ES2643485T3 - Hialuronidasa bacteriana y proceso para su producción - Google Patents

Description

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hialuronidasa a partir del ADN genómico utilizado como molde, produciendo un producto de PCR con una única banda específica de aproximadamente 550 pb. La secuenciación de nucleótidos del fragmento proporcionó la secuencia (SEQ ID NO: 8) mostrada en la Fig. 2.

La técnica de PCR inversa (IPCR) se desarrolló y realizó para identificar las regiones nucleotídicas flanqueando la secuencia génica así identificada (Fig. 3). El método IPCR que utiliza el par de cebadores SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 permitió obtener productos de PCR, respectivamente de aproximadamente 700 y 1400 pb, que, una vez secuenciados, proporcionaron información exacta sobre el gen completo que codifica la hialuronidasa de S. koganeiensis. Con este paso, se completa la identificación de la secuencia de nucleótidos de interés (SEQ ID NO: 13), mostrada en (figura 4).

Se utilizan un par de cebadores diseñados sobre las secuencias no codificantes (SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15) y flanqueando el gen completo que codifica la hialuronidasa para la amplificación del gen completo (SEQ ID NO: 16) y el producto de PCR (figura 5) se clonó directamente en el vector pCR®-Bluntll-TOPO® (Invitrogen) en células de E. coli. A partir de los resultados obtenidos del análisis bioinformático se observó que toda la longitud del gen que codifica la hialuronidasa de S. koganeiensis era de 744 pb (SEQ ID NO: 17) y que la longitud de la secuencia peptídica se estimaba en 247 aminoácidos (SEQ ID NO: 18). El gen contiene un dominio putativo (SEQ ID NO: 19) de proteínas pertenecientes a la familia de hialuronidasas (Hyaluronidase_1), como se evidencia mediante la búsqueda de homologías en una base de datos. Además, el análisis de la secuencia (SEQ ID NO: 18) utilizando una herramienta específica indicó la presencia de una secuencia señal (péptido señal) de 30 aminoácidos (aminoácidos 1 a 30 (SEQ. ID. NO: 47), con el sitio de escisión entre el aminoácido 30 y 31). Por lo tanto, la proteína madura (SEQ ID NO: 21) tiene 217 aminoácidos de longitud (secuencia de nucleótidos correspondiente 651bp (SEQ ID NO: 22)) y su peso molecular predicho (http://web.expasy.org/compute_pi/) es 21679.96 Da.

Finalmente, el análisis BLAST para las homologías de secuencia muestra una homología parcial entre la secuencia de aminoácidos determinada de hialuronidasa de S. koganeiensis ATCC 31394 (SEQ ID NO:27) con algunas de las secuencias de aminoácidos de proteínas hipotéticas pertenecientes a la familia Aactinobacteria informada en la base de datos de la web.

Existe una homología de secuencia entre una región de la secuencia (SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 52) de la hialuronidasa de S. koganeiensis (de acuerdo con la invención) y uno de los módulos presentes en el dominio de aminoácidos de CD44 murino que une el ácido hialurónico (Figura 7 (a)).

El ADNc que codifica la hialuronidasa de S. koganeiensis de acuerdo con la invención (SEQ ID NO: 41) se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pCR-BluntII-TOPO [sk_HYAL] y se ligó, después de ser digerido con enzimas de restricción, en los diferentes plásmidos usados de acuerdo con a esta invención, por ejemplo:

Vector

Cebadores usados Enzimas de restricción Longitud del nucleótido clonado de (SEQ ID NO: 41) Plásmido obtenido

pHT43

SEQ ID NO: 28 5'gtaGGATCCGCCGGG GAAACGGCGCGACGACGA3' BamHI 672bp pHTsk_HYAL (figura 13a)

SEQ ID NO: 29 5'gacTCTAGATCACGCC GGTGCGATCGTCGTGACC3'

Xbal

pET22b (+)

SEQ ID NO: 32 5'tggCCATGGCCGGGG AGAACGGCGCGACGACGA + 3' Ncol 671bp pHyal sk (+) (Fig. 13, b)

SEQ ID NO: 33 5'ctcGAATTCtcaCGCC GGTGCGATCGTCGTGACC3'

EcoRI

pET21b

(SEQ ID NO: 36) 5'aCATATGGCCGGGGA Ndel 672bp pHyal sk SL (Fig. 13, c)

(+)

GAACGGCGCGACGACGA3'

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Sin embargo, los mejores resultados en términos de producción, estabilidad y repetibilidad, se encontraron usando fermentaciones con el método del lote alimentado. La ampicilina, la neomicina, la canamicina o el cloranfenicol pueden utilizarse como antibióticos de acuerdo con las características de los vectores específicos.

Por ejemplo, se inoculó el clon de E. coli "BL21 (DE3) -pHyal_sk_SL" a partir de un vial (procedente del banco de células de trabajo almacenado a -80ºC) en medio de cultivo LB Miller fresco (relación 1/20 con respecto al volumen de fermentación) que contiene 50 μg/ml de ampicilina y se incuba a 37ºC a 150 rpm durante 16-18 horas. El clon procedente del inóculo se cultivó en el fermentador en un medio de cultivo mínimo a pH 6,8.

Preferentemente se administró una solución de glicerol como alimento. Durante el proceso de fermentación, E.coli genera ácido acético (acetato) como un subproducto indeseable que tiene numerosos efectos negativos sobre la producción de proteínas recombinantes. La cantidad de acetato que se forma durante la fase de fermentación está directamente relacionada con la cantidad de glucosa consumida por las células en crecimiento de E. coli [15]. En la presente invención, se encontró que al usar glicerol como una fuente de carbono (fuente de carbono de bajo coste no fermentable) en lugar de glucosa, se obtiene un aumento aproximadamente de 3 veces en el proceso de producción alimentado por lote para la producción de hialuronidasa recombinante. Como ejemplo no limitativo, la alimentación se puede proporcionar 6 horas después de la inoculación hasta la decimonovena hora (tiempo de inducción) con una relación de adición exponencial. Después de la inducción con isopropil β-D-1tiogalactopiranósido (IPTG), solución final de 1 mM, la alimentación se puede administrar al cultivo cada hora y en la misma cantidad que la última adición durante 5 horas. La inducción tiene lugar 24 horas después de la inoculación y continúa durante 8-24 horas, típicamente 12 horas. Las células bacterianas se recogen después del período de inducción, por centrifugación, y se almacenan a -80ºC. Las células de E. coli BL21 (DE3) transformadas con el vector pHyal_sk_SL producen la forma recombinante en el periplasma celular con una concentración máxima alcanzada de aproximadamente 2 g por litro de cultivo y una actividad enzimática superior a 87000 U/ml de cultivo (7,5 x 107 -8,7 x 107 UI/l de cultivo) obtenido después de 12 horas de inducción con IPTG 1 mM a 37ºC (Tabla 2).

Tabla 2: Resultado de los lotes de fermentación del clon rHyal_Sk, llevado a cabo para la presente invención

Lote

5C11 7C11 9C11 10C11 11C12

Método de fermentación

Lote Lote alimentado Lote alimentado Lote alimentado Lote alimentado

Hialuronidasa producida en el final de la fermentación (g/l)

0,5 1 1,5 1,2 2,1

Biomasa final (O.D.600nm)

32,7 42 51,6 64 55

Volumen de fermentación

8 10 10 10 10

Gránulos celulares (g/l)

81,2 83 116 115 149

Volumen del inóculo

0,4 0,5 0,5 0,5 1

Biomasa del inóculo (O.D.600nm)

3 3 3 2 2,2

Volumen de alimentación (L)

0 1,5 1,5 1,5 2,5

Inicio de alimentación (h)

/ 6 6 6 6

Tiempo de inducción (h)

16 12 12 12 12

Estabilidad del plásmido en el final de la fermentación (%)

100 95 100 100 100

Duración total de la fermentación (h)

~22 36 36 36 36

La cantidad de hialuronidasa producida de acuerdo con esta invención fue aproximadamente 670-750 veces mayor que la hialuronidasa autóloga producida en el fermentador como se describe en la patente anterior [9].

La proteína recombinante expresada por E. coli, en los diferentes parámetros de fermentación, se analizó por electroforesis en SDS-PAGE (12%) después de tinción con Azul Brillante de Coomassie G-250 (BIO-RAD, 1610406) que tenía un peso molecular de 24 kDa, mientras que la actividad enzimática se analizó por ensayo turbidimétrico [16].

La hialuronidasa recombinante producida en el fermentador por el método alimentado por lote se puede purificar mediante un proceso que comprende al menos tres etapas cromatográficas.

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En la preparación de la primera purificación, se colocan los gránulos almacenados a -80ºC (procedentes de la fermentación alimentada por lotes de E. coli BL21 (DE3) transformada con el vector pHyal_sk_SL) en una cantidad equivalente a 0,6 litros de producto de fermentación (aproximadamente equivalente al intervalo de 80-90 g de gránulos celulares que refleja aproximadamente una producción de 1-1,2 g/l de hialuronidasa recombinante) para equilibrar durante 45 minutos a temperatura ambiente.

Una vez equilibrados, los gránulos se trataron con una solución fresca (5ºC) para la dispersión del gránulo. Los sedimentos resuspendidos se trataron con una solución para que el choque osmótico favoreciera la extracción de las proteínas periplásmicas. Después de la etapa del choque osmótico, el producto obtenido se centrifugó y el sobrenadante resultante, una vez homogeneizado, se llevó a pH 8 y se filtró mediante filtros de gravedad con filtros de 0,65 μl. La concentración de la hialuronidasa extraída se evaluó en SDS-PAGE, resultando ser aproximadamente 750-900 mg/total (16-22% del total de proteínas periplásmicas). La actividad de la hialuronidasa recombinante extraída se evaluó por el método turbidimétrico de Dorfman.

