ES2638311T3

ES2638311T3 - Descubrimiento innovador de composiciones terapéuticas, diagnósticas y de anticuerpos relacionadas con fragmentos de proteína de treonil ARNt sintetasas

Info

Publication number: ES2638311T3
Application number: ES11777984.3T
Authority: ES
Inventors: Leslie Ann Greene; Kyle P. Chiang; Fei Hong; Alain P. Vasserot; Wing-Sze Lo; Jeffry D. Watkins; John D. Mendlein; Cheryl L. Quinn
Original assignee: Pangu Biopharma Ltd; aTyr Pharma Inc
Current assignee: Pangu Biopharma Ltd; aTyr Pharma Inc
Priority date: 2010-04-27
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2017-10-19
Anticipated expiration: 2031-04-27
Also published as: CN108165537A; EP2563382A4; US20150284706A1; JP2015186486A; JP2013531973A; WO2011139801A3; US8986681B2; US20190218542A1; JP2017201994A; US20130129704A1; US10563192B2; EP2563382A2; EP2563382B1; US20170246296A1; WO2011139801A2; US9580706B2; AU2011248521B2; US10150958B2; CA2797259C; JP6240500B2

Abstract

Una composición terapéutica que comprende un polipéptido de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) de 100 a 450 aminoácidos de longitud y que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, un 98 % o un 100 % idéntica a las SEQ ID NO: 12, 14, 50 o 58, en donde el polipéptido tiene una actividad de señalización extracelular y tiene una solubilidad de al menos 5 mg/ml y en donde la composición tiene una pureza de al menos el 95 % basándose en la proteína y menos de 10 UE de endotoxina/mg de proteína.

Description

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sujeto que recibe este tratamiento es cualquier sujeto que lo necesite. Los marcadores a modo de ejemplo de mejora clínica serán evidentes para las personas expertas en la materia.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos

5 convencionales de biología molecular y técnicas de DN recombinante dentro del nivel de capacidad de la técnica, muchas de las cuales se describen más adelante con fines ilustrativos. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª edición, 2000); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (P. Herdewijn, ed., 2004); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames

10 y S. Higgins, eds., 1985); Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin y Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, R.I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 5ª ed. Hoboken NJ, John Wiley & Sons;

B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (3ª edición, 2010); Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3ª edición 2005), Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis 15 and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual de Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-3,4-2), 1855. Handbook of Drug Screening, editado por Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, Nueva York, N.Y., Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); y Lab Ref: A

20 Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, editado por Jane Roskams y Linda Rodgers, (2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3).

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en el presente documento se incorporan al presente documento por referencia en su totalidad.

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III. FRAGMENTOS Y VARIANTES DE PROTEÍNA AARS PURIFICADOS PARA APLICACIONES TERAPÉUTICAS Y OTRAS

Sorprendentemente y a diferencia de sus secuencias parentales de longitud completa que se conocen únicamente

30 por sus actividades de aminoacilación, se ha descubierto que los fragmentos de AARS poseen actividades biológicas importantes para aplicaciones bioterapéuticas, de descubrimiento y diagnósticas. Por lo tanto, las realizaciones de la invención incluyen proteínas de longitud completa, isoformas maduras de proteínas y fragmentos de proteína de aminoacil-ARNt sintetasas (AARS), además de variantes biológicamente activas y fragmentos de las mismas. En determinadas realizaciones, las proteínas y los fragmentos pueden surgir mediante proteólisis

35 endógena, proteólisis in vitro, variación de corte y empalme o predicción informatizada, entre otros mecanismos.

Los fragmentos de proteína AARS descritos en el presente documento y las variantes de los mismos, pueden poseer al menos una actividad biológica "no canónica". Los fragmentos de proteína AARS de la presente invención también se citan en el presente documento como "polipéptidos de AARS" o "polipéptidos de referencia de AARS". En 40 determinadas realizaciones, los polipéptidos de AARS proporcionados en el presente documento comprenden o consisten esencialmente en la totalidad o una parte de las "secuencias de referencia" del polipéptido de AARS, tal como se exponen en las tablas 1-3 o las tablas 4-6 o las tablas 7-9 más adelante, que representan las secuencias de aminoácidos de diversos fragmentos de treonil-ARNt sintetasas. Las secuencias de proteína AARS de ratón y humanas están altamente relacionadas, difiriendo normalmente en no más de unos pocos aminoácidos dentro de

45 una secuencia completa, un dominio particular o un fragmento de proteína particular.

Polipéptidos de AARS N-terminales: (Tablas 1, 2 y 3)

Tabla 1A Polipéptidos de AARS identificados por EM

Nombre: Tipo / Especie / Restos Secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico SEQ ID NO

ThrRS1N1: Proteína / Humano / 1-322 imagen15 SEQ ID NO: 12

ThrRS1N1: ADN / Humano SEQ ID NO: 13

ThrRS1N2: Proteína / Humano / SEQ ID NO: 14

1-146

ThrRS1N2: ADN / Humano SEQ ID NO: 15

Tabla 1B ThrRS1N1 Péptidos detectados por espectrometría de masas y péptidos enlazadores deducidos

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: imagen16 SEQ ID NO: 16

Proteína / ratón: imagen17 SEQ ID NO: 17

Proteína / ratón: imagen18 SEQ ID NO: 18

Tabla 1C ThrRS1N1 Secuencias concatenadas basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína /: SEQ ID

ratón: NO.19

Tabla 1D ThrRS1N2 Péptidos detectados por espectrometría de masas y péptidos enlazadores deducidos

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: imagen19 SEQ ID NO: 20

Proteína / ratón: imagen20 SEQ ID NO: 21

Proteína / ratón: imagen21 SEQ ID NO: 22

Tabla 1E ThrRS1N2 Secuencias concatenadas basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: imagen22 SEQ ID NO: 23

Tabla 2 Polipéptidos de AARS y transcritos alternativos identificados mediante secuenciación profunda

ThrRS1N3: Proteína / Humano / 1328 + 1aa imagen23 SEQ ID NO: 24

ThrRS1N3: ADN / Humano SEQ ID NO: 25

ThrRS1N4: Proteína / Humano / 1- SEQ ID

109 + 9aa: NO: 26

ThrRS1N4: ADN / Humano imagen24 SEQ ID NO: 27

imagen25

ThrRS1N5: Proteína / Humano / 1- SEQ ID

576 + S577R + 613-: NO: 28

723

ThrRS1N5: ADN / Humano imagen26 SEQ ID NO: 126

imagen27

imagen28

Tabla 2B Uniones de corte y empalme únicas de polipéptidos de AARS

Nombre: Tipo / Especie Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos en la proximidad de la unión de corte y empalme única SEQ ID NO

T1-AS02: ADN / Humano / imagen29 SEQ ID NO: 29

Proteína / Humano: SEQ ID NO: 30

T1-AS04: ADN / Humano / SEQ ID NO: 31

Proteína / Humano: SEQ ID NO: 32

T1-AS05: ADN / Humano / SEQ ID NO: 33

Proteína / Humano: SEQ ID NO: 34

Tabla 3 Polipéptidos y ácidos nucleicos de AARS identificados mediante bioinformática

Polipéptidos de AARS C-terminales: (Tablas 4, 5 y 6)

Tabla 4A Polipéptidos de AARS identificados por EM

ThrRS1C1: Proteína / Humano / SEQ ID

307-723: imagen30 NO: 50

ThrRS1C1: ADN / Humano / imagen31 SEQ ID NO: 51

ThrRS1C2: Proteína / Humano / SEQ ID

346-723: NO: 52

ThrRS1C2: ADN / Humano / imagen32 SEQ ID NO: 53

ThrRS1C3: Proteína / Humano / SEQ ID

432-723: NO: 54

ThrRS1C3: ADN / Humano / imagen33 SEQ ID NO: 55

ThrRS1C4: Proteína / Humano / SEQ ID

380-723: NO: 56

ThrRS1C4: ADN / Humano / imagen34 SEQ ID NO: 57

imagen35

ThrRS1C5: Proteína / Humano / SEQ ID

294-723: imagen36 NO: 58

ThrRS1C5: ADN / Humano / SEQ ID NO: 59

imagen37

Tabla 4B ThrRS1C1 Péptidos detectados por espectrometría de masas y péptidos enlazadores deducidos

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: imagen38 SEQ ID NO: 60

Proteína / ratón: imagen39 SEQ ID NO: 61

Proteína / ratón: imagen40 SEQ ID NO: 62

Proteína / ratón: imagen41 SEQ ID NO: 63

Proteína / ratón: imagen42 SEQ ID NO: 64

Proteína / ratón: imagen43 SEQ ID NO: 65

Tabla 4C ThrRS1C1 Secuencias concatenadas basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: imagen44 SEQ ID NO: 66

Tabla 4D ThrRS1C2 Péptidos detectados por espectrometría de masas y péptidos enlazadores deducidos

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: imagen45 SEQ ID NO: 67

Proteína / ratón: imagen46 SEQ ID NO: 68

imagen47

Proteína / ratón: imagen48 SEQ ID NO: 69

Tabla 4E ThrRS1C2 Secuencias concatenadas basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: imagen49 SEQ ID NO: 70

Tabla 4F ThrRS1C3 Péptidos detectados por espectrometría de masas y péptidos enlazadores deducidos

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: imagen50 SEQ ID NO: 71

Proteína / ratón: imagen51 SEQ ID NO: 72

Proteína / ratón: imagen52 SEQ ID NO: 73

Tabla 4G ThrRS1C3 Secuencias concatenadas basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: SEQ ID NO: 74

Tabla 4H ThrRS1C4 Péptidos detectados por espectrometría de masas y péptidos enlazadores deducidos

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: imagen53 SEQ ID NO: 75

Proteína / ratón: SEQ ID

NO: 76

Proteína / ratón: SEQ ID

NO: 77

Tabla 4I ThrRS1C4 Secuencias concatenadas basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: imagen54 SEQ ID NO: 78

Tabla 4J ThrRS1C5 Péptidos detectados por espectrometría de masas y péptidos enlazadores deducidos

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: imagen55 SEQ ID NO: 79

Proteína / ratón: imagen56 SEQ ID NO: 80

Proteína / ratón: imagen57 SEQ ID NO: 81

Proteína / ratón: imagen58 SEQ ID NO: 82

Proteína / ratón: imagen59 SEQ ID NO: 83

Tabla 4K ThrRS1C5 Secuencias concatenadas basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: SEQ ID

NO: 84

Tabla 5 Polipéptidos de AARS y transcritos alternativos identificados mediante secuenciación profunda

ThrRS1C6: Proteína / Humano / 600-723 imagen60 SEQ ID NO: 85

ThrRS1C6: ADN / Humano imagen61 SEQ ID NO: 86

imagen62

ThrRS1C7: Proteína / Humano / SEQ ID

1-19 + 47-723: NO: 87

ThrRS1C7: ADN / Humano imagen63 SEQ ID NO: 88

imagen64

imagen65

ThrRS1C8: Proteína / Humano / SEQ ID

161-723: NO: 89

ThrRS1C8: ADN / Humano imagen66 SEQ ID NO: 90

imagen67

Tabla 5B Uniones de corte y empalme únicas de polipéptidos de AARS

T1-AS02: ADN / Humano / imagen68 SEQ ID NO: 91

Proteína / Humano /: N/A SEQ ID NO: 92

T1-AS03: ADN / Humano / imagen69 SEQ ID NO: 93

Proteína / Humano /: imagen70 SEQ ID NO: 94

T1-AS04: ADN / Humano / imagen71 SEQ ID NO: 95

Proteína / Humano /: N/A SEQ ID NO: 96

Tabla 6 Polipéptidos y ácidos nucleicos de AARS identificados mediante bioinformática

Nombre: Tipo / Especie / Restos Secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico SEQ ID NO:

Polipéptidos de AARS internos: (Tablas 7, 8 y 9)

Tabla 7A Polipéptidos de AARS identificados por EM

ThrRS1I1: Proteína / Humano / 147-620 imagen72 SEQ ID NO: 115

imagen73

ThrRS1I1: ADN / Humano / imagen74 SEQ ID NO: 116

imagen75

Tabla 7B ThrRS1I1 Péptidos detectados por espectrometría de masas y péptidos enlazadores deducidos

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: imagen76 SEQ ID NO: 117

Proteína / ratón: imagen77 SEQ ID NO: 118

Proteína / ratón: imagen78 SEQ ID NO: 119

Proteína / ratón: imagen79 SEQ ID NO: 120

Proteína / ratón: imagen80 SEQ ID NO: 121

Tabla 7C ThrRS1I1 Secuencias concatenadas basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo / Especie: Secuencia SEQ ID NO

Proteína / ratón: imagen81 SEQ ID NO: 122

Tabla 8 Polipéptidos de AARS y transcritos alternativos identificados mediante secuenciación profunda

Tabla 8B Uniones de corte y empalme únicas de polipéptidos de AARS

Tabla 9 Polipéptidos y ácidos nucleicos de AARS identificados mediante bioinformática

5 Los "fragmentos de proteína" o la secuencia de aminoácidos de los fragmentos de proteína, tales como los fragmentos proteolíticos o los fragmentos variantes de corte y empalme, pueden caracterizarse, identificarse o derivarse de acuerdo con diversas técnicas. Por ejemplo, las variantes de corte y empalme pueden identificarse mediante técnicas, tales como secuenciación profunda (véase, por ejemplo, Xing et al., RNA. 14:1470-1479, 2008; y

10 Zhang et al., Genome Research. 17:503-509, 2007). A modo de ejemplo adicional, pueden identificase fragmentos de proteína, tales como fragmentos proteolíticos in vitro, tal como incubando polipéptidos de AARS de longitud completa u otros con proteasas seleccionadas o pueden identificarse de manera endógena (por ejemplo, in vivo). En determinadas realizaciones, pueden generarse o identificarse fragmentos de proteína, tales como fragmentos proteolíticos endógenos, por ejemplo, expresando de manera recombinante polipéptidos de AARS de longitud

15 completa u otros en un microorganismo o célula eucariota seleccionada que se ha modificado para que contenga una o más proteasas seleccionadas o que contiene naturalmente una o más proteasas que son capaces de actuar en un polipéptido AARS seleccionado y aislar y caracterizar los fragmentos de proteína producidos por las mismas.

En determinadas realizaciones, pueden generarse o identificarse fragmentos de proteína, tales como fragmentos

20 proteolíticos endógenos (por ejemplo, de origen natural), por ejemplo, a partir de varias fracciones celulares (por ejemplo, citosólicas, membrana, nucleares) y/o medio de crecimiento de diversos tipos celulares, incluyendo, por ejemplo, células inmunitarias, tales como monocitos, células dendríticas, macrófagos (por ejemplo, macrófagos RAW 264.7), neutrófilos, eosinófilos, basófilos y linfocitos, tales como células B y células T (por ejemplo, células CD4+ colaboradoras y CD8+ citolíticas), incluyendo células T primarias y líneas de células T, tal como células T Jurkat, así

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un polipéptido de AARS, tal como un polipéptido de AARS de longitud completa, con una o más proteasas humanas aisladas, principalmente aquellas proteasas que son endógenas o naturales para seres humanos, tales como elastasa y otras descritas en el presente documento y conocidas en la técnica. Otras realizaciones se refieren a polipéptidos AARS aislados, que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en secuencias de

5 aminoácidos que se han derivado de variantes de corte y empalme de AARS endógenas de origen natural y a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos fragmentos y métodos de uso de los mismos. Esencialmente, el fragmento de proteína AARS puede aislarse de muestras que se han expuesto a proteasas, ya sea in vivo o in vitro.

10 En determinadas realizaciones, pueden identificarse fragmentos de proteína AARS mediante técnicas tales como espectrometría de masas o técnicas equivalentes. Solo a título ilustrativo y sin limitación, en determinadas realizaciones pueden separarse los proteomas de diversos tipos celulares, tejidos o fluidos corporales de una serie de estados fisiológicos (por ejemplo, hipoxia, dieta, edad, enfermedad) o fracciones de los mismos mediante SDS-PAGE en 1D y cortarse las bandas de gel a intervalos fijos; después de esto pueden digerirse opcionalmente las

15 bandas con una proteasa adecuada, tal como tripsina, para liberar los péptidos, que después pueden analizarse mediante CL-EM/EM en fase reversa en 1D. Los datos proteómicos resultantes pueden integrarse en los denominados peptografos, que representan, en el panel izquierdo, la cobertura de secuencia para una proteína dada en la dimensión horizontal (del extremo N al C, de izquierda a derecha) frente a la migración por SDS-PAGE en la dimensión vertical (de elevado a bajo peso molecular, de arriba a abajo). Los fragmentos peptídicos específicos

20 pueden secuenciarse o mapearse. En determinadas realizaciones, el fragmento de referencia de AARS puede caracterizarse por su peso molecular único, en comparación, por ejemplo, con el peso molecular del AARS de longitud completa correspondiente.

Como se ha indicado anteriormente, las realizaciones de la presente divulgación incluyen los polipéptidos de AARS

25 expuestos en las tablas 1-3 o las tablas 4-6 o las tablas 7-9. También se incluyen "variantes" de los polipéptidos de referencia de AARS. La expresión "variante" de polipéptido se refiere a polipéptidos que se distinguen respecto de un polipéptido de AARS de referencia por la adición, eliminación y/o sustitución de al menos un resto de aminoácido y que normalmente retienen (por ejemplo, imitan) o modulan (por ejemplo, antagonizan) una o más actividades no canónicas de un polipéptido de AARS de referencia.

30 Además, las treonil ARNt sintetasas humanas incluyen varios cientos de formas polimórficas altamente relacionadas y se conoce en la técnica que estas son funcionalmente intercambiables, al menos parcialmente. Por lo tanto, sería un hecho rutinario la selección de una variante de origen natural de treonil ARNt sintetasa, incluyendo, por ejemplo, las formas polimórficas de un solo nucleótido enunciadas en la tabla A para crear un polipéptido de AARS que

35 contiene uno o más cambios de aminoácidos, basándose en la secuencia de cualquiera de los homólogos, ortólogos e isoformas de origen natural de los seres humanos, así como otras especies de treonil ARNt sintetasa.

