ES2240979T3 - Enzima para la escision de la region de anclaje de las proteinas superficiales de bacterias gram positivas. - Google Patents
Enzima para la escision de la region de anclaje de las proteinas superficiales de bacterias gram positivas.Info
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Abstract
SE PRESENTA UNA ENZIMA QUE SE EXFOLIA EN LA SECUENCIA LPXTGX (N1 ID SEC: 1) DE LAS PROTEINAS SUPERFICIALES DE LA BACTERIA GRAM POSITIVA. LA ENZIMA SE AISLO DE UN GRUPO STREPTOCOCCUS A. ADEMAS SE PRESENTAN UN METODO PARA LA DETECCION DE LA ENZIMA, UN METODO PARA AISLAR LA ENZIMA, Y METODOS DE INHIBICION DE LA ENZIMA. LA FIGURA ES UNA ILUSTRACION ESQUEMATICA DEL POSICIONAMIENTO DE LA PROTEINA SUPERFICIAL EN LA MEMBRANA BACTERIANA, Y EL PASO DE EXFOLIACION QUE LLEVA A LA BACTERIA INFECTIVA.
Description
Enzima para la escisión de la región de anclaje
de las proteínas superficiales de bacterias gram positivas.
La presente invención se refiere a una enzima
para escindir en el interior de la región de anclaje de pared de
una proteína superficial de una bacteria
gram-positiva, a un procedimiento para detectar tal
enzima, y a un procedimiento para purificar esa enzima. En
particular, la enzima se aísla a partir de un Streptococcus
de grupo A y escinde la región de anclaje de la proteína
estreptocócica M.
Las bacterias pueden denominarse
gram-positivas y gram-negativas,
basándose en la tinción de sus paredes celulares con el colorante de
Gram. En la amplia división de las bacterias gram positivas están
los cocos gram positivos, que incluyen los géneros Aerococcus,
Corprococcus, Deinobacter, Deinococcus, Enterococcus, Gemella,
Lactococcus, Leuconostoc, Marinococcus, Melissococcus, Micrococcus,
Pediococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Planococcus,
Ruminococcus, Saccharococcus, Salinicoccus, Carcina,
Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Trichococcus,
Vagococcus, Listeria y Actinomyces.
En las bacterias gram-positivas,
las proteínas son secretadas al medio que las rodea, mientras que
en las bacterias gram-negativas, la secreción tiene
lugar en el espacio periplásmico entre el citoplasma y las
membranas externas (Model y Russel (1990) Cell 61:
739-741; Schatz y Beckwith (1990) Annu. Rev.
Genet. 24: 215-248). Se conciben las
señales procarióticas de selección para el ensamblaje local de
estructuras supramoleculares como microvellosidades (Strom y Lory,
(1987) J. Bacteriol. 169:3181-3188),
flagelos (Loewy et al (1987) Genes Dev. 1:
626-635), y bacteriófagos (Brissette y Russel
(1990) J. Mol. Biol. 211: 565-580), o
para localizar proteínas en compartimentos bacterianos definidos.
Dichos compartimentos incluyen la membrana externa de las bacterias
gram-negativas (Model y Russel (1990) Cell
61: 739-741), la pared celular (Braun et
al (1970) Eur. J. Biochem. 13:
336-346; Eur. J. Biochem. 14:
387-391; Biochemistry
9:5041-5049; Shockman y Barrett (1983)
Annu. Rev. Microbiol. 37: 501-527), y
el anillo periseptal (MacAlister et al (1983) Proc. Natl.
Acad. Sci. 80: 1372-1376).
Puede considerarse que la pared celular de las
bacterias gram-positivas representa un único
compartimento celular, que contiene proteínas superficiales ancladas
que requieren señales específicas de selección. Algunos productos
biológicamente importantes se anclan de esta forma, incluyendo la
proteína A y las proteínas que se unen a la fibronectina de
Staphylococcus aureus y la proteína M de Streptococcus
pyogenes. Estudios de la proteína A estafilocócica y de la
fosfatasa alcalina de E. coli muestran que la señal, tanto
necesaria como suficiente para el anclaje de la pared celular,
consiste en el motivo LPXTGX (SEC ID nº:1), un dominio hidrofóbico
C-terminal y una cola cargada. Estos elementos
secuenciales se conservan en muchas proteínas superficiales de
distintas bacterias gram-positivas.
La proteína M de los estreptococos del grupo A,
una molécula fibrilar arrollada
\alpha-helicoidalmente en forma de cilindro que se
encuentra en la superficie del organismo (Fischetti et al
(1988) Proteins Struct. Func. Genet. 3:60), es
responsable de la propiedad antifagocítica de estas bacterias
(Lancefield et al (1962) J. Immunol. 89: 307). La
variación antigénica (Jones et al (1988), Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:8271) y la inmunidad tipo específica depende
de los epítopos localizados en el interior de la mitad
NH_{2}-terminal de la molécula M (distal a la
pared celular) (Jones et al (1988) J. Exp. Med. 167:
1114). Las secuencias aminoácidas que se conservan entre distintas
proteínas M se localizan en la mitad COOH-terminal
(Jones et al (1985) J. Exp. Med. 161:623;
Hollingshead et al (1987) Infect. Immun. 55:3237) y
contiene epítopos que se han demostrado recientemente responsables
de la inmunidad de tipo no específico contra la colonización
estreptocócica (Bessen et al (1988) Infect. Immun,
56: 2666; Fischetti et al (1989) Science (Wash.
DC) 244:1487).
La región de unión de la molécula, predicha a
partir de la secuencia del ADN, se localiza en el extremo terminal
COOH, y está compuesta por aminoácidos cargados en el extremo COOH,
seguidos por 19 aminoácidos hidrofóbicos de los que se sospecha
constituyen un anclaje de la membrana, seguidos por un motivo
hexapeptídico, LPXTGX. Esta región es adyacente a una región rica
en glicina y prolina que se sitúa en el interior de la capa de
peptoglicanos de la pared celular (Fischetti (1988) Proteins
Struc. Func. Genet. 3: 60; Pancholi et al (1988) J.
Bacteriol. 170: 2618; Hollingshead et al (1986),
J. Biol. Chem. 261: 1677).
La asociación de la proteína M a la membrana
citoplásmica de las bacterias gram-positivas puede
examinarse después de eliminar la pared celular con la lisina
enzimática muralítica (Fischetti et al. (1974)
Streptococcal Disease and the Community, M.J. Haverkorn,
editor. Excerpta Medica, Amsterdam. 26.), que es activa contra las
paredes celulares de estreptococos del grupo A en un amplio
intervalo del pH. La proteína M se libera durante la eliminación de
la pared celular indicando que un factor endógeno media esta
liberación (Pancholi et al (1989) J. Exp. Med.
170: 2119-2133).
El análisis de la forma liberada de la proteína M
demuestra que los 19 aminoácidos hidrofóbicos COOH terminales y la
cola cargada de la molécula M no está presente (Pancholi et
al (1989) J. Exp. Med. 170:
2119-2133). Esto sugiere que la liberación de las
proteínas M a partir de la membrana y su unión a la pared celular se
asocia de algún modo con la escisión de la región hidrofóbica
COOH-terminal.