La fracción proteica con la actividad enzimática de hialuronidasa así obtenida se somete a cromatografía de intercambio aniónico fuerte (ejemplo: Q sepharose XL).

La fracción proteica con actividad enzimática de hialuronidasa así obtenida se concentra a 100 ml utilizando filtros de polietersulfona (PES) con un corte de 5 kDa y se diluye 10 veces con tampón de acetato de sodio 50 mM a pH 4.

La fracción de proteína con actividad enzimática de hialuronidasa así obtenida se sometió a cromatografía de intercambio catiónico débil (ejemplo: CM-Sepharose® Fast Flow).

La fracción proteica con actividad enzimática de hialuronidasa así obtenida se concentró a 100 ml utilizando filtros de polietersulfona (PES) con un corte de 5 kDa y se diluyó 10 veces con tampón de fosfato sódico 50 mM con sulfato de amonio 1,5 mM, pH 7.

La fracción proteica con actividad enzimática de hialuronidasa así obtenida se somete a cromatografía de interacción hidrofóbica aromática (ejemplo: fenilsefarosa HP) y las proteínas eluidas de esta última etapa cromatográfica se recogieron en una única fracción que tenía un volumen de aproximadamente 730 ml y se sometieron a ensayo de actividad de hialuronidasa. Después del análisis de la actividad enzimática, la fracción eluida se sometió a ultrafiltración y diálisis con 10 volúmenes de PBS 1x (Sigma-P4417) se llevó a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml y se filtró con filtros de 0,2 μl, la concentración de proteína se determinó mediante el Kit de Reactivos de Ensayo de Proteínas BCA (PIERCE).

Al final del proceso de purificación aplicado sobre aproximadamente 1 l del producto de fermentación, se obtuvieron aproximadamente 600-650 mg de hialuronidasa recombinante y una actividad enzimática superior a 2,6 x 107 por litro de producto purificado de la fermentación (Tabla 3).

Tabla 3: Resultado de la hialuronidasa recombinante purificada de acuerdo con la presente invención

Muestra

Hialuronidasa (U/ml) Volumen (ml) Hialuronidasa (total U) Producción (%) Hialuronidasa Total mg

Producto de fermentación

Carga 48000 600 4,8x107 100 1000

Extracción periplásmica

Eluida 7600 5000 3,8 x107 80 800

Q-Sepharose® XL

Carga 7600 5000 3,8 x107 100 800

Eluido

23100 950 2,2 x107 57,8 462

Flujo rápido CM -Sepharose®

Carga 23100 1000 2,2 x107 100 462

Eluido

57900 380 2,2 x 107 100 462

Fenil Sepharose® HP

Carga 22000 1000 2,2 x107 100 462

Eluido

26000 730 1,9 x 107 88,8 410

DIA/Filtración

Carga 26000 730 1,9 x107 100 410

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Conc. y DIA/Filtr.

48570 350 1,7 x 107 93 381

DIA/Filtración 5k

Carga 45300 375 1,7 x107 100 381

Filtr. 0,22μm

Eluido 45000 375 1,69 x 107 99,5 378

Producción total por litro de cultivo (%)

35

Cantidades totales por litro de cultivo (UI)

2,8 x107

Cantidades totales por litro de cultivo (mg)

630

Cantidades totales por gramo de gránulos (UI)

2,1 x107

Cantidades totales por gramo de gránulos (mg)

4,8

En todas las fracciones con actividad de hialuronidasa había una banda de proteína marcada a aproximadamente 24 kDa (figura 16), la banda se sometió a electroforesis SDS-PAGE con gel al 12% y a continuación se sometió a transferencia sobre membrana de difluoruro de polivinilideno (BIO-RAD) y se tiñó de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el proveedor. La banda de hialuronidasa se escindió con un escalpelo y se cargó en la cámara de reacción del secuenciador.

La secuenciación del extremo N-terminal así llevada a cabo permitió establecer que la hialuronidasa recombinante producida de acuerdo con la invención a partir de la muestra de E. coli transformada con el vector pHyal_sk_SL de acuerdo con la invención proporcionó cromatogramas en los que una sola secuencia de aminoácidos N-terminal estaba significativamente presente, lo que permite reconstruir la secuencia experimental mostrada a continuación: AGENGA (SEQ ID NO: 42).

El potencial enzimático de la hialuronidasa producida de acuerdo con la invención (E. coli transformada con el vector pHyal_sk_SL) se evaluó por comparación con la actividad enzimática de la hialuronidasa autóloga [9], utilizando el ensayo enzimático descrito [9] y se informó que el valor de la actividad era en ambos casos mayor que 4x104 UI/mg de proteína.

Además, en el análisis realizado por dicroísmo circular (DC), la línea negra de los archivos de superposición (hialuronidasa autóloga [9]) y la línea gris (hialuronidasa heteróloga de acuerdo con la invención) tienen un perfil comparable, confirmando la misma estructura proteica para ambos muestras (Fig. 17-a).

En comparación con la técnica anterior [9], el método de acuerdo con la presente invención permite:

-obtener una hialuronidasa de origen bacteriano de una cepa de E. coli bien caracterizada como segura, más que de Streptomyces koganeiensis, por tecnología recombinante (en lugar de la de extracción) adecuada para la producción a escala industrial, con producción en el periplasma (en lugar de en la matriz extracelular);

-alcanzar una actividad de hialuronidasa máxima sorprendentemente alta, superior a 80000 U por mililitro de cultivo, frente, por ejemplo, a 130 U por mililitro de sobrenadante de cultivo en el método de [9] y, en cualquier caso, claramente superior a los obtenibles con otros conocidos procesos;

-obtener hialuronidasa de alta pureza (> 99%) con solo 3 pasos cromatográficos (en lugar de 5), con beneficios económicos significativos y tiempos de procesamiento reducidos.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una hialuronidasa de Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 en una forma purificada y que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. No. 21.

La proteína de la presente invención puede ser aislada y producida a partir de Streptomyces koganeiensis o producida de forma recombinante, por ejemplo, a partir de cultivos de E. coli o Bacillus subtilis.

Se encontró sorprendentemente que, en comparación con la proteína conocida de Streptomyces koganeiensis [9], la enzima de la presente invención tiene:

•

un mayor nivel de pureza (99% frente a 98%)

•

un nivel inferior de endotoxinas (<0,5 U/mg en lugar de > 0,5 U/mg);

•

presencia de toda la secuencia peptídica (y la correspondiente secuencia de nucleótidos), que no tiene cisteína (reduciendo así la posibilidad de producir agregados);

•

mayor estabilidad en la solución a 5ºC (100% de estabilidad a los 24 meses versus 94% a los 24 meses de la proteína [9]);

•

excelente estabilidad a 20ºC (100% a los 24 meses), a pH 3-11,5 (probado hasta 24 horas);

•

máxima actividad a pH fisiológico (alrededor de 7) y temperatura corporal (alrededor de 37ºC);

5 • estabilidad en la sangre superior al 90%.

La hialuronidasa según la presente invención es un producto derivado de la ingeniería genética; hasta el momento, no hubo disponibilidad de todo el gen que codifica la proteína, ya que no había banco genómico o de proteínas de la cepa de S. koganeiensis. Sólo con el método desarrollado por los inventores descritos en la presente memoria se ha identificado y aislado la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína. Este fragmento de nucleótidos es la

10 primera secuencia de ADN aislada y documentada de esta cepa bacteriana. A nivel industrial, la posibilidad de poder obtener toda la secuencia del gen que codifica esta hialuronidasa con alta actividad enzimática permite su uso en diferentes sistemas tales como: vectores, sistemas de integración genómica y en células, ventajosos para la producción y el uso de la enzima en la industria farmacéutica.

Otro resultado sorprendente de la presente invención es el muy alto rendimiento del procedimiento reivindicado, que

15 se desarrolló a través de una actividad de cribado compleja con diferentes vectores de expresión, diferentes tipos de inserción del fragmento nucleotídico que codifica la proteína en el vector de expresión (es decir, la inserción del fragmento con algunos sitios de restricción con respecto a otros) y el cribado de la producción en diferentes líneas celulares. Esta actividad, aún más compleja puesto que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína no estaba disponible; por lo tanto, no permitiendo aplicar lo que era conocido por el experto en la técnica, ha permitido

20 la identificación del tipo más adecuado de clonación, tipo de vector y células de expresión para obtener una producción tan inesperadamente alta. La expresión y el modelo de producción de la proteína recombinante de acuerdo con la invención permite obtener, al final del proceso de purificación, una proteína pura con un nivel de endotoxina < 0,5 U/mg de proteína, usando solo tres etapas cromatográficas en lugar de 5 como se encuentra en el proceso conocido (endotoxinas > 0,5 U/mg de proteína) [9].

25 La enzima adecuadamente purificada se caracteriza por los ensayos cuyos resultados se enumeran en la tabla 4.

Tabla 4. Resultado de los ensayos de caracterización de la hialuronidasa recombinante producida según la presente invención a partir del clon rHyal_Sk.

