ES2247587T3

ES2247587T3 - Procedimiento para la esterilizacion de composiciones biologicas y el producto producido mediante el mismo.

Info

Publication number: ES2247587T3
Application number: ES94919293T
Authority: ES
Inventors: Bernard Horowitz; Bolanle Williams; Henrietta Margolis-Nunno; Sing N. Chin
Original assignee: New York Blood Center Inc
Current assignee: New York Blood Center Inc
Priority date: 1993-05-28
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2014-05-27
Also published as: CA2163636A1; AU7048594A; NO954815D0; ZA943754B; FI117288B; WO1994028120A1; KR960702864A; EP0702719B1; JPH11503601A; EP0702719A1; ATE301186T1; DE69434445D1; CA2163636C; FI955690L; EP0702719A4; KR100258377B1; NO954815L; JP3426237B2; AU696246B2; FI955690A0

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE AL PRODUCTO PRODUCIDO MEDIANTE LA INACTIVACION DE UN VIRUS PATOGENICO EXTRACELULAR O INTRACELULAR EN UNA COMPOSICION BIOLOGICA SIN INCURRIR EN LA INTERRUPCION O INACTIVACION SUSTANCIAL DE CELULAS Y SIN PERDIDA SIGNIFICATIVA DE PROTEINAS LABILES O DE OTROS COMPONENTES BIOLOGICOS VALIOSOS TAMBIEN CONTENIDOS EN LAS MISMAS, COMPRENDIENDO EL PROCESO DE INACTIVACION EL SOMETER DICHA COMPOSICION A UNA CANTIDAD VIRUCIDAMENTE EFECTIVA DE IRRADIACION EN LA PRESENCIA DE (A) UNA MEZCLA DE UN COMPUESTO QUE EXTINGUE REACCIONES FOTODINAMICAS DE TIPO (I) Y UN COMPUESTO QUE EXTINGUE REACCIONES FOTODINAMICAS DE TIPO (II) DE (B) UN COMPUESTO BIFUNCIONAL QUE ES CAPAZ DE EXTINGUIR REACCIONES TANTO DE TIPO (I) COMO DE TIPO (II), PARA ASI INACTIVAR DICHO VIRUS MIENTRAS MANTIENE LA FUNCIONALIDAD DE DICHA COMPOSICION. LA COMPOSICION SE SOMETE VENTAJOSAMENTE A LA IRRADIACION Y LA MEZCLA DE LOS COMPUESTOS O COMPUESTO BIFUNCIONAL EN LA PRESENCIA DE UN SENSIBILIZADOR DE IRRADIACION. POROTRA PARTE, EL PROCESO PUEDE COMBINARSE VENTAJOSAMENTE CON UN METODO VIRUCIDA DIFERENTE PARA MEJORAS LA INACTIVACION DE VIRUS.

Description

Procedimiento para la esterilización de composiciones biológicas y el producto producido mediante el mismo.

Derechos gubernamentales

Este trabajo está financiado en parte por la concesión nº HL 41221 del National Heart, Lung and Blood Institute.

Esta solicitud es una continuación en parte del nº de serie de EE.UU. 08/031.787, presentado el 15 de marzo de 1993, que es, a su vez, una divisional del nº de serie de EE.UU. 07/706.919, presentado el 29 de mayo de 1991, ahora aprobado, que es, a su vez, una continuación en parte del nº de serie de EE.UU. 07/524.208, presentado el 15 de mayo de 1990, ahora la patente de EE.UU. nº 5.120.649.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una composición biológica sustancialmente libre de virus con cubierta y sin cubierta contenidos en la misma, sin desestabilizar o inactivar sustancialmente las células contenidas en la misma y sin una pérdida significativa de las proteínas lábiles o de otros componentes biológicos de valor contenidos también en la misma.

Descripción de la técnica relacionada

Los problemas relacionados con la aplicación de procedimientos viricidas sobre composiciones biológicas y los esfuerzos realizados hasta la fecha para superar estos problemas, incluyendo la aplicación de luz y de agentes químicos, se resumen brevemente en la patente de EE.UU. nº 5.120.649, véase la columna 1, línea 27 a través de la columna 4, línea 41, de la misma.

Se han evaluado varias técnicas de esterilización fotodinámica para inactivar virus en componentes celulares de la sangre. Aunque muchas de éstas parecen ser prometedoras para el tratamiento de los concentrados de glóbulos rojos (Matthews y col., "Photodynamic therapy of viral contaminants with potential for blood banking applications", en Transfusion, 28: 81-83 (1988); O'Brien y col., "Evaluation of merocyanine 540-sensitized photoirradiation as a means to inactivate enveloped viruses in blood products", en J. Lab. Clin. Med., 116: 439-47 (1990); y Horowitz y col., "Inactivation of viruses in blood with aluminum phthalocyanine derivatives", en Transfusion, 31: 102-8 (1991)), los procedimientos fotodinámicos de inactivación vírica que implican únicamente reacciones dependientes de oxígeno hasta ahora han demostrado ser inapropiados para el tratamiento de concentrados de plaquetas (Proudouz y col., "Inhibition by albumin of merocyanine 540-mediated photosensitization of platelets and viruses", en Transfusion, 31: 415-22 (1991), Dodd y col., "Inactivation of viruses in platelet suspensions that retain their in vitro characteristics: comparison of psoralen-ultraviolet A and merocyanine 540-visible light ,methods", en Transfusion, 31: 483-90 (1991); y Horowitz y col., "Inactivation of viruses in red cell and platelet concentrates with aluminum phthalocyanine (AlPc) sulfonates", en Blood Cells, 18: 141-50 (1992)).

Uno de los últimos desarrollos es el uso de compuestos fotoactivos. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.120.649 y el nº de serie de EE.UU. 07/706.919, presentado el 29 de mayo de 1991. Se ha demostrado que el psoraleno, junto con UVA, destruye los virus en disoluciones con células y sin células, sin daño indebido a los componentes de valor necesarios para la transfusión. El azul de metileno, junto con la luz visible, se está usando para tratar plasma completo. Las ftalocianinas y otros análogos del grupo hemo, junto con la luz visible, están siendo investigados para el tratamiento de concentrados de glóbulos rojos y de otros componentes sanguíneos.

Se sabe que el tratamiento con psoralenos y luz ultravioleta de longitud de onda larga (UVA) produce varios efectos bioquímicos, incluyendo interacciones independientes de oxígeno con ácidos nucleicos (por ejemplo, formación de un monoaducto psoraleno-ADN y reticulación del ADN) y reacciones dependientes de oxígeno de una naturaleza fotodinámica (para una revisión, véase Gasparro, F. P. (Ed.) (1988) Psoralen DNA Photobiology, vol. I, vol. II, CRC Press, Boca Raton, FL). Al contrario que los procedimientos puramente fotodinámicos apropiados para los glóbulos rojos (más arriba), el uso de psoralenos y UVA ha demostrado ser prometedor como un medio para fotoinactivar contaminantes víricos en concentrados de plaquetas, aunque en la mayoría de los estudios (Lin y col., "Use of 8-methoxypsoralen and long-wavelength ultraviolet radiation for decontamination of platelet concentrates", en Blood, 74: 517-525 (1989); y Dodd y col., supra, aminomethyltrimethylpsoralen (AMT)), la combinación de altos niveles de inactivación vírica y el mantenimiento de la función plaquetar solamente eran posiblen cuando se intercambiaba el aire por nitrógeno antes de la radiación con UVA, un procedimiento incómodo con una variabilidad inherente. Sin embargo, se ha demostrado recientemente (Margolis-Nunno y col., "Virus Sterilization in Platelet Concentrates with Psoralen and UVA in the presence of Quenchers" Transfusion, 22: 541-547 (1992)), que para la inactivación de \geq 6,0 log_{10} virus sin células de la estomatitis vesicular (VSV) mediante AMT y UVA, la necesidad de una depleción en el oxígeno como un medio para proteger las plaquetas podría ser obviada mediante la inclusión de manitol, un capturador (inactivador) de radicales libres. (La adición de inactivadores de reacciones fotodinámicas de tipo I (mediadas por radicales libres) o de tipo II (mediadas por oxígeno singlete) se usa frecuentemente en otros contextos para distinguir qué especie de oxígeno activo produce un efecto fotodinámico en particular). En las condiciones usadas en ese estudio, es decir, 25 \mug/ml de AMT y 30 minutos de UVA con manitol 2 mM, la inactivación del VSV sin células en aire era en parte dependiente del oxígeno, dado que una destrucción equivalente del virus (\geq 6,0 log_{10}) con oxígeno deplecionado requirió de 3 a 4 veces más tiempo de radiación UVA (de 90 minutos a 2 horas).

Sin embargo, aunque estos procedimientos consiguieron un alto nivel de destrucción de virus sin células con cubierta lipídica y virus asociados a las células de replicación activa, los virus sin cubierta y los virus latentes asociados a las células no fueron destruidos en gran magnitud en las condiciones reseñadas en los mismos. Por lo tanto, había una necesidad de efectuar la destrucción de éstas últimas formas víricas sin causar un daño significativo a los deseados y valiosos componentes de la mezcla biológica. Se ha demostrado que las condiciones que dieron como resultado la destrucción de > 10^{6} dosis infecciosas de virus latentes o sin cubierta modifican los glóbulos rojos y las plaquetas, y dan como resultado una recuperación alterada de las proteínas lábiles, tales como el factor
VIII.

Uno de los procedimientos más exitosos de los numerosos que se han desarrollado para inactivar virus en fluidos biológicos es el tratamiento con disolventes orgánicos y detergentes; especialmente el tratamiento con fosfato de tri(n-butilo) (TNBP) y detergentes no iónicos tales como Tween 80 o Triton X-100. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.540.573. Este procedimiento da como resultado una excelente recuperación de las proteínas lábiles, por ejemplo, los factores de coagulación VIII y IX, consiguiendo a la vez un alto nivel de destrucción de virus, por ejemplo, la destrucción de \geq 10^{6} a \geq 10^{8} DI de virus con cubierta; sin embargo, una baja inactivación de virus sin cubierta. Véase también la patente de EE.UU. nº 4.481.189, en la que aparece la inactivación vírica para el tratamiento con detergentes no aniónicos, alcoholes, éteres o mezclas de los mismos.

