JPH09501832A

JPH09501832A - 高等植物の色素体においてポリヒドロキシブチレートおよび関係するポリヒドロキシアルカノエートを生産する方法

Info

Publication number: JPH09501832A
Application number: JP7507156A
Authority: JP
Inventors: ローランドソマービル，クリストファー; ナウラス，クリスチャン; ポワリエ，イブ
Original assignee: Michigan State University MSU
Current assignee: Michigan State University MSU
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1994-08-17
Publication date: 1997-02-25
Also published as: HK1013110A1; AU7633094A; WO1995005472A3; EP0719342B1; ATE295894T1; WO1995005472A2; EP0719342A1; ES2240965T3; US5610041A; DE69434377D1; DE69434377T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）および関係するポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を植物の色素体において生産する方法に関する。ＰＨＢの生産は、微生物からの修飾された遺伝子で植物を遺伝的に形質転換することによって達成される。これらの遺伝子は、アセチル−ＣｏＡまたは関係する代謝物からＰＨＢを合成するために要求される酵素をコードし、そして色素体に酵素を標的化するために追加の植物の配列と融合される。

Description

【発明の詳細な説明】高等植物の色素体においてポリヒドロキシブチレートおよび関係するポリヒドロキシアルカノエートを生産する方法発明の背景（１）発明の分野この特許は、高等植物におけるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）と呼ぶあるクラスの物質の生産を改良する発明に関する。ＰＨＡはヒドロキシ酸の線状ポリエステルから構成された細菌のポリマー物質の１グループであり、そして熱可塑性を有する。ＰＨＡの低いレベルの生産は、１９９１年７月１９日提出の米国特許出願第０７／７３２，２４３号に記載されているように、ＰＨＡ合成に関係する細菌の遺伝子で形質転換されたアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）において証明された。高等植物において大量のＰＨＡを生産するために、ＰＨＡの生産のための酵素は、ＰＨＡ合成のための前駆体を高いレベルで有する細胞下区画、すなわち色素体、の中に位置しなくてはならない。アセチル−ＣｏＡからのＰＨＡの合成に関係するアルカリゲネス・エウトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）の３つの遺伝子を修飾して、本発明の具体例として対応する酵素をアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の細胞の色素体に標的化した。（２）関係技術の説明多種の細菌による炭素貯蔵物として、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、即ち、３−ヒドロキシ酸のポリエステルが生産される(Anderson、A.j.および Dawes、E.A.、Microbiol.Rev.54:450-472、1990) 。ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、即ち、最も最も広くかつ完全に特性決定されたＰＨＡは、生物分解性でありかつ生物適合性の熱可塑性物質である。ＰＨＡの生産についての研究は、短鎖ＰＨＡ（Ｃ₃−Ｃ₅単位）を生産するアルカリゲネス・エウトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）に主として集中してきた。アルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）において、ＰＨＢはアセチル−ＣｏＡから３つの酵素の順次の作用により合成される（第１図）(Steinbu chel、A．およびSchlegel、H.G.、Mol.Microbiol.5: 535-542、1991)。この経路の第１酵素である３−ケトチオラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）は、アセトアセチル−ＣｏＡを形成する２つのアセチル−ＣｏＡ部分の可逆的縮合を触媒する。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３６）は引き続いてアセトアセチル−ＣｏＡをＤ−（−）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに還元し、次いでこれはＰＨＢシンターゼの作用により重合してＰＨＢを形成する。ＰＨＢは１０⁵〜１０⁶モノマー単位のポリマーとして生産され、このポリマーは直径０．２〜０．５μｍの顆粒で蓄積され、各顆粒はほぼ１０００のポリマー鎖を含有する(Anderson、A.J.および Dawe s、E.A.、Mic robiol.Rev.54:450-47 2、1990)。グルコースを含有する培地の中で増殖させるとき、アルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）は典型的にはＰＨＢを８０％の乾燥重量まで蓄積する。前述の３つのｐｈｂ生合成酵素をコードする遺伝子は、アルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）からクローニングされてきた(Peoples、O.P．およびSinskey、A.J.、J.Biol.Chem．264: 15293-15297、1989 およびJ.Biol.Chem.264:15298-15303、1989;Slater、S.C.、Vo ige W.H.およびDennis、D.E.、J.Bacteriol.170:4431-4436 、1988、Schubert、P.、 Steinbuchel 、A．およびSchlegel、H.G.、J.Bacteriol.170:5837-5847、1988)。ＰＨＢホモポリマーに加えて、アルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）および他の細菌種はある数の異なるＣ₃−Ｃ₅モノマーを種々の比で含有するポリマーを生産することができる。これらのモノマーの特質および性質は増殖培地の中に供給される炭素源により影響を受ける。例えば、プロピオン酸またはペンタン酸を発酵の供給原料に供給するとき、３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）および３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）の両方のモノマーを含有するランダムコポリマーは、それぞれ、４０モル％〜９０モル％の３ＨＶ単位の最大で生産される(Anderson、A.j.およびDawes、E.A.、Microbiol .Rev.54:450-472、1990)。これらのＰＨＡコポリマーは、Ｃ₃−Ｃ₅有機酸の補酵素Ａチオエステル誘導体を使用して、同一ＰＨＢシンターゼにより合成される。ＰＨＢおよびＰＨＢを含有するコポリマーに加えて、Ｃ₆〜Ｃ₁₂の領域のモノマー単位を含有するＰＨＡの他の一般的クラスが存在する。シュードモナス・オレバランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｖｏｒａｎｓ）は、ｎ−アルカンまたはｎ−アルカン酸を増殖培地の中に供給するとき、中鎖（Ｄ）−ヒドロキシ酸を含有するＰＨＡを合成するプロトタイプの細菌である。これらのＰＨＡのうちで研究された最良のものはポリオキシオクタノエートであり、これはオクタノエートを含有する培地の中でシュードモナス・オレバランス（Ｐ．ｏｌｅｖｏｒａｎｓ）を増殖させるとき蓄積される(Huisman、G.W.、de Leeuw 、O.、Eggink、G.、およびWitholt、B.、Appl.Environ.Microbiol.54:2924、1988)。さらに、発酵の供給原料の操作により、不飽和または分枝鎖状のモノマーを有し、ならびに塩化物またはフッ化物の側面の基を有するユニークなポリマーを得ることができる(Doi、 Y.(編)、Micorbial polyesters、Chpt.3、VCH Publisher、New York(1990)。ＰＨＢは、堅く、比較的脆い熱可塑性物質である(Doi、Y.(編)、Micorbial Poly esters、Chpt.6、VCH Publisher、New York、1990;Holmes、P.A.、Developments in cr ystalline polymers-2 、Basset、D.C.(編)、1-65、1988)。ポリマーの中への３ＨＶモノマーの組み込みはＰＨＢに比較して結晶化度および融点の減少に導き、ポリマーの堅さを減少させそして靭性を増加し、多数の商業的応用のためにいっそう適当なＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）および他の関係するコポリマーを作る。また、種々のポリマーおよび可塑剤をＰＨＢにブレンドしてその物理的特性を改良することが可能である(Holmes、P.A.、Developments in crystalline plymer-2、 Basset、D.C.(編)、1-65、1988)。ＰＨＢはすぐれた紫外線耐性を有するが、酸および塩基ならびに有機溶媒に対する耐性が一般に劣る。ＰＨＢはすぐれた酸素不透過性を有し、そして湿った空気の中の加水分解的分解に対して耐性である。これらの性質により、ＰＨＢは広い範囲の商品、例えば、家庭用容器、バッグおよび包装フィルム、のためのプラスチック源として魅力的である。ＰＨＢと対照的に、長鎖ＰＨＡは４０〜６０℃の融点範囲をもつエラストマーである(Gross、R.A.、 De Mello、C.、Lenz、R.W.、Brandl、H．およびFuller、R.C.、Macromolecules 22:1106、 1989)。これらのＰＨＡの物理的性質を、なお、完全に特徴づけなくてはならない。ＰＨＢおよび関係するコポリマーは、土壌、スラッジおよび海水の中で容易に分解される。例えば、３０℃の土壌の中で、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）コポリマーおよびＰＨＢのホモポリマーは、それぞれ、２週および１０週で分解する(D oi、Y.(編)、Micorbial Polyesters、Chpt.1、VCH Publishers、New York、1990)。多くの細菌および真菌は、これらのポリマーを活性的に分解できることが示された (Dawes、E.A．およびSenior、P.J.、Adv.Microb.Physiol.10:135-266(1973)。細胞外ＰＨＢデポリメラーゼおよびヒドロラーゼが、アルカリゲネス・フェカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆｅｃａｌｉｓ）を包含する、いくつかの細菌から単離された。従って、ＰＨＢはモノマーの３ＨＢ単位に分解され、これらの単位は細菌および真菌の増殖のための炭素源として使用されうる。さらに、ＰＨＢは非常に生体適合性であり、これにより縫合糸のフィラメントおよび薬物担体のような医学的応用のために潜在的に魅力的である(Koosha、F.、Muller、R.H.および Davis、S.S.、Critical reviews in therapeutic drug carrier system、6:117-129 、1989)。ＰＨＢが分解すると、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸、即ち、血液の中に通常存在する代謝物、が生成する。ＰＨＢの生物分解性は、商品の使い捨て製品のためプラスチックとして、ならびに例えば農芸の根覆いまたは医学的移植片のような特殊化された用途のためのプラスチックとしてのＰＨＢの有用性の重要な面である。アルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）により合成されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）コポリマーは、インペリアル・ケミカル・インダストリーズ（ＩｍｐｅｒｉａｌＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）により工業的に製造され、そしてＢＩＯＰＯＬの商標で市販されている。５０００００ｋｇ／年のポリマーの生産に基づく推定原価は、石油誘導商品のプラスチック、例えば、ポリプロピレンについてのほぼ１＄／ｋｇと対照的に、ほぼ１５＄／ｋｇである(Poole、R、Science 245:1187-1189、1989)。製造費に対する２つの主要な寄与因子は供給原料に添加される炭素源（例えば、スクロース、グルコース、プロピオネート）および細菌からのポリマーの収獲である。多くの戦略が製造費を減少するために探索されている(Poirier、Y.、Dennis、D.E.、Nawrath、C.およびSo merville、C,、Adv.Mater.5:30-36、1993)。例えば、ある細菌は、安価な未精製の糖源、例えば、糖蜜およびコーンシロップ上で増殖させるとき、ＰＨＢを生産することができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）のいくつかの株は、グルコース上で増殖させるとき、ある数のＰＨＡコポリマーを生産することができ、このようにして通常コポリマーの生産に要求される高価な基質、例えば、プロピオネートの添加は回避される。ＰＨＢを合成する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の使用を包含する、細菌の遺伝子操作は、また、ＰＨＢの製造費に対するインパクトを有することが期待される。しかしながら、これらの潜在的改良にかかわらず、細菌の発酵および下流のプロセスに関連する固有の原価のために、細菌により生産されるＰＨＡの原価は多分ほぼ３〜５＄／ｋｇより低くないであろうことが一般に認められている。高等植物からバイオマスを生産する原価に匹敵する原価で細菌のバイオマスを生産することが可能であるようには思われない。例えば、ジャガイモはほぼ２００００ｋｇ／ヘクタールの澱粉を生ずることができ、ジャガイモの塊茎はその乾燥重量の８０％まで澱粉を蓄積する(Martin、J.H.、Leonard、W.H．およびStamp、D.L.( 編)、Chapter36、Principles of Field Crop Production、898-932、Macmillan、New York、1976)。澱粉は最低の価格（ほぼ０．２＄／ｋｇ）の１つであり、そして最も豊富な世界的な商品である。同様に、油生産作物、例えば、菜種は１０００ｋｇ／ヘクタールの油を生産し、種油含量は乾燥重量の４４％までである(Downey、 R.K.およびRobbelen、G.、Oil crops of the world、Robbelen 、G.、Downey、R.K．およびAshri、A.(編)、Chpt.16、McGraw-Hill、New York、1989)。植物は高度に生産的であることに加えて、ある数の生物学的に活性な外来タンパク質、例えば、抗体の生産において非常に有効であることが示された(Hiatt、A,、Cafferkey、R.および Bowdish、K.、Nature 342:76-78、1989)。植物の高い生産性および柔軟性を使用して、タンパク質および種々の他のポリマーを包含する、種々の有機物質を生産することにおいて関心が増加しつつある(Moffat、A.S.、Science 256:770-771、1992) 。ＰＨＡのファミリーにおける１つの構成員であるポリＤ−（−）−３−ヒドロキシブチレートの生産は、高等植物のアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）において以前に証明された(Poirier、Y.、Dennis 、E.、Klomparens、K．およびSomerville、C.、Science 256:520-523、1992および米国特許出願第07/732,243号)。アセチル−ＣｏＡからＰＨＢを作るために要求される３つの酵素のうちで、３−ケトチオラーゼは植物の中に内因的に存在する。初期の実験において、３−ケトチオラーゼ（ｐｈｂＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ｐｈｂＢ）およびＰＨＢシンターゼ（ｐｈｂＣ）をコードする細菌アルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）からの遺伝子をアラビドープシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の中に転移させ、そしてその中で構築ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの転写のコントロール下に発現させた（第１図）。遺伝子産物上にオルガネラの標的化シグナルが存在しないので、これらの実験において、酵素を細胞質に対して標的化した。適当な遺伝的交雑を通して、ＰＨＢ合成に要求される酵素のすべてを含有するハイブリッド植物を得た。ハイブリッド植物の中に存在するクロロホルム可溶性化合物をガスクロマトグラフィーおよび質量分析（ＧＣ−ＭＳ）により分析すると、ＰＨＢの存在が明らかにされた。２０〜１００μｇのＰＨＢ／ｇの植物材料の新鮮重を検出できた。ＰＨＢを生産する植物組織の薄い切片を電子顕微鏡検査すると、電子透明の顆粒の集合体の存在が明らかとなった。これらの顆粒は、アルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）およびＰＨＢを蓄積する他の細菌において見出される顆粒に、大きさおよび外観が非常に類似した。驚くべきことには、ＰＨＢ顆粒は種々の区画、即ち、核、空胞および細胞質、の中に見出された。ＰＨＢはミトコンドリアまたは葉緑体の中に検出することができなかった。顆粒のこの分布の根拠は未知である。