ES2240986T3

ES2240986T3 - Linea de celulas t humanas infectadas con vih-2 que segrega gp160 del vih-2 funcionalmente intacta.

Info

Publication number: ES2240986T3
Application number: ES96200578T
Authority: ES
Inventors: Mangalasseril Gopalan Sarngadharan; Vaniambadi Srinivasan Kalyanaraman; Irene Larue Kalisz
Original assignee: Biomerieux Inc
Current assignee: Biomerieux Inc
Priority date: 1995-03-07
Filing date: 1996-03-04
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2016-03-04
Also published as: DE69634843D1; EP0731165A2; EP0731165A3; AU4792996A; JPH09246A; ATE297984T1; US5736317A; CA2171144A1; DE69634843T2; US5766844A; EP0731165B1; ZA961647B; US5876732A; EP0731165B8; AU710064B2; KR960034405A

Abstract

UNA NUEVA LINEA DE CELULA CRONICAMENTE INFECTADA CON EL VIRUS VIH-2{SUB,NIHZ} SEGREGA EL PRECURSOR DEL SOBRE VIRAL DE PROTEINAS EN UN MEDIO EXTRACELULAR. LAS CELULAS CRECEN BIEN EN UN MEDIO DE SUERO-LIBRE, EL CUAL PERMITE LA CONCENTRACION DEL MEDIO ACONDICIONADO DE LAS CELULAS PARA SER INCREMENTADAS EN GRAN MANERA (>100 AGRUPADAS). TAL PASO DE CONCENTRACION ES DE OTRA MANERA IMPOSIBLE DE CONSEGUIR SI LAS CELULAS ESTAN CRECIENDO BAJO CONDICIONES CONVENCIONALES, UTILIZANDO UN 10% DE SUERO DE FETO DE TERNERA. UN PROCEDIMIENTO ESPECIFICO DE AFINIDAD, ES SUMINISTRADO PARA PURIFICAR LA PROTEINA GP160 DESDE EL MEDIO CONCENTRADO ACONDICIONADO DE CULTIVOS DE LOTES DE 100 LITROS, UTILIZANDO UN ANTICUERPO MONOCLONAL DE RATON DE LA PROTEINA VIH2GP41, LA CUAL ES UNA PARTE DE LA PROTEINA GP160. ESTA VIH-2 GP160 PURIFICADA, REACCIONA CON ALTA ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD CON EL ANTICUERPO ANTIVIRAL DE VIH-2 HUMANO INFECTADO POR SEVEROS CRITERIOS COMO I) ELISA, II) ANALISIS MANCHA OESTE, Y III) RADIOINMUNO-PRECIPITACION DEL GP160 METABOLICAMENTE ETIQUETADO DESDE LA MISMA LINEA DE CELULA. EL VIH-2 GP160 PURIFICADO DESDE ESTA LINEA DE CELULA ES POR ESO UNA HERRAMIENTA DE DIAGNOSIS PARA LA DETECCION DE VIH-2 EN INFECCIONES HUMANAS. EN VISTA DE LAS PROPIEDADES OLIGOMETRICAS PREDICHAS DEL GP160 Y SU CERRADA SIMILITUD CONFORMACIONAL DEL SOBRE VIRICO, EL GP160 PURIFICADO PUEDE TAMBIEN SER UTIL PARA EL DESARROLLO DE VACUNAS ESTRATEGICAS CONTRA VIH-2 HUMANO.

Description

Línea de células T humanas infectadas con VIH-2 que segrega gp160 del VIH-2 funcionalmente intacta.

Fundamento de la invención

La presente invención se refiere a la producción y caracterización de la proteína gp160 del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) de tipo 2 (abreviadamente en lo sucesivo VIH-2). Se ha demostrado que el virus ha infectado a seres humanos de cierto número de áreas geográficas del mundo y además se ha demostrado que los individuos infectados por el VIH-2 desarrollan características de la enfermedad similares a las del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) causada por el VIH-1. El curso del progreso de la enfermedad en los individuos infectados por VIH-2 es significativamente más lento el de la patogénesis causada por el VIH-1.

