JPH04506662A - 接合体ワクチンのためのサイトカイニンおよびホルモンのキヤリヤー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サイトカイニンおよびリンホカイン、例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＦＳ 、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ− ７は、免疫応答の修飾において異なる活性を有することが示された。ホルモンお よび成長因子は、また、免疫系の細胞に対して変調効果を有し、こうして免疫応 答を変調することができる。インターフェロン、ＩＬ−１およびＩＬ−２は抗原 またはミトゲン刺激Ｔ細胞の増殖および分化を増加させる。それらは、また、Ｂ 細胞を刺激して成長させそして抗原に対して抗体の応答を発生させる。いったん 活性化されると、Ｂ細胞はＩＬ−２レセプターを発現することが示された。ある 数の合成を組み換えリンホカイン［ネンチオニ（Ｎｅｎｃｉｏｎｉ）ら、ジャー ナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ）、ｌ旦ユニ８００−８０４　 （１９８７）；クロンヘイム（Ｋｒｏｎｈｅｉｍ）ら、米国特許第４．８０１， ６８６号；タグリアブエ（Ｔａｇｌ　１ａｂｕｅ）ら、米国特許第４．７７４， ３２０号：フェルカンデス（Ｆｅｒｎａｄｅｓ）ら、米国特許第４，６０４，３ ７７号］は免疫機能を刺激することが示された。しかしながら、炎症および毒性 作用は、しばしば、有機体へのサイトカイニンまたはリンホカインの免疫治療的 投与を伴う。さらに、これらは一般に短い半減期を有する。

ある種のサイトカイニンおよびリンホカインはアジュバント活性を有し、これに より抗原に対する免疫応答を増強することが示された。例えば、ナカムラらはイ ンターフェロン−ガンマがいくっがの抗原に対する抗原の形成を２〜５倍増強す ることを実証した。ナヵムラら、ネイチャ（Ｎａｔｕｒｅ）３０７：３８１−３ ８２　（１９８４）、ネンチ才二（Ｎｅｎｃｉｏｎｉ）ら、ジャーナル・オブ・ イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ）、１旦９：８００−８０４　ｃｘ９ｓ７） ；ホワード（Ｈ。

ｗａ　ｒ　ｄ）ら、欧州特許（ＥＰ）２８５４４１号。

免疫原性が低い胸腺独立的抗原、例えば、多糖に対する抗体の応答の刺激は、近 年、強い胸腺依存性タンパク質抗原に多糖を共有カップリングすることによって 達成された。ある数のタンパク質、例えば、ジフテリアのトキソイド、破傷風の トキソイドおよびジフテリアの毒素の無毒の変異型、ＣＲＭ　１９□、は多糖の キャリヤーとして使用される。免疫応答はキャリヤーとして使用するタンパク質 の型に依存して高度に可変性である。

ある数の接合体が、タンパク質、例えば、リンホカインを安定化および可溶化す るために従来記載されてきている。モアランド（Ｍｏｒｅｌａｎｄ）およびニテ ッキ（Ｎｉｔｅｃｋｉ）（米国特許第４．　７４５゜１８０号１９８８年５月１ ７日）は、ヘパリン断片に共有接合したβ−インターフェロン、インターリュー キン−２またはイムノトキシンからなる製剤学的組成物を記載している。この接 合体は、その非接合形態で本質的に不溶性であるタンパク質を可溶化する手段を 提供する。

シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら（米国特許第４，７７２，６８５号、１９８８ 年９月２０日）は、高分子量のキャリヤーのタンパク質への■Ｌ−１誘導ペプチ ドの免疫原性接合体を記載している。ＩＬ−２またはインターフェロンおよび水 溶性ポリマー（ポリエチレングリコール）の接合体は記載された［カトレ（Ｋａ ｔｒｅ）およびフナラフ（Ｋｎａｕｆ）、米国特許第４，７６６．１０６号、１ ９８８年６月２３日およびＷＯ３７０００５６，１９８７年、１月１５日］。同 様に、ガーマン（Ｇａｒｍａｎ）［欧州特許（ＥＰ）１．８３５０３号、１９８ ６年６月４日］は、リンホカインの持続した解放について水溶性ポリマーへ結合 したインターフェロンまたはＩＬ−２の接合体を記載している。ホルモンおよび 成長因子およびそれらのレセプターについての背景は、例えば、次の文献を参照 、ヒル（Ｈｉｌｌ）、Ｄ、Ｊ、　、Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　８ ５ニア２３−７３４　（１９８９）；０ウパス（Ｒｏｕｐａｓ）ら、Ｍｏ１．Ｃ ｅ１ｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６１：１−１２３　（１９８９）。

発明の要約 本発明は、免疫原性接合体および免疫原性接合体を含有するワクチン組成物に関 する。接合体は、免疫変調活性を有するサイトカイニン、リンホカイン、ホルモ ンまたは成長因子結合した抗原（常態でサイトカイニン、リンホカイン、ホルモ ンまたは成長因子とアソシエーションしない）、ことに炭水化物を含有する抗原 からなり、ここでサイトカイニン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因子は抗 原の免疫原活性を変調する。

サイトカイニンまたはリンホカインは、インターリューキン、例えば、インター リューキン−１α、インターリューキン−１β、インターリューキン−２、イン ターフェロン、例えば、インターフェロンガンマ、または免疫変調活性を有する 他のサイトカイニンまたはリンホカインであることかできる。ホルモンまたは成 長因子は、例えば、ウシ、ブタまたはニワトリ由来であることができ、そして腫 瘍壊死因子（ＴＮＦ）　、ブ球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣ８Ｆ） 　、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣ５Ｆ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１ ）　、ソマトトロピンまたはインスリン、またはそのレセプターが免疫系の細胞 上で発現される任意の他のホルモンまたは成長因子であることができる。

本発明は、さらに、動物に免疫原性量のワクチン組成物を投与することからなり 、前記ワクチン組成物は製剤学的に許容されうる賦形剤および任意のアジュバン トの中の本発明の免疫原性接合体からなる、免疫応答を引き出す方法に関する。

免疫原性接合体は製剤学的に許容されうる賦形剤および任意のアジュバント中で 、同時に投与する抗原と混合して、接合した抗原および混合した抗原の両者にに 対する免疫応答を引き出すために使用できる補助ワクチンを生成し、前記同時に 投与する抗原はその抗原を誘導する有機体と同一であるか、あるいは異なる有機 体からの接合体、複合体または混合物であることができる。

図面の簡単な説明 第１図は、粗製のポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）−ｒｂＩＬ− ２接合体と比較して非接合組み換えヒトＩＬ−２（ｒｈｌＬ−２）の高圧液体ク ロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）の分析を示す。

第２図は、出発反応におけるＰＲＰ対ｒｈｌＬ−２の２　：　１　（ｗ／ｗ）比 におけるＰＲＰ−ｒｈ　Ｉ　Ｌ−２接合体のクロマトグラツムを示す。

第３図は、ＰＲＰを添加しないで接合手順を実施した、ｒｈＩＬ−２のモック接 合体のクロマトグラツムを示す。

第４図は、ＰＲＰに対するモノクローナル抗体を使用して検出した、選択した接 合体のイムノプロットを示す。左から右に、レーンは次のものを含有する：　Ｐ ＲＰ−ＣＲＭ、ｒｈＩＬ−２、ＰＲＰ、ＰＲＰ−ｒｈＩ　Ｌ−２（２ｘ）　、Ｐ ＲＰ−ｒｈ　Ｉ　Ｌ−２（２Ｘ）　、ブランク、ＰＲＰ−ｒｈ　Ｉ　Ｌ−２（２ ０Ｘ）　、およびＰＲＰ−ｒｈＩＬ−２（２０Ｘ）。