遺伝子操作されたアラビドープシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物におけるＰＨＢの生産の証明は、いくつかの問題を明らかにした。問題の１つはＰＨＢの低い収率である。第２の問題は植物の成長へのｐｈｂ遺伝子の発現の悪影響である。トランスジェニック植物におけるアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性の大量の発現は、野生型植物に関して、成長および種子生産の有意な減少を引き起こした。例えば、ほぼ９単位のアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性／ｍｇタンパク質（１単位は１μｍｏｌｅのアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ／分として定義される）を発現するトランスジェニック系統において、２２日齢のシュートの新鮮重（fresh weight）は野生型の１９％に減少した(Poirier、Y.、 Dennis、D.E.、Klomparens、K.、Nawrath、C.およびSomerville C.、FEMS Microbiol． Lett．、103:237-246、1992)。種子の生産はほぼ同一の比率に減少した。この表現型は、植物ホルモン、カロテノイド、ステロール、キノン、フロボノイド、および脂質のような化合物の生産の減少に導く本質的な生化学的経路から離れる方向に、アセチル−ＣｏＡおよび／またはアセトアセチル−ＣｏＡの有意な量が変更する結果であろう（第２図）。また、β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、またはそれから誘導される生産物の蓄積は、植物細胞にとって有害であろう。トランスジェニック植物において生産されたＤ−β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの運命は未知である。ＰＨＢシンターゼの発現は、それ自体、トランスジェニック植物の成長または成長力への見掛けの作用をもたなかった。しかしながら、両方の遺伝子を含有するハイブリッド植物は、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性のみを含有する植物より成長がいっそう厳しく阻害された。これはメバロネート経路からの基質のいっそう厳しい消耗のためであるか、あるいはＰＨＢ顆粒、特に核の中に蓄積する顆粒、の有害性の作用のためであろう。好ましい態様の説明本発明は、色素体を有するトランスジェニック植物材料（material）に関し、前記植物材料は、植物の中の色素体においてポリヒドロキシアルカノエートの生産を導く３−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼおよびそれらの混合物から成る群より選択される細菌のポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含有する。本発明は、また、植物の中の色素体において３−ケトチオラーゼ活性を示すペプチドをコードする外来ＤＮＡを含有する、色素体を有するトランスジェニック植物材料に関する。本発明は、また、植物の色素体においてアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性をコードする外来ＤＮＡを含有する、色素体を有するトランスジェニック植物材料に関する。本発明は、また、植物の色素体においてＰＨＡシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含有する、色素体を有するトランスジェニック植物材料に関する。本発明は、また、植物の色素体においてヒドロキシアシル−ＣｏＡからのポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成を導く１種または２種以上の酵素をコードする外来ＤＮＡを含有する、色素体を有するトランスジェニック植物材料に関する。本発明は、さらに、植物の中の色素体においてヒドロキシアシル−ＣｏＡの合成を触媒する１種または２種以上の酵素をコードする外来ＤＮＡを含有する、色素体を有するトランスジェニック植物材料に関する。本発明は、また、植物の中の色素体における、外来ＤＮＡによりコードされる生産物由来のヒドロキシアシル−ＣｏＡの生産を導く１種または２種以上の酵素をコードする外来ＤＮＡを含有する、色素体を有するトランスジェニック植物材料に関する。本発明は、また、植物の中の色素体における外来ＤＮＡによりコードされる生産物由来の３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの生産を導く１種または２種以上の酵素をコードする外来ＤＮＡを含有する、色素体を有するトランスジェニック植物材料に関する。本発明は、また、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を生産しない２つの植物を性的受精により交配することを含んでなり、各植物は植物の中の色素体においてＰＨＡを合成する植物を生産するためにＰＨＡシンターゼによるヒドロキシアシル−ＣｏＡの重合を導く経路において１または２以上の異なる酵素をコードする細菌由来の外来ＤＮＡを含有する、植物の中の色素体におけるＰＨＡの合成を導くポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを導入する方法に関する。目的従って、本発明の目的は、色素体におけるＰＨＡ、特にＰＨＢ、の蓄積を導く１種または２種以上の酵素を提供することである。さらに、本発明の目的は、すぐれた成長および種子の形成を示す植物を提供することである。これらおよび他の目的は、以下の説明および図面を参照することによって徐々に明らかになるであろう。図面の簡単な説明第１図は、アルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）におけるＰＨＢ合成の経路を示すフローダイヤグラムである。３つの酵素をコードする遺伝子は括弧内に示されている。第２図は、ＰＨＢを生産するトランスジェニック植物においてアセチル−ＣｏＡおよびアセトアセチル−ＣｏＡを利用する代謝経路を示すフローダイヤグラムである。前駆体としてアセチル−ＣｏＡおよびアセトアセチル−ＣｏＡを利用する内因性植物の代謝経路の主要な最終生産物は、このダイヤグラムの上部に示されている。アルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）からのｐｈｂＢおよびｐｈｂＣ遺伝子の発現によるトランスジェニック植物においてつくられた追加の経路は、ボックスの中に示されている。第３図は、ＴＰＳＳ−ｐｈｂ遺伝子融合の略図である。ａ）ＴＰＳＳ−３−ケトチオラーゼの遺伝子融合、ｂ）ＴＰＳＳ−アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼの遺伝子融合およびｃ）ＴＰＳＳ−ＰＨＢシンターゼの遺伝子融合。これらの構築物のすべては、ボックスの中に示す４つの明確な領域、即ち、５５アミノ酸のトランシット（transit）ペプチドおよびエンドウのルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の小さいサブユニットの遺伝子３．６によりコードされる成熟タンパク質の最初の２３アミノ酸、短いリンカー配列および、初期のメチオニンを除外したアルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）からのｐｈｂＡ（Ａ）、ｐｈｂＢ（Ｂ）およびｐｈｂＣ（Ｃ）遺伝子の完全なコーディング領域、から構成されている。ボールドフェースのアミノ酸配列（１文字のコード）および各領域の結合部に存在するＤＮＡ配列が示されている。ハイフンで示す、結合部の間のアミノ酸の伸長部は以前に発表された(Cashmore、A.R.、Genetic Engineering of planls(編者、Kosuge、T.、Meredith、C.P.およびHollaender、A.)29-38、Plenum Press N Y、1983;Janes、B.、Hollar、JおよびDennis、D.、E.A.Dawes(編)、Novel Biod egradable Microbial Polymers 175-190(1990))。星印は終止コドンを示す。サブクローニング法の間にＰＣＲにより導入されたエンドヌクレアーゼ制限部位が示されている。第４図は、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＴＰＳＳ−ｐｈｂの遺伝子融合を収容するＴｉ−プラスミドの略図である。ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏ（Ａ）、ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄ（Ｂ）およびｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎ（Ｃ）が示されている。各構築物の物理的成分は、左から右に、次の通りである：ＬＢ、左の境界配列；Ｋａｎ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子；ＣａＭＶ−３５Ｓ、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター；ＴＰＳＳ、エンドウのルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の小さいサブユニット（３．６遺伝子）のトランシットペプチド；陰影のボックス、合成リンカー；３−ケトチオラーゼ遺伝子（Ａ）、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子（Ｂ）、またはＰＨＢシンターゼ遺伝子（Ｃ）；ポリＡ、ポリアデニル化部位；ＲＢ、右の境界配列。重要なエンドヌクレアーゼ制限部位の位置が示されている。第５図は、種子特異的プロモーターおよびＴＰＳＳ−ｐｈｂ遺伝子融合を収容するＴｉ−プラスミドの略図である。ｐＢＩＢ−ＣＣＮ−Ｔｈｉｏ（Ａ）、ｐＢＩＢ−ＫＣＮ−Ｒｅｄ（Ｂ）、およびｐＢＩＢ−ＨＣＮ−Ｓｙｎ（Ｃ）の地図が示されている。構築体において、アラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）の１２Ｓａ種子貯蔵タンパク質のＣＲＢ遺伝子の種子特異的プロモーターはＴＰＳＳ−ｐｈｂ遺伝子融合の上流に配置された。下記の選択可能なマーカーを使用した：アセトアセテートシンターゼをコードするＡＬＳ（Ａ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩをコードするＫａｎ；Ｈｙｇ、ハイクロマイシンホスホトランスフェラーゼ。第４図はより詳細な記載を示す。第６図は、プラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏを発現するトランスジェニックアラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）植物および対照植物のウェスタンブロット分析のオートラジオグラフである。１．２μｇのタンパク質を含有する粗製の葉タンパク質抽出物のアリコートを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ニトロセルロース上でエレクトロブロットしたタンパク質を抗３− ケトチオラーゼ抗体とインキュベートした。分析したタンパク質抽出物は、Ｔ４ −３Ａ（レーンＣ；Somerville、C.R.、Poirier、Y.、およびDennis、D.E.、米国特許出願第07/732,243号）、ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＧＨＩ１（レーン１）、ＴＰＳＳ −ＴｈｉｏＬ（レーン２）、ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＳＴＵ４（レーン３）、およびＴＰＳＳ−ＲｅｄＳＴＵ（レーンＵ）であった。第７図は、プラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄを発現するトランスジェニックアラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）植物および対照植物のウェスタンブロット分析のオートラジオグラフである。１．２μｇのタンパク質を含有する粗製の葉タンパク質抽出物のアリコートを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ニトロセルロース上でエレクトロブロットしたタンパク質を抗アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ抗体とインキュベートした。分析したタンパク質抽出物は、ＲｅｄＢ−２Ｂ（レーンＣ；Somerville、C.R.、Poirier、Y.、およびDe nnis、D.E.、米国特許出願第07/732,243号）、ＴＰＳＳ−ＲｅｄＤＥＦ（レーン１）、ＴＰＳＳ−ＲｅｄＧＨＩ１（レーン２）、ＴＰＳＳ−ＲｅｄＧＨＩ２（レーン３）、ＴＰＳＳ−ＲｅｄＭＮＯ１（レーン４）、ＴＰＳＳ−ＲｅｄＭＮＯ２（レーン５）、ＴＰＳＳ−ＲｅｄＳＴＵ（レーン６）、ＴＰＳＳ− ＲｅｄＶＸＹ（レーン７）、およびＴＰＳＳ−ＳｙｎＶＸＹ（レーンＵ）であった。第８図は、プラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎを発現するトランスジェニックアラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）植物および対照植物のウェスタンブロット分析のオートラジオグラフである。５０μｇのタンパク質を含有する粗製の葉タンパク質抽出物のアリコートを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ニトロセルロース上でエレクトロブロットしたタンパク質を抗ＰＨＢシンターゼ抗体とインキュベートした。分析したタンパク質抽出物は、Ｓ８−１−２Ｃ（レーンＣ；Somerville、C.R.、Poirier、Y.、およびDennis、D.E.、米国特許出願第07/732,243号）、ＴＰＳＳ−ＲｅｄＳＴＵ（レーンＵ）、ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１（レーン１）、ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ２（レーン２）、ＴＰＳＳ −ＳｙｎＪＫＬ（レーン３）、およびＴＰＳＳ−ＳｙｎＶＸＹ（レーン４）であった。第９図は、プラスミドｐＢＩＢ−ＣＣＮ−Ｔｈｉｏを発現するトランスジェニックアラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）植物および対照植物のウェスタンブロット分析のオートラジオグラフである。５０μｇのタンパク質を含有する粗製の葉タンパク質抽出物のアリコートを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ニトロセルロース上でエレクトロブロットしたタンパク質を抗３−ケトチオラーゼ抗体とインキュベートした。分析したタンパク質抽出物は、ＣＮ− Ｒｅｄ１７−１（レーンＣ）、ＣＮ−Ｔｈｉｏ１３−３（レーン１）およびＣＮ−Ｔｈｉｏ１４−１（レーン２）であった。第１０図は、プラスミドｐＢＩＢ−ＫＣＮ−Ｒｅｄを発現するトランスジェニックアラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）植物および対照植物のウェスタンブロット分析のオートラジオグラフである。５０μｇのタンパク質を含有する粗製の葉タンパク質抽出物のアリコートを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ニトロセルロース上でエレクトロブロットしたタンパク質を抗アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ抗体とインキュベートした。分析したタンパク質抽出物は、ＲｅｄＢ−２Ｂ（レーンＬＲ；Somerville、C.R.、Poirier、Y.、および Dennis、D.E.、米国特許出願第07/732,243号）であり、種子タンパク質抽出物（レーンＵ）、ＣＮ−Ｒｅｄ１７−３Ｋ（レーン１）およびＣＮ−Ｒｅｄ１７− １（レーン２）であった。第１１図は、プラスミドｐＢＩＢ−ＨＣＮＳｙｎを発現するトランスジェニックアラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）植物および対照植物のウェスタンブロット分析のオートラジオグラフである。５０μｇのタンパク質を含有する粗製の葉タンパク質抽出物のアリコートを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ニトロセルロース上でエレクトロブロットしたタンパク質を抗ＰＨＢシンターゼ抗体とインキュベートした。分析したタンパク質抽出物は、Ｓ８−１ −２Ｃ（レーンＬＳ；Somerville、C.R.、Poirier、Y.、およびDennis、D.E.、米国特許出願第07/732,243号）、ＲｅｄＢ−２Ｂ（レーンＬＲ；Somerville、C.R.、Poir ier、Y.、およびDennis、D.E.、米国特許出願第07/732,243号）、ＣＮ−Ｒｅｄ１７−１（レーンＣ）、ＣＮ−Ｓｙｎ３５−１（レーン１）、ＣＮ−Ｓｙｎ３５−１ａＡ（レーン２）、ＣＮ−Ｓｙｎ３５−Ｇ１（レーン３）、ＣＮ−Ｓｙｎ３４−１Ｈｂ（レーン４）、ＣＮ−Ｓｙｎ３４−１Ｈｃ（レーン５）、ＣＮ−Ｓｙｎ３４−１ｂＡ（レーン６）、ＣＮ−Ｓｙｎ３４−１ｂＡ２（レーン７）、ＣＮ−Ｓｙｎ３４−１ｂＢ（レーン８）、ＣＮ−Ｓｙｎ３４− １Ｂ（レーン９）、およびＣＮ−Ｓｙｎ３４−１Ｇ（レーン１０）であった。第１２図は、非形質転換対照およびプラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−ｐｈｂ構築体で形質転換したトランスジェニックアラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）植物のサザンブロット分析のオートラジオグラフである。非形質転換アラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）品種Ｒｓｃｈｅｗおよびトランスジェニック植物からのゲノムＤＮＡの１μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、形質転換体をアガロースゲル電気泳動により分離し、そしてナイロン膜に移した。