes phb introducidos. Las secuencias no están actualmente disponibles para docenas de diferentes proteínas localizadas en los cloroplastos incluyendo las secuencias de sus péptidos de tránsito. Por consiguiente, los métodos para las mejoras de la presente invención mediante la sustitución de parte o todos los péptidos de tránsito aminoterminales utilizados en este ejemplo por el de una proteína localizada normalmente en el cloroplasto será evidente para un experto en la
materia.

La presencia de PHB sintetasa fue investigada mediante análisis de transferencia Western de extractos de proteína de las hojas de las plantas productoras de PHB. En las plantas híbridas TPSS-Thio/TPSS-Red/TPSS-Syn, la PHB sintetasa no pudo detectarse nunca en la fracción proteica soluble. Sin embargo, la PHB sintetasa se pudo detectar fácilmente en la transferencia Western de la membrana solubilizada y en las fracciones en forma de partícula de los extractos vegetales. En cambio, en las plantas transformadas solamente con pBI-TPSS-Syn, PHB sintetasa se pudo detectar en la fracción soluble (Figura 20). Este descubrimiento sugiere que la PHB sintetasa está íntimamente relacionada con los gránulos de PHB formados en las plantas como se demuestra para la PHB sintetasa en bacterias (Fukui, T., Yoshimoto, A., Matsumoto, M., Hosokawa, S. Saito, T., Nishikawa, H., y Tomita, K. Arch. Microbiol. 110, 149-156, 1976, Haywood, G.W., Anderson, A.J. y Dawes E.A. FEMS Microbiol. Lett. 57, 1-6, 1989).

En general, las plantas transgénicas con los niveles mayores de actividades de 3-cetotiolasa y acetoacetil-CoA reductasa presentaban los niveles más altos de PHB y plantas con bajos niveles de ambas actividades presentaban los niveles más bajos de PHB. No existió ninguna meseta obvia en la producción de PHB a los niveles más altos de actividad enzimática mensurable. Por consiguiente, parece que la acumulación de PHB estaba limitada por la cantidad de actividad enzimática más bien que por la disponibilidad de acetil-CoA. Por consiguiente, sería posible aumentar la cantidad de PHB producido en las plantas transgénicas más allá de la cantidad descrita en la presente solicitud de patente aumentando la cantidad de varias enzimas phb producidas en las plantas. Una forma de conseguir esto es impedir el fenómeno de la supresión conjunta de los genes phb modificados que poseen el mismo péptido de tránsito (para direccionamiento al plástido) utilizando una secuencia de direccionamiento al plástido diferente para cada uno de los genes phb introducidos en las plantas. Asimismo puede ser posible aumentar la cantidad de enzimas phb producidas en las plantas transgénicas utilizando activadores potentes que conducen a un nivel de expresión mayor que el posible con los activadores CaMV o CRB utilizados en estos experimentos. Debido a que la utilización del codón de las secuencias de codificación bacterianas de los genes phb no es típico para las plantas superiores, debería también ser posible aumentar la expresión de las enzimas alterando la secuencia de codificación de los genes bacterianos de modo que la secuencia de aminoácidos esté codificada por codones que son los utilizados más frecuentemente por la planta superior en la que se expresan los genes.

En resumen, las plantas modificadas genéticamente para expresar la serie biosintética de PHB en sus plástidos acumulan PHB en grandes cantidades. Cambiando la colocación de la producción de PHB desde un compartimento celular con un flujo bajo a través de acetil-CoA (citoplasma) hasta un compartimento con un flujo elevado a través de acetil-CoA (plástido) el nivel máximo de producción de PHB aumentó hasta 100 veces (desde aproximadamente 100 \mug por gramo de peso fresco para la expresión citoplásmica, tal como se describe en Poirier, Y., Dennis, D.E., Klomparens, K. y Somerville, C.R., Science 256, 520-523, 1992 y en la solicitud de patente nº de serie 07/732.243, hasta aproximadamente 10 mg por gramo de peso fresco para la expresión del plástido, tal como se describe en la presente solicitud). Las plantas que producen grandes niveles de PHB en los plástidos presentaban crecimiento y vigor normales. Esto indica que PHB no es tóxico para las plantas y que parece que no es una barrera biológica para la producción de PHB en los plástidos. La eliminación de metabolitos de la serie de reacciones metabólicas esenciales del citoplasma parece haber sido la razón para el efecto perjudicial de la producción de PHB en las plantas que expresan los enzimas de PHB en el citoplasma (Poirier, Y., Dennis, D.E., Klomparens, K. y Somerville, C.R., Science 256, 520-523, 1992 y solicitud de patente nº de serie 07/732.243). Sin embargo, ya que los gránulos de PHB estaban también situados en el núcleo, podría ser posible que la interacción de los gránulos de PHB con los constituyentes nucleares fuese también una causa del efecto perjudicial de la producción de PHB en estas plantas.