Otros procedimientos de inactivación de virus, aplicados habitualmente a los fluidos biológicos, útil en una situación de transfusión, incluyen el tratamiento térmico a una temperatura \geq 60ºC o el tratamiento con UVC junto con B-propiolactona (B-PL). Cada uno de estos procedimientos da como resultado una pérdida significativa de las proteínas lábiles y/o una destrucción incompleta del virus. Véase, por ejemplo, Horowitz, B., Biotechnology of Blood, "Inactivation of viruses found with plasma proteins", Goldstein, J., ed., Butterworth-Heinemann, Stoneham, 417-432, (1991). Adicionalmente, la adopción de la B-PL ha sido lenta debido a su carcinogenicidad. Se están desarrollando nuevos procedimientos destinados a aumentar la seguridad ante virus. Se está investigando en el laboratorio el uso de radiación gamma, pero hasta ahora, no se ha usado en el tratamiento de un producto disponible comercialmente. Véase Horowitz, B., y col., "Inactivation of viruses in labile blood derivatives 1. Disruption of lipid-enveloped viruses by tri(n-butyl)phosphate/detergent combinations", en Transfusion, 25: 516-521 (1985); y Singer y col., "Preliminary Evaluation of Phthalocyanine Photosensitization For Inactivation of Viral Pathogens in Blood Products", [resumen] British J. Hematology, 23-25 de marzo (1988: res. 31). Se están desarrollando filtros que parecen eliminar \geq 10^{6} DI_{50} de cada uno de varios virus; sin embargo, no se esperaría eliminar completamente virus pequeños, por ejemplo, el parvovirus o el virus de la Hepatitis A. Además, no se sabe si estos filtros pueden ser producidos comercialmente con una consistencia necesaria para la seguridad ante virus.

El documento EP0457196A2 describe un procedimiento para desactivar virus en composiciones biológicas. Con este fin sugiere combinar un inactivador con una sustancia fotorreactiva. Este documento deja abierto cómo combinar los inactivadores. Transfusion vol. 32, nº 6, 1992 describe el efecto viricida y funcional del tratamiento de concentrados de plaquetas con luz ultravioleta de longitud de onda larga y un derivado de psoraleno en presencia de un inactivador. A pesar de estos avances, continúa habiendo una necesidad de nuevos procedimientos que consigan un alto nivel de destreza para virus con cubierta y sin cubierta sin una pérdida significativa de las proteínas lábiles o de otros componentes biológicos de valor.

El objeto global de la invención es conseguir un alto nivel de inactivación de virus con cubierta y sin cubierta en composiciones biológicas sin incurrir en una desestabilización o inactivación sustancial de las células que se entiende están contenidas en las mismas y sin una pérdida significativa de las proteínas lábiles o de otros componentes biológicos de valor contenidos también en las mismas.

Este objeto se satisface con un procedimiento para inactivar un virus extracelular o intracelular con cubierta o sin cubierta que pueda estar presente en una composición biológica, comprendiendo dicha composición biológica al menos una de una composición biológica con células y una composición de un fluido biológico, comprendiendo dicho procedimiento el someter dicha composición biológica a una cantidad viricidamente eficaz de (i) radiación con rayos UV o gamma, o (ii) radiación con rayos UV, con rayos gamma, con rayos X o con luz visible y un sensibilizante en presencia de (a) una mezcla de al menos un compuesto inactivador que inactive las reacciones fotodinámicas de tipo I y al menos un compuesto inactivador que inactive las reacciones fotodinámicas de tipo II, o (b) un compuesto inactivador que inactive ambas reacciones de tipo I y de tipo II, o (c) una mezcla de un compuesto inactivador que inactive ambas reacciones de tipo I y de tipo II y un compuesto inactivador adicional, en la que dicho compuesto inactivador que inactiva ambas reacciones de tipo I y de tipo II de (b) y de (c) está presente en una concentración de al menos 0,2 mM, con la que se obtiene una conservación de la funcionalidad y la estructura de las células intactas mayor del 70% para las composiciones con células, y se obtiene una conservación de la actividad biológica mayor del 75% para los fluidos biológicos.

El procedimiento de la invención puede, por tanto, usarse para inactivar virus en sangre completa, en concentrados de glóbulos rojos y en concentrados de plaquetas, sin afectar negativamente a la estructura o la función de los glóbulos rojos o de las plaquetas. De forma similar, el procedimiento inventivo puede usarse para inactivar virus en composiciones biológicas sin incurrir en una inactivación sustancial de las sustancias biológicas solubles deseadas (por ejemplo, concentrados de factores de coagulación, disoluciones de hemoglobina) contenidas en las mismas.

Según otro aspecto de la invención, el procedimiento inventivo se lleva a cabo ventajosamente en presencia de un compuesto sensibilizante de radiación.

Según otro aspecto más de la invención, el procedimiento inventivo se combina ventajosamente con un procedimiento viricida diferente para incrementar la inactivación de virus.

El tratamiento aislado con UV bien de plasma o bien de concentrados del FAH da como resultado una pérdida relativamente alta de la actividad del factor de coagulación según las condiciones en las que se destruyen \geq 10^{5} DI_{50} de los virus; sin embargo, se ha descubierto que esta pérdida se reduce significativamente (es decir, la recuperación es alta) cuando se añaden inactivadores de las reacciones fotodinámicas antes del tratamiento con UV. Comparar, Murray y col., "Effect of ultraviolet radiation on the infectivity of icterogenic plasma", en JAMA, 157: 8-14 (1955): y, más recientemente, Kallenbach y col., "Inactivation of viruses by ultraviolet light" en Morgenthaler J-J ed. "Virus inactivation in plasma products", en Cum stud Hematol, Blood Transfus., 56: 70-82 (1989). Por lo tanto, el tratamiento combinado según la presente invención da como resultado un nivel muy alto de destrucción de virus mientras se conserva la actividad del factor de coagulación en niveles altos.

La radiación gamma de los componentes celulares sanguíneos es la técnica de elección para la prevención de la enfermedad del injerto contra el hospedador (GVHD) relacionada con la transfusión (TA) dado que es una radiación con UVB de los concentrados de plaquetas para la prevención de una aloinmunización por HLA. Sin embargo, cierta alteración de la integridad de los glóbulos rojos (pérdida de potasio durante el almacenamiento) y de las plaquetas (corrección de un tiempo de hemorragia disminuido) parece ser inherente a los actuales protocolos de radiación (Linden, J. V. y Pisciotto, P., 1992, "Transfusion associated graft-versus-host disease and blood irradiation," Trans. Med. Rev, 6: 116-123). La inclusión de inactivadores durante la radiación con \gamma o UVB (por ejemplo, flavonoides) o de mezclas inactivadoras que capturan los productos de las fotorreacciones de tipo I y de tipo II evitarán el daño a los glóbulos rojos y a las plaquetas según las condiciones en las que los glóbulos blancos resultan inactivados o alterados de otro modo. Recientes informes sobre especies de oxígeno activas como principales contribuyentes a la pérdida de potasio y al daño de la membrana celular de los glóbulos rojos producido con la radiación \gamma (Anderson y Mintz, 1992; Sadrzadeh y col., 1992) apoyan esta teoría y sugieren que la adición de estos inactivadores evitarán las pérdidas de K+ mejorando la especificidad hacia los ácidos nucleicos de este procedimiento de inactivación de los glóbulos
blancos.

Además, el uso de radiación \gamma con la inclusión de un inactivador como suplemento a los procedimientos de esterilización de virus con cubierta en concentrados de glóbulos rojos y en concentrados de plaquetas asegurará una inactivación de virus latentes o de provirus en los linfocitos contaminantes.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 comprende cuatro gráficas que representan los resultados de la inactivación mediante AMT y UVA del VSV y del bacteriófago M13 en presencia de manitol, de glicerol o de una mezcla de manitol y glicerol. La Fig. 1a representa los resultados de la función plaquetar. La Fig. 1b representa los resultados de destrucción de virus para la inactivación del VSV sin células. La Fig. 1c representa los resultados de destrucción de virus para el VSV asociado a las células. La Fig. 1d representa los resultados de destrucción de virus para el bacteriófago M13.

La Fig. 2 comprende dos gráficas que representan los resultados de la inactivación del VSV mediante AMT y UVA en presencia de \alpha-tocoferol, de triptófano o de una mezcla de fosfato de \alpha-tocoferol y triptófano. La Fig. 2a representa los resultados de la función plaquetar. La Fig. 2b representa los resultados de destrucción de virus para el VSV.

La Fig. 3 comprende cuatro gráficas que representan los resultados de la inactivación del VSV y del bacteriófago M13 mediante AMT y UVA en presencia de manitol, de fosfato de \alpha-tocoferol o de una mezcla de manitol y fosfato de \alpha-tocoferol. La Fig. 3a representa los resultados de la función plaquetar. La Fig. 3b representa los resultados de destrucción de virus para la inactivación del VSV sin células. La Fig. 3c representa los resultados de destrucción de virus para el VSV asociado a las células. La Fig. 3d representa los resultados de destrucción de virus para el bacteriófago M13.

La Fig. 4 comprende dos gráficas que representan los resultados de la inactivación del VSV mediante AMT y UVA en presencia de quercetina o de rutina, o de una mezcla de fosfato de \alpha-tocoferol y manitol. La Fig. 4a representa los resultados de la función plaquetar. La Fig. 4b representa los resultados de destrucción de virus para el VSV.

La Fig. 5 comprende dos gráficas que representan los resultados de la inactivación del VSV mediante AMT y UVA en presencia de quercetina o de rutina o de manitol. La Fig. 5a representa los resultados de la función plaquetar. La Fig. 5b representa los resultados de destrucción de virus para el VSV.

La Fig. 6 comprende una gráfica que representa el efecto sobre la recuperación del factor VIII de coagulación de la inclusión de rutina durante el tratamiento de inactivación vírica de plasma mediante AMT y UVA.

La Fig. 7 comprende una única gráfica que representa la influencia del tratamiento con UVC del concentrado de FAH con respecto a la infectividad del bacteriófago M13 y la recuperación del FVIII.

La Fig. 8 comprende dos gráficas que representan la concentración protectora y óptima del ascorbato en presencia de quercetina constante (Fig. 8a) y de quercetina en presencia de ascorbato constante (Fig. 8b).

La Fig. 9 comprende dos gráficas que representan la influencia del tratamiento con UVC en presencia de ascorbato 0,5 mM y de quercetina 0,2 mM con respecto a la infectividad del bacteriófago M13 y la recuperación del FVIII. La Fig. 9a representa los resultados del tratamiento del concentrado de FAH. La Fig. 9b representa los resultados del tratamiento de FFP (fresh frozen plasma -plasma fresco congelado-).

Descripción detallada de la invención

La sangre está formada por sólidos (células, es decir, eritrocitos, leucocitos y plaquetas) y líquido (plasma). Las células se transfunden en el tratamiento de anemia, alteraciones de la coagulación, infecciones, etc.. Además, las células contienen sustancias potencialmente valiosas tales como la hemoglobina, y pueden ser inducidas para que fabriquen otras sustancias potencialmente valiosas tales como interferón, factores de crecimiento y otros modificadores de la respuesta biológica. El plasma está formado principalmente por agua, sales, lípidos y proteínas. Las proteínas se dividen en grupos denominados fibrinógeno, globulinas séricas y albúmina sérica. Algunos anticuerpos típicos (inmunoglobulinas) que se encuentran en el plasma sanguíneo humano incluyen aquellos dirigidos contra hepatitis infecciosas, gripe H, etc..