Se ha mostrado que la escisión de las proteínas
superficiales de las bacterias gram-positivas en la
región LPXTGX adyacente al dominio hidrofóbico tiene lugar durante
el procedimiento de anclaje de estas proteínas (Schneewind et
al (1992) Cell 70:267-281). A causa de que la
interferencia con esta escisión evita la disposición apropiada de
las proteínas superficiales en la célula bacteriana, la
caracterización de la enzima responsable de esta escisión
constituirá una etapa crítica en el desarrollo antibiótico.
Pancholi et al. (J. Exp. Med.
170(6):2119-2133 (1989)) describe una
actividad enzimática endógena que escinde el anclaje de la membrana,
con capacidad para liberar la proteína M a partir de los
protoplastos aislados de estreptococos. La liberación de las
moléculas de la proteína M tiene lugar cuando los protoplastos
cargados con ella se disponen en tampón de rafinosa a pH 7,4.
Existen pruebas que confirman que la actividad enzimática que
escinde el anclaje está unida a la membrana, probablemente como una
molécula integral de ésta. Asimismo, se obtuvo una evidencia de la
similitud secuencial entre la proteína M y ciertas proteínas
ancladas a GPI en la región responsable del anclaje proteico.
Lee et al (Infect. & Immun.
60(10):4032-4039 (1992)) describe cómo las
células enteras y los protoplastos de Streptococcus mutans
son capaces de liberar sus proteínas superficiales en dependencia
del pH, con una liberación óptima entre un pH 5 a 6. Los análisis
revelaron que las proteínas liberadas eran muy complejas, no
debiéndose probablemente a la actividad proteolítica la liberación
de la adhesina P1.
El documento
US-A-4598044 describe un péptido
cromogénico para el ensayo de la actividad proteásica.
El documento
US-A-5235039 describe varios ensayos
enzimáticos generales para numerosas muestras.
Por tanto, está claro que lo que se requiere en
la presente técnica es un procedimiento para detectar y aislar esta
enzima que escinde las proteínas superficiales de bacterias
gram-positivas.
De acuerdo con esto, un objetivo principal de la
presente invención es proporcionar una enzima aislada y purificada
que escinda las proteínas superficiales de bacterias
gram-positivas en el interior del motivo LPXTGX.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar un anticuerpo dirigido contra la enzima que escinde a
las bacterias gram-positivas.
Otro objetivo, aún, de la presente invención, es
proporcionar un procedimiento para detectar la presencia de la
enzima que escinde las bacterias gram-positivas en
el interior del motivo LPXTGX.
Otro objetivo todavía de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para aislar una enzima que escinda
las proteínas superficiales en las bacterias
gram-positivas.
Brevemente, la presente invención se refiere a
una enzima que escinde una proteína superficial en bacterias
gram-positivas, y a un procedimiento para
detectarla, que incluye las etapas de: (a) sintetizar un péptido
que comprende una secuencia aminoácida de LPXTGX; (b) marcar el
péptido de la etapa (a) con un marcador detectable; (c) unir
covalentemente el péptido marcado a una perla cromatográfica; (d)
mezclar las perlas unidas con un extracto membranoso de bacterias
gram-positivas; (e) detectar una liberación del
marcador a partir de las perlas; y (f) correlacionar la liberación
del marcador con la presencia de la enzima.
La invención se refiere asimismo a anticuerpos
dirigidos a la enzima escindidora.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento para aislar la enzima escindidora, que incluye las
etapas de: (a) preparar un extracto de la membrana de las bacterias
gram-positivas que contiene proteínas unidas a la
membrana; (b) fraccionar las proteínas unidas a la membrana
mediante cromatografía, utilizando un gradiente salino; y (c)
identificar la presencia de la enzima en por lo menos una
fracción.
Con los objetivos anteriores y otros, y con las
ventajas y características de la invención que se pondrán más
claramente de manifiesto a continuación, la naturaleza de la
invención se entenderá más claramente haciendo referencia a la
descripción detallada que sigue a continuación de las formas de
realización preferidas de la invención, y a las reivindicaciones
adjuntas.
La Figura 1 es una curva
dosis-respuesta con el extracto de carbonato
dializado de las membranas D471.
La Figura 2 es una curva de
tiempo-respuesta que utiliza un extracto de
carbonato de las membranas D471.
La Figura 3 muestra la actividad de escisión de
la enzima en presencia de los inhibidores y activadores
enzimáticos.
| CPM | = | cuentas por minuto |
| DTT | = | Ditiotreitol |
| ZnCl_{2} | = | cloruro de zinc |
| CdOAc | = | acetato de cadmio |
| CaCl_{2} | = | cloruro cálcico |
| pHMB | = | ácido parahidroximercuribenzoico |
| pHMPS | = | ácido parahidroximercurifenilsulfónico. |
La Figura 4 es un esquema que muestra el
posicionamiento de la proteína superficial en la membrana
bacteriana, y la etapa de escisión que conduce a las bacterias
infecciosas. Un antibiótico que se dirija a la etapa de escisión da
lugar a bacterias no infecciosas.
Más particularmente, la presente invención se
refiere a procedimientos para detectar y purificar una enzima de
escisión que escinde proteínas superficiales de bacterias
gram-positivas en un motivo conocido,
preferentemente un motivo LPXTGX (SEC ID nº:1), y se refiere
asimismo a la enzima purificada de escisión en sí misma.
La enzima de escisión puede aislarse a partir de
cualquier bacteria gram-positiva.
Dichas bacterias gram-positivas
comprenden los géneros Aerococcus, Corprococcus, Deinobacter,
Deinococcus, Enterococcus, Gemella, Lactococcus, Leuconostoc,
Marinococcus, Melissococcus, Micrococcus, Pediococcus, Peptococcus,
Peptostreptococcus, Planococcus, Ruminococcus, Saccharococcus,
Salinicoccus, Carcina, Staphylococcus, Stomatococcus,
Streptococcus, Trichococcus, Vagococcus, Listeria y
Actinomyces. Las bacterias Gram-positivas
conocidas por tener proteínas superficiales que contienen un motivo
LPXTGX (SEC ID nº:1) son las siguientes:
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Una especie más preferida para la presente
invención es Streptococcus pyogenes, y la más preferida es
la M de tipo 6.
Los protoplastos pueden prepararse a partir de
las bacterias mediante cualquiera de los medios que se conocen en
la técnica. El cultivo se desarrolla en cualquier medio conocido
que soporte el crecimiento de la especie en particular,
preferentemente en el caldo de cultivo Todd-Hewitt.
Las células, entonces, se centrifugaron y lavaron. Las células se
volvieron entonces a suspender en tampón fosfato, a una
concentración preferentemente de entre 20 y 100 mM, más
preferentemente de 50 mM aproximadamente, y que contiene rafinosa,
preferentemente en un porcentaje de entre el 10 y 50%,
preferentemente de aproximadamente el 30%, o sacarosa en un
porcentaje de aproximadamente entre el 10 y el 30%, preferentemente
de aproximadamente el 20%, y EDTA. Se añadió entonces una enzima
específica para degradar la pared celular, preferentemente una
lisina estreptocócica del Grupo C, fágico asociada, incubándose a
una temperatura de aproximadamente 37ºC durante 30 minutos por lo
menos.
