ES2241124T3 - Actividad inhibidora de serin-proteinasa mediante tetraciclina hidrofoba. - Google Patents
Actividad inhibidora de serin-proteinasa mediante tetraciclina hidrofoba.Info
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Abstract
Un procedimiento para inhibir la actividad de la serina proteinasa en sistemas biológicos que comprende la administración al sistema de una cantidad de 4- (dimetilamino) tetraciclina hidrofóbica, inhibidor de la serina proteinasa. El procedimiento reduce la destrucción de tejido durante la inflamación producida por la actividad de la elastasa de los leucocitos humanos. El procedimiento se emplea con fines farmacéuticos o cosméticos.
Description
Actividad inhibitoria de
serin-proteinasa mediante tetraciclina
hidrófoba.
Esta invención se realizó con apoyo gubernamental
bajo los documentos DE 10985 y R37-DE03987
concedidos por el Instituto Nacional de Investigación Dental (NIH).
El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.
Esta invención se refiere al uso de una
tetraciclina hidrófoba para la inhibición de la actividad de
serin-proteinasa en sistemas biológicos. La
invención se refiere más particularmente a un uso terapéutico de una
4-des(dimetilamino)tetraciclina para
tratar mamíferos que padecen de destrucción de tejidos mediada por
inflamación que resulta de la actividad de elastasa de leucocitos de
serin-proteinasa.
El deterioro de los tejidos conectivos es una
complicación principal de la respuesta inflamatoria. Esta lesión
inflamatoria de tejidos contribuye, por ejemplo, a los cambios
patológicos de las articulaciones en la artritis, de los pulmones en
el enfisema y al síndrome de dificultad respiratoria, de los riñones
y el tracto digestivo en el síndrome de fallo orgánico
multisistémico, de las encías y el periodoncio en la periodontitis y
al fallo cardíaco y cerebral en el síndrome de
isquemia-reperfusión. Las proteasas liberadas por
los leucocitos desempeñan una función principal en la lesión de
tejidos asociada a la respuesta inflamatoria.
Dos clases de proteasas han estado asociadas a la
lesión inflamatoria de tejidos: serin-proteinasas y
metaloproteinasas de matriz (MMP). Las
serin-proteinasas tienen una especifidad de
sustratos y un modo de unión a sustratos que difieren completamente
de la especifidad de sustrato y el modo de unión a sustrato de las
MMP.
Las serin-proteinasas han sido
clasificadas por su especifidad de sustratos en tres tipos: de tipo
tripsina, tipo timotripsina y tipo elastasa. La elastasa de
serin-proteinasa prefiere sustratos con cadenas
alifáticas pequeñas (por ejemplo, Ala, Val) en la posición P_{1}.
Los P_{1}, P_{2}, etc. son grupos en el sustrato natural de una
proteasa que flanquean el sitio de escisión del sustrato y se cree
encajan en los subsitios de la enzima, habitualmente denominados
S_{1}, S_{2}, etc. El modo de acción de las
serin-proteinasas incluye el aminoácido serina que
tiene un grupo hidroxilo que actúa como un nucleófilo para la
escisión hidrolítica. Por el contrario, en las metaloproteinasas de
matriz, un metal, que habitualmente es el zinc, coordina y activa el
grupo carbonilo de la amida de la proteína diana para la hidrólisis.
Por lo tanto, la elastasa de serin-proteinasa
difiere de la elastasa de MMP.
Se ha dedicado un considerable esfuerzo a
desarrollar inhibidores de elastasa de
serin-proteinasa (elastasa de leucocitos humanos o
HLE), especialmente debido a su función putativa en el mecanismo de
la lesión pulmonar asociada con enfisema y síndrome de dificultad
respiratoria.
La inhibición de elastasa de leucocitos humanos
por productos naturales no péptidos, como por ejemplo triterpenoides
pentacíclicos de origen vegetal, particularmente ácido ursólico, se
describe por Q-L Ying y cols. "Inhibition of Human
Leucocyte Elastase by Ursolic Acid: Evidence for a Binding Site for
Pentacyclic Triterpenes", Biochem J. 277,
521-526 (1991).
Otros inhibidores no péptidos de elastasa de
leucocitos humanos de origen sintético, como
2-1-(1-metil-2-pirrolil)butirato
de 4-(metilsulfinil)fenilo y los derivados relacionados de
sulfuros y sulfonas, son descritos por R.T. Cunningham, y cols.,
"Synthesis and Evaluation of CE-0266: A New Human
Neeutrophil Elastase Inhibitor", Bioorganic Chemistry, 20,
345-355 (1992). Análogos adicionales de estos
compuestos que son inhibidores de HLE son descritos por G.P.
Kirschenheuter y cols., "Synthesis and Chaaracterization of Human
Neutrophil Elastase Inhibitors Derived From Aromatic Esters of
Phenylalkanoic Acids", in Proteases, Protease Inhibitors and
Protease-Derived Peptides, Birkhäuser Verlag,
Basel (1993), pag. 71-82. Estos compuestos no
péptidos de origen natural o sintético son inhibidores aniónicos,
hidrófobos, de bajo peso molecular.
Se cree que los inhibidores de bajo peso
molecular de HLE tienen preferentemente un dominio hidrófobo
prolongado, con un centro de carga negativa. Un análisis del sitio
de unión tridimensional de la elastasa de leucocitos por
cristalografía X indica que el sitio de unión de sustrato prolongado
para esta enzima está ampliamente alineado con residuos hidrófobos,
pero una cadena lateral de arginina (que no es directamente parte de
la tríada catalítica) en la mitad de este medio hidrófobo contribuye
estructuralmente a estabilizar la estructura del sitio activo. Se
supone que los compuestos aniónicos hidrófobos basados en péptidos y
no basados en péptidos que pueden servir como inhibidores se unen al
sitio de unión de sustrato prolongado a través de una combinación de
fuerzas hidrófobas e interacciones electrostáticas con el residuo de
arginina.
