ES2241850T3 - Tratamiento fotodinamico e irradiacion con uv-b de una suspension de trombocitos. - Google Patents
Tratamiento fotodinamico e irradiacion con uv-b de una suspension de trombocitos.Info
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Abstract
Procedimiento para el tratamiento de una suspensión de trombocitos que comprende las siguientes etapas: (A) exponer la suspensión a una radiación de un intervalo de longitud de onda de desde 400 hasta 750 nm en presencia de una o varias sustancias fotoactivas, que presentan uno o varios máximos de absorción en el intervalo de longitud de onda, y (B) exponer la suspensión a una radiación de un intervalo de longitud de onda de desde 270 hasta 320 nm con un aporte energético de desde 0, 1 a 10 J/cm2, de modo que - las etapas (A) y (B) pueden aplicarse en la orden primero (A), luego (B) y - en la etapa (B) no está presente ninguna sustancia fotoactiva que presente un máximo de absorción en el intervalo de longitud de onda según la etapa (B).
Description
Tratamiento fotodinámico e irradiación con
UV-B de una suspensión de trombocitos.
La invención se refiere a un procedimiento para
la inactivación de virus y para la destrucción de leucocitos en
suspensiones de trombocitos mediante una combinación de tratamiento
fotodinámico e irradiación con UV-B.
Se sabe que el uso terapéutico de preparados
sanguíneos entraña el riesgo de que el receptor del preparado
sanguíneo se infecte con virus. Deben mencionarse, por ejemplo, los
virus de la hepatitis B (VHB) y C (VHC), así como los agentes
etiológicos del sida VIH-1 y VIH-2.
El riesgo existe siempre que en la fabricación del preparado no se
lleva a cabo ninguna etapa de inactivación de virus o eliminación de
virus.
En el caso de concentrados de proteínas
plasmáticas purificados, como por ejemplo albúmina, preparados de
factor VIII y factor IX, se aplican procedimientos para la
inactivación de virus o eliminación de virus, de modo que a partir
de entonces éstos se consideran seguros en cuanto a los virus.
También puede al menos reducirse el riesgo por virus en el plasma
fresco usando diferentes métodos. Un método es, por ejemplo, el
almacenamiento en cuarentena. Es este caso, el plasma se almacena
congelado durante de 3 a 6 meses y sólo se autoriza para su uso
cuando se repite el análisis de una nueva muestra de sangre del
donante respectivo para determinar los marcadores habituales para
VHB, VHC, VIH-1 y VIH-2 y da un
resultado negativo. Un método de este tipo no puede aplicarse a
productos sanguíneos celulares, como por ejemplo concentrados de
eritrocitos y trombocitos, ya que éstos sólo poseen una vida útil de
almacenamiento de aproximadamente 7 semanas o 5 días. Los productos
sanguíneos celulares tampoco pueden prepararse de manera segura en
cuanto a los virus, por razones claras, mediante un tratamiento de
disolvente/detergente, como es posible en el caso de concentrados de
proteínas plasmáticas y también en el caso del plasma: los
eritrocitos y trombocitos se lisarían en este proceso.
Se ha trabajado intensamente para descontaminar
productos sanguíneos celulares por medio de un procedimiento
fotodinámico. La inactivación fotodinámica de virus se basa en que
el preparado respectivo en solución o en suspensión se expone a una
sustancia fotoactiva, un fotosensibilizador. La luz irradiada debe
presentar una longitud de onda que la sustancia fotoactiva absorba.
De esta manera se activa y se transmite esta energía de activación,
o bien directamente sobre un sustrato, que mediante esto se destruye
o queda dañado, o bien sobre moléculas de oxígeno: especies de
oxígeno activadas, es decir, los radicales de oxígeno u oxígeno
singlete, tienen una fuerte acción virucida. En el caso favorable,
la sustancia fotoactiva utilizada posee una gran afinidad por los
constituyentes víricos, por ejemplo, por ácidos nucleicos víricos y
sólo una pequeña afinidad por otros componentes que están contenidos
en el preparado respectivo. Así, se inactivan los virus y no se
alteran otros componentes. Actualmente, solamente encuentra una
aplicación más amplia un procedimiento fotodinámico según la patente
europea 0 491 757-B1 (H. Mohr y B. Lambrecht,
Procedimiento para la inactivación de virus en sangre y productos
sanguíneos). Se utiliza para la inactivación de virus en el plasma
fresco. En la aplicación técnica sirve como sustancia fotoactiva
sobre todo el colorante de fenotiazina, azul de metileno. En lugar
de azul de metileno también puede utilizarse azul de toluidina.
