ES2241122T3 - Formulaciones de inmunopotenciacion para uso como vacunas. - Google Patents

Abstract

La invención está relacionada con la rama de la medicina, particularmente con el uso de nuevas formulaciones de adyuvantes con antígenos vacunales. El objetivo técnico que se persigue con la invención propuesta es, precisamente, el desarrollo de formulaciones capaces de elevar y/o modular la respuesta inmune del organismo a antígenos vacunales a nivel sérico y de mucosas. Para lograr este objetivo se desarrolló una formulación que contiene como componentes fundamentales antígeno de superficie del virus de la hepatitis B y el acemanano en proporciones adecuadas. Como extensión de este resultado se desarrollaron formulaciones en las que: a) se utiliza el HbsAg como portador de antígenos homólogos o heterólogos, b) sistemas de envío de antígenos particulados y c) antígenos solubles, en combinación con el acemanano en proporciones específicas. La formulaciones de esta invención son aplicables en la industria farmacéutica como formulaciones vacunales tanto para uso humano como veterinario.

Description

Formulaciones de inmunopotenciación para uso como vacunas.

La presente invención se refiere al campo de la medicina, particularmente al desarrollo de nuevas formulaciones inmunológicas de potenciación que permiten el incremento del aumento y de la calidad de la respuesta inmunitaria a los antígenos de vacunas.

El objetivo técnico de la invención propuesta es el desarrollo de formulaciones que son capaces de aumentar y/o modular los niveles de la respuesta inmunitaria del cuerpo a los antígenos de la vacuna.

Técnica anterior

Los adyuvantes son sustancias que aumentan u optimizan la respuesta inmunitaria a los antígenos inoculados a través de las vías de las mucosas o generales. Los adyuvantes o sus formulaciones se combinan con el antígeno para generar o potenciar el tipo de respuesta deseada, disminuir el número de inoculaciones y reducir la cantidad de antígeno necesario para obtener y mantener la protección (McElrath, M.C. 1995 Seminars in Cancer Biology 6: 375-385).

Los adyuvantes se han desarrollado por la necesidad planteada por el avance de la biotecnología moderna con la producción de antígenos recombinantes y sintéticos puros y solubles. En general, estos antígenos son seguros, pero de una inmunogenicidad decreciente en comparación con los del organismo original. Una función importante de los adyuvantes o de sus formulaciones, consiste en aumentar la complejidad del antígeno frente al sistema inmunitario, de forma segura, aumentando de este modo su inmunogenicidad (Alving, R.C. 1992 AIDS Res. Hum. Retroviruses 8 (8): 1427-1430).

Actualmente, la búsqueda de nuevos adyuvantes y estimulantes inmunológicos, así como el desarrollo de nuevas vías de administración de antígenos y productos farmacéuticos, es una de las líneas principales de investigación en el mundo en el campo farmacéutico, especialmente en las vacunas. El desarrollo de los adyuvantes para utilización en las mucosas es una necesidad actual en el campo de las vacunas (Report of the Expert Panel VI: Concertad efforts in the field of mucosal immunology 1996 Vaccine 14: 644-664).

Los adyuvantes se pueden clasificar en adyuvantes para las mucosas y generales, considerando que las características fisiológicas en la recepción y el tratamiento del antígeno en ambas vías de inoculación, generan diferentes procedimientos de complementación. La vía de las mucosas, según las características del antígeno, requiere procedimientos de unión o recubrimiento con ligandos específicos que envían los antígenos a las células M. La actividad adyuvante para los antígenos de las mucosas se obtiene mediante estrategias que ayudan al antígeno a atravesar los límites impuestos por la vía. Las características físicas del antígeno pueden favorecer su fagocitosis. Una vez se ha asimilado el antígeno, el adyuvante puede influir en la respuesta por cualquiera de los mecanismos conocidos: la adsorción del antígeno, el efecto de deposición, la inducción de la citocina, la activación del complemento, la regeneración de diferentes poblaciones celulares del sistema inmunológico, la administración de antígeno a diferentes células que presentan el antígeno, la regulación de la expresión mediante la clase I o la clase II y la estimulación de la producción de diferentes subtipos de anticuerpos (McElrath M.C. 1995 Seminars in Cancer Biology 6: 375-385).

Algunos de los estimulantes inmunológicos conocidos como muramil-dipéptido (MDP), monofosforil-lípido A (MPL), la amina lipoide Avridina_ y los conocidos como toxinas de V. cholerae (CT) y de E. coli (HLT), son adyuvantes reconocidos para los antígenos administrados por la vía de la mucosa (Walter, R.I. 1994 Vaccine 12 (5): 387-400).

El MDP y el MPL han sido estudiados en formulaciones liposómicas para utilización terapéutica y profiláctica, sin embargo, las toxinas y sus subunidades (especialmente la CT y CTE) son los adyuvantes de las mucosas más frecuentes.

La capacidad de CT para actuar como adyuvante oral ha sido confirmada por un gran número de investigadores (McGhee, J.R. et al. 1992 Vaccine 10 (2): 75-88). La toxina del cólera no cumple la definición clásica de un adyuvante porque estimula una respuesta inmunitaria contra sí misma y su actividad adyuvante depende de su inmunogenicidad (Elson, C.O. 1987 Fed. Proc. 46: 1778). Los efectos inmunomoduladores de CT y HLT que explican su fuerte actividad adyuvante, incluyen el aumento de la presentación del antígeno por varios tipos de linfocitos B, el aumento de la diferenciación de los linfocitos B para el isotipo IgA, la interacción con los linfocitos T y la producción de citocinas (Lintermans, P. 1995 Advanced Drug Delivery Reviews 18: 73-89).

Desde el punto de vista práctico, no es posible la utilización de la holotoxina en el hombre debido a su toxicidad. Una estrategia mejor consiste en la desintoxicación de la CT, mediante la separación de la subunidad A o mediante las mutaciones del gen que la codifica. La CT así como la CTB (subunidad no tóxica) pueden potenciar la respuesta inmunitaria a varios antígenos unidos por enlace covalente debido a interacciones específicas con las células M (Holmgren, J. et al. 1993 Vaccine 11: 1179-1184).

Los sistemas de administración de antígenos han alcanzado un grado suficientemente alto de desarrollo como para presentar un impacto en la inmunización. Es de esperar que los sistemas sólidos en forma de partículas para administración parenteral o no parenteral estén entre los primeros productos autorizados (Li Wan Po et al. 1995 Advanced Drug Delivery Reviews 18: 101-109).