Un análisis similar se realizará con las plantas transgénicas que expresan los genes phb modificados bajo el control del activador CRB específico de la semilla. Las plantas transformadas con pBIB-KCN-Red, que producen una cantidad sustancial de acetoacetil-CoA reductasa en el plástido de las semillas en desarrollo, se polinizarán por cruzamiento con plantas transformadas con pBIB-HCN-Syn, que producen una cantidad sustancial de PHB sintetasa en el plástido de las semillas en desarrollo. La producción de PHB en las semillas en los híbridos resultantes se analizará mediante análisis GC-MS y microscopía electrónica. Ya que no es obvio que la cantidad de acetoacetil-CoA endógeno en el plástido de la semilla en desarrollo sea suficiente para permitir la producción de PHB, para crear un trihíbrido se introducirá la 3-cetotiolasa modificada para el direccionamiento del plástido en el plástido de la semilla en desarrollo. A fin de crear un trihíbrido que produzca las tres enzimas, los híbridos dobles de reductasa/sintetasa se polinizarán por cruzamiento con plantas transgénicas que expresan la 3-citotiolasa en el plástido de las semillas en desarrollo. La gran cantidad de PHB producido en las semillas de los trihíbridos de tiolasa/reductasa/sintetasa resultantes se analizarán por GC-MS y microscopía electrónica.

Este método para la producción de PHB en los plástidos no está limitado a la utilización de plantas híbridas producidas por cruzamiento de varias líneas transgénicas. Una aplicación alternativa preferida del método implicaría la colocación de los tres genes en una molécula de ADN colineal para la introducción simultánea en el interior de la planta anfitriona. Se observa además que el método general para producir grandes niveles de producción de PHB descritos en la presente memoria son métodos generalmente aplicables a todas las plantas superiores y que las modificaciones menores de los métodos que pueden ser requeridas para introducir y producir la expresión de los genes y el transporte de las proteínas al interior de los plástidos en otras especies de plantas superiores será evidente para los expertos en la materia.

Materiales y métodos Construcción de ADN recombinantes

La cepa DH5\alpha de E. coli que alberga plásmidos se desarrolló en caldo de cultivo LB enriquecido con kanamicina (50 \mug/ml) o ampicilina (50 \mu/ml). Las preparaciones del ADN del plásmido se realizaron por el procedimiento de lisis alcalina descrito por Sambrook, J., Fritsch, E.F y Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y si es necesario una purificación en las minicolumnas mágicas de afinidad al ADN (Promega Corp., WI). El ADN del plásmido se escindió con endonucleasas de restricción según las recomendaciones de los fabricantes (New England Biolabs, Mass; Promega Corp., WI; Boehringer Mannheim Biochemicals, IN; Stratagene, CA), separadas por electroforesis en gel de agarosa y observadas mediante coloración con bromuro de etidio tal como describen Sambrook, J., Fritsch, E.F y Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Los fragmentos de ADN se recuperaron del gel de agarosa por un método de congelación y descongelación y extracciones con fenol. En resumen, el fragmento de agarosa se corta en secciones en piezas muy pequeñas con una cuchilla de afeitar, se añade el mismo volumen de fenol (preparado como se describe en Sambrook, J., Fritsch, E.F y Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) y se agita a fondo. Se congela y se descongela dos veces la suspensión y posteriormente se centrifuga. El fragmento que contiene sobrenadante se purifica además mediante extracciones con fenol-cloroformo y precipitación en etanol. En algunos experimentos, los terminales 3' acoplados de los fragmentos de ADN se transformaron en terminales truncados con T4 ADN polimerasa utilizando el protocolo descrito en Sambrook, J., Fritsch, E.F y Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). La ligadura de los fragmentos de ADN con terminales unidos o truncados se realizó a 14ºC durante 16 h en tampón que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 5 mM, polietilenglicol 8000 al 5% (p/v), ATP 0,5 mM y ditiotreitol 5 mM descrito por Sambrook, J., Fritsch, E.F y Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Una fracción de la reacción de ligadura se transfirió al interior de E. coli por el método del cloruro de rubidio tal como describe Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166: 557-580 (1983). Las bacterias transformadas se colocaron en placas de agar-agar que contenían caldo de cultivo LB y 50 \mug/ml de kanamicina o 50 \mug/ml de ampicilina. La preparación de sondas radiomarcadas de ADN y la hibridación se describen en el apartado siguiente.