También los productos de desmetilación del azul de metileno, es
decir, los colorantes de azur A, B y C, así como tionina, son
fotodinámicamente activos y adecuados para la inactivación
fotodinámica de virus.
La patente de EE.UU. 5.545.516 (S. J. Wagner:
Inactivación de virus con envoltura extracelulares en sangre y
componentes sanguíneos por colorantes de
5-fentiazinio más luz) describe la inactivación de
virus extracelulares con ayuda de colorantes de fenotiazina en
combinación con luz visible. Según el documento US 5.545.516, los
preparados quedan libres de leucocitos antes del tratamiento
fotodinámico por medio de filtros especiales, ya que el método de
inactivación de virus no considera ningún virus o provirus asociado
a células. El método tampoco puede inactivar a los pequeños virus
sin envoltura presentes en la sangre, como por ejemplo virus de la
hepatitis A (VHA). Por el contrario, los virus libres que poseen
envolturas lipídicas, como por ejemplo el agente etiológico del sida
VIH-1 y los virus de las hepatitis B y C (VHB, VHC),
no pueden inactivarse según este procedimiento. A partir de los
documentos WO 00/04930 y WO 96/08965 también se conocen
procedimientos para la inactivación de patógenos en muestras
biológicas que utilizan sustancias fotoactivas, que se absorben,
entre otros, en el intervalo de UV-A y se activan
con radiación en el intervalo de longitud de onda de desde el
UV-A hasta el intervalo visible.
Los leucocitos en productos sanguíneos pueden
destruirse por medio de irradiación con UV-B. En el
caso de suspensiones de trombocitos, ha demostrado ser útil para
esto la irradiación con UV-B (intervalo de longitud
de onda de 290-320 nm), ya que normalmente para la
reducción del número de leucocitos es suficiente un aporte
energético de desde 1 hasta 3 J/cm^{2}, que no afecta todavía
mucho a los trombocitos, de modo que siguen siendo terapéuticamente
útiles. Un aporte de energía mediante irradiación con
UV-B superior a 10 J/cm^{2} actúa además de forma
virucida (K.N. Prodoux; J.C. Fratanoni, E.J. Boone y R.F. Bonner en
Blood, 70(2), 589-592 (1987): Use of
Laser-UV for inactivation of virus in blood
products. No obstante, de esta manera se dañan trombocitos, de modo
que debe cuestionarse su aplicabilidad (J.C. Fratanoni y K.N.
Prodoux en Transfusion 30(6); 480-481 (1990);
Viral inactivation of blood products).
Por tanto, el objetivo de la invención es poner a
disposición un método eficaz para la inactivación de virus
patogénicos humanos y de leucocitos en suspensiones de trombocitos,
especialmente en concentrados de trombocitos (CT). Los CT se
obtienen de donaciones de sangre mediante centrifugación diferencial
o directamente de donantes mediante aféresis automática de
trombocitos.
Se encontró de manera sorprendente que la
combinación de tratamiento fotodinámico con una irradiación con
UV-B en suspensiones de trombocitos o CT es eficaz
contra los virus a los que se puede llegar con la inactivación
fotodinámica, y simultáneamente consigue destruir los leucocitos
contenidos en los medios y por tanto, eliminar el riesgo de
infección mediante virus o provirus asociados a células. Además, se
encontró de manera sorprendente que mediante la combinación de los
métodos, la cantidad necesaria para destruir los leucocitos puede
ser significativamente menor en cuanto a radiación
UV-B que en el caso de solamente irradiación con
UV-B. Igualmente fue sorprendente que el tratamiento
adicional de las suspensiones de trombocitos con
UV-B con una intensidad que, por sí sola, es casi
ineficaz en la inactivación de virus, aumenta claramente la eficacia
del tratamiento fotodinámico.