Mediante las posibilidades ofrecidas por los sistemas de administración de antígenos en la formación de partículas de antígenos solubles, y aprovechándose de las características fisiológicas de la vía de las mucosas, estos sistemas se han probado y han demostrado actividad adyuvante. En la bibliografía se han clasificado como:

a) sintéticos/inactivados y b) vivos (Report of the Expert Panel VII: Vaccine Delivery Systems 1996 Vaccine 14: 644-664).

Con respecto al primer grupo, se han estudiado las partículas poliméricas artificiales con diferentes resultados que comprenden: las microesferas copoliméricas de los ácidos láctico y glicólico, además los polímeros alternativos como los polifosfacenos, polímeros de acetato de celulosa, iminocarbonatos, polímeros de acetato de etilenvinilo, microesferas proteinoides, polianhídrido de dextrano y nanoesferas; las partículas producidas a partir de materiales naturales: alginatos, gelatinas y semillas de plantas y también los liposomas y sus variantes: proteoliposomas, virosomas e ISCOM (Li Wan Po et al. 1995 Advanced Drug Delivery Reviews 18: 101-109).

El tamaño de las partículas está dentro del grupo de factores importantes para la transmisión del antígeno. En el caso de la vía de inmunización de las mucosas se ha descrito que las partículas de diámetro mayor de 10 \mum no se absorben (Eldridge J.H. 1990 J. Control. Release 11: 205-214). En experimentos con ratas se ha observado que después de la administración oral, únicamente las partículas de 5 \mum penetraron con profundidad en las placas de Peyer y las de 1 \mum de diámetro, penetraron en los linfonodos y en el hígado y se introdujeron en el torrente sanguíneo (Jani, P. et al. 1990 J. Pharm. Pharmacol. 42: 821-826) (Alpar, H.O. et al. 1989 J. Pharm. Pharmacol 41: 194-196).

La extrapolación de estos resultados al hombre aún no está definida y algunas veces la adsorción por el tubo digestivo no es un requisito para la actividad del adyuvante aunque se ha demostrado que con la adsorción de la vacuna de la difteria en semillas vegetales de hasta 2 mm de diámetro, se potenció la respuesta inmunitaria (Mirchamski, H. et al. 1994 Vaccine 12: 1167-1172).

Está en estudio la determinación del tamaño óptimo de los sistemas de liberación controlada por las vías oral, rectal o vaginal (Li Wan Po et al. 1995 Advanced Drug Delivery Reviews 18: 101-109).

Otro factor que afecta a las partículas es el equilibrio hidrófobo-hidrófilo, que se puede modificar para obtener una modulación de la respuesta inmunitaria (Jani, P. et al. 1990 J. Pharm. Pharmacol. 42: 821-826).

Recientemente, se ha patentado la utilización de vacunas de cocleatos de proteína descrita en 1975 (Papahadjopoulos D. et al. 1975 Biochem. Biophys. Acta 394: 483). Los cocleatos son complejos de liposoma y cationes divalentes (principalmente calcio) que, mediante la interacción calcio-fosfolípido, permiten la formación de una estructura de liposoma enrollada en sí misma, permitiendo la inmunización a través de diferentes vías (Gould Foguerite, S. documento WO 95/09648). Con esta estructura, se estimula la respuesta inmunitaria de los anticuerpos, así como las respuestas mediadas por las células (Gould Foguerite, S. 1994 AIDS Res. Hum. Retroviruses 10 (Supl. 2): S99-S103).

La absorción y el paso de los antígenos a través de células especializadas del epitelio asociadas al folículo linfoide, las células M (Microfold), es una etapa crítica en la generación de una respuesta inmunitaria a través del epitelio intestinal simple, que es generalmente aceptada por todos los autores. Mediante este proceso los antígenos son enviados a la cavidad basal de las células M, constituyendo el primer contacto del antígeno (prácticamente no degradado) con los linfocitos B y T y los macrófagos. La principal función de la cavidad es proporcionar al organismo un medio protegido de la influencia moduladora de los factores humorales externos (Neutra, R.M. 1996 Annu. Rev. Immunol. 14: 275-300).

En el aparato respiratorio, el epitelio cambia de pseudoestratificado a simple. En los bronquios, la zona epitelial simple, los espacios intercelulares están sellados por uniones estancas y el principal mecanismo para que se introduzcan los antígenos se cree que son las células M. En las amígdalas, el epitelio predominante es el epitelio estratificado. Aquí, el mecanismo de absorción del antígeno está íntimamente
relacionado con una red de macrófagos y células dendríticas móviles de la médula ósea, de hasta 700 células por mm^{2}. Estas células son capaces de migrar al tejido linfoide organizado asociado a la mucosa (O-MALT) o a un linfonodo, presentando el antígeno procesado que se fagocitó en la superficie de las amígdalas. En condiciones normales esto constituye el principal mecanismo para la presentación de los antígenos por la clase II de MHC del aparato respiratorio (Neutra, R.M. 1996 Annu. Rev. Immunol. 14: 275-300).

La diferencia en la absorción del antígeno a los niveles de la mucosa oral y naso-faríngeos permite comprender por qué la inoculación de un adyuvante a través de ambas vías no producirá necesariamente los mismos resultados. Por consiguiente, no es obvio que un adyuvante que es eficaz a través de la vía oral, sea o no eficaz por vía naso-faríngea. Los adyuvantes pueden presentar diferentes efectos en diferentes puntos de la mucosa, ya que diferentes superficies de la mucosa presentan diferentes micro-entornos. El avance en el conocimiento de la fisiología de la mucosa y el modo de actuación de los adyuvantes puede ayudar al desarrollo de vacunas más eficaces para la mucosa, así como las características del antígeno como: dimensiones, presencia de ligandos de la mucosa, carga eléctrica, lipofilia y dependencia de T pueden afectar también la respuesta inmunitaria. (Report of the Expert Panel VI: Concertad efforts in the field of mucosal immunology 1996 Vaccine 14: 644-664).

Al mismo tiempo, otros elementos del organismo como las fluctuaciones hormonales durante el ciclo menstrual, afectan la asimilación del antígeno en la vagina. Este hecho demuestra la colaboración intensa entre las células dendríticas y epiteliales y explica la variación en la eficacia de las vacunas a través de la vía vaginal (Parr, E.L., Parr, M.B. 1992 Vaccine Res. 1: 221-25).