第５図ａ　−Ｃは、（ａ）非接合組み換えウシＩ　Ｌ−２（Ｂ　ｒ　ｒ　Ｌ−２ ）、（ｂ）　ＰＲＰ−Ｂｒ　Ｉ　Ｌ−２（２二１）接合体および（ｃ）ＰＲＰ− Ｂｒ　ＩＬ−２（２０：　１）接合体のＨＰＬＣ分析を示す。

第６図は、ＰＲＰ−Ｂ　ｒ　Ｉ　Ｌ−２ワクチンのウェスタンプロット分析を示 す。プロットはモノクローナル抗ＰＲＰ抗体（Ｅ１１７−５）またはポリクロー ナル抗Ｂｒ■Ｌ−２抗体を示したように使用して展開した。

第７図は、ＢＴ−２バイオアツセイにおけるＢｒＩＬ−２とＰＲＰ〜Ｂｒ１Ｌ− ２接合体との生物学的活性の比較である。

発明の詳細な説明 本発明は、サイトカイニン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因子に結合した 抗原、とくにタンパク質、ペプチド、オリゴ糖または多糖または他の炭水化物を 含有する抗原からなる免疫原性接合体に関する。抗原をサイトカイニン、リンホ カイン、ホルモンまたは成長因子に接合すると、抗原への免疫応答を修飾するこ とができる免疫原性接合体が得られる。免疫原性の修飾に加えて、接合体の抗原 性成分はサイトカイニン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因子を安定化する ことができる。

サイトカイニン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因子は抗原に対する免疫応 答を変調する機能をし、そして抗原はサイトカイニン、リンホカイン、ホルモン または成長因子の生物学的活性を安定化する。サイトカイニン、リンホカイン、 ホルモンまたは成長因子は、インターリューキン、例えば、インターリューキン −１α、インターリューキン−１β、インターリューキン−２、インターフェロ ン、例えば、インターフェロンガンマ、または免疫変調活性を有する他のサイト カイニンまたはリンホカインであることができる。免疫変調活性を有するサイト カイニンまたはリンホカインの一部分または突然変異タンパク質またはミミク（ ｍｉｍｉｃ）を、また、使用することができる。好ましくは、リンホカインはイ ンターリューキン−２である。ホルモン、成長因子またはその免疫変調部分は、 例えば、ウシ、ブタまたはニワトリ由来であることができ、そして腫瘍壊死因子 （ＴＮＦ）　、プロラクチン、表皮成長因子（ＥＧＦ）、組織成長因子（ＴＧＦ ）　、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣ８Ｆ）、顆粒球コロニー 刺激因子（ＧＣＳＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、ソマトトロピン （成長ホルモン）またはインスリン、またはそのレセプターが免疫系の細胞上で 発現される任意の他のホルモンまたは成長因子であることができる。

サイトカイニン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因子は任意の適当な源から 得ることができる。それらは組み換えＤＮＡ方法により生成することができる。

例えば、いくつかのヒトインターフェロンをエンコードする遺伝子を種々の宿主 合成においてクローニングおよび発現して、大量の純粋なインターリューキンの 産生が可能となった。さらに、ある種のＴリンパ球系統は高いレベルのインター リューキンを産生し、こうしてリンホカイン源を提供する。

抗原または非炭水化物の抗原を含有する炭水化物は、免疫応答を望む任意の源か ら誘導することができる。炭水化物を含有する抗原または他の抗原は、それ自体 免疫原性ないか、あるいは弱く免疫原性であるが、サイトカイニン、リンホカイ ン、ホルモンまたは成長因子への接合により免疫原性またはそれ以上となること ができるものであることができる。

抗原を含有する炭水化物はオリゴ糖、多糖、ペプチドグリカンおよびグリコペプ チドであることができる。問題の炭水化物を含有する抗原の例は、次のものを包 含する：バクテリアの莢膜ポリマー、リポ多糖またはリポ多糖の成分。自己免疫 関係抗原、アレルゲン、腫瘍関連抗原、菌類およびウィルスの抗原、ホルモンお よびバクテリアの細胞壁成分、例えば、ペプチドグリカンまたはそれらの断片。

バクテリアの莢膜のポリマー、オリゴマーおよびそれらの断片は、ワクチンにお いて有効に使用される可能性を有するが、若いヒトにおいて弱く免疫原性である のみの抗原のグループに入る。この出願において使用するとき、用語「莢膜のポ リマーＪは、糖を含有するポリマー、例えば、糖、糖酸、アミノ糖、および糖ホ スフェートのポリマーを意味する。

これらの「莢膜のポリマー」はしばしば医学の文献において「莢膜の多糖」と呼 ばれるが、それらはグリコシド結合以外の結合および糖、例えば、上に列挙した ちの以外の成分を含有することがある。

莢膜のポリマー（ＣＰ）は多数の異なる型のバクテリアから誘導することができ る。これらの型は次のものを包含する：インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ ｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、連鎖球菌層（Ｓ　ｔ　ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ）種、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅ）（とくに血清型１．４．５．６Ａ。

６Ｂ、９Ｖ、１４．１８Ｃ１１９Ｆ１および２３Ｆ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅ ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびストレプトコックス噛アガラク チアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ ｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｆｎｇｉｔｉｄｊｓ）（例えば、血清型ａＳｂおよび Ｃ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎ　ｉ　ａｅ）　、緑膿菌 （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）および黄色ブドウ球菌（Ｓ ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）。

バクテリア以外のポリマーは酵母および菌類、例えば、クリプトコックス・ネオ フォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、または癌 細胞上に独特に見いだされる炭水化物を含有するユニットまたはアレルゲンに関 連して見いだされるものから誘導することができる。

本発明の接合体は、炭水化物を含有する抗原または他の抗原をキャリヤーへカッ プリングするためにこの分野において知られている生物学的に適合性の任意の方 法により調製することができる。カップリングの方法は最も好ましくは共有カッ プリングであり、これにより炭水化物を含有する抗原または他の抗原はサイトカ イニン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因子に直接結合される。しかしなが ら、抗原をサイトカイニン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因子に接合する 他の手段は本発明の範囲内に包含される。多数のこのような方法は、炭水化物を 含有する抗原または他の抗原をキャリャーヘカップリングするために現在入手可 能である。はとんどの方法はアミンまたはアミドの結合をつくるか、あるいはあ る場合においてチオ−エステルをつくる。炭水化物を含有する抗原をサイトカイ ニン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因子に結合する１つのと（に好ましい 方法は、次の米国特許に記載されている還元的アミン化による：米国特許第４， ６７３，５７３号（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｐ、Ｗ、）　、１９８７年６月１６日発 行、および米国特許第４゜７６１．２８３号（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｐ、Ｗ、）　 、１９８８年８月２日発行、それらの教示を引用によってここに加える。