Los oligonucleótidos fueron sintetizados por el complejo bioquímico en la Universidad del estado de Michigan.

Se realizó la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando un ciclador térmico de ADN Perkin-Elmer Cetus (Perkin-Elmer, CT). La mezcla de reacción contenía 200 pmoles de 2 cebadores de oligonucleótidos por PCR (Tabla 1), 200 ng de plásmido (Tabla 1) y 2,5 unidades de polimerasa Vent en condiciones tampón recomendadas por el suministrador (New England Biolabs Inc, Mass.). El programa del ciclador térmico de ADN para las amplificaciones de las enzimas PHB bacterianas fue el siguiente: 4 min a 95ºC, 30 ciclos de la secuencia 1,5 min a 97ºC-2 min a 65ºC-3 min a 72ºC y por último 7 min a 72ºC. Para el fragmento de TPSS: 4 min a 95ºC, 30 ciclos de la secuencia 1,5 min a 95ºC-2 min a 60ºC-2 min a 72ºC y por último 7 min a 72ºC y para el activador de CRB: 4 min a 95ºC, 30 ciclos de la secuencia 1,5 min a 95ºC-2 min a 58ºC-2 min a 72ºC y por último 7 min a 72ºC. Los productos de PCR se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron según se describió anteriormente.

Extracción y escisión de la endonucleasa de restricción del ADN genómico

Se cultivaron plantas naturales y transgénicas en el suelo durante 2 a 3 semanas, se recogió aproximadamente 5 g de material foliar y se congeló en nitrógeno líquido. Se extrajo ADN de alto peso molecular de los tejidos vegetales congelados tal como describen Rogers, S.C. y Bendich, A.J., Plant Molecular Biology Manual A6: 1-10 (1988). La escisión en endonucleasa de restricción con la enzima HindIII en 1 \mug de ADN se realizó en las condiciones recomendadas por el fabricante (New England Biolabs Inc, Mass.).

Electroforesis en gel de agarosa y procedimiento de hibridación

Se realizó el análisis del ADN por electroforesis en gel de agarosa y la transferencia a membranas de nilón (Hybond-N, Amersham, II.) utilizando los procedimientos demostrados descritos por Southern et al. (1975) y Sambrook, J., Fritsch, E.F y Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Los fragmentos específicos del ADN clonado que se deben utilizar como sondas se escindieron a partir del vector con endonucleasas de restricción apropiadas, se purificaron las inserciones del vector por electroforesis en gel de agarosa y electroelución. Se marcaron los fragmentos con ^{32}P-desoxirribonucleótidos por el método aleatorio de extensión del cebador utilizando hexámeros según describe Feinberg, A.P. y Volgelstein, B., Anal. Biochem. 132, 6-13 (1983). Se hibridaron filtros de nilón con sondas marcadas y se expusieron sobre la película según describe Poirier, Y. y Jolicoeur, P., J. Virol. 63, 2088-2098 (1989).