Las transfusiones sanguíneas se usan para tratar la anemia resultante de una enfermedad o de una hemorragia, el choque resultante de una pérdida de proteínas plasmáticas o de una pérdida del volumen circulante, enfermedades en las que no se mantiene un nivel adecuado de proteínas plasmáticas, por ejemplo, hemofilia, y para impartir una inmunización pasiva.

En algunas enfermedades pueden estar ausentes uno o varios de los componentes sanguíneos. Por lo tanto, la administración de la fracción adecuada será suficiente, y los otros componentes no se "desperdiciaran" con el paciente; las otras fracciones pueden usarse para otro paciente. La separación de la sangre en sus componentes y su subsiguiente fraccionamiento permite concentrar las células y/o las proteínas, aumentando así su uso terapéutico.

Los tipos celulares encontrados en la sangre humana incluyen glóbulos rojos, plaquetas y varios tipos de leucocitos. Algunos procedimientos para la preparación de concentrados celulares útiles en transfusiones pueden encontrarse en la Kirk Othmer's Encyclopedia of Chemical Technology, tercera edición, Interscience Publishers, volumen 4, págs. 25-37.

Las proteínas encontradas en el plasma humano incluyen prealbúmina, proteína de unión al retinol, albúmina, alfa-globulinas, beta-globulinas, gamma-globulinas (inmunoglobulinas séricas), las proteínas de la coagulación (antitrombina III, protrombina, plasminógeno, factor antihemofílico-factor VIII, factor estabilizante de la fibrina-factor XIII y fibrinógeno), inmunoglobulinas (inmunoglobulinas G, A, M, D y E), y los componentes del complemento. Actualmente se han descrito más de 100 proteínas plasmáticas. Puede encontrarse una lista integral en "The Plasma Proteins", ed. Putnam, F. W., Academic Press, Nueva York (1975).

Las proteínas encontradas en la fracción celular sanguínea incluyen hemoglobina, fibronectina, fibrinógeno, factor de crecimiento derivado de plaquetas, superóxido dismutasa, enzimas del metabolismo de glúcidos y proteínas, etc.. Además, puede inducirse la síntesis de otras proteínas, tales como interferones y factores de crecimiento.

Puede encontrarse una lista integral de las proteínas inducibles en leucocitos en Stanley Cohen, Edgar Pick, J. J. Oppenheim, "Biology of the Lymphokines", Academic Press, Nueva York, (1979).

El fraccionamiento del plasma sanguíneo implica generalmente el uso de disolventes orgánicos tales como etanol, éter y polietilenglicol a bajas temperaturas y a valores de pH controlados para efectuar la precipitación de una fracción en particular que contiene una o más proteínas plasmáticas. El sobrenadante resultante puede precipitarse, y así sucesivamente, hasta que se alcanza el grado de fraccionamiento deseado. Más recientemente, las separaciones se basan en procedimientos cromatográficos. Un excelente estudio sobre el fraccionamiento sanguíneo también aparece en Kirk-Other's Encylopedia of Chemical Technology, tercera edición, Interscience Publishers, volumen 4, páginas 25 a 62, cuyo contenido completo se incorpora a este documento como referencia.

La presente invención está dirigida a someter a una composición biológica, tal como sangre completa, concentrados de glóbulos rojos, concentrados de plaquetas, extractos de plaquetas, concentrados de leucocitos, semen, fluido abdominal, leche, fluido linfático, líneas celulares de hibridoma y productos derivados de cualquiera de los anteriores, a una radiación en presencia de un inactivador o de una mezcla de inactivadores.

No debe interpretarse que los términos "composición con células", "composición biológica" o "fluido biológico", según se usan en este documento, incluyen ningún organismo vivo. Más bien, el procedimiento inventivo está destinado a llevarse a cabo en un entorno in vitro, y la composición con células, la composición biológica o el fluido biológico obtenidos mediante el procedimiento inventivo, a ser un producto producido in vitro, pero que podrá usarse in vivo.

La presente invención puede emplearse para tratar el producto de una composición que contiene células normales o cancerosas no sanguíneas o el producto del empalme de genes.

El término "radiación" debe interpretarse ampliamente como que incluye cualquier forma de radiación usada convencionalmente para inactivar células, por ejemplo, glóbulos blancos, virus, parásitos u otros organismos patógenos, por ejemplo, Toxoplasma gondii, Trvpanosoma cruzi, Plasmodium malariae o Babesia microti, ya sea solos o combinados con algún otro agente o dolencia. Algunos ejemplos no limitantes de radiación incluyen UV (UVA, UVB y UVC), radiación gamma, rayos X y luz visible.

Los detalles sobre la aplicación de la radiación para efectuar la inactivación de virus son conocidos por los expertos en la técnica. Los intervalos de fluencias de radiación típicos para la invención son 5-100 J/cm^{2} (preferiblemente 50-100 J/cm^{2}) para UVA, 0,02-2 J/cm^{2} (preferiblemente 0,05-0,2 J/cm^{2}) para UVC, y 1-40 kGy para radiación \gamma. Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que la inactivación de virus puede mejorarse ventajosamente si el tratamiento convencional de radiación se lleva a cabo en presencia de un inactivador o de una mezcla de inactivadores.

Algunos inactivadores adecuados de mezclas de inactivadores son cualquier sustancia de la que se sabe que reacciona tanto con los radicales libres (los denominados "inactivadores de tipo I") como con las formas reactivas del oxígeno (los denominados "inactivadores de tipo II").

Algunos inactivadores representativos incluyen ácidos grasos no saturados, azúcares reducidos, colesterol, derivados indólicos y similares, azidas, tales como azida sódica, triptófano, alcoholes polihídricos tales como glicerol y manitol, tioles tales como glutatión, superóxido dismutasa, flavonoides, tales como quercetina y rutina, aminoácidos, DABCO, vitaminas y similares.

El inactivador se usa en cantidades inactivadoras convencionales, pero sorprendentemente, cuando se usa, el procedimiento global da como resultado un daño preferente al virus pero no al material biológico deseado.

Según la presente invención, se consigue una eliminación superior de virus inactivando ambas reacciones fotodinámicas de tipo I y de tipo II, es decir, usando una mezcla de inactivadores de tipo I y de tipo II o usando compuestos, por ejemplo, flavonoides, de los que se sabe que inactivan ambos tipos de reacciones de tipo I y de tipo II. El intervalo de destrucción de virus es en la mayoría de los casos más amplio que el conseguido usando inactivadores de tipo I y de tipo II solos -incluso si se compara con concentraciones aumentadas del inactivador de tipo I o de tipo II- o usando mezclas de inactivadores de tipo I o mezclas de inactivadores de tipo II. Además, este intervalo más amplio de destrucción de virus se consigue sin sacrificar la funcionalidad o la estructura de las células intac-
tas.

Previamente se han usado los inactivadores para aumentar la especificidad de reacción en numerosos sistemas, incluyendo la radiación con rayos X y los compuestos activados por la luz. Sin embargo, el uso de inactivadores para el tratamiento UV de fluidos biológicos, especialmente disoluciones de proteínas sanguíneas, no ha sido reseñado previamente. La patente de EE.UU. nº 4.946.648 combina UV, disolventes y detergentes para tratar FAH o plasma estimulado por virus, pero los resultados son inferiores a los conseguidos según la presente invención. El mejor tratamiento permitió 5,4 logs de inactivación del fago Kappa, acompañado por un 74% de recuperación del FVIII. A modo de contraste, una forma de realización del procedimiento inventivo dio como resultado la inactivación de \geq 10^{16} DI_{50} del VSV, un virus prototipo con cubierta, y \geq 10^{8} DI_{50} del EMCV, un virus prototipo sin cubierta, con una recuperación del FVIII \geq 80%.

El procedimiento inventivo se lleva a cabo típicamente en un intervalo de temperatura de 0-42ºC, preferentemente de 20-37ºC y más preferentemente de 20-25ºC. El procedimiento inventivo se lleva a cabo típicamente a un pH de 6,5-8, más preferentemente de 7,2-7,6. Las muestras se someten típicamente al procedimiento inventivo durante un periodo de tiempo de menos de 24 horas; preferentemente de menos de 4 horas para radiación \gamma o X. Las muestras también pueden tratarse congeladas.

En una forma de realización de la presente invención, la composición biológica se somete a la radiación y al inactivador o mezcla inactivadora en presencia de un sensibilizante de radiación. En este contexto, algunos compuestos sensibilizantes de radiación adecuados para su uso en la presente invención incluyen ftalocianinas, purpurinas y otras moléculas cuya estructura se asemeja a la de las porfirinas (según se describió anteriormente), así como compuestos fotoactivos excitados por luz ultravioleta (por ejemplo, psoraleno, 8-metoxipsoraleno, 4'-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno, bergapteno y angelicina), pigmentos que absorben luz en el espectro visible (por ejemplo, hipericina, azul de metileno, eosina, fluoresceínas y flavinas), y pigmentos que absorben radiación X (por ejemplo, psoraleno bromado, hematoporfirina bromada, ftalocianina yodada). El uso de dichos sensibilizantes de radiación será fácilmente apreciable por los expertos en la técnica, y es preferiblemente sustancialmente según se describe en la patente de EE.UU. nº 5.120.649 y en el nº de serie de EE.UU. 07/706.919, presentado el 29 de mayo de 1991, cuyas divulgaciones se incorporan a este documento como referencia.

Según otra forma de realización de la invención, el tratamiento de la composición biológica con radiación y un inactivador o mezcla inactivadora se combina con un segundo procedimiento viricida. Este segundo procedimiento viricida puede ser cualquier procedimiento usado convencionalmente para inactivar virus con cubierta y/o sin cubierta, tales como, simplemente como ejemplo, un tratamiento térmico, secado o de otro modo, una manipulación del pH, un tratamiento con disolventes lipídicos y/o detergentes, un tratamiento con radiación por separado, por ejemplo, con radiación gamma, o un tratamiento con agentes químicos, por ejemplo, con formaldehído.