本発明の接合体を使用して、抗原、例えば、炭水化物を含有する抗原またはサツ カリドに対する免疫応答を温血動物において引き出すことができる。この方法は 、ワクチン組成物の中のサイトカイニン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因 子に結合した炭水化物を含有する抗原からなる接合体の免疫学的に有効な投与量 を動物に投与することからなる。

ワクチン組成物は微生物の感染の防止に有用である。接合体は製剤学的に許容さ れうる賦形剤、例えば、生理学的塩類溶液、またはエタノールポリオール（例え ば、グリセロールまたはポリプロピレングリコール）と混合して投与することが できる。ワクチン組成物は、必要に応じて、次のものを含むことができるニアシ ュバント、例えば、植物油またはその乳濁液、表面活性物質、例えば、ヘキサデ シルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、オクタデシルアミン、リソレクチ ン、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムプロミド、Ｎ、Ｎ−ジオクチデシル −Ｎ−Ｎ′　ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキ サデシルグリセロール、およびプルロニックポリオール：ポリアミン、例えば、 ビラン、デキストラサルフエート、ポリ■Ｇ１カルボポル；ペプチド、例えば、 ムラミルジペプチド、ジメチルグリジン、ツフッシン：免疫刺激複合体（ＩＳＣ ＯＭＳ）：油孔濁液；およびミネラルゲル。本発明の接合体は、また、リポソー ムまたはｌＳＣ０Ｍ５の中に混入することができる。補助的活性成分をまた使用 できる。接合体は、また、ミネラルゲル懸濁液、例えば、間管、すなわち、水酸 化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム上に吸着して、炭水化物を含有する抗 原に対する免疫応答をさらに変調することができる。

ワクチンはヒトまたは動物に種々の方法で投与することができる。これらは皮肉 、経皮（例えば、ゆっくり解放するポリマー）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下 、経口的および鼻内のルートの投与を包含する。このようなワクチンにおける接 合体の使用量は、使用する炭水化物を含有する抗原または他の抗原の同一性に依 存して変化するであろう。現在の接合体ワクチンへの適合のために伝統的キャリ ヤーとともに使用する確立された投与量の範囲の調節および操作は、当業者の能 力の範囲内である。本発明の接合体は、未成熟および大人の両者の温血動物、と （に人間の処置における使用を意図する。本発明の方法および接合体の使用は予 防の応用に限定されない：治療の応用（例えば、エイズの予防または治療）、な らびに成長、生産性または再生集中される免疫が考えられる。

インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）により引 き起こされる髄膜炎に対するワクチン接種において有用であるワクチン組成物は 、インターリューキン−２に接合したインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ ｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型のオリゴマーのポリリボシルリビトールホスフ ェート（ＰＲＰ）からなるであろう。

米国におけるバクテリアの髄膜炎は、最も普通にインフルエンザ菌（Ｈｉｎｆ　 Ｉｕｅｎｚａｅ）ｂ型により引き起こされる。

本発明の免疫原性接合体は、同一であるか、あるいは異なる有機体からの抗原決 定基または抗原と製剤学的に許容されうる賦形剤または任意のアジュバント中て 混合して、接合した抗原および混合した非接合抗原の両者に対する免疫応答を引 き出すために使用することができる補助ワクチン組成物を生成することができる 。

本発明の補助ワクチン組成物において使用できる適当な抗原は、粒状抗原、例え ば、バクテリア、ウィルス、寄生体または菌類および細胞の微小成分および可溶 性抗原、例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモンおよび糖タンパク質を包含す る。とくに興味ある抗原は、ウィルス、菌類、寄生体またはバクテリアの抗原、 アレルゲン、自己免疫関係抗原、または腫瘍関連抗原である。抗原は自然源から 得ることができるか、あるいはそれらは組み換えＤＮＡ技術または他の人工的手 段により産生ずることができる。

問題のバクテリアの抗原の例は、次のものを包含するが、これらに限定されない ヒトのバクテリアの病原体とアソシエーションしたものである：例えば、分類可 能なおよび不可能なインフルエンザ菌（Ｈａｅｍ。

ｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓ　ｃｈｅ　ｒ　ｉ　ｃｈ ｉａ　ｃｏ］ｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉ’ｎｇｉｔｉｄｉ ｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、 化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カタル球菌 （’Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌ　ｉ　ｓ）　、コレラ！（Ｖ ｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ　ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈａ ｅａｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、緑膿菌（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐ ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　 ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎ ｉ）。いくつかの特定の抗原は、次のものを包含する２バクテリアの表面および 外膜のタンパク質［例えば、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎ ｆｌｕｅｎｚａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｔｔｉｄｉ ｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇ。

ｎｏｒｒｈａｅａｅ）またはカタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒ ｒｈａｌｉｓ）］およびバクテリアの表面タンパク質Ｕ例えば、化膿連鎖球菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＭタンパク質］。

病原性ウィルスからのウィルスの抗原は次のものを包含するが、これらに限定さ れない：ヒト免疫欠損ウィルス（■およびＩＩ型）、ヒトＴ細胞白血病ウィルス （ＬＩＩおよびＩＩＩ型）、ＲＳウィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、非 Ａ型および非Ｂ型肝炎のウィルス、単純ヘルペスウィルス（ＩおよびＩＩ型）、 サイトメガロウィルス、インフルエンザウィルス、パラインフルエンザウィルス 、ポリオウィルス、ロタウィルス、コロナウィルス、ルベラウィルス、はしかウ ィルス、ヴアリセラ、エプスタイン−バーウィルス、アデノウィルス、乳頭腫ウ ィルスおよび黄熱病ウィルス。

これらの病原性ウィルスのいくつかの特定のウィルスの抗原は、Ｆタンパク質（ ことにＦペプチド２８３−３１５を含有する抗原、ＷＯ３９１０２９３５、発明 の名称ｒＲＳウィルス：ワクチンおよび診断のアッセイ」、発明者Ｐａｒａｄｉ ｓｏ、Ｐ、ら）およびＲＳウィル７、（Ｒ８Ｖ）のＮおよびＧタンパク質、ＶＦ ６　（ＶＦ６として従来知られている）、ロタウィルスのＶＦ６およびＶＰ７ポ リペプチド、ヒト免疫欠損ウィルスのエンベロープ糖タンパク質およびＢ型肝炎 の表面および前表面抗原およびヘルペス糖タンパク質ＢおよびＤ０菌類の抗原を 誘導することができる菌類は、次のものを包含するが、これらに限定されない： カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種（ことにａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコックス （Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種（ことにｎｅｆｏｒｍａｎｓ）、プラストムセ ス（Ｂｌａｓ　ｔｏｍｙｃｅｓ）種（例えば、ｄｅｒｍａｔｉｔｄｉｓ）、ヒス トプラスｖ（Ｈｉｓｔｒｏｐｌａｓｍａ）種（ことに１ｍｍ１ｔｉｓ）、バラコ ツシトロイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｒｏｉｄｅｓ）種（ことにｂｒａｓｉｌ ｉｅｎｓｉｓ）およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ　Ｉ　１ｕｓ）種。寄生 体の抗原の例は、次のものを包含するが、これらに限定されない：プラスモジウ ム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、エイメリア（Ｅ　ｉｍｅ　ｒ　ｉ　ａ）種、シ ストツマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）種、ｌ・リバノソマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏ ｍａ）種、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）種、レイシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎ ｉａ）種、クリプトポリシア（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａ）種、トキソブラ ズ？　（Ｔｏｘｏｐ　Ｉ　ａｓｍａ）種およびニューモススチス（Ｐｎｅｕｍｏ ｃｙｓ　ｔ　ｉ　ｓ）種。