Las membranas pueden prepararse a partir de los
protoplastos utilizando cualquier procedimiento conocido en la
técnica, pero preferentemente, mediante tratamientos repetidos de
congelación-descongelación en presencia de
inhibidores de la proteasa. Las membranas se recuperaron entonces
mediante centrifugación a 100.000 x g aproximadamente, se lavaron,
y se volvieron entonces a sedimentar en presencia de inhibidores
proteásicos.
Como procedimiento para analizar la actividad de
escisión de la enzima, y especialmente para analizar la actividad de
los mutantes enzimáticos de escisión, pueden prepararse moléculas
superficiales diana liberando éstas de la membrana utilizando
cualquier procedimiento conocido en la técnica. Preferentemente, la
molécula superficial puede liberarse tratando las membranas con
carbonato sódico a un pH>9, preferentemente >11, más
preferentemente con un valor de 11,5 aproximadamente.
La presencia de la proteína superficial,
particularmente de la proteína M, puede identificarse en el
sobrenadante utilizando cualquier procedimiento conocido en la
técnica, que incluye la separación en el gel
SDS-PAGE, transferencia Western, ensayo
inmunoenzimático (ELISA), ELISA de captura, RIA y similares. Los
anticuerpos para la detección de la proteína M están disponibles en
la técnica e incluyen sueros policlonales, tales como el
(producido) contra la proteína ColiM6.1 (Fischetti et al
(1984) J. Exp. Med. 159: 1083); sueros policlonales
para un péptido sintético que corresponde a residuos de la proteína
M, tales como los residuos 1-21 (Jones et al
(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8271), o los
anti-SM6 (308-327) para los residuos
308-327, los anti-SM6
(339-352) para los residuos
339-352, o los anti-SM6
(381-398) para los residuos 381-398;
o el anticuerpo monoclonal 10B6 para un epítopo en la región
conservada de la molécula M entre los residuos 275 y 289.
En general, los monoclonales se utilizan a una
dilución de 1:100-1:10.000, preferentemente
alrededor de 1:1000, y los sueros policlonales se utilizan a una
dilución de alrededor de 1:50-1:5000,
preferentemente alrededor de
1:500.
1:500.
La enzima de escisión se detecta preferentemente
preparando un substrato sintético marcado de forma detectable. El
substrato sintético marcado contiene preferentemente una secuencia
LPXTGX (SEC ID nº:1), y más preferentemente contiene una secuencia
LPSTGE (SEC ID nº:14). Los procedimientos para la preparación y
análisis de dicho péptido sintético son bien conocidos en la
técnica.
El péptido sintético puede marcarse con cualquier
marcador detectable conocido en la técnica. Preferentemente, este
marcador es un isótopo, muy preferentemente el ^{125}I. El
péptido sintético marcado se une preferentemente a un substrato, muy
preferentemente a una perla disponible comercialmente.
La cepa bacteriana que contiene la enzima de
escisión se trata para extraer la membrana bacteriana.
Preferentemente, las membranas bacterianas son tratadas con un
tampón alcalino, preferentemente tampón carbonato, a un pH de 9 a 13
aproximadamente, preferentemente de aproximadamente 11,5. La
extracción se lleva a cabo preferentemente a una temperatura
inferior a la ambiental, preferentemente a 0ºC aproximadamente. El
extracto de la membrana se mezcla entonces con las perlas marcadas
en un tampón apropiado, analizándose la liberación del marcado
radioactivo a partir del péptido sintético escindido.
La enzima se aísla a partir del extracto
utilizando procedimientos de purificación proteica conocidos en la
técnica. En particular, el extracto de la membrana que contiene la
actividad de escisión detectada, se somete a técnicas
cromatográficas que separan las proteínas que se encuentran en el
extracto según su tamaño, afinidad y carga. Las fracciones
obtenidas de cada etapa cromatográfica se analizan con respecto a la
actividad de escisión tal como se ha descrito anteriormente, y se
someten a ulteriores etapas de purificación. Un procedimiento
particularmente preferido para obtener la enzima de escisión
purificada es la cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC).
Después de que la enzima se haya purificado, su
secuencia aminoácida puede determinarse utilizando procedimientos de
secuenciación aminoácida conocidos en la técnica. Un procedimiento
particularmente preferido es la degradación de Edman. Habiendo
obtenido información secuencial mediante la enzima de escisión, se
pueden diseñar sondas oligonucleótidas para aislar el ADN que
codifica la enzima de escisión, utilizando procedimientos
convencionales de rastreo, o procedimientos de amplificación tales
como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Es preferible
particularmente diseñar dichos oligonucleótidos de una forma
completamente degenerada, de tal manera que los oligonucleótidos que
contenga cada codón que codifica un aminoácido particular, se
encuentren en la mezcla oligonucleótida. Alternativamente, la
inosina puede utilizarse en posiciones en el codón en las que se
sabe que se encuentran degeneraciones.
En general, los procedimientos para aislar el ADN
que codifica la enzima de escisión, sometiéndolo a digestión
parcial, aislando (los) fragmentos de ADN, uniendo los fragmentos
en un vector de clonación y transformado un huésped, son bien
conocidos en la tecnología del ADN recombinante. De acuerdo con
esto, un experto en la materia puede utilizar o adaptar los
protocolos detallados para dichos procedimientos, tal como se
encuentran en Sambrook et al. (1989); Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY, 3 volúmenes, o en cualquier otro manual sobre
tecnología del ADN recombinante.
Una vez que se ha obtenido a partir de una
especie el gen que codifica la enzima de escisión del LPXTGX (SEC
ID nº:1), puede servir como una sonda de hibridación para aislar
los genes correspondientes de otras especies mediante hibridación
cruzada bajo condiciones de baja a moderada restricción. Dichas
condiciones se encuentran habitualmente de modo empírico
determinando las condiciones en las que la sonda hibridiza cruzada
y específicamente a su gen opuesto con una mínima hibridación
anterior. La hibridación de ácidos nucleicos es una técnica bien
conocida y que se detalla en profundidad en Sambrook et
al.
Tal como se consideró anteriormente, el ADN que
codifica la enzima de escisión puede aislarse originariamente
utilizando la PCR. Los ADNs correspondientes de otras especies
pueden aislarse asimismo utilizando la PCR, y los oligonucleótidos
para realizar estas subsiguientes reacciones PCR pueden optimizarse
utilizando la información secuencial obtenida a partir del ADN
clonado de las primeras especies.
También pueden producirse los ácidos nucleicos
que codifican los genes objeto en vectores de expresión capaces de
replicación y los huéspedes transformados que contienen estos
vectores. Los vectores de expresión capaces de replicación pueden
también utilizarse para obtener los polipéptidos de la presente
invención, mediante procedimientos que son bien conocidos en la
tecnología del ADN recombinante.
Los vectores de expresión capaces de replicación
pueden comprender un ácido nucleico que codifica el gen objeto, es
decir, la secuencia codificante está unida operativamente en un
marco de lectura apropiado a un elemento de la secuencia nucleótida
que dirige la expresión del enzima de escisión. En particular, los
elementos de la secuencia nucleótida pueden incluir un promotor, un
elemento de potenciación de la transcripción, una señal de
finalización, una señal de traducción, o una combinación de dos o
más de estos elementos, que incluyen generalmente por lo menos un
elemento promotor.