El procedimiento según la invención para el
tratamiento de una suspensión de trombocitos se caracteriza por:
(A) exponer la suspensión a una radiación de un
intervalo de longitud de onda de desde 400 hasta 750 nm,
preferiblemente de 550 a 700 nm, en presencia de una o varias
sustancias fotoactivas que presentan uno o varios máximos de
absorción en el intervalo de longitud de onda, y
(B) exponer la suspensión a una radiación de un
intervalo de longitud de onda de desde 270 hasta 320 nm,
preferiblemente de 290 a 320 nm, con un aporte energético de desde
0,1 a 10 J/cm^{2}. de modo que en la etapa (B) no está presente
ninguna sustancia que pueda fotoactivarse en el intervalo de
longitud de onda según la etapa (B) y las etapas (A) y (B) pueden
aplicarse en el orden primero (A), luego (B). Las formas de
realización preferidas son objeto de las reivindicaciones
dependientes.
La suspensión de trombocitos presenta
preferiblemente una concentración de más de 5x10^{8} trombocitos
por ml, de manera especialmente preferida más de 10^{9}/ml. Los
trombocitos pueden suspenderse, por ejemplo, en plasma o en un medio
de almacenamiento de trombocitos con un contenido en plasma
cualquiera.
La etapa A incluye un tratamiento fotodinámico de
la suspensión de trombocitos en presencia de una sustancia
fotoactiva con luz visible; la etapa B incluye la irradiación del
preparado (la suspensión que contiene trombocitos) con luz en un
intervalo de longitud de onda de UV-B. En el sentido
de la invención, se considera como intervalo de UV-B
de la irradiación el intervalo de longitud de onda de 270 nm a 330
nm.
La concentración de la sustancia fotoactiva y el
aporte energético mediante la exposición a la luz y la irradiación
con UV-B se miden de tal manera que finalmente se
inactivan los virus presentes y se destruyen los leucocitos
contenidos en las suspensiones de trombocitos, pero se conserva la
funcionalidad de los trombocitos.
Como recipientes para el tratamiento de las
suspensiones de trombocitos sirven recipientes transparentes a
UV-B, que consisten preferiblemente en plástico y
pueden tener, por ejemplo, la forma de bolsas. También es posible
llevar a cabo el tratamiento fotodinámico y con UV-B
en diferentes recipientes.
También es posible llevar a cabo el tratamiento
con UV-B de las suspensiones de trombocitos durante
el transvase de las suspensiones de trombocitos de un recipiente a
otro.
Como sustancias fotoactivas pueden utilizarse por
ejemplo los colorantes de fenotiazina, azul de metileno, azur A, B,
C y tionina. Igualmente pueden utilizarse de manera ventajosa otras
sustancias fotoactivas, por ejemplo, en las concentraciones
conocidas a partir de la literatura para la inactivación de virus en
productos sanguíneos. En el caso de colorantes de fenotiazina como
tionina, el intervalo concentración posible está entre
aproximadamente 0,1 y 10 \muM, preferiblemente entre
aproximadamente 0,5 y 5 \muM o 1 y 5 \muM.
Como fuente luminosa para el tratamiento
fotodinámico, especialmente en el uso de tionina, sirven
preferiblemente las lámparas de vapor de sodio a baja presión, cuyo
máximo de emisión luminosa se encuentra en 590 nm. Esto se
corresponde aproximadamente con el máximo de absorción de la
tionina, que en solución acuosa es de aproximadamente 595 nm. Pero
también son posibles otras fuentes luminosas, especialmente cuando
se utiliza una sustancia fotoactiva que absorbe luz en otro
intervalo de longitud de onda, como por ejemplo la tionina.
Para la irradiación con UV-B
pueden utilizarse tubos, lámparas o láser especiales, que emiten luz
ultravioleta en el intervalo de longitud de onda de entre
aproximadamente 270 - 330 nm. El aporte energético mediante el
tratamiento con UV-B puede estar entre 0,1 y 10
J/cm^{2}, preferiblemente entre 0,3 y 6 J/cm^{2}, de manera
especialmente preferida entre 0,5 y 3 J/cm^{2}.
Los experimentos descritos a continuación se
llevaron a cabo con CT que se aislaron a partir de donaciones de
sangre individuales y estaban suspendidos en plasma sanguíneo. Como
sustancia fotoactiva se utilizó tionina (Th). Pero también pueden
obtenerse resultados similares con otras sustancias fotoactivas, por
ejemplo con los colorantes de fenotiazina, azul de metileno y sus
derivados de azur A, B y C. La invención solamente se aclara
mediante los ejemplos experimentales, pero no se limita en su
alcance.