自己免疫病、例えば、慢性関節リウマチおよびエリテマトーデスに関連する種々 の抗原はまた重要である。

免疫応答の変調はある数の重要な関係を有する。例えば、サイトカイニン、リン ホカイン、ホルモンまたは成長因子のアジュバントの作用は、ワクチン接種した 有機体における接合体の抗原性部分に対して産生された保護的抗体の濃度を増加 することができる。同様に、接合体と同時に投与された抗原に対する抗体の産生 を増加することができる。その結果、有効な（すなわち、保護的）ワクチン接種 は、通常要求されるより少ない量の接合した抗原および／または同時に投与され た抗原で達成することができる。接合された抗原および同時に投与された抗原の 要求される量の減少は、調製が困難であるか、あるいは経費を必要とするか、あ るいは免疫原的に弱いワクチンの使用をいっそ広くすることができる。これは流 行病、例えば、マラリアおよびコレラに直面しなくてはならない、非常に限られ た医療の予算の、開発途上国の国民において真実である。

それは、また、抗原が有効な免疫化のために通常要求される濃度で毒性であると き、より安全なワクチン接種を提供することができる。抗原の量を減少すること によって、毒性反応の危険は減少する。

他の応用は、また、ホルモンを包含する細胞の修飾因子の安定性またはそれらと それらの対応するレセプターまたは結合性成分による相互作用を刺激または阻害 する免疫応答を引き出すことを包含することができる。この方法において、免疫 応答を使用して成長、再生、分化、および全体の性能を阻害／増強することがで きる。あるいは、免疫応答の量は操作して所望の保護的応答を最適化することが できる。

本発明の特定の実施態様において、ＩＬ−２接合体は追加の利点を有する；特定 のＢおよびＴ細胞への炭水化物を含有する抗原または他の結合はＢおよびＴ細胞 のインターリューキンのレセプターの付近にＩＬ−２を集中させる。

サイトカイニン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因子は、それらの免疫変調 活性により、限界的にまたは非免疫原性の接合した抗原および結合した非接合抗 原に対して保護的免疫応答を引き出すことを促進することができる。このように して、より大きいタンパク質の断片、合成抗原または組み換えＤＮＡ技術の産生 物を含有するワクチン組成物は、本発明の接合体との混合によりより効力のある ものとすることができる。

典型的には、ワクチン接種の養生法は「保護的」免疫応答を刺激するために敗退 または数か月にわたる抗原の投与を必要とする。保護的免疫応答は、ワクチンを 向ける特定の病原体または複数の病原体による産生的感染から、免疫化した有機 体を保護するために十分な免疫応答である。

炭水化物を含有する抗原または他の抗原は、サイトカイニン、リンホカイン、ホ ルモンまたは成長因子に接合し、そして必要に応じて同一であるか、あるいは異 なる有機体からの抗原と同時投与するとき、保護的免疫応答の発生を修飾するこ とができる。これは有効なワクチン接種の養生法の時間経過を減少する。さらに 、本発明の免疫原性接合体からなるワクチン配合物は、ワクチン配合物の調製、 輸送および貯蔵を可能とするために十分な期間の間安定である。

用語抗原の使用は、全抗原またはその抗原決定基の１つを意味し、そしてまた本 発明の接合体の存在のために免疫応答の増加により有益でありうるハプテンの分 子を包含することを、上の説明から、理解すべきである。抗原の上のリストは例 示のみを目的とする。本発明の補助ワクチン組成物において使用することができ る追加の抗原は、当業者により容易に確認することができる。

さらに、次の非限定的実施例によって、本発明をさらに説明する。

組み換えヒトｒｈｌＬ−２（１ｍｇの凍結乾燥物、Ｃｅｔｕｓ、カリフォルニア 州エメリイビレ）を３００μｌの蒸留水で再構成し、そして１００μＩのアリコ ートに分割した。各１００μｌのアリコートは３３３μｇのｒｈｌＬ−２を含有 した。

ＰＲＰのオリゴ糖（重合度２０＋Ｄｐ２０）を、次の３つの反応条件に従い、還 元的アミン化［アンダーリン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）Ｐ、Ｗ。

の米国特許第４．６７３．５７４号、１９８７年６月１６日発行、および米国特 許第４．７６１，２８３号、１９８８年８月２日発行）により、ＰＲＰ対ｒｈＩ Ｌ−２の２＝１または２０：１重量比でｒｈＩＬ−２上にカップリングした（開 始反応において）：反応１ 第１反応において、１００μｍのｒｈｌＬ−２を２モルの重炭酸塩の緩衝液ｐＨ ９，６（５μｍ）と混合し、これは反応混合物をｐ）（ｓ、５とした。シアノホ ウ水素化ナトリウム（脱イオン水の中の５７ｍｇ／ｍＬ２μｌ）を添加し、そし てこの溶液を３０℃で２４時間貯蔵した。

区座ｌ ｒｈ　ＩＬ−２（１００μ＋、３３３μｇ）をインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐ ｈｉ　ｌｕｓ　ｉｎｆ　Ｉｕｅｎｚａｅ）ｂ型オリゴ糖の凍結乾燥したＰＲＰ　 （Ｈｂｏ）（ＷＷ−２−６５，６００μｇ）と混合した。重炭酸塩の緩衝液２モ ルｐＨ９，２（５μｌ）を添加して反応混合物をｐＨ８，５とした。シアノホウ 水素化ナトリウム（脱イオン水の中の５７ｍｇ／ｍｌ、２μｌ）を添加し、そし てこの溶液を３７℃で２４時間貯蔵した。

区座旦 ｒｈＩＬ−２（１００μｌ、３３３　ｔｔ　ｇ）を凍結乾燥したＨｂｏ（ＷＷ− ２−６５，６，０ｍｇ）と混合した。重炭酸塩の緩衝液２モルｐＨ９、２（５μ Ｉ）を添加して反応混合物をｐ）Ｉｓ、５とした。シアノホウ水素化ナトリウム （脱イオン水の中の５７ｍｇ／ｍＬ　２μＩ）を添加し、そしてこの溶液を３７ ℃で２４時間貯蔵した。

２４時間後、反応混合物の各々をｓ、ｏｏｏ分子量の膜を使用して数回交換した 生理的塩類溶液に対して透析して、無機のイオン、例えば、シアンイオンを除去 した。粗製反応混合物のＨＰＬＣ分析をウルトラヒドロゲル（Ｗａ　ｔ　ｅ　ｒ 　ｓ、マサチュセッツ州ミルフォード）のカラム１２５／２５０でリン酸塩緩衝 液中で実施すると、非接合ｒｈｌＬ−２に比較して、タンパク質成分（接合した ｒｈＩＬ−２）の大きさは増加することが示された（第１図）。