Otros ejemplos de inhibidores
hidrófobos-aniónicos no péptidos de HLE son los
ácidos grasos, ácidos bílicos y ácido
pireno-trisulfónico, todos los cuales han sido
también investigados en el laboratorio de uno de los presentes
inventores. S. Simon, y cols., "Inhibition of Human Neutrophil
Elastase by Polyguanylic Acid and Other Synthetic
Polynucleotides", Adv. Exp. Med. Biol. 240,
65-74 (1988); S.C. Tyagi y S.R. Simon,
"Inhibitors Directed to Binding Domains in Neutrophil
Elastase", Biochemistry 20, 9970-9977
(1990); S. Tyagi y S.R. Simon, "Parinaric Acids as Probes of
Binding Domains in Neutrophil Elastase", J. Biol. Chem.
266, 15185-15191 (1991); S. Tyagi y S.R. Dimon,
"Interaction of Neutrophil Elastase with Hidrophobic Polyanionic
chelators", Biochem. Cell Biol. 69,
624-629 (1991). Estos compuestos son todos
inhibidores reversibles, y forman interacciones no covalentes con la
enzima. Puesto que se unen en el sitio de unión del sustrato
prolongado, son inhibidores competitivos de la hidrólisis enzimática
de sustratos de oligopéptidos y proteínas mayores como elastina,
pero son inhibidores no competitivos de la hidrólisis de los
sustratos sintéticos más pequeños que se unen solamente en las
proximidades inmediatas de la tríada catalítica en el sitio
activo.
Ninguno de estos compuestos no péptidos de origen
natural o sintético se parece a la tetraciclina.
Las tetraciclinas son una clase de compuestos que
son particularmente bien conocidos por su éxito temprano y
espectacular como antibióticos. Estos compuestos como tetraciclina,
esporociclina, etc., son antibióticos de amplio espectro, que tienen
utilidad contra una amplia diversidad de bacterias y otros
microbios. El compuesto parental, la tetraciclina, tiene la
siguiente estructura general:
El sistema de numeración del núcleo de anillos
múltiples es como sigue:
La tetraciclina, así como los derivados de
5-OH (oxitetraciclina, por ejemplo, terramicina®) y
7-Cl (clorotetraciclina, por ejemplo, aureomicina®),
existen en la naturaleza, y son todos antibióticos bien conocidos.
Las tetraciclinas semisintéticas incluyen, por ejemplo, doxiciclina,
minociclina y metaciclina. El uso de antibióticos de tetraciclina,
aunque generalmente es eficaz para tratar una infección, puede
conducir a efectos secundarios indeseables. Por ejemplo, la
administración a largo plazo de tetraciclinas antibióticas puede
reducir o eliminar la flora saludable, como la flora intestinal, y
puede conducir a la producción de organismos resistentes a los
antibióticos o al sobrecrecimiento de levaduras y hongos. Estas
desventajas significativas normalmente desaconsejan los regímenes de
tratamiento que requieran la administración crónica de estos
compuestos.
Las tetraciclinas naturales pueden ser
modificadas sin pérdida de sus propiedades antibióticas, aunque
ciertos elementos de la estructura deben ser retenidos para que sea
así. Ha sido definida una clase de compuestos que están
estructuralmente relacionados con las tetraciclinas antibióticas,
pero cuya actividad antibiótica ha sido sustancial o completamente
extinguida por modificación química. Las modificaciones que pueden o
no pueden hacerse a la estructura básica de la tetraciclina fueron
examinadas por Mitscher, L.A. The Chemistry of the Tetracycline
Antibiotics, Marcel Dekker, New York (1978), capítulo 6. Según
Mitscher, la modificación en las posiciones 5-9 del
sistema de anillos de la tetraciclina se puede hacer sin provocar la
pérdida completa de las propiedades antibióticas. Sin embargo, los
cambios de la estructura básica del sistema de anillos, o
sustitución de los sustituyentes en las posiciones
1-4 o 10-12,conduce generalmente a
tetraciclinas sintéticas con una actividad antibacteriana
sustancialmente menor o esencialmente nula.
Las tetraciclinas químicamente modificadas (CMT)
incluyen, por ejemplo,
4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-1), tetraciclinonitrilo
(CMT-2),
6-desmetil-6-desoxi-4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-3),
7-cloro-4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-4), tetraciclina-pirazol
(CMT-5),
4-hidroxi-4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-6),
4-des(dimetilamino)12\alpha-desoxitetraciclina
(CMT-7),
6-desoxi-5\alpha-hidroxi-4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-8),
4-des(dimetilamino)-12\alpha-desoxianhidrotetraciclina
(CMT-9) o
4-des(dimetilamino)minociclina
(CMT-10).
Ejemplos adicionales de tetraciclinas modificadas
para una actividad antimicrobiana reducida incluyen
4-epímeros de oxitetraciclina y clorotetraciclina
(epi-oxitetraciclina y
epi-clorotetrciclina).
Se ha mostrado que ciertas tetraciclinas suprimen
las metaloproteinasas de matriz, y los laboratorios de dos de los
presentes inventores han desempeñado una función principal en la
identificación de tetraciclinas como una familia de compuestos que
pueden inhibir MMP independientemente de la actividad antibiótica de
la tetraciclina. Las patentes de EE.UU. nº 5.459.135 de Golub y
cols., 5.321.017 de Golub y cols., 5.308.839 de Golub y cols.,
4.935.412 de McNamara y cols., 4.704.383 de McNamara y cols. y
4.666.897 de Golub y cols. describen el uso de tetraciclinas no
antimicrobianas para tratar estados destructores de tejidos,
inflamación crónica y otros estados asociados a una excesiva
actividad de metaloproteasa de metaloproteinasas de matriz como
colagenasa, gelatinasa y elastasa de MMP.
La inhibición de la actividad de
metaloproteinasas de matriz por tetraciclinas es mostrada en una
serie de estudios que incluyen animales experimentales en los que es
iatrogénicamente inducida una periodontitis por infección con
agentes patógenos orales o en los que es inducida una atrofia de
ligamentos periodontales por destrucción de islotes pancreáticos,
que dan lugar a una elevación patológica de la actividad de MMP en
los sitios de la lesión tisular. El tratamiento de estos animales
con tetraciclinas semisintéticas que retienen la actividad
antibiótica así como tetraciclinas químicamente modificadas
desprovistas de actividad antibiótica da lugar a una reducción
considerable en los niveles de MMP en los sitios de la lesión de los
tejidos así como una marcada mejora del periodoncio en los animales.