Análisis

Hialuronidasa recombinante

Secuenciación de N-terminal Ensayo de Proteínas Método (Lowry/BCA)

1 mg/ml AGENGA

lSDS-Page

> 99%

Enfoque Isoeléctrico Teórico I. P.5.5

90% (I. P. 5,2 + 0,4)

SEC -HPLC

100%

RP – HPLC

> 99%

Cartografía de péptidos (por LC -MS) Identidad con secuencia de aminoácidos de referencia

94% (<90%)

Ensayos patentados de HCP para Límite de E. coli <100 ppm

6,5-8,8 ppm

Sistema Umbral (Ensayos de ADN patentado para Límite de E. coli <300 pg/mg)

19 pg/mg

Chromo-LAL

< 0,5 U/mg

Coeficiente de Extinción Molar

12383 L*mol-1*cm-1 ABS 280 (= 1 g/l) 0,570

Espectrometría de Masa de MW Teórico de Proteínas 21679,96

21679,98 + 0,82

5

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Análisis

Hialuronidasa recombinante

Electroforesis de Pureza En Capilar (Zona)

100%

Agregados moleculares (análisis UV250-350 nm)

Sin agregado

Solución pH en (1x PBS)

~7,5

La hialuronidasa de acuerdo con la presente invención tiene la actividad y características de alta pureza que son necesarias para su uso en aplicaciones industriales, diagnósticas y terapéuticas. Además, en comparación con otras hialuronidasas conocidas hasta ahora, la hialuronidasa producida de acuerdo con la presente invención ha demostrado ser una enzima que es capaz de hidrolizar el ácido hialurónico presente en la matriz intersticial, incrementando la permeabilidad del tejido conectivo y favoreciendo la difusión y dispersión del fármaco, administrado localmente por vía subcutánea, en los tejidos circundantes con extrema estabilidad sin la posibilidad de ser digerido por las enzimas proteolíticas presentes en el tejido conectivo, lo que fácilmente podría degradarlo una vez inyectado, inhibiendo así su acción (figura 24).

En esta invención, gracias a la provisión de un modelo experimental in vitro utilizando el método turbidimétrico, se confirmó lo que ya había surgido de estudios clínicos previos, esto es, la actividad enzimática de hialuronidasa bovina (PH20 bovina) es inhibida por sangre humana y/o animal, pero se encontró, sin embargo, que la sangre humana y/o animal no inhibe la hialuronidasa a partir de S. koganeiensis recombinante (Fig. 25).

Por lo tanto, a partir de los estudios presentados en este documento se encontró que la hialuronidasa recombinante de la invención (producida de acuerdo con el método anterior o de S. koganeiensis) tiene una elevada actividad hialuronidasa, tiene una alta estabilidad frente a las enzimas proteolíticas y es capaz de realizar, con su biodisponibilidad máxima, la actividad total en el torrente sanguíneo sin posibilidad de infecciones bacterianas y virales. Por lo tanto, puede encontrar uso, solo o en combinación con otros principios activos, en la preparación de composiciones farmacéuticas o veterinarias destinadas al tratamiento de patologías donde es necesario o ventajoso degradar el ácido hialurónico presente en el órgano o tejido afectado por la patología.

Gracias a su alta estabilidad en solución acuosa, la hialuronidasa de la invención también puede formularse en forma de composiciones a base de agua tales como soluciones, cremas hidrófilas, hidrogeles, así como en forma de productos lipófilos tales como ungüentos o cremas aceitosas.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. Nº 17 que codifica la hialuronidasa bacteriana de Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. No. 21.

En otra realización, la presente invención se refiere a un vector recombinante modificado genéticamente que comprende dicho polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. No. 17.

Preferiblemente, dicho vector es un plásmido.

En otra realización, la presente invención proporciona una célula huésped que comprende dicho vector.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición adecuada para uso farmacéutico o cosmético que comprende la hialuronidasa de Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 en una forma purificada y que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. Nº 21, obtenible a partir del método anterior o por extracción de Streptomyces koganeiensis.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a la hialuronidasa de Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 en una forma purificada y que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. No. 21, obtenible por el método anterior o por extracción de Streptomyces koganeiensis, para uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o trastorno, opcionalmente en combinación con al menos otro principio activo.

La hialuronidasa de la presente invención se puede aplicar tanto en el campo médico como en el campo veterinario. Preferentemente, la hialuronidasa de acuerdo con la invención es para uso en el tratamiento y/o la prevención de al menos uno de entre edemas, estados inflamatorios, sabañones, tumores sólidos, alergias mediadas por IgE, enfermedades de la cavidad oral, hemorragias vítreas espontáneas, arteriosclerosis, trastornos de la presión de la sangre, trastornos cardio-cerebrovasculares, tales como estenosis arterial cerebral o accidente cerebrovascular o mastitis bovina.

En lo que respecta al uso humano, sin pretender limitarse a él, la hialuronidasa de la invención puede utilizarse para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de edemas, en particular edemas sobre una base traumática, o afecciones inflamatorias tales como el síndrome hemorroide; además, puede utilizarse para la preparación de composiciones destinadas al tratamiento de los sabañones. La hialuronidasa de la invención

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El ADNc que codifica la hialuronidasa de S. koganeiensis (SEQ ID NO: 41) se amplificó por PCR a partir del plásmido pCR-BluntII-TOPO [sk_HYAL] extraído y purificado de células de E. coli con DNA Purification System Wizard Plus SV Minipreps y utilizando los cebadores siguientes: sentido (5'-aCATATGGCCGGGGAGAACGGCGCGACGACGA-3' (SEQ ID NO: 36)); antisentido (5'ctcGAATTCtcaCGCCGGTGCGATCGTCGTGACC-3' (SEQ ID NO: 37)). Los ciclos de la PCR realizados para la amplificación fueron: desnaturalización inicial a 96ºC durante 5 minutos; 30 ciclos de recocido a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 1 minuto y después la desnaturalización a 96ºC durante 40 segundos. La Taq ADN polimerasa utilizada para la amplificación fue DyNAzyme™ II DNA Polimerasa (FINNZYME) (Fig. 8). El producto amplificado (672 pb) se purificó mediante el Kit Wizard SV Gel y PCR Clean-Up System (Promega), digerido con Ndel (BioLabs) y EcoRI (BioLabs), y se ligó usando T4 ligasa (Ambion) con el vector pET21b (+) (Novagen) previamente digerido con Ndel y EcoRI (Fig. 8). Una vez que tuvo lugar la ligasa, el vector se transformó dentro de las células DH5a de la cepa E. coli (código Invitrogen 12297-016) por tratamiento químico. Las células después de la transformación se sembraron en agar LB que contenía ampicilina (50 μg/ml) y se incubaron a 37ºC durante 16 h. Las colonias obtenidas se analizaron para verificar la ligasa correcta producida entre el fragmento del gen de la hialuronidasa y el vector por PCR (desnaturalización inicial a 94ºC durante 5 minutos, para 30 ciclos: recocido a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 60 segundos y después la desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto), gracias a la ayuda de cebadores específicos de vector (promotor T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (SEQ ID NO: 34), terminador T7: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3' (SEQ ID NO: 35)). El producto de la PCR obtenido (874 pb) junto con los productos obtenidos por digestión del vector pHyal_sk_SL [vector con inserto] (figura 12) con enzimas de restricción (Ndel, EcoRI), se analizó por electroforesis en gel de agarosa al 1% Fig. 9), utilizando las normas de referencia para el peso molecular (ΦΧ174 DNA y λDNA/HindIII de Fermentas). Para el análisis del marco correcto del gen que codifica la hialuronidasa después de haber sido ligada con el vector, se secuenció la secuencia del producto de PCR. La secuencia de nucleótidos obtenida (SEQ ID NO: 40) después de la secuenciación (Figura 13, c) se analiza utilizando herramientas bioinformáticas tales como ClustalW, Traslate (ExPASy) y Chromas life.

Ejemplo 8: Cepas bacterianas hospedantes usadas para la clonación y la expresión del gen de hialuronidasa de S. koganeiensis.

Se utilizó DH5α de la cepa Escherichia coli (Invitrogen, Genotipo: F-φ80lacZΔM15 Δ (lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdRl7 (rk-, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relAl tonA (confiere resistencia al fago Tl) [22], como huésped para la amplificación del plásmido del sistema de clonación. Esta cepa es proporcionada por Invitrogen (One Shot Max Efficiency DH5α-T1R, E. coli quimicamente competente, 12297-016). Las células se descongelaron y se cultivaron en medio sólido agar LB (10 g/l de peptona de caseína, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl, 15 g/l de agar bacteriológico) que contenía MgSO4 10 mM y se cultivaron durante 18 h a 37ºC. A partir del cultivo resultante, se toma una sola colonia y se cultiva en caldo TYM (triptona 20 g/l, extracto de levadura 5 g/l, 20 ml de NaCl 5 M, MgSO4 1 mM) a 37ºC. A partir del cultivo, las células resultantes se tratan químicamente para obtener células químicamente competentes. Las células obtenidas se reparten y se almacenan a -80ºC en un tampón de almacenamiento apropiado que contiene 15% de glicerol. Las transformaciones se realizan sobre este stock de alícuotas.

B. subtilis WB800N (Genotipo: nprE aprE epr bpr mpr :: ble nprB :: bsr vpr wprA :: hyg cm :: neo; NeoR [23]), proporcionado por MOBITEC, es una cepa bacteriana gram-positiva caracterizada por un déficit de ocho proteasas, como resultado es una cepa bacteriana que se utiliza para la producción de proteínas heterólogas secretadas. El gen de resistencia a la neomicina también se insertó en este gen, tomando la nomenclatura de WB800N. Las células de esta cepa bacteriana después de una producción apropiada se hicieron competentes, se repartieron y se almacenaron a -80ºC en un tampón de almacenamiento apropiado que contenía glicerol al 15%. Las transformaciones se realizan sobre este stock de alícuotas.

La cepa MG1655 de Escherichia coli (número ATCC: 12297-016, genotipo: F-lambda-[24, 25]), se usó como huésped en el sistema de expresión del gen de hialuronidasa de S. koganeiensis. La cepa bacteriana es proporcionada por la American Type Culture Collection (ATCC). Las células liofilizadas se cultivaron en primer lugar en pocos ml de medio líquido y luego en medio sólido LB agar (10 g/l de peptona de caseína, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl) que contenía MgSO4 10 mM y se cultivó durante 18 h a 37ºC. A partir del cultivo resultante, se toma una sola colonia y se cultiva en caldo TYM a 37ºC. A partir del cultivo, las células resultantes se tratan químicamente para obtener células químicamente competentes. Las células obtenidas se reparten y se almacenan a -80ºC en un tampón de almacenamiento apropiado que contiene 15% de glicerol. Las transformaciones se realizan sobre este stock de alícuotas.