Tabla A SNP de treonil ARNt sintetasa humana

N.º de referencia de Gen Bank: Cambio de nucleótido N.º de referencia de Gen Bank Cambio de nucleótido

rs117847077: A/G rs3849683 G/T

rs117577672: A/G rs3849682 C/T

rs116809288: A/G rs3830415 -/GAA

rs116793555: A/G rs3777083 C/T

rs116686295: A/G rs3777082 C/T

rs116583264: C/T rs3777081 C/T

rs116548419: A/C rs3777080 A/C

rs116483994: A/T rs3777079 C/T

rs116483298: A/T rs3777078 C/T

rs116477391: A/G rs3777077 C/G

rs116390906: C/T rs3777076 C/G

rs116389220: C/T rs3777075 C/G

rs116202547: C/T rs3777074 A/C

rs116175137: C/T rs3777073 C/T

rs116106015: A/G rs3765147 A/G

rs116034587: A/T rs3765146 C/T

rs115949173: A/G rs3765145 A/G

rs115916716: A/G rs3765144 A/G

rs115854398: A/G rs3756664 A/G

rs115792337: A/G rs3756663 G/T

rs115791161: A/G rs3756662 A/G

rs115757567: C/T rs3756661 A/C

rs115722196: G/T rs3736393 A/G

rs115716728: G/T rs3215116 -/TT

rs115631256: A/C rs2642669 A/C

rs115615283: C/T rs2642668 A/C

rs115606888: C/T rs2453288 A/C

rs115521824: C/T rs2304621 C/G

rs115457182: C/T rs2292015 A/T

rs115335493: C/T rs2292014 A/G

rs115269494: A/C rs2270905 A/G

rs115142319: A/G rs2270904 A/G

rs115094360: C/T rs2270903 A/T

rs115022219: C/G rs2270902 C/T

rs114861363: A/G rs2164991 C/T

rs114781111: C/T rs1804513 G/T

rs114771001: C/G rs1687511 A/C

rs114460446: C/T rs11960553 A/G

rs114430658: A/G rs11955289 A/G

rs114345473: C/G rs11955272 C/G

rs114325362: A/G rs11952399 A/G

rs114216008: C/T rsll747025 C/T

rs114076009: C/T rs11742862 A/C

rs114050082: A/T rs11541416 A/G

rs113811412: A/G rs11457738 -/G

rs113783190: C/T rs11422595 -/T

rs113761016: A/G rs11414360 -/T

rs113591967: A/G rs11383852 -/C

rs113541140: C/T rs11356243 -/T

rs113423654: C/T rs10941055 C/T

rs113336276: G/T rs9885230 A/C

rs113272480: C/T rs9686398 C/T

rs113224643: A/G rs7734078 C/T

rs113183080: A/G rs7705177 C/T

rs113177776: C/T rs6893613 A/T

rs113130518: -/A rs6889780 A/G

rs112838270: A/G rs6887261 A/C

rs112825149: A/G rs6885094 A/C

rs112725208: C/T rs6884566 C/G

rs112715860: C/G rs6880623 A/G

rs112666038: G/T rs6880616 A/C

rs112663402: C/T rs6870521 C/T

rs112327269: C/G rs6866808 A/C

rs112295695: A/G rs6450991 A/G

rs112111323: A/G rs6450990 A/C

rs111991770: A/G rs5867191 -/CGCG

rs111989999: A/G rs5867190 -/T

rs111861274: A/C rs5867189 -/G

rs111820262: A/G rs5022546 G/T

rs111784154: G/T rs4867513 C/G

rs111754118: C/T rs4867512 C/T

rs111751492: C/T rs4421109 A/G

rs111627406: C/T rs4398642 C/T

rs111585777: A/T rs4267874 C/T

rs111524308: A/G rs1051211 C/T

rs111503761: A/G rs1051210 C/T

rs111244859: A/G rs35817175 -/G

rs80171437: A/C rs35558849 -/G

rs80050750: G/T rs35375523 -/A

rs79877895: A/T rs35331115 -/G

rs79826178: A/G rs35121278 -/T

rs79824382: A/G rs35079782 -/TT

rs79651403: -/T rs34910729 A/C

rs79630452: -/AA rs34875186 -/TTG

rs79607007: C/T rs34725061 -/T

rs79542443: G/T rs34715628 C/T

rs79519321: A/G rs34673293 -/T

rs79384125: A/G rs34630295 -/A

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rs79329976: C/G rs34580645 -/C

rs79122509: A/G rs34374932 -/G

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rs78297441: C/T rs16891180 A/G

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rs78020132: A/G rs16891141 C/G

rs77972413: A/G rs16891129 A/G

rs77949355: -/T rs16891125 C/G

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rs77571586: G/T rs13164529 A/G

rs77568569: A/G rs13154531 A/G

rs77381964: -/TTT rs12659798 C/T

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rs76879463: C/T rs12187715 A/C

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rs76642289: A/G rs72532931 -/T

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rs76360820: C/T rs72267455 -/AG

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rs75998770: A/G rs72136033 -/TG

rs75982140: G/T rs72087182 -/TA

rs75786537: G/T rs72062875 -/TT

rs75716245: G/T rs71996427 -/TT

rs75690412: A/T rs71824161 -/T

rs75560674: A/T rs71801512 -/A

rs75334927: C/T rs71749653 -/T

rs75319890: C/T rs71678725 -/GA

rs75309293: A/C rs71600909 -/GAA

rs75248757: A/G rs71600908 -/T

rs75238388: A/C rs67503660 -/T

rs75075633: A/G rs67450756 A/C

rs74889236: -/TT rs66916211 -/TT

rs74728320: C/T rs66544947 -/TT

rs74618872: A/C rs62351066 A/G

rs74417746: A/C rs62351065 A/G

rs74316832: C/T rs61734318 C/G

rs73758555: A/G rs60881601 -/TA

rs73758552: C/T rs60484211 G/T

rs73076308: C/G rs60163332 C/T

rs73076306: C/T rs59747499 A/G

rs73074392: C/G rs59128488 A/T

rs73074385: A/G rs59078367 A/G

rs73074377: A/G rs58771215 A/G

rs73074376: C/G rs58510147 A/T

rs73074374: C/T rs58463740 A/T

rs73074360: C/T rs56938839 A/G

rs73074357: C/T rs56718466 C/T

rs72737350: A/G rs55759090 A/C

rs72737349: A/G rs55749081 -/T

rs72737345: A/C rs35931457 -/T

rs1003000: C/T

rs893551: C/T

rs7261: A/G

rs3842066: -/AAC/CAA

rs4365842: -/C/CACGTG/T

rs10583985: -/CTCTCTCT

rs36102914: -/TA/TATATA

rs57691465: -/TTTTTTT

rs59141272: -/ATATATATAG

rs66723019: -/ATATA/ATATATATAG

rs71676557: (ELIMINACIÓN GRANDE)/

rs67402626: -/TTTTTTT

rs71692029: (ELIMINACIÓN GRANDE)/

rs78884891: -/CGCGTATA

En determinadas realizaciones, una variante de polipéptido se distingue de un polipéptido de referencia por una o más sustituciones, que pueden ser conservativas o no conservativas, tal como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. En determinadas realizaciones, la variante de polipéptido comprende

5 sustituciones conservativas y, a este respecto, se entiende en la técnica que pueden cambiarse algunos aminoácidos por otros con propiedades ampliamente similares sin cambiar la naturaleza de la actividad del polipéptido.

En determinadas realizaciones, una variante de polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al

10 menos aproximadamente un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o más de identidad o similitud de secuencia con una secuencia correspondiente de un polipéptido de AARS de referencia, tal como se describe en el presente documento y retiene sustancialmente la actividad no canónica de ese polipéptido de referencia. También se incluyen secuencias que difieren de las secuencias de AARS de referencia por la adición, eliminación o sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,

15 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 o más aminoácidos pero que mantienen las propiedades del polipéptido de AARS de referencia. En determinadas realizaciones, las adiciones o eliminaciones de aminoácidos se producen en el extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal del polipéptido de AARS de referencia. En determinadas realizaciones, las adiciones de aminoácidos incluyen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

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peptídicas. La estructura de la prolina difiere de la de todos los demás aminoácidos de origen natural en que su cadena lateral está unida al nitrógeno del grupo α-amino, así como al carbono α. Se conocen en la técnica varias matrices de similitud de aminoácidos (véase, por ejemplo, la matriz PAM120 y la matriz PAM250 divulgadas, por ejemplo, por Dayhoff et al., 1978, A model of evolutionary change in proteins). Las matrices para determinar

5 relaciones distantes en M. O. Dayhoff, (ed.), Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, págs. 345-358, National Biomedical Research Foundation, Washington DC; y de Gonnet et al., (Science, 256: 14430-1445, 1992), sin embargo, incluyen a la prolina en el mismo grupo que la glicina, serina, alanina y treonina. Por consiguiente, para los fines de la presente invención, la prolina se clasifica con un aminoácido "pequeño".

10 El grado de atracción o repulsión necesario para la clasificación como polar o no polar es arbitrario y, por lo tanto, los aminoácidos contemplados específicamente por la invención se han clasificado como de uno u otro modo. La mayor parte de los aminoácidos no nombrados específicamente pueden clasificarse basándose en un comportamiento conocido.

15 Los restos aniónicos pueden subclasificarse adicionalmente como cíclicos o no cíclicos y aromáticos o no aromáticos, clasificaciones que se explican por sí mismas respecto de los grupos sustituyentes de la cadena lateral de los restos y como pequeños o grandes. El resto se considera pequeño en caso de que contenga un total de cuatro átomos de carbono o menos, incluyendo el carbono del carboxilo, siempre que esté presente un sustituyente polar adicional; de tres o menos en caso contrario. Evidentemente, los restos pequeños siempre son no aromáticos.

20 Dependiendo de sus propiedades estructurales, los restos de aminoácidos pueden encontrarse en dos o más clases. Para los aminoácidos de proteínas de origen natural, en la tabla B se presenta una subclasificación de acuerdo con este esquema.

Tabla B: Subclasificación de aminoácidos

Subclases: Aminoácidos

Ácidos Básicos Cargados Pequeños Polares/neutros Polares/grandes Hidrófobos Aromáticos Restos que influyen en la orientación de la cadena: Ácido aspártico, Ácido glutámico No cíclicos: Arginina, Lisina; Cíclicos: Histidina Ácido aspártico, Ácido glutámico, Arginina, Lisina, Histidina Glicina, Serina, Alanina, Treonina, Prolina Asparagina, Histidina, Glutamina, Cisteína, Serina, Treonina Asparagina, Glutamina Tirosina, Valina, Isoleucina, Leucina, Metionina, Fenilalanina, Triptófano Triptófano, Tirosina, Fenilalanina Glicina y Prolina

25 La sustitución conservativa de aminoácidos también incluye agrupamientos basados en las cadenas laterales. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas está formado por glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas-de hidroxilo está formado por serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida está formado por

30 asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas está formado por fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas está formado por lisina, arginina e histidina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre está formado por cisteína y metionina. Por ejemplo, sería razonable esperar que el reemplazo de una leucina por una isoleucina o valina, de un aspartato por un glutamato, de una treonina por una serina o un reemplazo similar de un aminoácido

35 por un aminoácido relacionado estructuralmente no tenga un efecto importante en las propiedades del polipéptido variante resultante. Puede determinarse fácilmente si un cambio de aminoácido da como resultado un polipéptido de AARS truncado y/o variante funcional ensayando su actividad no canónica, tal como se describen en el presente documento. En la tabla C se muestran sustituciones conservativas bajo el encabezado de sustituciones a modo de ejemplo. Las sustituciones de aminoácidos que se encuentran dentro del alcance de la invención se llevan a cabo en

40 general seleccionando sustituciones que no difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del péptido en el área de la sustitución, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, (c) el volumen de la cadena lateral o (d) la función biológica. Después de haber introducido las sustituciones, se explora la actividad biológica de las variantes.

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Tabla C: Sustituciones de aminoácidos a modo de ejemplo

Resto original Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val: Sustituciones a modo de ejemplo Val, Leu, He Lys, Gln, Asn Gln, His, Lys, Arg Glu Ser Asn, His, Lys, Asp, Lys Pro Asn, Gln; Lys, Arg Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleu Norleu, He, Val, Met, Ala, Phe Arg, Gln, Asn Leu, Ile, Phe Leu, Val, He, Ala Gly Thr Ser Tyr Trp, Phe, Thr, Ser He, Leu, Met, Phe, Ala, Norleu Sustituciones preferidas Val Lys Gln Glu Ser Asn Asp Pro Arg Leu Ile Arg Leu Leu Gly Thr Ser Tyr Phe Leu

Como alternativa, pueden agruparse en tres categorías aminoácidos similares para producir sustituciones conservativas basándose en la identidad de las cadenas laterales. El primer grupo incluye ácido glutámico, ácido

5 aspártico, arginina, lisina, histidina, que tienen todos cadenas laterales cargadas; el segundo grupo incluye glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, glutamina, asparagina; y el tercer grupo incluye leucina, isoleucina, valina, alanina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina, tal como se describe en Zubay, G., Biochemistry, tercera edición, Wm.C. Brown Publishers (1993).

10 Por lo tanto, un resto de aminoácido no esencial predicho en un polipéptido de AARS truncado y/o variante se reemplaza normalmente por otro resto de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Como alternativa, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o parte de una secuencia codificante de AARS, tal como mediante mutagénesis de saturación y pueden explorarse los mutantes resultantes respecto de una actividad del polipéptido progenitor para identificar mutantes que conservan esa actividad. Después de la

15 mutagénesis de las secuencias codificantes, el péptido codificado puede expresarse de manera recombinante y determinarse la actividad del péptido. Un resto de aminoácido "no esencial" es un resto que puede alterarse respecto de la secuencia de referencia de una realización de polipéptido sin suprimir o alterar sustancialmente una o más de sus actividades. De manera adecuada, la alteración no suprime sustancialmente una de estas actividades, por ejemplo, la actividad es al menos un 20 %, 40 %, 60 %, 70 % u 80 % o un 100 %, 500 %, 1000 % o más de la

20 secuencia de AARS de referencia. Un resto de aminoácido "esencial" es un resto que, cuando se altera respecto de la secuencia de referencia de un polipéptido de AARS, da como resultado la supresión de una actividad de la molécula parental, de tal forma que está presente menos de un 20 % de la actividad de referencia. Por ejemplo, dichos restos de aminoácido esenciales incluyen aquellos que están conservados en polipéptidos de AARS entre diferentes especies, incluyendo aquellas secuencias que se encuentran conservadas en los sitios o motivos de unión

25 activos de polipéptidos de AARS de diversos orígenes.

En general, los polipéptidos y los polipéptidos de fusión (así como sus polinucleótidos codificantes) se encuentran aislados. Un polipéptido o polinucleótido "aislado" es uno que se extrae de su ambiente natural. Por ejemplo, una proteína de origen natural se encuentra aislada en caso de que esté separada de algunos o de todos los materiales

30 coexistentes en el sistema natural. Preferentemente, dichos polipéptidos son al menos un 90 % puros, más preferentemente, al menos aproximadamente un 95 % puros y lo más preferentemente, al menos aproximadamente un 99 % puros. Se considera que un polinucleótido está aislado si, por ejemplo, se clona en un vector que no forma parte del ambiente natural.

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M a aproximadamente 0,02 M de sal para el lavado a 55 °C.

Las condiciones de rigurosidad elevada también pueden incluir BSA al 1 %, EDTA 1 mM, NaHPO4 0,5 M (pH 7,2), un 7 % de SDS para hibridación a 65 °C e (i) 0,2 x SSC, SDS al 0,1 %; o (ii) BSA al 0,5 %, EDTA 1 mM, NaHPO4

5 40 mM (pH 7,2), SDS al 1 % para el lavado a una temperatura superior a 65 °C. Una realización de condici ones de rigurosidad elevada incluye hibridar en 6 x SSC a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % a 65 °C. Una realización de condicion es de muy alta rigurosidad incluye hibridación en fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7 % a 65 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2 x SSC, SDS al 1 % a 65 °C.

Se conocen en la técnica otras condiciones de rigurosidad y un experto en la materia reconocerá que pueden manipularse diversos factores para optimizar la especificidad de la hibridación. La optimización de la rigurosidad de los lavados finales puede servir para asegurar un alto grado de hibridación. Para ejemplos detallados, véase Ausubel et al., anteriormente citado, en las páginas 2.10.1 a 2.10.16 y Sambrook et al. (1989, anteriormente citado) en las secciones 1.101 a 1.104.

15 Aunque los lavados rigurosos se suelen llevar a cabo a temperaturas de aproximadamente 42 °C a 68 °C, u n experto en la materia apreciará que pueden ser adecuadas otras temperaturas para las condiciones rigurosas. La velocidad máxima de hibridación se produce normalmente de aproximadamente 20 °C a 25 °C por debajo de la Tm para la formación de un híbrido de ADN-ADN. Es de sobra conocido en la técnica que la Tm es la temperatura de fusión o la temperatura a la cual se disocian dos secuencias de polinucleótido complementarias. Los métodos para estimar la Tm se conocen bien en la técnica (véase Ausubel et al., anteriormente citado, en la página 2.10.8).

En general, la Tm de un dúplex de ADN perfectamente emparejado puede predecirse de manera aproximada mediante la fórmula: Tm = 81,5 + 16,6 (log10 M) + 0,41 ( %G+C) -0,63 ( % formamida) -(600/longitud) en donde: M

25 es la concentración de Na+, preferentemente en el intervalo de 0,01 molar a 0,4 molar; %G+C es la suma de bases de guanosina y citosina como porcentaje del número total de bases, dentro del intervalo entre un 30 % y un 75 % de G+C; % formamida es el porcentaje de concentración de formamida en volumen; longitud es el número de pares de bases en el dúplex de ADN. La Tm de un dúplex de ADN se reduce en aproximadamente 1 °C con cada aumento del 1 % en el número de pares de bases desemparejadas al azar. El lavado se lleva a cabo generalmente a Tm -15 °C para alta rigurosidad o Tm -30 °C para rigurosidad moderada.

En un ejemplo de un procedimiento de hibridación, se hibrida una membrana (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o una membrana de nylon) que contiene ADN inmovilizado durante una noche a 42 °C en un ta mpón de hibridación (formamida desionizada al 50 %, 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt (ficoll al 0,1 %, polivinilpirrolidona

35 al 0,1 % y seroalbúmina bovina al 0,1 %), SDS al 0,1 % y 200 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado) que contiene una sonda marcada. Después, se somete a la membrana a dos lavados de rigurosidad media secuenciales (es decir, 2 x SSC, SDS al 0,1 % durante 15 min a 45 °C, seguido de 2 x SSC, SDS al 0,1 % durante 15 min a 50 °C), seguido de dos la vados secuenciales de mayor rigurosidad (es decir, 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % durante 12 min a 55 °C seguido de 0,2 x SSC y solución de SDS al 0,1 % durante 12 min a 65-68 °C.

Como se ha indicado anteriormente, determinadas realizaciones se refieren a polinucleótidos de AARS que codifican un polipéptido de AARS. Entre otros usos, estas realizaciones pueden utilizarse para producir de manera recombinante un polipéptido de AARS deseado o una variante del mismo o para expresar el polipéptido de AARS en una célula o sujeto seleccionado. Los expertos en la materia apreciarán que, como consecuencia de la degeneración

45 del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido tal como se describe en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos pueden portar una homología mínima para la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. Sin embargo, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones se contemplan específicamente por la presente invención, por ejemplo, polinucleótidos que están optimizados para la selección de codones humanos y/o de primate.