Véase, por ejemplo, K. M. Chang y cols., "Local and Systemic
Factors in Periodontal Disease Increase
Matrix-Degrading Enzyme Activities in Rat Gingiva;
Effect of Minocycline Therapy", Research Communications in
Molecular Pathology and Pharmacology, 91,
303-318 (1996); M.E. Ryan, y cols., "Matrix
Metalloproteinases and Their Inhibition in Periodontal
Treatment", Current Opinion in Periodontology, 3,
85-96 (1996).
Pero en esta serie
inter-relacionada de estudios se encontró que aunque
diversas tetraciclinas modificadas inhibían la actividad de
metaloproteinasa de matriz-elastasa, las
tetraciclinas caracterizadas en ese momento no inhibían la actividad
de elastasa de serin-proteinasa in vitro de
PMN ni de rata ni de sinovio humano. Véase, por ejemplo, L. Golub y
cols., "Tetracyclines Inhibit Connective Tissue Breakdown: New
Therapeutic Implications For an Old Family of Drugs" Crit.
Rev. Oral Biol. Med., 2, 297-322(1991) en
las páginas 300 y 301.
Las metaloproteinasas y
serin-proteinasas pueden funcionar en combinación
para llevar a cabo la destrucción de la mayoría de los elementos de
la matriz extracelular incluidos el estroma intersticial y las
membranas de basamento. En esta interacción 1) la catepsina G (una
serin-proteinasa) puede activar
NEAP-8; 2) la elastasa de leucocitos humanos (una
serin-proteinasa) puede desactivar los principales
inhibidores de tejidos endógenos de metaloproteinasas de matriz
(TIMP); y 3) MMP-8 y MMP-9 pueden
desactivar el inhibidor de \alpha_{1}-proteinasa
(\alpha_{1}-PI), el principal inhibidor endógeno
de la elastasa de leucocitos humanos. Véase, por ejemplo, S. K.
Mallya, y cols., "Interaction of Matrix Metalloproteinases With
Serine Protease Inhibitors", Annals of the New York Academy of
Science, 732, 303-314 (1994); y A. R. Rinehart,
y cols., "Human \alpha-Proteinase Inhibitor
Binds to Extracellular Matrix In Vitro", Am. J. Respir.
Cell Mol. Biol., 9. 666-679 (1993). Por
tanto, contribuyendo a la activación de proteasas e inactivando los
inhibidores endógenos, las dos clases de proteinasas pueden desviar
el equilibrio proteasa-antiproteasa hacia la
degradación de tejidos patológicos. Aunque las enzimas están
reguladas bajo condiciones normales, una descomposición del
mecanismo de control pueden conducir a diversos estados de
enfermedad caracterizados por una excesiva actividad de
serin-proteinasa.
Por ejemplo, bajo condiciones de infiltración con
grandes números de neutrófilos, como se puede encontrar en el
síndrome de dificultad respiratoria, en el que los niveles endógenos
de \alpha_{1}-PI no pueden neutralizar
eficazmente los niveles de elastasa de leucocitos humanos, el
equilibrio proteasa-antiproteasa puede resultar
desviado de tal forma que la protección de la antielastasa endógena
no sea suficiente para proporcionar una protección a partir de la
lesión mediada por HLE.
Hasta ahora no ha sido descubierto un inhibidor
exógeno de proteinasa que sea capaz de restaurar completamente el
equilibrio proteasa-antiproteasa.
Consecuentemente, la invención proporciona el uso
de una tetraciclina hidrófoba para elaborar una composición para
inhibir la excesiva actividad de elastasa de leucocitos en un
sistema biológico, en el que la tetraciclina hidrófoba comprende
6-desmetil-6-desoxi-4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-3).
La invención proporciona adicionalmente el uso de
una tetraciclina hidrófoba para elaborar una composición para tratar
un sujeto que padece un deterioro de tejidos que resulta de una
excesiva actividad de elastasa de leucocitos, en el que la
tetraciclina hidrófoba comprende
6-desmetil-6-desoxi-4-des(dimetilamino)-tetraciclina
(CMT-3).
La
6-desmetil-6-desoxi-4-des(dimetilamino)tetraciclina
es administrada a un mamífero en una cantidad suficiente para
inhibir la actividad de elastasa de leucocitos y, por tanto, es
reducida la destrucción inflamatoria relacionada con la actividad de
la elastasa de leucocitos. El mamífero es preferentemente un ser
humano, pero pueden ser tratados ventajosamente también otros
animales.
La invención es útil para fines farmacéuticos así
como cosméticos. El inhibidor tiene ventajas considerables como un
agente terapéutico que restaura el equilibrio
proteasa-antiproteasa.
La Figura 1 es un gráfico de barras de la
inhibición de la degradación mediada por neutrófilos humanos de
matriz extracelular de once tetraciclinas diferentes, como se expone
en el Ejemplo 1. Un estudio de la dependencia de la dosis de esta
inhibición se muestra en la Tabla I.
La Figura 2 es un gráfico de barras que ilustra
una inhibición comparable de la degradación mediada por neutrófilos
humanos y mediada por elastasa de leucocitos humanos de matriz
extracelular por CMT-3 (COL-3), como
se expone en los Ejemplos 1 y 2.
Las Figuras 3A,B y 4A,B ilustran gráficos de
Dixon (Figura 3A y 4A) y gráficos de Cornish-Bowden
(figuras 3B y 4B) de la inhibición de la actividad amidolítica de
elastasa de leucocitos humanos por CMT-3
(COL-3), como se describe en el Ejemplo 2. La
intersección de los gráficos de Dixon anteriores en el eje X y las
pendientes paralelas de os gráficos de
Cornish-Bowden confirman que la
CMT-3 (COL-3) es un inhibidor
competitivo de la actividad amidolítica de elastasa de leucocitos
humanos hacia el sustrato cromógeno de oligopéptidos
metoxisuccinil-Ala-Ala-Fro-Yal-p-nitroanilida.
La Figura 5 ilustra un gráfico de Dixon de la
actividad amidolítica de HLE en presencia de doxiciclina, que
solamente muestra una inhibición muy débil por esta tetraciclina en
contraste con la CMT-3, como se expuso en el Ejemplo
2.
La Figura 6 es un gráfico de barras que ilustra
la capacidad de CMT-3 administrada por vía oral para
reducir la actividad de elastasa de leucocitos en extractos de
tejidos de las encías de ratas que habían recibido inyecciones en
las encías de tipo polisacárido bacteriano para inducir la
inflamación local en el Ejemplo 3.