Construcción de las proteínas de fusión y producción de anticuerpos

Para la producción de anticuerpos contra la 3-cetotiolasa, acetoacetil-CoA reductasa y PHB sintetasa de proteínas de fusión de A. eutrophus con la proteína que se une a la maltosa, se construyeron malE de E. coli utilizando el vector pIH821 (New England Biolabs Inc, Mass.). Se construyó la proteína de fusión MALE-Tiolasa purificando el fragmento XhoII-EcoRI de 1,2 kbp del plásmido pUC-Thio (Somerville, C. R., Poirier, Y. y Dennis, D. E., solicitud de patente nº de serie 07/732.243), rellenando los extremos con T4-ADN polimerasa y clonándolo en pIH821. El vector se había preparado por digestión con XbaI y rellenando el extremo con T4-ADN polimerasa. Los clones que llevan la inserción en la orientación deseada contienen la fusión génica que manera que el marco de lectura es correcto para obtener la fusión MALE-Thiolasa. El plásmido se denominó pmalE-Thio.

Para obtener la proteína de fusión MALE-reductasa se digirió el plásmido pUC-Red (Somerville, C. R., Poirier, Y. y Dennis, D. E., solicitud de patente nº de serie 07/732.243) con DdeI y SacI. Tras la purificación del fragmento de 0,7 kbp, se rellenaron los extremos con T4-ADN polimerasa. Se clonó el fragmento con los terminales truncados en el XbaI digerido y en el vector pIH821 con los extremos truncados según se describió anteriormente. El clon que contiene el fragmento en la orientación exacta para la expresión de la expresión de MALE-reductasa se denominó pmaIE-Red.

Para la construcción de la proteína de fusión MALE-sintetasa se digirió pUC-Syn con NcoI y se rellenaron los extremos con T4-ADN polimerasa. Posteriormente, se digirió el plásmido con HindIII y se clonó el fragmento de 1,6 kbp en el pIH821. El vector había sido preparado mediante digestión con XbaI y rellenando el extremo con T4 ADN polimerasa y digiriendo posteriormente con HindIII. Los clones se denominaron pmaIE-Syn.

Se transformaron los plásmidos pmaIE-Thio, -Red y -Syn en DH5\alpha y las proteínas de fusión se expresaron y purificaron tal como describe el fabricante (New England Biolabs Inc, Mass.). Se inyectaron las proteínas de fusión en conejos para producir anticuerpos policlonales utilizando adyuvantes de Freund como inmunoestimulantes.

Análisis de la actividad de 3-cetotiolasa

Se homogeneizaron muestras de hojas congeladas (0,1 g) en 200 \mul de tampón de tiolasa enfriado en hielo que contenía Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), MgCl_{2} 40 mM y \beta-mercaptoetanol 5 mM. Se purificó el homogeneizado por centrifugación a 10.000 \times g durante 5 min y se transfirió el sobrenadante a un tubo fresco. El contenido en proteína del extracto se midió por el análisis de Bradford utilizando el kit de análisis de proteína Bio Rad (Bio Rad Laboratories, CA). Se utilizaron entre 3 y 30 \mug de extracto de proteína vegetal por análisis. Se analizó la actividad de la enzima 3-cetotiolasa en los diferentes extractos según el procedimiento de Senior, P.J. y Dawes, E.A., Biochem. J. 134: 225-238, 1973.

Análisis de la actividad de acetoacetil-CoA reductasa

Se homogeneizaron muestras de hojas congeladas (0,1 g) en 200 \mul de tampón de reductasa enfriado en hielo que contenía KH_{2}PO_{4} 100 mM (pH 5,5), MgCl_{2} 0,02 mM y \beta-mercaptoetanol 4,0 mM. Se purificó el homogeneizado por centrifugación a 10.000 \times g durante 5 min y se transfirió el sobrenadante a un tubo fresco. El contenido en proteína del extracto se midió por el análisis de Bradford utilizando el kit de análisis de proteína Bio Rad. Se utilizaron entre 0,8 y 10 \mug de extracto de proteína vegetal por análisis. Se analizó la actividad de la enzima acetoacetil-CoA reductasa según el procedimiento de Senior, P.J. y Dawes, E.A., Biochem. J. 134: 225-238, 1973.