Por lo tanto, los polinucleótidos de la invención pueden codificar los polipéptidos de AARS de la invención. Asimismo, puede manipularse la secuencia de polinucleótido por diversos motivos. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, la incorporación de codones preferidos para potenciar la expresión del polinucleótido en diversos organismos (véase, de manera general Nakamura et al., Nuc. Acid. Res. (2000) 28 (1): 292). Además, pueden

55 incorporarse mutaciones silentes para introducir o eliminar sitios de restricción, reducir la densidad de motivos de dinucleótido CpG (véase, por ejemplo, Kameda et al., Biochem. Biophys. Res. Co mMun. (2006) 349(4): 1269-1277)

o reducir la capacidad de las secuencias monocatenarias para formar estructuras de tallo-bucle: (véase, por ejemplo, Zuker M., Nucl. Acid Res. (2003); 31(13): 3406-3415). Además, puede optimizarse adicionalmente la expresión en mamíferos incluyendo una secuencia consenso Kozak [es decir, (a/g)cc(a/g)ccATGg] en el codón de inicio. Las secuencias consenso Kozak útiles para este fin se conocen en la técnica (Mantyh et al. PNAS 92: 2662-2666 (1995); Mantyh et al. Prot. Exp. & Purif. 6.124 (1995)).

Los polinucleótidos de la presente invención, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de

65 enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes y similares, de tal forma que su longitud general puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que pueda emplearse un

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disponibles nucleótidos que están marcados radiactivamente en el primer grupo fosfato o α, o en el tercer grupo fosfato o γ. Por ejemplo, se encuentran disponibles comercialmente tanto [α -32P] dATP como [γ -32P] dATP. Además, también se encuentran disponibles comercialmente diferentes actividades específicas para nucleótidos marcados radiactivamente y pueden diseñarse a medida para diferentes protocolos.

5 Otros ejemplos de moléculas detectables que pueden utilizarse para detectar un oligonucleótido incluyen fluoróforos. Pueden emplearse varios fluoróforos para el marcaje de nucleótidos incluyendo, por ejemplo, fluoresceína, tetrametilrodamina, rojo Texas y varios otros (por ejemplo, Haugland, Handbook of Fluorescent Probes -9ª Ed., 2002, Molec. Probes, Inc., Eugene OR; Haugland, The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies-10ª Ed., 2005, Invitrogen, Carlsbad, CA).

Como ejemplo, los oligonucleótidos pueden marcarse fluorescentemente durante la síntesis química, ya que la incorporación de aminas o tioles durante la síntesis de nucleótidos permite la adición de fluoróforos. Se encuentran disponibles comercialmente nucleótidos marcados fluorescentemente. Por ejemplo, hay disponibles uridina y

15 desoxiuridina trifosfatos que están conjugados a diez diferentes fluoróforos que abarcan el espectro. Los colorantes fluorescentes que pueden unirse directamente a los nucleótidos también pueden usarse como moléculas detectables. Por ejemplo, FAM, JOE, TAMRA y ROX son colorantes fluorescentes de amina reactiva que se han unido a nucleótidos y se usan en la secuenciación de ADN automatizada. Estos nucleótidos marcados fluorescentemente, por ejemplo, ROX-ddATP, ROX-ddCTP, ROX-ddGTP y ROX-ddUTP, se encuentran disponibles comercialmente.

También hay disponibles moléculas detectables no radiactivas y no fluorescentes. Como se ha indicado anteriormente, la biotina puede unirse directamente a los nucleótidos y detectarse mediante la unión específica y de alta afinidad a avidina o estreptavidina que se ha acoplado químicamente a una enzima que cataliza una reacción

25 colorimétrica (tal como fosfatasa, luciferasa o peroxidasa). De manera similar, pueden usarse nucleótidos marcados con digoxigenina para la detección no isotópica de ácidos nucleicos. Se encuentran disponibles comercialmente nucleótidos biotinilados y marcados con digoxigenina.

También pueden usarse partículas muy pequeñas, denominadas nanopartículas, para marcar sondas de oligonucleótido. Estas partículas tienen un tamaño en el intervalo de 1-1000 nm e incluyen diversas estructuras químicas, tales como partículas de oro y plata y puntos cuánticos. Cuando se irradian con una luz blanca incidente con un ángulo determinado, las nanopartículas de plata u oro en el intervalo de 40-120 nm dispersarán luz monocromática con una alta intensidad. La longitud de onda de la luz dispersada depende del tamaño de la partícula. De cuatro a cinco partículas diferentes muy próximas entre sí dispersarán cada una luz monocromática,

35 que cuando se superponga proporcionará un color único específico. Las partículas se fabrican por compañías tales como Genicon Sciences (Carlsbad, CA). Las partículas de plata u oro derivatizadas pueden unirse a una gran variedad de moléculas que incluyen proteínas, anticuerpos, moléculas pequeñas, ligandos de receptor y ácidos nucleicos. Por ejemplo, puede derivatizarse químicamente la superficie de la partícula para permitir la unión a un nucleótido.

Otros tipos de nanopartículas que pueden usarse para la detección de una molécula detectable incluyen puntos cuánticos. Los puntos cuánticos son cristales fluorescentes de 1-5 nm de diámetro que son excitables mediante luz dentro de un amplio intervalo de longitudes de onda. Tras su excitación mediante luz que tenga una longitud de onda adecuada, estos cristales emiten luz, tal como luz monocromática, con una longitud de onda que depende de su

45 composición química y tamaño. Los puntos cuánticos tales como CdSe, ZnSe, InP o InAs poseen propiedades ópticas únicas; estos puntos cuánticos y otros similares se encuentran disponibles de una serie de fuentes comerciales (por ejemplo, NN-Labs, Fayetteville, AR; Ocean Nanotech, Fayetteville, AR; Nanoco Technologies, Manchester, R.U.; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Pueden crearse decenas de clases de partículas según el número de clases de tamaño de los cristales de puntos cuánticos. Las clases de tamaño de los cristales se crean 1) mediante un control estricto de los parámetros de formación de los cristales para crear cada clase de tamaño deseado de la partícula o 2) mediante creación de lotes de cristales con parámetros de formación de cristales poco controlados, seguido de clasificación de acuerdo con el tamaño y/o las longitudes de onda de emisión deseados. Dos ejemplos de referencias en las que se incluyen puntos

55 cuánticos dentro de capas epitaxiales de silicio intrínsecas de dispositivos semiconductores emisores/detectores de luz son las Patentes de los Estados Unidos n.º 5.293.050 y 5.354.707 de Chapple Sokol, et al.

En determinadas realizaciones, los cebadores o sondas de oligonucleótidos pueden marcarse con uno o más colorantes emisores de luz o detectables de otro modo. La luz emitida por los colorantes puede ser luz visible o luz invisible, tal como luz ultravioleta o luz infrarroja. En realizaciones a modo de ejemplo, el colorante puede ser un colorante de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET); un colorante de xanteno, tal como fluoresceína y rodamina; un colorante que tiene n grupo amino en la posición alfa o beta (tal como un colorante de naftilamina, 1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato, sulfonato de 1-anilino-8-naftaleno y sulfonato de 2-p-touidinil-6naftaleno); un colorante que tiene 3-fenil-7-isocianatocoumarina; una acridina, tal como 9-isotiocianatoacridina y 65 naranja de acridina; un pireno, un benzoxadiazol y estilibeno; un colorante que tiene 3-(ε-carboxipentil)-3’-etil-5,5’dimetiloxacarbocianina (CYA); 6-carboxi fluoresceína (FAM); 5 y 6-carboxirrodamina-110 (R110); 6

carboxirrodamina-6G (R6G); N,N,N’,N’-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA); 6-carboxi-X-rodamina (ROX); 6carboxi-4’,5’-dicloro-2’,7’-dimetoxifluoresceína (JOE); ALEXA FLUOR™; Cy2; rojo Texas y rojo de rodamina; 6carboxi-2’,4,7,7’-tetraclorofluoresceína (TET); 6-carboxi-2’,4,4’,5’,7,7’-hexaclorofluoresceína (HEX); 5-carboxi2’,4’,5’,7’-tetraclorofluoresceína (ZOE); NAN; NED; Cy3; Cy3.5; Cy5; Cy5.5; Cy7; y Cy7.5; IR800CW, ICG, Alexa

5 Fluor 350; Alexa Fluor 488; Alexa Fluor 532; Alexa Fluor 546; Alexa Fluor 568; Alexa Fluor 594; Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 680 o Alexa Fluor 750.

Los polinucleótidos y oligonucleótidos de AARS de la presente invención pueden usarse en cualquiera de las composiciones y métodos terapéuticos, diagnósticos, de investigación o de descubrimiento de fármacos descritos en el presente documento.

V. ANTICUERPOS

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona además anticuerpos que muestran especificidad de

15 unión por un polipéptido de AARS o su compañero de unión celular nativo (es decir, compañero de unión de receptor celular, lípido, carbohidrato, proteína o ácido nucleico), o un complejo los mismos y métodos de uso de los mismos. El término anticuerpo incluye las diversas variaciones de los mismos, tales como FAB, anticuerpos humanos, anticuerpos humanos modificados, cadenas individuales, anticuerpos no humanos y otros derivados del plegamiento de la inmunoglobulina que subyacen en el sistema inmunitario como ligandos para antígenos, tal como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. Los anticuerpos pueden usarse en cualquiera de los métodos y composiciones terapéuticas, diagnósticas, de descubrimiento de fármacos o de expresión/purificación de proteínas proporcionados en el presente documento.

Determinados anticuerpos de la presente invención difieren respecto de algunos anticuerpos producidos con 25 anterioridad debido a que pueden distinguir entre los fragmentos de proteína AARS de las tablas 1-3 o las tablas 4-6

o las tablas 7-9 y sus correspondientes AARS de longitud completa, normalmente uniéndose con mayor afinidad a los fragmentos de proteína AARS que a las AARS de longitud completa correspondientes. En general, dichos anticuerpos pueden unirse a secuencias o estructuras únicas generadas o reveladas mediante variaciones de corte y empalme, proteólisis u otro procesamiento celular que genere un fragmento de proteína AARS de la invención (por ejemplo, procesamiento postraduccional, incluyendo, pero sin limitación, fosforilación y otras modificaciones que cambian la estructura de la proteína). En algunos aspectos, los anticuerpos pueden unirse a secuencias alrededor de una unión de corte y empalme única (por ejemplo, a una o más regiones de al menos 5 aminoácidos contiguos seleccionados entre las secuencias de unión de corte y empalme listadas en las tablas 2B, 5B u 8B o como alternativa, a cualquier secuencia de aminoácidos en C-terminal de este sitio de corte y empalme, por ejemplo, tal 35 como se lista en las tablas 2B, 5B u 8B. Por ejemplo, dichos anticuerpos pueden tener especificidad de unión por una o más caras no expuestas a disolventes que se encuentran expuestas en el fragmento de proteína AARS pero no en la AARS de longitud completa o secuencias que no se encuentran o que son de otro modo inaccesibles en las AARS de longitud completa. Los anticuerpos también pueden unirse a estructuras tridimensionales únicas que surgen como resultado de diferencias en el plegamiento entre el fragmento de proteína AARS y la AARS de longitud completa. Dichas diferencias en el plegamiento pueden estar localizadas (por ejemplo, en un dominio o una región específica) o globalizadas. Como ejemplo, el plegamiento de fragmentos de proteína AARS pueden generar epítopos continuos o discontinuos únicos que no se encuentran en la AARS correspondiente o parental. Los ejemplos también incluyen anticuerpos que se unen específicamente a los extremos N o C-terminales generados por variaciones de corte y empalme, proteólisis u otro procesamiento celular; dichos extremos pueden ser únicos en

45 comparación con la AARS de longitud completa o pueden no estar expuestos a la unión de anticuerpos en las versiones de longitud completa debido a que sus extremos están completa o parcialmente enterrados en la estructura general de la molécula parental de AARS de mayor tamaño.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en el presente documento no forman agregados, tienen una solubilidad deseada y/o tienen un perfil de inmunogenicidad que es adecuado para su uso en seres humanos, tal como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. También se incluyen anticuerpos que son adecuados para trabajos de producción, tal como para purificar los fragmentos de proteína AARS descritos en el presente documento. Preferentemente, pueden concentrarse los anticuerpos activos a al menos aproximadamente 10 mg/ml y opcionalmente formularse para usos bioterapéuticos.

55 En determinadas realizaciones, los anticuerpos son eficaces para modular una o más de las actividades no canónicas mediadas por un polipéptido de AARS de la invención. En determinadas realizaciones, por ejemplo, el anticuerpo es uno que se une a un polipéptido de AARS y/o su compañero de unión, inhibe su capacidad para interactuar entre sí y/o antagoniza la actividad no canónica del polipéptido de AARS. En determinadas realizaciones, por ejemplo, el anticuerpo se une al compañero de unión celular de un polipéptido de AARS e imita la actividad del polipéptido de AARS, tal como aumentando o agonizando la actividad no canónica mediada por el polipéptido de AARS. Por consiguiente, pueden usarse anticuerpos para diagnosticar, tratar o prevenir enfermedades, trastornos u otras afecciones que están mediadas por un polipéptido de AARS de la invención, tal como antagonizando o agonizando su actividad parcial o completamente.

65 Se dice que un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo "se une específicamente", "se une

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ensayos de liberación de cromo o europio para medir la apoptosis; véase, por ejemplo, von Zons et al., Clin Diagn Lab I mMunol.4:202-207, 1997), entre otros, que pueden evaluar la citotoxicidad de fragmentos de proteína AARS, ya sea para determinar curvas de respuesta a la dosis, prueba de lotes u otras propiedades relacionadas con la aprobación por diversas agencias regulatorias, tales como la Food and Drug Administration (FDA).

Dichos ensayos pueden usarse, por ejemplo, para desarrollar una curva de respuesta a la dosis para un fragmento de proteína AARS seleccionado u otro agente y/o para comparar las curvas de respuesta a la dosis de diferentes lotes de proteínas u otros agentes. Una curva de respuesta a la dosis es una gráfica X-Y que está relacionada con la magnitud de un agente inductor de estrés con la respuesta de un receptor; la respuesta puede ser una respuesta fisiológica o bioquímica, tal como una actividad biológica no canónica en una célula in vitro o en una célula o tejido in vivo, una cantidad terapéuticamente eficaz medida in vivo (por ejemplo, medida mediante la CE50), o muerte, ya se mida in vitro o in vivo (por ejemplo, muerte celular, muerte del organismo). La muerte se indica normalmente en forma de una DL50, una dosis obtenida estadísticamente que es letal para el 50 % de una población modelo, Aunque puede estar indicada por la CL01 (dosis letal para un 1 % de la población de animales de ensayo), CL100 (dosis letal para el 100 % de la población de animales de ensayo), o CLLO (dosis más baja que provoca letalidad). Puede caracterizarse prácticamente cualquier efecto o criterio de valoración deseado de este modo.

La dosis medida de una curva de respuesta a la dosis se representa normalmente en el eje X y la respuesta se representa en el eje Y. Más normalmente, se representa el logaritmo de la dosis en el eje X, generando con mayor frecuencia una curva sigmoidea con la porción con más pendiente en medio. El nivel de efecto no observable (NOEL) se refiere a la dosis experimental más baja para la que no se observa un efecto medible y la dosis umbral se refiere al primer punto en la gráfica que indica una respuesta por encima de cero. Por norma general, los fármacos más fuertes generan curvas de respuesta a la dosis más pronunciadas. Para muchos fármacos, se observan los efectos deseados a dosis ligeramente mayores que la dosis umbral, a menudo debido a que las dosis menores son relativamente ineficaces y las dosis mayores dan lugar a efectos secundarios no deseados. Para las curvas de respuesta a la dosis generadas in vivo, puede caracterizarse una curva por valores tales como µg/kg, mg/kg o g/kg de peso corporal, si se desea.

Para las comparaciones por lotes, puede ser útil calcular el coeficiente de variación (CV) entre diferentes curvas de respuesta a la dosis de diferentes lotes (por ejemplo, entre diferentes lotes de fragmentos de proteína AARS, anticuerpos u otros agentes), en parte debido a que el CV permite la comparación entre conjuntos de datos con diferentes unidades o diferentes medios. Por ejemplo, en determinadas realizaciones a modo de ejemplo, dos o tres

o más lotes diferentes de fragmentos de proteína AARS u otros agentes tienen un CV entre ellos de menos de aproximadamente un 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10%, 9 %, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3 %, 2%, o 1 % para una curva de respuesta a la dosis de 4, 5, 6, 7 u 8 puntos. En determinadas realizaciones, la curva de respuesta a la dosis se mide en un ensayo basado en células y su lectura se relaciona con un aumento o una reducción en una actividad no canónica seleccionada del fragmento de proteína AARS. En determinadas realizaciones, la curva de respuesta a la dosis se mide en un ensayo de liberación celular o un modelo animal (por ejemplo, modelo de ratón), y su lectura se relaciona con la muerte celular o la muerte del animal. Otras variaciones serán evidentes para las personas expertas en la materia.

VIII. SISTEMAS DE EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN

Las realizaciones de la presente invención incluyen métodos y composiciones relacionadas para expresar y purificar los fragmentos de proteína AARS u otros agentes a base de polipéptidos de la invención. Dichos polipéptidos de AARS recombinantes pueden prepararse convenientemente usando protocolos convencionales, tal como se describen, por ejemplo, en Sambrook, et al., (1989, anteriormente citado), en particular, las Secciones 16 y 17; Ausubel et al., (1994, anteriormente citado), en particular, los Capítulos 10 y 16; y Coligan et al., Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997), en particular, los Capítulos 1, 5 y 6. A modo de ejemplo general, pueden prepararse polipéptidos de AARS mediante un procedimiento que incluye una o más de las etapas de: (a) preparar una construcción que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido de AARS y que está unida operablemente a un elemento regulador; (b) introducir la construcción en una célula hospedadora; (c) cultivar la célula hospedadora para que exprese el polipéptido de AARS; y (d) aislar el polipéptido de AARS de la célula hospedadora.

En otras partes del presente documento se describen polinucleótidos de AARS. Para expresar un polipéptido deseado, puede insertarse una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido o un equivalente funcional en un vector de expresión adecuado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Pueden usarse métodos bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican un polipéptido de interés y elementos de control transcripcional y traduccional adecuados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989).

Se conocen y pueden utilizarse diversos sistemas de vector de expresión/hospedador para que contengan y

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componentes volátiles de la mezcla. También se incluyen técnicas de ultrafiltración, que normalmente emplean una

o más membranas permeables selectivas para concentrar una solución de proteína. La membrana permite que pasen a su través agua y moléculas pequeñas y retiene la proteína; la solución puede forzarse contra la membrana mediante una bomba mecánica, presión de gas o centrifugación, entre otras técnicas.