El VIH-1 es trópico para las células T al igual que el VIH-1, y el antígeno CD4 de la superficie de las células T actúa como receptor del virus. La interacción de la cubierta viral con el antígeno CD4 inicia el proceso de infección por el virus. La glicoproteína de la cubierta del VIH-2 se sintetiza en las células infectadas por el virus como la proteína precursora gp160, que subsiguientemente se escinde en la glicoproteína de la cubierta externa denominada gp120 y la proteína transmembranal gp41 antes de ser empaquetada en la cubierta del virus. A diferencia de la proteína gp41 del VIH-1, la proteína transmembranal está presente como proteína gp41 intacta o como proteína gp31 truncada en los viriones del VIH-2. Además, los viriones del VIH-2 con la proteína gp31 truncada son altamente infecciosos mientras que los viriones correspondientes defectuosos del VIH-1 no son infecciosos. Esto hace que las propiedades biológicas y bioquímicas de las proteínas de la cubierta no sean fácilmente comparables.

Debido a su localización, las proteínas de cubierta gp120 y gp41 son las dianas principales de la respuesta inmune en seres humanos infectados con el VIH-2. Esto es similar a la respuesta inmune al VIH-1 en los individuos infectados con el VIH-1. Sin embargo, los dos virus tienen menos de 50% de homología en sus proteínas de cubierta y por tanto es difícil extender las observaciones realizadas en el sistema VIH-1 a las respuestas al VIH-2. Por ejemplo, al menos en los sistemas de modelos animales la diana principal de la respuesta inmune es el bucle V3 de la proteína gp120 en el sistema VIH-1, y esto es cierto entre materiales aislados muy divergentes de VIH-1. Por otro lado, no se ha identificado dicho dominio inmune principal en la proteína de la cubierta del VIH-2. Sin embargo, una similitud entre los dos virus es la gran variabilidad en las glicoproteínas de la cubierta entre múltiples materiales aislados tanto del VIH-1 como del VIH-2. Esto ha limitado el uso de subunidades de las proteínas gp120 o gp41 del VIH-2 ya sea para uso diagnóstico o ya sea como vacunas candidatas en seres humanos.

La capacidad de obtener ciertas líneas de células T humanas crónicamente infectadas con formas defectuosas del VIH-1, que segregan la proteína gp160 intacta, se ha descrito en las patentes de EE.UU. nº 5.116.740 y 5.122.468. Sin embargo, la capacidad de obtener dichas líneas celulares no es universalmente aplicable a todas las variantes del VIH-1. En el caso del VIH-2 es incluso más difícil de predecir que en el caso del VIH-1, puesto que el VIH-2 es mucho menos citopático que el VIH-1 y el VIH-2 es todavía infeccioso incluso con la forma truncada de la proteína gp31. También, el desarrollo de líneas celulares infectadas con VIH-1 o VIH-2 que segregan la proteína precursora de la cubierta gp160 no es generalmente aplicable a todas las diversas variantes de estos dos virus. La experiencia ha demostrado que cada material aislado de virus individual es único y requiere la manipulación selectiva y diferentes manipulaciones del sistema de cultivo, que todavía puede no tener éxito. Las propiedades definitorias del virus que finalmente conducen al fenómeno de la secreción no se comprenden claramente. Por ejemplo, se ha tratado repetidamente sin éxito de desarrollar líneas celulares que segregan la gp160 a partir de cierto número de aislados, incluyendo otra variante de VIH-2, el VIH-2 SBL_{6669}. El desarrollo de la línea celular 6D5_{NIHZ} de la presente invención llevó más de tres años de trabajo experimental con una probabilidad de éxito no garantizada, antes de que se obtuviera una línea celular que segregaba la proteína gp160 del VIH-2 en cantidades adecuadas para el aislamiento a gran
escala.