Según la invención, una tetraciclina hidrófoba
tiene una eficaz actividad inhibidora de elastasa de
serin-proteinasa.
La elastasa de leucocitos humanos (HLE) y la
catepsina G son serin-proteinasas que se encuentran
en los gránulos azurofílicos de leucocitos polimorfonucleares
humanos (neutrófilos). Esta elastasa se denomina a veces elastasa de
neutrófilos humanos (HNE). El sustrato natural, elastina, es una
proteína flexible que es altamente reticulada por desmosina y
\alpha-isodesmosina y otros restos reticulantes.
La elastasa de serin-proteinasa es capaz de degradar
fibras elásticas, colágeno de tipo IV (que se produce en la
membrana de basamento de los vasos sanguíneos), colágeno de tipo III
que se produce en las encías y músculos lisos, proteoglicanos,
glicoproteínas de adhesión como fibronectina y laminina. TIMP y
otros componentes proteicos de tejidos conectivos y fluidos
intersticiales.
La elastasa de leucocitos humanos (HLE) de
serin-proteinasa tiene la capacidad potencial de la
destrucción de tejidos en muchos estados de enfermedad como
artritis, enfermedad periodontal, glomerulonefritis, enfermedad
pulmonar aguda, fibrosis cística y algunos cánceres malignos
caracterizados por la invasión de la matriz extracelular por células
tumorales. La actividad de HLE ha estado implicada en colapsos
sépticos, fallos orgánicos multisistémicos (MOF)y estados de
reperfusión-isquemia de miocardio. La actividad de
HLE ha estado también implicada en el mecanismo de la lesión
pulmonar asociada con el enfisema y con el síndrome de dificultad
respiratoria en adultos (ARDS). Se cree que el daño pulmonar está
provocado, al menos en parte, por un desequilibrio entre proteasas y
antiproteinasas endógenas (por ejemplo, TIMP y
\alpha_{1}-PI). La antiproteinasa endógena
principal que inhibe la elastasa de leucocitos es
\alpha_{t}-PI.
Se ha descubierto ahora que una tetraciclina
químicamente modificada puede ser usada para la actividad inhibidora
de la elastasa de leucocitos. La tetraciclina es una
4-des(dimetilamino)tetraciclina
hidrófoba, lo más preferentemente
6-desmetil-6-desoxi-4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-3). La inhibición de la HLE no solamente
reducirá la lesión directa de tejidos provocada pro esta enzima,
sino que también conservará los niveles de la TIMP, manteniendo así
los inhibidores endógenos de MMP en su estado activo.
La inhibición de proteasas de neutrófilos usando
tetraciclinas no antibacterianas no plantea una respuesta eficaz a
la infección a ningún riesgo apreciable porque estos compuestos,
cuando son empleados a dosis congruentes con su actividad inhibidora
in vitro, no son propensos a obstaculizar la capacidad de los
neutrófilos para extravasar e invadir los estromas intersticiales en
respuesta a los quimio-atractores generados en los
sitios de infección bacteriana.
Se ha encontrado ahora que ciertas CMT,
particularmente la CMT-3, demuestran una sustancial
actividad inhibidora de elastasa de leucocitos mientras que la
minociclina, doxiciclina y otras tetraciclinas químicamente
modificadas no exhiben ninguna actividad inhibidora sustancial de
elastasa de leucocitos.
La actividad de diversas tetraciclinas fue
investigada empleando un ensayo in vitro de lesión
inflamatoria de tejidos en la que se permitió que neutrófilos
humanos degradaran una matriz extracelular estromal intersticial
completa (ECM) preparada por vía biosintética. Un neutrófilo es un
tipo de leucocito (leucocito polimorfonuclear). Los estudios con
este sistema experimental muestran que la degradación mediada por
neutrófilos de esta ECM puede ser inhibida de forma virtualmente
completa mediante la adición de \alpha_{1}-PI,
que es un potente inhibidor de elastasa de leucocitos así como un
sustrato competitivo para las MMP. E.J. Roemer, K.J. Stanton, y S.R.
Simon, "In Vitro Assay Systems for Inflammatory
Cell-Mediated Damage to Interstitial Extracellular
Matrix," In Vitro Toxicol. 7,75-81 (1994);
E.J. Roemer, K.J. Stanton y S.R. Simon, "In Vitro Assay
Systems for Cell Interactions With Interstitial Extracellular
Matrix," In Vitro Toxicol. 7, 209-224
(1994). Cuando se ensayaron las tetraciclinas (Ejemplo 1) en cuanto
a su capacidad para inhibir la degradación de ECM en este sistema, a
una dosis, por ejemplo, de 30 \muM, la CMT-3 fue
muy superior a las demás tetraciclinas en la protección de la ECM de
la destrucción mediada por neutrófilos, como se muestra en la Figura
1. En estudios adicionales de respuesta a la dosis usando este
ensayo in vitro, se pudo conseguir una inhibición de
aproximadamente 50% de la degradación de ECM mediada por neutrófilos
con 25-50 \muM. La mayoría de las otras
tetraciclinas ensayadas sobre el mismo intervalo de dosis fueron
incapaces de inhibir más de -20% de la degradación de ECM mediada
por neutrófilos usando este ensayo.
La inhibición directa de HLE por
CMT-3 se determinó (Ejemplo 2) usando una
modificación del ensayo de la actividad de la elastasa de leucocitos
humanos (HLE) descrito por Ying y cols. (Q. Ying, A.R. Rinehart,
S.R. Simon y J.C. Cheronis, "Inhibition of Human Leukocyte
Elastase by Ursolic Acid: Evidence for a Hydrophobic Binding Site
for Pentacyclic Triterpenes," Biochem. J. 277,
521-526 (1991)) en el que se redujeron las
concentraciones de detergente y disolvente orgánico, usando un
ensayo tradicional de actividad de elastasa de leucocitos humanos
(HLE) mediante la medición de la amidolisis del sustrato de
oligopéptido cromógeno,
metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilida.