En una forma de realización preferible, el segundo procedimiento viricida es un tratamiento con un disolvente/detergente tal como el descrito en la patente de EE.UU. nº 4.540.573. En esta forma de realización, el fluido biológico se pone en contacto con un fosfato de dialquilo o con un fosfato de trialquilo con grupos alquilo que contengan de 1 a 10 átomos de carbono, especialmente de 2 a 10 átomos de carbono. Algunos miembros ilustrativos de los fosfatos de trialquilo para su uso en la presente invención incluyen fosfato de tri-(n-butilo), fosfato de tri-(t-butilo), fosfato de tri-(n-hexilo), fosfato de tri-(2-etilhexilo) y fosfato de tri-(n-decilo), sólo por nombrar unos pocos. Un fosfato de trialquilo especialmente preferible es el fosfato de tri-(n-butilo). También pueden emplearse mezclas de diferentes fosfatos de trialquilo, así como fosfatos con grupos alquilo de diferentes cadenas alquílicas, por ejemplo, etilfosfato de di-(n-butilo). De forma similar, pueden emplearse los respectivos fosfatos de dialquilo, incluyendo aquellos con mezclas de dife-
rentes grupos alquilo del fosfato de dialquilo. Adicionalmente pueden emplearse mezclas de fosfatos de di y trialquilo.

Los fosfatos de di y trialquilo para su uso en la presente invención se emplean en una cantidad de entre aproximadamente 0,01 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml, y preferiblemente entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml.

El fosfato de di o trialquilo puede usarse con o sin la adición de agentes humectantes. Sin embargo, es preferible usar el fosfato de di o trialquilo junto con un agente humectante. Dicho agente humectante puede añadirse antes, simultáneamente con, o después, de que el fosfato de di o trialquilo entra en contacto con el fluido biológico. La función del agente humectante es mejorar el contacto del virus del fluido biológico con el fosfato de di o trialquilo. El agente humectante solo no inactiva adecuadamente el virus.

Los agentes humectantes preferibles son los detergentes no tóxicos. Algunos detergentes no iónicos contemplados incluyen aquellos que, a la temperatura reinante, se dispersan en al menos el 0,1% en peso de la grasa en una disolución acuosa que contiene la misma, cuando se introduce en la misma 1 gramo de detergente por 100 ml de disolución. En particular, se contemplan detergentes que incluyan derivados polioxietilenados de ácidos grasos, ésteres parciales de anhídridos de sorbitol, por ejemplo, aquellos productos conocidos comercialmente como "Tween 80", "Tween 20" y "polisorbato 80", y detergentes acuosos no iónicos solubles en aceite tales como los vendidos comercialmente con la marca comercial "Triton X 100" (alquilfenol oxietilado). También se contempla el desoxicolato sódico, así como los "Zwittergentes" que son detergentes bipolares sintéticos conocidos como "sulfobetaínas", tales como el sulfonato de N-dodecil-N,N-dimetil-2-amonio-1-etano y sus congéneres, o detergentes no iónicos tales como octil-beta-D-glucopiranósido.

La cantidad de agente humectante, si se emplea, no es crucial; por ejemplo, puede usarse desde aproximadamente el 0,001% hasta aproximadamente el 10%, preferiblemente aproximadamente del 0,01 al 1,5%.

Los fosfatos de di y trialquilo pueden usarse junto con otros agentes inactivantes, tales como alcoholes o éteres, con o sin la presencia simultánea de agentes humectantes, según la patente de EE.UU. nº 4.481.189.

El tratamiento de los fluidos biológicos con un fosfato de trialquilo se efectúa a una temperatura de entre -5ºC y 70ºC, preferiblemente de entre 0ºC y 60ºC. El tiempo de dicho tratamiento (contacto) es de durante al menos 1 minuto, preferiblemente al menos 1 hora, y generalmente de 4 a 24 horas. El tratamiento se efectúa normalmente a presión atmosférica, aunque también pueden emplearse presiones subatmosféricas y superatmosféricas.

Normalmente, tras el tratamiento se eliminan el fosfato de trialquilo y los otros agentes inactivantes, por ejemplo, éter, aunque esto no es necesario en todos los casos, dependiendo de la naturaleza de los agentes inactivantes de virus y del tratamiento adicional pretendido del fluido biológico.

El fosfato de di o trialquilo y los detergentes no iónicos pueden eliminarse como sigue:

(1) extracción con aceites fisiológicamente compatibles (patente de EE.UU. nº 4.789.545);

(2) diafiltración usando membranas microporosas insolubles en éter, por ejemplo, de "TEFLON", que retienen las proteínas plasmáticas;

(3) absorción de los componentes plasmáticos deseados en soportes cromatográficos o en soportes cromatográficos de afinidad; y

(4) precipitación, por ejemplo, mediante la precipitación salina de las proteínas plasmáticas.

En particular, la eliminación desde FAH puede efectuarse mediante precipitación de FAH con glicina 2,2 molal y cloruro sódico 2,0 M. La eliminación desde fibronectina puede efectuarse fijando la fibronectina sobre una columna de gelatina insolubilizada y lavando la fibronectina unida para eliminar el reactivo.

Algunos ejemplos no limitantes de virus patógenos humanos con cubierta lipídica que pueden ser inactivados mediante la presente invención incluyen el virus de la estomatitis vesicular (VSV), el virus del sarcoma de Moloney, el virus Sindbis, los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1; VIH-2), el virus-I humano linfotrófico de linfocitos T (HTLV-I), el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis no A, no B (NANB) (hepatitis C), citomegalovirus, los virus de Epstein Barr, el virus elevador de la lactato deshidrogenasa, los virus del grupo herpes, rabdovirus, leucovirus, mixovirus, alfavirus, arbovirus (grupo B), paramixovirus, arenavirus y coronavirus. Algunos ejemplos no limitantes de virus sin cubierta que pueden ser inactivados mediante la presente invención incluyen el parvovirus, el virus de la polio, el virus de la hepatitis A, el virus entérico de la hepatitis no A, no B, el bacteriófago M13 y virus satélites adenoasociados (AAV).

Las composiciones con células que van a ser tratadas según la invención tienen \geq 1 x 10^{8} células/ml, preferiblemente \geq 1 x 10^{9} células/ml y más preferiblemente \geq 1 x 10^{10} células/ml. Adicionalmente, las composiciones con células que van a ser tratadas según la invención tienen preferiblemente > 4 mg/ml de proteínas y más preferiblemente > 25 mg/ml de proteínas y muy preferiblemente de 50 a 60 mg/ml de proteínas (células no lavadas).

Las composiciones sin células que van a ser tratadas según la invención tienen \geq 0,1 mg/ml, y preferiblemente \geq 5 mg/ml de proteínas.

En el procedimiento inventivo se inactivan al menos 10^{4}, preferiblemente 10^{6}, unidades infecciosas de virus parásitos o de otros patógenos.

Las composiciones biológicas tratadas según la invención, aunque inicialmente contienen \geq 1000 unidades infecciosas de virus/l, una vez que el virus ha sido inactivado y se ha realizado el tratamiento según la invención, tienen, en el caso de composiciones con células, una conservación de la funcionalidad y de la estructura celular intacta mayor del 70%, preferiblemente mayor del 80% y muy preferiblemente mayor del 95%. En el caso de fluidos biológicos puede alcanzarse una conservación de la actividad biológica mayor del 75%, preferiblemente mayor del 85% y muy preferiblemente mayor del 95%.

Mediante el procedimiento de inactivación de la invención, la mayoría, si no virtualmente todos los virus contenidos en la misma, serían inactivados. Un procedimiento para determinar los niveles de infectividad mediante inoculaciones en chimpancés (in vivo) es planteado por Prince, A. M., Stephen, W., Bortman, B. y van den Ende, M. C., "Evaluation of the Effect of Beta-propiolactone/Ultraviolet Irradiation (BPL/UV) Treatment of Source Plasma on hepatitis Transmission by Factor IX Complex in Chimpanzees", Thrombosis and Hemostasis, 44: 138-142, (1980).

Según la invención, la inactivación de virus se obtiene hasta el grado de al menos "4 logs", preferiblemente \geq 6 logs, es decir, el virus de la muestra está totalmente inactivado hasta el grado determinado por los estudios de infectividad en los que ese virus está presente en la muestra sin tratar en una concentración tal que incluso tras una dilución hasta 10^{4} (o 10^{6}) puede medirse la actividad vírica.

La presente invención describe la inactivación de virus, conservando simultáneamente las características funcionales y estructurales de las células sanguíneas lábiles.

Las actividades funcionales de las plaquetas están determinadas por su capacidad para agregarse en presencia de ciertos agentes biológicos y por su morfología. La integridad estructural de las plaquetas se evalúa mediante su supervivencia in vivo tras un radiomarcaje con indio-111 y la identificación de la presencia de antígenos plaquetarios específicos.

Tras el tratamiento con el compuesto fotorreactivo, el exceso de compuesto fotorreactivo puede eliminarse mediante centrifugación, diálisis de lavado y/o adsorción sobre matrices hidrófobas.

En una forma de realización de la presente invención, la fracción con células tratada del procedimiento inventivo es transfundida o devuelta al donante, por ejemplo, un donante humano, del que procedía la fracción inicial con células. De este modo, el nivel de virus circulantes en el donante se reducirá, mejorando así la capacidad del donante para liberarse del virus y/o mejorar la eficacia de los fármacos antivíricos.

Las actividades coagulantes del factor VIII y del factor IX se ensayan determinando el grado de corrección en el TTPA de plasma deficiente en factor VIII -y en factor IX-, respectivamente. J. G. Lenahan, Philips and Philips, Clin. Chem., vol. 12, página 269 (1966).

La actividad de las proteínas que son enzimas se determina midiendo su actividad enzimática. La actividad del factor IX puede medirse mediante esa técnica.

Se pueden medir las actividades de las proteínas de unión determinando su cinética y su afinidad de unión a sus sustratos naturales.

La actividad de las linfocinas se mide biológicamente en sistemas celulares, típicamente ensayando su actividad biológica en cultivos celulares.

La actividad de las proteínas se determina generalmente mediante los modos estándar conocidos para determinar la actividad de la proteína o el tipo de proteína implicada.

La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos Materiales y procedimientos Sangre

La sangre completa tenía típicamente menos de 48 horas cuando se usó. Antes de su uso se almacenó a 4ºC.

Concentrados de plaquetas

Los concentrados de plaquetas, liberados tras el banco de pruebas sanguíneas rutinario, tenían típicamente entre 24 y 48 horas cuando se trataron. Antes del tratamiento, los concentrados de plaquetas se almacenaron a entre 22 y 24ºC en las bolsas (PL 732, Fenwal Laboratories, Deerfield, IL) en las que se recibieron, y se agitaron constantemente en un agitador de plaquetas (Helmer Labs, St. Paul, MN).

Disoluciones de psoraleno

Se adquirió 4'-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (AMT) en HRI Assoc. Inc., Concord, CA. Las disoluciones de almacenamiento del AMT (4 mg/ml) se prepararon en agua destilada.