Se utilizó la cepa de Escherichia coli BL21 (DE3) (E. coli BF-dcm ompT HSDS (rB-mB-) gal λ (DE3) [26, 27]), como huésped para el sistema de expresión del gen que codifica la hialuronidasa de S koganeiensis. La cepa bacteriana es proporcionada por Novagen con el código 69450-3. Las células se cultivaron en primer lugar en pocos ml de medio líquido y luego en medio sólido agar LB (10 g/l de peptona de caseína, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl) que contenía MgSO4 10 mM y se cultivó durante 18 h a 37ºC. A partir del cultivo resultante, se toma una sola colonia y se cultiva en caldo TYM a 37ºC. A partir del cultivo, las células resultantes se tratan químicamente para obtener células químicamente competentes. Las células obtenidas se reparten y se almacenan a -80ºC en un

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tampón de almacenamiento apropiado que contiene 15% de glicerol. Las transformaciones se realizan sobre este stock de alícuotas.

Ejemplo 9: Transformación de plásmidos pHTsk_HYAL, pHyal_sk y pHyal_sk_SL en células de expresión.

Las células DH5a que contenían respectivamente los vectores pHTsk_HYAL, pHyal_sk y pHyal_sk_SL se pusieron en cultivo en aproximadamente 6 ml de caldo LB con ampicilina (50 μg/ml) y se cultivaron durante 16-18h. Los cultivos respectivos después del crecimiento de las células modificadas se centrifugaron a aproximadamente 5000 g durante 10 minutos. Los plásmidos respectivos pHTsk_HYAL, pHyal_sk y pHyal_sk_SL se extrajeron y purificaron a partir del gránulo obtenido utilizando el kit Wizard Plus SV minipreps DNA Purification System (Promega). Los vectores purificados pHTsk_HYAL, pHyal_sk y pHyal_sk_SL se transforman por separado en células de expresión. El primer vector se transforma en células, hechas competentes, de Bacillus subtilis (WB800N-MOBITEC) mientras que los otros dos vectores se transforman en células, hechas competentes, de E. coli, cepa BL21 (DE3) y/o MG1655. Todas las transformaciones se llevaron a cabo mediante el tratamiento químico [13]. Las células de B.subtilis y E. coli después de la transformación, respectivamente, se colocan en agar LB que contiene cloranfenicol (10 μΜ) más neomicina (10 μΜ) y en agar LB que contiene ampicilina (50 μg/ml) para desarrollar resistencia al antibiótico, y se incuba a 37ºC durante 16 h. Las colonias obtenidas después de las respectivas transformaciones se analizaron para verificar la presencia del plásmido correcto dentro de las células de expresión, mediante PCR (desnaturalización inicial a 94ºC durante 5 minutos, durante 30 ciclos: recocido a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 60 segundos y después la desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto), gracias a la ayuda de cebadores específicos de especie (Directo: 5'-TGTGGAATTGTGAGCGGATA-3' (SEQ ID NO: 30), Inverso: 5'-TTTCAACCATTTGTTCCAGGT-3' (SEQ ID NO: 31)) para el análisis de la transformación exitosa en B. subtilis y para verificar la transformación exitosa en E. coli. (Promotor T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (SEQ ID NO:34), terminador T7: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3' (SEQ ID NO: 35)). Los productos de la PCR obtenidos para las células transformadas con pHTsk_HYAL (927 pb), pHyal_sk (940 pb) y pHyal_sk_SL (874 pb) se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% usando patrones de referencia para el peso molecular (ΦX174 DNA y λDNA/HindIII de Fermentas). Para el análisis del marco correcto del gen que codifica la hialuronidasa después de enlazarse al vector, se secuenció la secuencia de los productos de la PCR. La secuencia de nucleótidos obtenida después de la secuenciación se analiza utilizando herramientas bioinformáticas tales como el Vector NTI Advance 9 (Invitrogen), ClustalW, Traslate (ExPASy) y Chromas life. (Figura 13a, b, c).

Ejemplo 10: Evaluación del nivel de expresión de la hialuronidasa recombinante.

Los clones de B. subtilis resultaron ser positivos para la presencia de vectores que contienen el fragmento de nucleótidos de hialuronidasa encontrado genéticamente con la secuencia de marco para la expresión correcta (SEQ ID NO: 41), se ensayan para el nivel de expresión y luego las células así modificadas se inoculan en frascos que contienen 500 ml de caldo LB con cloranfenicol (10 μm, Sigma) y neomicina (10 μm, Sigma), y se incuban a 37ºC a 250 rpm. Cuando el valor del crecimiento celular alcanza una OD600nm de 0,8, se llevan con IPTG (Sigma, 16758) a una concentración final de 1 mM. Después de 12 horas de inducción, el cultivo bacteriano se centrifuga a 7500 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante del cultivo se recoge para evaluar la expresión en B. subtilis.

Posteriormente, el sobrenadante de los ensayos de expresión en B.subtilis se concentró (20 veces) y se dializó en tampón fosfato 1x mediante ultrafiltración en filtros especiales de polietersulfona con un corte de 5 kD.

En SDS-PAGE, el recombinante expresado tenía un peso molecular de aproximadamente 24 kDa con la expresión máxima después de la inducción con IPTG 1 mM a OD600nm 0,8 después de 12 horas a 37ºC.

La expresión y localización de la expresión de hialuronidasa en las células de B. subtilis (SEQ ID NO: 21), en los diferentes clones analizados, se determinó por electroforesis en SDS-PAGE (12%) después de tinción con Azul de Coomassie Brilliant G-250 (BIO-RAD, 161 -0406) y con un ensayo enzimático apropiado, por ejemplo, el ensayo de Dorfman.

Ejemplo 11: Evaluación del nivel de expresión de hialuronidasa recombinante en E. coli

Los clones de E. coli resultaron ser positivos para la presencia respectiva de vectores que contienen el fragmento nucleotídico de hialuronidasa encontrado genéticamente con la secuencia de marco (SEQ ID NO: 41) para la expresión correcta (SEQ ID NO: 21) se analizaron para detectar el nivel de expresión, se inocularon en matraces que contenían 500 ml de caldo LB con ampicilina (50 g/ml, Sigma) y se incubaron a 37ºC a 250 rpm. Cuando el valor de crecimiento celular alcanza OD600nm 0,8, se llevan con IPTG (Sigma, 16758) a una concentración final de 1 mM. Las células bacterianas se cosechan después de 3-4 horas de inducción, por centrifugación a 7500 rpm durante 10 minutos. Después de la centrifugación, el sedimento bacteriano se recoge para la evaluación de la expresión en células modificadas de E. coli y para verificar en qué porción de la célula se produce el recombinante.

Posteriormente, los gránulos procedentes de las células de E. coli inducidas con IPTG se trataron con la Proteína Bacteriana B-PER (PIERCE) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el proveedor, para evaluar la expresión de hialuronidasa en la porción periplásmica y/o citoplásmica y/o para formar cuerpos de inclusión. Ambos clones de E. coli que contenían respectivamente los plásmidos pHyal_sk y pHyal_sk_SL expresaron el recombinante en forma soluble en la porción periplásmica:

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E. coli BL21 (DE3) que contiene pHyal_sk. En SDS-PAGE, el recombinante expresado tiene un peso molecular de aproximadamente 24 kDa, constituyendo aproximadamente 40% de las proteínas bacterianas totales después de la inducción a OD600nm 0,8 con IPTG 1 mM durante 3-4 horas a 37ºC. Sin embargo, de la cantidad de recombinante expresado, sólo el 18% (sólo 7,2% en total) está presente en forma soluble en el periplasma, el 82% restante tiene cuerpos de inclusión (sólo 32,8% en total). La porción soluble periplásmica resulta estar presente a una concentración máxima de 52 μg/ml de cultivo, con una actividad enzimática igual a aproximadamente 2100 U/ml de cultivo.

E. coli BL21 (DE3) que contiene pHyal_sk_SL. En SDS-PAGE, el recombinante expresado tiene un peso molecular de aproximadamente 24 kDa, que constituye aproximadamente el 15% de las proteínas bacterianas totales después de la inducción a DO 600 nm 0,8 con IPTG 1 mM durante 3-4 horas a 37ºC. Además, toda la proteína expresada está presente en forma soluble en el periplasma. La porción soluble periplásmica resultó estar presente a una concentración de aproximadamente 125 μg/ml de cultivo, con una actividad enzimática mayor que 5000 U/ml de cultivo.

Tanto la expresión como la localización de la expresión de hialuronidasa en las células de E. coli en los diferentes clones analizados se determinó por electroforesis en SDS-PAGE (12%) después de tinción con Azul de Coomassie Brilliant G-250 (BIO-RAD, 161 -0406) y con un ensayo enzimático apropiado, por ejemplo el ensayo de Dorfman.

Ejemplo 12 Desarrollo del banco de células maestras y el banco de células de trabajo de cepas recombinantes

Banco de Células Maestras (MCB)

Bajo esterilidad, se tomó una única colonia de las colonias pertenecientes a la cepa productora y se resuspendió en un matraz estéril que contenía 10 ml de medio líquido (caldo LB con cloramfenicol (10 μm, Sigma) y neomicina (10 μm, Sigma) con respecto a las células recombinantes de B.subtilis y caldo LB con ampicilina (50 μg/ml, Sigma) con respecto a las células recombinantes de E. coli) y se incubaron a 200 rpm a 37ºC durante aproximadamente 16 horas. Después del periodo de incubación y después de los controles adecuados sobre la esterilidad del cultivo, se transfirieron respectivamente 10 ml de cada cultivo en 100 ml de medio líquido (caldo LB con cloramfenicol (10 μm, Sigma) y neomicina (10 μm, Sigma) en lo que respecta a las células recombinantes de B. subtilis y caldo LB con ampicilina (50 μg/ml, Sigma) con respecto a las células recombinantes de E. coli) y se incubaron durante 5-6 horas a 37ºC a 200 rpm. De nuevo, después del período de incubación y después de los controles apropiados sobre la esterilidad del cultivo, se añadió una cantidad de glicerol estéril a cada cultivo hasta alcanzar una concentración final de glicerol igual al 15%. La mezcla se agita y se introducen alícuotas de 2 ml en viales criogénicos (CORNING, 430659) que se colocan inmediatamente a -80ºC.