Con respecto al grupo de virus VIH-1 durante los últimos siete años de investigación y desarrollo, solamente se ha alcanzado éxito con el material aislado de VIH-1_{IIIB} y el sistema 6D5_{451} tal como se indica en las patentes de EE.UU. 5.116.740 y 5.122.468. No ha sido posible, después de años de investigación, desarrollar la línea celular que segregue la proteína gp160 de la mayoría de los aislados de VIH, incluyendo VIH-1_{MN}, VIH-1_{CDC71}, VIH-1_{WCM}, VIH-1_{26}, y VIH-1_{Bal}. También se ha intentado, pero repetidamente se ha fracasado, desarrollar una línea celular de células infectadas con SIV_{mac251} que segregue la proteína gp160 del SIV_{mac251} (estando el SIV_{mac251} claramente relacionado con el VIH-2 y teniendo >70% de homología en la proteína de la cubierta). Teniendo en cuenta el carácter único de cada virus, y de cada cepa de virus individual, así muy pocos casos en que se ha podido desarrollar una línea celular que segrega la proteína gp160 funcionalmente intacta, la probabilidad de éxito en desarrollar cualquier línea celular infectada con virus que segregue la proteína gp160, y en particular la probabilidad de desarrollar cualquier línea celular que segregue la proteína gp160 del VIH-2, funcionalmente intacta, es baja.

Hasta la presente invención, la proteína gp160 del VIH-2 se ha producido por técnicas recombinantes, o como se describe la solicitud de patente WO-A-8906276, en donde se describe una línea de células T humanas (Molt 4) en la que las células se infectan con VIH-2 y producen la proteína gp160 del VIH-2. La proteína gp160 del VIH-2 se obtiene tratando las células infectadas Triton X-100 de tal modo que se obtienen las proteínas del virus solubilizadas. Posteriormente las proteínas del virus se aíslan empleando una columna de celulosa y un gradiente de sacarosa.

Sin embargo, la glicosilación de la proteína recombinante varía significativamente, tanto cualitativa como cuantitativamente, de la proteína natural procedente de las células infectadas con el VIH-2. A causa de esto hay diferencias, en la conformación entre la proteína gp160 del cultivo viral natural y la proteína gp160 recombinante. Estos fenómenos han llegado a ser críticos para las estrategias de diagnóstico y vacunación contra el SIDA.

Sumario de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un clon único de células HUT78 que cuando se infectan crónicamente con un material aislado de VIH-2_{NIHZ}, libera la glicoproteína viral natural gp160 funcionalmente intacta en el medio extracelular.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un clon único de células HUT78 inmortalizadas infectadas con VIH-2_{NIHZ} hechas crecer en un medio exento de suero bajo condiciones tales que la línea celular libera la proteína gp160 en el medio extracelular.

Descripción de las figuras de los dibujos

La Figura 1 muestra el perfil en SDS-PAGE de la proteína gp160 del VIH-2 purificada por afinidad.

La Figura 2 muestra el perfil de la SDS-PAGE de la proteína marcada con ^{35}S-metionina de las células 6D5_{NIHZ} (clon 11) y el medio acondicionado, inmunoprecipitadas con (i) suero humano positivo frente anticuerpos contra el VIH-2 (pista 1); (ii) dos anticuerpos monoclonales de ratón separados para la proteína gp120 del VIH-2 (pistas 2 y 3); y (iii) tres anticuerpos monoclonales de ratón separados para la proteína gp41 del VIH-2 (pistas 4, 5 y 6).

La Figura 3 muestra la radioinmunoprecipitación del medio acondicionado marcado con ^{35}S-metionina de 6D5_{NIHZ} (clon 11) por trece sueros diferentes de seres humanos infectados con el VIH-2.

La Figura 4 muestra la reactividad de los sueros positivos frente a anticuerpos contra el VIH-2 en análisis de transferencia Western con la proteína gp160 del VIH-2 purificada (mismos sueros que en la Figura 3).

La Figura 5 muestra la reacción de la proteína gp160 del VIH-2 con diluciones seriadas de dos sueros diferentes procedentes de seres humanos infectados con VIH-2.