En el caso de la vía epitelial simple del intestino, ha sido difícil la administración de vacunas no vivas a las células M, dado el hecho de que las macromoléculas son digeridas o arrastradas fácilmente por las secreciones y la motilidad del tubo digestivo. Existe poca información disponible en relación con los componentes de la membrana apical de las células M que pueden servir como receptores. Los liposomas y las micropartículas pueden adherirse a las superficies de la mucosa mediante interacciones hidrófobas, pero la entrada de los antígenos a las células M es ineficaz ya que son rápidamente atrapadas en los geles de la mucosa y muchas no llegan a alcanzar la mucosa. Las macromoléculas o partículas que conjugan o cubren con ligandos como la CTB, presentan el factor limitante de su acceso a los receptores (Neutra, R.M. 1996 Cell 86: 345-348).

Recientes experimentos en ratones, utilizando partículas coloidales de oro de 28,8 nm recubiertas con CTB demostraron que pueden adherirse y penetrar selectivamente en las células M del epitelio asociado al folículo de la mucosa, siendo incapaces de penetrar en los enterocitos del denominado "borde del cepillo". Las partículas mayores; de aproximadamente 1,13 \mum; recubiertas también con CTB, no pudieron adherirse a las células M, mientras que las partículas de CTB-FITC de aproximadamente 6,4 nm, se adhirieron y se introdujeron a través de ambos tipos de células. Este experimento demostró la función del glicocáliz en la adhrencia y en la introducción de los
antígenos a través de las células M. La subunidad B de la toxina del cólera tiene receptores tanto en los enterocitos como en las células M. La utilización de ligandos unidos a partículas puede producir una adherencia específica a las células M, pero solo en un intervalo de tamaños restringido al glicocáliz. Las partículas de 1 \mum o mayores, requieren ligandos que se dirijan específicamente a los componentes de las células M. La identificación de estos componentes está todavía en estudio (Frei, A. et al. 1996 J. Exp. Med. 184: 1045-1059).

Un grupo de bacterias patógenas es capaz de superar las dificultades de los sistemas no vivos al ser asimiladas de manera eficaz por falta de receptores en las células M. Estas bacterias aprovechan este mecanismo al infectar los tejidos de las mucosas y diseminarse de forma generaliza antes de ser detenidos en el sistema inmunitario. Los patógenos bacterianos que se adhieren a la superficie de las células M inician los episodios de transducción de señal al nivel del epitelio que favorecen su introducción. El mejor conocido es el de las cepas bacterianas atenuadas ty21a de S. typhi, para las cuales un tipo de lectina interactúa con los receptores de naturaleza polisacárido de la membrana celular de las células M. Asimismo para la inmunización oral son seguras y eficaces las cepas vivas atenuadas de V. cholerae y del virus de la polio. Las cepas manipuladas genéticamente de estos microorganismos se utilizaron en primer lugar en el hombre como portadoras de antígenos heterólogos (Mekalanos, J.J. 1992 Adv. Exper. Med. Biol. New York Plenum Press: 43-50).

La biología de estos vectores vivos introduce nuevos retos. Las cepas de la vacuna del V. cholerae, que no tienen genes para la toxina, pueden producir todavía diarrea, al parecer porque las células epiteliales liberan citocina como respuesta a la adherencia bacteriana. El principal reto en la utilización de las cepas manipuladas genéticamente de S. typhi y S. typhimurium consiste en obtener una atenuación suficiente que ofrezca seguridad mientras se está adhiriendo todavía a las células M y su proliferación en la mucosa, para mantener su inmunicidad. Las cepas atenuadas de Shigella también son interiorizadas por las células M, pero han perdido su capacidad para diseminarse de célula en célula. Este fenómeno es la base de la atenuación, pero existe todavía liberación de citocinas locales y de factores quimiotácticos que puede producir la rotura de la función normal de la barrera epitelial (Sansonetti, P.J. 1991 Rev. Infect. Dis. 13: 285-292).

También se han descubierto virus en este estudio. El hecho de que el virus de la polio de tipo I y la cepa de Sabin atenuada utilicen el transporte a través de las células M para atravesar la barrera epitelial, les convierte en importantes candidatos para que las vacunas orales transmitan antígenos extraños al hombre. Las vacunas y otros virus infecciosos son asimilados por la superficie de la mucosa pero su interacción con las células M es todavía desconocida (Report of the Expert Panel VI: Concertad efforts in the field of mucosal immunology 1996 Vaccine 14: 644-664).

Muchos carbohidratos complejos de origen natural estimulan las células del sistema inmunitario y del sistema retículo-endotelial (Davis, S.E. 1975 Am. Chem. Soc. Sympos. Serie 15, Jeanes A. Hodge J. Eds. Am. Chem. Soc. Washington D.C.). Entre estos están los polímeros de las plantas y de los hongos como los glucanos, dextranos y lentinanos, todos los cuales son polímeros de glucosa, y los mananos, entre los cuales se encuentran los glucomananos y los galactomananos. Asimismo se encuentran los levanos y xilanos (Tizard, I.R. et al. 1989 Mol. Biother. 1: 290-296). La actividad de muchos de estos poliglicanos sobre los macrófagos (que tienen receptores de glucano y de manano) incluye la inducción de fagocitosis y la secreción de citocinas, leucotrienos y prostaglandinas. El lentinano, un glucano que es frecuente en los champiñones, estimula la célula y la respuesta al anticuerpo en los eritrocitos de las ovejas mientras que el levano es mitógeno para los linfocitos B y un activador del macrófago (Simon, P. M. 1994 Exp. Opin. Invest. Drugs 3 (3): 223-239).

El acemanano es un manano compuesto de manosa con O acetilaciones en aproximadamente 8 de cada 10 restos. Se extrae como componente principal de la sustancia mucilaginosa o del gel de la hoja de Aloe barbadensis Miller, planta medicinal utilizada a lo largo de la historia. Diferentes pruebas in vitro indican que los mananos activan los monocitos y los macrófagos induciendo la producción de interferón-\gamma, factor \alpha de la necrosis tumoral, factor estimulante de colonias de monocitos y granulocitos, IL-1\beta e IL-6 (Peng, S.Y. et al. 1991 Mol. Biother. 3: 79-87). El acemanano potencia la generación de linfocitos T citotóxicos (CTL) (Womble, D. et al. 1988 Int. J. Immuno-pharmacol. 10: 967-974), la actividad citotóxica de las células destructoras naturales (NK) (Marshall G.D. et al. 1993 J. Immunol. (parte II) 150: Abstr 1381), y también, ligeramente, la alorrespuesta humana in vitro.