Este oligopéptido se supone que generalmente ocupa los cinco
primeros subsitios del dominio de unión del sustrato extendido en
HLE. Usando una combinación de gráficos Dixon y
Cornish-Bowden para analizar los datos de la
velocidad de la misma forma que se describió previamente para otros
inhibidores de elastasa no péptidos por Ying y cols. {Biochem. J.
277, 521-526 (1991)), se mostró que la
CMT-3 es un inhibidor predominantemente competitivo
de la amidolisis de
metoxisuccinil-ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilida,
con un valor aparente de K de 18-40 \muM, como se
ilustra en las Figuras 3A,B y 4A,B. Por el contrario, la
doxiciclina, que es capaz de inhibir la actividad de
MMP-8 in vitro con un valor de K_{1} de
25-50 \muM, es solamente un inhibidor muy débil de
HLE, con un exceso de K_{1} de 300 \muM, como se muestra por la
pendiente del gráfico Dixon en la Figura 5. cuando se emplea
CMT-3 en el ensayo de degradación de ECM mediado por
HLE purificada en lugar de neutrófilos vivos, se demuestra que es un
inhibidor eficaz, con un valor aparente de I_{50} de \sim
25-50 \muM.
Los ensayos in vivo (Ejemplo 3)
demostraron que la administración de CMT-3 a ratas
en las que se indujo una inflamación periodontal aguda mediante la
administración de endotoxina, redujo la actividad de la elastasa de
leucocitos, según se ensayó mediante un ensayo amidolítico con el
sustrato
succinil-Ala-Ala-p-nitroanilida.
Los estados que pueden ser tratados según la
presente invención se producen en sujetos mamíferos. Los pacientes
humanos son con diferencia los sujetos más importantes, pero el
método puede ser practicado para el aprovechamiento de otros
mamíferos que incluyen, por ejemplo, animales mascotas como perros y
gatos y animales de laboratorio, como ratas y ratones, así como
animales de granja.
La invención puede ser usada para tratar sujetos
que padecen un deterioro de tejidos que resulta de una excesiva
actividad de elastasa de leucocitos humanos, por ejemplo, en algunas
enfermedades pulmonares y enfermedades renales. Las enfermedades
pulmonares de este tipo incluyen fibrosis cística, enfisema,
síndrome de dificultad respiratoria en adultos como una complicación
de un politraumatismo, estrés quirúrgico, sepsia, o como un
componente de un fallo orgánico multisistémico; también una lesión
pulmonar aguda que resulta de la inhalación de agentes tóxicos como
ácidos, productos químicos, venenos industriales y militares y el
humo de otros productos tóxicos de combustión. Las enfermedades
renales de este tipo incluyen glomerulonefritis y fallo renal agudo
como una complicación de politraumatismo o sepsia, o como un
componente de un fallo orgánico multisistémi-
co.
co.
La invención puede ser usada también para tratar
lesiones y enfermedades inflamatorias de la piel que incluyen una
infiltración considerable de la unión
dérmica-epidérmica con neutrófilos y que da lugar a
la separación de la unión dérmica-epidérmica. Estos
estados pueden ser de origen inmunológico (autoinmune o como
consecuencia de reacciones de fármacos) o puede ser provocado por
una toxina bacteriana (como en la "piel escaldada" de niños).
Es altamente probable que la elastasa de leucocitos contribuya a la
destrucción de la unión dérmica-epidérmica en estos
estados. Algunas lesiones provocadas por agentes vesicantes químicos
(que incluyen exposiciones tanto industriales como militares) en los
que se produce una infiltración neutrofílica y la separación de la
unión dérmica-epidérmica, incluyen también elastasa
de leucocitos, y son también candidatos para un tratamiento por
medio de terapia con CMT-3. Algunas lesiones
oculares tienen también infiltración neutrofílica como un componente
de la herida, y pueden ser tratadas más eficazmente con una
antiproteinasa como CMT-3.
La invención incluye la administración del
compuesto de tetraciclina en una cantidad que sea eficaz para
reducir o inhibir consecuencias indeseables asociadas con una
excesiva actividad de elastasa de leucocitos. El compuesto de
tetraciclina preferido es modificado químicamente para reducir o
eliminar sus propiedades antimicrobianas. Esta tetraciclina
químicamente modificada puede ser usada a niveles superiores a los
de las tetraciclinas antimicrobianas, aunque evitando ciertas
desventajas, como la destrucción indiscriminada de microbios
beneficiosos que acompañan a menudo el uso de cantidades
antimicrobianas o antibacterianas de estos compuestos.
La dosificación máxima para un sujeto es la
dosificación más elevada que no provoca efectos secundarios
indeseables o intolerables. Por ejemplo, el compuesto de
tetraciclina puede ser administrado en una cantidad de
aproximadamente 0,1 mg/kg/día a aproximadamente 24 mg/kg/día y,
preferentemente, de aproximadamente 2 mg/kg/día a aproximadamente 18
mg/kg/día. Para los fines de la presente invención, los efectos
secundarios incluyen una actividad antimicrobiana o antibacteriana
clínicamente significativa, así como efectos tóxicos. Por ejemplo,
una dosis por encima de aproximadamente 50 mg/kg/día producirá
probablemente efectos secundarios en la mayoría de los mamíferos,
incluidos los seres humanos. En cualquier caso, el facultativo puede
guiarse por la experiencia y los conocimientos en el campo técnico,
y la presente invención incluye, sin limitación, las dosificaciones
que sean eficaces para conseguir los fenómenos descritos.
La composición farmacéutica preferida para ser
usada en la invención comprende una combinación del compuesto de
tetraciclina en un vehículo farmacéutico adecuado, como es entendido
por lo facultativos de la técnica.
Para los fines farmacéuticos anteriormente
descritos, la tetraciclina de la invención puede ser formulada por
sí misma en preparaciones farmacéuticas opcionalmente con adyuvantes
o vehículos conocidos farmacéuticamente aceptables. Estas
preparaciones pueden ser realizadas según métodos químicos
convencionales y pueden ser administradas por vía interna, por
ejemplo, por vía oral mediante comprimidos o líquidos, o por medio
de supositorios; por vía parenteral, pro ejemplo, por vía
intravenosa, intramuscular o subcutánea, en forma de soluciones o
suspensiones inyectables; por vía tópica en la forma de una
pulverización o aerosol de gotitas dentro del intervalo respirable
para la inhalación en los pulmones y vías respiratorias. Estos
aerosoles pueden incluir vehículos como preparaciones de
tensioactivos pulmonares que pueden contribuir a una eficacia
terapéutica adicional. Puede ser empleada una administración de
liberación retardada o de suministro controlado.