Estudios de virus prototipo

Se estudió la inactivación de los siguientes virus: virus de la estomatitis vesicular (VSV), un virus de ARN con cubierta lipídica; el virus de la encefalomiocarditis (EMC), un virus de ARN con cubierta proteica; el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), un retrovirus patógeno humano; el virus de la hepatitis A, un virus de ARN sin cubierta; el virus adenoasociado, un virus de ADN sin cubierta; el M13, un bacteriófago sin cubierta; y el poliovirus, un virus de ARN sin cubierta.

Se propagó la cepa pHM175 del VHA en cultivos monocapa de células de riñón de mono verde africano (BS-C-1) según describen Jansen y col., 1988 (Jansen R. W., J. E. Newbold y S. M. Lemon, Virology, 163: 299-367, 1988).

La cuantificación de la infectividad vírica se basó en la detección autorradiográfica de focos desarrollados en láminas celulares mantenidas por debajo del 0,5% de cubiertas de agarosa tras la fijación de las células con acetona al 80% y la subsiguiente tinción con anticuerpos (IgG) marcados con I-125 contra el VHA.

Se prepararon diluciones del VHA seriadas diez veces en medio de cultivo MEM complementado con suero bovino fetal al 2%; cada dilución se usó para inocular placas Corning duplicadas de 60 mm de células BS-C-1. Después de 5-7 días de incubación a 35 grados Centígrados en un entorno humidificado con CO_{2} al 5%, los focos derivados de la replicación de partículas de virus individuales se visualizaron, se contaron y los resultados se expresaron en términos de unidades formadoras de radioinmunofocos (RFU) de virus.

Se coinfectaron 293 células subconfluyentes con 10 PFU de Ad5, y diluciones del AAV seriadas 10 veces en medio de cultivo DMEM complementado con suero bovino fetal al 2% en 24 placas de pocillos. A las 48 horas tras la infección y la incubación a 37ºC en un entorno humidificado con CO_{2} al 5%, las células se rasparon de los pocillos, se lavaron, se desnaturalizaron y se hibridaron con una sonda de ADN de AAV (^{32}P) y se autorradiografiaron, según describen Carter y col, Virology, 128: 505-516, 1983. Tras la exposición a una película de rayos X y un recuento, se dibujaron las curvas estándar cpm a partir de las reservas de virus conocidos, y se usaron para determinar la concentración del AAV en cada dilución de la muestra desconocida.

Se cultivó el VSV en células A549 humanas. Se prepararon reservas del EMC en células L929 de ratón o A459 humanas. El poliovirus se hizo crecer en células HeLa humanas. Los procedimientos de cultivo y de ensayo eran similares a los descritos en Horowitz, B., Wiebe, M. E., Lippin, A. y Stryker, M. H., "Inactivation of Viruses in Labile Blood Derivatives", Transfusion, 1985; 25: 516-522. La infectividad del VSV, del EMC y del poliovirus se evaluó mediante diluciones de punto final seriadas 10 veces en medio de cultivo DMEM (Gibco Laboratories; Grand Island, Nueva York) con suero bovino fetal al 10% (FCS; MA Bioproducts, Walkersville, Maryland). Cada dilución se usó para inocular ocho pocillos replicados de células A549 (VSV o EMC) o HeLa (poliovirus) humanas en placas de microtitulación de 96 pocillos. La citopatología inducida por los virus se puntuó tras 72 horas de incubación a 37ºC en CO_{2} al 5%. El título reseñado del virus se calculó usando el método de Spearman-Karber (Spearman, C., "The Method of Right and Wrong Cases' (``Constant Stimuli'') Without Gauss's Formula", Br. J. Psvchol., 1908; 2: 227-242) e indica la cantidad de virus que infecta al 50% de los pocillos de cultivo tisular (DICT_{50}).

Se preparó VSV asociado a las células incubando una monocapa confluyente de células A549 humanas con 5 ml de 10^{7} DI_{50}/ml de VSV en DMEM sin suero durante 1 hora a 37ºC en CO_{2} al 5% en matraces de cultivo tisular de 150 cm^{2}. La multiplicidad de la infección en estas condiciones era de aproximadamente 2,1 DICT_{50}/célula. Después de decantar el líquido, las células adheridas se lavaron tres veces para eliminar el virus libre con 50 ml de PBS por lavado. Después se añadieron 40 ml de DMEM que contenía FCS al 5% y las células se incubaron durante 4 3/4 horas adicionales. Las células adheridas se lavaron tres veces con PBS y se liberaron mediante un tratamiento durante 10 minutos con una disolución salina normal que contenía un 0,01% de tripsina (Cooper Biomedical, Freehold, Nueva Jersey; cristalizada dos veces) y 5 \mug/ml de EDTA. Las células liberadas se recogieron mediante centrifugación, se lavaron tres veces con PBS y se resuspendieron en PBS.

Para evaluar la inactivación del virus se detuvo la reacción viricida mediante una dilución de 10 veces en DMEM que contenía suero bovino fetal al 5%, y las células, cuando estaban presentes, se eliminaron mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos. La ausencia de inactivación del virus a esta dilución o en ausencia de radiación se confirmó para cada una de las condiciones de inactivación estudiadas. Las muestras se filtraron estériles (Swinnex filters, Millipore Corp., Bedford, Massachusetts) y se congelaron a -70ºC o menos hasta su ensayo.

Los procedimientos para la evaluación de la inactivación del VSV asociado a las células fueron similares a los del VSV sin células, excepto porque todos los experimentos del VSV asociado a las células se llevaron a cabo en unas condiciones asépticas totalmente controladas. Al concluir el experimento, las células A549 infectadas se aislaron mediante centrifugación, se lavaron tres veces con PBS mediante centrifugación, se resuspendieron en 1 ml de PBS e inmediatamente se ensayaron para evaluar la infectividad del VSV mediante diluciones de punto final seriadas 10 veces, como con el virus sin células.

Ejemplo 1 Efecto de la inclusión de inactivadores de tipo I durante el tratamiento de un concentrado de plaquetas con AMT y UVA

Se trataron alícuotas (3 ml) de un concentrado de plaquetas con 25 \mug/ml de 4'-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (AMT) y 7,5 mW/cm^{2} de UVA durante los tiempos indicados en presencia o ausencia de varios inactivadores de tipo I. Antes del tratamiento se añadieron por separado el virus de la estomatitis vesicular (VSV) sin células, el VSV asociado a las células o el bacteriófago M13 sin cubierta a las alícuotas de concentrado de plaquetas. Tras el tratamiento se ensayaron las muestras que contenían virus para evaluar su infectividad vírica, y las muestras sin virus se almacenaron hasta el día siguiente y después se ensayaron para evaluar la agregación en respuesta a 20 \mug/ml de colágeno en un agregómetro BioData. La respuesta a la agregación proporcionada en la tabla compara la tasa inicial de agregación en la muestra tratada con la observada en el control sin tratar.

Los resultados del Ejemplo 1, mostrados en la Tabla I, indican que con los 30 minutos de tiempo de radiación UVA necesarios para la completa inactivación del VSV sin células (\geq 6,0 log_{10}) con AMT, la adición de ciertos inactivadores de tipo I (por ejemplo, manitol 2 mM, glicerol 4 mM) mejoró la función de agregación plaquetar desde aproximadamente el 70% hasta más del 90% de los niveles de control. Había, sin embargo, una pequeña inactivación del VSV asociado a las células o del M13 con el tratamiento de 30 minutos, tanto si había inactivadores de tipo I presentes como si no. Con los tiempos de radiación UVA de 60 minutos o más que fueron necesarios para una destrucción de más de 1 log_{10} del virus asociado a las células o sin cubierta, la función plaquetar desapareció (la tasa de agregación fue de un 60% o menos, incluso en presencia de inactivadores de tipo I a concentraciones de hasta 50 mM).

Los datos de la Tabla I también indican que la inclusión de inactivadores de tipo I a concentraciones de hasta al menos 10 mM, no tuvo un efecto aparente sobre la inactivación del VSV sin células o asociado a las células o del M13 por AMT y UVA.

TABLA I Adición de inactivadores de tipo I: efectos sobre la agregación plaquetar y la destrucción de virus

	Respuesta de agregación,	Inactivación del virus (log_{10})(3)
	% del control
Inactivador				VSV sin	VSV asociado a	M13
(concentración)	30^{(1)}	60	90	células	las células
Manitol (2 mM)	95	60	32	\geq 6,0	1, 2^{(4)}, 3^{(5)}	1, 2^{(4)}, 3^{(5)}
Manitol (4 mM)	95	58	n.d.^{(2)}	\geq 6,0
Manitol (10 mM)	91	56	n.d.	\geq 6,0	1, 2^{(4)}, 3^{(5)}
Manitol (50 mM)	85	55	30	5,8
Glicerol (2 mM)	90	50	n.d.	\geq 6,0
Glicerol (4 mM)	95	55	35	\geq 6,0	1, 2^{(4)}, 3^{(5)}	1, 2^{(4)}, 3^{(5)}
Glicerol (10 mM)	80	50	n.d.	\geq 6,0
Glicerol (50 mM)	85	50	n.d.	5,8

TABLA I (continuación)

	Respuesta de agregación,	Inactivación del virus (log_{10})(3)
	% del control
Inactivador				VSV sin	VSV asociado a	M13
(concentración)	30^{(1)}	60	90	células	las células
Glutatión (2 mM)	80	60	40	\geq 6,0
Glutatión (4 mM)	80	55	25	\geq 6,0
Glutatión (10 mM)	75	n.d.	n.d.	\geq 6,0
Superóxido dismutasa	85	50	30	\geq 6,0
(20 \mug/ml)
Superóxido dismutasa	75	45	n.d.	n.d.
(100 \mug/ml)
Ninguno (- - -)	75	52	35	\geq 6,0	1, 2^{(4)}, 3^{(5)}	1, 2^{(4)}, 3^{(5)}
(1) minutos de exposición a UVA;
(2) n.d. = no disponible;
(3) \begin{minipage}[t]{145mm} salvo que se indique de otro modo, sólo se proporcionan los resultados de virus con 30 min. de UVA, dado que tiempos de tratamiento más largos alteraban la integridad plaquetar;\end{minipage}
(4) resultados de destrucción con 60 minutos de UVA;
(5) resultados de destrucción con 90 minutos de UVA.