Análisis de transferencia Western

Para los análisis de transferencia Western, se utilizaron extractos de proteína en bruto preparados según se describió anteriormente para los análisis de actividad enzimática. Para el análisis de la expresión de la PHB sintetasa se homogeneizaron muestras de hojas congeladas (0,1 g) en 200 \mul de tampón enfriado en hielo que contenía Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), EDTA 5 mM y \beta-mercaptoetanol 4 mM. Se purificó el homogeneizado por centrifugación a 10000 \times g durante 5 min y se transfirió el sobrenadante a un tubo fresco. En algunos experimentos, la membrana y las fracciones en partículas se solubilizaron parcialmente en tampón de extracción que contenía SDS al 1% y se purificó otra vez por centrifugación. El contenido en proteína de estas muestras se midió por un método de Lowry modificado (Markwell, M.A.K., Haas, M., Bieber, L.L. y Tolbert, N.E., Anal. Biochemistry 87, 206-210 (1978).

Se separaron alícuotas de los sobrenadantes por electroforesis en gel de dodecilsulfatopoliacrilamida (SDS PAGE) según Laemmli, Nature 227: 680-685, 1970. Se transfirieron por electroforesis las proteínas a filtros de nitrocelulosa. Se realizó el análisis de transferencia Western según se recomienda en el protocolo ECL de transferencia Western (Amersham International plc, Amersham UK). Para el bloqueo de los filtros TBS (Tris-HCl 20 mM, pH 7,6, NaCl 137 mM) con 5% de leche en polvo exenta de grasa se seleccionó Tween 20 al 0,12%. Se diluyó el primer anticuerpo 1:1000 en solución de bloqueo antes de incubar los filtros. La reacción del anticuerpo se detectó mediante el sistema de detección ECL de transferencia Western (Amersham International plc, Amersham UK).

Análisis de polihidroxibutirato

Para los análisis por cromatografía de gases, se extrajeron 20 a 100 mg de material foliar 3 a 4 veces con etanol al 50% y a continuación con metanol al 100% durante 45 minutos-1 h a 55ºC. Se extrajeron los residuos secos a 55ºC con 0,5 ml de cloroformo durante por lo menos 12 h y se transesterificaron durante 4 a 6 h en HCl 0,8 M en etanol a 100ºC. Tras la extracción con NaCl 0,9 M, se analizó la fase de cloroformo en un cromatógrafo de gases Hewlett Packard 5890 serie II. Se utilizó PHB bacteriano (Sigma) como patrón. Para la observación de los gránulos de PHB por microscopía de epi-fluorescencia se fijaron las muestras foliares en glutaraldehído al 2% en tampón de fosfato 10 mM (pH 7,2) durante 2 h. Se enjuagaron los tejidos en agua y se tiñeron durante 5 min en azul Nilo A al 1%. Se enjuagaron los tejidos varias veces en agua y se remojaron 1 min en ácido acético al 8% seguido de un enjuague final con agua. Se observaron los gránulos de PHB por microscopía de epi-fluorescencia bajo una longitud de onda de excitación de 546 ó 565 nm (Ostle, A.G. y Holt J.G. Appl. Environ. Microbiol. 44, 238-241, 1982).

Microscopía de transmisión electrónica

Se fijaron muestras de tejidos en glutaraldehído al 0,8%/paraformaldehído al 2% en tampón de fosfato 0,01 M (pH 7,2) durante 2 h en un vacío ligero. Tras 4 lavados con tampón de fosfato, se trataron las muestras con tetróxido de osmio al 1% durante 40 a 60 min. Se deshidrataron las muestras en una serie escalonada de etanol y se insertaron en resina de Spurr (Ted Pella Inc.). Se cortaron secciones de 80 a 90 nm, se colocaron en rejillas de cobre y se tiñeron con acetato de uranilo al 5% durante 30 a 45 min, seguido de tinción con citrato de plomo de Reynolds durante 3 a 4 minutos. Se observaron las secciones en un microscopio electrónico de transmisión JEOL100CX II operado a 80 kV.