Las preparaciones farmacéuticas o cosméticas
contienen una cantidad eficaz inhibidora de
serin-proteasa, particularmente inhibidora de
elastasa de leucocitos de la tetraciclina.
En otra realización, la tetraciclina puede ser
usada como un agente en preparaciones cosméticas como cremas y
lociones para la piel, mascarillas cosméticas, parches cosméticos,
vendajes cosméticos y champúes para tratamientos cosméticos. Debe
entenderse que el término "cosmético" está destinado a indicar
un realce o mejora de la apariencia física.
Para una aplicación tópica o cosmética, las
formulaciones adecuadas incluyen, pero sin limitación, liposomas,
soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos,
linimentos, pomadas, aerosoles, etc., que, si se desea, son
esterilizados y/o mezclados con agentes auxiliares, por ejemplo,
conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, tampones o sales
para influir en la presión osmótica, etc.
Debe apreciarse que las cantidades reales
preferidas de compuesto activo en un caso especifico variarán según
las composiciones particulares formuladas, el modo de aplicación y
los sitios particulares del sujeto que está siendo tratado. Las
dosificaciones serán determinadas usando consideraciones
convencionales, por ejemplo, mediante una comparación habitual de
las actividades diferenciales de las formulaciones de un agente
conocido, por ejemplo, por medio de un protocolo farmacológico o
cosmético convencional y apropiado.
Para usos cosméticos, pueden incorporarse a la
tetraciclina muchos materiales adicionales biocompatibles o
biológicamente inertes. "Biocompatible" significa que es no
tóxico o no perjudicial para los tejidos humanos y no humanos. Estos
materiales adicionales incluyen, por ejemplo, humectantes, es decir,
sustancias que tienen afinidad al agua como glicerina,
propilenglicol o isopropanol-propilenglicol, sales
orgánicas o inorgánicas como compuestos de amonio cuaternario y
sales de zinc, alcoholes como alcohol bencílico o alcoholes
alifáticos inferiores, látices polímeros, materiales de carga como
sílice y talco, aceites como aceite mineral, aceite de ricino y
petrolato, agentes humectantes o dispersantes o tensioactivos como
copolímeros de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno,
colorantes, fragancias, pigmentos, óxido de zinc, dióxido de
titanio, medicamentos tópicos como salicilato de metilo,
nicotinatos, capsaicina y mentol, medicamentos
anti-acné como peróxido de benzoilo, resorcinol y
ácido retinoico, antibacterianos tópicos como sulfadiazina de plata,
otras tetraciclinas y cefazolina, agentes hidratantes de la piel
como ácido pirrolidino-carboxílico de sodio y
agentes protectores solares absorbentes de radiaciones
UV-A y/o UV-B como ácido
p-aminobenzoico (PABA) o
4-N,N-dimetilaminobenzoato de
2-etilhexilo (Padimate O). Pueden usarse también
sustratos para proporcionar un refuerzo, una barrera gaseosa o
líquida, o protección de la zona de tratamiento. Los sustratos son
virtualmente ilimitados e incluyen películas de polímeros, hojas
metálicas, materiales celulósicos y otros materiales naturales o
sintéticos.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ayudar a una mejor comprensión de la invención y no están destinados
a ser limitativos de su alcance razonable.
La actividad inhibidora de
serin-proteinasa de las tetraciclinas se ensayó
usando un ensayo in vitro de la lesión inflamatoria de
tejidos en la que se permitió que neutrófilos humanos (PMN vivos)
degradaran una matriz extracelular estromal intersticial completa
(ECM) preparada biosintéticamente producida por medio de células de
músculos lisos cardíacos de rata R22 cultivadas como se describe por
Roemer y cols. (E.J. Roomer, K.J. Stanton y S.R Simon, "In
Vitro Assay Systems for Inflammatory
Cell-Mediated Damage to Interstitial Extracellular
Matrix", In Vitro Toxicol. 7,75-81 (1994);
E.J. Roemer, K.J. Stanton y S.R. Simon, "In Vitro Assay
Systems for Cell Interactions With Interstitial Extracellular
Matrix," In Vitro Toxicol. 7,209-224
(1994). Se añadieron diez tetraciclinas diferentes modificadas
químicamente (CMT) denominadas CMT-1 a
CMT-10 y doxiciclina, a concentraciones que variaban
en el intervalo de 5 \muM
a 50 \muM a la ECM simultáneamente con una suspensión de 2 x 10^{6} PMN humanas viables/ml en solución de sales equilibradas de Hank (HBSS). En estos estudios, la ECM fue radiomarcada metabólicamente con H^{3}-prolina, y los recuentos solubilizados después de seis horas de incubación se midieron y se compararon con los recuentos liberados después de una incubación solamente con PMN. Los resultados para concentraciones de 5 \mum, 25 \mum y 50 \mum se muestran en la Tabla 1 y los resultados para 30 \mum se muestran la Figura 1.
a 50 \muM a la ECM simultáneamente con una suspensión de 2 x 10^{6} PMN humanas viables/ml en solución de sales equilibradas de Hank (HBSS). En estos estudios, la ECM fue radiomarcada metabólicamente con H^{3}-prolina, y los recuentos solubilizados después de seis horas de incubación se midieron y se compararon con los recuentos liberados después de una incubación solamente con PMN. Los resultados para concentraciones de 5 \mum, 25 \mum y 50 \mum se muestran en la Tabla 1 y los resultados para 30 \mum se muestran la Figura 1.
La Tabla 1 y la Figura 1 muestran que la
CMT-3 era capaz de conseguir una inhibición
significativa de la degradación de ECM mediada por neutrófilos
(inhibición de \sim 50% a concentraciones de \geq
25-30 \muM) y con una buena inhibición de la
degradación de ECM a todas las dosis empleadas en este ensayo. La
CMT-8 y la CMT-10, particularmente
la CMT-8, a algunas concentraciones, mostraron
alguna inhibición de la degradación de ECM.