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Ejemplo 2 Efecto de la inclusión de inactivadores de tipo II durante el tratamiento de un concentrado de plaquetas con AMT y UVA

Se trató un concentrado de plaquetas (3 ml) con 25 \mug/ml de AMT y 11 mW/cm^{2} de UVA durante los tiempos indicados, en presencia o ausencia de varios inactivadores de tipo II. La agregación plaquetar y la inactivación de los VSV sin células y asociados a las células, y del M13 se ensayaron y se reseñaron según se describe en el Ejemplo 1. Los resultados (Tabla II) indican que con 30 minutos de radiación UVA, la presencia de inactivadores de tipo II disminuyó la inactivación del VSV sin células por el AMT, y esta supresión de la destrucción aumentó al aumentar la concentración del inactivador de tipo II. Dado que la función plaquetar no estaba protegida por la inclusión del inactivador de tipo II, la destrucción efectiva del virus con AMT y UVA en concentrados de plaquetas parecía estar disminuida con la adición de los inactivadores de tipo II.

La Tabla II también indica que mientras que era inhibida la inactivación del virus VSV con cubierta lipídica, la destrucción del bacteriófago M13 sin cubierta no se modificó por la inclusión de los inactivadores de tipo
II.

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TABLA II Adición de inactivadores de tipo II: efectos sobre la agregación plaquetar y la destrucción de virus

	Respuesta de agregación,	Destrucción del virus (log_{10})(3)
	% del control
Inactivador	30^{(1)}	60	90	VSV sin	VSV asociado a	M13
(concentración [mM])				células	las células
Fosfato de \alpha-tocoferol (0,5)	76	55	35	4,8
Fosfato de \alpha-tocoferol (1,0)	75	60	40	4,0	0,5, 1,5^{(4)}	1, 2^{(4)} 2^{(5)} 3^{(5)}
Fosfato de \alpha-tocoferol (2,0)	70	50	30	3,5
Triptófano (2)	70	50	30	5,5	1	1
Triptófano (4)	60	45	20	4,9

TABLA II (continuación)

	Respuesta de agregación,	Destrucción del virus (log_{10})(3)
	% del control
Inactivador	30^{(1)}	60	90	VSV sin	VSV asociado a	M13
(concentración [mM])				células	las células
Triptófano (10)	45	20	0	4,0	0,5	1
Histidina (5)	75	55	35	5,1
Histidina (10)	65	n.d.^{(2)}	n.d.^{(2)}	4,8
Ninguno (--)	75	52	35	\geq 6,0	1, 2^{(4)}, 3^{(5)}	1, 2^{(4)}, 3^{(5)}
(1) minutos de exposición a UVA;
(2) n.d. = no disponible;
(3) \begin{minipage}[t]{145mm} salvo que se indique de otro modo, se proporcionan los resultados de destrucción de virus con sólo 30 minutos de UVA;\end{minipage}
(4) resultados de destrucción con 60 minutos de UVA;
(5) resultados de destrucción con 90 minutos de UVA.

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Ejemplo 3 Efecto de la inclusión de mezclas de inactivadores de tipo I durante el tratamiento de un concentrado de plaquetas con AMT y UVA

Se trataron alícuotas (3 ml) de un concentrado de plaquetas con 25 \mug/ml de AMT y 11 mW/cm^{2} de UVA durante los tiempos indicados en ausencia o presencia individual de los inactivadores de tipo I manitol (2 mM) o glicerol (4 mM), o en presencia de la mezcla de estos dos inactivadores de tipo I. Se muestran los resultados (Fig. 1) para la función plaquetar (Fig. 1a) y para la inactivación del VSV sin células (Fig. 1b) y asociado a las células (Fig. 1c), y para M13 (Fig. 1d), que se ensayaron según se describe en el Ejemplo 1.

Los efectos de la adición de la mezcla de los inactivadores de tipo I manitol y glicerol sobre la función plaquetar (Fig. 1a) y la destrucción de virus (Figs. 1b, 1c, 1d) son similares a los efectos de la adición individual de inactivadores de tipo I según se describe en el Ejemplo 1. La destrucción de virus es equivalente en ausencia o en presencia de mezclas de inactivadores de tipo I, y la función plaquetar tras los 30 minutos de tratamiento con UVA, que produce la destrucción completa del VSV sin células, está mejorada por la presencia del inactivador de tipo I. Sin embargo, con los tiempos de tratamiento de 60 minutos o más que son necesarios para una destrucción de más de 1 log_{10} de virus asociados a las células o del M13, la función plaquetar resulta alterada tanto si se incluyen inactivadores de tipo I como si no, solos o en combinación.

Otras mezclas de inactivadores de tipo I, por ejemplo, manitol 2 mM o glicerol 4 mM combinados con glutatión 2 mM (no mostrado), dieron unos resultados equivalentes a los obtenidos con la combinación de manitol y glicerol, y no proporcionaron más protección a las plaquetas que cualquiera de los inactivadores de tipo I que forman la mezcla.

Ejemplo 4 Efecto de la inclusión de mezclas de inactivadores de tipo II durante el tratamiento de un concentrado de plaquetas con AMT y UVA

Se trató un concentrado de plaquetas (alícuotas de 3 ml) con 25 \mug/ml de AMT y 11 mW/cm^{2} de UVA durante 30, 60 ó 90 minutos en ausencia o presencia de la mezcla de los inactivadores de tipo II fosfato de \alpha-tocoferol (1 mM) y triptófano (5 mM), o en la presencia individual de cualquier inactivador. Los resultados (Fig. 2) para la función plaquetar (Fig. 2a) y para la destrucción del virus VSV sin células (Fig. 2b) se ensayaron y reseñaron según se describe en el Ejemplo 1.

La inclusión de inactivadores de tipo II, bien individualmente o bien combinados con otros inactivadores de tipo II, no proporcionó protección a las plaquetas (Fig. 2a). Además, la presencia de inactivadores de tipo II disminuyó la tasa de destrucción del VSV sin células por AMT y UVA en el aire, y esta supresión de la destrucción era aditiva con los inactivadores de tipo II combinados. En 30 minutos la destrucción era completa (\geq 6,0 log_{10}) sin inactivadores presentes, mientras que en la presencia individual de \alpha-tocoferol 1 mM o de triptófano 5 mM, la destrucción fue de sólo aproximadamente 4,2 log_{10}, y con la presencia combinada de estos inactivadores la destrucción se redujo adicionalmente hasta aproximadamente 2,8 log_{10} (Fig. 2b). Otras mezclas de inactivadores de tipo II, por ejemplo, triptófano o \alpha-tocoferol en combinación con histidina 5 mM (no mostrado), tuvieron efectos similares; no protegieron la función plaquetar y su inclusión combinada causó una disminución en la tasa de destrucción del VSV sin células, que era mayor que la de cualquiera de los inactivadores individuales. Por lo tanto, la función plaquetar resultaba alterada en todas las condiciones de tratamiento con AMT y UVA en presencia de inactivadores de tipo II (solos o en combinación), con los que se inactivaron \geq 6 log_{10} de VSV sin células.

Ejemplo 5 Efecto de la inclusión de mezclas de inactivadores de tipo I y de tipo II durante el tratamiento de un concentrado de plaquetas con AMT y UVA

Se trataron alícuotas (3 ml) de un concentrado de plaquetas con 25 \mug/ml de AMT y 11 mW/cm^{2} de UVA durante 30, 60 ó 90 minutos en presencia de una mezcla del inactivador de tipo I manitol (2 mM) y del inactivador de tipo II fosfato de \alpha-tocoferol (1 mM), o en la presencia individual de manitol o de \alpha-tocoferol. La función plaquetar (Fig. 3a) y la destrucción del virus (Figs. 3b, 3c, 3d) se ensayaron y reseñaron según se describe en el Ejemplo 1.

Con 30 minutos de radiación, la función plaquetar (Fig. 3a) se preservaba tanto con la adición individual del inactivador de tipo I (manitol) como con la combinación de manitol (tipo I) y fosfato de \alpha-tocoferol (tipo II). Con 60 minutos o más de UVA, la presencia combinada de manitol y fosfato de \alpha-tocoferol mejoró la agregación plaquetar (desde aproximadamente el 70% hasta más del 90% del control con 60 minutos de UVA), mientras que la presencia individual de cada uno de estos inactivadores no lo hizo. Los resultados funcionales usando glicerol como el inactivador de tipo I fueron similares a los del manitol combinado con \alpha-tocoferol. Con todas las combinaciones probadas de tipo I más tipo II, los resultados de destrucción de virus de los inactivadores combinados eran los mismos que los del inactivador de tipo II solo, y la tasa de destrucción del VSV sin células (Fig. 3b) y asociado a las células (Fig. 3c) disminuyeron de alguna manera, mientras que la del M13 (Fig. 3d) no se vio afectada por la adición del inactivador de tipo II.

Con los tiempos de radiación más largos, posibles mediante la adición de la combinación de inactivadores de tipo I y de tipo II, manitol (o glicerol) y \alpha-tocoferol, el intervalo efectivo de destrucción del virus por AMT y UVA en concentrados de plaquetas aumentó.

Ejemplo 6 Efecto de la inclusión de compuestos que inactivan ambas reacciones fotodinámicas de tipo I y de tipo II durante el tratamiento de un concentrado de plaquetas con AMT y UVA

Se trataron alícuotas (3 ml) de un concentrado de plaquetas con 25 \mug/ml de AMT y UVA (11 mW/cm^{2}) durante 30, 60 ó 90 minutos en ausencia o presencia de una mezcla de quercetina 0,25 mM o de rutina 0,25 mM, o con la mezcla de fosfato de \alpha-tocoferol 1 mM y manitol 2 mM. La función plaquetar y la inactivación del virus se ensayaron y reseñaron como en el Ejemplo 1 (Fig. 4).

Los efectos de la inclusión de los flavonoides quercetina o rutina, compuestos de los que se sabe que inactivan eficazmente ambos tipos de reacciones fotodinámicas de tipo I y de tipo II, fueron similares a los obtenidos cuando se incluían mezclas de inactivadores de tipo I y de tipo II durante el tratamiento. La tasa de destrucción del VSV (Fig. 4b), pero no la del M13 (no mostrada, Fig. 3d) disminuyó, y la función plaquetar (Fig. 4a) estaba protegida, incluso con los tiempos de radiación más largos requeridos para la completa destrucción del VSV sin células.

Ejemplo 7 Efecto de los flavonoides sobre la agregación plaquetar

La agregación inducida por colágeno es un indicador perceptible de la función plaquetar y los resultados con el colágeno habitualmente se correlacionan bien con los de la morfología plaquetar, la activación y la liberación de tromboxano y ATP, así como la agregación inducida por otros agonistas. Se proporciona la respuesta de agregación (grado y tasa inicial de agregación comparados con el control sin tratar) ante el colágeno tras el tratamiento con 25 \mug/ml de AMT y 90 minutos de UVA (Tabla III). La tabla III indica que cada uno de los flavonoides probados protegía la respuesta de agregación inducida por el colágeno.