Aunque el ejemplo específico de la invención descrito en la presente memoria implicaba la planta Arabidopsis thaliana, los genes de Alcaligenes eutrophus y un péptido de tránsito del guisante, la invención es de utilidad general. Las reivindicaciones correspondientes a la producción de poli-D-(-)-3-hidroxibutirato y/o de polihidroxialcanoato en los plástidos de las plantas no se limitan a Arabidopsis thaliana ni están ligadas específicamente a la utilización de genes de Alcaligenes eutrophus ni al péptido de tránsito descrito para el direccionamiento del plástido. Las reivindicaciones descritas a continuación describen un método general para la producción de polihidroxialcanoato en el plástido de las plantas mediante la introducción de material de ADN extraño en el interior de las células vegetales.

Las mejoras en la presente invención son:

1: La transformación de células vegetales con material de ADN que codifica la información que conduce a la producción en el plástido de una enzima que posee actividad de 3-cetotioasa. La expresión "material de ADN extraño" se refiere al material de ADN que normalmente no está presente en un organismo, pero que se introduce en una célula y reside ya sea integrado en el cromosoma o reside en forma extracromosómica. Un aumento en la actividad de 3-cetotiolasa en los plástidos de las células vegetales procede de la introducción del material de ADN extraño en el interior de las células vegetales.

2: La transformación de células vegetales con material de ADN que codifica la información que conduce a la producción en los plástidos de una enzima que posee actividad de acetoacetil-CoA reductasa. Un aumento en la actividad de acetoacetil-CoA reductasa en los plástidos de las células vegetales procede de la introducción del material de ADN extraño en el interior de las células vegetales.

3: La transformación de las células vegetales con un material de ADN extraño que conduce a la producción de hidroxiacil-CoA en los plástidos que resulta extraña a la célula vegetal. La transformación de células vegetales con material de ADN extraño que conduce a la producción de un aumento de concentración de hidroxiacil-CoA en los plástidos de las plantas.

4: La transformación de células vegetales con material de ADN que codifica la información que conduce a la producción en los plástidos de una enzima que posee capacidad de polimerizar hidroxiacil-CoA reductasa de células vegetales. Un aumento en la actividad enzimática conduce a la polimerización de hidroxiacil-CoA en los plástidos de las células vegetales procede de la introducción del material de ADN extraño en el interior de las células vegetales.

5: La producción de un polihidroxialcanoato, incluyendo poli-D-(-)-3-hidroxibutirato, en los plástidos de células vegetales mediante la introducción de material de ADN extraño dentro de las células vegetales.

6: La producción de polihidroxialcanoato en los plástidos de células vegetales, es preferentemente a un nivel mayor de 2 \mug de polihidroxialcanoato por gramo de material vegetal fresco.

7: La producción de polihidroxialcanoato en los plástidos se realiza preferentemente a una concentración mayor de 2 \mug de polihidroxialcanoato por gramo de material vegetal fresco, en cualquier célula vegetal para la cual sea posible introducir material de ADN extraño.

8: La producción de polihidroxialcanoato en los plástidos de plantas híbridas se realiza preferentemente a una concentración mayor de 2 \mug de polihidroxialcanoato por gramo de material vegetal fresco, procedente de la polinización por cruzamiento entre dos líneas de plantas precursoras que han sido transformadas con material de ADN extraño, pero que por sí mismas no producen polihidroxialcanoato en los plástidos o producen polihidroxialcanoato a una concentración menor que la producida en la planta híbrida.

9: La producción de polihidroxialcanoato en forma de gránulos en el interior de los plástidos de las células vegetales.

Las semillas que contienen los genes de las Figuras 3 y 4 se conservan en la Universidad del estado de Michigan, East Lansing, Michigan.

Se pretende que la descripción anterior sea únicamente ilustrativa de la presente invención y que la presente invención esté limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas a la presente memoria a continuación.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): Solicitante: Christopher R. Somerville, Christiane Nawrath, Yves Poirier

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(ii): Título de la invención: Procedimiento para la producción de polihidroxibutirato y polihidroxialcanoatos relacionados en los plástidos de las plantas superiores

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(iii): Número de secuencias: 3

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(iv): Dirección de la correspondencia:

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(A): Destinatario: Ian C. McLeod

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(B): Calle: 2190 Commons Parkway