La Figura 2 ilustra una comparación de la
potencia inhibidora de CMT-3 25 \muM
(COL-3) en ensayos paralelos de la degradación de
ECM mediada por 2 x 10^{6} PMN/ml o por medio de HLE purificada 10
\muM, usando los mismos métodos anteriormente citados.
El efecto inhibidor directo de las tetraciclinas
sobre la actividad amidolítica de la elastasa de leucocitos humanos
/HLE) se evaluó mediante el método descrito por Ying y cols.,
Biochem. J. 277, 521-526 (1991), modificado
rebajando la concentración en DMSO hasta 2% y eliminando el uso del
detergente Triton X-100. Para evitar la adsorción
dependiente del tiempo de HLE en las paredes de las microplacas de
96 pocillos usadas en los análisis amidolíticos, las placas fueron
previamente tratadas con una solución de albúmina de suero bovino al
0,2%. Se empleó una gama de concentraciones del sustrato de
oligopéptido cromógeno
metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilida
desde 100 \muM hasta 300 \muM para todas las mediciones; se cree
que este sustrato ocupa los subsitios de unión del sustrato S_{1}
a S_{5} en HLE sobre la base de análisis cristalográficos de rayos
X (W. Bode, E. Meyer y J. C, Powers, "Human Leukocyte and Porcine
Pancreatic Elastase: X-Ray Crystal Structures,
Mechanism; Substrate Specificity, and
Mechanism-Based Inhibitors," Biochemistry
28, 1951-1963 (1989)). La inhibición de la
actividad amidolítico se analizó mediante los métodos gráficos de
Dixon (M. Dixon, Biochem. J. 55, 170-171
(1953)) y Cornish-Bowden (A.
Comish-Bowden, Biochem. J. 137,
143-144 (1974)) como en Ying y cols.: intersección
de gráficos de Dixon obtenidos a diferentes concentraciones de
sustrato en un punto por encima del eje X que establece un mecanismo
de inhibición no competitiva pura, mientras que los gráficos
paralelos de Cornish-Bowden obtenidos a diferentes
concentraciones de sustrato son congruentes con la inhibición
competitiva pura. La concentración de sustrato a la que los gráficos
de Dixon intersecan es una medida de la K_{i} para el inhibidor.
Los gráficos típicos de Dixon y Cornish-Bowden para
la inhibición de HLE por CMT-3
(COL-3) se ilustran en las Figuras 3A,B y 4A,B. A
partir de estos datos, el valor de K_{i} para la inhibición de la
actividad amidolítica de HLE por CMT-3 se puede
estimar que es de 25-40 \muM. En presencia de
dimetilsulfóxido al 10% y Triton X-100 al 0,1%, la
potencia inhibidora de CMT-3 se reduce
considerablemente, apoyando la conclusión de que las interacciones
hidrófobas contribuyen a la estabilización de la unión de
CMT-3 a HLE.
Se determinó la actividad inhibidora de la
doxiciclina hacia la amidolisis de
metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilida
por HLE también en presencia de 2% de DMSO y sin detergente, como se
describió anteriormente para CMT-3. El análisis de
la pendiente del gráfico de Dixon para la inhibición de la actividad
amidolítica de HLE por doxiciclina indica un valor mucho más elevado
de K_{i}, de aproximadamente 300 \muM, como se ilustra en la
Figura 5. Otros derivados de tetraciclina que mostraron una potencia
comparablemente baja o nula como inhibidores de la actividad
amidolítica de HLE fueron oxitetraciclina y su
4-epímero, epi-oxitetraciclina;
clorotetraciclina y su 4-epímero,
epi-clorotetraciclina; anhidroclorotetraciclina; y
CMT-5, una tetraciclina modificada químicamente en
la que los restos oxo e hidroxi en la base de los cuatro anillos
condensados están sustituidos por un anillo de pirazol. Se cree que
como carece únicamente de cualquiera de los sustituyentes en las
posiciones 6 ó 4 del sistema de anillos condensados de las
tetraciclinas, inesperadamente parece que la CMT-3
es capaz de unirse con una afinidad mucho mayor a HLE que a
cualquiera de las otras tetraciclinas ensayadas.
La capacidad de la CMT-3 para
inhibir HLE no está restringida a ensayos amidolíticos, como ya se
mostró en la Figura 2, en la que la degradación de una matriz
extracelular intersticial completa por HLE purificada es inhibida
por CMT-3. La potencia de la actividad inhibidora de
CMT-3 en este ensayo de inhibición de la degradación
de la matriz por HLE es comparable a la determinada a partir de los
ensayos de la actividad amidolítica de HLE, consistente con la
interpretación de que el mecanismo de inhibición en los dos tipos de
ensayos incluye la unión de CMT-3 a la enzima de una
forma que bloquea la unión de cualesquiera sustratos de péptidos o
proteínas. En el ensayo de degradación mediada por HLE de ECM, las
otras tetraciclinas ensayadas no fueron eficaces a dosis comparables
a las ensayadas con CMT-3.
Se demostró la capacidad de CMT-3
administrada por vía oral (COL-3) para reducir la
actividad in vivo de la elastasa de leucocitos en un modelo
de animal de inflamación aguda e infiltración neutrofílica, usando
un protocolo experimental análogo al descrito por Chang y cols.
(K.M. Chang, M.E. Ryan, L.M. Golub, N.S. Ramamurthy y T.F. McNamara,
"Local and Systemic Factors in Periodontal Disease Increase
Matrix-Degrading Enzyme Activities in Rat Gingiva:
Effect of Minocycline Therapy," Res. Comm. Mol. Path. Pharm.