Los CT utilizados en los experimentos se
almacenaron en aparatos de rotación de trombocitos durante un máximo
de 5 días. Los recipientes de almacenamiento eran bolsas de PVC que
pueden obtenerse comercialmente. Para el tratamiento fotodinámico y
con UV-B se transvasaron los CT a bolsas de plástico
de poliolefina, cuyo material laminado es transparente para
UV-B. Para la exposición a la luz en presencia de
tionina se utilizó una instalación que está equipada con lámparas de
vapor de sodio a baja presión. Los CT se expusieron a la luz por
ambos lados. Para la irradiación con UV-B se utilizó
un proyector plano que estaba dotado de tubos UV, que emitían
principalmente luz UV en el intervalo de longitud de onda entre 290
y 320 nm.
Como virus de prueba se utilizó generalmente el
virus de la estomatitis vesicular (VEV), que se propaga rápidamente
en el cultivo celular y a consecuencia de esto también puede
cuantificarse en ensayos de ECP (ECP = efecto citopático). En el
experimento 1 se utilizó además una serie de otros virus. El VEV se
propagó en células Vero. Las mismas células se utilizaron también
para los ensayos de infectividad, con los que se determinó el título
de virus. El medio de cultivo celular utilizado era RPMI 1640 con
10% de suero bovino fetal y antibióticos. Los ensayos se llevaron a
cabo en placas de microtitulación. Las muestras respectivas se
diluyeron de 1 a 3 veces. Se analizaron 8 replicados por dilución.
Los títulos de virus se expresan como log_{10}TCID_{50} (TCID =
"Tissue Culture Infective Doses" (dosis infectante en cultivo
celular)) y se calcularon de manera correspondiente a las normas de
Kärber y Spearman (G. Kärber en Naunym-Schmiedebers
Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 162, 480-483 (1931):
Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche;
C. Spearman in Br.J.Psychol. 2, 277-282 (1908): The
method of "right and wrong cases" ("constant stimuli")
without Gauss formulae).
Como pruebas de función para los trombocitos se
utilizaron la reacción de colapso hipotónico y la agregación
inducida por colágeno.
Las células mononucleares se aislaron por medio
de centrifugación en gradiente de densidad a partir de sangre de
donantes. En el caso de los experimentos respectivos, éstas se
añadieron en una concentración de 5 x 10^{5}/ml a las suspensiones
de trombocitos. Después del tratamiento fotodinámico o irradiación
con UV-B, se centrifugaron alícuotas de las
suspensiones a bajo número de revoluciones (1500 rpm durante 4
min.). Las células sedimentadas se lavaron tres veces con medio de
cultivo celular (RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal y
antibióticos) y entonces se suspendieron de nuevo en el mismo medio.
La concentración de células se ajustó a 5x10^{5}/ml. Para el
ensayo de proliferación, las células se estimularon con
concanavalina A (ConA, 2 \mug/ml) y se cultivaron en alícuotas de
200 \mul durante 3 - 4 días a 37ºC en un incubador con inyección
de CO_{2}. Entonces se añadieron los cultivos celulares. Cuatro
horas más tarde se determinó la tasa de incorporación de BRDU (BRDU
= bromo-desoxiuridina) con un espectrofotómetro a
una longitud de onda de 450 nm (DO_{450}). Los valores de
extinción son proporcionales a la incorporación de BRDU y por tanto
a la viabilidad de las células.
Experimento
1
A continuación se investigó en una serie de virus
si podían inactivarse mediante el tratamiento con tionina/luz y en
qué medida. La concentración de la sustancia fotoactiva era de 1
\muM. Como muestran los resultados recogidos en la tabla 1,
distintos virus demuestran distinta sensibilidad: así, los virus del
modelo para el virus de la hepatitis C humana, VDVB y VPPC, así como
el togavirus SFV, se inactivaron completamente después de 5 minutos
de exposición a la luz, mientras que la infectividad del VEV y del
SV-40 todavía no se habían eliminado completamente
después de 30 minutos.
Experimento
2
Como se deduce de la tabla 2, el VEV es muy
resistente a la irradiación con UV-B. Incluso
después de 60 min. o de un aporte energético de aproximadamente 20
J/cm^{2}, el virus todavía no se había inactivado completamente. A
partir de aproximadamente 10 min. o 3 J/cm^{2}, la irradiación con
UV-B repercute, por el contrario, de manera negativa
sobre las funciones y la capacidad de conservación de los
trombocitos (no mostrado).