TABLA III Efectos de la adición de flavonoides sobre la respuesta de agregación plaquetar tras el tratamiento con AMT y UVA

		% del control sin tratar - grado/tasa de
		respuesta de agregación al colágeno^{(1)}
Inactivador flavonoide	Forma del glicón	Sin tratar	Tratado
ninguno	- -	100/100	44/24
quercetina	- -	100/100	98/98
crisina	- -	100/100	90/85
rutina	+	100/100	100/100
hesperidina	+	98/90	100/86
naringina	+	90/83	78/61
(1) \begin{minipage}[t]{140mm} antes del almacenamiento hasta el día siguiente la muestra se trató con 25 \mug/ml de AMT y 90 minutos de UVA en ausencia o en presencia del flavonoide indicado.\end{minipage}

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Ejemplo 8 Efecto de la inclusión de compuestos que inactivan ambas reacciones fotodinámicas de tipo I y de tipo II durante el tratamiento de un concentrado de plaquetas con UVA y concentraciones crecientes de AMT

Debido a que sólo se inactivó un 3 log_{10} del VSV asociado a las células usando una concentración de AMT de 25 \mug/ml, se evaluaron los efectos de concentraciones mayores de AMT con y sin la adición de varios inactivadores. Se trataron alícuotas (3 ml) de concentrado de plaquetas con UVA (11 mW/cm^{2}) durante 90 minutos en presencia de AMT a unas concentraciones de 25, 50 ó 100 \mug/ml, con o sin la adición de rutina 0,7 mM, quercetina 0,7 mM o manitol 2 mM. La agregación plaquetar en respuesta al colágeno (Fig. 5a) y la inactivación del VSV asociado a las células (Fig. 5b) se ensayaron y reseñaron según se describe en el Ejemplo 1.

Ante el tratamiento de las plaquetas con 90 minutos de UVA y 25 \mug/ml de AMT, la respuesta de agregación al colágeno fue sólo de aproximadamente el 35% del control, y según se mencionó anteriormente, la adición de manitol no protegió la función plaquetar con este tratamiento de radiación. La agregación disminuyó adicionalmente (hasta menos del 30% con 50 \mug/ml y hasta ninguna respuesta con 100 \mug/ml de AMT) con una concentración creciente de AMT tanto si había manitol presente como si no. Cuando se incluyó rutina 0,7 mM durante el tratamiento, la función de agregación aumentó hasta más del 80% del control con todas las concentraciones de AMT probadas (Fig. 5a). El VSV sin células (no mostrado) era completamente inactivado en todas estas condiciones de tratamiento, y con 100 \mug/ml de AMT y rutina (o quercetina) 0,7 mM presentes, la inactivación del VSV asociado a las células era de casi 6 log_{10} (Fig 5b). Por lo tanto, mediante la inclusión de compuestos que inactivan ambas reacciones fotodinámicas de tipo I y de tipo II (por ejemplo, flavonoides tales como la rutina), durante el tratamiento de un concentrado de plaquetas con psoralenos y UVA, la función de agregación plaquetar se mantuvo bien en las condiciones en las que se inactivó prácticamente un 6 log_{10} de virus asociados a las células en presencia de oxígeno.

Ejemplo 9 Efecto de la desoxigenación comparado con la adición de rutina durante el tratamiento de un concentrado de plaquetas con AMT y UVA

Se trataron alícuotas de un concentrado de plaquetas con AMT a la concentración indicada y 90 minutos de UVA, tanto en aire en ausencia o en presencia de rutina, como con el aire del conducto intercambiado por una combinación de nitrógeno (95%) y CO_{2} (5%). La agregación plaquetar se evaluó como en el Ejemplo 1 tras un almacenamiento hasta el día siguiente en aire. La tabla IV muestra que con una concentración de AMT de 50 \mug/ml, aunque tanto la desoxigenación como la adición de rutina fueron capaces de mejorar la función plaquetar tras el tratamiento con AMT/UVA, los resultados con la rutina eran coherentes entre experimento y experimento, mientras que los del intercambio de gases eran más variables y a menudo no mostraban ningún beneficio.

TABLA IV Agregación plaquetar tras 90 minutos de tratamiento con AMT y UVA. Efecto de la rutina frente a la eliminación de oxígeno sobre la coherencia de los resultados

	Concentración	Aire sin	Aire +	Sin oxígeno
Exp.	de AMT	inactivador	rutina 0,5 mM	Sin inactivador

1	50 \mug/ml	32/33	100/100	95/100
2	50 \mug/ml	42/31	98/95	90/85
3	50 \mug/ml	36/18	95/90	56/36
4	50 \mug/ml	70/30	96/96	91/94
5	50 \mug/ml	21/13	100/84	3/13

Ejemplo 10 Recuperación mejorada de los factores de coagulación durante el tratamiento de plasma con AMT y UVA con la inclusión de compuestos que inactivan ambas reacciones fotodinámicas de tipo I y de tipo II

Se trató plasma humano (alícuotas de 3 ml) con 25, 50, 100 ó 200 \mug/ml de AMT y se radiaron con UVA (11 mW/cm^{2}) durante 90 minutos. La recuperación del factor de coagulación VIII (Factor AntiHemofílico, FAH) se comparó en las muestras tratadas con o sin la inclusión de rutina 1, 2 ó 5 mM. Los resultados se muestran en la Figura 6. Durante el tratamiento del plasma con 25 \mug/ml de AMT y 90 minutos de UVA, la recuperación del FAH en ausencia de rutina fue sólo del 27% del control sin tratar, y este bajo valor disminuyó adicionalmente al aumentar la concentración de psoraleno, y con un tratamiento de 200 \mug/ml de AMT, la recuperación fue sólo del 7%. Notablemente, la recuperación del FAH se restableció hasta el 83% o más cuando se incluyó la rutina durante el tratamiento (a unas concentraciones de 2 mM o mayores para unas concentraciones de AMT de hasta 100 \mug/ml, o a 5 mM con una concentración de AMT de 200 \mug/ml, y con \geq 25 \mug/ml de AMT, estas condiciones de tratamiento fueron suficientes para inactivar al menos 4 log_{10} del bacteriófago sin cubierta M13.

Por lo tanto, mediante la adición de rutina, un compuesto del que se sabe que inactiva ambos tipos de reacciones fotodinámicas de tipo I y de tipo II durante el tratamiento del plasma con psoralenos y UVA, puede obtenerse un aumento significativo en la recuperación del factor de coagulación VIII con oxígeno presente, en unas condiciones en las que el virus sin cubierta puede ser inactivado.

El siguiente conjunto de ejemplos, que se establece a continuación, hace referencia a un tratamiento con "disolvente-detergente" y/o "DD". En cada caso, el protocolo para este tratamiento fue como sigue: se trataron los concentrados de FAH con un 0,3% de fosfato de tri(n-butilo) (TNBP) y un 1% de Tween 80 durante 6 horas a 24ºC, tras lo cual los reactivos añadidos se eliminaron, cuando se indique, mediante cromatografía de intercambio iónico. El plasma se trató con un 1% de TNBP y un 1% de Triton X-100 durante 4 horas a 30ºC, tras lo cual los reactivos añadidos se eliminaron mediante cromatografía hidrófoba sobre una resina que contenía C18.

Ejemplo 11 Tratamiento con UV del concentrado de FAH en ausencia de inactivadores añadidos

A un concentrado de FAH se añadió el fago M13, un virus sin cubierta. La mezcla se sometió a una dosis variable de radiación UV en una celda de flujo de cuarzo variando la tasa de flujo. La fuente de luz UV era una bombilla BLEIT155 (Spectronic Co., Westbury, NY). Antes y después de la radiación se midió la infectividad del fago M13 mediante un ensayo en placa en células hospedadoras JM101; la actividad del FAH se midió en un ensayo de coagulación. Los resultados, mostrados en la Figura 7, indican que en las condiciones en las que se consigue una inactivación de 5 log_{10} del fago M13, la recuperación del factor VIII era menor del 50%.

Ejemplo 12 Tratamiento con UV del plasma en presencia de quercetina y ascorbato

Al plasma se añadió el fago M13 sin cubierta. El tratamiento de la mezcla en presencia de ascorbato 0,75 mM y quercetina 0,20 mM (concentración final) con de 0,073 J/cm^{2} a 0,134 J/cm^{2} de UV dio como resultado una inactivación de 6,2 a 6,5 log_{10} (DI_{50}) del M13, mientras que las recuperaciones del FVIII y del FIX fueron del 82-97% y del 81-94%, según se muestra en la Tabla V, a continuación:

TABLA V

Dosis de UV	Destrucción del fago (log_{10})	% de recuperación del FVIII	recuperación del FIX
(J/cm)	- inactivador	+ inactivador	- inactivador	+ inactivador	- inactivador	+ inactivador
0		0	100	100	100	100
0,073	5,5	6,4	63	86	65,5	81,0
0,083	5,6	6,5	62	82	60,0	83,0
0,099	6,7	6,5	64,8	83	60	94,0
0,134	5,3	5,5	73	97	59,6	85,0

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Nótese que la recuperación del factor VIII y del factor IX en presencia de inactivadores es significativamente mayor, mientras que la adición del inactivador no tuvo un efecto significativo sobre la destrucción del virus.

Ejemplo 13 Tratamiento con UV del concentrado de FAH en presencia de quercetina y ascorbato

Antes de la etapa de inactivación con disolvente-detergente del procedimiento de elaboración, el FAH se trató con UV a 0,086 J/cm^{2} tras añadir EMC o VSV. Las otras condiciones eran las mismas a las descritas en el ejemplo 12. En la tabla VI, a continuación, se muestra que se inactivaron \geq 7,0 log_{10} de EMC y VSV. La correspondiente recuperación del FVIII fue del 80,0% cuando hubo inactivadores presentes durante la radiación. Esto se compara con el 33% sin inactivadores.

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TABLA VI

	Destrucción del virus (log_{10})	% de rendimiento de FVIII
Dosis de UV	– inactivador	+ inactivador	- inactivador	+ inactivador
	EMC	VSV	EMC	VSV
0	0	0	0	0	100	100
0,086	\geq 7,0	\geq 7,0	\geq 7,0	\geq 7,0	33	80

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Ejemplo 14 Tratamiento combinado del plasma con UV y DD

Se añadió el virus al plasma tratado con disolvente-detergente y se trató con UV a 0,083 J/cm^{2}. La Tabla VII muestra que la destrucción del EMC fue \geq 7,7, del VSV \geq 6,5 y del AAV \geq 3,0, mientras que la recuperación del factor de coagulación fue generalmente del 79-105% y el rendimiento del fibrinógeno fue del 107 al 113% cuando había inactivadores presentes. Estos valores son un 30-50% mejores que cuando no se añadieron los inactivadores. De nuevo, en estas condiciones, la destrucción del virus no se vio afectada.