第１図は、ＰＲＰ対ｒｈＩＬ−２の２０：１の比において、ＰＲＰ−ｒｈｌＬ− ２の粗製接合体混合物のＨＰＬＣクロマトグラフムを示す。

この混合物をリン酸塩緩衝液生理的塩類溶液の中のウルトラヒドロゲルのカラム で分析した。第２図および第３図は、それぞれ、ＰＲＰ対ｒｈＩＬ−２の２＝１ の比のＰＲＰ　−ｒ　ｈ　Ｉ　Ｌ−２についておよびモック接合体についてのＨ ＰＬＣクロマトグラフムを示す。

次いで、粗製接合体を、ドツトプロット分析により、モノクローナル抗ＰＲＰ抗 体（Ｅ１１１７−５：Ｌａｂ　５ｅｒｖｉｃｅ、Ｐｒａｘｉｓ　Ｂｊｏｌｏｇｉ ｃｓ、Ｉｎｃ、、ニューヨーク州ロチェスター）を使用してＰＲＰのｒｈＩＬ− ２へのカップリングについて試験した。１または２モルの接合体をニトロセルロ ース紙上に適用し、そして室温において１０分間空気乾燥した。この紙をＢＬＯ ＴＴＯ（１０ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝化生理的塩類溶液ｐＨ７，２，１ ５０ミリモルのＮａＣｌ中の５％の非脂肪乾燥ミルク）でブロッキングした。プ ロットをモノクローナル抗ＰＲＰ抗原と反応させた。ＢＬＯＴＴＯでよく洗浄し た後、プロットをＨＰＲ−ヤギ抗マウス抗体と反応させた。プロットを０．０１ ％の過酸化水素；０．０６％の４−クロロ−１−ナフトールを含有する溶液（Ｓ ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、ミゾリー州セントルイス）で展開した。

ｒｈｌＬ−２またはＰＲＰ単独は反応性を示さず、そしてＰＲＰ　−ｒ　ｈ　Ｉ 　Ｌ−２接合体は陽性の反応性を示した。

ＰＲＰ単独はニトロセルースに結合しないので、データが示唆するようにＰＲＰ はｒｈＩＬ−２にカップリングする（第４図）。

生物学的活性 接合体を４℃で貯蔵しそして種々の日数後、ｒｈｌＬ−２の活性を生物学的アッ セイにおいてＡＴＣＣから得られたＣＴＬＬ細胞系を使用してモニターした。Ｃ ＴＬＬはｒｈＩＬ−２依存性細胞系であり、そしてこれらの細胞からのｒｈｌＬ −２の剥奪はこれらの細胞の死を生ずる。

簡単に述べると、５Ｘ１０３のＣＴＬＬ細胞を種々の濃度のｒｈＩＬ−２または ＰＲＰ−ｒｈ　Ｉ　Ｌ−２とともに培養した。ＣＴＬＬの成長を［’Ｈ］−チミ ジンの組み込みによりモニターした（表１）。

表１は、種々のＰＲＰ　−ｒ　ｈ　Ｉ　Ｌ−２接合体の中のインターリューキン −２の生物学的活性を示す。ｒｈＩＬ−２および接合体を種々の濃度で３Ｘ１０ ３のＣＴＬＬ細胞を含有する培養物の中に滴定した。細胞の成長を［”Ｈ］−チ ミジンの組み込みにより測定した。データは対照の応答の％として表す。刺激の 指数は、ｒｈｌＬ−２の標準の調製物を使用して得られた値に対して正規化する 。データから、ＰＲＰ−ｒｈｌＬ−２接合体よりすぐれたｒｈｌＬ−２活性を有 する。

表１ １　刺激因子　１０　２０　４０　５０　７０モツク 接合体　３７　１．５　２．５　１８　８ＰＲＰ−ｒｈＩＬ−２（２：１）　３ ３　４．９　６１　’　４０　１７ＰＲＰ−ｒＭＩ、−２（２０：１）　６８　 ２３　８６　９１　９５ＰＲＰ”ＣＲＭ＋＠ｙ（ＨｂＯＣ）　０　０　０　０　 ０ＰＲＰ−ｒｈＩＬ−２接合体ワクチンの免疫原性ニスイス−ウェブスター（Ｓ ｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ　ＦａｒｍＳ、ニューヨー ク州ジャーマンタウン）をＰＲＰ−ｒｈ　Ｉ　Ｌ−２（２０：　１）またはＰＲ Ｐ−ｒｈ　Ｉ　Ｌ−２（２：　１）接合体ワクチンで免疫化した。各ワクチンは ５匹の動物の群で試験した。

Ｐ　ＲＰ　−ＣＲＭ　ｌ　９１接合体（ＨｂＯＣ，Ｐｒａｘｆｓ　Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃｓ、Ｉｎｃ、　、ニューヨーク州ロチェスター）を陽性の対照として使用し た。ＰＲＰ　−ｒ　ｈ　Ｉ　Ｔ、−２接合体接合体（４℃で１３５日間貯蔵した ）を、アジュバントを使用しないで、マウスに１０または１μｇのｒｈ　Ｉ　Ｌ −２ノ量’ｔ’注射シタ。ＰＲＰ−ＣＲＭｎｔをＩμｇｃ７）ＰＲＰ／ｖウスで 使用した。次いで、マウスを２週で同一の投与量および投与ルートを使用して促 進した。血清試料を０，２および４週で取り、プールし、そして次の手順に従い ファー（Ｆａｒｒ）アッセイによりＰＲＰに対する抗体の応答を決定した： ＰＲＰに対する抗体を標準化したファー（Ｆ　ａ　ｒ　ｒ）ラジオイムノアッセ イにより決定した。血清、血清の標準およびアッセイの対照の種々の希釈物を胎 児ウシ血清中で調製し、そして２５μｍのアリコートを、二重反復試験において 、１．５μｍのエツペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管に移した。［３Ｈ］　 −ＰＰＰ　（５０μｍ）を［３１１ＣＩコートレーサーとともにすべての管に添 加した。試料を渦形成し、そして４℃において一夜インキユベーションした。飽 和硫酸アンモニウム溶液（７５μＪ）をすべての試料に添加し、次いで試料を渦 形成し、そして４℃において４０分間インキュベーションした。上澄み液を注意 して吸引し、そして４００μｍの蒸留水をすべての沈澱に添加した。渦形成後、 バイアルの内容物全体およびバイアルそれ自体を１０ｍ１のシンチレーション流 体を含有するシンチレーションバイアルに入れた。激しく撹拌した後、バイアル を液体シンチレーションカウンターで計数した。ＰＲＰに結合した抗体の濃度を 、既知の標準に比較して、計算した。

表ＩＩは、種々の接合体ワクチンで免疫化したマウスにおいて引き出された抗Ｐ ＲＰ抗体の応答を示す。２〜３．５μｇの変化する一次抗ＰＲＰ抗体の応答を異 なるワクチンを使用して観測した。促進可能な応答をワクチンの大部分を使用し て第４週に観測した。ＰＲＰ−ｒｈｌＬ−２（２０：　１）は、インフルエンザ 菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆ　Ｉｕｅｎｚａｅ）ｂ型オリゴ糖ＣＲＭ１ ９？接合体（ＨｂＯＣ）のそれに匹敵する応答を誘発した。