91, 303-318 (1996)). Las ratas recibieron 0,01
mg de liposacárido (LPS) de E. coli o solamente un vehículo
de solución salina inyectado en un volumen de 10 \mul
en la encía labial maxilar y mandibular en días alternados durante un período de seis días. Dos conjuntos de ratas también recibieron 2 mg o 5 mg de CMT-3 diariamente en un volumen de 1 ml, administrado por alimentación oral forzada, durante el período de seis días, mientras que los otros conjuntos de ratas recibieron solamente el vehículo de 2% de carboximetilcelulosa. Al final de este período de tratamiento de seis días, los animales fueron sacrificados y los tejidos de las encías fueron diseccionados. Los tejidos de cada grupo experimental fueron reunidos, congelados y descongelados y extraídos para ensayos de la actividad enzimática según el procedimiento de Yu y cols. (Z. Yu, N.S. Ramamurthy, M. Leung, K.M. Chang, T.F. McNamara y L.M. Golub, "Chemically Modified Tetracycline Normalizes Collagen Metabolism in Diabetic Rats," J. Periodont. Res. 28, 420-428 (1993)). La actividad de la elastasa de leucocitos se valoró usando el sustrato succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida según el procedimiento de Ramamurthy y Golub (1983) (N.S, Ramamurthy y L.M. Golub, "Diabetes Increases Collagenase Activity in Extracts of Rat Gingiva and Skin," J. Periodont. Res. 18, 23-30 (1983)). El descubrimiento expuesto en la presente memoria descriptiva es la capacidad de la CMT-3 administrada por vía oral para reducir el nivel de actividad de elastasa de leucocitos en los extractos de encías de ratas inyectadas con LPS. La Figura 6 ilustra los niveles reducidos de actividad de elastasa de leucocitos en los extractos de encías de ratas inyectadas con LPS tratadas con ambas dosis de CMT-3, en comparación con la actividad de elastasa en extractos de encías de ratas que recibieron inyecciones de LPS y alimentación forzada de vehículo solo o inyecciones de solución salina. La administración de CMT-3 parece que reduce los niveles de la actividad de elastasa en los extractos de encías de ratas inyectadas con LPS hasta los niveles detectados en animales que recibían inyecciones en las encías de solución salina sola. Este resultado demuestra que la administración de CMT-3 in vivo da lugar a niveles reducidos de elastasa de leucocitos en los sitios de inflamación aguda localizada con infiltración de neutrófilos.
en la encía labial maxilar y mandibular en días alternados durante un período de seis días. Dos conjuntos de ratas también recibieron 2 mg o 5 mg de CMT-3 diariamente en un volumen de 1 ml, administrado por alimentación oral forzada, durante el período de seis días, mientras que los otros conjuntos de ratas recibieron solamente el vehículo de 2% de carboximetilcelulosa. Al final de este período de tratamiento de seis días, los animales fueron sacrificados y los tejidos de las encías fueron diseccionados. Los tejidos de cada grupo experimental fueron reunidos, congelados y descongelados y extraídos para ensayos de la actividad enzimática según el procedimiento de Yu y cols. (Z. Yu, N.S. Ramamurthy, M. Leung, K.M. Chang, T.F. McNamara y L.M. Golub, "Chemically Modified Tetracycline Normalizes Collagen Metabolism in Diabetic Rats," J. Periodont. Res. 28, 420-428 (1993)). La actividad de la elastasa de leucocitos se valoró usando el sustrato succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida según el procedimiento de Ramamurthy y Golub (1983) (N.S, Ramamurthy y L.M. Golub, "Diabetes Increases Collagenase Activity in Extracts of Rat Gingiva and Skin," J. Periodont. Res. 18, 23-30 (1983)). El descubrimiento expuesto en la presente memoria descriptiva es la capacidad de la CMT-3 administrada por vía oral para reducir el nivel de actividad de elastasa de leucocitos en los extractos de encías de ratas inyectadas con LPS. La Figura 6 ilustra los niveles reducidos de actividad de elastasa de leucocitos en los extractos de encías de ratas inyectadas con LPS tratadas con ambas dosis de CMT-3, en comparación con la actividad de elastasa en extractos de encías de ratas que recibieron inyecciones de LPS y alimentación forzada de vehículo solo o inyecciones de solución salina. La administración de CMT-3 parece que reduce los niveles de la actividad de elastasa en los extractos de encías de ratas inyectadas con LPS hasta los niveles detectados en animales que recibían inyecciones en las encías de solución salina sola. Este resultado demuestra que la administración de CMT-3 in vivo da lugar a niveles reducidos de elastasa de leucocitos en los sitios de inflamación aguda localizada con infiltración de neutrófilos.
Por tanto, se ha descrito lo que actualmente se
cree que son las realizaciones preferidas de la invención, y los
expertos en la técnica se darán cuenta de que se pueden hacer
cambios y modificaciones en las mismas sin apartarse de las
características generales de la invención, y está previsto
reivindicar todos estos cambios y modificaciones para que caigan
dentro del verdadero alcance de la invención.
Claims (11)
1. Uso de una tetraciclina hidrófoba para
elaborar una composición para inhibir la excesiva actividad de
elastasa de leucocitos en un sistema biológico, en el que la
tetraciclina hidrófoba comprende
6-desmetil-6-desoxi-4-des(dimetilamino)-tetraciclina
(CMT-3).
2. Uso según la reivindicación 1, en el que la
composición es una composición cosmética.
3. Uso según la reivindicación 1, en el que la
composición es una composición farmacéutica.
4. Uso de una tetraciclina hidrófoba para
elaborar una composición para tratar un sujeto que padece un
deterioro de tejidos que resulta de una excesiva actividad de
elastasa de leucocitos, en el que la tetraciclina hidrófoba
comprende
6-desmetil-6-desoxi-4-des(dimetilamino)-tetraciclina
(CMT-3).
5. Uso según la reivindicación 4, en el que el
sujeto es un mamífero.
6. Uso según la reivindicación 4, en el que el
deterioro de tejidos que resulta de la excesiva actividad de
elastasa de leucocitos es una enfermedad pulmonar.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que la
enfermedad pulmonar es fibrosis cística, enfisema, síndrome de
dificultad respiratoria en adultos o lesión pulmonar aguda que
resulta de la inhalación de materias tóxicas.
8. Uso según la reivindicación 7, en el que el
síndrome de dificultad respiratoria es una complicación de
politraumatismos, estrés quirúrgico, sepsia o es un componente de un
fallo orgánico multisistémico.
9. Uso según la reivindicación 7, en el que la
materia tóxica es un ácido, un producto químico, un veneno
industrial, un veneno militar, humo o un producto tóxico de
combustión.
10. Uso según la reivindicación 4, en el que el
deterioro de tejidos que resulta de la excesiva actividad de
elastasa de leucocitos es una enfermedad renal.
11. Uso según la reivindicación 10, en el que la
enfermedad renal es glomerulonefritis, fallo renal agudo como una
complicación de un politraumatismo o sepsia, o fallo renal agudo
como un componente de un fallo orgánico multisistémico.
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