En determinadas realizaciones, los reactivos, fragmentos de proteína AARS o agentes relacionados (por ejemplo, anticuerpos) tienen una pureza de al menos aproximadamente el 90 %, medida de acuerdo con técnicas rutinarias en la técnica. En determinadas realizaciones, tales como composiciones diagnósticas o determinadas composiciones terapéuticas, las composiciones de AARS de la presente invención tienen una pureza de al menos aproximadamente el 95 %. En realizaciones específicas, tales como composiciones terapéuticas o farmacéuticas, las composiciones de AARS de la presente invención tienen una pureza de al menos aproximadamente el 97 % o el 98 % o el 99 %. En otras realizaciones, tales como cuando se usan como reactivos de referencia o de investigación, los fragmentos de proteína AARS pueden tener una menor pureza y pueden tener una pureza de al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, u 80 %. La pureza puede medirse en general o en relación con componentes seleccionados, tales como otras proteínas, por ejemplo, pureza basándose en una proteína.

Los fragmentos de proteína AARS purificados también pueden caracterizarse según sus características biológicas. Los ejemplos incluyen afinidad de unión o cinética de unión a un ligando seleccionado (por ejemplo, un compañero de unión celular del fragmento de proteína ARS, tal como un receptor de la superficie celular o un dominio extracelular del mismo), y la presencia o niveles de una o más actividades biológicas canónicas o no canónicas, tal como se describe en el presente documento. La afinidad de unión y la cinética de unión pueden medirse según diversas técnicas conocidas en la materia, tales como BIACORE® y tecnologías relacionadas que utilizan resonancia de plasmón superficial (SPR), un fenómeno óptico que permite la detección de agentes que interactúan no marcados en tiempo real. Pueden usarse biosensores basados en SPR para la determinación de la concentración de agente activo, la exploración y la caracterización en términos tanto de afinidad como cinética. La presencia o los niveles de una o más actividades canónicas o no canónicas pueden medirse de acuerdo con ensayos basados en células, incluyendo aquellos que utilizan un compañero de unión celular (por ejemplo, receptor de la superficie celular) de un fragmento de proteína AARS seleccionado, que está acoplado funcionalmente a un marcador de lectura o un indicador, tal como un indicador fluorescente o luminiscente de una actividad biológica no canónica, tal como se describen en el presente documento.

En determinadas realizaciones, tal como se ha indicado anteriormente, las composiciones de polipéptido de AARS se encuentran aproximadamente sustancialmente libres de endotoxina, incluyendo, por ejemplo, aproximadamente un 95 % libres de endotoxina, preferentemente aproximadamente un 99 % libre de endotoxina y más preferentemente, aproximadamente un 99,99 % libre de endotoxina. La presencia de endotoxinas puede detectarse de acuerdo con técnicas rutinarias en la materia, tal como se describen en el presente documento. En realizaciones específicas, las composiciones de AARS se preparan a partir de una célula eucariota, tal como una célula de mamífero o humana en medio sustancialmente libre de suero.

En determinadas realizaciones, las composiciones de polipéptido de AARS comprenden menos de aproximadamente un 10 % p/p de agregados de alto peso molecular o menos de aproximadamente un 5 % p/p de agregados de alto peso molecular o menos de aproximadamente un 2 % p/p de agregados de alto peso molecular o menos de aproximadamente un 1 % p/p de agregados de alto peso molecular.

También se incluyen ensayos analíticos y métodos basados en proteínas, que pueden usarse para evaluar, por ejemplo, la pureza de proteínas, el tamaño, la solubilidad y el grado de agregación, entre otras características. La pureza de proteínas puede evaluarse mediante una serie de formas. Por ejemplo, la pureza puede evaluarse basándose en la estructura primaria, la estructura de orden mayor, el tamaño, la carga, la hidrofobia y la glucosilación. Los ejemplos de métodos para evaluar la estructura primaria incluyen secuenciación N y C-terminal y mapeo peptídico (véase, por ejemplo, Allen et al., Biologicals. 24:255-275, 1996)). Los ejemplos de métodos para evaluar la estructura de mayor orden incluyen dicroísmo circular (véase, por ejemplo, Kelly et al., Biochim Biophys Acta. 1751:119-139, 2005), espectroscopía de fluorescencia (véase, por ejemplo, Meagher et al., J. Biol. Chem. 273:23283-89, 1998), FT-IR, cinética de intercambio de hidrogenodeuteruro de amida, calorimetría de barrido diferencial, espectroscopía RMN, inmunorreactividad con anticuerpos conformacionalmente sensibles. La estructura de orden mayor también puede evaluarse en función de diversos parámetros, tales como pH, temperatura o sales añadidas. Los ejemplos de métodos para evaluar las características de proteínas, tales como el tamaño, incluyen ultracentrifugación analítica y HPLC de exclusión por tamaño (SEC-HPLC), y los métodos a modo de ejemplo para medir la carga incluyen cromatografía de intercambio iónico e isoelectroenfoque. La hidrofobia puede evaluarse, por ejemplo, mediante HPLC en fase reversa y cromatografía HPLC de interacción hidrófoba. La glucosilación puede afectar a la farmacocinética (por ejemplo, eliminación), la conformación o la estabilidad, la unión a receptor y la función de proteínas y pueden expresarse, por ejemplo, mediante espectrometría de masas y espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN).

Como se ha indicado anteriormente, determinadas realizaciones incluyen el uso de SEC-HPLC para evaluar características de proteínas, tales como pureza, tamaño (por ejemplo, homogeneidad de tamaño) o grado de agregación y/o para purificar proteínas, entre otros usos. SEC, que también incluye cromatografía de filtración en gel

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diagnóstico se refiere al porcentaje de células, tejidos o sujetos enfermos que dan positivo en la prueba (porcentaje de "auténticos positivos"). Las células, tejidos o sujetos enfermos no detectados por el ensayo se citan normalmente como "falsos negativos". Las células, tejidos o sujetos que no están enfermos y que dan negativo en el ensayo pueden denominarse "auténticos negativos". En determinadas realizaciones, la "especificidad" de un ensayo diagnóstico puede definirse como uno (1) menos la tasa de falsos positivos, donde la tasa de "falsos positivos" se define como la proporción de aquellas muestras o sujetos son la enfermedad y que dan positivo. Aunque un método diagnóstico particular puede no proporcionar un diagnóstico definitivo de una afección, es suficiente si el método proporciona una indicación positiva que ayuda en el diagnóstico.

En determinados casos, puede diagnosticarse la presencia o el riesgo de desarrollar una afección patológica comparando la presencia o los niveles de uno o más polinucleótidos de AARS seleccionados o secuencias de polipéptido de referencia o porciones de las mismas que se correlacionan con la afección, ya sea por niveles aumentados o reducidos, en comparación con un control adecuado. Un "control adecuado" o "control apropiado" incluye un valor, nivel, rasgo, característica o propiedad determinada en una célula u otra muestra biológica de un tejido u organismo, por ejemplo, una célula, tejido u organismo de control o normal que muestra, por ejemplo, rasgos normales, tales como la ausencia de la afección. En determinadas realizaciones, un "control adecuado" o "control apropiado" es un valor, nivel, rasgo, característica o propiedad predefinida. Otros controles adecuados serán evidentes para los expertos en la materia. Los ejemplos de enfermedades y afecciones se describen en otras partes del presente documento.

Las realizaciones de la presente invención incluyen técnicas de detección basadas en polinucleótidos o ácidos nucleicos de AARS, que ofrecen ciertas ventajas debido a la sensibilidad de la detección. Por tanto, determinadas realizaciones se refieren al uso o la detección de polinucleótidos de AARS como parte de un método o ensayo diagnóstico. Puede medirse la presencia y/o los niveles de polinucleótidos de AARS mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo ensayos de hibridación, tales como transferencia de Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa o cualitativa, PCR de retrotranscriptasa (RT-PCR) cuantitativa o cualitativa, micromatriz, transferencias de puntos o ranuras o hibridación in situ, tal como hibridación in situ de fluorescencia (FISH), entre otros. Algunos de estos métodos se describen con más detalle más adelante.

Los polinucleótidos de AARS, tales como ADN y ARN, pueden recogerse y/o generarse a partir de sangre, fluidos biológicos, tejidos u órganos, líneas celulares u otra muestra relevante usando técnicas conocidas en la materia, tales como aquellas descritas en Kingston. (2002 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. y John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (véase, por ejemplo, como se describe por Nelson et al. Proc Natl Acad Sci U S A,

99: 11890-11895, 2002) y en otras partes. Además, diversos kits comerciales para construir ARN es útil para producir el ARN para su uso en la presente invención. El ARN puede construirse a partir de órganos/tejidos/células obtenidas de sujetos sanos normales; sin embargo, la presente invención también contempla la construcción de ARN de sujetos enfermos. Algunas realizaciones contemplan el uso de cualquier tipo de órgano de cualquier tipo de sujeto o animal. Para las muestras de ensayo, el ARN puede obtenerse de un individuo (por ejemplo, cualquier animal, incluyendo mamíferos) con o sin enfermedad visible y de muestras de tejidos, fluidos biológicos (por ejemplo, sangre entera) o similares.

En determinadas realizaciones, puede ser útil la amplificación o construcción de secuencias de ADNc para aumentar las capacidades de detección. La presente divulgación, así como la técnica, proporciona el nivel de detalle requerido para llevar a cabo dichas tareas. En una realización ilustrativa, se usa sangre completa como fuente de ARN y por consiguiente, se usan opcionalmente reactivos estabilizantes del ARN, tales como tubos PAX, tal como se describe, por ejemplo, en Thach et al., J. I mMunol. Methods. Dec 283(1-2):269-279, 2003 y Chai et al., J. Clin. Lab Anal. 19(5):182-188, 2005 (ambos incorporados por referencia). Pueden generarse bibliotecas de ADN complementario (ADNc) usando técnicas conocidas en la materia, tales como aquellas descritas en Ausubel et al. (2001 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. y John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY) y en otras partes. Además, diversos kits comerciales para construir bibliotecas de ADNc son útiles para producir las bibliotecas de ADNc de la presente invención. Las bibliotecas pueden construirse a partir de órganos/tejidos/células obtenidas de sujetos normales sanos.

Determinadas realizaciones pueden emplear métodos de hibridación para detectar secuencias de polinucleótido de AARS. Los métodos para llevar a cabo ensayos de hibridación de polinucleótidos se han desarrollado bien en la técnica. Los procedimientos y las condiciones de los ensayos de hibridación variarán dependiendo de la aplicación y se seleccionan de acuerdo con los métodos de unión generales conocidos, incluyendo aquellos citado en: Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Ed. Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Berger and Ki mMel Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1987); Young y Davis, PNAS. 80: 1194 (1983). Los métodos y aparatos para llevar a cabo reacciones de hibridación repetidas y controladas se han descrito en las Patentes de los Estados Unidos n.º 5.871.928, 5.874.219, 6.045.996 y 6.386.749, 6.391.623, incorporándose cada una de ellas al presente documento por referencia.

Determinadas realizaciones pueden emplear métodos de amplificación de ácidos nucleicos para detectar secuencias de polinucleótido de AARS. El término "amplificación" o la expresión "amplificación de ácidos nucleicos" se refieren a

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lógicas del método de la invención. Los medios legibles por ordenador adecuados incluyen discos flexibles, CD-ROM/DVD/DVD-ROM, discos duros, memorias flash, ROM/RAM, cintas magnéticas etc. Las instrucciones ejecutables por el ordenador pueden estar escritas en un lenguaje informático adecuado o una combinación de varios lenguajes. Los métodos básicos de biología computacional se describen en, por ejemplo, Setubal y Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Ámsterdam, 1998); Rashidi y Buchler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, Londres, 2000) y Ouelette y Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2ª ed., 2001). Véase la Patente de los Estados Unidos n.º 6.420.108.

Determinadas realizaciones pueden emplear varios productos de programas informáticos para diversos fines, tales como el diseño de sondas, la gestión de datos, el análisis y el manejo de instrumentos. Véase, las Patentes de los Estados Unidos n.º 5.593.839, 5.795.716, 5.733.729, 5.974.164, 6.066.454, 6.090.555, 6.185.561, 6.188.783, 6.223.127, 6.229.911 y 6.308.170.

El ensayo de muestreo de genoma completo (WGSA) se describe, por ejemplo, en Kennedy et al., Nat. Biotech. 21, 1233-1237 (2003), Matsuzaki et al., Gen. Res. 14: 414-425, (2004), y Matsuzaki, et al., Nature Methods 1:109-111 (2004). Los algoritmos para su uso con ensayos de mapeo se describen, por ejemplo, en Liu et al., Bioinformatics.

19: 2397-2403 (2003) y Di et al. Bioinformatics. 21:1958 (2005). Se divulgan métodos adicionales relacionados con WGSA y matrices útiles para WGSA y aplicaciones de WGSA, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos n.º 60/676.058, presentada el 29 de abril de 2005, 60/616.273 presentada el 5 de octubre de 2004, 10/912.445, 11/044.831, 10/442.021, 10/650.332 y 10/463.991. Los estudios de asociación de todo el genoma usando ensayos de mapeo se describen en, por ejemplo, Hu et al., Cancer Res.; 65(7):2542-6 (2005), Mitra et al., Cancer Res., 64(21):8116-25 (2004), Butcher et al., Hum Mol Genet., 14(10):1315-25 (2005), y Klein et al., Science. 308(5720):385-9 (2005).

Además, determinadas realizaciones pueden incluir métodos para proporcionar información genética por las redes, tales como Internet, tal como se muestra, por ejemplo, en las Solicitudes de los Estados Unidos n.º 10/197.621, 10/063.559 (Publicación de los Estados Unidos número 2002/0183936), 10/065.856, 10/065.868, 10/328.818, 10/328.872, 10/423.403 y 60/482.389.

X. AGENTES ANTISENTIDO Y DE IARN

Las realizaciones de la presente divulgación también incluyen oligonucleótidos antisentido y agentes de iARN que se dirigen a las secuencias de polinucleótido de AARS y a métodos de uso de los mismos para reducir la expresión de un transcrito y/o fragmento de proteína AARS. Determinadas realizaciones se refieren al direccionamiento de una o más uniones de corte y empalme (normalmente únicas) que generan una variante de corte y empalme, o un fragmento de proteína AARS de la presente invención. También se incluyen métodos de antisentido o inhibición de iARN que se dirigen a determinadas formas de corte y empalme, ya sea para alentar o desalentar el corte y empalme de un fragmento de proteína seleccionado. En determinadas realizaciones preferidas, las uniones de corte y empalme que generan los fragmentos de proteína AARS se sobreexpresan respecto de tejidos particulares y son únicos para esa variante de corte y empalme. En estas realizaciones y otras relacionadas, dichas variantes de corte y empalme no son la única fuente de actividad de AARS citosólica en el tipo celular diana. Por ejemplo, determinadas variantes de corte y empalme que se van a usar como diana pueden representar aproximadamente del 10 % al 50 % del número de copias total de las variantes de corte y empalme de ARN de AARS en una célula o tejido dado y preferentemente, aproximadamente el 1-10 % del número total de copias de las variantes de corte y empalme de ARN de AARS en una célula o tejido dado. También pueden usarse como diana las variantes de corte y empalme que representan aproximadamente < 1 % del número total de copias de las variantes de corte y empalme de ARN de AARS en una célula o tejido dado.

En determinadas realizaciones, la diana de iARN antisentido no se dirige a la proteína de longitud completa, debido a que dichas proteínas de longitud completa son responsables de una etapa clave en la síntesis de proteínas y de este modo se evita la letalidad que normalmente resulta de las supresiones génicas de AARS de tipo silvestre. Por lo tanto, algunos de los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para evitar efectos no deseados, tales como toxicidades en tratamientos tanto crónicos como agudos y para modular selectivamente las actividades no canónicas del fragmento de proteína AARS. Sin embargo, algunas realizaciones pueden dirigirse genéricamente a secuencias de AARS, incluyendo secuencias de AARS de longitud completa, tal como para eliminar o trastornar sustancialmente la fisiología celular de una célula o tejido diana.

En determinadas realizaciones, la variante de corte y empalme de AARS que se va a usar como diana posee una actividad biológica no canónica. En algunas realizaciones, la variante de corte y empalme de AARS tiene una actividad canónica de AARS reducida o indetectable y el método relacionado con antisentido o iARN modula más específicamente su actividad no canónica. En determinadas realizaciones, los agentes relacionados con antisentido

o iARN pueden combinarse con una estrategia dirigida o de suministro local para aminorar los efectos no deseados sistémicos a células o tejidos no diana. Entre otras descritas en el presente documento, las células o tejidos a modo de ejemplo que podrían usarse como diana de este modo incluyen células cancerosas y células para tejidos que los

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ARN diana, valores de Tm por encima de aproximadamente 45 °C en oligonucleótidos relativamente cortos ( por ejemplo, 10-15 bases), la capacidad del oligonucleótido de ser transportado activa o pasivamente en células de mamífero y la capacidad del heterodúplex de oligonucleótidos antisentido:ARN para resistir la degradación por RNasa y RNasaH, respectivamente.

En determinadas realizaciones, puede modificarse un oligonucleótido sustancialmente no cargado para que incluya enlaces cargados, por ejemplo, hasta aproximadamente 1 por cada 2-5 enlaces no cargados, tal como aproximadamente 4-5 por cada 10 enlaces no cargados. En determinadas realizaciones, puede observarse una mejora óptima en la actividad antisentido cuando es catiónico aproximadamente un 25 % de los enlaces del armazón. En determinadas realizaciones, puede observarse potenciación con un número pequeño, por ejemplo, un 10-20 % de enlaces catiónicos o donde el número de enlaces catiónicos está en el intervalo del 50-80 %, tal como aproximadamente el 60 %. En determinadas realizaciones, las cargas del armazón catiónico pueden potenciarse adicionalmente distribuyendo el volumen de las cargas próximas de los enlaces de armazón de la "región central" del oligonucleótido antisentido, por ejemplo, en un oligonucleótido 20-meto con 8 enlaces de armazón catiónicos, que tienen al menos un 70 % de estos enlaces cargados en los 10 enlaces más próximos al centro.

Los oligonucleótidos que se dirigen a una o más porciones de una secuencia de polinucleótido de AARS de referencia o su complemento pueden usarse en cualquiera de los métodos terapéuticos, diagnósticos o de exploración de fármacos descritos en el presente documento y evidentes para las personas expertas en la materia.

B. Agentes de interferencia de ARN

Determinadas realizaciones se refieren a agentes de interferencia de ARN (iARN) que se dirigen a uno o más transcritos de ARNm de un polinucleótido de referencia de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS), incluyendo fragmentos y variantes de corte y empalme de los mismos. También se incluyen métodos de uso de los mismos para modular los niveles de un transcrito de AARS seleccionado, tal como una variante de corte y empalme de AARS o un fragmento proteolítico endógeno.