表ＩＩ ＰＲＰ　−ｒ　ｈ　Ｉ　Ｌ−２接合体ワクチンに対する抗ＰＲＰ抗体の応答抗Ｐ ＲＰ抗体（μｇ／ｍｌ）＊ ワクチン　投与量（８ｇ）　ｆｋｏ　Ｗｋ２　Ｗｋ４ＰＲＰ−ｒｈｒＬ−２（２ ０：１）　１０　０．１？　２．０　８．０ＰＲＰ−ｒｈＩＬ−２（２０：１） 　１　０．１０　２．０　５．３７Ｐｌ？Ｐ−ｒｈＩＬ−２（２＋１）　１０　 ０．１０　３，５４　４．１９ＰＲＰ−ｒｈＩＬ−２（２：１）　１　０．１４ 　２．０　４．２０ＰＲＰ−ｒｈ　Ｉ　Ｌ−２接合体ワクチンをｒｈＩＬ−２濃 度に基づいて注射し、そしてＨｂＯＣｔ−ＰＲＰ濃度に基づいて使用した。

＊前の実験からのデータが示すように、ＰＲＰ　（ＤＰ２０）単独またはＰＲＰ とタンパク質の混合物はＰＲＰ抗体の応答を誘発しない。

ＰＲＰ　−ｒ　ｈ　Ｉ　Ｌ−２ワクチンによるマウスにおける抗ＰＲＰ抗体の誘 発は、適当なり細胞へのＰＲＰのターゲティングよりむしろ、ＩＬ−２のキャリ ヤー効果のためである可能性がある。この可能性を妨げるために、この仮説を相 同性系において試験した。この現象を例示するために、ＰＲＰを組み換えウシＩ 　Ｌ−２（Ｂ　ｒ　Ｉ　Ｌ−２）に共有的にカップリングし、そしてこの接合体 をウシ系において免疫原性について試験した。

実施例１に記載するプロトコルに従い、ＰＲＰを組み換えウシＩＬ−２に２：１ および２０　：　１　（ＰＲＰ　：　ｒＬ−２）の比でカップリングさせた。２ ４時間後、接合体をｓ、ｏｏｏ分子量の膜を使用して生理的塩類溶液に対して数 回透析して無機のイオン、例えば、シアンイオンを除去した。粗製反応混合物を ＨＰＬＣ分によりウルトラヒドロデル（Ｗａｔ　ｅ　ｒ　ｓ、マサチュセッツ州 ミルフォード）のカラム１２５／２５０でリン酸塩緩衝液中で精製した。非接合 Ｂ　ｒ　Ｉ　Ｌ−２に比較して、タンパク質成分大きさの増加は、すぐれた接合 体を示唆する（第５図）。

精製した接合体および非接合Ｂｒ１Ｌ−２を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン プロットにより評価した。材料を１００μｌの試料緩衝液（０，２モルトリス緩 衝液、５％のＳＤＳ、０．０２５％のブロモフェノールブルー、１０−１モルの ２−メタノールおよび２０％のグリセロールを含有する）中に溶解し、そして１ ００℃に５分間加熱した。バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ミニタンパク質ゲル 系（カリフォルニア州しドモンド）を使用して分析を実施した。ゲルは１．５ｍ ｍの厚さであり、そして分離するゲルは１５％のアクリルアミドを含有し、アク リルアミド対ビスの比は３０：０．８であった（０．３７モルのトリスＨＣＩ、 ｐＨ８，８および０．１％の５ＤＳ）。積み重ねゲルは、アクリルアミド対ビス の同−比で、４．８％のアクリルアミドを含有した。

１〜１０　ｕ　ｇの試料を含有する１０〜１５μＩを各レーンに適用した。

電気泳動後、ゲルをエタノール：酢酸：水（５：　１　：　５）の中の０．１２ ５％のクーマツシー（Ｃｏｏｍａｓｓ　ｉ　ｅ）ブルーで少なくとも１時１間染 ；色し１．次いで色素を含まない同一、溶・媒系で脱色・し−た。前以て染色し た分子量の櫟準を使用して、タンパク質の比・較的分子＠Ｃのご決、定を促進し た。染色しない二重反復試験のゲルをウェスタンプロット分析に使用した。はぼ １６．０００ダルトンの分子量の主要なバンドをＢｒ１Ｌ−２単独を負荷したレ ーンにおいて観測された。接合体はより高い分子量の領域において拡散したバン ドとして現れる。接合しないＢｒ１Ｌ−２の証拠は観測されなかった。

ＰＡＧＥで分離された試料を、１２ミリモルのトリス−３８３ミリモルのグリシ ンｐＨ８，８中で室温において９０分間０．４５ミリアンペアで電気泳動的にニ トロセルロース膜上に移した。膜をＢＬＯＴＴＯ（リン酸塩緩衝液生理的塩類溶 液の中の５％の非脂肪ドライミルク）中で３７℃において１時間ソーキングした 。膜を前以て決定した濃度のモノクローナル抗ＰＲＰ抗体（Ｅ１１７−５）また はポリクローナルウサギ抗ＢｒＩＬ−２で３７℃において１時間プロービングし 、そしてＢＬＯＴＴｏで洗浄した。結合した抗原をＢＬＯＴＴＯ中の二次抗体に 接合したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｋｉ　ｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　 ｐｅｒｒｙ、マリイランド州）で３７℃において１時間検出した。プロットを３ 〜４ＸＰＢＳで洗浄し、そしてメタノール中に０．０１過酸化水素；０．０６％ の４−クロロ−１７ナフトールを含有するＰＢＳで室温において２０分間展開し た。濾液を蒸留水に移すことによって反応を停止し、モして濾液をプロッティン グにより乾燥した。データを第６図に表す。抗ＰＲＰ抗体は両者のＰＲＰ−Ｂ　 ｒ　ＩＬ−２接合体と反応したが、非接合体ＢｒＩＬ−２と反応しなかった。接 合体の分子量は、また、かなり増加した。遊離のＰＲＰは、タンパク質にカップ リングしないとき、ニトロセルロース膜に付着しない。データが示唆するように 、ＰＲＰはＢｒ１■ＩＩ、−２，に共有的にカップリングした。

抗ＢｒＩＬ−２は遊離のＩＬ−２およびＩＬ−２接合体と反応した。

データは抗ＰＲＰ抗体を使用して観測されたものに類似する。

ＩＬ−２上へのＰＲＰの共有カップリングはアミノ酸分析により確証された。サ ツカリドはタンパク質のりジン残基のニブシロンアミノ基にカップリングするの で、リジンの減少および独特ヒドロキシエチルリジンの発生をモニターした。デ ータの分析が示すように、ヒドロキシエチルリジンはタンパク質上へのＰＲＰの 共有カップリングを実証している。

生物学的活性 接合体を４℃において貯蔵し、そしてウシＩＬ−２の生物学的活性をバイオアッ セイにおいてＩＬ−２依存性ウシＴ細胞系、ＢＴ−２を使用してモニターした。

これらの細胞系からのＩＬ−２の剥奪はこれらの細胞の死を生ずる。簡単に述べ ると、５Ｘ１０’のＢＴ−２細胞を９６ウエルの平らな底のマイクロ培養プレー トの中の異なる濃度のＢＴ−２またはＰＲＰ−Ｂ　ｒ　Ｉ　Ｌ−２接合体の存在 下に培養した。４８時間後、１０μＩのＭＴＴ　［３−（４，５−ジメチルチア ゾルー２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］溶液を添加し く５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ）そして２０回混合した。ＭＴＴを生きている細胞によ り切断してダークブルーのホルマザン産生物を生成した。ホルマザン産生物をイ ソプロパツールの添加により５５０ｎｍにおける吸収を測定することによって定 量した。データを第７図に表す。２：１および２０：１の両者の接合体は生物学 的活性を保持し、これらは非接合体のＢｒＩＬ−２より、それぞれ、１００〜１ ０００倍低い。