フィルターを遺伝子（Ａ）ｐｈｂＡ、（Ｂ）ｐｈｂＢおよび（Ｃ）ｐｈｂＣからの³²Ｐ標識化ＤＮＡ断片にハイブリダイゼーションさせた。分析したゲノムＤＮＡは次の通りであった：ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＧＨＩ１（レーンＴｈｉｏ１）、ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ（レーンＴｈｉｏ２）、ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＳＴＵ４（レーンＴｈｉｏ３）、ＴＰＳＳ−ＲｅｄＤＥＦ（レーンＲｅｄ１）、ＴＰＳＳ−ＲｅｄＧＨＩ１（レーンＲｅｄ２）、ＴＰＳＳ −ＲｅｄＧＨＩ２（レーンＲｅｄ３）、ＴＰＳＳ−ＲｅｄＭＮＯ１（レーンＲｅｄ４）、ＴＰＳＳ−ＲｅｄＭＮＯ２（レーンＲｅｄ５）、ＴＰＳＳ−ＲｅｄＳＴＵ（レーンＲｅｄ６）、ＴＰＳＳ−ＲｅｄＶＷＸ（レーンＲｅｄ７）、ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１（レーンＳｙｎ１）、ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ２（レーンＳｙｎ２）、ＴＰＳＳ−ＳｙｎＪＫＬ（レーンＳｙｎ３）、ＴＰＳＳ−ＳｙｎＶＷＸ（レーンＳｙｎ４）および非形質転換野生型（レーンＣ）。第１３図は、非形質転換対照およびプラスミドｐＢＩＢ−ＣＮ−ｐｈｂ構築体で形質転換したトランスジェニックアラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）植物のサザンブロット分析のオートラジオグラフである。分析したゲノムＤＮＡは次の通りであった：ＣＮ−Ｔｈｉｏ１３−３（レーンＴｈｉｏ１）、ＣＮ−Ｔｈｉｏ１４−１（レーンＴｈｉｏ２）、ＣＮ−Ｒｅｄ１７−２（レーンＲｅｄ１）、ＣＮ−Ｒｅｄ１７−３（レーンＲｅｄ２）、ＣＮ−Ｒｅｄ１７−１ｄＡ（レーンＲｅｄ３）、ＣＮ−Ｒｅｄ１７−１ｄＢ（レーンＲｅｄ４）、ＣＮ−Ｒｅｄ１７−３Ｋ（レーンＲｅｄ５）、ＣＮ−Ｒｅｄ１７− ２Ｋ（レーンＲｅｄ６）、ＣＮ−Ｓｙｎ３４−１ｂＡ（レーンＳｙｎ１）、ＣＮ −Ｓｙｎ３４−１ｂＢ（レーンＳｙｎ２）、ＣＮ−Ｓｙｎ３４−１Ｈｂ（レーンＳｙｎ３）、ＣＮ−Ｓｙｎ３４−１Ｇ１（レーンＳｙｎ４）、ＣＮ−Ｓｙｎ３５−１（レーンＳｙｎ５）、ＣＮ−Ｓｙｎ３５−１Ａ（レーンＳｙｎ６、および非形質転換野生型（レーンＣ）。いっそう詳細な説明については、図面の凡例１２を参照のこと。第１４図は、精製したＰＨＢおよび植物抽出物のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を示す。（Ａ）シグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）から購入したエステル交換ＰＨＢのガスクロマトグラム；（Ｂ）非形質転換野生型アラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）品種Ｒｓｃｈｅｗからの葉のクロロホルム抽出物のガスクロマトグラム。矢印は、エチル−ヒドロキシブチレートがクロマトグラムから溶出する位置を示す；（Ｃ）ハイブリッドＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＤＥＦ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１からの葉のクロロホルム抽出物のガスクロマトグラム。矢印はエチル−ヒドロキシブチレートのピークの位置を示す。第１５図は、ＰＨＢ標準および植物抽出物から調製したＰＨＢのガスクロマトグラフィー−質量分析の分析を示す。（Ａ）エステル交換された商用ＰＨＢの質量スペクトラム；（Ｂ）エチル−ヒドロキシブチレートと同一の保持時間を有するＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＤＥＦ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１ハイブリッドの葉のクロロホルム抽出物からのＧＣピークの質量スペクトラム（第１４Ｃ図）。第１６図は、異なるハイブリッドＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏ／ＴＰＳＳ−Ｒｅｄ／ＴＰＳＳ−Ｓｙｎ植物の葉におけるＰＨＢの蓄積を図解する棒グラフを示す。（Ａ）伸び広がる葉についての測定（２０〜３０日齢）；（Ｂ）成熟した葉についての測定（５０〜６０日齢）。第１７図は、色素体（Ａ）および細胞質（Ｂ）の中でＰＨＢ生合成酵素を発現する野生型（ＷＴ）およびトランスジェニックアラビドープシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の完全に発育したロゼットの写真を示す。色素体の中でＰＨＢを生産するハイブリッドＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＤＥＦ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１の葉は、１．２ｍｇのＰＨＢ／ｇの新鮮重を含有した（Ａ、ＰＨＢ＋）。細胞質の中でＰＨＢ酵素を発現するＲｅｄ／Ｓｙｎハイブリッドは、ほぼ１００μｇのＰＨＢ／ｇの新鮮重を含有した（Ｂ／ＰＨＢ＋）。野生型およびトランスジェニック植物は同一条件下に成長させた。第１８図は、葉の色素沈着への色素体におけるＰＨＢの高いレベルの蓄積の効果を図解する写真を示す。（Ａ）５０日齢の野生型植物の葉；（Ｂ）伸び広がる葉の色素体において７００μｇのＰＨＢ／ｇの新鮮重を生産する５０日齢のトランスジェニックアラビドープシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ハイブリッドの葉。第１９図は、色素体においてＰＨＢ酵素を発現するＰＨＢ生産性トリ−ハイブリッドからの薄い切片の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）を示す（ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＤＥＦ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１）。（Ａ）葉肉細胞の葉緑体の中における電子透過性顆粒の凝集を矢印で示す。ＥＭ分析のためのサンプリングの前に、植物を４８時間の間暗所に配置して澱粉を除去する。バーは１μｍを表す。（Ｂ）１２時間の光周期において４時間の照明後に集めた、野生型の葉の薄い切片の透過型電子顕微鏡写真。胚珠の特異な顆粒の形態の色素体の中の澱粉の蓄積を、野生型において大きい矢印で示す；（Ｃ）１２時間の光周期において４時間の照明後に集めた、ＰＨＢ陽性のＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＤＥＦ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１ハイブリッドの葉の薄い切片の透過型電子顕微鏡写真。胚珠の特異な顆粒の形態の色素体の中の澱粉の蓄積を、野生型において大きい矢印で示す。トリハイブリッドの色素体における電子透過性ＰＨＢ顆粒の凝集を小さい矢印で示す。バーは１μｍを表す。第２０図は、抗ＰＨＢシンターゼ抗体とインキュベートしたトランスジェニックＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＤＥＦ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１植物の植物抽出物のウェスタンブロット分析を示す。２つの異なるＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＤＥＦ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１植物の可溶性タンパク質（レーン１、２）および膜および粒状画分の可溶化タンパク質（レーン３、４）の抽出物。レーンＣはＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１植物の可溶性タンパク質の抽出物を示す。以後使用すべきある種の用語の定義を記載することは助けとなるであろう。形質転換は、どんな手段によってもＤＮＡの安定な導入により受容生物の遺伝子型を変化する方法を意味する。トランスジェニック植物は、種の中に通常存在するが、形質転換により導入されたＤＮＡ配列を含有する植物である。転写は、ＤＮＡの中に含有される遺伝情報に従うＲＮＡ鎖の形成を意味する。翻訳は、ｍＲＮＡ分子の中の遺伝情報がタンパク質合成の間の特定のアミノ酸の順序を方向づける方法を意味する。プロモーターは、遺伝物質の転写を引き起こすＤＮＡ断片である。本明細書に記載する目的のために、プロモーターは植物細胞の中で転写を可能とするＤＮＡ断片を示すために使用する。ポリ−Ａ付加部位は、ある種の酵素がｍＲＮＡを特定の部位で切断し、そしてアデニル酸残基をｍＲＮＡの３’末端に付加するようにさせるヌクレオチド配列である。ｐｈｂＣ、ｐｈｂＡ、ｐｈｂＢは、それぞれ、ＰＨＢポリメラーゼ、３−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼについてアルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）遺伝子に与えられた遺伝子記号である(Peoples、O.P．およびSinskey、A.J.、J.Biol.Chem.264:15298-15303、1989)。色素体は、異なる種類の植物細胞の細胞質の中に多数のコピーで位置する、自己複製性オルガネラである。このオルガネラは二重層の膜により取り囲まれており、そしてそれ自身のＤＮＡを含有する。色素体の中に位置するタンパク質は、それ自身のＤＮＡによりコードされそして色素体の中で合成されるか、または植物細胞の核によりコードされ、細胞質の中で合成されそして色素体の中に輸送される。トランスジェニック植物の子孫を記載するとき、ＤＮＡの導入から、どれだけの数の自家受粉の世代が経過したかを表示するコンベンションを採用することは有用である。ここにおいて、われわれはもとの形質転換体をＴ０世代と表示する。この世代の自家受粉から生ずる子孫をＴ１世代などと表示する。２つの明確な親の植物の間の異花受粉の場合において、最初の異花受粉事象から生ずる子孫をＦ１世代と表示する。この開示の中に記載する本発明は、ＰＨＢ生合成酵素の細胞の局在化を変化させそして組織の特異性および発現のタイミングを調節することによって、ＰＨＢ生産植物の第１世代に関連する成長の崩壊および低いＰＨＢ生産を軽減することに関する。ＰＨＢの生産を増加しかつアセチル−ＣｏＡおよび／またはアセトアセチル− ＣｏＡから誘導された必須生産物の潜在的消耗を回避するために、アセチル−ＣｏＡおよび／またはアセトアセチル−ＣｏＡを通る高い代謝の流れを有する細胞下区画、即ち、色素体、に細菌のＰＨＢ生合成酵素を標的化した(Harwood、J.L.、 Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.39:101-138、1988)。貯蔵組織において、脂肪酸の生合成からＰＨＢの生産に向かうこの色素体の多少の転換は植物の成長に有害であってはならない。植物の中で自然に合成される高分子量のバイオポリマーである澱粉は、多数の貯蔵組織（アミロプラスト）の色素体の中に大量に蓄積される(Preiss、J.、Ann.Rev.Plant Physiol.33:431-454、1982)。光合成葉緑体において、澱粉は、また、ＣＯ₂固定の日周期の間に一時的に蓄積される。従って、色素体はその寸法を変化させることができそして大きい貯蔵容量を有する区画である。従って、色素体の中のＰＨＢの蓄積が色素体の機能を妨害しないか、または多少の機械的崩壊を引き起こすことは期待されない。さらに、細胞質におけるＰＨＢの生合成経路の発現は、色素体の中でなく、細胞質、核および空胞の中のＰＨＢ顆粒の蓄積を生じた(Poirier、Y.、Dennis、E.、Klomoparens、K.およびSomerville、C.、Science 256:520-523、1992)。これは色素体のエンベロープがＰＨＢ顆粒による浸透に対して不透過性である可能性を発生させる。従って、色素体のＰＨＢの生産の付加された利点は、ＰＨＢ顆粒がもっぱら色素体の中に蓄積されかつその中に止まることができ、顆粒による他のオルガネラの潜在的機械的崩壊を回避するということである。本明細書に記載する本発明において、コードされた酵素の色素体の標的化のために修飾されたアルカリゲネス・エウトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）からの遺伝子ｐｈｂＡ、ｐｈｂＢおよびｐｈｂＣは植物細胞の中に導入された。それらの遺伝子はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの転写のコントロール下に発現され、このプロモーターはＰＨＢ生産植物を構築するために従来使用されてきているプロモーターと同一であった。このアプローチは、酵素の色素体および細胞質の発現とＰＨＢ生産レベルとの直接の比較を可能とする。本明細書に記載する本発明の第２面において、植物の全体の成長への有害作用の可能性を減少するために、ＰＨＢ生産は特定の組織および植物の生活環の特定の段階に限定された。色素体におけるアセチル−ＣｏＡの流れは大量の油脂を通常蓄積する組織、例えば、油脂植物の種子、において特に高いので、発育する種子はＰＨＢ生産のために適当な組織である。貯蔵脂質に使用される脂肪酸合成からＰＨＢ合成に向かうこのアセチル−ＣｏＡの多少の転換は、植物の成長に有害であってはならない。従って、色素体標的化ｐｈｂ酵素は、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）の種子貯蔵タンパク質遺伝子のプロモーターを使用して、発育する種子において特別に発現された。農芸規模のＰＨＡ生産は、ＰＨＡ生産植物が正常の成長力を有することと、生産されたＰＨＡのレベルがトランスジェニック植物の前の世代においてまだ到達されていないある最小レベルを超えることとを必要とする。従って、本発明はＰＨＢ生産植物の有望な発育のために高い重要性を有する。アラビドープシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）とブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）との密接な関係のために、下記の節に記載する構築体をブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）におけるＰＨＢ生産のために直接使用した。さらに、高等植物の異なる種における遺伝子発現および一次炭素代謝のメカニズムが類似するために、本発明の本質、即ち、本発明におけるＰＨＡの生産、は他の植物種に適用可能であることがまた明らかである。他の油脂生産植物、例えば、菜種およびヒマワリの種子、またはアボカドまたはギネアアブラヤシの中果皮におけるＰＨＢの生産は、これらの植物器官が脂肪酸の生合成のための前駆体アセチル−ＣｏＡを提供するために特殊化されているので、特に魅力的である。後述する実験は植物種アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈｏｌｄに関するが、記載する方法は形質転換法が利用可能である任意の高等植物に一般に適用可能である。同様に、本明細書に記載する方法はアルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）からの遺伝子の使用に関するが、記載する方法はＰＨＢを合成できる任意の生物からの遺伝子の使用に一般に適用可能である。また、記載する方法はＰＨＢの生産に関するが、ＰＨＡシンターゼ（ＰＨＢシンターゼを包含する）活性により微生物の中で通常生産され、そしてそのために適当なヒドロキシアセチル−ＣｏＡ基質が特定の植物の中で生産される、任意のポリヒドロキシアルカノエートの生産に、この手法は一般に適用可能であることが明らかである。トランスジェニック植物の中の色素体におけるＰＨＢの生産は、次のような順序のステップの完結を必要とする：１．）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において植物プロモーターのコントロール下に発現された色素体標的化配列と、ＰＨＢ合成のための細菌遺伝子との融合体を含有する１または２以上のプラスミドの構築、２．）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の中へのこれらのプラスミドの導入、３．）修飾された遺伝子で植物細胞を形質転換するための、形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による植物の感染（即ち、この例においてアラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ））４．）修飾された遺伝子で形質転換された植物の選択、５．）異所性（ectopic）遺伝子についてホモ接合である植物の選択、６．）形質転換された植物をプラスミドの組み込みおよび異所性遺伝子の発現に関して分析して、それらが活性でありかつ遺伝子産物が色素体に標的化されることを保証すること、７．）性的交雑による２またはそれ以上の異なる異所性遺伝子を含有するハイブリッド植物の生産、８．）ハイブリッド物質のＰＨＢの存在についての分析。１．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で植物プロモーターのコントロール下に色素体標的化配列−ｐｈｂ遺伝子融合を含有するプラスミドの構築。１．１．ｐｈｂ遺伝子のコーディング領域へのシグナル配列の融合。植物細胞の中の色素体のストロマにタンパク質を標的化させるために、タンパク質はＮ−末端にトランシット（transit）ペプチドを含有しなくてはならない (Keegstra、K.およびOlsen、L.J.、Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.40:471 -501、1989;Archer、E.K．およびKeegstra、K.、J.Bioenerg.Biomem.22:789-810、199 0)。