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(C): Ciudad: Okemos

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(D): Estado: Michigan

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(E): País: Estados Unidos

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(F): Código postal: 48864

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(v): Forma legible por ordenador:

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(A): Tipo de soporte: Disquete 5,25 pulgadas, almacenamiento 360 kb

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(B): Ordenador: Acer

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(C): Sistema operativo: MS-DOS (versión 3.3)

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(D): Programa informático: Wordperfect 5.1

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(vi): Datos actuales de la solicitud:

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(A): Número de solicitud:

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(B): Fecha de presentación:

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(C): Clasificación:

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(vii): Información sobre aplicaciones anteriores

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(A): Número de solicitud: 08/108.193 y 07/732.243

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(B): Fecha de presentación: 17 de agosto de 1993 y 19 de julio de 1991

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(viii): Información del consultor o apoderado:

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(A): Nombre: Ian C. MacLeod

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(B): Número de registro: 20.931

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(C): Número de referencia/etiqueta: MSU 4.1-222

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(ix): Información de telecomunicaciones:

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(A): Teléfono: (517) 347-4100

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(B): Fax: (517) 347-4103

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(2) Informaciones para la SEC ID nº 1:

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(i): Características de la secuencia:

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(A): Longitud: 1431 pares de bases

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(B): Tipo: ácido nucleico

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(C): Clase de cadenas: doble

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(D): Configuración: lineal

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(ii): Tipo de molécula:

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(A): Descripción: ADN genómico

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(iii): HIPOTÉTICA: No

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(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: No

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(vi): FUENTE ORIGINAL:

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(A): Organismo: Alcaligenes eutrophus

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(vii): FUENTE INMEDIATA:

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(A): Banco: Genómico

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:

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2

3

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(2) Informaciones para la SEC ID nº 2:

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(i): Características de la secuencia:

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(A): Longitud: 990 pares de bases

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(B): Tipo: ácido nucleico

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(C): Clase de cadenas: doble

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(D): Configuración: lineal

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(ii): Tipo de molécula:

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(A): Descripción: ADN genómico

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(iii): HIPOTÉTICA: No

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(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: No

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(vi): FUENTE ORIGINAL:

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(A): Organismo: Alcaligenes eutrophus

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(vii): FUENTE INMEDIATA:

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(A): Banco: Genómico

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:

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4

5

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(2) Informaciones para la SEC ID nº 3:

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(i): Características de la secuencia:

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(A): Longitud: 2019 pares de bases

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(B): Tipo: ácido nucleico

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(C): Clase de cadenas: doble

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(E): Configuración: lineal

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(ii): Tipo de molécula:

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(A): Descripción: ADN genómico

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(iii): HIPOTÉTICA: No

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(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: No

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(vi): FUENTE ORIGINAL:

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(A): Organismo: Alcaligenes eutrophus

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(vii): FUENTE INMEDIATA:

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(A): Banco: Genómico

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:

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6

7

8

Claims

1. Material vegetal transgénico que tiene plástidos, estando dicho material vegetal caracterizado porque contiene un primer segmento génico que codifica un gen modificado de 3-cetotiolasa, destinado al direccionamiento al plástido de la planta un segundo segmento génico que codifica un gen modificado de acetoacetil-CoA reductasa, destinado al direccionamiento al plástido de la planta, y un tercer segmento génico que codifica un gen modificado de polihidroxibutirato (PHB) sintetasa destinado al direccionamiento al plástido de la planta, en el que los segmentos génicos permiten la producción de un polihidroxialcanoato (PHA), caracterizado porque cada gen presenta una secuencia de codificación para un péptido de tránsito y cada péptido de tránsito es diferente.

2. Material vegetal según la reivindicación 1, en el que el PHA es polihidroxibutirato (PHB) y en el que las secuencias de codificación del ADN y del ARN destinadas a la 3-cetotiolasa son tal como se representan en la SEC. ID. nº: 1, la acetoacetil-CoA reductasa es tal como se representa en la SEC. ID. nº: 2 y la PHA sintetasa es tal como se representa en la SEC. ID. nº: 3.

3. Material vegetal según la reivindicación 1 ó 2, en forma de embrión, semilla o propágulo de las semillas.