ＰＲＰ−Ｂ　ｒ　Ｉ　Ｌ−２接合体のワクチンの免疫原性３匹の雌牛を接合体の ワクチンで免疫化した。ＰＲＰ−ＣＲＭ、、、（ＨｂＯｃ）接合体ワクチンを陽 性の対照として使用し、そしてＰＲＰとＢｒＩＬ−２との混合物を陰性の対照と して使用した。すべてのワクチンはリン酸アルミニウム中で１ｍｇ／ｍｌの濃度 で配合した。各動物に１０μｇのＰＲＰ／投与量を与えた。雌牛を前以て採血し て前以て存在するＰＲＰに対して抗体レベルを推定し、そして高い抗ＰＲＰ力価 をもつものを実験と対照の群の間に等しく分布させた。

動物を２ｍｌの体積の１０μｇのＰＲＰまたは接合体で第０週に皮下的に免疫化 し、そして第１および２週に採血した。ワクチンの第２投与量を第２週に投与し 、そして血液を第３および４週に集めた。ＰＲＰに対する抗体の応答を標準化し たファール（Ｆａａｒ）ラジオイムノアッセイにより前に記載したように測定し た。幾何平均の抗ＰＲＰ抗体の力価を表ＩＩＩに表す。ＰＲＰ−ＩＬ−２（２＋ 　１）接合体は免疫前の抗体レベルより２．３倍高い抗ＰＲＰ抗体を第３週に誘 発し、そしてＰＲＰ−ＩＬ−２（２０：１）’は第３週にほぼ３倍の増加を誘発 した。ＨｂＯＣ，ヒトＰＲＰ−ＣＲＭＩ９７ワクチン配合物は、第３週に６倍の 抗ＰＲＰ力価の増加を誘発した。ＰＲＰは、ＢｒＩＬ−２と混合すると、抗ＰＲ Ｐ抗体レベルの有意の上昇を誘発しなかった。データが示唆するように、ＰＲＰ −ＩＬ−２（２：　１）および（２０：　１）接合体はワクチンを適当なリンパ 球上にターゲティングして応答を刺激する。

表ＩＩＩ ＰＲＰ−Ｂ　ｒ　Ｉ　Ｌ−２接合体に対するウシ抗ＰＲＰ抗体の応答ＧＭＴ抗Ｐ ＲＰ抗体 抗原　Ｗｋ　ＯＷｋ　１　、　Ｗｋ　２　Ｗｋ　３　増加（倍）＊ＰＲＰ＋ＩＬ −２０，７００，４６０，５４，４６なしＰＲＰ−ＣＲＭ１９７　（ＨｂＯＣ） 　０．３８　０．３８　０．９８　、２．３　６．１ＰＲＰ−ｒＬ−２（２０： Ｉ）　０．３５　０．４８　０．５５　１．０　２．８＊第３週における増加（ 倍）は第０週の抗体の力価を越えた増加として表す。

同等の実施態様 当業者は、日常の実験を越えないものを使用して、ここにおいて特定的に記載し た本発明の特定の実施態様に対する多数の同等の実施態様を認識するか、あるい は確認することができるであろう。このような同等の実施態様は次の請求の範囲 内に包含される。

ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ １、ＰＲＰ−ＣＲＭ　２．　ＩＬ−２のみ５．　ＰＲＰ−ＩＬ−２（２Ｘ）　６ ．−？、ＰＰＰ−ＩＬ−２＋２０Ｘｌ　８．ＰＰＰ−ＩＬ−２Ｆ２０Ｘ）ＦＩＧ 、　４ 遊離ＨｂＯ ＦＩＧ、　５ｃ 抗ＰＲＰを使用するブロービング ５）　ＰＲＰ−工Ｉ、−２（２：１） 抗ＢｒＩＬ−２を使用するブロービングＦＩ　Ｇ、　６ 、０００１　．００＋　０１　、＋　１　１０投与量（ナノグラム７ｍ１） ＦＩＧ、　７ 補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成４年１月１０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、そのレセプターが免疫系の細胞上で発現されるサイトカイニン、リンホカイ ン、ホルモン、成長因子またはその一部分へ結合した抗原からなり、免疫変調活 性を有し、前記抗原は常態でサイトカイニン、リンホカイン、ホルモンまたは成 長因子とアソシエーションしていない、免疫原性接合体。 ２、サイトカイニンまたはリンホカインはインターフェロン、インターリューキ ン−１α、インターリューキン−１β、インターリューキン−２またはその一部 分である、上記第１項記載の接合体。 ３、ホルモンまたは成長因子は、腫瘍壊死因子、プロラクチン、表皮成長因子、 組織成長因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因 子、インスリン様成長因子、ソマトトロピンまたはインスリンである、上記第１ 項記載の接合体。 ４、抗原はサイトカイニンまたはホルモンに共有結合している、上記第１項記載 の接合体。 ５、抗原はサイトカイニン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因子に還元的ア ミン化により結合している、上記第４項記載の接合体。 ６、抗原はサイトカイニン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因子に遺伝子融 合技術により結合している、上記第１項記載の接合体。 ７、抗原はウィルス、バクテリア、菌類または温血動物またはヒトの病原体の寄 生体の抗原である、上記第１項記載の接合体。 ８、抗原は炭水化物を含有する抗原である、上記第１項記載の接合体。 ９、炭水化物を含有する抗原はオリゴ糖または多糖である、上記第８項記載の接 合体。 １０、抗原はバクテリアの莢膜のポリマー、オリゴマーまたはその断片である、 上記第１項記載の接合体。 １１、ポリマーまたはオリゴマーは、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ ｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎連鎖球菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒ ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌ ｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ） 、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈａｅａｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄ ｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅ ｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ ｅｕｓ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または破 傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎｉ）から誘導される、上記第１０ 項記載の接合体。 １２、ポリマーまたはオリゴマーはポリリボシルリビトールホスフェートである 、上記第１１項記載の接合体。 １３、ポリマーまたはオリゴは肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から誘導される、上記第１１項記載の接合体。 １４、ポリマーまたはオリゴマーは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ）の血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆまたは２３Ｆ からのものである、上記第１３項記載の接合体。 １５、ポリマーまたはオリゴマーは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ）のグループＡまたはグループＣの莢膜のサッカリドである、上記第１０項記載 の接合体。 １６、抗原はバクテリアの細胞壁のペプチドグリカンまたはその断片である、上 記第１項記載の接合体。 １７、抗原はバクテリアのリポ多糖またはその成分である、上記第１項記載の接 合体。 １８、製剤学的に許容されうる賦形剤および任意のアジュバントの中の免疫原性 接合体からなり、前記免疫原性接合体は、そのレセプターが免疫系の細胞上で発 現されるサイトカイニン、リンホカイン、ホルモン、成長因子またはその一部分 へ結合した抗原からなり、免疫変調活性を有し、前記抗原は常態でサイトカイニ ン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因子とアソシエーションしていない、ワ クチン組成物。 １９、サイトカイニンまたはリンホカインはインターフェロン、インターリュー キン−１α、インターリューキン−１β、インターリューキン−２またはその一 部分である、上記第１８項記載のワクチン組成物。 ２０、ホルモンまたは成長因子は、腫瘍壊死因子、プロラクチン、表皮成長因子 、組織成長因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激 因子、インスリン様成長因子、ソマトトロピンまたはインスリンである、上記第 １８項記載のワクチン組成物。 ２１、抗原はバクテリア、菌類または温血動物またはヒトの病原体の寄生体の抗 原である、上記第１８項記載のワクチン組成物。 ２２、抗原は炭水化物を含有する抗原である、上記第１８項記載のワクチン組成 物。 ２３、抗原はオリゴ糖または多糖である、上記第２２項記載のワクチン組成物。 ２４、抗原はバクテリアの莢膜のポリマー、オリゴマーまたはその断片である、 上記第２３項記載のワクチン組成物。 ２５、ポリマーまたはオリゴマーは、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ ｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎連鎖球菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒ ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌ ｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ） 、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈａｅａｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄ ｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅ ｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ ｅｕｓ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または破 傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎｉ）から誘導される、上記第２４ 項記載のワクチン組成物。 ２６、ポリマーまたはオリゴマーはポリリボシルリビトールホスフェートである 、上記第２４項記載のワクチン組成物。 ２７、ポリマーまたはオリゴは肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から誘導される、上記第２５項記載のワクチン組成物。 ２８、ポリマーまたはオリゴマーは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ）の血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆまたは２３Ｆ からのものである、上記第２７項記載のワクチン組成物。 ２９、ポリマーまたはオリゴマーは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ）のグループＡまたはグループＣの莢膜のサッカリドである、上記第２５項記載 のワクチン組成物。 ３０、明■のミネラル懸濁液をさらに含む、上記第１８項記載のワクチン組成物 。 ３１、温血動物の宿主に有効量のワクチン組成物を投与することからなり、前記 ワクチン組成物は、製剤学的に許容されうる賦形剤および任意のアジュバントの 中の免疫原性接合体からなり、前記免疫原性接合体は、そのレセプターが免疫系 の細胞上で発現されるサイトカイニン、リンホカイン、ホルモン、成長因子また はその一部分へ結合した抗原からなり、免疫変調活性を有し、前記抗原は常態で サイトカイニン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因子とアソシエーションし ていない、抗原、弱く免疫原性の抗原または非免疫原性の抗原に対する応答を引 き出す方法。 ３２、サイトカイニンまたはリンホカインはインターフェロン、インターリュー キン−１α、インターリューキン−１β、インターリューキン−２またはその一 部分である、上記第３１項記載の方法。 ３３、ホルモンまたは成長因子は、腫瘍壊死因子、プロラクチン、表皮成長因子 、組織成長因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激 因子、インスリン様成長因子、ソマトトロピンまたはインスリンである、上記第 ３１項記載の方法。 ３４、抗原は炭水化物を含有する抗原である、上記第３１項記載の方法。 ３５、製剤学的に許容されうる賦形剤および任意のアジュバントの中の、免疫原 性接合体と混合された、抗原またはその断片からなり、前記免疫原性接合体は、 そのレセプターが免疫系の細胞上で発現されるサイトカイニン、リンホカイン、 ホルモン、成長因子またはその一部分へ結合した抗原からなり、免疫変調活性を 有し、前記抗原は常態でサイトカイニン、リンホカイン、ホルモンまたは成長因 子とアソシエーションしていない、接合された抗原および少なくとも１種の他の 抗原に対して免疫応答を引き出すための補助ワクチン組成物。 ３６、サイトカイニンまたはリンホカインはインターフェロン、インターリュー キン−１α、インターリューキン−１β、インターリューキン−２またはその一 部分である、上記第３５項記載の補助ワクチン組成物。 ３７、ホルモンまたは成長因子は、腫瘍壊死因子、プロラクチン、表皮成長因子 、組織成長因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激 因子、インスリン様成長因子、ソマトトロピンまたはインスリンである、上記第 ３５項記載の補助ワクチン組成物。 ３８、接合した抗原は炭水化物を含有する抗原である、上記第３５項記載の補助 ワクチン組成物。 ３９、接合した抗原はバクテリアの莢膜のポリマー、オリゴマーまたはその断片 である、上記第３８項記載の補助ワクチン組成物。 ４０、ポリマーまたはオリゴマーは、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ ｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎連鎖球菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒ ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌ ｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ） 、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈａｅａｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄ ｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅ ｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ ｅｕｓ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または破 傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎｉ）から誘導される、上記第３９ 項記載の補助ワクチン組成物。 ４１、ポリマーまたはオリゴマーはポリリボシルリビトールホスフェートである 、上記第４０項記載の補助ワクチン組成物。 ４２、ポリマーまたはオリゴは肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から誘導される、上記第４０項記載の補助ワクチン組成物 。 ４３、ポリマーまたはオリゴマーは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ）の血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆまたは２３Ｆ からのものである、上記第４２項記載の補助ワクチン組成物。 ４４、ポリマーまたはオリゴマーは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ）のグループＡまたはグループＣの莢膜のサッカリドである、上記第４０項記載 の補助ワクチン組成物。 ４５、抗原はバクテリアの細胞壁のペプチドグリカンまたはその断片である、上 記第３５項記載の補助ワクチン組成物。 ４６、抗原はバクテリアのリボ多糖またはその成分である、上記第３５項記載の 補助ワクチン組成物。 ４７、抗原は、微生物の抗原、ウィルス抗原、寄生体の抗原、腫瘍の抗原、アレ ルゲン、ホルモン、レセプター、結合性タンパク質、自己抗原および自己免疫性 関係抗原から成る群より選択される、上記第３５項記載の補助ワクチン組成物。 ４８、抗原はバクテリアの表面または外膜のタンパク質またはその一部分である 、上記第４７項記載の補助ワクチン組成物。 ４９、抗原は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚ ａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓ ｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ ｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ 　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈ ａｌｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃ ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅ ｒｉａｇｏｎｏｒｒｈａｅａｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔ ｕｓｓｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄 色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、肺炎杆菌（Ｋ ｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉ ｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎｉ）のバクテリアの外膜タンパク質またはその一部分であ る、上記第４８項記載の補助ワクチン組成物。 ５０、バクテリアの表面タンパク質は化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＭタンパク質である、上記第４８項記載の補助ワクチ ン組成物。 ５１、抗原はＲＳウィルスのＦ、ＮまたはＧタンパク質である、上記第４７項記 載の補助ワクチン組成物。 ５２、抗原はＲＳウィルスのタンパク質Ｆのペプチド２８３−３１５である、上 記第５１項記載の補助ワクチン組成物。 ５３、明■のミネラル懸濁液をさらに含む、上記第３５項記載の補助ワクチン組 成物。 ５４、インターリューキン−２に結合したポリリボシルリビトールホスフェート からなり、インターリューキン−２はポリリボシルリビトールホスフェートの免 疫原活性を修飾することができる、免疫原性接合体。 ５５、製剤学的に許容されうる賦形剤および任意のアジュバントの中の免疫原性 接合体からなり、前記免疫原性接合体はインターリューキン−２に結合したポリ リボシルリビトールホスフェートからなり、インターリューキン−２はポリリボ シルリビトールホスフェートの免疫原活性を修飾することができる、ワクチン組 成物。