従って、トランシットペプチドをコードするシグナル配列を、正しいリーディングフレームにおいてタンパク質のコーディング配列の５’末端に融合させなくてはならない。リブロース１−５ビスホスフェートカルボキシラーゼ（ルビスコ）の小さいサブユニットのトランシットペプチド（ｔｒａｎｓｉｔｐｅｐｔｉｄｅｏｆｔｈｅｓｍａｌｌｓｕｂｕｎｉｔ）（ＴＰＳＳ）はよく特性決定され(Robinson、C.およびEllis、R.J.、Eur.J.Biochem.142:343-346、1984、Wasm ann、C.C.、Reiss、B.、Barlett、S.G.、およびBohnert、H.J.、Mol.Gen.Genet.205:446 -453、1986;Friemann、A.L．およびKeegstra、K.、Plant Physiol.89:993-999、1988; Lubben、T.H.、Gatenby、A.A.、Ahlquist、P.、およびKeegstra、K.、Plant Mol.Biol.1 2:13-18、1989;Schnell、D.J.、Blobel、G.、およびPain、D.、J.Biol.Chem.266:3335-3 342,1991)そして従来ある数の標的化実験において首尾よく使用された(van de B roeck、G.、Timko、M.P.、Kausch、A.P.、Cashmore、A.R.、Van Montagu、M.およびHerrer a-Estrella、L.、Nature 313:358-363、1985;Schreier、P.H.、Seftor、E.A.、Schell、J .、およびBohnert、H.J.、EMBO J.4:25-23、1985;Boutry、M.、Nagy、F.、Poulsen、C.、Ao yagi、K.、およびChua N.-H.、Nature 328:340-342、1987;Lubben、T.H.、およびKeeg stra、K.、Proc.Natl.Acad.Sci.83:5502-5506、1986;Lamppa、G.K.、J.Biol.Chem.263 :14996-14999、1988;Gatenby、A.A.、Lubben、T.H.、Aphlquist、P.、およびKeegstra、 K.、EMBO J.7:1307-1314、1988;Cheung、A.Y.、Bogorad、L.、Van Montagu 、M.、およびSchell、J.、Proc.Natl.Acad.Sci.85:391-395、1988;Lubben、T.H.、Theg、S.M.およびKeegstra、K.、Photosyn.Res.17:173-194、1988)。従って、エンドウのＴＰＳＳを下記の実験において使用した。しかしながら、色素体の標的化に関係した多くの異なるトランシットペプチドを類似の方法で使用できるであろう。トランシットペプチドは色素体の中に輸入されるの間に通常切断されるので、トランシットペプチドとタンパク質との間の結合部における３次元構造は輸送の効率のために重要であることがある(Wasmann、C.C.、Reiss、B.、Barlett、S.G.、およびBohnert、H.J.、Mol.Gen.Genet.205:446-453、1986;Lubben、T.H.、Gatenby、A.A.、 A hlquist 、P.、およびKeegstra、K.、Plant Mol.Biol.12:13-18、1989)。従って、ルビスコの成熟した小さいサブユニットの最初の２３アミノ酸をコードする遺伝子の配列はトランシットペプチドの中に含め、このペプチドをＰＨＢ生産に関係するアルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）の細菌の遺伝子、即ち、ｐｈｂＡ、ｐｈｂＢおよびｐｈｂＣ遺伝子に融合させた。シグナル配列と細菌の遺伝子との間の正確な断片を得るために、ＴＰＳＳをコードする配列ならびにｐｈｂ遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して増幅し、そしてオリゴヌクレオチドのプライマーは配列のいずれかの末端に新しい合成制限部位をつくった。増幅のために設計したプライマーを表１に表す。表１は、また、断片の増幅に使用したＤＮＡ源および増幅された断片の大きさを含む。ＰＣＲ断片を増幅し、導入された制限部位を認識する酵素で切断し、そしてアガロースゲル電気泳動により分離した。シグナル配列のＤＮＡ断片を含有する精製された０．２７ｋｂｐのＸｂａＩ− ＳｍａＩ断片を、同一の制限酵素で切断したベクターｐＵＣ１８に結合して、プラスミドｐＵＣ−ＴＰＳＳを生成した。ｐｈｂＡ遺伝子の精製された１．３ｋｂｐのＳｍａＩ−ＳａｃＩ断片およびｐｈｂＢ遺伝子の０．８ｋｂｐの断片をＳｍａＩおよびＳａｃＩで切断したｐＵＣ −ＴＰＳＳプラスミドの中に結合して、プラスミドｐＵＣ−ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏおよびｐＵＣ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄをつくった。ｐｈｂＣ遺伝子の１．９ｋｂｐのＳｍａＩ断片をＳｍａＩ切断ｐＵＣ−ＴＰＳＳに結合した。シンターゼがシグナル配列の背後に正しい向きにクローニングされたしたクローンを選択し、そしてｐＵＣ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎと表示した。要約すると、つくられたプラスミド、即ち、ｐＵＣ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏ、ｐＵＣ−ＴＰＳＳ−ＲｅｄおよびｐＵＣ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎの各々は、１つの合成ポリペプチドをコードするような方法で一緒に融合された植物遺伝子および細菌遺伝子のコーディング領域の一部分を含有する。植物の配列と細菌の配列との間の結合部において、３アミノ酸のセリン−アルギニン−バリン（Ｓ−Ｒ−Ｖ）をコードする合成配列が形成された。シグナル配列と細菌遺伝子との間の結合部に存在するアミノ酸およびＤＮＡ配列は、表３に示されている。植物細胞の中で発現されるとき、これらのポリペプチドは色素体のタンパク質輸入機構により認識され、そして色素体のストロマに輸送されることが期待される。１．２．修飾されたｐｈｂ遺伝子の上流の植物プロモーターの付加。高等植物において合成コーディング領域を転写するために、コーディング領域はその５’末端付近に位置する植物プロモーターのコントロール下になくてはならない。さらに、ポリアデニル化部位をコーディング領域の３’末端に付加して、高等植物における遺伝子の発現を保証することは普通に実施されている。さらに、形質転換された植物を選択するために、形質転換された植物のみが選択条件下に生き残るようにさせる遺伝子が存在しなくてはならない。このような遺伝子は選択可能なマーカーと呼ばれる。２つの異なるプロモーターを使用して、修飾されたｐｈｂ遺伝子を発現した：ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣＲＢプロモーター。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（カリフラワーモザイクウイルスから）は、高等植物の多数の種における広範な種類の組織において比較的高いレベルの転写を生ずる構成的プロモーターと見なされる(Benfey、P.N.およびChua、N.-H.、Science 2 50:959-966、1990)。対照的に、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）の１２Ｓ種子貯蔵タンパク質のＣＲＢ遺伝子から単離されたＣＲＢプロモーターは、ほとんどもっぱら発育する種子の胚における高いレベルの転写を促進する(Pang、P.P.、Pruitt、R.E.、およびMeyerowitz、E.M.、Plan t Mol.Biol.11:805-820、1988)。１．２．１．修飾されたｐｈｂ遺伝子の上流のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの付加。修飾されたｐｈｂＡ、ｐｈｂＢおよびｐｈｂＣ遺伝子の上流にＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを配置し、そして高等植物におけるコーディング領域の発現のための他の要求を満足させるために、プラスミドベクターｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、カリフォルニア州）を使用した。このベクターは選択可能なマーカーとしてネオマイシンＩＩホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有する。ＣａＭＶ３５Ｓ−ＴＰＳＳ−ｐｈｂＡおよびＣａＭＶ３５Ｓ−ＴＰＳＳ−ｐｈｂＢの遺伝子融合体を構築するために、プラスミドｐＵＣ−ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏおよびｐＵＣ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄを制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化した。ｐＵＣ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏからの１．６ｋｂｐの断片およびｐＵＣ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄからの１．１ｋｂｐの断片を、アガロースゲル電気泳動により他の断片から分離した。精製されたＤＮＡ断片を同一酵素で切断したｐＢＩ１２１に結合し、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中にクローニングした。新しくつくられたプラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏおよびｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄは、色素体の標的化のために修飾されそして植物プロモーターの下流に位置する、それぞれ、ｐｈｂＡ遺伝子およびｐｈｂＢ遺伝子を含有する（第４図）。ＣａＭＶ３５Ｓ−ＴＰＳＳ−ｐｈｂＣ遺伝子融合体を構築するために、プラスミドｐＵＣ−ＴＰＳＳ−ＳｙｎをＥｃｏＲＩで消化し、そして付着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより充填した。引き続いて、プラスミドをＸｂａＩで消化した。２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により他の断片から分離した。精製されたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩ／ＸｂａＩ消化ｐＢＩ１２１の中にクローニングした。生ずるプラスミドをｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎと表示し（第４図）、これはアルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）からのｐｈｂＣ遺伝子を有し、この遺伝子は色素体の標的化のために修飾され、ＣａＭＶプロモーターおよびｐＢＩ１２１のポリアデニル化部位に関して、右向きにクローニングされているので、それは高等植物において発現されることが期待される。これらの構築体は、遺伝子の高い発現および対応するタンパク質、即ち、修飾された３−ケトチオラーゼ、修飾されたアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよび修飾されたｐｈｂシンターゼ、の色素体のストロマへの標的化のためのすべての要件を満足する。１．２．２．修飾されたｐｈｂ遺伝子の上流の種子特異的プロモーターの付加。ＣＲＢプロモーターの下流の修飾されたｐｈｂコーディング領域をクローニングするために、ｐＢＩＢベクター(Becker、D.、Nucleic Acids Res.18:203,1990) を使用した。これらのベクターは、植物の形質転換のために必要なすべての機能を含有する。ベクターの２つのバージョンが存在する：ｐＢＩＢ−Ｋａｎは選択可能なマーカーとしてネオマイシンＩＩホスホトランスフェラーゼ、ｐＢＩＢ− Ｈｙｇ、即ち、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有する。引き続くクローニング手法を簡素化するために、ＣＲＢプロモーターは位置− ９９３におけるＸｂａＩ制限部位を除去することによってわずかに修飾しなくてはならなかった。従って、プラスミドｎＡｔ４０１１(Pang P.P.、Pruitt、R.E.、およびMeyerowits、E.M.、Plant Mol.Biol.11:805-820、1988)をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化しそして精製後、３．５ｋｂｐの断片をｐＢＲ３２２(Bolivar、 F.、Rodriguez、R.L.、Greene、P.J.、Betlach、M.C.、Heyneker、H.L．およびBoyer、H. W.、Gene 2:95-113、1977)の中にクローニングしてｐＢＲ３２２−ＣＲＢを生産した。ｐＢＲ３２２−ＣＲＢの単一のＸｂａＩ部位を切断した後、付着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼとのインキュベーションによりデオキシリボヌクレオチドでフィルインし、そしてプラスミドを再結合した。生ずるプラスミドはＣＲＢプロモーター領域の中にＸｂａＩを含有しなかった。配列のいずれかの末端に適当な制限部位をもつＣＲＢプロモーターを得るために、表１に示すオリゴヌクレオチドのプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応を実施した。１．１ｋｂｐのＸｂａＩ断片をｐＫ１９(Pridmore、R.D.、Gene 56 :309-312、1987)の中にクローニングしてｐＫ−ＣＲＢをつくった。ＣＲＢプロモーターの背後のＴＰＳＳ−ｐｈｂＡコーディング領域をクローニングするために、プラスミドｐＵＣ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏを制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化し、そして１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製した。この断片をＸｂａＩおよびＳａｃＩ切断ベクターｐＢＩＢ −Ｈｙｇに結合した。３つのｐｈｂ遺伝子の各々と組み合わせた異なる選択可能なマーカーを有することは非常に有用であるので、ｐＢＩＢ−ＨｙｇベクターのハイクロマイシンＩＩホスホトランスフェラーゼ遺伝子を、引き続いて、形質転換された植物にクロルスルフォロン耐性を付与するアセトラクテートシンターゼ遺伝子と置換した(Haughn、G.W.、Smith、J.、Mazur、B.およびSomerville C.R.、Mol. Gen.Genet.211:266-271、1988)。これを行うために、生ずるプラスミドをおよびＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断して、ハイクロマイシンＩＩホスホトランスフェラーゼ遺伝子を除去した。プラスミドの付着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼによりデオキシリボヌクレオチドで充填した。プラスミドｐＧＨ１(Haughn、 G.W.、Smith、J.、Mazur、B.およびSomerville C.R.、Mol.Gen.Genet.211:266-271、19 88)から精製された５．８ｋｂｐのＸｂａＩ断片を、引き続いて調製されたプラスミドの中に挿入した。生ずる構築体をｐＢＩＢ−Ｃ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏと表示した。次いで、ｐＫ−ＣＲＢの１．１ｋｂｐの長いＸｂａＩ断片をユニークＸｂａＩ部位の中にクローニングすることによって、ＣＲＢプロモーターを構築体に付加した。修飾されたｐｈｂＡの適切な発現のために右向きにプロモーターを含有するクローンを、ｐＢＩＢ−ＣＣＮ−Ｔｈｉｏと表示した（第５図）。ＣＲＢプロモーターの背後のＴＰＳＳ−ｐｈｂＢコーディング領域をクローニングするために、プラスミドｐＵＣ−ＴＰＳＳ−ＲｅｄをＸｂａＩで消化し、そしてプラスミドｐＫ−ＣＲＢの１．１ｋｂｐのＸｂａＩ断片を挿入した。右向きのプロモーターをもつクローンを選択し、そしてｐＫ−ＣＮ−Ｒｅｄと表示した。プラスミドｐＫ−ＣＮ−ＲｅｄをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化してプロモーター／遺伝子断片を形成し、そして末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼによりデオキシリボヌクレオチドで満した。２．２ｋｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、そしてＳｍａＩで消化したベクターｐＢＩＢ−Ｋａｎの中に結合した。植物における適切な遺伝子の発現のための右向きの断片を有するクローンを、ｐＢＩＢ−ＫＣＮ−Ｒｅｄと命名した（第５図）。ｐＢＩＢ−ＨｙｇベクターにおいてＣＲＢプロモーターの背後のＴＰＳＳ−ｐｈｂＣコーディング領域をクローニングするために、プラスミドｐＵＣ−ＴＰＳＳ−ＳｙｎをＥｃｏＲＩで消化し、付着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより充填し、そして線状化プラスミドを引き続いてＸｂａＩで切断した。２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を他の断片からアガロースゲル電気泳動により分離した。精製されたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩで消化したｐＢＩＢ−Ｈｙｇの中にクローニングした。ＸｂａＩで消化したこの生ずるプラスミドにおいて、プラスミドｐｋ−ＣＲＢの切断により得られたＣＲＢプロモーターを含有する１．１ｋｂｐの断片をクローニングした。修飾されたｐｈｂＣ遺伝子の適切な発現のための右向きのプロモーターを有するクローンを、ｐＢＩＢ−ＨＣＮＳｙｎと表示した（第５図）。