El desarrollo del banco de células maestras se realizó en condiciones estériles para las cepas: cepa B. subtilis (WB800N-MoBitec) que contenía el plásmido diseñado con pHTsk_HYAL (clon 105), cepa E. coli (DH5α) que contenía el plásmido modificado con pHTsk_HYAL (clon 105), la cepa E. coli (DH5 α) y E. coli (BL21 (DE3)) que contiene el plásmido diseñado con pHyalsk (clon 413), cepa E. coli (DH5α) y E. coli (BL21 (DE3)) que contiene el plásmido modificado con pHyal_sk_SL (clon 225) y cepa E. (DH5 α) y E. coli (BL21 (DE3)) que contiene el plásmido modificado con pRH_sk (clon 600).

Banco de células de trabajo (WCB)

Bajo esterilidad, se tomó una alícuota de un vial del banco de células maestras y se ensayó en caldo LB de medio sólido con cloranfenicol (10 μΜ, Sigma) y neomicina (10 μΜ, Sigma) con respecto a las células recombinantes de B. subtilis y caldo LB con ampicilina (50 μg/ml, Sigma) o canamicina (30 μg/ml, SIGMA) con respecto a las células recombinantes de E. coli) y se incubaron a 200 rpm a 37ºC durante aproximadamente 18 horas. Bajo cubierta estéril, se tomó una única colonia de las colonias pertenecientes a la cepa productora y se resuspendió en un matraz estéril que contenía 10 ml de medio líquido (caldo LB con cloranfenicol (10 μΜ, Sigma) y neomicina (10 μΜ, Sigma) con respecto a las células recombinantes de B. subtilis y caldo LB con ampicilina (50 μg/ml, Sigma) o canamicina (30 μg/ml, SIGMA) con respecto a las células recombinantes de E. coli) y se incubaron a 200 rpm a 37ºC durante aproximadamente 16 horas. Después del período de incubación y después de controles adecuados sobre la esterilidad del cultivo, se transfirieron respectivamente 10 ml de cada cultivo en 100 ml de medio líquido (caldo LB con cloranfenicol (10 μΜ, Sigma) y neomicina (10 μm, Sigma) con respecto a las células recombinantes de B. subtilis y caldo LB con ampicilina (50 μg/ml, Sigma) o canamicina (30 μg/ml, SIGMA) en lo que respecta a las células recombinantes de E. coli) y se incubaron durante 5-6 horas a 37ºC a 200 rpm. De nuevo, después del período de incubación y después de los controles apropiados sobre la esterilidad del cultivo, se añadió una cantidad de glicerol estéril a cada cultivo hasta alcanzar una concentración final de glicerol igual al 15%. La mezcla se agita y se introducen alícuotas de 2 ml en viales criogénicos (CORNING, 430659) que se colocan inmediatamente a -80ºC.

El desarrollo del banco de células de trabajo se llevó a cabo con la máxima esterilidad y para las cepas: cepa B. subtilis (WB800N-MoBitec) que contenía el plásmido modificado con pHTsk_HYAL (clon de rialuronidasa 105), E. coli (BL21 (DE3)) que contenía el plásmido diseñado con pHyal_sk (clon de hialuronidasa 413), cepa E. coli (BL21 (DE3) que contiene el plásmido modificado con pHyal_sk_SL (clon rHyal_Sk) y para la cepa E. coli (BL21 (DE3)) que contiene el plásmido modificado genéticamente con pRH_sk (clon rH_sk).

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Los ensayos siguientes se realizaron tanto en MCB como en WCB para evaluar su pureza: evaluación del número de copias del plásmido de las células de MCB y WCB, análisis del plásmido por enzimas de restricción y separación de los fragmentos digeridos con gel de agarosa al 1%, evaluación de la conservación del glicerol en células que contienen el plásmido de expresión en el MCB y WCB, evaluación de la estabilidad de las células que contienen el plásmido de expresión en el MCB y WCB, viabilidad de células recombinantes en placas LB, identidad de las cepas E .coli, pureza del cultivo, ensayo de fagos Coli, evaluación del producto de expresión en SDS-PAGE, secuenciación de la región que codifica la proteína recombinante.

Ejemplo 13: Fermentaciones discontinuas de hialuronidasa recombinante.

La capacidad de los clones de E. coli BL21 (DE3) -pHyal_sk y BL21 (DE3) -pHyal_sk_SL para producir la hialuronidasa recombinante se evaluó por crecimiento en fermentadores por cultivo discontinuo.

El inoculo se prepara inoculando un vial (del banco de células de trabajo almacenado a -80ºC) en 400 ml de medio LB fresco (relación 1/20 con respecto al volumen de fermentación) que contiene 50 μg/ml de ampicilina y se incuba a 37ºC a 150 rpm durante 16 -18 horas. Los clones de los respectivos inóculos (E. coli BL21 (DE3) -pHyal_sk y BL21 (DE3) -pHyal_sk_SL) se cultivaron por separado en el fermentador en un medio de cultivo mínimo cuya composición por litro se proporcionó por: 2 g de Na2HPO4 * 2H2O, 2 g de KH2PO4, 4 g de K2HPO4, 3,8 g de ácido cítrico, 3,3 g de (NH4)2SO4, 40 ml de glicerol, 0,6 ml de antiespumante PPG 2000 (Fluka Code 81380). El pH se corrigió después de la esterilización a 121ºC a 6,8ºC con una solución al 25% de hidróxido de amonio % (SIGMA), y solo se añadieron los siguientes componentes por litro de medio, esterilizados por filtración a través de filtros de 0,2

g: 0,49 g de MgSO4 * 7H2O, 0,0147 g de CaCl2, 1 ml de FeCl2 (0,2 M), 2 ml de oligoelementos (oligoelementos por litro: 0,96 g de ácido cítrico, 0,25 g de CoCl2 * 6H2O, 1,5 g de MnCl2 * 4H2O, 0,15 g de CuCl2 * 2H2O, 1,5 g de H3BO3, 0,25 g de Na2MoO4 * 2H2O, 1,3 g de Zn(CH3COO) 2 * 2H2O), 0,01 g de tiamina, 5 g de glucosa, 3 g de extracto de levadura.

La inducción con isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) ocurre 4-6 horas después de la inoculación y continúa durante aproximadamente 16-18 horas. Los parámetros de fermentación desarrollados fueron los siguientes: temperatura 37ºC, agitación 600 rpm, flujo de aire 5-10 litros de aire por minuto y presión de cabeza de aproximadamente 0,8 bar.

Las células bacterianas se recogen después de un período de inducción de aproximadamente 16 horas por centrifugación a 7500 rpm durante 25 minutos. Después de la recogida, las células bacterianas se almacenan a 80ºC, listas para ser utilizadas para la extracción y purificación de la hialuronidasa recombinante. La proteína recombinante expresada por E. coli, en los diferentes parámetros de fermentación, se analiza mediante electroforesis en SDS-PAGE (12%) después de tinción con Azul Brillante de Coomassie G-250 (BIO-RAD, 1610406), mientras que la actividad de la enzima se analiza por ensayo turbidimétrico [16]. Las células de E. coli BL21 (DE3) transformadas con el vector pHyal_sk se indujeron a expresar la proteína heteróloga soluble en el periplasma, en el fermentador con 8 litros de medio. En SDS-PAGE, el recombinante expresado tenía un peso molecular de aproximadamente 24 kDa y una cantidad de proteína expresada en el periplasma celular de aproximadamente 0,1 0,15 g/L de cultivo, la cantidad máxima alcanzada después de 16 horas de inducción con IPTG 1 mM a 37ºC.

Las células de E. coli BL21 (DE3) transformadas con el vector pHyal_sk_SL son inducidas a expresar la proteína heteróloga soluble en el periplasma, en el fermentador con 8L de medio. La porción soluble periplásmica resultó estar presente a una concentración de aproximadamente 0,35-0,5 g/L de cultivo, con una actividad enzimática mayor que 15050 -21495 U/ml de cultivo. En SDS-PAGE, el recombinante expresado tenía un peso molecular de aproximadamente 24 kDa, constituyendo aproximadamente 18% de las proteínas bacterianas totales, después de la inducción con IPTG 1 mM a la decimosexta hora a 37ºC.

Para ambos clones, se encontró que la estabilidad del plásmido durante la fermentación era del 100% (Tabla 2). La estabilidad del plásmido se controla hasta el final de la fermentación mediante cribado con la técnica de revestimiento de replica [29] que permite la replicación de las colonias en placas que contienen el antibiótico.

Ejemplo 14: Fermentaciones en lotes alimentados de hialuronidasa recombinante.

La capacidad de los clones de E. coli BL21 (DE3) -pHyal_sk y BL21 (DE3) -pHyal_sk_SL para producir la hialuronidasa recombinante se evaluó mediante el crecimiento en fermentadores mediante el cultivo de lotes alimentados.