El término "bicatenario" significa dos hebras de ácido nucleico separadas que comprenden una región en la que al menos una parte de las hebras es suficientemente complementaria para formar enlaces de hidrógeno y forman una estructura de dúplex. El término "dúplex" o la expresión "estructura de dúplex" se refieren a la región de una molécula bicatenaria en donde las dos hebras separadas son sustancialmente complementarias y por lo tanto hibridan entre sí. "ARNbc" se refiere a una molécula de ácido ribonucleico que tiene una estructura de dúplex que comprende dos hebras de ácido nucleico complementarias y antiparalelas (es decir, las hebras sentido y antisentido). No todos los nucleótidos de un ARNbc deben mostrar pares de bases de Watson-Crick; las dos hebras de ARN pueden ser sustancialmente complementarias. Las hebras de ARN pueden tener el mismo número u otro diferente de nucleótidos.

En determinadas realizaciones, un ARNbc es o incluye una región que es al menos parcialmente complementaria al ARN diana. En determinadas realizaciones, el ARNbc es completamente complementario al ARN diana. No es necesario que haya una complementariedad perfecta entre el ARNbc y la diana, pero la correspondencia debe ser suficiente para permitir el ARNbc o un producto de escisión del mismo, para dirigir el silenciamiento específico de secuencia, tal como mediante escisión de iARN del ARN diana. La complementariedad o el grado de homología con la hebra diana, es normalmente más crítica en la hebra antisentido. Aunque normalmente se desea una complementariedad perfecta en la hebra antisentido, algunas realizaciones pueden incluir uno o más pero preferentemente 6, 5, 4, 3, 2 o menos desemparejamientos respecto del ARN diana. Los desemparejamientos se toleran mejor en las regiones terminales y en caso de estar presentes, se encuentran en una región o regiones terminales, por ejemplo, a 6, 5, 4 o 3 nucleótido del extremo 5' y/o 3'. La hebra complementaria solo necesita ser sustancialmente complementaria a la hebra antisentido para mantener el carácter bicatenario general de la molécula.

Tal como se usa en el presente documento, "ARNbc modificado" se refiere a una molécula de ARNbc que comprende al menos una alteración que la hace más resistente a las nucleasas (por ejemplo, proteína cinasa) que una molécula de ARNbc idéntica que antagoniza al mismo ARN diana. Los ARNbc bicatenarios pueden incluir un saliente de nucleótidos monocatenarios y/o al menos un nucleótido sustituido.

Tal como se usa en el presente documento, un "saliente de nucleótidos" se refiere al nucleótido o a los nucleótidos no emparejados que sobresalen de la estructura de dúplex cuando un extremo 3' de una hebra de ARN se prolonga más allá del extremo 5' de la otra hebra complementaria o viceversa. "Romo" o "extremo romo" significa que no hay nucleótidos no emparejados en ese extremo del ARNbc, es decir, ningún saliente de nucleótidos. Un ARNbc de "extremos romos" es un ARNbc que es bicatenario a lo largo de toda su secuencia, es decir, ningún saliente de nucleótidos en cualquiera de los dos extremos de la molécula.

La expresión "par de bases terminales", tal como se usa en el presente documento, se refiere al último par de bases de nucleótidos en un extremo de la región dúplex de una molécula bicatenaria. Por ejemplo, en caso de que un ARNbc u otra molécula tenga extremos romos (es decir, no tiene salientes de nucleótidos), el último par de bases de nucleótidos en ambos extremos de la molécula son pares de bases terminales. En los casos donde un ARNbc u otra

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cabo, por ejemplo, mediante técnicas de hibridación o PCR convencionales, tal como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. Las técnicas para la generación de mezclas de oligonucleótidos y su exploración se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y., 1989; e Innis et al., eds. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, Inc., Nueva York, 1990.

Además, pueden emplearse métodos en la identificación simultánea de genes que codifican el compañero de unión u otro polipéptido. Estos métodos incluyen, por ejemplo, sondado de bibliotecas de expresión, de un modo similar a la técnica bien conocida de sondado con anticuerpo de bibliotecas de lambda-gt11, usando proteína AARS marcada u otro polipéptido, péptido o proteína de fusión, por ejemplo, una variante de polipéptido AARS o un dominio de AARS fusionado a un marcador (por ejemplo, una enzima, flúor, proteína luminiscente o colorante), o un dominio Fc de Ig.

Un método que detecta interacciones de proteína in vivo, el sistema de dos híbridos, se describe en detalle con fines ilustrativos y no de manera limitante. Se ha descrito un ejemplo de este sistema (Chien et al., PNAS USA 88:9578 9582, 1991) y se encuentra disponible comercialmente de Clontech (Palo Alto, Calif.).

En resumen, utilizando dicho sistema, pueden construirse plásmidos que codifican dos proteínas híbridas: un plásmido consiste en nucleótidos que codifican el dominio de unión a ADN de una proteína activadora de la transcripción fusionado a una secuencia de nucleótido de referencia de AARS (o, en determinadas realizaciones, su compañero de unión), o una variante del mismo y el otro plásmido consiste en nucleótidos que codifican el dominio de activación de la proteína activadora de la transcripción fusionado a un ADNc (o colección de ADNc) que codifican una proteína desconocida que se ha recombinado en el plásmido como parte de una biblioteca de ADNc. El plásmido de fusión de dominio de unión a ADN y la biblioteca de ADNc activadora pueden transformarse en una cepa de la levadura Saccharomyces cerevisiae que contiene un gen indicador (por ejemplo, HBS o lacZ) cuya región reguladora contiene el sito de unión al activador de transcripción. Cualquiera de las dos proteínas híbridas sola no podría actuar la transcripción del gen indicador: el híbrido de dominio de unión a ADN no puede debido a que no proporciona función de activación y el híbrido de dominio de activación no puede debido a que no puede localizarse en los sitios de unión del activador. La interacción de las dos proteínas híbridas reconstituye la proteína activadora funcional y da como resultado la expresión del gen indicador, que se detecta mediante un ensayo para el producto génico indicador.

Puede emplearse el sistema de dos híbridos u otra metodología similar para explorar bibliotecas de dominio de activación respecto de proteínas que interactúan con el producto génico "señuelo". A modo de ejemplo y no de limitación, puede usarse un polipéptido de referencia de AARS o una variante como producto génico señuelo. También puede usarse un compañero de unión de AARS como producto génico "señuelo". Las secuencias genómicas totales o de ADNc se fusionan al ADN que codifica un dominio de activación. Se cotransforman esta biblioteca y un plásmido que codifica un híbrido de un producto génico de AARS señuelo al dominio de unión a ADN en una cepa indicadora de levadura y se exploran los transformantes resultantes respecto de aquellos que expresan el gen indicador.

Puede producirse una biblioteca de ADNc de la línea celular de la que se van a detectar proteínas que interactúan con productos génicos de AARS señuelo usando métodos practicados de manera rutinaria en la técnica. Por ejemplo, pueden insertarse los fragmentos de ADNc en un vector de tal forma que se fusionan traduccionalmente al dominio de activación transcripcional de GAL4. Esta biblioteca puede cotransformarse junto con el plásmido de fusión de gen señuelo-GAL4 en una cepa de levadura, que contiene un gen lacZ dirigido por un promotor que contiene la secuencia de activación de GAL4. Una proteína codificada por el ADNc, fusionada al dominio de activación transcripcional de GAL4, que interactúa con el producto génico señuelo reconstituirá una proteína GAL4 activa y de este modo dirigirá la expresión del gen HIS3. Las colonias, que expresan HIS3, pueden detectarse por su crecimiento sobre placas de Petri que contienen medio de agar semisólido que carece de histidina. Después, puede purificarse el ADNc a partir de estas cepas y usarse para producir y aislar la proteína que interactúa con el gen de AARS señuelo usando técnicas practicadas de manera rutinaria en la técnica.

También se incluyen sistema de tres híbridos, que permiten la detección de interacciones de ARN-proteína en levadura. Véase, por ejemplo, Hook et al., RNA. 11:227-233, 2005. Por consiguiente, pueden usarse estos métodos y otros relacionados para identificar un compañero de unión celular de un polipéptido de AARS y para identificar otras proteínas o ácidos nucleicos que interactúan con el polipéptido de AARS, el compañero de unión celular o ambos.

Determinadas realizaciones se refieren al uso de estrategias de exploración de interactoma. Los ejemplos particulares incluyen exploración basada en dominios de proteínas (véase, por ejemplo, Boxem et al., Cell. 134:534545,2008; y Yu et al., Science. 322:10-110, 2008).

Como se ha indicado anteriormente, una vez aislados, los compañeros de unión pueden identificarse y pueden, a su vez, usarse conjuntamente con técnicas estándar para identificar proteínas u otros compuestos con los que interactúan. Determinadas realizaciones se refieren por lo tanto a métodos de exploración para un compuesto que se

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descritas en el presente documento y conocidas en la técnica.

Las composiciones de la invención también pueden ser útiles como inmunomoduladores para tratar indicaciones anti

o pro-inflamatorias mediante la modulación de células que median, ya sea directa o indirectamente, enfermedades, afecciones y trastornos autoinmunitarios y/o inflamatorios. Puede controlarse la utilidad de las composiciones de la invención como inmunomoduladores o moduladores de la inflamación usando cualquiera de una serie de técnicas conocidas y disponibles en la técnica que incluyen, por ejemplo, ensayos de migración (por ejemplo, usando leucocitos o linfocitos) o ensayos de viabilidad celular (por ejemplo, usando células B, células T, monocitos o células NK).

La "inflamación" se refiere en general a la respuesta biológica de los tejidos a estímulos dañinos, tales como patógenos, células dañadas (por ejemplo, heridas), e irritantes. La expresión "respuesta inflamatoria" se refiere a los mecanismos específicos mediante los cuales se consigue y regula la inflamación, incluyendo, solo a modo ilustrativo, activación o migración de células inmunitarias, producción de citocinas, vasodilatación, incluyendo liberación de cinina, fibrinólisis y coagulación, entre otras descritas entre otras descritas en el presente documento y conocidas en la técnica.

Los signos clínicos de la inflamación crónica dependen de la duración de la enfermedad, las lesiones inflamatorias, la causa y el área anatómica afectada. (Véase, por ejemplo, Kumar et al., Robbins Basic Pathology-8ª Ed., 2009 Elsevier, Londres; Miller, LM, Pathology Lecture Notes, Atlantic Veterinary College, Charlottetown, PEI, Canadá). La inflamación crónica se asocia con diversas patologías o enfermedades, incluyendo, por ejemplo, alergias, enfermedad de Alzheimer, anemia, estenosis de la válvula aórtica, artritis, tal como artritis reumatoide y artrosis, cáncer, insuficiencia cardíaca congestiva, fibromialgia, fibrosis, ataque cardíaco, insuficiencia renal, lupus, pancreatitis, ictus, complicaciones quirúrgicas, enfermedad inflamatoria pulmonar, enfermedad inflamatoria del intestino, ateroesclerosis, trastornos neurológicos, diabetes, trastornos metabólicos, obesidad y psoriasis, entre otras descritas entre otras descritas en el presente documento y conocidas en la técnica. Por tanto, las composiciones de AARS pueden usarse para tratar o controlar la inflamación crónica, modular cualquiera de una o más de las respuestas inflamatorias crónicas o tratar una cualquiera o más enfermedades o afecciones asociadas con la inflamación crónica.

Los criterios para evaluar los signos y síntomas de las afecciones inflamatorias u otras, incluyendo con el fin de efectuar un diagnóstico diferencial y también para controlar tratamientos, tal como determinar si se ha administrado una dosis terapéuticamente eficaz durante el transcurso del tratamiento, por ejemplo, determinando la mejora de acuerdo con criterios cínicos aceptados, serán evidentes para los expertos en la materia y se ejemplifican por las enseñanzas de, por ejemplo, Berkow et al., eds., The Merck Manual, 16ª edición, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Goodman et al., eds., Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10ª edición, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y., (2001); Avery’s Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3ª edición, ADIS Press, Ltd., Williams and Wilkins, Baltimore, MD. (1987); Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, (1985); Osolci al., eds., Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990); Katzung, Basic and Clinical Pharmacology, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992).

En otras realizaciones, las composiciones de AARS de la invención pueden usarse para modular la proliferación y/o la supervivencia celular y, por consiguiente, para tratar o prevenir enfermedades, trastornos o afecciones caracterizadas por anomalías en la proliferación y/o supervivencia celular. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, las composiciones de AARS pueden usarse para modular la apoptosis y/o para tratar enfermedades o afecciones asociadas con la apoptosis anormal. La apoptosis puede controlarse mediante cualquiera de una serie de técnicas disponibles conocidas y disponibles en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ensayos que miden la fragmentación del ADN, alteraciones en la asimetría de la membrana, activación de caspasas apoptóticas y/o liberación de citocromo C y AIF.

El progreso de estas y otras terapias (por ejemplo, terapias ex vivo) puede controlarse fácilmente por métodos y ensayos convencionales y basándose en criterios conocidos por el médico u otras personas expertas en la materia.

XIII. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS, ADMINISTRACIÓN Y KITS

Las realizaciones de la presente invención incluyen polinucleótidos de AARS, polipéptidos de AARS, células hospedadoras que expresan polipéptidos de AARS, agentes de unión, agentes moduladores u otros compuestos descritos en el presente documento, formulados en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para su administración a una célula o a un animal, ya sean solas o en combinación con otras una o más modalidades de terapia. También se entenderá que, si se desea, pueden administrarse las composiciones de la invención en combinación también con otros agentes, tales como, por ejemplo, otras proteínas o polipéptidos o diversos agentes farmacéuticamente activos. No hay prácticamente ningún límite en cuanto a otros componentes que puedan incluirse también en las composiciones, a condición de que los agentes adicionales no afecten de manera adversa a los efectos moduladores u otros que se desee conseguir.

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En realizaciones particulares, la dosis eficaz logra los niveles en el plasma sanguíneo o la concentración media constante de una composición o agente descrito en el presente documento. Estas pueden determinarse fácilmente usando procedimientos rutinarios.

Las realizaciones de la presente invención, en otros aspectos, proporcionan kits que comprenden uno o más recipientes rellenos con uno o más de los polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, complejos de múltiples unidades, las composiciones de los mismos, etc., de la invención, tal como se describen en el presente documento. Los kits pueden incluir instrucciones escritas acerca de cómo usar dichas composiciones (por ejemplo, para modular la señalización celular, angiogénesis, cáncer, afecciones inflamatorias, diagnósticos, etc.).

Los kits del presente documento también pueden incluir uno o más agentes terapéuticos adicionales u otros componentes adecuados o deseados para la indicación que se esté tratando o para la aplicación diagnóstica deseada. Un agente terapéutico adicional puede estar contenido en un segundo recipiente, si se desea. Los ejemplos de agentes terapéuticos adicionales incluyen, pero sin limitación, agentes antineoplásicos, agentes antiinflamatorios, agentes antibacterianos, agentes antivíricos, agentes angiogénicos, etc.

Los kits del presente documento también pueden incluir una o más jeringuillas u otros componentes necesarios o deseados para facilitar un modo de suministro previsto (por ejemplo, stents, depósitos implantables, etc.).

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de comprensión, será fácilmente evidente para un experto habitual en la materia a la luz de las enseñanzas de la presente invención que pueden efectuarse determinados cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Los siguientes ejemplos se proporcionan solo a modo ilustrativo y de ningún modo limitativo. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente una serie de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse para proporcionar resultados esencialmente similares.

XIV. EJEMPLOS

MÉTODOS GENERALES. A menos que se indique de otro modo en los ejemplos a continuación, se usaron los siguientes métodos generales para la optimización génica, la expresión de proteínas a pequeña y gran escala, la purificación de proteínas, la elaboración de perfiles transcripcionales y la exploración para producir y caracterizar los polipéptidos de AARS descritos en los ejemplos a continuación.

SÍNTESIS GÉNICA Y CLONACIÓN EN VECTORES DE EXPRESIÓN

Se optimizaron por codones y se clonaron en vectores bacterianos las secuencias de polinucleótidos que codifican versiones marcadas epitópicamente de los polipéptidos de AARS usando los métodos listados a continuación.

En el método (1), el ADN optimizado por codones de E. coli (Welch et al., PLoS ONE 4(9): e7007 doi:10.1371/journal.pone.0007002) que codifica cada uno de los polipéptidos de AARS se sintetizó por DNA 2.0 (Menlo Park, CA), y se sintetizaron dos versiones de cada polipéptido de AARS, conteniendo un marcador epitópico combinado N-terminal o C-terminal que comprende tanto un marcador de seis histidinas como un marcador epitópico V5.

El ADN que codifica los polipéptidos de AARS marcados N-terminalmente se sintetiza con una extensión 5' que codifica en orientación de 5' a 3', un sitio de unión a ribosomas (rbs (subrayado más adelante)), un sitio de restricción de Ndel, un marcador de seis histidinas y un marcador epitópico V5, (AGGAGGTAAAACATATGCATCATCATCATCATCACGGTAAGCCTATCCCTAA CCCTTTGCTCGGTCTCGATTCTACG) (SEQ ID NO 1), que está fusionado en fase a la fase abierta de lectura predicha del polipéptido de AARS. En los casos donde el polipéptidos de AARS comprende un resto de metionina (ATG) de iniciación nativo predicho o el primer resto de aminoácido del polipéptido de AARS predicho es Met, se eliminó. Al final de la fase abierta de lectura del polipéptido de AARS predicho, se añadieron dos codones de parada en un sitio de Xhol (TAATGACTCGAG) (SEQ ID NO:2).

EL ADN que codificaba los polipéptidos de AARS marcados en C-terminal se sintetizó con una extensión 5' que codificaba un rbs (subrayado más adelante) y un sitio de restricción de Ndel que o bien recapitula el codón de inicio nativo predicho para el polipéptido de AARS o inserta un ATG en fase con la fase abierta de lectura del polipéptido de AARS predicho, (AGGAGATAAAACATATG) (SEQID NO3). En diferentes realizaciones, el sitio de unión a ribosomas puede comprender las secuencias "AGGAGGTAAAACAT" (SEQ ID NO 4), "AGGAGATAAAACAT" (SEQ ID NO 5), o GAAGGAGATATACAT (SEQ ID NO 6). En el extremo 3' de la fase abierta de lectura del polipéptido de AARS predicho, se sintetizó una extensión 3' que codificaba en orden de 5' a 3', un marcador epitópico V5, marcador de seis histidinas, dos codones de parada y un sitio de Xhol, (GGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCACCACCATCA TCACCATTAATGACTCGAG) (SEQ ID NO 7), que está fusionado en fase a la fase abierta de lectura predicha del polipéptido de AARS. En caso de que el polipéptido de AARS incluyese un codón de parada nativo predicho, se eliminó.

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LAL QCL-1000 (Lonza, n.º de cat. 50-648U) según las instrucciones del fabricante.