要約すると、植物の中に形質転換したとき、修飾された遺伝子が発育する種子の中で特異的に発現され、タンパク質が種子の中の色素体のストロマに標的化されるように、プラスミドｐＢＩＢ−ＣＣＮ−Ｔｈｉｏ、ｐＢＩＢ−ＫＣＮ−Ｒｅｄ、ｐＢＩＢ−ＨＣＮ−Ｓｙｎは構築される。２．アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の中への構築体の導入。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）により伝達される植物形質転換法の使用を可能とするために、両方の系列の構築体のプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ｐＧＶ３１０１株の中にエレクトロポレーションにより転移させた(Koncz、C．およびSchell、J.、 Mol.Gen.Genet.204:383-396、1986;Sambrook、J.、Fritsch、E.F．およびManiatis、 T.、Molecular cloning:a Laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989)。種々のプラスミドで形質転換された細菌のコロニーを、プラスミドｐＢＩ１２１およびｐＢＩＢ上に存在するカナマイシン耐性遺伝子の細菌の発現について選択することによって回収した。３．アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による植物細胞の形質転換。開示する実験において、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）を色素体におけるＰＨＢ生産のモデル植物として使用した。アラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）伝達分裂組織形質転換法により形質転換することができる(Chag、S.S.、Perk、S.K.およびNam、h.-G.、Abstract in:Fourth International Conference on Arabidopsis Research、Vienna、1990)。アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）Ｒｓｃｈｅｗ品種の植物を、植物が抽薹を開始するまで（ほぼ３週）、連続的光の下で成長させた。薹（ほぼ２ｃｍ）を副芽（ａｕｘｉｌｉａｒｙｂｕｄｓ）と一緒にそれらの基部から除去した。創傷部位を所望のプラスミドを有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で感染させた。新しい薹が発生するまで（ほぼ１週）植物を成長させた。再び、薹を除去し、そして創傷部位をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で感染させた。植物を完全な成熟に成長させ、そして種子を収穫した。４．形質転換された植物の選択。種々のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株で感染させた植物から得られた種子を、適当な選択化合物を含有する寒天固化植物培地上に分散させることによって、形質転換されたＴ０植物を選択した。ｐＢＩ−ＴＰＳＳ− Ｔｈｉｏ、−Ｒｅｄおよび−ＳｙｎおよびｐＢＩＢ−ＫＣＮ−ＲｅｄのＴ−ＤＮＡを有する形質転換された植物を選択するために、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを培地に添加した。ｐＢＩＢ−ＣＣＮ−ＴｈｉｏのＴ−ＤＮＡを有する形質転換された植物を選択するために、３０ｎｇ／ｍｌのクロルスルフォロンを培地に添加し、そしてｐＢＩＢ−ＨＣＮＳｙｎを有する植物の選択するために３０μ ｇ／ｍｌのハイクロマイシンを添加した。上の濃度の選択化合物は非形質転換アラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）の成長を妨害するが、形質転換された植物の正常の成長を可能とする。平均すると、ほぼ４０のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染植物の種子から１つの推定上の形質転換体を単離できた。カナマイシン耐性植物を文字／番号の組み合わせで表示した。プラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で感染した植物の種子から、合計１４のカナマイシン耐性植物が回収された。これらをＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＧＨＩ１、−ＧＨＩ２、−ＧＨＩ３、−ＧＨＩ４、−Ｌ、−ＳＴＵ１、−ＳＴＵ２、− ＳＴＵ３、−ＳＴＵ４、−ＳＴＵ５、−ＳＴＵ６、−ＹＺＡＡ１、−ＹＺＡＡ２および-ＹＺＡＡ３と表示した。プラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で感染した植物の種子から、合計１０のカナマイシン耐性植物系が回収された。これらをＴＰＳＳ−ＲｅｄＤＥＦ、 −ＧＨＩ１、−ＧＨＩ２、−ＭＮＯ１、−ＭＮＯ２、−Ｐ１、−Ｐ２、 −ＱＲ、−ＳＴＵ、−ＶＷＸと表示した。プラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で感染した植物の種子から、合計６のカナマイシン耐性植物系が回収された。これらをＴＰＳＳ−Ｓｙｎ−ＡＢＣ、−ＧＨＩ１、−ＧＨＩ２、−ＪＫＬ、− ＰＱＲ、−ＶＷＸと表示した。プラスミドｐＢＩ−ＣＣＮ−Ｔｈｉｏを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で感染した植物の種子から、合計２つのクロルスルフオロン耐性植物が回収された。これらをＣＮ−Ｔｈｉｏ１３− ３および−１４−１と表示した。プラスミドｐＢＩＢ−ＫＣＮ−Ｒｅｄを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で感染した植物の種子から、合計６のカナマイシン耐性植物が回収された。これらをＣＮ−Ｒｅｄ１７−１、−１７ −３、−１７−１ｄＡ、−１７−１ｄＢ、−１７−２Ｋ、−１７−３Ｋと表示した。プラスミドｐＢＩＢ−ＨＣＮ−Ｓｙｎを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で感染した植物の種子から、合計１７のカナマイシン耐性植物が回収された。これらをＣＮ−Ｓｙｎ３４−１ｂＡ、 −３４−１ｂＢ、−３４−２Ａ、−３４−２Ｂ、−３４−１Ｈａ、−３４−１Ｈｂ、−３４−１Ｈｃ、−３４−１Ｇ１、−３４−１Ｇ２、−３５−１、− ３５１ａＡ、−３５−１ａＢ、−３５−２Ａ、−３５−２Ｂ、−３５−２Ｃ、− ３５−３、−３５−１Ｇ１と表示した。５．推定上のホモ接合トランスジェニック系統の単離。ホモ接合植物を生産するために使用した最小の基準は、ホモ接合植物からのすべての子孫が選択マーカーに対して耐性であることが期待されるということである。ゲノムの中の異なる位置に挿入されたＴ−ＤＮＡの多数の異所性コピーの存在は同様な表現型を生じさせるので、一次形質転換事象がただ１つの染色体位置の中へのＴ−ＤＮＡの挿入を含むとき、この基準は最も有用である。推定上のホモ接合系統を同定するために、耐性Ｔ０植物を生殖的隔離で成熟まで成長させた。引き続いて、選択培地に対して耐性であることが示されたいくつかのＴ１植物を再び成熟まで成長させた。次いで、各系統からのほぼ１００個のＴ２種子の試料において、選択可能なマーカーに対する耐性頻度を決定した。特定の植物からのＴ２種子のすべてが選択可能なマーカーに対して耐性である場合、その系統は仮にホモ接合であると考えた。６．得られたトランスジェニック植物の分析。６．１．ｐｈｂ酵素の発現および色素体標的化およびそれらの酵素の色素体への標的化の分析。６．１．１．ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏ、ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−ＲｅｄおよびｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎで形質転換後に得られた推定上の植物の分析。ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏ、ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−ＲｅｄおよびｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎで形質転換されたトランスジェニック植物が葉緑体の中に位置する機能的酵素を生産したかどうかを決定するために、カナマイシン耐性トランスジェニック植物のタンパク質をウェスタンブロット分析により分析した。ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏで形質転換したトランスジェニック植物のタンパク質のウェスタンブロットをアルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）の３−ケトチオラーゼに対して生じさせた抗体とインキュベートした。ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄで形質転換したトランスジェニック植物のタンパク質のウェスタンブロットをアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼに対して生じさせた抗体とインキュベートし、そしてｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎで形質転換したトランスジェニック植物のタンパク質をＰＨＢシンターゼに対して生じさせた抗体とインキュベートした。陰性対照として、推定的に生産された酵素を含有しないトランスジェニック植物の植物抽出物の分析を分析に含めた。陽性対照として、細胞質において酵素を生産するトランスジェニック植物の抽出物を含めた．ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏで形質転換された１４の推定上のトランスジェニック植物のうちで、３つの植物、即ち、ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＧＨＩ１、−Ｌおよび−ＳＴＵ４、の植物抽出物は３−ケトチオラーゼの生産について強いシグナルを示した（第６図）。この酵素はウェスタンブロット上に４５、４６．５および４８ｋＤのバンドのトリプレットとして現れた。これらのバンドは正しくプロセシングされたタンパク質および不正確にプロセシングされた生産物を表す。細胞質の中に位置する非修飾の３−ケトチオラーゼは４４ｋＤａに現れる。従って、葉緑体に標的化した、正しくプロセシングされたＴＰＳＳ−３−ケトチオラーゼは、ルビスコの小さいサブユニットから付加された２３アミノ酸のために、約４７ｋＤａの分子量を有することが期待される。非プロセシングタンパク質は、なお全体のトランシットペプチドを収容し、約５３ｋＤａの分子量を有するであろう。ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄで形質転換された１０の推定上のトランスジェニック植物のうちで、Ｐ１およびＰ２を除外したすべてはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼの生産のシグナルを示した。これらのシグナルの強度は変化し、そしてＴＰＳＳ−Ｒｅｄ−ＤＥＦおよび−ＳＴＵにおいて最強であった（第７図）。シグナルは、タンパク質の正しくプロセシングされた形態および不正確にプロセシングされた形態を表す２８．５、２９．０および３０．５ｋＤａのバンドとして常に現れた。非修飾のタンパク質は２６．５ｋＤａで移動した。従って、非プロセシングＴＰＳＳ−アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼは３５ｋＤａの分子量を有することが期待され、そしてタンパク質の正しくプロセシングされた形態は約２９ｋＤａの分子量を有するであろう。ＴＰＳＳ−Ｓｙｎ−ＡＢＣおよび−ＰＱＲを除外した、ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎで形質転換された６つの推定上のトランスジェニック植物のすべてはシグナルを示した。これらのシグナルの強度は変化し、そして植物ＴＰＳＳ−Ｓｙｎ− ＶＷＸにおいて最強であった（第８図）。シグナルは正しくプロセシングされたＴＰＳＳ−Ｓｙｎタンパク質の大きさでトリプレットのバンドとして示され（６３ｋＤａ）、そしてプロセシングされたバージョンは期待したものよりわずかに短かった（６０および６１ｋＤａ）。非修飾のＰＨＢシンターゼは６０ｋＤａで移動する。実施したすべてのウェスタンブロット分析において、非形質転換植物のタンパク質はシグナルを示さなかった。細胞質においてｐｈｂ酵素を発現する植物は、期待した大きさで強いシグナルを示した。色素体への標的化のためのトランシットペプチドで修飾されたＰＨＢ酵素は期待した大きさにプロセシングされ、従って、色素体の中にほとんど挿入された。さらに、わずかに高いか、または低い移動度におけるバンドがまた発生した。期待するよりわずかに高い移動度をもつタンパク質は、細菌の酵素に付加されたルビスコの小さいサブユニットの成熟タンパク質の２３アミノ酸上のプロテアーゼ活性により発生させることができる。人工的につくられたエクステンションはプロテアーゼに対して特に感受性であることがある。ＣａＭＶプロモーターを含有する各構築体について、高いレベルで期待した酵素を生産する形質転換された植物を得ることができることを、これらの結果は示す。ウェスタンブロット分析において期待した大きさのダブレットまたはトリプレットとしてこれらの酵素の各々が出現することは、酵素が色素体へ輸送されそして期待した方法でプロセシングされることを示す。ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏで形質転換して得られたトランスジェニック植物を、下記の文献に記載されているアッセイの小さい修飾により３−ケトチオラーゼ活性についてアッセイした：Senior、P.J．およびDawes、E.A.、Biochem.J.134:2 25-238、1973。カナマイシン耐性ヘテロ接合Ｔ１植物からの凍結した葉の組織をＴｒｉｓ緩衝液の中で均質化し、そして清澄化粗抽出物を３−ケトチオラーゼ活性について試験した。これらの実験の結果を表２に表す。ウェスタンブロット分析により検出したところ遺伝子を発現していなかった、非形質転換植物、ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄで形質転換されたトランスジェニック植物およびｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏで形質転換されたトランスジェニック植物の抽出物は、アッセイの条件下に非常に低いレベルの３−ケトチオラーゼ活性を有した。対照的に、ウェスタンブロット分析において高い３−ケトチオラーゼの生産を有することが発見されたトランスジェニック植物の各々は、また、増加したレベルの３−ケトチオラーゼ活性を有した。これは修飾された細菌３−ケトチオラーゼが植物の中で機能であることを示す。修飾された３−ケトチオラーゼの比活性は、アラビドープシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の細胞質の中で発現された、非修飾の細菌３−ケトチオラーゼとして活性であった。ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄで形質転換して得られたトランスジェニック植物を、下記の文献に記載されているアッセイの小さい修飾によりアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性についてアッセイした：Senior、P.J．およびDawes、E.A.、B iochem.J.134:225-238、1973。カナマイシン耐性ヘテロ接合Ｔ１植物からの葉をリン酸塩緩衝液の中で均質化し、そして清澄化抽出物をアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性についてアッセイした。これらの実験の結果を表３に表す。ウェスタンブロット分析により検出したところ遺伝子を発現していなかった、非形質転、ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏで形質転換された植物または形質転換された植物からの抽出物は、検出不可能なレベルのアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼを有した。対照的に、ウェスタンブロット分析においてアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼを生産することが発見されたトランスジェニック植物の各々は、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性を示した。活性レベルはウェスタンブロットにおいて見られる生産レベルと相関した。これは修飾された細菌アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼが植物において機能的であることを示す。構築体ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎで形質転換して得られたトランスジェニック植物は、ＰＨＢシンターゼ活性の存在についてアッセイしなかった。なぜなら、チオラーゼ活性およびレダクターゼ活性の不存在においてこの酵素の活性を測定するのが困難であったからである(Peoples、O.P．およびSinsky、A.J.、J.Biol.Che m.264:15298-1530 3、1989)。要約すると、色素体の標的化のために修飾されたＰＨＢシンターゼに関係するすべての３つの酵素は植物の中で有意なレベルに生産され、色素体への輸送について期待した方法でプロセシングされ、そして酵素的に活性であったことを、これらの実験の結果は示す。６．１．２．ｐＢＩＢ−ＣＣＮ−Ｔｈｉｏ、ｐＢＩＢ−ＫＣＮ−ＲｅｄおよびｐＢＩＢ−ＨＣＮ−Ｓｙｎによる形質転換後に得られた推定トランスジェニック植物の分析。ｐＢＩＢ−ＣＣＮ−Ｔｈｉｏ、ｐＢＩＢ−ＫＣＮ−ＲｅｄおよびｐＢＩＢ−ＨＣＮ−Ｓｙｎで形質転換された推定トランスジェニック植物が適当な酵素を生産するかどうかを決定するために、未熟種子の中のタンパク質を分析した。