El inoculo se prepara inoculando un vial (del banco de células de trabajo almacenado a -80ºC) en 500 ml de medio LB fresco (relación 1/20 con respecto al volumen de fermentación) que contiene 50 μg/ml de ampicilina y se incuba a 37ºC a 150 rpm durante 16 -18 horas. Los clones de los respectivos inóculos (E. coli BL21 (DE3) -pHyal_sk y BL21 (DE3) -pHyal_sk_SL), fueron cultivados de forma separada en el fermentador en un medio de cultivo mínimo, cuya composición por litro fue dada por: 2 g de Na2HPO4 * 2H2O, 2 g de KH2PO4, 4 g de K2HPO4, 3,8 g de ácido cítrico, 3,3 g de (NH4)2SO4, 0,6 ml de antiespumante PPG 2000 (Código 81380 de Fluka). El pH se corrigió después de la esterilización a 121ºC hasta 6,8 con una solución al 25% de hidróxido de amonio (SIGMA), y sólo después de haber añadido los siguientes componentes por litro de medio, esterilizado por filtración a través de filtros de 0,2 μm: 0,49 g de MgSO4 * 7H2O, 0,0147 g de CaCl2, 1 ml de FeCl2 (0,2 M), 2 ml de oligoelementos (oligoelementos por litro: 0,96 g

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de ácido cítrico, 0,25 g de CoCl2 * 6H2O, 1,5 g de MnCl2* 4H2O, 0,15 g de CuCl2* 2H2O, 1,5 g de H3BO3, 0,25 g de Na2MoO4 * 2H2O, 1,3 g de Zn(CH3COO)2 * 2H2O), 0,01 g de tiamina, 5 g de glucosa, 3 g de extracto de levadura.

Se añadió una solución de glicerol (~1,2 kg por 10 l de fermentación) esterilizada en un autoclave como alimentación y se añadieron a continuación los siguientes componentes, previamente filtrados con filtros de 0,2 μm, por litro de alimento: 2 g de Na2HPO2 * 2H2O, 3 g de KH2PO4, 5,4 g de K2HPO4, 3,8 g de ácido cítrico, 4 g de (NH4) 2SO4, 9 g de MgSO4 * 7H2O, 0,047 g de CaCl2, 1 ml de FeCl2 (solución 0,2 M), 2 ml de elementos traza (oligoelementos por litro: 0,96 g de ácido cítrico, 0,25 g de CoCl2 * 6H2O, 1,5 g de MnCl2 * 4H2O, 0,15 g de CuCl2 * 2H2O, 1,5 g de H3BO3, 0,25 g de Na2MoO4 * 2H2O, 1,3 g de Zn(CH3COO)2 * 2H2O) y 0,01 g de tiamina. La alimentación se administra 6 horas después de la inoculación hasta la hora diecinueve con una relación exponencial de adición. La elección de utilizar el glicerol como fuente de carbono se debe al hecho de que las células de expresión de E. coli utilizadas generan ácido acético (acetato) como un subproducto no deseado que tiene numerosos efectos adversos sobre la producción de proteínas recombinantes [14]. En particular, las células de E. coli producen ácido acético como coproducto extracelular de la fermentación aerobia, la velocidad de formación de acetato está directamente relacionada con la velocidad a la que crecen las células o a la velocidad a la que consumen el sustrato sólido como fuente de carbono, la glucosa. En los sistemas de fermentación en lote alimentado común, la velocidad de crecimiento del cultivo se determina por la velocidad de alimentación del nutriente limitante "glucosa", lo que da como resultado un crecimiento celular por encima del umbral que conduce a una producción consiguiente de acetato y, por tanto, a una reducción de la expresión de proteínas recombinantes.

En esta invención, se han desarrollado diversas estrategias para limitar la acumulación de acetato con el fin de reducir los efectos negativos y aumentar la productividad de la proteína recombinante. Una estrategia que nos ha permitido obtener excelentes resultados fue utilizar el glicerol como fuente de carbono. El glicerol, a diferencia de la glucosa, no se fermenta al ácido acético. Los resultados obtenidos mostraron que el uso de glicerol, en lugar de glucosa, en el proceso de fermentación alimentada por lotes desarrollado en esta invención, ha mejorado el rendimiento de la proteína hialuronidasa recombinante soluble de aproximadamente 2 -3 veces [15]. Además, a diferencia de la glucosa que tiene un efecto inhibidor sobre el promotor que regula la síntesis de la proteína recombinante de esta invención, el glicerol puede administrarse a la fermentación también después de la inducción con IPTG, permitiendo la reducción no sólo de la formación de acetato sino también el aumento de la formación soluble de hialuronidasa recombinante. Además, el bajo coste del glicerol comparado con la glucosa lo hace preferente como una fuente de carbono para la fermentación de E. coli, en el campo industrial.

Después de la inducción con isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG), solución final 1 mM, se administra la alimentación al cultivo cada hora y en la misma cantidad que la última adición durante 5 horas. La inducción comenzó 24 horas después de la inoculación y continuó durante 12 horas. Los parámetros de fermentación desarrollados son los siguientes: temperatura 37ºC, agitación 600 rpm, flujo de aire 5-10 litros de aire por minuto y presión de cabeza de aproximadamente 0,8 bar.

Las células bacterianas se recogen después del período de inducción de 12 horas por centrifugación a 7500 rpm durante 25 minutos. Después de la recolección, las células bacterianas se almacenan a -80ºC, listas para ser utilizadas para la extracción y purificación de la hialuronidasa recombinante. La proteína recombinante expresada por E. coli, en los diferentes parámetros de fermentación, se analiza por electroforesis en SDS-PAGE (12%) después de tinción con Azul Brillante de Coomassie G-250 (BIO-RAD, 161-0406), mientras que la actividad de la enzima se analiza por ensayo turbidimétrico [16].

Las células de E. coli BL21 (DE3) transformadas con el vector pHyal_sk se indujeron a expresar la proteína heteróloga soluble en el periplasma, en el fermentador con 10 l de medio. En SDS-PAGE, el recombinante expresado tenía un peso molecular de aproximadamente 24 kDa y una cantidad de proteína expresada en el periplasma de aproximadamente 0,4 g/L de cultivo, la cantidad máxima alcanzada después de 6 horas de inducción con IPTG 1 mM a 37ºC (Figura 14).

Las células de E.coli BL21 (DE3) transformadas con el vector pHyal_sk_SL son inducidas a expresar la proteína heteróloga soluble en el periplasma, en el fermentador con 10 l de medio. La porción soluble periplásmica resultó estar presente a una concentración de aproximadamente 1,2 g/l de cultivo, con una actividad enzimática mayor que 48000 U/ml de cultivo. En SDS-PAGE, el recombinante expresado tenía un peso molecular de aproximadamente 24 kDa, constituyendo aproximadamente 16-18% de las proteínas bacterianas totales, después de la inducción con IPTG 1 mM a la duodécima hora a 37ºC (Figura 15).

Ejemplo 15: Fermentación alimentada por lotes de E. coli BL21 (DE3) transformada con el vector pHyal_sk_SL en 20L de medio.

En pocas palabras, las células de E. coli BL21 (DE3) transformadas con el vector pHyal_sk_SL son inducidas a expresar la proteína heteróloga soluble en el periplasma, en el fermentador con 20L de medio. Se encontró que la porción soluble periplásmica estaba presente a una concentración de aproximadamente 2 g/l de cultivo (Tabla 2) con una actividad enzimática mayor que 87000 U/ml de cultivo (7,5 x 107-8, 7 x 107 UI/l de cultivo), aproximadamente 670 -750 veces superior en comparación con la hialuronidasa autóloga producida en el fermentador como se describe en la patente anterior [9]. En SDS-PAGE, el recombinante expresado tenía un peso molecular de aproximadamente

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velocidad de 10000 rpm. Después de aproximadamente 1 hora, el gránulo resuspendido se centrifuga a 5ºC durante 45 minutos a una velocidad de aproximadamente 11.000 rpm usando una centrífuga Sorval Rc-5B con rotor Sorvall. Después de la centrifugación, el sobrenadante resultante se añadió en frío en una solución de 5l de Tris-HCl 50 mM, pH 8. La solución obtenida se agita durante 10 minutos a 4ºC, utilizando un agitador magnético Heidolph tipo MR2002 a una velocidad de 200 rpm. Después de agitar, la solución se homogeneizó usando el sistema "Ultra Turrax" con un nivel de velocidad 2 durante 15 segundos. El sobrenadante, después del tratamiento con Ultra Turrax, se llevó a pH 8 y se filtró por gravedad con filtros de 0,65 micrómetros. La concentración de la hialuronidasa extraída se evaluó en SDS-PAGE y se encontró que era de aproximadamente 0,9-1,1 g/total (16% -18% de las proteínas periplásmicas totales). La actividad de la hialuronidasa recombinante extraída se evalúa por el método turbidimétrico de Dorfman.

Ejemplo 18: Purificación recombinante

Las resinas y las columnas cromatográficas se adquirieron de GE Healthcare Life Sciences y se mantuvieron de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El balance y las etapas de elución se llevaron a cabo con un sistema de cromatografía líquida de rápido rendimiento (FPLC, AKTA explorer 100, GE Healthcare) a un flujo de 4050 ml/min para las 3 cromatografías. Al final de cada paso cromatográfico se controló la actividad hialuronidasa con el ensayo de Dorfman modificado descrito [9]. Una vez que la fracción soluble se extrae de la porción periplásmica, se carga en la primera cromatografía de intercambio iónico fuerte. Cromatografía de intercambio iónico fuerte (Q sepharose XL):

El extracto filtrado llevado a Tris-HCl 50 mM y pH 8 se cargó en 500 ml-600 ml de resina Q sepharose XL (GE Healthcare) envasada en una columna XK-50 (GE Healthcare) y equilibrada con 8 volúmenes de lecho (BVs) de tampón Tris-HCl a pH 8. Después de cargar, la columna se lavó, primero con 3 BV del mismo tampón y posteriormente con 8 BV de tampón Tris-HCl a pH 8 con NaCl 40 mM, después se eluyeron las proteínas unidas con 5 BV de una solución tampón Tris-HCl a pH 8 con NaCl 110 mM. Las proteínas eluidas se recogieron en una única fracción que tenía un volumen de aproximadamente 950 ml y se sometieron a un ensayo de actividad de hialuronidasa.