Dispersión de luz dinámica: Se calentaron un instrumento DynaPro 99 de Wyatt Technology y el controlador de la temperatura (20 °C) durante 15 minutos antes del ex perimento seguido de la conexión del programa informático Dynamics al instrumento. El tiempo de adquisición se ajustó a 10 segundos para múltiples adquisiciones y se ajustó la potencia del láser al 100 %. Se lavó exhaustivamente la cubeta de cuarzo con agua desionizada y metanol antes de la adición de la muestra de proteína (15µl a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml en PBS). Se retiraron las burbujas de aire golpeando suavemente la cubeta antes de insertarla en el soporte con el lado congelado hacia la izquierda. En caso de que la intensidad fuese demasiado elevada (se muestra un mensaje de advertencia en la pantalla), se diluye adicionalmente la muestra con PBS hasta que la intensidad se reduce hasta un intervalo normal. Los datos recogidos incluyen el radio hidrodinámico, polidispersidad, peso molecular medio predicho, porcentaje de intensidad y porcentaje de masa.

Cromatografía de exclusión por tamaños: La muestra de proteína se diluyó hasta una concentración de aproximadamente 5-10 mg/ml en PBS antes de cargarla en un asa de muestra de 100 µl en el dispositivo de FPLC AKTA de General Electric. Para la separación, se usó la columna de exclusión por tamaños Superdex 200 10/300 GL (General Electric, n.º de cat. 17-5175-01). En primer lugar, la columna se equilibró con 1,5 volúmenes de columna (VC) de tampón PBS 1X, seguido de la inyección de la muestra. La columna se corrió con 1 VC de tampón PBS 1x (flujo isocrático) controlando la absorbancia a 280 nm. Se integró el área máxima y se calculó el porcentaje con el programa informático Unicorn. Se usó le volumen de elución para estimar el peso molecular basándose en la comparación con kits de calibración de filtración en el (General Electric, n.º de cat. 28-4038-41 y 28-4038-42).

Recuperación de proteína tras su almacenamiento a alta concentración: se transfirieron 10 µl de los polipéptidos de AARS concentrados a ≥ 10 mg/ml usando una unidad de filtro Amicon Ultra-15 (Millipore, n.º de cat. UFC901024 o UFC900324 dependiendo del peso molecular) a un tubo de microcentrifugación limpio. La muestra se almacenó a temperatura ambiente durante una semana seguido de centrifugación a 16.000 g durante 10 minutos para aglomerar cualquier precipitado. Se determinó la concentración del sobrenadante mediante un ensayo de proteína Bradford y se comparó con la concentración medida antes de la exposición de una semana a temperatura ambiente. La recuperación se expresó como porcentaje de la concentración inicial.

Caracterización de los polipéptidos de AARS por CL-EM: Se diluyeron polipéptidos de AARS purificados (1 mg/ml) a 1:10 en ácido fórmico al 0,1 % y se cargaron 0,6 µg de proteína con un automuestreador Dionex en una columna capilar C4. La columna capilar se preparó cortando 150 mM de tubos de sílice fusionado (0,36 mM de DE por 0,1 mM de DI, Polymicro Technologies, n.º de cat. 2000023). El capilar se estiró desde un extremo con un instrumento láser para estirar fibras de Suter y se cortó con un cortador de sílice fusionado para generar una punta de 5 µm. El capilar se empaquetó hasta una longitud de 75 mM con resina C4 (5µm, 300Å, Michrom, n.º de cat. PM5/64300/00) usando una bomba de presión. Se llevó a cabo el análisis CL-EM en un espectrómetro de masas de trampa iónica ThermoFisher LTQ acoplado a un sistema HPLC Dionex Ultimate3000. El analito se eluyó de la columna usando un gradiente de 35 minutos de acetonitrilo al 5-70 % en ácido fórmico al 0,1 % a un caudal de 0,9 µl/min. El LTQ se hizo funcionar en un modo de escaneo de EM completo (300-2.000 m/z) con un voltaje de pulverización de 2,5 kV.

Recogida y análisis de datos: los datos de espectrometría de masas en bruto se almacenaron en archivos RAW generados mediante XCalibur ejecutado en el espectrómetro de masas LTQ XL. Los espectros de masas de los picos principales en el cromatógrafo se analizaron adicionalmente con el algoritmo de desconvolución ProMass de ThermoFisher para obtener los pesos moleculares del polipéptido de AARS.

ANÁLISIS FUNCIONAL DE POLIPÉPTIDOS DE AARS

Elaboración de perfiles transcripcionales

Antecedentes y relevancia terapéutica: Además de las técnicas de identificación de dianas tradicionales, han surgido recientemente las herramientas genómicas como estrategias importantes para ayudar en la dilucidación del mecanismo de acción de los polipéptidos de AARS y pueden proporcionar una perspectiva directa acerca de la relevancia terapéutica de manera temprana en el proceso de descubrimiento de fármacos. Para facilitar una comprensión de la utilidad terapéutica potencial, se cultivaron tipos celulares humanos primarios con polipéptidos de AARS y se evaluaron los perfiles de transcripción en dos instantes separados después de la incubación con polipéptidos de AARS.

Los tipos celulares seleccionados para la elaboración de perfiles transcripcionales estaban basados en las capacidades pluripotentes de las células en cuestión y su potencial para identificar polipéptidos de AARS con un valor terapéutico directo. Por ejemplo, las células madre mesenquimales (MSC) pueden diferenciarse en linajes osteogénicos, adipogénicos, condrogénicos, miocárdicos o neurales cuando se exponen a estímulos específicos, haciendo que sean atractivas para comprender la relevancia potencial de los polipéptidos de AARS para una gran variedad de tipos celulares y enfermedades.

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Tabla E1 Lista de genes evaluados en la elaboración de perfiles transcripcionales

Lista única compilada: refseq_nt Nombre completo Sinónimos

ABCA1: NM_005502 Casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 1 ABC-1|ABC1|CERP|FLJ14958| HDLDT1 |MGC164864|MGC165011|TGD

ACTB: NM_001101 actina, beta PS1TP5BP1

ACTG1: NM_001614 actina, ga mMa 1 ACT|ACTG|DFNA20|DFNA26

ACVR2B: NM_001106 receptor de activina A, tipo IIB ACTRIIB|ActR-IIB|MGC116908

APOA1: NM_000039 apolipoproteína A-I MGC117399

ARNT: NM_178427 traslocador nuclear del receptor de hidrocarburos de arilo HIF-1beta|HIF1B|HIF1BETA| TANGO |bHLHe2

BAD: NM_032989 agonista de la muerte celular asociado a BCL2 BBC2|BCL2L8

BCL2: NM_000657 CLL/linfoma de células B 2 Bc1-2

BMP2: NM_001200 proteína morfogenética ósea 2 BMP2A

BMP4: NM_130851 proteína morfogenética ósea 4 BMP2B|BMP2B1|MCOPS6|OFC11 | ZYME

C3AR1: NM_004054 receptor 1 del componente de complemento 3a AZ3B|C3AR|HNFAG09

CASP3: NM_032991 caspasa 3, cisteína peptidasa relacionada con la apoptosis CPP32|CPP32B|SCA-1

CAV1: NM_001753 caveolina 1, proteína caveolae, 22kDa BSCL3|CGL3|MSTP085|VIP21

CDH5: NM_001795 cadherina 5, tipo 2 (endotelio vascular) 7B4|CD144|FLJ17376

CFLAR: NM_003879 regulador de la apoptosis similar a CASP8 y FADD CASH|CASP8AP1|CLARP|Casper| FLAME|FLAME-1|FLAME1|FLIP |I-FLICE|MRIT| c-FLIP|c-FLIPL| c-FLIPR|c-FLIPS

COMP: NM_000095 proteína de matriz oligomérica de cartílago EDM1|EPD1|MED|MGC131819| MGC149768| PSACH|THBS5

CSF1: NM_172212 factor estimulante de colonias 1 (macrófagos) MCSF|MGC31930

CTGF: NM_001901 factor de crecimiento de tejido conectivo CCN2|HCS24|IGFBP8|MGC10283 9| NOV2

CTNNB1: NM_001904 catenina (proteína asociada a cadherina), beta 1, 88kDa CTNNB|DKFZp686D02253| FLJ25606| FLJ37923

DAAM1: NM_014992 activador de la morfogénesis 1 asociado a dishevelled FLJ41657|KIAA0666

ELN: NM_001081755 elastina FLJ38671|FLJ43523|SVAS|WBS|W S

ENO1: NM_001428 enolasa 1, (alfa) ENO1L1|MPB1|NNE|PPH

FABP3: NM_004102 proteína de unión a ácidos grasos 3, músculo y corazón (inhibidor del crecimiento derivado de mama) FABP11|H-FABP|MDGI|O-FABP

FAK: NM_001199649 cinasa de adhesión focal fak1

FGF4: NM_002007 factor de crecimiento de fibroblastos 4 HBGF-4|HST|HST-1|HSTF1|K-FGF| KFGF

FIGF: NM_004469 factor de crecimiento inducido por c-fos (factor de crecimiento endotelial vascular D) VEGF-D|VEGFD

FLT1: NM_002019 tirosina cinasa 1 relacionada con fms (factor de crecimiento endotelial vascular/receptor de factor de permeabilidad vascular) FLT|VEGFR1

FOXA1: NM_004496 caja A1 de forkhead HNF3A|MGC33105|TCF3A

GAPDH: NM_002046 gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa G3PD|GAPD|MGC88685

GFAP: NM_002055 proteína ácida glialfibrilar FLJ45472

SLC2A4: NM_001042 familia de transportador de soluto 2 (transportador de glucosa facilitado), miembro 4 GLUT4

HAND1: NM_004821 derivados de la cresta neural y cardiaca expresados 1 Hxt|Thing1|bHLHa27|eHand

HIF1A: NM_181054 factor inducible por hipoxia 1, subunidad alfa (factor de transcripción de hélice-bucle-hélice básico) HIF-1alfa|HIF1|HIF1-ALFA|MOP1|PASD8|bHLHe78

HK2: NM_000189 hexocinasa 2 DKFZp686M1669|HKII|HXK2

HMGB1: NM_002128 caja 1 de grupo de alta movilidad DKFZp686A04236|HMG1|HMG3| SBP-1

HNF4A: NM_178850 factor nuclear de hepatocitos 4, alfa FLJ39654|HNF4|HNF4a7|HNF4a8| HNF4a9| HNF4alpha|MODY|MODY1|NR2A 1 |NR2A21|TCF|TCF14

HPRT1: NM_000194 hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 HGPRT|HPRT

HSPB1: NM_001540 proteína 1 de choque térmico de 27kDa CMT2F|DKFZp586P1322|HMN2B| HS.76067|HSP27|HSP28|Hsp25|SRP27

ICAM1: NM_000201 molécula de adhesión intercelular 1 BB2|CD54|P3.58

IFNG: NM_000619 interferón, ga mMa IFG|IFI

IGF1: NM_001111285 factor de crecimiento insulínico 1 (somatomedina C) IGF-I|IGF1A|IGFI

IGF2: NM_001127598 factor de crecimiento insulínico 2 (somatomedina A) C11orf43|FLJ22066|FLJ44734|INSI GF| pp9974.

IGFBP3: NM_001013398 proteína de unión 3 al factor de crecimiento insulínico BP-53|IBP3

IGFBP5: NM_000599 proteína de unión 5 al factor de crecimiento insulínico IBP5

IKBKB: NM_001556 inhibidor del potenciador de gen de polipéptido ligero kappa en células B, cinasa beta FLJ33771|FLJ36218|FLJ38368|FLJ 40509| IKKbeta|IKK2|IKKB|MGC131801 |NFKBIKB

IL10: NM_000572 interleucina 10 CSIF|IL-10|L10A|MGC126450| MGC126451|TGIF

IL1B: NM_000576 interleucina 1, beta IL-1|IL1-BETA|IL1F2

IL3: NM_000588 interleucina 3 (factor estimulante de colonias, múltiple) IL-3|MCGF|MGC79398|MGC79399| MULTI-CSF

IL4: NM_172348 interleucina 4 BCGF-1|BCGF1|BSF1|IL-4| MGC79402

IL5: NM_000879 interleucina 5 (factor estimulante de colonias, eosinófilos) EDF|IL-5|TRF

IL6R: NM_181359 receptor de interleucina 6 CD126|IL-6R-1|IL-6R-alpha|IL6RA|MGC104991

IL8: NM_000584 interleucina 8 CXCL8|GCP1|GCP1|LECT|LUCT| LYNAP|MDNCF |MONAP|NAF|NAP-1|NAP1

ITGA5: NM_002205 integrina, alfa 5 (receptor de fibronectina, polipéptido alfa) CD49e|FNRA|VLA5A

KDR: NM_002253 receptor del dominio de inserción de cinasa (una tirosina cinasa receptora de tipo III) CD309|FLK1|VEGFR|VEGFR2

LEP: NM_000230 leptina FLJ94114|OB|OBS

LPL: NM_000237 lipoproteína lipasa HDLCQ11|LIPD

MAPK11: NM_002751 proteína cinasa 11 activada por mitógeno P38B|P38BETA2|PRKM11|SAPK2| SAPK2B |p382|p38Beta

mMP1: NM_002421 metalopeptidasa de matriz 1 (colagenasa intersticial) CLG|CLGN

mMP3: NM_002422 metalopeptidasa de matriz 3 (estromelisina 1, progelatinasa) CHDS6|MGC126102|MGC126103 |MGC126104| mMP3|SL-1|STMY|STMY1|STR1

MYH1: NM_005963 miosina, cadena pesada 1, músculo esquelético, adulto MGC133384|MYHSA1|MYHa| MyHC-2X/D|MyHC-2x

MYH11: NM_022844 miosina, cadena pesada 11, músculo liso AAT4|DKFZp686D10126| DKFZp686D19237| FAA4|fLJ35232|MGC126726| MGC32963| SMHC|S mMHC

MYH7: NM_000257 miosina, cadena pesada 7, músculo cardíaco, beta CMD1S|CMH1|DKFZp451F047| MGC138376| MGC138378|MPD1|MYHCB| SPMD|SP mM

MYOD1: NM_002478 diferenciación miogénica 1 MYF3|MYOD|PUM|bHLHc1

NFATC1: NM_172390 factor nuclear de células T activadas, citoplasmático, dependiente de calcineurina 1 MGC138448|NFATC|NFAT2|NFATc

NFATC2: NM_173091 factor nuclear de células T activadas, citoplasmático, dependiente de calcineurina 2 NFAT1|NFATP

NFKB1: NM_003998 factor nuclear del potenciador de gen de polipéptido ligero kappa en células B 1 DKFZp686C01211|EBP-1|KBF1| MGC54151| NFkappa-B|NF-kappaB|NFKB-p105| NFKB-p50|p105|p50

NOS2: NM_000625 sintasa de óxido nítrico 2, inducible HEP-NOS|INOS|NOS|NOS2A

NOTCH1: NM_017617 notch 1 TAN1|hN1

NR3C1: NM_0010240 94 subfamilia 3 de receptor nuclear, grupo C, miembro 1 (receptor de glucocorticoides) GCCR|GCR|GR|GRL

NRP2: NM_201279 neuropilina 2 MGC126574|NP2|NPN2|PRO2714| VEGF165R2

PAX7: NM_013945 caja emparejada 7 FLJ37460|HUP1|PAX7B|RMS2

PDGFB: NM_033016 polipéptido beta de factor de crecimiento derivado de plaquetas (homólogo de oncogén de sarcoma viral de simio (v-sis)) FLJ12858|PDGF2|SIS|SSV|c-sis

PDK4: NM_002612 piruvato deshidrogenasa cinasa, isozima 4 FLJ40832

PLA2G1 B: NM_000928 fosfolipasa A2, grupo IB (páncreas) MGC119834|MGC119835|PLA2 |PLA2A| PPLA2

PLIN1: NM_002666 proteína asociada a microgotas lipídicas perilipina

PPARG: NM_138712 receptor ga mMa activado por proliferador de peroxisomas CIMT1|GLM1|NR1C3|PPARG1| PPARG2| PPARga mMa

QARS: NM_005051 glutaminil-ARNt sintetasa GLNRS|PRO2195

RHOA: NM_001664 familia de genes homólogos de ras, miembro A ARH12|ARHA|RHO12|RHOH12

RUNX1: NM_001754 factor de transcripción 1 relacionado con runt AML1|AML1-EVI-1 |AMLCR1|CBFA2|EVI-1| PEBP2aB

RXRA: NM_002957 receptor X de retinoides, alfa FLJ00280|FLJ00318|FLJ16020| FLJ16733 |MGC102720|NR2B1

SERPINE1: NM_0011654 13 inhibidor de serpin peptidasa, clado E (nexina, inhibidor del activador de plasminógeno de tipo 1), miembro 1 PAI|PAI-1 |PAI1|PLANH1

SMAD2: NM_005901 miembro 2 de la familia de SMAD JV18|JV18-1|MADH2|MADR2| MGC22139| MGC34440|hMAD-2|hSMAD2

SMAD4: NM_005359 miembro 4 de la familia de SMAD DPC4|JIP|MADH4

TERT: NM_198255 retrotranscriptasa de telomerasa EST2|TCS1|TP2|TRT|hEST2

TGFB1: NM_000660 factor de crecimiento transformante, beta 1 CED|DPD1|LAP|TGFB|TGFbeta

TGFB3: NM_003239 factor de crecimiento transformante, beta 3 ARVD|FLJ16571|TGF-beta3

THBS4: NM_003248 trombospondina 4 TSP4

TNF: NM_000594 factor de necrosis tumoral DIF|TNF-alfa|TNFA|TNFSF2

TUBB: NM_178014 tubulina, beta M40|MGC117247|MGC16435| OK/SW-c1.56|TU13B1| TUBB5

TUBB1: NM_030773 tubulina, beta 1 isoforma beta (1) de tubulina

TUBG1: NM_001070 tubulina, ga mMa 1 GCP-1|TUBG|TUBGCP1

VCAM1: NM_080682 molécula de adhesión celular vascular 1 CD106|DKFZp779G2333|INCAM-100|MGC99561

VEGFA: NM_003376 factor de crecimiento endotelial vascular A MGC70609|MVCD1|VEGF|VPF

VIM: NM_003380 vimentina FLJ36605

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incubadora con CO2 al 5 % durante 18 horas. En el día 2 del experimento, se prepara el medio de detección de SEAP (QUANTI-BLUE™) (Invivogen, código de catálogo: rep-qb1) siguiendo las instrucciones y se añaden 120 µl por pocillos a una placa de fondo plano transparente de 96 pocillos y se añade sobrenadante de células (20 µl). Las muestras se incuban a 37 °C durante aproximadamente 30 minutos durante hasta 2 horas. Los niveles de SEAP se determinan usando un espectrofotómetro y leyendo la absorbancia a 650 nm. Los pocillos de control se pretratan con PBS y agonistas de TLR conocidos tales como LPS ultrapuro (TLR-4) o PAM3CSK4 (TLR-2). Se usa la proporción de fondo restado [PBS más señal de LPS] a [polipéptido de AARS más señal de LPS] para determinar el porcentaje de agonismo.