Ｐａｎｇｅｔａｌ．は、これらの実験において使用した種子特異的プロモーターは花の受精後第６日〜第１４日の間に高い遺伝子の発現を指令するので、種子をこの期間に集めた(Pang、P.P.、Pruitt、R.E.およびMeyerowitz、E.M.、Plant Mol.Biol .11:805-820、988)。凍結未熟種子を緩衝液の中で均質化し、そして水性相の中に存在するタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。タンパク質をニトロセルロースに移し、そして前述したように抗体とインキュベートした。ｐＢＩＢ−ＣＣＮ−Ｔｈｉｏで形質転換後に得られた両方の植物は、ウェスタンブロットにおいて酵素の高いレベルの発現を示した。酵素は４３〜４７ＫＤａの間の大きさで四重バンドとして現れた。４７ＫＤａにおけるバンドは修飾された酵素の正しくプロセシングされた形態について期待した大きさを表す（第９図）。６つのカナマイシン耐性植物のウェスタンブロット分析において、植物１７− ３Ｋのタンパク質抽出物のみがアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼに対して生じさせた抗体と反応した。シグナルはタンパク質の正しくプロセシングされた大きさ（２９ＫＤａ）における二重バンドおよびわずかに大きいタンパク質（３１ＫＤａ）として現れた（第１０図）。ｐＢＩＢ−ＨＣＮ−Ｓｙｎで形質転換後に得られた１７植物のうちの１３を分析した。これらのうちで、１１植物は修飾された細菌シンターゼの低いレベルの発現を示した。トランスジェニック植物ＴＰＳＳ−Ｓｙｎ３４−１Ｇ１は、他のトランスジェニック植物よりほぼ５倍高いレベルの発現を有する。シグナルはプロセシングされた酵素の大きさの単一バンドとして現れる（６３ＫＤａ）（第１１図）。種子特異的プロモーターのコントロール下に発現された修飾ＰＨＢ酵素の予備的結果は、それらが種子の中で合成されておりそして色素体に対する標的化について期待した方法でプロセシングされることを示す。適当なｐｈｂ酵素を高いレベルに発現する形質転換植物のホモ接合系統が得られた後、酵素が色素体の中に位置することをさらに示すために、免疫局在化研究が実施されるであろう。６．２．トランスジェニック植物におけるｐｈｂ遺伝子の組み込みの分析生産された種々のトランスジェニック植物系統におけるｐｈｂ遺伝子の適切な組み込みを評価するために、トランスジェニック植物のゲノムＤＮＡを分析した。非形質転換植物およびプラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏ、ｐＢＩ− ＴＰＳＳ−ＲｅｄおよびｐＢＩ−ＴＰＳＳ−ＳｙｎまたはｐＢＩＢ−ＣＣＮ−Ｔｈｉｏ、ｐＢＩＢ−ＫＣＮ−ＲｅｄおよびｐＢＩＢ−ＨＣＮＳｙｎで形質転換されたＴ２トランスジェニック植物から、高分子量のＤＮＡを単離した。ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、そしてナイロンフィルター上に移した。構築体ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏ、ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−ＲｅｄおよびｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎにおいて、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩはＣａＭＶ３５Ｓプロモ一ターの５’末端において１回だけ切断する（第４図）。ｐＢＩＢ−ＣＣＮ−Ｔｈｉｏ、ｐＢＩＢ−ＫＣＮ−ＲｅｄおよびｐＢＩＢ−ＨＣＮＳｙｎにおいて、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩはｐｈｂ遺伝子のコーディング領域の５’のみを数回切断する。従って、ｐｈｂ遺伝子特異的プローブを使用して検出された断片は、Ｔｉベクターと植物ゲノムＤＮＡとの接合断片、またはコンカタマー化Ｔｉベクターの内部断片を表すであろう。プラスミドｐＵＣ−ＴＨＩＯ、ｐＵＣ−ＲＥＤおよびｐＵＣ−ＳＹＮの中のインサートをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理して切取り、電気泳動により精製し、そしてランダムプライミングにより³²ｐ−デオキシリボヌクレオチドで標識化した。次いで、標識化ｐｈｂ遺伝子断片を使用してナイロンフィルターをプロービングした。フィルターをハイブリダイゼーションし、そして引き続いて高いストリンジェント条件下に洗浄した。これらのフィルターのハイブリダイゼーションの結果をｐＢＩ−ＴＰＳＳ−ｐｈｂ構築体について第１２図に、そしてｐＢＩＢ −ＣＮ−ｐｈｂ構築体について第１３図に示す。３つのｐｈｂ遺伝子のいずれも非形質転換対照植物において検出できない（第１２図ａ、ｂ、ｃおよび第１３図ａ、ｂ、ｃ、レーンＣ）。プラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏで形質転換して生産された３つのトランスジェニック系統（第１２図ａ、レーンＴｈｉｏ１〜３）およびプラスミドｐＢＩＢ−ＣＣＮ−Ｔｈｉｏで形質転換して生産された２つのトランスジェニック系統（第１３図ａ、レーンＴｈｉｏ１〜２）において、ｐｈｂＡ遺伝子が検出された。プラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄで形質転換して生産されたトランスジェニック植物（第１２図ｂ、レーンＲｅｄ１〜７）およびプラスミドｐＢＩＢ−ＫＣＮ−Ｒｅｄで形質転換して生産された６つのトランスジェニック系統のうちの２つ（第１３図ｂ、レーンＲｅｄ１〜５）において、ｐｈｂＢ遺伝子が検出された。植物系統ＣＮ−Ｒｅｄ１７−３、−１７−１ｄＡ、１７−１ｄＢおよび−１７−２Ｋは５０μｇ／ｍｌのカナマイシンに対して耐性であり、ＮＰＴＩＩ遺伝子の組み込みを示唆したが、ｐｈｂＢ遺伝子は検出されなかった。ＮＰＴＩＩ遺伝子を収容し、ｐｈｂＢ遺伝子を収容しないＴｉベクターの断片のみがこれらの系統のゲノムＤＮＡの中に組み込まれたようである（第１３図ｂ）レーンＲｅｄ２、３、４、６）。プラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎで形質転換して生産された４つのトランスジェニック植物系統（第１２図ｃ、レーンＳｙｎ１〜４）およびプラスミドｐＢＩＢ−ＨＣＮ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎで形質転換して生産された６つのトランスジェニック植物系統（分析した、第１３図ｃ、レーンＳｙｎ１〜６）において、ｐｈｂＣ遺伝子が検出された。トランスジェニック植物系統ＣＮ−Ｓｙｎ３４− １ｂＡおよびＣＮ−Ｓｙｎ３４−１ｂＢは、サザンブロット上でバンドの同一パターンを有するので、同一である（第１３図ｃ、レーンＳｙｎ１および２）。植物ＣＮ−Ｓｙｎ３４−１ＨｂおよびＣＮ−Ｓｙｎ３４−１Ｇ１（第１３図ｃ、レーンＳｙｎ３および４）および植物ＣＮ−Ｓｙｎ３５−１およびＣＮ− Ｓｙｎ３５−１ａ（第１３図ｃ、レーンＳｙｎ５および６）について同一の現象を見ることができ、そしてこの現象は形質転換法に関係づけられる。一連の性的交雑を使用して、すべての組織の色素体の中にすべての３つのｐｈｂ酵素を含有する植物系統を構築した。色素体の中で大量のアセトアセチル −ＣｏＡレダクターゼを発現する３つのトランスジェニック系統（系統ＴＰＳＳ −ＲｅｄＤＥＦ、ＭＮＯ１およびＳＴＵ）を、色素体の中で大量のＰＨＢシンターゼを生産するトランスジェニック植物（系統ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１、ＧＨＩ２およびＶＷＸ）と異花受粉させた。色素体の中でアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼを発現する、生ずるハイブリッドＴＰＳＳ−Ｒｅｄ／ＴＰＳＳ−Ｓｙｎ植物は、ガスクロマトグラフィーにより分析して、伸び広がる葉の中で測定可能な量のＰＨＢを生産しなかった（＜２０μｇ／ｇ新鮮重のＰＨＢ）。比較により、細胞質の中でアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼを同様なレベルに生産するトランスジェニック植物はＰＨＢを生産した(Poirier、Y.、Dennis、D.E.、Klomparens、K.、およびSomerville、 C.R.、Science 256、520-523、1992および米国特許出願第07/732,243号）。この差について考えられる理由は、ＰＨＢ生産を支持するために十分な３−ケトチオラーゼを色素体が有することができないということである。これはアセチル−ＣｏＡからイソペンテニル−ピロホスフェートへ導かれるメバロネートの経路の初期の段階が分化した色素体の中に存在しないという証拠と一致する(Krenz、K．およびKleinig、H.、Eur.J.Biochem.141、531-535、1984、Schultz、G.およびSchulze-Sieb ert、D.、Biological Role of Plant Lipids、編、Biacs P.A.、Gruiz、K.、およびKre mmer、T.(Plenum Publishing Corporation、New York、NY)pp.313-319、989)。すべての組織の色素体における完全な生合成経路を確立するために、大量のチオラーゼを有するトランスジェニックアラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）（系統ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ）をＴＰＳＳ−Ｒｅｄ／ＴＰＳＳ−Ｓｙｎハイブリッドで異花受粉した。交雑の５つの組み合わせから、ＰＨＢを生産しそして従ってＰＨＢ生産のために必要なすべての３つの酵素を有するある数のハイブリッドを形成した（ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ− ＲｅｄＤＥＦ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１、ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＳＴＵ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１、ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＳＴＵ／ＴＰＳＳ−Ｓｙｎ−ＧＨＩ２、ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＳＴＵ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＶＷＸ、ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＭＮＯ１／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＶＷＸ）。まず、ナイル・ブルー（ＮｉｌｅＢｌｕｅ）Ａで染色した組織のエピフルオレンス顕微鏡により、ＰＨＢを生産するハイブリッドを同定した。高いレベルの蛍光をもつ植物は、比較的低いレベルの蛍光をもつ植物より高いレベルのＰＨＢを有した。次いで、これらのハイブリッドにおいて生産されたＰＨＢをガスクロマトグラフィーにより定量し、そしてＧＣ−ＭＳにより同定した（第１４図、第１５図）。日齢２０〜３０の植物の伸び広がる葉の中のＰＨＢの量は、２０μｇのＰＨＢ／ｇ新鮮重〜７００μｇのＰＨＢ／ｇ新鮮重の範囲であった（第１６Ａ図）。３系ハイブリッドは植物の生存を通じてＰＨＢを蓄積し続けたので、老衰する植物の葉において、ＰＨＢのレベルは伸び広がる葉における量より８〜１３倍高かった（即ち、７ｍｇまでのＰＨＢ／ｇ新鮮重）（第１６Ｂ図）。経時的ＰＨＢ蓄積のこの増加は、初期ＰＨＢ含量が低い植物（伸び広がる葉における１００μｇ／ｇ新鮮重は老衰前の葉における１．１ｍｇ／ｇに到達する）ならびに初期ＰＨＢ含量が高い植物（伸び広がる葉における７００μｇ／ｇ新鮮重は老衰前の葉における７ｍｇ／ｇに到達する）において観察された。ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＤＥＦ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１ハイブリッドにおいて、老衰する葉において測定したＰＨＢの最大量はそれらの乾燥重量のほぼ１４％であった（１０ｍｇ／ｇ新鮮重）。色素体の中でＰＨＢを生産する植物は、最高レベルのＰＨＢ蓄積においてさえ野生型の成長および受精能力を示した（第１７図）。高いレベルのＰＨＢを生産するハイブリッドの種子の発芽速度において、野生型と差は観察されなかった。しかしながら、伸び広がる葉において３００〜４００μｇＰＨＢ／ｇ新鮮重を生産する植物は、成長の後の段階の間に視的検査により野生型と区別することができた。これらの植物において、葉はほぼ５０〜６０日の成長後にわずかの白化を示し、非常に高いレベルのＰＨＢ蓄積（＞３ｍｇＰＨＢ／ｇ新鮮重）において、葉緑体の代謝のある面は影響を受けることがある（第１８図）。ＰＨＢ生産ハイブリッドの葉の試料の透過型電子顕微鏡検査は、ＰＨＢが電子密な物質の薄層で取り囲まれた、ほぼ０．２〜０．７μｍの電子透過性顆粒の集合体として蓄積することを明らかにした（第１９Ａ図）。同様な外観の顆粒は細菌のＰＨＢについて(Lundgren、D.G.、Pfister、R.M.、およびMerrick、j.M,、J.Gen． Microbiol.3 4、441-446、964)または植物細胞の細胞質、核および空胞におけるＰＨＢについて(Poirier、Y.、Dennis、D.E.、Klomparens、K.、およびSomerville、C.R.、 Science 256、520-523、992および米国特許出願第07/732,243号)記載されてきている。色素体ターゲテッドｐｈｂ酵素を発現する植物において、これらの顆粒の集合体はもっぱら色素体の中に位置した。これは細胞質においてＰＨＢ生合成経路を発現するトランスジェニック植物と対照的であり、この細胞質は色素体の中ではなく、核、空胞および細胞質の中でＰＨＢを蓄積した(Poirier、Y.、Dennis、D.E .、Klomparens、K.、およびSomerville、C.R.、Science 256、520-523、1992および米国特許出願第07/732,243号)。ＰＨＢ顆粒は、慣用の電子顕微鏡検査の固定のプロトコールにより可視化したとき、顆粒の形態、外観および体制において、澱粉顆粒と明瞭に区別された。ＰＨＢ顆粒は小さく、丸い電子透過性顆粒を形成する密な集合体である（第１７ａ図）。比較において、澱粉は、拡散区域により取り囲まれた、胚珠の形態の、変わった、電子が密な顆粒として現れる（第１９Ｂ図）。伸び広がる葉において少量のみのＰＨＢを生産するトリ−ハイブリッドにおいて、電子顕微鏡検査の分析により、すべてではない葉緑体がＰＨＢを蓄積したように思われた。この理由は知られていない。異なる組織における導入遺伝子の異なる発現についての徴候が存在した。多分、それは電子顕微鏡検査の分析が全体の色素体の体積の小さい区域のみの検査を可能とするという事実を単に反映しているのであろう。また、それはペチュニアにおいて観察されるような、示差的発現のモザイクに導くことがある共抑制の作用を反映していることがある(Jor gensen、R,、Trends in Biotechno1ogy 8、340-344、990)。高いレベルのＰＨＢを蓄積するトリ−ハイブリッドの古い葉において、ほとんどすべての葉緑体はＰＨＢを含有した。種々のハイブリッドにおいて生産されたＰＨＢの異なる量の原因となるメカニズムを洞察するために、ＰＨＢ生産植物の中に存在する３−ケトチオラーゼ活性およびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性のレベルを清澄化粗葉タンパク質抽出物において測定した。ＰＨＢシンターゼはウェスタンブロット分析により分析した。ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−Ｒｅｄ／ＴＰＳＳ−Ｓｙｎハイブリッド植物における３−ケトチオラーゼ活性は、０．００１〜０．８ｕ／ｍｇタンパク質の範囲であった。対照的に、親ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ植物における３−ケトチオラーゼ活性は０．８４＋／−０．１５ｕ／ｍｇタンパク質であった。ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ系統のサザンブロット分析は、多分構築体のいくつかの独立の組み込みに相当する、ｐｈｂＡ遺伝子にハイブリダイゼーションした４つのバンドを明らかにした（第１２Ａ図、ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏレーン２）。従って、異なるｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏ構築の分離は、Ｆ１世代における３−ケトチオラーゼ活性の範囲を発生させることができる。このような変動は、問題の種々の導入遺伝子についてホモ接合である真の育種系統を発生させる標準の植物育種法を使用することによって、容易に排除することができる。ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＤＥＦ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１ハイブリッド植物におけるアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性は、０．００７〜０．７８ｕ／ｍｇタンパク質であった。ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬとの交雑における親として働いたＴＰＳＳ−ＲｅｄＤＥＦ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１ハイブリッドにおけるアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性は、２．０９＋／−０．２３ｕ／ｍｇタンパク質であった。Ｆ１世代におけるサザンブロット分析および選択可能なマーカーの分離比の分析は、ＴＰＳＳ−ＲｅｄＤＥＦ植物が構築体ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄを単一の組み込み部位に収容することを示した（第１２ｂ図、ＴＰＳＳ−Ｒｅｄレーン１）。