Diafiltración y cromatografía de intercambio iónico débil (CM-Sepharose® Fast Flow):

La fracción obtenida se concentra a 100 ml utilizando el sistema TFF de ultrafiltración tangencial (Millipore) y utilizando filtros de polietersulfona (PES) con un corte comprendido entre 3 y 8 kDa, preferiblemente de 5 kDa. Después de la concentración, la muestra se diluye 10 veces con tampón de acetato de sodio 50 mM a pH 4. La fracción así obtenida se cargó en una resina CM-Sepharose® Fast Flow de 300 ml a 400 ml (GE Healthcare), se empaquetó en una columna XK-50 (GE Healthcare) y se equilibró con 6 volúmenes de lecho (BV) de tampón de acetato de sodio 50 mM a pH 4,0. Después de cargar (preferiblemente a una temperatura de 4-5ºC), la columna se lavó con 3 BV del mismo tampón, después se eluyeron las proteínas unidas con 8 BV de una solución tampón de acetato de sodio 50 mM a pH 4,5. Las proteínas eluidas se recogieron en una única fracción que tenía un volumen de aproximadamente 380 ml y se sometieron a un ensayo de actividad de hialuronidasa.

Diafiltración y cromatografía de interacción hidrofóbica aromática (Phenyl-Sepharose HP).

La fracción obtenida y positiva a la dosificación enzimática se concentra a 100 ml usando el sistema de TFF de ultrafiltración tangencial (Millipore) y utilizando filtros de polietersulfona (PES) con un corte comprendido entre 3 y 8 kDa, preferiblemente de 5 kDa. Después de la concentración, la muestra se diluye 10 veces con tampón de fosfato de sodio 50 mM con sulfato de amonio 1,5 M, pH 7. La fracción así obtenida se cargó en 300 ml-400 ml de resina Phenyl-Sepharose HP (GE Healthcare), se empaquetó en una columna XK-50 (GE Healthcare) y se equilibró con 8 volúmenes de lecho (BV) de tampón fosfato sódico 50 mM con sulfato amónico 1,5M , pH 7. Después de cargar, la columna se lavó con 3 BV del mismo tampón, después se eluyeron las proteínas unidas con 5 BV de una solución de tampón de fosfato de sodio 50 mM con sulfato amónico 0,8 M, pH 7. Las proteínas eluidas se recogieron en una única fracción que tenía un volumen de aproximadamente 730 ml y se sometieron a ensayo de actividad de hialuronidasa. Después del ensayo de actividad enzimática, la fracción eluida se sometió a ultrafiltración y diálisis con 10 volúmenes 1x PBS (SIGMA-P4417), utilizando filtros de polietersulfona (PES) con un corte comprendido entre 3 y 8 kDa, preferiblemente de 5 kDa, llevados a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml y se filtró con filtros de 0,2 μm (la concentración de proteína se determinó mediante el Kit de Reactivos de Ensayo de Proteínas BCA, PIERCE). Durante las etapas de purificación para obtener una buena recuperación del producto purificado, la porción recombinante se carga en las columnas cromatográficas con una relación máxima de 1,5 mg de hialuronidasa por ml de resina. Todas las fracciones de proteína eluidas, tanto las enzimáticamente activas, como las inactivas o poco activas, se analizaron a continuación mediante SDS-PAGE al 12% y a continuación se tiñeron con tinción de plata de acuerdo con las instrucciones del fabricante; en todas las fracciones que tenían actividad de hialuronidasa había una banda de proteína marcada de aproximadamente 24 kDa (Fig. 16). En las diferentes etapas de purificación, la concentración de proteína de la porción recombinante se estimó como la previamente descrita en SDS-PAGE (12%) y se encontró que era de 0,45-0,5 g/L total en la primera cromatografía (Q sepharose XL), 0,450,50 g/L total en la segunda cromatografía (CM-Sepharose® Fast Flow), 0,4-0,45 g/L total en la tercera cromatografía (Phenyl-Sepharose HP) y 0,35-0,4 g/L total después de la filtración con DIA. Al final del proceso de purificación aplicado sobre aproximadamente 1 l de producto de fermentación, se obtuvieron aproximadamente 600

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650 mg (actividad enzimática mayor que 2,6 x 107 U/L de producto de fermentación purificado) de hialuronidasa recombinante (Tabla 3).

Ejemplo 19: Análisis y caracterización

Determinación de la actividad de hialuronidasa

La actividad de hialuronidasa se midió con el método de Dorfman modificado [10]. En resumen, el producto obtenido mediante las diferentes etapas del procedimiento se diluyó en tampón fosfato 0,03 M, NaCl al 0,82%, pH 6,3 y se mezcló 1 ml de la solución así obtenida con 1 ml de tampón sustrato (tampón fosfato 0,03 M, NaCl 10,82%, pH 6,3) que contiene 0,5 mg de ácido hialurónico. La digestión enzimática se llevó a cabo a 37ºC durante 30 minutos y al final del proceso de incubación, se generó turbidez mediante la adición de una solución ácida de 4 ml de suero de caballo (SIGMA). La densidad óptica a 640 nm se midió exactamente 30 minutos después de la adición de la solución ácida de suero de caballo. Se usó un patrón de hialuronidasa de testículos de mamífero (EDQM, FIP Hyaluronidase, H1115000) que contenía 328 UI/mg para construir una curva estándar y la actividad (en unidades) de las muestras se calculó usando esta curva.

Electroforesis SDS-PAGE

Los ensayos electroforéticos sobre gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) se llevaron a cabo usando el método de Laemmli [11] en gel de poliacrilamida al 12%, usando un Mini-PROTEAN 3 (BIO-RAD) según las instrucciones del fabricante. La concentración y el peso molecular de la hialuronidasa en el producto de fermentación y en diferentes etapas de purificación se estimaron mediante comparación con proteínas estándar de bajo peso molecular (GE Healthcare).

Los geles de poliacrilamida adecuadamente teñidos con Coomassie (BIO_RAD) después de la operación electroforética, fueron adquiridos por un dispositivo de captura de imagen de laboratorio ImageQuant™ 300 TL (GE Healthcare), mientras que los ensayos (cuantitativos y cualitativos) se realizaron usando el software de análisis de imagen ImageQuant TL (GE Healthcare).

Secuenciación del extremo N-terminal

La secuenciación de aminoácidos N-terminal se llevó a cabo según el método de degradación de Edman utilizando un secuenciador de proteínas automatizado en fase líquida pulsada (ABI-Perkin Elmer Mod. 477A). El software BLAST [18] se utilizó para llevar a cabo la investigación de homología en la base de datos GenBank y en la del proyecto de genoma humano de las especies Streptomyces disponibles en la web. Las fracciones, obtenidas por las purificaciones de la cepa de E. coli transformada con el vector pHyal_sk y la cepa de E. coli transformada con el vector pHyal_sk_SL de acuerdo con la invención, se sometieron a electroforesis SDS-PAGE sobre gel al 12%, como se ha descrito anteriormente, después a la transferencia de membrana de difluoruro de polivinilideno (BIO-RAD) y se tiñeron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La banda relativa a la hialuronidasa para ambas producciones se separó con un bisturí, tratando de obtener una pieza lo más pequeña posible (3 mm x 10 mm) y se cargó en la cámara de reacción del secuenciador.

La secuenciación del extremo N-terminal, llevada a cabo como se ha descrito anteriormente, permite determinar que las dos hialuronidasas recombinantes producidas y procedentes de dos sistemas diferentes de ingeniería genética y expresión, contienen diferencias en la secuencia de aminoácidos N-terminal. En el caso de la muestra de E. coli transformada con el vector pHyal_sk_SL de acuerdo con la invención, el ensayo proporcionó cromatogramas en los que una única secuencia de aminoácidos N-terminal estaba significativamente presente, permitiendo reconstruir la secuencia de ensayo descrita a continuación: AGENGA (SEQ ID NO: 42). La secuencia experimentalmente determinada, mencionada anteriormente, se corresponde con el N-terminal de la proteína aislada en su forma autóloga descrita por [9] libre de metionina en la posición 1.

En el caso de la muestra de E. coli transformada con el vector pHyalsk de acuerdo con la invención, el ensayo detectó en cambio la presencia de al menos dos secuencias de aminoácidos N-terminales, a continuación se menciona el listado de los aminoácidos N-terminales detectados por la secuenciación: La secuencia más representada MAGENGA (SEQ ID NO: 43) que corresponde al extremo N de la proteína madura con metionina en la posición 1, y una secuencia menos representada AQPAMAMAGENGA (SEQ ID NO: 44) que corresponde a la proteína parcialmente madura (contiene la secuencia AQPAMAM (SEQ ID NO: 45) perteneciente al péptido señal aparentemente no totalmente privado de la proteína por el sistema celular).

Comparación de la actividad de hialuronidasa entre la forma heteróloga y autóloga.

El potencial enzimático de la hialuronidasa de acuerdo con la invención (E. coli transformada con el vector pHyal_sk_SL) se evaluó por comparación con la actividad enzimática de la hialuronidasa autóloga [9], utilizando el ensayo enzimático descrito [9] y se informa que el valor de la actividad era en ambos casos mayor que 4 x 104 UI/mg (la concentración de proteína se determinó mediante el Kit de Reactivos de Ensayo de Proteínas BCA, PIERCE).

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El resultado de este ensayo muestra que la hialuronidasa de acuerdo con la invención, en particular de la forma procedente de la cepa de E. coli modificada con el plásmido pHyal_sk_SL, tiene la misma actividad que la forma autóloga. Sin embargo, por medio de los métodos de producción y purificación descritos en la invención fue posible evaluar con precisión el valor de la actividad enzimática de la hialuronidasa recombinante de acuerdo con la invención, que se encontró que era mayor que 40.000 U/mg de proteína.

Análisis de espectros UV y comparación de espectros de dicroísmo circular de las formas heteróloga y autóloga.