El aumento de la actividad citotóxica y de la secreción del interferón \gamma apoya la utilización terapéutica anti-vírica y anti-tumoral del acemanano. Su actividad anti-retrovírica se demostró en animales en el caso de la leucemia felina (Sheets, M.A. et al. 1991 Mol. Biother. 3: 41-45). Actualmente están en curso ensayos clínicos en pacientes de SIDA y de cáncer.

Recientemente se ha aplicado en patentes en relación con la utilización del acemanano como adyuvante para vacunas. (McAnalley, B.H. patente EP 0 619 117 A2, Nordgrem, R.M. patente WO 93/14195), pero en ninguno de estos dos casos la utilización nasofaríngea del acemanano está protegida. En ambas patentes los antígenos se inoculan por vía general (subcutánea e intramuscular). En relación con la vía de la mucosa, la primera patente presenta pocos resultados en la utilización oral de una formulación de acemanano. La segunda patente extiende la utilización a los colirios. Los resultados obtenidos con una formulación oral de acemanano (presentada en la primera patente) pueden considerarse escasos en comparación con los obtenidos por la vía general de inoculación. Como se explicó anteriormente, los adyuvantes pueden presentar diferentes efectos en diferentes puntos de la mucosa debido a la fisiología de la asimilación del antígeno y al entorno diferente en cada vía, que puede afectar la actividad del potenciador inmunológico (Report of the Expert Panel VI: Concertad efforts in the field of mucosal immunology 1996 Vaccine 14: 644-664).

Además de las diferencias entre las vías de las mucosas, se han obtenido también diferentes resultados cuando se utiliza el mismo adyuvante de forma generalizada o a través de las mucosas. Este es el caso del adyuvante general habitual utilizado, el hidróxido
de aluminio. Este adyuvante no ha sido más eficaz que el PBS cuando se inoculan ratones por las vías oral y nasal con antígenos para los cuales es el adyuvante tradicional de uso general (como por ejemplo la vacuna del tétanos) (Alpar H.O. et al. 1992 Int. J. of Pharm. 88: 335-344). Por consiguiente, no es obvio que un adyuvante general sea también necesariamente un adyuvante de la mucosa.

Descripción detallada de la invención

En la presente invención los autores describen por primera vez una formulación de vacuna de administración nasofaríngea, que tiene como componentes principales el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) y el acemanano, en proporciones adecuadas.

Esta formulación es una novedad debido a las propiedades procedentes de su administración en la mucosa, éstas son: generar una inmunidad generalizada de similar intensidad y mayor calidad para dosis de antígeno similares a las obtenidas con las formulaciones de vacuna convencionales utilizando hidróxido de alumino como adyuvante. Asimismo, se genera una fuerte respuesta en la mucosa, que no se obtiene mediante las inoculaciones generales del HBsAg.

Los autores también demostraron que con la utilización general de la formulación de HBsAg con acemanano, la respuesta inmunitaria aumentó de forma significativa tanto cuantitativa como cualitativamente en comparación con las formulaciones convencionales de vacunas que utilizan hidróxido de aluminio como adyuvante.

Esta es la primera vez que se describe la utilización del HBsAg como sistema de administración de antígenos por vía nasofaríngea combinada con polisacáridos activadores de inmunidad no específica. Con este sistema se obtuvo un aumento proporcional de la respuesta para los epítopos presentados en su superficie en relación con la proporción obtenida con otros adyuvantes. Este descubrimiento permite la formulación de vacunas combinadas que utilizan el HBsAg como sistema de administración de antígenos a través de la mucosa. También apoya la utilización de esta estrategia para la combinación soluble antígeno-antígeno en forma de partículas y su utilización con polisacáridos con estas características por las vías de inoculación en la mucosa. Aquí, se generalizó que las formulaciones líquidas de sistemas de administración de antígeno en forma de partículas junto con el acemanano inoculado por vía nasofaríngea potenciaban preferentemente la respuesta inmunitaria en relación con el antígeno soluble hasta superar el nivel de respuesta serológica obtenida por vía general con otros adyuvantes. Está demostrado el incremento en la calidad de la respuesta para aumentar el nivel de anticuerpos de subclase IgG2a en ratones Balb/C. Este aspecto constituye una superioridad cualitativa en relación con el hidróxido de aluminio, que permite el diseño de vacunas que son antitumorales y contra microorganismos en los casos en los que se requiere la inducción de respuestas de Th 1. Se ha observado recientemente que las citocinas producidas por las células Th 2 son las asociadas con la inmunidad de la mucosa y que los linfocitos T en los ganglios linfáticos de la mucosa son más propensos a producir citocinas de tipo Th 2 (Meeusen, E.N.T. 1996 Immunology Today 17 (9): 421-424) lo que confirma el valor de este descubrimiento.

En la presente invención también se describe la
actividad inmunológica moduladora de las formulaciones combinadas de antígeno-acemanano. Los autores describen por primera vez la actividad del potenciador específico de la respuesta de Th 1 en relación con otros adyuvantes utilizados habitualmente, por las vías nasofaríngea y general para antígenos en forma de partículas y solubles. Para esta última, la respuesta humoral es de similiar intensidad a la obtenida con el hidróxido de aluminio, pero es cualitativamente diferente, de ahí el efecto inmunológico modulador descrito. Estos resultados apoyan su introducción en formulaciones de vacunas para la inmunoprofilaxis y la inmunoterapia de las enfermedades producidas por patógenos intracelulares y el cáncer.

Hoy en día no están completamente claros los mecanismos de actuación del acemanano y otros polisacáridos inmunológicos estimulantes. Un mecanismo propuesto se refiere a los macrófagos y células dendríticas, que tienen receptores específicos para patrones de antígeno presentes en la superficie de los patógenos que discriminan aquellos que son peligrosos y aquellos que no lo son. Según esto, en el punto de inoculación generalizada existe una fuerte monocitemia. La asimilación antigénica en el nivel naseofaríngeo y más específicamente en el anillo de Waldeyer de acuerdo con el mecanismo de asimilación para el tejido epitelial estratificado puede potenciarse con la activación de los macrófagos y de las células dendríticas observadas en el área y con la atracción hacia esta zona de un número creciente de células inmunológicas competentes.