ウェスタンブロット分析において、活性の減少はＰＨＢ生産植物の清澄化抽出物の中のタンパク質量のほぼ１０倍の減少と相関することが示された。同様に、ＰＨＢ生産ハイブリッド植物ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＳＴＵ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ１、ＴＰＳＳ− ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＳＴＵ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＧＨＩ２、ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＳＴＵ／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＶＷＸ、およびＴＰＳＳ−ＴｈｉｏＬ／ＴＰＳＳ−ＲｅｄＭＮＯ１／ＴＰＳＳ−ＳｙｎＶＷＸは、また、それらの親植物に比較して、広く変化する、予期せざるほどに低いレダクターゼ活性を有し、これはウェスタンブロット分析におけるタンパク質の少ない物質と相関した。トリ−ハイブリッドにおいてレダクターゼ活性が変動し、異常に低い理由は、ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄ構築体のコピー数の変化により説明することができない。この変動性は修飾されたｐｈｂ遺伝子のすべての転写体が２４３ｂｐの共通の配列、即ち、トランシットペプチド（ＴＰＳＳ）のコーディング領域、を含有するという事実のためである（第３図）。ＴＰＳＳのコーディング領域で修飾された１または２以上のチオラーゼ遺伝子を獲得すると、共抑制のメカニズムにより、他のＴＰＳＳ含有遺伝子、例えば、ＴＰＳＳ− Ｒｅｄ、を下方に調節することができる(Jorgensen、R.、Trends in Biotechnolog y 8、340-344、1990、Seymour、G.B.、Fray、G.R.、Hill、P．およびTucker、G.A.、Plant Mol.Biol.23、1-9、1993)。共抑制は、また、透過型電子顕微鏡検査により検査したとき、ある細胞はＰＨＢで充満されているが、隣接する細胞はＰＨＢを示さないという理由を説明することができる。従って、共抑制を回避しかつＰＨＢ生産植物におけるｐｈｂ遺伝子の変動する低い発現を軽減するために、導入されたｐｈｂ遺伝子の各々のために異なるトランシットペプチドを付加することによって、色素体の標的化のためにすべてのｐｈｂ遺伝子を修飾すべきである。トランシットペプチドの配列を包含する多数の異なる葉緑体局在化タンパク質のために配列は、現在、入手可能である。従って、この例において使用するアミノ末端のトランシットペプチドの一部分またはすべてを、通常葉緑体局在化のタンパク質のそれと置換することによる本発明の改良方法は、当業者にとって明らかであろう。ＰＨＢ生産植物の葉タンパク質抽出物のウェスタンブロット分析により、ＰＨＢシンターゼの存在を研究した。ＴＰＳＳ−Ｔｈｉｏ／ＴＰＳＳ−Ｒｅｄ／ＴＰＳＳ−Ｓｙｎハイブリッド植物において、ＰＨＢシンターゼは可溶性タンパク質の画分の中に決して検出することができなかった。しかしながら、ＰＨＢシンターゼは可溶化膜のウェスタンブロットおよび植物抽出物の粒状画分上で容易に検出可能であった。対照的に、ｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｓｙｎのみで形質転換した植物において、ＰＨＢシンターゼは可溶性画分の中で検出できた（第２０図）。この発見は、細菌の中のＰＨＢシンターゼについて示したように、ＰＨＢシンターゼは植物の中で形成されたＰＨＢ顆粒と密接に関連することを示唆する(Fukui、T.、 Yoshimoto、A.、Matsumoto、M.、Hosokawa、S.Saito、T.、Nishikawa、H.、およびTomita、 K.、Arch.Microbiol.110、149-156、1976、Haywood、G.W.、Anderson、A.J.およびDawe s、E.A.、FEMS Microbiol.Lett.57、1-6、1989)。一般に、最高のレベルの３−ケトチオラーゼ活性およびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性の両方をもつトランスジェニック植物は最高のレベルのＰＨＢを有し、そして低いレベルの両方の活性をもつ植物は最低のレベルのＰＨＢを有した。最高のレベルの測定可能な酵素活性において、ＰＨＢ生産の明らかなプラトーは存在しなかった。従って、ＰＨＢ蓄積はアセチル−ＣｏＡの利用可能性よりむしろ酵素活性の量により制限されるように思われる。従って、植物において生産される種々のｐｈｂ酵素の量を増加することによって、トランスジェニック植物において生産されるＰＨＢの量を本明細書に記載する量を越えて増加させることができるであろう。これを達成する１つの方法は、植物の中に導入されるｐｈｂ遺伝子の各々について異なる色素体標的化配列を使用することによって、同一トランシットペプチド（色素体に対する標的化のための）を有する修飾されたｐｈｂ遺伝子の共抑制現象を回避することである。また、これらの実験において使用するＣａＭＶまたはＣＲＢプロモーターを使用して可能であるより高い発現レベルに導く強いプロモーターを使用することによって、トランスジェニック植物におけるｐｈｂ酵素の生産量を増加することが可能である。ｐｈｂ遺伝子の細菌のコーディング領域のコドンの使用は高等植物について典型的ではないので、また、その中で遺伝子を発現すべき高等植物が最も普通に利用するコドンによりアミノ酸配列がコードされるように、細菌遺伝子のコーディング配列を変更することによって、酵素の発現を増加することが可能であろう。要約すると、ＰＨＢ生合成経路をそれらの色素体の中で発現するように操作された植物は、ＰＨＢを大量に蓄積する。アセチル−ＣｏＡを通る低い流れをもつ細胞区画（細胞質）からアセチル−ＣｏＡを通る高い流れをもっ区画（色素体）にＰＨＢ生産の位置を変化させることによって、ＰＨＢ生産の最大レベルは１００倍まで増加された（Poirier、Y.、Dennis、D.E.、Klomparens、K.、およびSomervil le、C.R.、Science 256、520-523、992および米国特許出願第07/732,243号に記載されているように、細胞質の発現についてほぼ100 μg/g新鮮重から、本明細書に記載されているように、色素体の発現についてほぼ10mg/g新鮮重まで）。色素体において高いレベルのＰＨＢを生産する植物は、通常の成長および成長力を示した。これは、ＰＨＢが植物に対して毒性でないこと、そして色素体におけるＰＨＢ生産に対する生物学的障害は存在しないように思われることを示す。細胞質の必須の代謝経路からの代謝物の消耗は、細胞質においてＰＨＢ酵素を発現する植物におけるＰＨＢ生産の有害作用のための理由であったように思われる（ Poirier、Y.、Dennis、D.E.、Klomparens、K.、およびSomerville、C.R.、Science 256、 520-523、1992および米国特許出願第07/732,243号）。しかしながら、ＰＨＢ顆粒は、また、核の中に位置したので、ＰＨＢ顆粒と核の構成成分との相互作用は、また、これらの植物におけるＰＨＢ生産の有害作用の原因であった可能性がある。種子特異的プロモーターＣＲＢのコントロール下に修飾されたｐｈｂ遺伝子を発現するトランスジェニック植物を使用して、同様な分析を実施した。ｐＢＩＢ −ＫＣＮ−Ｒｅｄで形質転換され、発育する種子の色素体において実質的な量のアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼを生産する植物を、ｐＢＩＢ−ＨＣＮ−Ｓｙｎで形質転換され、発育する種子の色素体において実質的な量のＰＨＢシンターゼを生産する植物と異花受粉させた。ＧＣ−ＭＳ分析および電子顕微鏡検査により、生ずるハイブリッドを種子におけるＰＨＢ生産について分析する。発育する種子の色素体の中の内因性アセチル−ＣｏＡの量はＰＨＢ生産を可能とするために十分であるので、発育する種子の色素体における色素体の標的化のために修飾された３−ケトチオラーゼを導入してトリ−ハイブリッドをつくる。すべての３つの酵素を生産するトリ−ハイブリッドをつくるために、レダクターゼ／シンターゼの二重ハイブリッドを、発育する種子の色素体において３−ケトチオラーゼを発現するトランスジェニック植物と異花受粉させる。生ずるチオラーゼ／レダクターゼ／シンターゼのトリ−ハイブリッドの種子の中で生産される大量のＰＨＢを、ＧＣ−ＭＳおよび電子顕微鏡検査により分析する。色素体の中でＰＨＢを生産するこの方法は、種々のトランスジェニック系統を交雑して生産されたハイブリッド植物の使用に制限されない。この方法の好ましい別の実行は、宿主植物の中への同時の導入のために共直線状ＤＮＡ分子上にすべての３つの遺伝子を配置することを包含する。また、本明細書に記載するＰＨＢを高いレベルで生産させる一般的方法はすべての高等植物に一般に適用可能であり、そして遺伝子を導入しそして発現させ、そして高等植物の他の種における色素体の中にタンパク質を輸送することは当業者にとって明らかであると考えられる。材料および方法ＤＮＡ組み換え体の構築プラスミドを収容する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）またはアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢブロスの中で増殖させた。プラスミドＤＮＡの調製は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）に記載されているようなアルカリ溶解法により実施し、そして必要に応じてマジックミニＤＮＡアフィニティーカラム（ＰｏｒｍｅｇａＣｏｒｐ．、ウイスコンシン州）による精製を実施した。プラスミドＤＮＡを製造業者（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、マサチュセッツ州；ＰｏｒｍｅｇａＣｏｒｐ．、ウイスコンシン州；ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インジアナ州；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州）の勧めに従い制限エンドヌクレアーゼで切断し、アガロースゲル電気泳動により分離し、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）に記載されているように臭化エチジウムにより可視化した。ＤＮＡ断片を凍結融解法（ｆｒｅｅｚｅｔｈｒｏｗｍｅｔｈｏｄ）およびフェノール抽出によりアガロースゲルから回収した。簡単に述べると、アガロース断片をレーザーブレードで非常に小さい片にスライスし、同一体積のフェノール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）に記載されているように調製した）を添加し、そして激しく攪拌した。懸濁液を２回凍結し、融解し、そして引き続いて遠心した。断片を含有する上澄みをフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によりさらに精製した。いくつかの実験において、ＤＮＡ断片のくぼんだ（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）３’末端を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）に記載されているプロトコールを使用して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端に変換した。ＤＮＡ断片と粘着末端または平滑末端との結合は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）に記載されているように、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール８０００、０．５ｍＭのＡＴＰおよび５ｍＭのジチオスレイトールを含有する緩衝液の中で１４℃ において１６時間実施した。結合反応の画分を、Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０（１９８３）に記載されているような塩化ルビジウム法により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中に移した。形質転換された細菌をＬＢブロスおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンまたは５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する寒天プレート上にプレートした。放射線標識化ＤＮＡプローブの調製およびハイブリダイゼーションは、下記の節に記載されている。オリゴヌクレオチドはミシガン州立大学の生化学設備により合成された。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、パーキン−エルマー・セツス（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）サーマルサイクラー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、コネチカット州）を使用して実施した。反応混合物は２００ｐｍｏｌの２オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー（表１）、２００ｎｇのプラスミド（表１）、および２．５単位のＶｅｎｔポリメラーゼを供給業者（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＩｎｃ．、マサチュセッツ州）により推奨される緩衝条件において含有した。細菌のＰＨＢ酵素の増幅のためのＤＮＡサーマルサイクラーのプログラムは次の通りであった：９５℃において４分、続いて９７℃において１．５分−６５℃において２分−７２℃において３分を３０回繰り返すおよび最後に７２℃において７分。ＴＰＳＳ断片について：９５℃において４分、続いて９５℃において１．５分−６０℃において２分−７２℃において２分を３０回繰り返す、および最後に７２℃において７分。ＣＲＢプロモーターについて：９５℃において４分、続いて９５℃において１．５分−５８℃において２分−７２ ℃において２分を３０回繰り返す、および最後に７２℃において７分。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動により単離し、そして前述したように精製した。ゲノムＤＮＡの抽出および制限エンドヌクレアーゼ切断野生型植物およびトランスジェニック植物を土壌の中で２〜３週間成長させ、そして葉材料のほぼ５ｇを集め、そして液体窒素の中で凍結させた。高分子量のＤＮＡを、Ｒｏｇｅｒｓ、Ｓ．Ｃ．およびＢｅｎｄｉｃｈ、Ａ．Ｊ．、ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌＡ６：１− １０（１９８８）に記載されているように、凍結植物組織から抽出した。１μｇのＤＮＡについて酵素ＨｉｎｄＩＩＩによる制限エンドヌクレアーゼ切断を、製造業者（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＩｎｃ．、マサチュセッツ州）により推奨される条件下に実施した。アガロースゲル電気泳動およびハイブリダイゼーション法アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ分析およびナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ− Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州）への転移は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎｅｔａｌ．（１９７５）およびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている確立された方法により実施した。プローブとして使用すべき特定のクローニングしたＤＮＡ断片を適当な制限エンドヌクレアーゼでベクターから切取り、インサートをアガロースゲル電気泳動および電気溶離によりベクターから精製した。Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、Ａ．Ｐ．およびＶｏｌｇｅｌｓｔｅｉｎ、Ｂ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２、６−１３（１９８３）に記載するように、ヘキサマーを使用するランダムプライマー抽出法により、断片を³²Ｐ−デオキシリボヌクレオチドで標識化した。ナイロンフィルターを標識化プローブとハイブリダイゼーションさせ、そしてＰｏｉｒｉｅｒ、Ｙ．およびＪｏｌｉｃｏｅｕｒ、Ｐ．Ｊ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３、２０８８−２０９８（１９８９）に記載されているように、フィルム上に露出した。融合タンパク質の構築および抗体の発生アルカリゲネス・エウトロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）の３−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼに対する抗体を発生させるために、ｐＩＨ８２１（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＩｎｃ．、マサチュセッツ州）を使用することによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のマルトース結合タンパク質ｍａｌＥとの融合タンパク質を構築した。ｐＵＣ−Ｔｈｉｏプラスミド(Somerville、C.R.、Poirier、Y.、およびDennis、D.E.、米国特許出願第07/732,243号)の１．２ｋｂｐのＸｈｏＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を精製し、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼにより末端を満たし、そしてそれをｐＩＨ８２１の中にクローニングすることによって、ＭＡＬＥ−Ｔｈｉｏｌａｓｅ融合タンパク質を構築した。