Los vectores de expresión capaces de replicarse
son generalmente moléculas de ADN que se construyen para la
expresión controlada de un gen deseado, especialmente si se desea
producir grandes cantidades de un producto génico particular, o un
polipéptido. Los vectores comprenden una o más secuencias
nucleótidas que se unen operativamente a un gen para controlar la
expresión de ese gen, el gen que va a expresarse, y un origen de
replicación, que es capaz de operar en el huésped que se considera.
Preferentemente, el vector codifica un marcador seleccionable, por
ejemplo, la resistencia a los antibióticos. Los vectores de
expresión capaces de replicarse pueden ser plásmidos, bacteriófagos,
cósmidos y virus. También se considera cualquier vector de
expresión que comprenda ARN. Los vectores de expresión capaces de
replicarse pueden expresar la enzima de escisión en grandes
cantidades. Muchos de estos vectores se basan en pBR322, M13 y
lambda, y son bien conocidos en la técnica, utilizando promotores
tales como trp, lac, P_{L} T7 polimerasa y
similares. Por lo tanto, el experto en la materia tiene muchas
posibilidades de selección de vectores de expresión capaces de
replicarse, huéspedes compatibles, y procedimientos bien conocidos
para obtener y utilizar los vectores.
Además, también se consideran los péptidos y
fragmentos, así como los derivados químicamente modificados de la
enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1). Brevemente, se considera
cualquier fragmento peptídico, derivado o análogo que conserve
sustancialmente la misma actividad biológica de la enzima de
escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1). Un análogo puede definirse en la
presente memoria como un péptido o fragmento que exhibe una
actividad de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1), pero posee una
sustitución, inserción o deleción aminoácida en comparación con la
enzima de escisión de tipo salvaje. Dicho análogo puede prepararse
mediante la sustitución "conservadora" de un aminoácido que
tenga propiedades químicas similares.
Así, también se apreciará que no sólo puedan
producirse las secuencias de ADN que codifican una enzima de
escisión en LPXTGX (SEC ID nº1) que tenga la misma secuencia
aminoácida que la enzima de tipo salvaje, sino que asimismo, puedan
producirse aquellas secuencias de ADN que están degeneradas con
respecto a la secuencia de tipo salvaje. "Están degeneradas con
respecto a" significa que se utiliza un codón de tres letras
distinto para especificar un aminoácido particular. Es bien conocido
en la técnica que los siguientes codones pueden utilizarse de modo
intercambiable para codificar cada aminoácido específico:
| Fenilalanina (Phe o F) | UUU o UUC |
| Leucina (Leu o L) | UUA o UUG o CUU o CUC o CUA o CUG |
| Isoleucina (Ile o I) | AUU o AUC o AUA |
| Metionina (Met o M) | AUG |
| Valina (Val o V) | GUU o GUC de GUA o GUG |
| Serina (Ser o S) | UCU o UCC o UCA o UCG o AGU o AGC |
| Prolina (Pro o P) | CCU o CCC o CCA o CCG |
| Treonina (Thr o T) | ACU o ACC o ACA o ACG |
| Alanina (Ala o A) | GCU o GCG o GCA o GCG |
| Tirosina (Tyr o T) | UAU o UAC |
| Histidinac (His o H) | CAU o CAC |
| Glutamina (Gln o Q) | CAA o CAG |
| Asparagina (Asn o N) | AAU o AAC |
| Lisina (Lys o K) | AAA o AAG |
| ácido aspártico (Asp o D) | GAU o GAC |
| ácido glutámico (Glu o E) | GAA o GAG |
| Cisteína (Cys o C) | UGU o UGC |
| Arginina (Arg o R) | CGU o CGC o CGA o CGG o AGA o AGG |
| Glicina (Gly o G) | GGU o GGC o GGA o GGG |
| Codón de finalización | UAA (ocre) o UAG (ámbar) o UGA (ópalo). |
Deberá entenderse que los codones que se
especifican anteriormente son para las secuencias de ARN. Los
codones correspondientes para el ADN tienen la T sustituida por la
U.
Las mutaciones pueden llevarse a cabo en la
secuencia de tipo salvaje, de forma que un codón particular se
cambia a un codón que codifica un aminoácido distinto. Dicha
mutación se realiza generalmente llevando a cabo los mínimos cambios
nucleótidos posibles. Una mutación de sustitución de este tipo
puede realizarse para cambiar un aminoácido en la proteína
resultante de una manera no conservadora (es decir, cambiando el
codón de un aminoácido que pertenece a una grupo de aminoácidos que
tienen un tamaño o característica particular, a un aminoácido que
pertenece a otro grupo) o de una manera conservadora (es decir,
cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de
aminoácidos que tienen un tamaño o característica particular, a un
aminoácido que pertenece al mismo grupo). Dicho cambio conservador
conduce generalmente a un cambio menor en la estructura y función
de la proteína resultante. Un cambio no conservador es más proclive
a alterar la estructura, actividad o función de la proteína
resultante.
A continuación se da un ejemplo de varios grupos
aminoácidos:
Alanina
Valina
Leucina
Isoleucina
Prolina
Fenilalanina
Triptófano
Metionina.
Glicina
Serina
Treonina
Cisteína
Tirosina
Asparagina
Glutamina.
ácido aspártico
ácido glutámico.
Lisina
Arginina
Histidina (a pH 6,0).
Otro grupo puede consistir en aquéllos
aminoácidos con grupos fenilos:
Fenilalanina
Triptófano
Tirosina.
Otro grupo puede constituirse según el peso
molecular (es decir, tamaño de los grupos R):
| Glicina | 75 |
| Alanina | 89 |
| Serina | 105 |
| Prolina | 115 |
| Valina | 117 |
| Treonina | 119 |
| Cisteína | 121 |
| Leucina | 131 |
| Isoleucina | 131 |
| Asparagina | 132 |
| Ácido aspártico | 133 |
| Glutamina | 146 |
| Lisina | 146 |
| Ácido glutámico | 147 |
| Metionina | 149 |
| Histidina (pH 6) | 155 |
| Fenilalanina | 165 |
| Arginina | 174 |
| Tirosina | 161 |
| Triptófano | 204. |
Sustituciones particularmente preferidas son:
- Lys por Arg y viceversa, de forma que pueda
mantenerse una carga positiva;
- Glu por Asp y viceversa, de forma que pueda
mantenerse una carga negativa;
- Ser por Thr, de forma que pueda mantenerse un
-OH libre; y
- Gln por Asn, de forma que pueda mantenerse un
NH_{2} libre.
Las sustituciones aminoácidas pueden también
introducirse para sustituir un aminoácido con una propiedad
particularmente preferida. Por ejemplo, una Cys puede introducirse
en un sitio potencial para el puente disulfuro con otra Cys. Una
His puede introducirse como un sitio particularmente
"catalítico" (es decir, His puede actuar como un ácido o una
base y constituye el aminoácido más habitual en la catálisis
bioquímica). Pro puede introducirse a causa de su estructura
particularmente planar, que induce giros \beta en la estructura
proteica.