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
3
En estos experimentos, la concentración de
tionina era de nuevo 1 \muM y el tiempo de exposición a la luz de
30 min. El aporte energético mediante radiación UV-B
era de 2,4 J/cm^{2} (tiempo de irradiación: 8 min). Mediante el
tratamiento fotodinámico solo se redujo la infectividad a
aproximadamente 4 o 4,42 log_{10}, mediante radiación
UV-B sola a 1,97 o 2,21 log_{10}. En la
combinación, en el primer experimento se eliminó completamente la
infectividad (\geq 7,04 log_{10}), en el segundo se redujo a
aproximadamente 6,26 log_{10} (tabla 3).
Experimento
4
Como muestran las tablas 4 y 5, tanto la HSR
(reacción de colapso hipotónico) como también la agregación inducida
por colágeno de los CT no están esencialmente influenciados de
manera más notable mediante el tratamiento combinado con tionina/luz
y UV-B (condiciones de los experimentos: véase
experimento 3) que mediante el tratamiento fotodinámico solo.
Experimento
5
Se añadieron células mononucleares al CT en una
concentración de 5x10^{5}/ml; después se irradiaron durante
distintos tiempos con UV-B o se trataron sólo o
adicionalmente con tionina/luz (concentración de colorante: 2
\muM; duración de la exposición a la luz: 30 min.). Como muestran
los resultados recogidos en la tabla 6, para la inactivación total
de las células se necesitó un tiempo de irradiación de al menos 4
min. (1,2 J/cm^{2}). Cuando los CT se trataron adicionalmente con
tionina/ luz, pudo acortarse a aproximadamente 3 min., aunque la
tionina/luz sola no tuvo ninguna influencia en la proliferación de
las células.
Claims (12)
1. Procedimiento para el tratamiento de una
suspensión de trombocitos que comprende las siguientes etapas:
(A) exponer la suspensión a una radiación de un
intervalo de longitud de onda de desde 400 hasta 750 nm en presencia
de una o varias sustancias fotoactivas, que presentan uno o varios
máximos de absorción en el intervalo de longitud de onda, y
(B) exponer la suspensión a una radiación de un
intervalo de longitud de onda de desde 270 hasta 320 nm con un
aporte energético de desde 0,1 a 10 J/cm^{2},
de modo que
- -
- las etapas (A) y (B) pueden aplicarse en la orden primero (A), luego (B) y
- -
- en la etapa (B) no está presente ninguna sustancia fotoactiva que presente un máximo de absorción en el intervalo de longitud de onda según la etapa (B).
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la sustancia fotoactiva es un colorante
de fenotiazina.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque como colorante de fenotiazina se
utilizan tionina, azul de metileno, azul de toluidina y/o los
colorantes de azur A, B y C.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 o 3, caracterizado porque la sustancia
fotoactiva se utiliza en la etapa (A) en una concentración de desde
0,5 hasta 10 \muM, preferiblemente de 0,5 a 5 \muM.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
intensidad de la radiación en la etapa (B) se mide de tal manera que
la capacidad de proliferación de los linfocitos T que están
contenidos en los concentrados de trombocitos se reduce en
aproximadamente al menos el 50%, preferiblemente en aproximadamente
más del 75%.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa
(B) el aporte energético es de 0,5 a 3 J/cm^{2}.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa
(B) la suspensión se expone a una radiación de un intervalo de
longitud de onda de desde 290 hasta 320 nm.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las
suspensiones de trombocitos son concentrados de trombocitos.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las
suspensiones de trombocitos o concentrados de trombocitos se
obtienen a partir de donaciones de sangre o mediante aféresis de
trombocitos.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el
tratamiento de la suspensión según la etapa (A) y/o etapa (B) tiene
lugar en recipientes de plástico transparentes para la respectiva
radiación.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el
tratamiento de la suspensión según la etapa (A) y/o etapa (B) tiene
lugar en una aparato de circulación transparente para la respectiva
radiación.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
concentración de virus de la suspensión diminuye en aproximadamente
al menos 5, preferiblemente aproximadamente en al menos 6 en escala
de log_{10}.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10031851 | 2000-07-04 | ||
| DE10031851A DE10031851B4 (de) | 2000-07-04 | 2000-07-04 | Photodynamische Behandlung und UV-B-Bestrahlung einer Thrombozyten-Suspension |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2241850T3 true ES2241850T3 (es) | 2005-11-01 |
Family
ID=7647321
Family Applications (1)
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