Una proporción importante del peso en seco de gel de la hoja de la planta Aloe está constituida por cristales de oxalato de calcio (Carpenter, H.R. P.N. 5 118 673). Éstos han sido objeto de recientes estudios debido a la mayor presencia en los cálculos renales, que es una patología frecuente (Lieske, J.C. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 19; 91(15): 6987-91). Desde 1993, se han descrito determinadas macromoléculas que pueden ser adsorbidas por el cristal (Stapleton, A.M. et al. 1993 Kidney Int. 44(4):817-24). Más recientemente, se han descubierto otras proteínas: Nefrocalcina, proteína de Tamm-Horsfall, Uropontina y Litostatina renal (Berland, Y. et al. 1993 Nephrologie 14(4):183-7).

Los experimentos realizados por el grupo de investigadores demostraron la adsorción del HBsAg en el cristal de oxalato de calcio así como la coprecipitación del ADN con esta sal, obteniendo partículas de tamaño reducido debido a las características de la sal y a los procesos de inhibición de aglutinación de los cristales que se producen en un medio rico en polisacárido como es el acemanano.

Para la inoculación generalizada del HBsAg, la combinación de los componentes del gel de aloe también generó mejores resultados que los obtenidos con los elementos por separado.

La división en partículas de los antígenos, mediante sales coloidales así como las conjugaciones con antígenos en forma de partículas o su inclusión o asociación a sistemas de administración de antígenos, constituye una primera etapa en el tratamiento del antígeno en esta invención, la segunda etapa es la adición del polisacárido que activa el sistema inmunitario.

La consistencia viscosa del acemanano le convierte en un vehículo activo que aumenta el tiempo en que la partícula antigénica permanece en el punto de inoculación. No se descartan otras actividades como la inducción de las citocinas, la activación de mecanismos para la absorción de antígenos por la célula M, la regeneración de diferentes poblaciones de células del sistema inmunológico y el aumento del antígeno que presenta actividad.

La formulación objeto de esta invención presenta, según el tamaño de las especies que deben inmunizarse, una cantidad de inóculo capaz de cubrir el área nasofaríngea hasta la subglotis. Para su aplicación la dosis puede dividirse en dos partes o puede introducirse de una vez. La concentración de polisacárido que garantiza una respuesta inmunológica óptima y al mismo tiempo una viscosidad adecuada para una mejor retención del antígeno en la mucosa, es del orden de 1 mg/ml a 12 mg/ml. Dentro de los requisitos de los antígenos está su carácter de materia en partículas ya que se ha demostrado que esta formulación nasal no es igualmente eficaz con el mismo antígeno soluble o sin el efecto del ligando que se observa específicamente en la mucosa. Por consiguiente, el resultado positivo con un determinado tipo de antígeno no garantiza un buen resultado para otro tipo, por cuya razón las características del antígeno de estar en forma de partículas o de presentar actividad de ligando con las células epiteliales constituye un fuerte requisito del antígeno, que se consigue con los métodos en partículas presentados.

Las formulaciones que son el objetivo de esta invención permiten obtener niveles elevados de anticuerpos séricos y una respuesta más completa en relación con los isótopos de inmunoglobulina y las subclases, que son mayores en cantidad y calidad a las obtenidas cuando se inocula el antígeno soluble o al utilizar otro adyuvante.

Las respuestas inmunitarias obtenidas serológicamente mediante la administración en la mucosa de estas formulaciones son comparables a las obtenidas con inoculaciones generales utilizando adyuvantes convencionales pero es mucho mayor al nivel de la mucosa.

La baja capacidad de reacción en la mucosa en relación con los adyuvantes del tipo de toxina y los microorganismos atenuados, junto con un coste más bajo, la respuesta T independiente para el adyuvante y su actividad moduladora hacia una respuesta a Th 1 permite generar respuestas de mayor calidad. Al alcanzar una mayor inmunogenicidad de los antígenos, se puede reducir el número de inoculaciones así como la cantidad de antígeno por dosis.

Ejemplos de rendimiento Ejemplo 1

El polisacárido acemanano se obtiene a partir del extracto acuoso total de la hoja de Aloe barbadensis Miller. Se recogen hojas de plantas de 2 a 3 años de vida y se almacenan durante 2 a 3 días a 4ºC en una habitación oscura. A continuación se elimina la punta y los bordes de las hojas. Se dividen las hojas en pequeñas porciones y se muelen mientras se añade ocasionalmente una cantidad mínima de agua esterilizada para facilitar el proceso. El mucílago (o gel hallado dentro de la hoja) se utilizó también para obtener el acemanano.

Las hojas o el gel, tras la molienda, se centrifugaron a 10.000 rpm, eliminando todos los restos insolubles que estaban principalmente en los tejidos epidérmicos y fibrosos de la hoja. El sobrenadante liofilizado se denominó extracto total (Te). El Te se volvió a poner en suspensión a conveniencia para una
precipitación en etanol al 80% posterior con agitación lenta. La temperatura de precipitación fue de 4ºC. Después de 24 horas se centrifugó la solución durante 20 min a 10.000 rpm y se descartó el sobrenadante. Se volvió a poner en suspensión el precipitado en agua destilada esterilizada y se liofilizó. Este producto se denomina precipitado en etanol.

Para obtener el acemanano con un grado elevado de pureza, se selecciona la cromatografía por exclusión molecular en Sepharose CL-4B. Se utilizó una solución salina con tampón de fosfato (PBS) o NaCl 0,2 M para la serie, así como para volver a poner la muestra en suspensión. La Figura 1 presenta el cromatograma de una cromatografía HPLC en una columna con gel de filtración TSK G6000PW antes de la filtración en gel en Sepharose CL-4B. En este cromatograma se anota el punto correspondiente al volumen de elución del azul de dextrano (DB) de P.M.=2000 kDa, y al final es un punto correspondiente al volumen de elución total (TEV). El primer pico (M), de mayor peso molecular que el DB fue positivo por el método colorimétrico de Antrona (Trevelyan W.E. y Harrison J.S. 1952 Biochem J. 23: 1824).

El análisis por espectroscopía infrarroja de ambos picos mostró la presencia de bandas que son características del acemanano en el primer pico de la cromatografía (M). Este máximo, cerca de 1250 y
1750 cm^{-1}, indica la presencia de acetilaciones que corresponden al estado natural de este polisacárido. Estas bandas no se observaron en el pico correspondiente al volumen de elución total (TEV) de la columna.