La purificación de la enzima de escisión del
sujeto LPXTGX (SEC ID nº:1) a partir de fuentes naturales o
recombinantes, puede realizarse mediante medios de purificación
convencionales tales como la precipitación mediante sulfato amónico,
cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio
iónico, cromatografía de adsorción, cromatografía de afinidad,
cromatoenfoque, HPLC, FPLC, y similares. En los cuales
procedimientos, las etapas apropiadas de purificación pueden
llevarse a cabo en tanques o en columnas.
Los fragmentos peptídicos de la enzima de
escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) pueden prepararse mediante
proteolisis o degradación química. Las enzimas proteolíticas
típicas son la tripsina, quimiotripsina, proteasa V8, subtilisina y
similares; las enzimas se encuentran disponibles comercialmente y
los protocolos para realizar los digestos proteolíticos son bien
conocidos. Los fragmentos peptídicos se purifican mediante medios
convencionales, tal como se ha descrito anteriormente. Los
fragmentos peptídicos pueden identificarse a menudo mediante la
composición aminoácida o secuencia. Los fragmentos peptídicos son
útiles como inmunógenos para obtener anticuerpos contra la enzima de
escisión del sujeto LPXTGX (SEC ID nº:1).
La presente invención se refiere asimismo a
anticuerpos para la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº1).
Dichos anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y se
consideran útiles para desarrollar ensayos de detección
(inmunoensayos) para las proteínas enzimáticas de escisión, para
controlar los niveles de los enzimas de escisión y para purificar
éstos. Así, según la presente invención, un anticuerpo para una
enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) abarca anticuerpos
monoclonales o policlonales para dicha enzima de escisión en LPXTGX
(SEC ID nº:1), o para partes antigénicas suyas.
Tanto los anticuerpos policlonales como los
monoclonales para la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1)
pueden obtenerse mediante inmunización de un animal con la enzima
de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) purificada, la enzima de
escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) recombinante purificada, fragmentos
de estas proteínas, o proteínas de fusión purificadas de la enzima
de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) con otra proteína. En el caso
de los anticuerpos monoclonales, pueden servir como inmunógenos
proteínas o fragmentos parcialmente purificados. Los procedimientos
para obtener ambos tipos de anticuerpos son bien conocidos en la
técnica, encontrándose excelentes protocolos para la producción de
los anticuerpos en Harlow et al. (1988) Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY, pág. 726.
Los sueros policlonales se preparan de modo
relativamente fácil, inyectando a un animal apropiado de
laboratorio una cantidad efectiva de la enzima de escisión en
LPXTGX (SEC ID nº:1) purificada o de partes suyas, recuperando el
suero del animal, y aislando sueros específicos mediante cualquiera
de las técnicas inmunoadsorbentes conocidas. Los anticuerpos
producidos mediante este procedimiento, son útiles en virtualmente
cualquier tipo de inmunoensayo.
Los anticuerpos monoclonales son particularmente
útiles, porque pueden producirse en grandes cantidades y con un
alto grado de homogeneidad. Fusionando una progenie celular
inmortal con linfocitos sensibilizados contra la preparación
inmunogénica, se preparan progenies celulares hidridómicas que
producen anticuerpos monoclonales, llevándose a cabo mediante
procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la
materia. (Véase, por ejemplo, Douillard, I.Y. y Hoffman, T.,
"Basic Facts About Hybridomas", en Compendium of
Immunology, Vol. II, L. Schwartz (Ed.) (1981); Kohler, G. y
Milstein, C., Nature 256: 495-497
(1975) y European Journal of Immunology 6:
511-519 (1976); Harlow et al,; Koprowski,
et al., patente U.S. nº 4.172.124; Koprowski et al.,
patente U.S. nº 4.196.265 y Wands, patente U.S. nº 4.271.145.
La presencia de la enzima de escisión en LPXTGX
(SEC ID nº:1) en una muestra, tal como un sobrenadante de cultivo y
similares, en un microorganismo, o en cualquier otra fuente de la
que se sospeche contenga la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID
nº:1), puede detectarse utilizando anticuerpos monoclonales o
policlonales, preparados tal como se ha mencionado anteriormente,
en virtualmente cualquier tipo de inmunoensayo. De este modo, estos
anticuerpos pueden utilizarse para identificar microorganismos que
tengan o produzcan la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1). De
acuerdo con esto, la presente invención proporciona un procedimiento
para detectar una enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1)
mediante las etapas de poner en contacto una muestra de la que se
sospeche que contiene dicha enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID
nº:1), con un anticuerpo de la invención, durante un tiempo y bajo
condiciones suficientes para formar un complejo
enzima-anticuerpo, sometiendo este complejo a medios
de detección. Como es conocido por los expertos en la materia, el
tiempo y condiciones para los ensayos de inmunodetección son
variables y dependen del ensayo particular.
Está disponible una amplia variedad de técnicas y
condiciones de detección para el experto en la materia, como puede
apreciarse tomando como referencia las patentes U.S. nº 4.016.043;
nº 4.424.279 y nº 4.018.653 y a Harlow et al, que
proporcionan protocolos extensos para la inmunodetección de
moléculas. Estas técnicas, por supuesto, incluyen tanto ensayos den
sitios únicos como en sitios dobles, o ensayos "sándwich",
ensayos de tipo no competitivo, así como ensayos de unión
competitiva, ELISA; radioinmunoensayos, inmunoprecipitación e
inmunotransferencia (Transferencia Western). Los ensayos sándwich
se utilizan habitualmente, existen diversas variaciones de la
técnica, y todas tienen el propósito de incluirse en la presente
invención.
Inmunoensayos directos e indirectos, es decir,
ELISA, inmunotransferencia y similares, pueden utilizar moléculas
informadoras unidas a un anticuerpo primario (ensayo directo) o a
un anticuerpo secundario, o a una proteína anticuerpo específica tal
como la Proteína A o la Proteína G (ensayo indirecto). El
anticuerpo primario puede ser un anticuerpo de la invención objeto
marcado con la molécula informadora deseada.
Por "molécula informadora", tal como se
utiliza en la presente memoria, se quiere significar una molécula
que, por su naturaleza química, proporciona una señal identificable
para detectar los complejos antígeno-anticuerpo. La
detección puede ser cualitativa o cuantitativa. Las moléculas
informadoras utilizadas más habitualmente son enzimas, fluoróforos,
o moléculas que contienen radionúclidos (es decir, isótopos
radioactivos). En el caso de un inmunoensayo enzimático, una enzima
se conjuga al anticuerpo, generalmente mediante glutaraldehído o
peryodato. Como fácilmente se reconocerá, sin embargo, existe una
amplia variedad de distintas técnicas de conjugación, que están
fácilmente disponibles para el experto en la materia. Las enzimas
que se utilizan habitualmente incluyen la peroxidasa de rábano,
glucosa oxidasa, \beta-galactosidasa, y fosfatasa
alcalina, entre otras. El substrato a utilizar con una enzima
particular se selecciona generalmente para producir un cambio de
color detectable después de la reacción. Por ejemplo, el
p-nitrofenil fosfato es apropiado para utilizar con
conjugados de la fosfatasa alcalina; para los conjugados de la
peroxidasa, pueden utilizarse habitualmente la
1,2-fenilendiamina, el ácido
5-aminosalicílico, o la toluidina. Es posible
asimismo utilizar substratos fluorogénicos, que dan lugar a un
producto fluorescente, más que los substratos cromogénicos que se
consideraron anteriormente. Después de unir un anticuerpo marcado
con una enzima a un antígeno o complejo
antígeno-anticuerpo, de forma apropiada, el
anticuerpo marcado en exceso se elimina, y se añade una solución
que contiene el substrato apropiado. El substrato reacciona con la
enzima, es decir, la molécula informadora, para dar una señal visual
cualitativa o una señal cuantitativa que puede evaluarse para
indicar la cantidad del antígeno que se encuentra en la
muestra.