LIBERACIÓN DE CITOCINAS (ENSAYOS E1-E16 EN LAS TABLAS DE DATOS MÁS ADELANTE)

Antecedentes y relevancia terapéutica: Las citocinas son un conjunto diverso de moléculas proteínicas de señalización celular pequeñas que se usan profusamente para la comunicación intercelular y desempeñan papeles significativos en la homeostasia corporal normal, incluyendo la modulación y regulación inmunitaria. Por consiguiente, los polipéptidos de AARS que modulan la liberación o las actividades biológicas de las citocinas, tienen utilidad terapéutica en una gran variedad de enfermedades y trastornos que incluyen, por ejemplo, enfermedades y trastornos inflamatorios, enfermedades autoinmunitarias, trasplante de tejidos/rechazo de órganos, prevención o tratamiento del cáncer, la modulación de la hematopoyesis e infecciones.

Liberación de citocinas de células en cultivo

Métodos: Se siembran células de ensayo en una placa de 24 pocillos a una densidad de aproximadamente 1 millón de células/pocillo en 1 ml de medio de crecimiento. Las células se tratan con polipéptido de ARS (a las concentraciones mostradas en los ejemplos más adelante) o en un volumen igual de PBS y se incuban durante una noche a 37 °C con CO 2 al 5 %. Después del tratamiento de las células, las muestras se centrifugan a 4 °C en una centrifugadora de cubeta oscilante a 2.000 x g durante 5 minutos. El medio se retira cuidadosamente para no alterar el sedimento de células y se transfiere a un nuevo tubo. Las muestras se ensayan inmediatamente o se conservan instantáneamente en nitrógeno líquido para su posterior análisis. La liberación de citocinas (incluyendo las citocinas MIF, IL-8, IL-10, Serpina E1, GM-CSF, GRO, IL-1 alfa, IL-1beta, IL-1ra, IL-6, MCP-1, MIP-1, RANTES y TNFalfa) se determina usando kits disponibles comercialmente (R&D Systems, Inc, MN, EE.UU.) o mediante una organización de investigación subcontratada (MD Biosciences (St. Paul, MN).

Liberación de citocinas de sangre humana completa

Métodos: Se obtiene sangre humana completa de donantes humanos normales y se recoge con heparina en tubos de recogida estándar. La sangre se usa el mismo día que se recoge para asegurar una salud celular adecuada. La sangre se mezcla cuidadosamente y se siembra en un volumen de 100 µl en placas de fondo en V de policarbonato de 96 pocillos. Los polipéptidos de AARS se añaden y se mezclan lentamente en 2X de sangre usando una pipeta multicanal ajustada a 50 µl. Se usan puntas de filtro para todos los experimentos y se emplea PPE completa. Todos los experimentos se producen en una campana de bioseguridad dedicada que es adecuada para la experimentación con sangre humana. La sangre se incuba durante una noche a 37 °C con CO 2 al 5 %. Después del tratamiento de las células, las muestras se centrifugan en una centrifugadora de cubeta oscilante a 2.000 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se recoge para los ELISA de citocinas. Los ELISA se llevan a cabo del modo descrito anteriormente.

Liberación de citocinas de PBMC

Métodos: Para aislar células mononucleares de sangre periférica, se dispone en capas sangre completa humana recientemente aislada sobre HISTOPAQUE®-1077 de Sigma a una proporción de 1:1 en tubos cónicos de 50 ml a temperatura ambiente. Las muestras dispuestas en capas se centrifugan a 400 x g en una centrifugadora clínica de cubeta oscilante durante 30 minutos a temperatura ambiente sin freno. La capa celular blanca en la interfaz entre el plasma y el gradiente de densidad se retira posteriormente con una pipeta. Estas células mononucleares de sangre periférica se lavan dos veces con RPMI-1640 (Invitrogen, n.º 22400-105) mediante dilución y centrifugación durante 10 minutos a 250 x g. Las PBMC lavadas se resuspendieron en RPMI-1640 + FBS al 10 % y se emplacaron a razón de 1x106 células/ml.

Liberación de citocinas de sinoviocitos humanos

Antecedentes y relevancia terapéutica: Un gran número de estudios ha demostrado que la IL-6 y la IL-8 se sobreproducen en varias enfermedades y por lo tanto, pueden desempeñar un papel fundamental en la patogénesis de enfermedades inflamatorias. La IL-6 activa la producción de células endoteliales, dando lugar a la liberación de IL-8 y de proteína quimioatrayente de monocitos, la expresión de moléculas de adhesión y el reclutamiento de leucocitos a los sitios de inflamación. Estas citocinas se expresan en tipos celulares asociados con enfermedades inflamatorias, incluyendo células implicadas en la patogénesis de la artritis juvenil sistémica, el lupus eritematoso sistémico, la enfermedad de Crohn y la artritis reumatoide. Una de las acciones sistémicas más importantes de la producción de citocinas es la inducción de la respuesta de fase aguda. Las proteínas de fase aguda se producen principalmente por el hígado e incluyen proteínas que promueven la respuesta inmunitaria mediante la activación del

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los polipéptidos de AARS con la capacidad de modular el desarrollo muscular también tienen utilidad como reguladores in vitro e in vivo de la miogénesis.

Métodos: Para evaluar el papel potencial de los polipéptidos de AARS en este proceso, se empleó un ensayo estándar de diferenciación de células musculares esqueléticas. Para este ensayo, las células musculares esqueléticas adultas humanas (HSkMC, Cell Applications, n.º de cat. 150-05f) se aíslan de donantes humanos sanos de músculos esqueléticos de las extremidades. Las células se mantienen en medio de crecimiento de HSkMC (Cell Applications, n.º de cat. 151-500). Estas células pueden cultivarse y propagarse durante al menos 15 duplicaciones de la población. Para la diferenciación, las células se mantienen en medio de crecimiento durante un pase y después se siembran a 50.000 células por ml de medio en placas tratadas para TC de paredes negras y fondo transparente de 96 pocillos tratadas con colágeno a 100 µl por pocillo. Se dejan adherir las células durante una noche. Los polipéptidos de AARS en PBS o solo PBS, se añaden a cada pocillo a una concentración final de 250nM de proteína (o como se indique de otro modo en los ejemplos más adelante). Los pocillos de control recibieron el mismo volumen de medio de diferenciación (Cell Applications, n.º de cat. 151D-250) en ese instante. Las células se incuban con proteína o medio de diferenciación durante 48 horas. A las 48 horas, se recoge el sobrenadante de cultivo de todos los pocillos y se añade medio de diferenciación a un volumen de 150 µl para toda la placa con la excepción de los pocillos de control, que se mantuvieron solo en medio de crecimiento. El sobrenadante se utilizó para evaluar la producción de citocinas incluyendo IL6 e IL8 como se ha descrito anteriormente. La proliferación se evalúa con resazurina como se ha descrito anteriormente añadiendo medio fresco que contenía resazurina a las placas después de la retirada del sobrenadante y de incubar durante tres horas a 37 °C. Las células se controlan bajo el microscopio y se intercambia el medio por medio de diferenciación fresco cada 2 días. En el día 10, se retira el medio y se fijan las células con paraformaldehído al 10 % durante 30 minutos. Las células se permeabilizan con triton X-100 al 0,1 % en PBS durante 15 minutos y se tiñen las células con faloidina marcada con TR y Hoechst 33432 (como se ha descrito anteriormente) para definir la actina y los núcleos, respectivamente. La intensidad nuclear se usa para determinar la proliferación celular en cada pocillo y la intensidad de la faloidina se usa para determinar el contenido total de actina. Las células se tiñen también con anticuerpo para alfa actina de músculo esquelético (GenTex, n.º de cat. GTX101362). Se efectúan fotografías digitales usando un microscopio de fluorescencia así como inspecciones visuales y puntuaciones de todos los pocillos.

Diferenciación y proliferación de células madre mesenquimales de médula ósea humana.

Antecedentes y relevancia terapéutica: Las células madre mesenquimales (MSC) son células madre multipotentes que pueden diferenciarse en una serie de tipos celulares, incluyendo osteoblastos, condrocitos, miocitos, adipocitos, células de islotes pancreáticos beta y potencialmente, células neuronales. Muchos eventos diferentes contribuyen a la diferenciación de las MSC en otros linajes que incluyen la coordinación de una red compleja de factores de transcripción, cofactores e intermedios de señalización de numerosas vías. Las MSC tienen un gran interés terapéutico debido a que representan una población de células con potencial para tratar una gran variedad de enfermedades agudas y degenerativas.

Además, los polipéptidos de AARS con la capacidad de modular la diferenciación de las MSC en diferentes vías de desarrollo tienen una utilidad terapéutica significativa para posibilitar la modulación in vitro o in vivo de la hematopoyesis, neurogénesis, miogénesis, osteogénesis y adipogénesis, así como en una gran variedad de trastornos y enfermedades, que incluyen, por ejemplo, respuestas inflamatorias, autoinmunidad, cáncer, degeneración neuronal, distrofia muscular, osteoporosis y lipodistrofia. Las MSC humanas son inmuno-privilegiadas y representan un tipo celular ventajoso para el trasplante alogénico, reduciendo el riesgo de rechazo y complicaciones del trasplante. Recientemente, también se han producido avances significativos en el uso de células madre mesenquimales autólogas para regenerar tejidos humanos, incluyendo cartílago y menisco, tendones y fracturas óseas. Muchos estudios han investigado también el uso de MSC para terapia génica, que incluye el trasplante de MSC transfectadas con factor de crecimiento endotelial vascular para la mejora de la función cardíaca después de un IM en ratas, MSC como vehículos para el suministro de interferón-β en tumores en ratones y terapia génica con MSC que expresan BMP para promover la formación de hueso. Por consiguiente, debido al gran interés en las MSC como agentes terapéuticos directos y modificados, así como el potencial de los polipéptidos de AARS para actuar como agentes terapéuticos para regular la diferenciación de las MSC in vivo, se ensayaron los polipéptidos de AARS como inductores potenciales de la proliferación y diferenciación de MSC.

Métodos: Se mantienen hMSC (células estromales de médula humanas) (Cell Applications, n.º de cat 492-05f) según las instrucciones del vendedor. Para el cultivo, se descongelan rápidamente las células y se transfieren inmediatamente a 15ml de medio de crecimiento de células estromales de médula (Cell Application, n.º de cat. 419500) y se sembraron en un matraz tratado para cultivo tisular estéril convencional. El medio se reemplaza con medio de crecimiento de células estromales de médula reciente cada dos días hasta que las células alcanzan una confluencia > 60 %. Las células se cultivan a 37 °C , CO2 al 5 %, en un ambiente humidificado y se utilizaron en campanas certificadas para cultivo tisular BSL2 usando técnicas estériles y equipamiento de protección personal adecuado que incluye gafas, guantes y batas de laboratorio. Las células se siembran en placas de ensayo tratadas para cultivo tisular de 96 pocillos de paredes negras y fondo transparente a una concentración de 50.000 células/ml. Se añaden las proteínas derivadas de ARNt sintetasa a una concentración final de 250 nM por pocillo (o como se especifique de otro modo en los ejemplos más adelante) a cada pocillo de ensayo. Todas las células se mantienen

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complementario (ADNc) se sintetiza a partir de los ARN maduros usando cebadores que se hibridan a secuencias exónicas de los genes de aminoacil ARNt sintetasa. Se amplifica un transcriptoma enriquecido respecto de genes de aminoacil ARNt sintetasa mediante PCR multiplexada usando el ADNc específico de exones de aminoacil ARNt sintetasa y diferentes combinaciones de cebadores para exones de aminoacil ARNt sintetasa. Los productos bicatenarios de la PCR del transcriptoma enriquecido respecto de aminoacil ARNt sintetasa se reparan enzimáticamente en ambos extremos antes de añadir salientes de A a los extremos 3' de los fragmentos reparados. Después se añaden adaptadores de secuenciación y secuencias de índice a los productos de la PCR de transcriptoma enriquecidos respecto de aminoacil ARNt sintetasa para generar bibliotecas de ADNc para secuenciación profunda con el kit de secuenciación multiplexada de Illumina. En resumen, los productos de la PCR de transcriptoma enriquecidos respecto de aminoacil ARNt sintetasa con salientes de 3'-A se ligan en los oligonucleótidos adaptadores InPE proporcionados en los kits. Se añaden secuencias de índice a los productos de la PCR con adaptadores InPE. Para obtener suficientes fragmentos de ADN para secuenciación profunda, los productos de la PCR con secuencias de índice se amplifican adicionalmente mediante PCR. Las bibliotecas de ADNc enriquecidas respecto de aminoacil ARNt sintetasa con diferentes índices se agrupan y secuencian usando una máquina de secuenciación de ADN de Illumina para obtener lecturas de los 50 pares de bases terminales. Las lecturas de secuenciación se mapean en el genoma humano o de ratón para la identificación de acontecimientos de corte y empalme alternativo. Se usa el programa informático "Splicemap" (disponible para su descarga pública en http://www-stat.stanford.edu/~kinfai/SpliceMap/) para identificar las uniones de corte y empalme.

Se lleva a cabo la secuenciación profunda de estos ADNc para generar aproximadamente 1 millón de lecturas de secuenciación de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Las secuencias específicas para exones de las aminoacil ARNt sintetasas se buscan contra uniones exónicas anotadas y se identifican nuevas uniones exónicas como eventos de corte y empalme alternativo.

Las columnas en las tablas2,5 y8 marcadas como "exón 5'" y "exón 3'" indican, cuando están presentes, qué exones están fusionados entre sí en la secuencia de ADNc. Las tablas2,5 y8 muestran secuencias que se identificaron para eventos de corte y empalme alternativo, transcritos que contienen dichos eventos de corte y empalme y los polipéptidos expresados por estos transcritos. Las variantes de corte y empalme alternativo identificadas por secuenciación profunda se identifican en las tablas 2, 5 y8 como aquellas en las que hay números mayores de cero en las columnas marcadas como "Lecturas de secuenciación" en el cerebro de humano adulto o fetal.

Ejemplo 3

IDENTIFICACIÓN DE POLIPÉPTIDOS DE AARS USANDO BIOINFORMÁTICA

Los fragmentos de proteína AARS (péptidos de resectina o apendacrina) se identifican usando bioinformática. Las secuencias de aminoácidos de la aminoacil ARNt sintetasa humana de longitud completa se alinean con la secuencia de aminoácidos de longitud completa de su ortólogo de la bacteria Escherichia coli usando un programa tal como Fasta (disponible en la página web http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi) o el programa BLASTP del NCBI (disponible en la página web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS =blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthom). Las secuencias de resectinas de las proteínas humanas se identifican como secuencias que abarcan regiones donde se producen huecos en la secuencia bacteriana en el alineamiento o regiones con baja homología entre las dos especies. El péptido y las secuencias de ADN correspondientes en las tablas 3, 6 y 9 incluyen ejemplos identificados de este modo.

Ejemplo 4

EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE POLIPÉPTIDOS DE AARS IDENTIFICADOS POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Se usa la técnica PROTOMAP como se describe en el ejemplo 1 para comparar la expresión diferencial de treonil ARNt sintetasas en diferentes tejidos/tipos celulares (véanse las tablas 1, 4 y 7 para secuencias y comparaciones): La expresión de resectinas de aminoacil-ARNt sintetasa se compara entre el tejido de hígado de ratón y el tejido de páncreas de ratón. La expresión de resectinas de aminoacil-ARNt sintetasas se compara entre el citosol de RAW264.7 y el medio condicionado de células RAW264.7 recogidas después de 48 horas de privación de suero.

Ejemplo 5

EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE POLIPÉPTIDOS DE AARS IDENTIFICADOS MEDIANTE SECUENCIACIÓN PROFUNDA

Para comprobar la expresión diferencial de eventos de corte y empalme, se efectúa la secuenciación profunda para ADNc preparados a partir de diferentes tejidos.

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ThrRS1N3: SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 47 1-328 + 1aa N-terminal 1

ThrRS1N3: SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 47 1-328 + 1aa C-terminal I

ThrRS1N4: SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 48 1-109 + 9aa N-terminal 2

ThrRS1N4: SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 48 1-109 + 9aa C-terminal 2

ThrRS1N2: SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 49 1-146 N-terminal 2

ThrRS1N2: SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 49 1-146 C-terminal 2

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ThrRS1C1: SEQ ID NO: 97 SEQ ID NO: 109 307-723 N-terminal 1

ThrRS1C1: SEQ ID NO: 98 SEQ ID NO: 109 307-723 C-terminal 1

ThrRS1C2: SEQ ID NO: 99 SEQ ID NO: 110 346-723 N-terminal 2

ThrRS1C2: SEQ ID NO: 100 SEQ ID NO: 110 346-723 C-terminal 2

ThrRS1C3: SEQ ID NO: 101 SEQ ID NO: 111 432-723 N-terminal 1

ThrRS1C3: SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 111 432-723 C-terminal 1

ThrRS1C4: SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 112 380-723 N-terminal 2

ThrRS1C4: SEQ ID NO: 104 SEQ ID NO: 112 380-723 C-terminal 2

ThrRS1C5: SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 113 294-723 N-terminal 1

ThrRS1C5: SEQ ID NO: 106 SEQ ID NO: 113 294-723 C-terminal 1

ThrRS1C6: SEQ ID NO: 107 SEQ ID NO: 114 600-723 N-terminal 2

ThrRS1C6: SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 114 600-723 C-terminal 2

imagen143

ThrRS1I1: SEQ ID NO: 123 SEQ ID NO: 125 147-620 N-terminal 1

ThrRS1I1: SEQ ID NO: 124 SEQ ID NO: 125 147-620 C-terminal 1

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de AARS seleccionados listados en la tabla E2, junto con el marcador epitópico N o C-terminal adecuado, se sintetizan y clonan como se describe en la sección de Materiales y métodos generales usando la metodología de síntesis génica en la tabla E2. 5

Ejemplo 9

EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN BACTERIANA A PEQUEÑA ESCALA

10 Los polipéptidos de AARS listados en la tabla E2 se expresan en E. coli como se describe en la sección de Materiales y Métodos generales. La expresión relativa de polipéptidos de AARS solubles y localizados en cuerpos de inclusión se resume en la tabla E3 a continuación.