Ejemplo 2

Con objeto de evaluar la actividad inmunológica potenciadora del extracto de la hoja de Aloe barbadensis Miller en el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), se llevaron a cabo programas de inmunización por vía intraperitoneal en ratones Balb/c macho de 6 a 8 semanas de vida. La comparación se realizó tomando como referencia la vacuna Heberbiovac-HB (producida en CIGB, Cuba) cuyo antígeno se adsorbe en hidróxido de aluminio. Los programas de inmunización utilizados son específicos para cada caso (Figuras 2a y 2b).

La detección de la respuesta inmunitaria al HBsAg se realizó por ELISA total anti-HBsAg, creado para el control de calidad de la vacuna. Los títulos de anticuerpo se expresan en unidades internacionales por litro. Los análisis estadísticos de los resultados se realizaron por la prueba de Student: p<0,05 se consideró como la diferencia significativa.

Existían diferencias significativas entre ambos grupos en los programas. Se demostró con este ejemplo que es posible potenciar de manera significativa la respuesta inmunitaria a HBsAg en relación con el hidróxido de aluminio después de una o dos inoculaciones intraperitoneales.

Ejemplo 3

Con el objetivo de evaluar dos de los componentes del extracto basándose en sus posibilidades de potenciar la respuesta inmunitaria, se seleccionaron el acemanano y el oxalato de calcio. Se utilizaron hidróxido de aluminio y el Te como referencias. En la tabla de la figura 3 se presentan las cantidades probadas y los resultados por grupo experimental.

Esta prueba de inmunogenicidad fue precedida por experimentos en adsorción del HBsAg por el oxalato cálcico, donde se demostró que esto era posible. La adsorción del oxalato de calcio (presente en forma de sol coloidal en el Te del Aloe) podría generar un efecto sinérgico con el acemanano en la potenciación de la respuesta inmunitaria.

Se llevó a cabo extracción de sangre después de 28 días por punción retro-orbital. La evaluación de los resultados se realizó por ELISA con anti-HBsAg total, ya mencionado.

El grupo 6 que contenía la combinación de acemanano y oxalato de calcio, presentó una respuesta al anticuerpo significativamente mayor que el resto de los grupos.

Se demostró un sinergismo entre el oxalato de calcio y el acemanano, con ellos fue posible reconstituir y superar la actividad inmunológica potenciadora del extracto total. En este caso se demuestra la división en partículas del HBsAg sobre el sol de oxalato de calcio favorece la presentación de este antígeno al sistema inmunológico.

Ejemplo 4

Para determinar la actividad inmunológica potenciadota del acemanano por vía de la mucosa, se llevaron a cabo pruebas de inmunogenicidad en ratones Balb/c de 7 a 10 semanas de vida utilizando el modelo de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg). La inoculación se realizó por vía nasofaríngea en volúmenes de 50 \mul en ratones anestesiados. La extracción se realizó por perforación retro-orbital a los 28 días después del comienzo del programa. Se realizó la determinación del título por ELISA con HBsAg anti-total. Se realizó el análisis estadístico mediante la prueba de Student: p<0,05 se consideró diferencia significativa.

Se probaron diferentes niveles de dosis del acemanano, la referencia utilizada fue el HBsAg en PBS. Se utilizó el antígeno solamente a un nivel: 5 \mug/dosis. Los resultados se presentan en la tabla de la figura 4.

Se demostró una fuerte actividad inmunológica potenciadora en los grupos en los que se añadió acemanano. Todos los grupos eran significativamente superiores a la referencia de HBsAg en PBS. El aumento excesivo del generó un efecto inhibidor (Grupo 5). Esto podría ser debido a un aumento de la viscosidad resultante.

Ejemplo 5

Con el objetivo de comparar la actividad inmunológica potenciadora de acemanano para HBsAg con otro adyuvante de referencia de la mucosa, se realizó un programa de inmunización para compararlo con una formulación de HBsAg y la toxina del cólera (CT) (Figuras 5a-d). Se ensayaron varias dosis de antígeno y la inoculación generalizada de HBsAg en alúmina se utilizó también como referencia. El programa se llevó a cabo en ratones hembra Balb/c de 6 a 8 semanas de vida con cuatro inoculaciones los días 0, 14, 28 y 56. Se realizaron extracciones los días 26, 42 y 70. La evaluación de los sueros se realizó por ELISA convencional para la detección de anticuerpos IgG específicos de ratón. El suero se analizó 14 días después de la segunda, tercera y cuarta dosis.

Otro objetivo de este ensayo fue comparar la cinética de la respuesta inmunitaria humoral en los grupos implicados en el estudio.

Un análisis estadístico después de una segunda dosis no demostró diferencias significativas entre el grupo de referencia de alúmina (G4) y el grupo nasal con la misma cantidad de antígeno y acemanano (G1). El grupo de ratones inmunizados con CT como
adyuvante por vía nasofaríngea (G5) generó una respuesta al anticuerpo mayor que la del grupo con la cantidad menor de antígeno y no fue significativamente diferente de la del grupo con igual cantidad de vacuna (G2) (Figura 5a).

Después de tres inmunizaciones, no hubo diferencia significativa estadística entre el grupo de ratones inmunizados por vía intranasal y sistémica con 2 \mug (G1 y G4). De la misma forma, no hubo diferencia significativa entre el grupo de ratones inmunizado con CT como adyuvante (G5) y la formulación equivalente bajo ensayo (G2), ambos con 10 \mug de HBsAg (Figura 5b).

Teniendo en cuenta el fuerte aumento en los títulos de la segunda a la tercera dosis, los investigadores emprendieron la tarea de probar si este aumento siguió la misma pendiente para los diferentes grupos ensayados tras una cuarta dosis, aplicada un mes después de la tercera inoculación. Los resultados se presentan en la figura 5c.

Utilizando acemanano como adyuvante es posible obtener después de una cuarta dosis una respuesta que es mayor que la obtenida con CT en suero, como se demostró comparando G2 y G5.