La Figura 6 muestra la fuerte reactividad de los sueros humanos positivos frete a anticuerpos contra el VIH-2 en un ensayo ELISA de la proteína gp160 del VIH-2 purificada.

Descripción de las realizaciones preferidas

Un clon unicelular de células HUT78 se infectó con el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1), con lo cual la línea celular infectada llegó a ser un productor continuo de virus. El clon 6D5 es susceptible de infección crónica con el VIH-1 como se describe en Getchell et al. (J. Clin. Microbiol. 23:737-742, 1986). En la presente invención, el clon 6D5 se encuentra que el clon 6D5 es altamente susceptible a la infección por cierto número de aislados divergentes del VIH-2. A pesar de las diferencias biológicas entre el VIH-1 y el VIH-2, se ha encontrado ahora un método para infectar las células 6D5 con el VIH-2_{NIHZ} aislado del VIH-2, las cuales células segregan la proteína gp160 en el medio. La línea celular crónicamente infectada se denomina 6D5_{NIHZ}. Se aisló un clon unicelular de esta línea celular (clon 11) y se encontró que segregaba en el medio un elevada cantidad de la proteína gp160 del VIH-2. Importantemente, la línea celular clonada puede hacerse crecer en un medio exento de suero, tal como el medio exento de suero HB104 comercialmente disponible en Irvine Scientific Co. (California). El crecimiento de las células en medio exento de suero es una etapa esencial para concentrar y purificar la proteína gp160 del VIH-2 del medio acondicionado de 6D5_{NIHZ}, las células del clon 11. Solamente cuando se usa un medio exento de suero puede separarse fácilmente la glicoproteína gp160 de otras proteínas del medio. La proteína gp160 no puede separarse fácilmente de otros componentes del medio cuando se usa medios que contienen suero.

En una realización preferida, el suplemento de suero HB104 contiene transferrina humana, insulina humana, seroalbúmina humana y selenio como factores promotores del crecimiento. Para obtener un crecimiento y una producción óptimos de la proteína gp160 del VIH-2, las células 6D5_{NIHZ}, (clon 11) se hicieron crecer durante 3 a 4 generaciones en medio exento de suero. La presencia de la proteína gp160 del VIH-2 en el medio se detectó por marcado metabólico de las células con ^{35}S-metionina durante la noche y radioinmunoprecipitacióon de las proteínas marcadas en el medio con suero humano positivo frente a anticuerpos contra el VIH-2.

El medio acondicionado exento de células se usó como la fuente de la proteína gp160 del VIH-2_{NIHZ}. Usualmente se hicieron crecer tandas de 50 a 100 litros de las células en medio exento de suero en frascos rodantes. Las células se separaron del medio y se añadieron fosfato de sodio pH 7,5, cloruro de sodio, Triton X-100, y PMSF al medio acondicionado hasta concentraciones finales de 20 mM, 400 mM, 0,5% y 0,1 mM respectivamente con el fin de inactivar el virus infeccioso. Después de la incubación a temperatura ambiente durante una hora el medio inactivado se concentró aproximadamente 50 veces empleando un Pellicon Cassette provisto con un filtro de corte del peso molecular 10 K (Millipore Corporation). La proteína gp160 del VIH-2_{NIHZ} se purificó a partir del medio acondicionado inactivado y concentrado por cromatografía por inmunoafinidad empleando un anticuerpo monoclonal de ratón para la proteína gp41 del VIH-2. El anticuerpo monoclonal se desarrolló por ABL usando la proteína gp160 parcialmente purificada del VIH-2_{NIHZ}. La inmunoglobulina purificada del anticuerpo monoclonal se acopló a Sepharose activada por CNBr (adquirida a Pharmacia) a una concentración de 5 mg por ml de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El medio acondicionado y concentrado de las células 6D5_{NIHZ} (clon 11) se hizo pasar a través de una columna de 50 ml del anticuerpo anterior a 4ºC. Después de lavar la columna con solución salina tamponada con fosfato y luego solución salina, las proteínas fijadas se eluyeron de la columna con carbonato de sodio 100 mM que contenía PMSF 0,1 mM. La elución de la proteína de la columna se monitorizó por medida de la absorbancia a 280 nm usando un aparato LKB UVICORD conectado a un registrador. La proteína eluida se neutralizó usando HCl 2N, y se añadió fosfato de sodio pH 7,5 hasta una concentración de 10 mM. Esta fracción contenía la proteína gp160 del VIH-2_{NIHZ} junto con seroalbúmina humana (HSA) como contaminante. Para separar la HSA, la muestra se hizo pasar a través de una columna de anticuerpo de cabra contra HSA (adquirido a Cappel Labs) acoplado a Sepharose (5 mg por ml de Sepharose). La fracción no unida se concentró hasta 10 a 20 ml y se conservó en partes alícuotas adecuadas a -70ºC. La Figura 1 muestra el perfil de SDS-PAGE de la proteína gp160 de VIH-2_{NIHZ} purificada. La proteína se hizo desplazar en geles de SDS al 7,5%, se tiñó con azul Comassie, se destiñó y se fotografió.