Tabla E3 Resumen de características de expresión bacteriana de polipéptidos de AARS

Polipéptido de AARS: Ubicación del marcador epitópico Cantidad de proteína recuperada de la fracción soluble Cantidad de proteína recuperada de los cuerpos de inclusión

ThrRS1N1: N-terminal ++ ND

ThrRS1N1: C-terminal +++ ND

ThrRS1N2: N-terminal +++ ND

ThrRS1N2: C-terminal +++ ND

ThrRS1N3: N-terminal ++ ND

ThrRS1N3: C-terminal ++ ND

ThrRS1N4: N-terminal ++ ND

ThrRS1N4: C-terminal + ND

imagen144

ThrRS1C1: N-terminal ++ ND

ThrRS1C1: C-terminal ++ ND

ThrRS1C2: N-terminal + ND

ThrRS1C2: C-terminal + ND

ThrRS1C3: N-terminal + ND

ThrRS1C3: C-terminal + ND

ThrRS1C4: N-terminal + ND

ThrRS1C4: C-terminal + ND

ThrRS1C5: N-terminal + ND

ThrRS1C5: C-terminal ++ ND

ThrRS1C6: N-terminal + ND

ThrRS1C6: C-terminal + ND

ThrRS1I1: N-terminal + +

ThrRS1I1: C-terminal + +

"+" representa expresión de polipéptidos de AARS de 0-1 mg/l "++" representa expresión de polipéptidos de AARS de 1-5 mg/l; "+++" representa expresión de polipéptidos de AARS de 5-10 mg/l; "++++" representa expresión de polipéptidos de AARS de 10-15 mg/l; "+++++" representa expresión de polipéptidos de AARS de ≥15 mg/l;

ND: no determinado L: niveles de expresión de indetectables a bajos M: niveles de expresión medios H: niveles de expresión altos

Sorprendentemente, los datos de expresión de proteínas demuestran la existencia de al menos tres dominios de proteína que muestran un alto nivel de expresión de proteína soluble cuando se expresan en E. coli. Específicamente, los datos demuestran que los polipéptidos de AARS ThrRS1N1, (aminoácidos 1-322), y ThrRS1N3 (aminoácidos 1-328+1 aa), definen un primer límite de un primer nuevo dominio de proteína que está altamente expresado en E. coli; ThrRS1N2 (aminoácidos 1-146), define un segundo límite de un segundo nuevo dominio de proteína que está altamente expresado en E. coli; y ThrRS1C1 (aminoácidos 307-723) y ThrRS1C5 (aminoácidos 294723), definen un tercer límite de un tercer nuevo dominio de proteína que está altamente expresado en E. coli;

imagen145

imagen146

Los resultados de este estudio establecen que las proteínas de AARS representativas de las familias ThrRS1N3 y ThrRS1C1de las proteínas AARS, muestran rendimientos de expresión de proteínas y características de solubilidad favorables.

5 Ejemplo 11

ELABORACIÓN DE PERFILES TRANSCRIPCIONALES DE POLIPÉPTIDOS DE AARS REPRESENTATIVOS

Para ensayar respecto de la capacidad de los polipéptidos de AARS para modular la expresión génica, se incubaron

10 polipéptidos de AARS seleccionados con células madre mesenquimales o células de músculo esquelético humanas durante los tiempos y a las concentraciones mostradas en la tabla E5.

Tabla E5 Elaboración de perfiles transcripcionales de polipéptidos de AARS representativos en células madre mesenquimales (MSC) o células musculares esqueléticas humanas (HSkMC)

Descripción de la muestra de ensayo: Tipo de célula y tiempo de exposición

Polipéptidos de AARS: Ubicación del marcador epitópico Concentración nM MSC 24 horas MSC 72 horas HSkMC 24 horas HSkMC 72 horas

ThrRS1C1: N-terminal 70 1 7 7 5

ThrRS1N2: N-terminal 250 2 4 4 5

ThrRS1N2: C-terminal 250 1 6 6 4

Controles

Media entre todos los polipéptidos de AARS explorados: 3 5 6 7

Cóctel de osteogénesis: 17 20 11 16

Cóctel de condrogénesis: 17 19 14 19

Cóctel de adipogénesis: 19 15 16 18

Control de SKMC Pos: 11 8 5 4

No tratadas: 0 0 1 1

En la tabla E5, los números en cada columna representan el número de genes que se modularon, ya sea positiva o

15 negativamente en al menos un factor de 4 en comparación con los genes de control, tal como se describe en la sección de métodos generales. Los datos muestran que las formas específicas de los polipéptidos de AARS ensayadas tienen la capacidad sorprendente de regular la transcripción y por tanto potencialmente la de modular el destino de desarrollo o el estado de diferenciación cuando se añaden a células madre mesenquimales (MSC) y/o células musculares esqueléticas humanas (HSkMC). Las celdas sombreadas con números en negrita en la tabla

20 representan ejemplos donde el polipéptido de AARS muestra un impacto significativo en la regulación de la transcripción génica en las líneas celulares y los tiempos indicados en la tabla.

Se llega a la conclusión de que ThrRS1C1parece ser el regulador principal de la expresión génica de las células madre mesenquimales.

25 Ejemplo 12

ELABORACIÓN DE PERFILES FUNCIONALES DE POLIPÉPTIDOS DE AARS

30 Para ensayar respecto de la capacidad de los polipéptidos de AARS para modular una serie de procesos fenotípicos, se incubaron polipéptidos de AARS seleccionados con los tipos celulares y las condiciones proporcionadas en la sección de métodos generales y las tablas E5 y E6.

Tabla E6 Clave para los ensayos y criterios para indicar un acierto

Ensayos de proliferación

Fuente y tipo celular Número de ensayo

Células de leucemia megacariocítica humana / Mo7e: A1

Células de leucemia promielocítica aguda humanas / HL60: A2

Linfoblastos humanos (línea celular de cáncer) / RPMI8226: A3

Células madre mesenquimales humanas / hMSC: A4

Astrocitos humanos: A5

Células de aspirado de médula ósea humanas / células de médula ósea: A6

Células de aspirado de médula ósea humanas / células de médula ósea (cultivo de larga duración): A7

Sinoviocitos humanos / HFLS-SynRA: A8

Pre-adipocitos humanos / hPAD: A9

Células musculares lisas de la arteria pulmonar humanas / hPASMC: A10

Células de músculo esquelético humanas / hSKMC: A11

El análisis de los datos para los ensayos de proliferación se llevó a cabo dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo entre el valor medio de PBS para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran proliferativos en caso de haber más de 3 DT respecto del valor de PBS en la dirección positiva. Se consideró que un polipéptido de AARS derivado de ARNt sintetasa era citotóxico en caso de haber más de 3 DT respecto del valor de PBS en la dirección negativa. Se utilizó un compuesto citotóxico como control negativo y el valor medio para este era siempre mayor de 3 DT respecto del valor medio de PBS.

Ensayos de diferenciación celular y fenotipado

Descripción del ensayo: Número de ensayo

Captación de LDL acetiladas por hepatocitos humanos (células HepG2C3a): B1

El análisis de los datos para el ensayo de captación de ac-LDL se llevó a cabo dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo entre el valor medio de PBS para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la captación de ac-LDL en caso de haber más de 2 DT respecto del valor de PBS en la dirección positiva o negativa. Se efectuó una comprobación visual para confirmar los resultados del lector de placas usando un microscopio de fluorescencia.

Ensayos de neutrófilos humanos

Descripción del ensayo: Número de ensayo

Elastasa de neutrófilos: C1

Explosión oxidativa de neutrófilos (agonista): C2

Explosión oxidativa de neutrófilos (antagonista): C3

El análisis de los datos para los ensayos de neutrófilos se llevó a cabo dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo entre el valor medio de PBS para la placa de ensayo. Los polipéptidos de AARS se consideraron como un modulador de la producción de elastasa de neutrófilos o de la biología de la explosión oxidativa en caso de haber más de 2 DT respecto del valor de PBS en la dirección positiva o negativa.

Modulación de receptores de tipo Toll (TLR)

Descripción del ensayo: Número de ensayo

Activación de TLR en células RAW BLUE: D1

Antagonismo de TLR en células RAW BLUE: D2

Activación de hTLR2: D3

Activación de hTLR4: D4

Descripción del ensayo: Número de ensayo

El análisis de los datos para los ensayos de modulación de TLR se llevó a cabo dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo entre el valor medio de PBS para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la biología específica de TLR en caso de haber más de 3 DT respecto del valor de PBS en la dirección positiva o negativa. Los controles positivos, que incluyen LPS y reactivo de detección, fueron siempre significativamente distintos y a > 3 DT respecto del valor medio de PBS.

Liberación de citocinas

Descripción del ensayo: Número de ensayo

Producción de citocinas por sinoviocitos humanos (liberación de IL6): E1

Producción de citocinas por células musculares lisas de la arteria pulmonar humanas (hPASMC) (liberación de IL6): E2

Producción de citocinas por células de músculo esquelético humanas (hSKMC) (liberación de IL6): E3

Producción de citocinas por astrocitos humanos (liberación de IL6): E4

Liberación de IL6 por sangre completa: E5

Producción de citocinas por células musculares lisas de la arteria pulmonar humanas (hPASMC) (liberación de IL8) 72 h de incubación: E6

Producción de IL8

Producción de citocinas por sinoviocitos humanos (liberación de IL8): E7

Producción de citocinas por células musculares lisas de la arteria pulmonar humanas (hPASMC) (liberación de IL8): E8

Producción de citocinas por células de músculo esquelético humanas (hSKMC) (liberación de IL8): E9

Producción de citocinas por astrocitos humanos (liberación de IL8): E10

Liberación de IL8 por hepatocitos humanos (células HepG2C3a): E11

Células de leucemia promielocítica aguda humanas / HL60 (liberación de IL8): E12

Linfoblastos humanos (línea celular de cáncer) / RPMI8226 (liberación de IL8): E13

Producción de TNF alfa

Producción de citocinas por sinoviocitos humanos (liberación de TNF alfa): E14

Liberación de TNF alfa por sangre completa: E15

Liberación de IL10

Células de leucemia promielocítica aguda humanas / HL60 (liberación de IL10): E16

Células mononucleares primarias de sangre humana (liberación de IL10): E17

El análisis de los datos para los ensayos de liberación de citocinas se llevó a cabo dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo entre el valor medio de PBS para la placa de ensayo. Los polipéptidos de AARS se consideraron como un modulador de la producción de citocinas o de la biología relacionada con las citocinas en caso de obtener un valor medido mayor de 2 DT respecto del valor de PBS en la dirección positiva o negativa. Se corrió un patrón de proteínas (específico para cada kit de ensayo) en cada placa para asegurar la buena calidad del ensayo. Solo los ensayos con curvas patrón de proteínas que tenían un valor de R2 de > de 0,9 se seleccionaron para el análisis de datos.

Adhesión celular y quimiotaxis

Descripción del ensayo: Número de ensayo

Adhesión celular de monocitos THP 1 / células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC): F1

Hepatocitos humanos (células HepG2C3a) (liberación de ICAM): F2

Descripción del ensayo: Número de ensayo

Regulación de la adhesión celular de células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HLMVEC) (liberación de ICAM): F3

Regulación de la adhesión celular de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) (liberación de VCAM): F4

Regulación de la adhesión celular de células madre mesenquimales humanas (hMSC) (liberación de VCAM): F5

Regulación de la adhesión de células de músculo esquelético humanas (hSKMC) (liberación de VCAM): F6

Regulación de la adhesión celular de células musculares lisas de la arteria pulmonar humanas (hPASMC) (liberación de VCAM): F7

El análisis de los datos para los ensayos de regulación de la adhesión celular se llevó a cabo dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo entre el valor medio de PBS para la placa de ensayo. Los polipéptidos de AARS se consideraron un modulador de la adhesión celular o un modulador de la biología relacionada con la adhesión celular en caso de obtener un valor medido de más de 2 DT respecto del valor de PBS en la dirección positiva o negativa. En el caso de los ensayos ELISA, se corrió un patrón de proteínas (específico para cada kit de ensayo) en cada placa para asegurar la buena calidad del ensayo. Solo los ensayos con curvas patrón de proteínas que tenían un valor de R2 de > de 0,9 se seleccionaron para el análisis de datos.

Diferenciación celular

Diferenciación celular de preadipocitos humanos (hPAD): G1

Diferenciación celular de células de músculo esquelético humano (hSKMC): G2

Diferenciación celular de células madre mesenquimales humanas (hMSC): G3

Diferenciación de células musculares lisas de la arteria pulmonar humanas (hPASMC): G4

El análisis de los datos para los ensayos de diferenciación celular se llevó a cabo dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo entre el valor medio de PBS para la placa de ensayo. Los ensayos de diferenciación se puntuaron basándose en la intensidad de fluorescencia de anticuerpos particulares, tal como se describe en la sección de métodos. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la diferenciación celular en caso de obtener una lectura de intensidad de más de 2 DT respecto del valor de PBS en la dirección positiva o negativa. Para el análisis de hSKMC, se tomaron fotografías digitales de todos los pocillos y se puntuaron las fotografías de un modo ciego por tres personas usando un sistema de puntuación de 4 puntos, donde 4 indicó una intensa tinción de actina de músculo esquelético y una formación evidente de miotubos. Se usó el valor medio de la puntuación visual y solo se consideraron como aciertos los pocillos con un valor medio > 3. Los pocillos tratados con control de diferenciación en este ensayo normalmente tuvieron puntuaciones > 2, mientras que los pocillos tratados con PBS tuvieron puntuaciones < 2.

Unión celular

Descripción del ensayo: Número de ensayo

PBMC: H1

Célula T primaria: H2

Célula B primaria: H3

Monocito primario: H4

HepG2: H5

3T3L1: H6

C2C12: H7

THP1: H8

Jurkat: H9

Raji: H10

Descripción del ensayo: Número de ensayo

Se consideró que los polipéptidos de AARS se unían a un tipo celular particular en caso de que la intensidad de fluorescencia media de células unidas fuese mayor de 2 DT respecto de los valores de reactivo de control para ese tipo celular.

Tabla E7 Resultados de los estudios de elaboración de perfiles funcionales de polipéptidos de AARS

Polipéptidos de AARS: Ubicación del marcador epitópico Concentración [nM] Aciertos de ensayo

ThrRS1N1: N-terminal 120 (Proliferación) C2 (Activación de neutrófilos) D1 (Modulación de receptores de tipo Toll) G2 (Diferenciación celular)

ThrRS1N1: C-terminal 250 A7 (Proliferación) E8 (Liberación de citocinas) G1, G2 (Diferenciación celular)

ThrRS1N2: N-terminal 250 A7 (Proliferación) B1 (Captación de LDL acetiladas) C2 (Activación de neutrófilos) D2 (Modulación de receptores de tipo Toll) G2 (Diferenciación celular)

ThrRS1N2: C-terminal 250 A7 (Proliferación) C2 (Activación de neutrófilos) D2 (Modulación de receptores de tipo Toll) E11 (Liberación de citocinas) G2 (Diferenciación celular)

ThrRS1N3: N-terminal 124 A7 (Proliferación) B1 (Captación de LDL acetiladas) C2 (Activación de neutrófilos) E4, E14 (Liberación de citocinas) G1 (Diferenciación celular)

ThrRS1N3: C-terminal 250 A4, A7 (Proliferación) B1 (Captación de LDL acetiladas) C2 (Activación de neutrófilos) E4 (Liberación de citocinas)

ThrRS1N4: N-terminal 229 A7 (Proliferación) B1 (Captación de LDL acetiladas) C2 (Activación de neutrófilos) D1 (Modulación de receptores de tipo Toll) E12 (Liberación de citocinas) G1 (Diferenciación celular)

ThrRS1C1: N-terminal 70 B1 (Captación de LDL acetiladas) C2 (Activación de neutrófilos) G1, G2, G3, G4 (Diferenciación celular)

ThrRS1C1: C-terminal 131 A7 (Proliferación) C2 (Activación de neutrófilos) A8 (Proliferación) A7 (Proliferación)

ThrRS1C5: C-terminal 95 C2 (Activación de neutrófilos) D2 (Modulación de receptores de tipo Toll) E1, E8 (Liberación de citocinas)

Se llega a la conclusión de que ThrRS1N1, ThrRS1N2, ThrRS1N3, ThrRS1N4, ThrRS1C1 y ThrRS1C5 parecen ser reguladores principales de la proliferación celular, la diferenciación, la liberación de citocinas, la captación de LDL acetiladas, la adhesión celular y la quimiotaxis y son posiblemente reguladores de los receptores de tipo Toll y la

5 activación de neutrófilos.

Los datos de exploración fenotípica demuestran que los polipéptidos de AARS ThrRS1N1, (aminoácidos 1-322), y ThrRS1N3 (aminoácidos 1-328+1 aa) definen los límites de un primer nuevo dominio de proteína que es altamente activo en una amplia serie de ensayos de exploración fenotípica.

10 Por consiguiente, se llega a la conclusión de que los polipéptidos de AARS que comprenden los aminoácidos 1-328 de treonil ARNt sintetasa definen los límites aproximados (es decir, en aproximadamente +/-5 aminoácidos) de un primer nuevo dominio de proteína AARS altamente activo, que es i) altamente activo funcionalmente, ii) puede fabricarse y producirse fácilmente en E. coli e iii) muestra características de estabilidad de proteínas y agregación

15 favorables. Los expertos en la materia apreciarán que cualquier polipéptido de AARS que comprenda tan pocos como 322 aminoácidos de la treonil ARNt sintetasa, hasta tan grandes como polipéptidos que comprenden los primeros 328 aminoácidos de la treonil ARNt sintetasa, representan equivalentes funcionales de los polipéptidos de AARS específicos descritos.

20 Los datos de exploración fenotípica también demuestran que los polipéptidos de AARS ThrRS1N2, (aminoácidos 1146), definen los límites de un segundo nuevo dominio de proteína que es altamente activo en una amplia serie de ensayos de exploración fenotípica. Por consiguiente, se llega a la conclusión de que los polipéptidos de AARS que comprenden los aminoácidos 1-146 de treonil ARNt sintetasa definen los límites aproximados (es decir, en aproximadamente +/-5 aminoácidos) de un segundo nuevo dominio de proteína AARS altamente activo, que es i)

25 altamente activo funcionalmente, ii) puede fabricarse y producirse fácilmente en E. coli e iii) muestra características de estabilidad de proteínas y agregación favorables.

Además, los datos de exploración fenotípica también demuestran que los polipéptidos de AARS ThrRS1C1 , (aminoácidos 307-723), y ThrRS1C5 (aminoácidos 294-723) definen los límites de un tercer nuevo dominio de

30 proteína que es altamente activo en una amplia serie de ensayos de exploración fenotípica.

Por consiguiente, se llega a la conclusión de que los polipéptidos de AARS que comprenden los aminoácidos 294723 de treonil ARNt sintetasa definen los límites aproximados (es decir, en aproximadamente +/-5 aminoácidos) de un tercer nuevo dominio de proteína AARS altamente activo, que es i) altamente activo funcionalmente, ii) puede 35 fabricarse y producirse fácilmente en E. coli e iii) muestra características de estabilidad de proteínas y agregación favorables. Los expertos en la materia apreciarán que cualquier polipéptido de AARS que comprende tan pocos como los aminoácidos 307-723 de la treonil ARNt sintetasa, hasta tan grandes como polipéptidos que comprenden los aminoácidos 294-723 de la treonil ARNt sintetasa, representan equivalentes funcionales de los polipéptidos de

Claims

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