Alternativamente, compuestos fluorescentes, tales
como la fluoresceína y la rodamina, pueden acoplarse químicamente
a anticuerpos sin alterar su capacidad de unión. Tal como se
utiliza en la inmunofluorescencia, cuando un anticuerpo marcado con
un fluoróforo es activado iluminándolo con una luz de longitud de
onda específica, absorbe la energía luminosa, induciendo al
fluoróforo a un estado de excitación al que sigue la emisión de luz
con una longitud de onda característica. Generalmente, la luz que se
emite constituye un color característico en el espectro visible y
es detectable con un microscopio óptico equipado para
inmunofluorescencia. Los anticuerpos fluorescentes se utilizan en
ensayos sándwich y en inmunoensayos directos e indirectos tal como
se ha descrito anteriormente, y excepto después de lavado, el
complejo inmune se expone a la luz de una longitud de onda
apropiada, observándose la fluorescencia. La inmunofluorescencia y
las técnicas de inmunoensayo basadas enzimáticamente están ambas
bien establecidas en la técnica y son particularmente preferidas.
Sin embargo, otras moléculas informadoras tales como isótopos
radioactivos, moléculas quimioluminiscentes o bioluminiscentes,
pueden asimismo utilizarse. Será fácil para el experto en la
materia variar el procedimiento para lograr la finalidad
requerida.
Otro aspecto de la invención proporciona un medio
para purificar una enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1)
mediante selección por afinidad. Este procedimiento implica
contactar una muestra que contiene la enzima de escisión en LPXTGX
(SEC ID nº:1) con un anticuerpo de la invención, y separar el
complejo antígeno-anticuerpo, es decir, el complejo
enzima-anticuerpo del resto de la muestra y
recuperar la enzima en una forma que esté libre del anticuerpo.
Típicamente, la muestra que contiene el complejo se fracciona y la
fracción o fracciones que contienen la enzima se identifican
mediante medios convenientes de detección bioquímica, enzimática,
inmunológica u otros. Para facilitar el fraccionamiento dichos
anticuerpos pueden unirse a una resina cromatográfica antes o
después de unirse a la enzima de escisión. Este procedimiento puede
producir la enzima de escisión purificada en grandes cantidades y en
forma pura.
De acuerdo con esto, puede prepararse asimismo un
equipo para el ensayo conveniente y rápido de una enzima de escisión
en LPXTGX (SEC ID nº:1), en muestras en las que se sospeche que
contienen la enzima. El equipo puede contener un anticuerpo
dirigido a la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1), y un
anticuerpo secundario detectable, o puede contener un substrato
marcado para la enzima, de tal forma que, en presencia de ésta, se
detecte un producto de escisión marcado.
Otro aspecto se refiere a un procedimiento para
detectar el ADN o el ARN que codifica la enzima de escisión en el
LPXTGX sujeto (SEC ID nº:1), mediante técnicas de hibridización de
ácidos nucleicos tales como la transferencia Southern, la
transferencia Northern y similares, o mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR). De acuerdo con esto, se proporciona un
procedimiento para detectar una enzima de escisión que comprende
contactar una muestra que se sospecha contiene dicho ADN
codificante de la enzima de escisión, con un primer ácido nucleico
suficientemente complementario para hibridizar un segundo ácido
nucleico que codifica dicha enzima de escisión en dicha muestra,
durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para llevar a cabo
dicha hibridización y por tanto, formar un complejo de dichos
primer y segundo ácidos nucleicos y someter dicho complejo a un
medio de detección. En este procedimiento, el primer ácido nucleico
puede tener un grupo informador unido a él. Los grupos informadores
pueden incluir isótopos radioactivos, grupos que se detectan
enzimáticamente tales como biotina, o fluoróforos tales como
rodamina y fluoresceína. En Sambrook et al. se encuentran
procedimientos detallados para la hibridización y transferencia.
Para la PCR, el procedimiento para detectar un
gen que codifica la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1)
comprende someter una muestra que se sospecha contiene la enzima
de escisión, a una reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
utilizando por lo menos dos iniciadores oligonucleótidos
suficientemente complementarios para hibridizar a un ácido nucleico
en dicha muestra, que codifique dicha enzima de escisión,
produciendo, por lo tanto, por lo menos, un segmento amplificado de
ácido nucleico e identificar dicho segmento. La PCR se ha descrito
en las patentes U.S. nº 4.683.195; nº 4.683.202; y nº 4.800.159 que
se incorporan en la presente memoria como referencia, habiendo sido
asimismo descrita extensamente en la literatura, véase por ejemplo
Saiki et al. (1988), Science
239:487-491. El segmento puede detectarse
mediante electroforesis en gel o transferencia, por ejemplo.
Los siguientes ejemplos se presentan para
ilustrar de modo más completo las formas de realización preferidas
de la invención. Sin embargo, no deben de ninguna forma
contemplarse a título del amplio alcance de la invención.
Se diseñó un péptido sintético con la siguiente
secuencia aminoácida (SEC ID nº:18):
- K R Q L P S T G E T A N P F Y
Este péptido se preparó mediante el procedimiento
en fase sólida de Barany y Merrifield (1979) En Gross y J.
Meienhofer, (ed.), Academic Press, Inc., New York, págs 1 a 284,
que se incorpora completo como referencia, y que se purificó
mediante cromatografía líquida de alta presión en una columna
Brownlee C8 de fase inversa (Brownlee Laboratories, Santa Clara,
CA) con un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al
0,05%. La secuencia se comprobó mediante composición aminoácida y
análisis de la secuencia, de la forma siguiente:
Para el análisis de aminoácidos, se hidrolizaron
los péptidos en HCl 6N a 110ºC durante 22 horas y se derivatizaron
con
etanol-trietilamina-agua-fenilisotiocianato
(7:1:1:1) en una estación de trabajo Picotag (Waters Associates,
Inc., Milford, MA), analizándose con una columna Novapak C18
(Waters) y un Módulo de Datos Waters 840.
El análisis de la secuencia aminoácida se realizó
mediante el modelo de degradación de Edman automatizado en un
secuenciador de fase de gas modelo 470A (Applied Biosystems, Foster
City, CA). Los aminoácidos fenilhidantoínicos se identificaron
mediante cromatografía líquida de alta presión en una columna C18
con un analizador 1084B (Hewlett-Packard Co,
Rockville, MD) o bien un modelo de analizador 120A PTH (Applied
Biosystems). Para el análisis de los amino azúcares, se hidrolizaron
los péptidos en HCl 4 N a 100ºC durante 7 horas. Se derivatizaron
entonces y se analizaron tal como se describe anteriormente para el
análisis de aminoácidos con una columna C18 Novapak (Waters).