La cinética de la respuesta presenta un aumento constante, que tras la tercera y cuarta dosis superó la respuesta generada por CT. Los niveles de anticuerpo generados por inoculación intranasal de 2 \mug de Ag por dosis (G1) fueron significativamente mayores que los obtenidos por la misma cantidad de antígeno administrada con alúmina por vía general (G4). Esta es la primera prueba de que es posible conseguir por inoculación nasofaríngea de antígenos inactivos en partículas, complementados con polisacáridos, respuestas que pueden exceder en cantidad y calidad la respuesta generada mediante inoculaciones generalizadas utilizando alúmina. Además, el hecho de que una respuesta fuerte de la mucosa fue inducida solamente por vía nasofaríngea, convierte en una posibilidad verdadera la eficacia y la inoculación de HBsAg humano potencialmente inocuo. Este es un caso especial de antígeno en partículas de naturaleza proteo-liposómica. Se pueden utilizar otros antígenos por esta vía, con el fin de alcanzar una respuesta generalizada de igual intensidad y mayor calidad. A partir de este resultado puede concluirse que podrían utilizarse con buenos resultados por vía intranasal otros antígenos derivados de levadura los cuales se adquieren generalmente en forma de partículas con un tamaño similar al HBsAg,.

Cuantificación de IgA en la vagina (día 70º)

Es de gran importancia alcanzar una respuesta de la mucosa si se considera que una de las vías de transmisión de la hepatitis B y de otras enfermedades es la sexual. Con el objetivo de comparar la respuesta vaginal de la IgA anti-HBsAg, se realizaron lavados vaginales con 100 de PBS después de 70 días de la primera inoculación y se analizó la respuesta al anticuerpo anti-IgA por un ELISA convencional. Los resultados se cuantificaron con relación a un lavado vaginal con un título elevado que sirvió como referencia positiva, por consiguiente se consideraron unidades relativas (RU) (Figura 5d).

En la mucosa vaginal de ratones inmunizados con alúmina como adyuvante por vía sistémica (grupo 4) no se detectó una respuesta a IgA anti-HBsAg. Este resultado apoya la importancia de la inmunización de la mucosa y específicamente de la potencia del adyuvante, capaz de generar más respuestas fuertes en los grupos 2 y 3 aún cuando la respuesta no sea estadísticamente significativa. Los niveles de anticuerpo alcanzados con 2 \mug y el polisacárido, no fueron estadísticamente diferentes de los alcanzados con 10 \mug y CT.

Ejemplo 6

Con el objetivo de demostrar la posibilidad de administrar antígenos a las mucosas se utilizó HBsAg para unir antígenos solubles por conjugación química a un péptido multiantigénico (MAP) Th-B, formado por el epítopo universal Th (830-843) de la toxina del tétanos y un péptido B del bucle gp 120 V3 del VIH. La inoculación intranasal se realizó como se describió anteriormente y se realizó también extracción de sangre por punción retro-orbital 42 días después de iniciar el programa. La determinación de los títulos se realizó mediante un ELISA con anti IgG específico para el péptido B. Se determinaron los títulos con relación a una referencia positiva y por lo tanto se consideraron unidades relativas (RU) (Figura 6).

En el grupo B no existió seroconversión. En el grupo A existió 100% de seroconversión, la presencia de dos ratones que responden mucho afecta la visibilidad del gráfico de los otros dos que fueron seroconvertidos pero con un título menor.

Aunque el MAP (40 \mug) estaba mucho más representado en el grupo B con respecto a lo que podía estar el mismo en 20 \mug del conjugado HBsAg-MAP (grupo A), no existió ninguna respuesta en el suero en el grupo B. Como criterios de seroconversión se consideraron los valores medios dobles de las densidades ópticas de referencias negativas (ratones inmunizados con 20 \mug de HBsAg por vía nasofaríngea). Este resultado demostró que el estado en partículas, más que la presencia de epítopos Th, desempeña una función importante en la respuesta al antígeno.

Como se conoce por la fisiología de la vía de inoculación, la división en partículas es importante, pero otros adyuvantes de la mucosa conocidos tal como CT subvierten esta necesidad. Por consiguiente se puede encontrar en la bibliografía numerosos ejemplos de actividad inmunológica potenciadora de CT para antígenos no en forma de partículas, entre ellos los péptidos sencillos. Este efecto no tiene lugar con el polisacárido sino con ayuda del estado en partículas.

Ejemplo 7

Se incorporó a los liposomas el polipéptido recombinante de la proteína Opc, una de las proteínas de la membrana externa de Neisseria meningitidis. Se evaluó su respuesta en ratones por vía nasofaríngea comparándola con la respuesta generada por el polipéptido soluble.

Se demostró inicialmente la actividad inmunológica potenciadora en el liposoma. Se inmunizaron dos grupos de ratones 10 Balb/c. El grupo A se inmunizó con 20 \mug de proteína encapsulada en liposomas y el grupo B se inmunizó con 20 \mug de la misma preparación añadiendo acemanano a una concentración final de 6 mg/ml. Se evaluó la respuesta humoral en el nivel general y en lavados pulmonares.

Se midieron concentraciones de IgG por ELISA y se representaron como logaritmos de las unidades arbitrarias asignadas a cada suero. El grupo B presentó las concentraciones mayores de IgG en el suero, la diferencia fue estadísticamente significativa (Figura 7a). Este experimento demostró la capacidad del acemanano para potenciar la respuesta inmunitaria a las formulaciones liposómicas.

Se diseñó un segundo experimento para comparar el efecto potenciador del polisacárido sobre la proteína Opc en los liposomas (A) y sobre la proteína Opc renaturalizada en 10 mg/ml de octil-glucósido (B). La utilización de este detergente aumentó el reconocimiento de la proteína por cuatro anticuerpos monoclonales específicos para la proteína natural Opc. Dos de estos anticuerpos reconocen epítopos conformacionales y los otros dos epítopos lineales. Según los criterios de reconocimiento por anticuerpos monoclonales, la proteína Opc renaturalizada con octil-glucósido presenta una conformación más próxima a la proteína natural.

Se inmunizaron por vía intranasal dos grupos de ratones 10 Balb/c. Se cuantificaron los niveles de anticuerpo en el suero y en los lavados pulmonares y se representaron como logaritmos de las unidades arbitrarias asignadas a cada muestra (figura 7b).

En el suero, así como en las irrigaciones de la mucosa, se observó que la combinación de los liposomas con el polisacárido hacía los títulos de inmunoglobina más altos y menor la dispersión en la respuesta. El acemanano potencia de manera significativa la respuesta al antígeno cuando es presentado al sistema inmunitario por el liposoma (sistema de administración para antígenos en partículas).