Se hizo un depósito de células 6D5_{NIHZ.} (clon 11) descritas en la presente memoria de acuerdo con los requerimientos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, el 25 de enero de 1995, teniendo en la ATCC la denominación CRL-11826.

Ejemplos Ejemplo 1

Cinco millones de células 6D5_{NIHZ} (clon 11) en 5 ml de medio RPMI 1640 exento de metionina que contenía 2% de suero de ternera fetal dializado y 100 \muC por ml de ^{35}S-metionina (NEN DuPont) se incubaron a 37ºC durante 15 horas. Las células se separaron por centrifugación y se añadió un volumen igual de tampón 2X PBS-TD (2X PBS que contenía 2% de Triton X-100, desoxicolato de sodio 1M y PMSF 0,1 mM). A 1 ml de esta mezcla se añadieron 10 \mul de suero humano positivo frente a anticuerpos contra el VIH-2 o 50 pg anticuerpo monoclonal de ratón para la proteína gp120 o gp41 del VIH-2. Además, también se añadió a las mezclas 200 \mul de Proteína-A al 10%-Sepharose (la Proteína A-Sepharose se pre-saturó con anticuerpo de conejo para IgG de ratón en el caso de los anticuerpos monoclonales). La mezcla se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron durante 2 minutos a 10.000 rpm en una centrifuga Eppendorf y el sedimento se lavó tres veces con el tampón PBS-TD. El sedimento de Sepharose se llevó a ebullición durante 2 minutos con tampón que contenía con 2% de SDS, 2% de p-mercaptoetanol, Tris-HCl 50 mM pH 6,8 y 20% de glicerol. Las proteínas solubilizadas se separaron en geles de SDS-PAGE al 7,5%, se trataron con Amplify (Amersham) y se secaron y expusieron a una película de rayos X. La Figura 2 muestra que el medio contenía una banda de proteína de aproximadamente 140 kD inmunoprecipitada por los tres anticuerpos anteriores que demuestran que representaba la forma truncada de la proteína gp160 del VIH-2.

Ejemplo 2

Las proteínas virales de células del medio extracelular de 6D5_{NIHZ} (clon 11) marcadas con ^{35}S-metionina se inmunoprecipitaron con 12 sueros humanos diferentes positivos frente a anticuerpos contra el VIH-2 (obtenidos de Serologicals Inc.) como se ha descrito antes. El medio marcado se preincubó con 10 \mul de suero humano normal negativo frente a anticuerpos contra el VIH-2 y 200 \mul de Proteína A al 10%-Sepharose durante una hora a temperatura ambiente y se centrifugó. El líquido sobrenadante clarificado era reactivo con los sueros positivos frente a anticuerpos específicos. Como se muestra en la Figura 3 todos los sueros humanos positivos frente a anticuerpos contra el VIH-2 precipitaron fuertemente la proteína gp160 en el medio acondicionado marcado.