ＸｂａＩで消化しそしてＴ４−ＤＮＡポリメラーゼにより末端を満たすことによって、ベクターを調製した。所望の向きでインサートを有するクローンは、リーディングフレームがＭＡＬＥ−Ｔｈｉｏｌａｓｅ融合を得るために正しい方法で、遺伝子融合を含有する。このプラスミドをｐｍａｌＥ−Ｔｈｉｏと表示した。ＭＡＬＥ−Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ融合タンパク質を得るために、ｐＵＣ−Ｒｅｄプラスミド(Somerville、C.R.、Poirier、Y.、およびDennis、D.E.、米国特許出願第07 /732,243号)をＤｄｅＩおよびＳａｃＩで消化した。０．７ｋｂｐの断片の精製後、末端をＴ４−ＤＮＡポリメラーゼで満した。平滑末端のｐＩＨ８２１ベクターを、前述したように、ＸｂａＩ消化した平滑末端のｐＩＨ８２１ベクターの中にクローニングした。ＭＡＬＥ−Ｒｅｄｕｃｔａｓｅの発現のために正確な向きで断片を含有するクローンを、ｐｍａｌＥ−Ｒｅｄと表示した。ＭＡＬＥ−Ｓｙｎｔｈａｓｅ融合タンパク質の構築のために、ｐＵＣ−ＳｙｎをＮｃｏＩで消化し、そして末端をＴ４−ＤＮＡポリメラーゼで充填した。引き続いて、プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして１．６ｋｂｐの断片をｐＩＨ８２１の中にクローニングした。ＸｂａＩで消化し、そしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を満し、引き続いてＨｉｎｄＩＩＩで消化することによって、ベクターを調製した。このクローンをｐｍａｌＥ−Ｓｙｎと表示した。ｐｍａｌＥ−Ｔｈｉｏ、−Ｒｅｄおよび−ＳｙｎプラスミドをＤＨ５αの中に形質転換しそして、製造業者（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＩｎｃ．、マサチュセッツ州）が記載するように、融合タンパク質を発現させそして精製した。免疫刺激剤としてフロインドアジュバントを使用することによって、融合タンパク質をウサギに注射してポリクローナル抗体を発生させた。３−ケトチオラーゼ活性についてのアッセイ１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭのＭｇＣｌ₂および５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含有する２００μｌの氷冷チオラーゼ緩衝液の中で、凍結した葉の試料（０．１ｇ）を均質化した。ホモジネートを１００００×ｇで５分間遠心することによって清澄化し、そして上澄みを新しい管に移した。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイによりＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイキット（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州）を使用して、抽出物のタンパク質含量を測定した。３〜３０μｇ／アッセイの植物タンパク質を使用した。異なる抽出物の中の３−ケトチオラーゼ酵素の活性を、Ｓｅｎｉｏｒ、Ｐ．Ｊ．およびＤａｗｅｓ、Ｅ．Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３４：２２５−２３８、１９７３、の方法従いアッセイした。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性のアッセイ１００ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ５．５）、０．０２ｍＭのＭｇＣｌ₂および４．０ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含有する２００μｌの氷冷レダクターゼ緩衝液の中で、凍結した葉の試料（０．１ｇ）を均質化した。ホモジネートを１００００×ｇで５分間遠心することによって清澄化し、そして上澄みを新しい管に移した。ブラッドフォード・アッセイによりＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイキットを使用して、抽出物のタンパク質含量を測定した。０．８〜１０μｇ／アッセイの植物タンパク質を使用した。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ酵素の活性を、Ｓｅｎｉｏｒ、Ｐ．Ｊ．およびＤａｗｅｓ、Ｅ．Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３４：２２５−２３８、１９７３、の方法従いアッセイした。ウェスタンブロット分析ウェスタンブロット分析のために、酵素活性のアッセイのために前述したように調製した粗植物抽出物を使用した。ＰＨＢシンターゼの発現の分析のために、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＥＤＴＡおよび４ｍＭの β−メルカプトエタノールを含有する２００μｌの氷冷チオラーゼ緩衝液の中で、凍結した葉の試料（０．１ｇ）を均質化した。ホモジネートを１００００×ｇで５分間遠心することによって清澄化し、そして上澄みを新しい管に移した。いくつかの実験において、膜および粒子の画分を１％のＳＤＳを含有する抽出緩衝液の中で部分的に可溶化し、そして再び遠心により清澄化した。変更されたＬｏｗｒｙ法(Markwell、M.A.K.、Haas、M.、Bieber、L.L.およびTolbert、N.E.、Anal.Bioc hemistry 87、206-210(1978)により、この試料のタンパク質含量を測定した。Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５、１９７０に従い、ドデシル硫酸ナトリウムのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳＰＡＧＥ）により、上澄みのアリコートを分離した。タンパク質を電気泳動によりニトロセルロースフィルターに移した。ＥＣＬウェスタンブロッティングプロトコール（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｐＩｃ、ＡｍｅｒｓｈａｍＵＫ）において推奨されているように、ウェスタンブロット分析を実施した。フィルターをブロッキングするために、５％の脂肪不含乳粉／０．１２％のツイーン２０を含むＴＢＳ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１３７ｍＭのＮａＣｌ）を選択した。フィルターのインキュベーション前に、第１抗体をブロッキング溶液の中で１：１０００に希釈した。ＥＣＬウェスタンブロッティン検出システム（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｐｌｃ、ＡｍｅｒｓｈａｍＵＫ）により、抗体反応を検出した。ポリヒドロキシブチレートの分析ガスクロマトグラフィーの分析のために、２０〜１００ｍｇの葉材料を５０％のエタノールで３〜４回抽出し、次いで１００％のメタノールで４５分〜１時間の間５５℃において抽出した。乾燥残留物を５５℃において０．５ｍｌのクロロホルムで少なくとも１２時間抽出し、そしてエタノール中の０．８ＭのＨＣｌの中で１００℃において４〜６時間エステル交換した。０．９ＭのＮａＣｌで抽出後、クロロホルム相をヒューレット−パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋｅｒｄ）５８９０系列ＩＩガスクロマトグラフで分析した。細菌のＰＨＢ（Ｓｉｇｍａ）を標準として使用した。エピフルオレセンス顕微鏡検査によりＰＨＢ顆粒を可視化するために、葉の試料を１０ｍＭのリン酸塩緩衝液中の２％のグルタルアルデヒドの中で２時間固定した。組織を水の中ですすぎ、そして１％のナイル・ブルーＡの中で５分間染色した。組織を水の中で数回すすぎ、そして８％の酢酸の中で１分間ソーキングし、次いで最後に水の中ですすいだ。５４６または５６５ｎｍの励起波長下のエピフルオレセンス顕微鏡検査により、ＰＨＢ顆粒を可視化した(Ostle、A.G．およびHolt、J.G.、Appl.Environ.Microbiol.44、238-241、19 82)。透過型電子顕微鏡検査組織の試料を０．０１Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）中の０．８％のグルタルアルデヒド／２％のパラホルムアルデヒドの中でわずかの真空下に２時間固定した。リン酸塩緩衝液で４回洗浄した後、試料を１％の四酸化オスミウムで４０〜６０分間処理した。試料をエタノール勾配の系列で脱水し、そしてスプール（Ｓｐｕｒｒ）樹脂（ＴｅｄＰｅｌｌａＩｎｃ．）の中に埋め込んだ。８０〜９０ｎｍの切片を切断し、銅グリッド上に配置し、そして５％の酢酸ウラニルで３０〜４５分間染色し、次いでレイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）クエン酸鉛で３〜４分間染色した。８０ｋＶで作動するＪＥＯＬ１００ＣＸＩＩ透過型電子顕微鏡で、切片を見た。本明細書に記載する本発明の特定の実施例は、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）植物、アルカリゲネス・エウトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）からの遺伝子およびエンドウのトランシットペプチドを含んだが、本発明は一般的実用性を有する。植物の中のプラスチドにおけるポリＤ−（−）−３−ヒドロキシブチレートおよび／またはポリヒドロキシアルカノエートの生産に関する請求の範囲は、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）に限定されず、または色素体の標的化のためのアルカリゲネス・エウトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）からの遺伝子または記載したトランシットペプチドの使用に特別に関連しない。後述する請求の範囲は、植物細胞の中に外来ＤＮＡ物質を導入することによって、植物の中のプラスチドにおいてポリヒドロキシアルカノエートを生産する一般的方法について記載する。本発明の改良は次の通りである：１ − ３−ケトチオラーゼ活性を有する酵素の色素体の中における生産を導く情報をコードする外来ＤＮＡ物質による植物細胞の形質転換。用語「外来ＤＮＡ物質」は、生物の中に通常存在しないが、細胞の中に導入されそして染色体の中に組み込まれて存在するか、または染色体外の形態で存在するＤＮＡ物質を意味する。植物細胞の色素体の中の３−ケトチオラーゼ活性の増加は、植物細胞の中への外来ＤＮＡ物質の導入から生ずる。２ − アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有する酵素の色素体の中における生産を導く情報をコードする外来ＤＮＡ物質による植物細胞の形質転換。植物細胞の色素体の中のアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性の増加は、植物細胞の中への外来ＤＮＡ物質の導入から生ずる。３ − 色素体の中におけるヒドロキシアシル−ＣｏＡの生産を導く情報をコードする、植物細胞に対して外来である外来ＤＮＡ物質による植物細胞の形質転換。外来ＤＮＡ物質による植物細胞の形質転換は、植物細胞の色素体の中のヒドロキシアシル−ＣｏＡのレベルの増加を導く。４ − 植物細胞のヒドロキシアシル−ＣｏＡを重合する能力を有する酵素の色素体の中における生産を導く情報をコードする外来ＤＮＡ物質による植物細胞の形質転換。植物細胞の色素体におけるヒドロキシアシル−ＣｏＡの重合を導く酵素活性の増加は、植物細胞の中への外来ＤＮＡ物質の導入から生ずる。５ − 植物細胞の中に外来ＤＮＡ物質を導入することによる、植物細胞の色素体における、Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチレートを包含する、ポリヒドロキシアルカノエートの生産。６ − 植物細胞の色素体におけるポリヒドロキシアルカノエートの生産は、好ましくは２μｇポリヒドロキシアルカノエート／ｇ新鮮植物材料より高いレベルである。７ − 色素体におけるポリヒドロキシアルカノエートの生産は、好ましくは、外来ＤＮＡ物質を導入できる任意の植物細胞において、２μｇポリヒドロキシアルカノエート／ｇ新鮮植物材料より高いレベルである。８ − ハイブリッド植物の色素体におけるポリヒドロキシアルカノエートの生産は、好ましくは２μｇポリヒドロキシアルカノエート／ｇ新鮮植物材料より高いレベルであり、これは外来ＤＮＡ物質で形質転換されているが、それら自体色素体の中でポリヒドロキシアルカノエートを生産しないか、またはハイブリッド植物において生産されるより低いレベルでポリヒドロキシアルカノエート生産する、２つの親植物系統から生ずる。９ − 植物細胞の色素体の内部で顆粒の形態のポリヒドロキシアルカノエートの生産。第３図および第４図の遺伝子を含有する種子は、ミシガン州立大学（ミシガン州イーストランジング）において維持されている。以上の記載は本発明の例示のみであり、そして本発明は下記の請求の範囲によってのみ限定されることを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 9/04 9359−4ＢＣ１２Ｎ 9/10 9/10 9359−4ＢＣ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｐ 7/62 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:05） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ポワリエ，イブアメリカ合衆国ミシガン州、イー．ランシング、チェリー、レイン、704、アパートメント、203

Claims

【特許請求の範囲】１．植物の中の色素体においてポリヒドロキシアルカノエートの生産を導く３ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼおよびそれらの混合物から成る群より選択される細菌のポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含有することを特徴とする、トランスジェニック植物材料。２．ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）がポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）であり、そしてポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）合成を導く酵素の生産のためのＤＮＡおよびＲＮＡのコーディング配列が配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３に示されるものである、請求項１に記載の植物材料。３．植物の中の色素体において３−ケトチオラーゼ活性を示すペプチドをコードする外来ＤＮＡを含有することを特徴とする、色素体を有するトランスジェニック植物材料。４．オープンリーディングフレームを含有するＤＮＡが配列番号：１に示すものである、請求項３に記載の植物材料。５．植物の色素体においてアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性をコードする外来ＤＮＡを含有することを特徴とする、色素体を有するトランスジェニック植物材料。６．オープンリーディングフレームを含有するＤＮＡが配列番号：２に示すものである、請求項５に記載の植物材料。７．植物の色素体においてＰＨＡシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含有することを特徴とする、色素体を有するトランスジェニック植物材料。８．ＤＮＡが配列番号：３に示すものである、請求項７に記載の植物材料。９．胚、種子または種子の零余子 (propagule)である、請求項１〜８のいずれか一つに記載の植物材料。１０．ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を生産しない２つの植物を性的受精により交配することを含んでなり、各植物は植物の中の色素体においてＰＨＡを合成する植物を生産するためにＰＨＡシンターゼによるヒドロキシアシル−ＣｏＡの重合を導く経路において１または２以上の異なる酵素をコードする細菌由来の外来ＤＮＡを含有する、植物の中の色素体におけるＰＨＡの合成を導くポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを導入する方法。１１．ＰＨＡがポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）である、請求項１０に記載の方法。１２．植物の色素体に標的化するための修飾された３−ケトチオラーゼ遺伝子をコードするプラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−ＴｈｉｏまたはｐＢＩＢ−ＣＣＮ −Ｔｈｉｏの中に含有された遺伝子セグメント。１３．植物の色素体に標的化するための修飾されたアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子をコードするアルカリゲネス・エウトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）由来のプラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−Ｒｅｄの中に含有された遺伝子セグメント。１４．植物の色素体に標的化するための修飾されたポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）シンターゼ遺伝子をコードするアルカリゲネス・エウトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）由来のプラスミドｐＢＩ−ＴＰＳＳ−ＳｙｎまたはｐＢＩＢ−ＨＣＮＳｙｎの中に含有された遺伝子セグメント。１５．請求項１２〜１４のいずれか一つに記載の遺伝子セグメントを含有する植物。１６．請求項１〜９のいずれか一つに記載の植物材料により生産されたポリヒドロキシアルカノエート。