El péptido purificado contenía la secuencia
LPSTGE (SEC ID nº: 14) flanqueada a cada lado por los aminoácidos
que se encontraban en esta posición en la molécula de la proteína M
estreptocócica. Como marcador, se secuenció el péptido con una
tirosina (Y) en el extremo C-terminal, de forma que
pudiera marcarse con ^{125}I.
El péptido se marcó radioactivamente con
^{125}I utilizando perlas de yodo, y se purificó entonces el
péptido marcado en una columna Sephadex G10 y se unió
covalentemente por su extremo N-terminal y por EDC
(etil-3-(3 dietilaminopropil)carbodiimida
HCl) a un brazo extendido sobre una perla disponible comercialmente
(3M Emphase Biospheres AB1 de Pierce, Rockford, IL), eliminándose
el marcaje radioactivo en exceso lavando las perlas con tampón de
NaCl 1M.
La cepa D471 estreptocócica M de tipo 6 se trató
con carbonato sódico 0,1 M (pH 11,5) y se incubó durante 30 minutos
a 0ºC para extraer las membranas estreptocócicas.
El extracto resultante se mezcló con las perlas
marcadas del Ejemplo 1 (muestra de 50 \mul, 50 \mul de 50 mM
Tris HCl (pH 8,0) con 10 mM DTT). El marcaje radioactivo se liberó
en dependencia del tiempo y de la dosis, tal como se aprecia en las
Figuras 1 y 2. Los controles que utilizaron detergente no iónico, y
los tampones que contenían una alta concentración de sales, fueron
incapaces de liberar la actividad enzimática, sugiriendo que la
actividad enzimática de escisión estaba firmemente asociada con la
membrana estreptocócica. Sin embargo, las membranas que se
extrajeron con carbonato sódico 0,1 M, pH 11,5, demostraron
actividad de escisión.
El extracto de carbonato se cromatografió en una
columna cromatográfica de perfusión 20 HQ, utilizando un instrumento
Biocad Sprint (Perceptive Biosystem), empleando un gradiente de
NaCl de entre 0 mM y 500 mM (24,9 ml)
seguido por un gradiente de entre 500 mM y 1000 mM (33,2 ml). Para medir la actividad enzimática que se encontró en las fracciones, una muestra de 50 \mul de cada fracción se mezcló en un tampón de reacción con un volumen final de 100 \mul que contenía 5 mM DTT y 5 \mul del substrato-perla, tal como se describe en el Ejemplo 1. Las muestras de control que contenían sólo tampón y el substrato, se mezclaron asimismo y se incubaron a 37ºC durante 4 horas bajo rotación lenta y constante. La radioactividad liberada se midió entonces en 25 \mul del sobrenadante obtenido después de centrifugación. La actividad específica se midió después de restar los valores de control de las muestras del ensayo.
seguido por un gradiente de entre 500 mM y 1000 mM (33,2 ml). Para medir la actividad enzimática que se encontró en las fracciones, una muestra de 50 \mul de cada fracción se mezcló en un tampón de reacción con un volumen final de 100 \mul que contenía 5 mM DTT y 5 \mul del substrato-perla, tal como se describe en el Ejemplo 1. Las muestras de control que contenían sólo tampón y el substrato, se mezclaron asimismo y se incubaron a 37ºC durante 4 horas bajo rotación lenta y constante. La radioactividad liberada se midió entonces en 25 \mul del sobrenadante obtenido después de centrifugación. La actividad específica se midió después de restar los valores de control de las muestras del ensayo.
La actividad enzimática se eluyó en un pico
obtenido entre un gradiente de 0,6 M a 0,7 M NaCl (es decir, entre
37,5 y 43,2 mSiemans de conductividad) en un total de 6 fracciones
de 1 ml cada una. Se descubrió que la radioactividad específica que
se liberó en estas fracciones estaba entre 6000 y 11000 cpm
comparada con otras fracciones en las que los valores variaron
entre 0 y 1000 cpm.
La Figura 3 muestra la actividad enzimática del
extracto de carbonato de las membranas (como fuente enzimática) en
presencia de varios inhibidores y activadores.
Se descubrió que la actividad se potenciaba en
presencia de 5 mM DTT y de cationes divalentes tales como el
calcio.
Cada 1 mM de ácido parahidroximercuribenzoico
(PHMB) y de ácido parahidroximercurifenilsulfónico (PHMPS) inhibió
la actividad de escisión.
Estos resultados indican que la enzima es
sulfhidrilo dependiente.
Se analizó el péptido sintético escindido marcado
utilizando la secuenciación del extremo C y/o el análisis
aminoácido para determinar el sitio exacto de la escisión, y las
regiones óptimas que franquean al sitio diana LPXTGX (SEC ID
nº:1).
Aunque la presente invención se ha descrito e
ilustrado en la presente memoria haciendo referencia a diversos
procedimientos, ejemplos y material específico, se comprende que no
se restringe a las combinaciones particulares del material y de los
procedimientos que se seleccionaron con esta finalidad. Pueden
considerarse numerosas variaciones de dichos detalles, tal como se
apreciará por los expertos en la materia.
Claims (28)
1. Enzima purificada y aislada que escinde las
proteínas superficiales de bacterias gram-positivas
en el interior del motivo LPXTGX (SEC ID nº:1).
2. Enzima según la reivindicación 1, en la que la
bacteria es Streptococcus, preferentemente un
Streptococcus del grupo A.
3. Enzima según la reivindicación 1 ó 2, en la
que la proteína superficial enzimática es una proteína M, y,
preferentemente, la secuencia aminoácida del motivo es LPSTGE (SEC
ID nº:14).
4. Enzima según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que se ha aislado de bacterias
gram-positivas preferentemente de
Streptococcus, más preferentemente de un
Streptococcus del grupo A.
5. Enzima según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la actividad de escisión de
la enzima es potenciada en presencia de un agente reductor,
preferentemente ditiotreitol.
6. Enzima según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la enzima es inhibida por el
ácido parahidroximercuribenzoico o por el ácido
parahidroximercurifenilsulfónico.
7. Anticuerpo dirigido a la enzima según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
8. Anticuerpo según la reivindicación 7, en la
que el anticuerpo es policlonal.
9. Anticuerpo según la reivindicación 7, en la
que el anticuerpo es monoclonal.
10. Procedimiento para analizar en una muestra,
el nivel de actividad enzimática de una enzima que escinde las
proteínas superficiales de bacterias gram-positivas
en el interior del motivo LPXTGX (SEC ID nº:1), que comprende las
etapas de:
- (a)
- mezclar el substrato que vehiculiza el péptido marcado unido covalentemente, que comprende una secuencia aminoácida de LPXTGX (SEC ID nº:1), con un extracto de la membrana de bacterias gram-positivas de dicha muestra;
- (b)
- detectar una liberación del marcado a partir del substrato; y
- (c)
- correlacionar la liberación del marcado con la actividad de la enzima.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que el péptido comprende la secuencia LPSTGE (SEC ID nº:14).
12. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que la bacteria es Streptococcus, preferentemente un
Streptococcus de grupo A.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, en el que el marcado es radioactivo.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, en el que el substrato está formado por
perlas cromatográficas de un diámetro preferentemente de entre 30 y
100 \mum, más preferentemente de entre 50 y 80 \mum.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 14, en el que el extracto de la membrana se
obtiene tratando dicha muestra con un tampón carbonato,
preferentemente con una concentración de carbonato sódico
comprendido entre 0,05 a 2,0 M, más preferentemente de
aproximadamente 0,1 M.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que el tampón bicarbonato tiene un pH comprendido entre 9 y 14,
preferentemente de aproximadamente 11,5.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 16, en el que se evalúa la actividad de un
inhibidor putativo de dicha enzima, en el que la etapa a) se lleva
a cabo en presencia y ausencia del inhibidor putativo, comparándose
la liberación del marcado en presencia del inhibidor con la
liberación del marcado en ausencia del inhibidor putativo.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que el inhibidor es un compuesto que oxida los grupos sulfhidrilo
de los residuos de cisteína en la enzima para formar cistina, y se
encuentra en la etapa a) en una cantidad suficiente para inactivar
la unión de la enzima a su substrato.
19. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que el inhibidor es un compuesto que contiene un metal pesado que
reacciona con los grupos sulfhidrilo de los residuos de cisteína en
la enzima para formar mercáptidos, y se encuentra en la etapa a),
seleccionándose preferentemente de entre el grupo formado por el
ácido parahidroximercuribenzoico y parahidroximercurifenilsulfónico
en una cantidad suficiente para inactivar la unión de la enzima a
su substrato.
20. Substrato sintético que comprende un péptido
que comprende una secuencia aminoácida LPSTGE, un marcador
radioactivo y una perla.
21. Substrato sintético según la reivindicación
20, en el que el marcador radioactivo es ^{125}I y
preferentemente perlas yodadas.
22. Substrato sintético según la reivindicación
21, en el que el péptido es KRQLPSTGETANPFY.
23. Substrato sintético según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 22, en el que las perlas son perlas
cromatográficas, con un diámetro preferentemente de entre 30 y 100
\mum, más preferentemente de entre 50 y 80 \mum.
24. Utilización de un substrato sintético según
cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el procedimiento de
la reivindicación 10.
25. Procedimiento para aislar e identificar una
enzima que escinde las proteínas superficiales de bacterias
gram-positivas, que incluye las etapas
siguientes:
- (a)
- preparar un extracto de la membrana de una muestra que contiene las bacterias gram-positivas que contienen proteínas unidas a la membrana;
- (b)
- fraccionar las proteínas unidas a la membrana mediante cromatografía, utilizando un gradiente salino; y
- (c)
- identificar la presencia de la enzima en una fracción utilizando el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que la bacteria gram-positiva en la muestra es
Streptococcus, preferentemente un Streptococcus de
grupo A.
27. Procedimiento según la reivindicación 25 ó
26, en el que (en la etapa a) el extracto de membrana se obtiene
utilizando tampón carbonato, con una concentración de carbonato
sódico comprendida preferentemente entre 0,05 y 0,2 M, más
preferentemente aproximadamente del 0,1 M.
28. Procedimiento según la reivindicación 27, en
el que el tampón carbonato es de un pH comprendido entre 9 y 14,
preferentemente aproximadamente del 11,5.
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Families Citing this family (23)
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|---|---|---|---|---|
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| US20030082110A1 (en) * | 1997-10-31 | 2003-05-01 | Vincent Fischetti | Use of bacterial phage associated lysing proteins for treating bacterial dental caries |
| US6752988B1 (en) * | 2000-04-28 | 2004-06-22 | New Horizons Diagnostic Corp | Method of treating upper resiratory illnesses |
| US6406692B1 (en) | 1997-10-31 | 2002-06-18 | New Horizons Diagnostics Corp | Composition for treatment of an ocular bacterial infection |
| US6428784B1 (en) * | 1997-10-31 | 2002-08-06 | New Horizons Diagnostics Corp | Vaginal suppository for treating group B Streptococcus infection |
| US7232576B2 (en) | 1997-10-31 | 2007-06-19 | New Horizons Diagnostics Corp | Throat lozenge for the treatment of Streptococcus Group A |
| US20030129146A1 (en) * | 1997-10-31 | 2003-07-10 | Vincent Fischetti | The use of bacterial phage associated lysing proteins for treating bacterial dental caries |
| US6056954A (en) | 1997-10-31 | 2000-05-02 | New Horizons Diagnostics Corp | Use of bacterial phage associated lysing enzymers for the prophylactic and therapeutic treatment of various illnesses |
| US6423299B1 (en) | 1997-10-31 | 2002-07-23 | Vincent Fischetti | Composition for treatment of a bacterial infection of an upper respiratory tract |
| US6277399B1 (en) | 1997-10-31 | 2001-08-21 | New Horizon Diagnostics Corporation | Composition incorporating bacterial phage associated lysing enzymes for treating dermatological infections |
| US6432444B1 (en) | 1997-10-31 | 2002-08-13 | New Horizons Diagnostics Corp | Use of bacterial phage associated lysing enzymes for treating dermatological infections |
| US7063837B2 (en) * | 1999-09-14 | 2006-06-20 | New Horizons Diagnostics Corp | Syrup composition containing phage associated lytic enzymes |
| CA2881568C (en) | 2000-10-27 | 2019-09-24 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b |
| DK1395648T3 (da) | 2001-06-11 | 2009-08-03 | Applied Nanosystems Bv | Fremgangsmåder til binding af AcmA-type proteinankerfusioner til cellevægsmateriale af mikroorganismer |
| US20070053924A1 (en) * | 2002-08-26 | 2007-03-08 | Herve Tettelin | Conserved and specific streptococcal genomes |
| US7604975B2 (en) * | 2002-10-01 | 2009-10-20 | The Rockefeller University | Glycosylated LPXTGases and uses thereof |
| ES2505695T3 (es) | 2003-07-31 | 2014-10-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Composiciones inmunógenas para Streptococcus pyogenes |
| US8945589B2 (en) * | 2003-09-15 | 2015-02-03 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Srl | Immunogenic compositions for Streptococcus agalactiae |
| JP2008508320A (ja) | 2004-07-29 | 2008-03-21 | カイロン コーポレイション | Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅのようなグラム陽性細菌に対する免疫原性組成物 |
| US7838010B2 (en) * | 2004-10-08 | 2010-11-23 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Immunogenic and therapeutic compositions for Streptococcus pyogenes |
| CA2668018A1 (en) * | 2006-10-30 | 2008-09-12 | Novartis Ag | Immunogenic and therapeutic compositions for streptococcus pyogenes |
| KR101621837B1 (ko) | 2007-09-12 | 2016-05-17 | 노파르티스 아게 | Ｇａｓ57 돌연변이 항원 및 ｇａｓ57 항체 |
| EP2537857B1 (en) | 2007-12-21 | 2017-01-18 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Mutant forms of streptolysin O |
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