Ejemplo 3

En el Ejemplo 2, la proteína gp160 marcada segregada por las células 6D5_{NIHZ} (clon 11) se inmunoprecipitaron específicamente y con alta sensibilidad por todos los sueros humanos positivos frente a anticuerpos contra el VIH-2. Además demostramos que todos los sueros humanos positivos frente a anticuerpos contra el VIH-2 también reaccionaban con alta especificidad en inmunotransferencias con la proteína gp160 del VIH-2 mostrada en la Figura 1. Para este fin la proteína gp160 del VIH-2 se separó en geles de SDS-PAGE al 7,5% y se transfirieron a nitrocelulosa para electrotransferencia. La nitrocelulosa se bloqueó con leche seca no grasa y se cortó en tiras de 4 mm. Las tiras se trataron con 20 \mul de sueros humanos positivos frente a anticuerpos contra el VIH-2 o sueros de control negativos durante una incubación de 2 horas en 5 ml de tampón (Tris HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 10 mM y Tween 20 al 0,05%). Las tiras se lavaron y los anticuerpos fijados se visualizaron usando IgG de cabra anti-humana conjugada con fosfatasa alcalina. Como se muestra en la Figura 4 la totalidad de los sueros positivos frente a anticuerpos contra el VIH-2, pero no el suero de control negativo reaccionaron con la proteína gp160 de VIH-2 purificada.

Ejemplo 4

Uno de los métodos convenientes usados en la detección masiva de anticuerpos contra un patógeno específico en sueros humanos es por un ensayo ELISA. Por tanto, se ensayó la capacidad de la proteína gp160 del VIH-2 purificada a partir de células 6D5_{NIHZ} (clon 11) para detectar anticuerpos específicos de virus en este formato. Para este fin placas ELISA de 96 pocillos se revistieron con 100 ng por pocillo de la proteína gp160 purificada y estos pocillos se trataron con 100 \mul de sueros humanos diluidos 1:25. Los anticuerpos unidos se detectaron con el segundo anticuerpo conjugado con peroxidasa por técnicas estándares. La absorbancia en los pocillos a 450 nm se midió en un lector de ELISA. Como se muestra en la Figura 6 la proteína gp160 del VIH-2 purificada se detectó específicamente y con alta sensibilidad como se midió por la muestra a las relaciones de corte.

La Figura 5 muestra la sensibilidad de la detección de anticuerpos contra el VIH-2 en dos sueros humanos diferentes. Para este fin se hicieron reaccionar dos diluciones doble seriadas de los sueros con la proteína gp160 del VIH-2 en la placa ELISA y la absorbancia se midió a 450 nm. Como es evidente de la figura, la proteína gp160 del VIH-2 reacciona con alta sensibilidad con estos sueros y probablemente con una variedad de epítopos en la proteína purificada.

Claims

1. Una línea de células T denominada HUT78 infectada con el VIH-2_{NIHZ} que segrega la proteína gp160 natural del VIH-2 funcionalmente intacta.

2. Una línea de células según la reivindicación 1, en donde dicha línea celular es 6D5_{NIHZ}, la que en la ATCC tiene la denominación CRL-11826.

3. Células 6D5_{NIHZ} seleccionadas que en ATCC tiene la denominación CRL-11826 en medio exento de suero.

4. Un método para la producción de la proteína gp160 natural del VIH-2 que comprende: infectar células de la línea de células T denominada HUT78 con el VIH-2_{NIHZ}; seleccionar las células HUT78 infectadas que producen la proteína gp160 natural; incubar dicha línea celular que produce la proteína gp160 en medio exento de suero en condiciones que favorecen el crecimiento celular; y aislar la proteína gp160 natural de dicho medio.

5. Un método para la producción de proteínas de la cubierta del VIH-2 que comprende;

i) infectar una línea de células T con VIH-2;

ii) incubar células de una línea de células T infectada con 6D5_{NIHZ} que produce la proteína gp160 en un medio exento de suero; y

iii) aislar del medio una proteína de aproximadamente 140 kD que corresponde a la glicoproteína natural gp160 de la cubierta del VIH-2.