Experimentos de dicroísmo circular (CD): Los espectros en el dicroísmo circular de Far-UV se recogieron a temperatura ambiente en un espectroscopolarímetro Jasco modelo J-715, con una celda de cuarzo con una longitud de trayectoria de 1 milímetro. Otras configuraciones de prueba fueron: velocidad de exploración, 10 nm/min, sensibilidad, 50 MDEG, constante de tiempo, 16 s, ancho de banda, 3 nm. Las mediciones de dicroísmo circular se llevaron a cabo sobre soluciones de proteínas (hialuronidasa autóloga, hialuronidasa recombinante de acuerdo con la invención) a una concentración de 2,10-6 M. Todas las muestras se diluyeron a una concentración final de 2,10-6 M usando agua ultra pura. Los espectros de CD se recogieron a 260-195 nm de blanco corregido y ajustado para dilución.

Los espectros de dicroísmo circular se presentan en la Figura 17. Los archivos de superposición coinciden: la línea inferior corresponde a la hialuronidasa autóloga [9] y la superior corresponde a la hialuronidasa heteróloga de acuerdo con la invención. Los dos espectros tienen un perfil superpuesto, confirmando la misma estructura para ambas muestras (Fig. 17-a). La pequeña diferencia que se observa puede atribuirse a la no coincidencia perfecta de las concentraciones de las dos soluciones.

A partir de los espectros UV, la muestra de hialuronidasa recombinante no muestra agregación. A partir de este estudio se puede inferir que la preparación de acuerdo con la invención tiene una estructura secundaria muy similar a la de la hialuronidasa autóloga [9] y que la proteína producida de acuerdo con la presente invención no muestra agregación (figura 17b).

Espectrometría de masas

Los ensayos de espectrometría de masas para determinar el peso molecular se llevaron a cabo utilizando el micro espectrómetro de masa Quattro (Waters), mientras que el ensayo de la cartografía de péptidos para confirmar la identidad de la estructura primaria de la porción recombinante se llevó a cabo usando los valores de masa precisos de los péptidos determinados mediante el sistema MALDI-MS Voyager DE-PRO (Applied Biosystems, Firmingham MA, EE.UU.) después de la separación en RP-HPLC.

La fracción obtenida después de la purificación de la hialuronidasa recombinante de acuerdo con la invención se sometió a digestión con tripsina, después de la separación en RP-HPLC, la mezcla de péptidos producida para cada muestra se analizó mediante MALDI-MS en modo reflector. El estudio e interpretación de los espectros MALDI adquiridos, por lo tanto, permitieron, respectivamente, verificar la identidad del 97% de la estructura primaria de la secuencia de aminoácidos de referencia [9] y más del 94% de identidad de la estructura primaria de la secuencia teórica de aminoácidos según la invención (secuencia de péptido predicha por http://web.expasy.org/translate/) con la secuencia de aminoácidos de la muestra producida de acuerdo con la invención (SEQ ID NO: 21).

Además, la fracción obtenida después de la purificación de la hialuronidasa recombinante de acuerdo con la invención se sometió a la determinación del peso molecular de la proteína por medio de espectrometría de masas y el resultado del ensayo se muestra en la Figura 18.

Enfoque isoeléctrico

La fracción de proteína a analizar (hialuronidasa recombinante obtenida de acuerdo con la invención) se mezcla en un tampón de carga adecuado y se carga sobre tiras de IPG a pH 3-10 (ReadyStrips 7 cm, BIO-RAD); la incubación se realiza a 25ºC hasta la absorción de la muestra y la tira se carga sobre la celda PROTEAN IEF (BIO-RAD) para el enfoque isoeléctrico (IEF). Al final de la operación del enfoque isoeléctrico, la tira se tiñe con solución de tinción con gel IEF (BIO-RAD) durante 45 minutos y después se destiñe con solución Destain (BIO-RAD). Las tiras de IPG desteñidas fueron adquiridas por un dispositivo de captura de imágenes de laboratorio ImageQuant 300 TL (GE Healthcare) mientras que los ensayos (cuantitativos y cualitativos) se realizaron utilizando el programa de análisis de imágenes ImageQuant TL (GE Healthcare).

El punto isoeléctrico de la muestra se determinó por comparación con los puntos isoeléctricos de los patrones de referencia (IEF Marker pH 3-10, SERVA). El resultado del ensayo se reporta en la Figura 19.

Caracterización por electroforesis capilar de la hialuronidasa recombinante y determinación del coeficiente de extinción molar.

El ensayo cualitativo-cuantitativo de la fracción proteica a analizar (hialuronidasa recombinante obtenida de acuerdo con la invención) fue realizado por BIOTEKNET (Nápoles, Italia) mediante electroforesis capilar con un instrumento Beckman-Coulter MDQ P/ACE equipado con detector de matriz de diodos y lámpara UV, utilizando un capilar de

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proteínas de la hialuronidasa bovina reaccionó con un anticuerpo policlonal anti-hialuronidasa (Abnova) por Western Blotting, confirmando que la enzima hialuronidasa es un componente menor de las preparaciones de hialuronidasa derivadas de animales (Fig. 22).

Detección de endotoxinas

La prueba de Lisado de Amebocitos Limulus (LAL), que utiliza el reactivo preparado a partir de la sangre del limulus Polifemo, mostró ser la prueba más sensible y específica para detectar y medir el nivel de endotoxinas bacterianas en las materias primas utilizadas en la producción y para la monitorización "en proceso" de los niveles de endotoxinas. Las endotoxinas, más comúnmente conocidas como pirógenos, causan desde la fiebre a un shock irreversible, desde dificultades en los intercambios de sangre y tejido a consecuencias letales.

Con la hialuronidasa recombinante producida según la invención en células de E. coli, era esencial evaluar el nivel de endotoxinas en el producto final. Para ello, se utilizó el método de "Chromo-LAL", una prueba cinética cromogénica para la detección cuantitativa de endotoxinas producidas por bacterias Gram-negativas.

Brevemente, en el "Chromo LAL (art. 32427, PBI S.p.A-Italia)", el lisado y el sustrato de reactivo cromogénico coliofilizado se mezclaron con la muestra de hialuronidasa (producida de acuerdo con la invención) en una microplaca de multi-pocillos (96 pocillos) y se incubaron a 37 ± 1ºC en un lector adecuado (ELX 808 IU, BioTek). Los valores de absorbancia leídos fueron recogidos y analizados por un software dedicado. Se calculó el tiempo requerido para que la muestra de hialuronidasa alcanzara un valor de absorbancia específico (densidad óptica). Además, se construyó una curva de calibración estándar (CSE, lot. 104, art.17078, PBI S.p. A -Italia) que muestra la correlación lineal entre el logaritmo de "tiempo de inicio" y el logaritmo de la concentración de endotoxina estándar. El intervalo máximo entre las concentraciones de endotoxina de la curva estándar es de 0,005 EU/ml-50 EU/ml. La sensibilidad

[19] de la prueba se definió a partir de la menor concentración de endotoxina utilizada para construir la curva estándar. La sensibilidad máxima de este ensayo es 0,005 EU/ml.

La concentración de endotoxina para el correspondiente "tiempo de inicio" de la muestra de hialuronidasa se leyó a partir de la curva patrón que es un diagrama log-log derivado de las puntuaciones obtenidas calculando los "tiempos de inicio" frente a las concentraciones estándar.

Al final, el valor estimado de endotoxinas en la muestra de hialuronidasa producida de acuerdo con la invención se calculó mediante el software Gen5 (BioTek) resultando muy bajo, es decir, inferior a 0,5 unidades de endotoxina por miligramo de hialuronidasa recombinante (Tabla 4).

Determinación de proteínas y ADN procedentes de células huésped

En cuanto a la determinación de proteínas derivadas de células huésped de E. coli usadas para la expresión heteróloga de hialuronidasa recombinante (como se describe por la presente invención) se utilizó el método ELISA, en particular, el kit de inmunoensayo emzimático "E.coli HCP" de Cygnus Technologies (F010). El ensayo se basa en el uso intercalado de anticuerpos purificados por afinidad dirigidos a una mezcla de 6 cepas de E. coli comúnmente usadas para la clonación y expresión de proteínas recombinantes.

El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en la muestra purificada de hialuronidasa recombinante, la concentración de proteínas derivadas de E. coli (cepa huésped) es directamente proporcional al desarrollo de color provocado por la reacción enzimática de la fosfatasa alcalina conjugada al anticuerpo .

Se estimó la concentración de proteínas que derivan de la cepa huésped hacia las concentraciones estándar (el cálculo y la calibración de la curva se realizaron mediante el programa GEN 5, BioTek) en la muestra de hialuronidasa producida de acuerdo con la invención era inferior a 10 ppm, como se muestra en la Tabla 4 (el límite aprobado por las autoridades competentes es inferior a 100 ppm).

Por otra parte, la determinación de la cantidad de ADN de la cepa huésped de E. coli se llevó a cabo en la muestra de hialuronidasa recombinante (producida de acuerdo con la invención), utilizando el método de Umbral de ADN.

Este ensayo se realizó en los laboratorios Charles River Biopharmaceutical services GmbH, Alemania. Los estudios indicados con los códigos M1/F07/12 y M2/F07/12 dieron como resultado final un nivel muy bajo de ADN derivado del huésped celular, calculado como inferior a 20 pg (el límite aprobado por las autoridades competentes es menor o igual a 300 pg/mg de proteína) por miligramo de hialuronidasa recombinante (Tabla 4).

Ejemplo 20: Ensayo en gel de agarosa de la despolimerización de ácido hialurónico

Para la evaluación in vitro de la capacidad de la hialuronidasa recombinante, producida de acuerdo con la invención, de despolimerizar el ácido hialurónico (Hyalgan®, Fidia S.p.A., Italia) en sus constituyentes primarios Nacetilglucosamina y ácido glucurónico, se utilizó el método de ensayo electroforético en gel de agarosa [20] después de digerir el ácido hialurónico con 1 unidad de hialuronidasa recombinante dentro de los tiempos indicados de 5 minutos a 24 horas.

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