Ejemplo 8

Con el objetivo de analizar cuantitativamente la respuesta, se cuantificaron los niveles de IgG1, 2a y 2b por un ELISA convencional, utilizando conjugados anti IgG1, 2a y 2b específicos. En el experimento se compararon las respuestas obtenidas con acemanano como adyuvante por vía IN (IN/Aloe) con el antígeno inoculado por vía intraperitoneal en polisacárido y oxalato de calcio (IP/Aloe) y con la respuesta obtenida utilizando adyuvante de alúmina (IP/alúmina) como referencia (Figura 8a).

El aumento de los niveles de anticuerpo IgG2a relacionados con el grupo inmunoestimulante en estudio, permite la utilización de este tipo de formulaciones en el campo de las vacunas preventivas y terapéuticas que requieren una respuesta celular intensa.

De acuerdo con lo que se ha indicado anteriormente, es posible alcanzar un aumento del nivel de respuesta inmunitaria al antígeno de superficie mediante un aumento en el nivel de IgG2a e IgG2b.

Entre los elementos que pueden ser determinantes para obtener una respuesta inmunitaria protectora se incluyen no solamente los que están en relación con su intensidad sino también con su calidad, es decir, el tipo de respuesta que se genera como resultado de la inmunización. En los últimos años uno de los tópicos que se tratan más frecuentemente en inmunología es el tipo de respuesta a los linfocitos T cooperadores (Th 1/Th 2). Muchos autores han demostrado que la respuesta eficaz para los patógenos intracelulares y los virus es el tipo Th 1, que se correlaciona con la respuesta citotóxica y con un aumento en la subclase IgG2a con respecto a las demás subclases.

Con el objetivo de analizar si existe el mismo rendimiento para los antígenos físicamente diferentes se realizó un programa de inmunización utilizando un polipéptido multiepitópico (TAB9), integrado por zonas del bucle V3 del virus de inmunodeficiencia humana (VIH). La cuantificación de inmunoglobulinas anti TAB9 se realizó por un análisis ELISA convencional para la determinación de subclases de IgG. Se inocularon 10 \mug de la proteína por vía intraperitoneal con diferentes adyuvantes (Figura 8b).

Según los resultados presentados se demuestra un desplazamiento del equilibrio Th 1/Th 2 hacia el tipo de respuesta Th 1. El nivel de IgG2b con la combinación acemanano/oxalato es mayor que el generado utilizando Quil A. Este resultado es una nueva pieza de conocimiento para la formulación así como para el polisacárido y permite su utilización no solamente para potenciar respuestas sino también para modular las respuestas hacia Th 1, que es un requisito de inmunidad para un gran número de patógenos y el cán-
cer.

Descripción de las figuras

Figura 1. Cromatografía HPLC. AD: Azul de dextrano (2.000 kDa), M: muestra, VET: Volumen de elución total. Procesador cromatográfico con BioCROM versión 2.3 (1994). Detector: Índice de refracción (Knauer). Gel: TSK G6000PW (intervalo de fraccionamiento: 500 a 50.000 kDa). Dimensiones: 7,5 \times 600 mm. Caudal: 0,5 ml/min. Tampón: PBS. Volumen de muestra aplicada: 100 \mul.

Figura 2a. Programa de 2 dosis (0, 14 días) y extracción a los 28 días.

Figura 2b. Programa de una dosis y extracción a los 28 días.

Figura 3. Programa de una dosis por vía intraperitoneal y extracción a los 28 días.

Figura 4. Programa de 0 y 14 días y extracción a los 28 días.

Figura 5a. Evaluación del suero después de una segunda dosis.

Figura 5b. Evaluación del suero después de una tercera dosis.

Figura 5c. Evaluación del suero después de una cuarta dosis.

Figura 5d. Evaluación de las irrigaciones vaginales (día 70).

Figura 6. El programa utilizado fue 0, 14 y 28 y extracción a los 42 días. A: 20 \mug de HBsAg conjugado con A: MAP+polisacárido (6 mg/ml), B: 40 \mug de MAP+polisacárido (6 mg/ml).

Figura 7a. Programa de tres dosis: 0, 28 y 56 y extracción a los 63 días.

Figura 7b. Programa de tres dosis: 0, 28 y 56 y extracción a los 63 días.

Figura 8a. Programa de tres dosis 0, 14 y 28 y extracción a los 42 días. Se agruparon los sueros de cada variante con fines analíticos. La dilución de trabajo de las muestras fue 1:4.000.

Figura 8b. Programa de tres dosis 0, 14 y 28 y extracción a los 42 días. Se presenta la media geométrica de los títulos después de la inmunización con la preparación multiepitópica de TAB9 con diferentes adyuvantes.

Claims (9)

1. Una formulación de vacuna nasofaríngea que comprende un antígeno en forma de partículas en estado soluble y el polisacárido acemanano como adyuvante.

2. Una formulación de vacuna nasofaríngea según la reivindicación 1, en la que el acemanano es una fracción o el extracto total de las hojas de Aloe barbadensis Miller.

3. Una formulación de vacuna nasofaríngea según la reivindicación 1 o 2, en la que la concentración de acemanano está en el intervalo de 1 a 12 mg/ml.

4. Una formulación de vacuna nasofaríngea según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho antígeno en forma de partículas en estado soluble es HBsAg (antígeno de superficie de la hepatitis B).

5. Una formulación de vacuna nasofaríngea según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho antígeno en forma de partículas en estado soluble es el antígeno de superficie de la hepatitis B conjugado con un péptido multiantigénico Th-B.

6. Una formulación de vacuna nasofaríngea según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho antígeno en forma de partículas en estado soluble es la proteína 5C de la membrana externa de Neisseria meningitidis incorporada a los liposomas.

7. Utilización de acemanano para la preparación de una formulación de vacuna destinada a la vacunación de un ser humano o un animal por administración nasofaríngea, comprendiendo dicha formulación un antígeno en forma de partículas en estado soluble y el polisacárido acemanano como adyuvante.

8. Utilización de acemanano según la reivindicación 7, en la que dicha formulación de vacuna está destinada al tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad en un ser humano o un animal.

9. Un procedimiento para la preparación de una formulación de vacuna nasofaríngea que comprende un antígeno y un adyuvante, en el que el antígeno en forma de partículas en estado soluble se utiliza como antígeno y el polisacárido acemanano se utiliza como adyuvante.