TABLA VII

	+	Destrucción del virus	Recuperación de fibrinógeno y del factor de
	inactivador	(log_{10})	coagulación (%)
Dosis	(ascorbato,
de UV	quercetina o	EMC	AAV	VSV	FV	FVII	FVIII	FIX	FXI	FRN
	rutina)
0	-	0	0	0	100	100	100	100	100	100
0	+	0	0	0	100	103	100	93,9	112,5	106-114
0,083	-	\geq 7,7	\geq 3,0	\geq 6,5	54	46-54	58	40	70	76
0,083	+	\geq 7,7	\geq 3,0	\geq 6,5	83-93	70-87	83-100	79-94	86-105	107-113

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Ejemplo 15 Tratamiento combinado del concentrado de FAH con UV y DD

El concentrado de factor VIII tratado con disolvente-detergente, rehidratado en 10,0 ml de agua por vial se estimuló con virus de la polio de tipo 2, que es un pequeño virus marcador sin cubierta lipídica. El tratamiento con UV a 0,083 J/cm^{2} dio como resultado una inactivación \geq 5,0 log_{10}. El rendimiento del FVIII fue del 81-94%. Los correspondientes valores en ausencia de inactivador fueron un 30-40% menores. En otro ejemplo en el que se trató el concentrado de FAH estimulado con VHA (Virus de la Hepatitis A), la destrucción del VHA fue \geq 4 logs, mientras que la recuperación del FVIII fue similar a la anterior. Los resultados se resumen en la Tabla VIII.

TABLA VIII

Dosis de UV	+ inactivador y concentración	Destrucción del virus	Recuperación	Destrucción del
(J/cm^{2})	del inactivador	de la polio (log_{10})	del FVIII (%)	VHA (log_{10})
0	- inactivadores	0	100	0
0	+ inactivadores	0	100	0
0,083	+ ascorbato 0,75 mM	\geq 5,6	80,8	\geq 4,4
	+ quercetina 0,2 mM
0,083	+ ascorbato 0,75 mM	\geq 5,3	93,9	\geq 4,4
	+ rutina 0,5 mM

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Ejemplo 16 Tratamiento del plasma con UVC en presencia de inactivadores variados

Se trató el plasma con UV a entre 0,064 y 0,09 J/cm^{2} en presencia de varios inactivadores. La tabla IX muestra la recuperación de varios factores y de fibrinógeno en las condiciones de tratamiento. Basándonos en lo anterior, la retención de los factores de coagulación y de la actividad del fibrinógeno es mejor cuando el tratamiento UV se produce en presencia de flavonoides, con o sin ascorbato o histidina añadidos. Es significativo mencionar que la presencia de estos inactivadores no alteró la destrucción de ninguno de los virus marcadores probados.

TABLA IX

Destrucción del virus (log_{10})	Recuperación del factor de coagulación (%)
Inactivador	M13	EMC	VSV	FV	FVII	FVIII	FIX	FXI	FBN
Flavonoides
Ninguno	5,5	\geq 7,7	\geq 6,5	59	67	54	50	49	75
Quercetina	5,0	\geq 7,7	\geq 6,5	75	97	70	46	50	82
Rutina	-	\geq 7,7	\geq 5,4	75	104	86	63	63	96
Mezclas de flavonoides
Quercetina	-	\geq 7,7	\geq 6,5	72	100	93	97	107	91
+ ascorbato
Crisina +	-	\geq 6,5	\geq 6,5	92	101	86	100	113	96
ascorbato
Quercetina	-	\geq 6,0	\geq 6,5	-	-	105	136	-	-
+ histidina
Inactivadores de Tipo I o de Tipo II solos
Ascorbato	4,7	\geq 7,7	\geq 6,5	67	97	73	54	52	86
Histidina	4,0	-	-	-	-	79	69	-	-
Glutatión	4,4	-	-	-	-	78	68	-	-
Triptófano	4,0	-	-	-	-	79	69	-	-
Manitol	6,6	-	-	-	-	60	58	-	-
Glicerol	6,6	-	-	-	-	49	51	-	-
Superóxido	3,9	-	-	-	-	84	82	-	-
dismutasa
SCNAT	1,6	-	-	-	-	75	81	-	-

Ejemplo 17 Recuperación del FVIII en plasma tratado con UV con concentraciones variables de inactivadores (ascorbato y quercetina)

El plasma tratado con disolvente-detergente se trató con UV a 0,0865 J/cm^{2} en presencia de varias concentraciones de quercetina (desde 0 hasta 1,75 mM) manteniendo la concentración final de ascorbato en el plasma constante, a 0,50 mM. Inversamente, la concentración final de quercetina se mantuvo constante a 0,20 mM añadiendo varias concentraciones de ascorbato (desde 0 hasta 1,50 mM). El objetivo era determinar los mejores -óptimos- niveles de cada uno de estos compuestos. Los resultados, que se muestran en las Figuras 8a y 8b, indican que cada uno de estos estabilizantes es autolimitante. La quercetina tuvo un máximo a 0,20 mM. El ascorbato tiene un máximo más amplio, a entre 0,75 y 1,25 mM.

Ejemplo 18 Cinética de destrucción del virus (M13) en plasma y en derivados plasmáticos (FAH tratado con disolvente-detergente) a varias dosis de UV (254 nM)

Se sembraron independientemente plasma fresco congelado y FAH tratado con disolvente-detergente con el fago M13, y después se trataron a varias dosis de UV, [desde 0 hasta 0,6 J/cm^{2}] en presencia de inactivadores (ascorbato 0,75 mM y quercetina 0,2 mM). La tasa de flujo se varió con cada dosis de UV. Los resultados, mostrados en las figuras 9a [concentrado de FAH tratado) y 9b [FFP tratado], indican que el tratamiento a entre 0,04 y 0,13 J/cm^{2} con el que se consiguió al menos una inactivación del fago M13 de 5 log_{10}, la recuperación del factor VIII era mejor del 80%.

Ejemplo 19 Tratamiento de un concentrado de glóbulos rojos con radiación X y un sensibilizante bromado

Se trató un concentrado de glóbulos rojos con radiación X en presencia de un derivado bromado de hematoporfirina. La presencia de rutina 1 mM redujo la hemólisis de los glóbulos rojos desde el 8% hasta menos del 2%. La destrucción del virus, medida con el M13, superó el 5 log_{10} en cada caso.

Ejemplo 20 Tratamiento de plasma con radiación gamma

Se trató plasma fresco congelado con 40 kGy de radiación gamma. La recuperación del factor IX de coagulación fue del 77% en ausencia de rutina y del 90% en presencia de rutina 2 mM. La destrucción del VSV superó el 5 log_{10} en cada caso.

Ejemplo 21 Fotoinactivación de virus aumentada por inactivadores

Los siguientes son ejemplos adicionales que apoyan la conclusión de que la especificidad de destrucción de virus en componentes celulares y disoluciones proteicas mediante procedimientos fotoactivos puede aumentarse bien con una mezcla de inactivadores de tipo I y de tipo II o bien con un inactivador bifuncional.

\vskip1.000000\baselineskip

100

\newpage

Dado lo que sabemos, la destrucción de virus se infiere como sigue:

Destrucción proyectada de virus en un tratamiento combinado con d/d-uv

	Destrucción de virus (log_{10})
	EMC	Sindbis	VSV	AAV	VHA	Polio
D/D	0	\geq 8,8	\geq 9,2	0	0	0
UV	\geq 7,7	\geq 8,7	\geq 6,5	\geq 3,0	\geq 4,4	\geq 5,6
Combinado	\geq 7,7	\geq 17,5	\geq 15,7	\geq 3,0	\geq 4,4	\geq 5,6

\vskip1.000000\baselineskip

Los datos dados del tratamiento (UV) se obtuvieron en presencia de ascorbato 0,75 mM y quercetina 0,20 mM, y una fluencia de 0,086 J/cm^{2}.

La recuperación del factor de coagulación fue del 80-90%.

Ejemplo 22 Inactivación de linfocitos y conservación de la integridad de los glóbulos rojos y de las plaquetas 1. Radiación gamma

a) radiación \gamma de concentrados de glóbulos rojos: se tratan concentrados de glóbulos rojos con radiación \gamma a unas dosis de 15, 25 ó 50 Gy (1 Gy = 1 Gray = 100 Rads) usando una fuente de cobalto-60 en presencia o ausencia de rutina 0,5, 1 ó 2 mM. La inactivación de los linfocitos se determina mediante medidas de la captación de ^{3}H-timidina tras una estimulación con mitógeno (concentración final de PHA del 2%). Se mide el potasio extracelular (plasmático) tras 7 días de almacenamiento a 4ºC, y se compara con los controles sin radiar.

Los linfocitos radiados conservaron sólo el 1,5% de su captación de ^{3}H-timidina tras una exposición a 15 Gy, y nada tras 50 Gy, y esto era independiente de la presencia o de la concentración del inactivador (rutina). El potasio extracelular aumentó con una dosis de radiación creciente y disminuyó hasta los niveles de control por la presencia de rutina 2 mM. Con 50 Gy de radiación \gamma, los linfocitos se inactivaron completamente y el K+ plasmático era de 80 mM en ausencia de inactivadores, y de 40 mM cuando había presente rutina 2 mM durante el tratamiento. Por lo tanto, los inactivadores pueden usarse para aumentar la especificidad de la radiación gamma sobre los concentrados de glóbulos rojos para la inactivación de los linfocitos.

b) muestras de glóbulos rojos tratadas en primer lugar con AlPcS_{4} y luz, y después con radiación \gamma en presencia de flavonoides: tras el tratamiento de un concentrado de glóbulos rojos (diluido con un volumen igual de PBS) con AlPcS_{4} 6,5 \muM con 44 J/cm^{2} de luz visible en presencia de GSH 4 mM, las muestras se radian con rayos \gamma de 25 Gy en presencia o ausencia de rutina 1 mM o 2 mM. Se mide el potasio plasmático después de 2 y 7 días de almacenamiento tras el tratamiento y se compara con los controles sin tratar y los glóbulos rojos tratados sólo con AlPcS_{4}. (Además, para examinar el efecto de la adición de rutina sobre la pérdida de K+ durante el almacenamiento tras el tratamiento con AlPcS_{4}, se almacenó una muestra tratada con AlPcS_{4} que no había sido radiada con radiación gamma en presencia de rutina 2 mM). La inactivación de los linfocitos y la pérdida de K+ se midieron como en a) anterior-
mente.

La adición de radiación \gamma al tratamiento con AlPcS_{4} aumentó el daño a los glóbulos rojos (el K+ plasmático a los 2 días era de 75 mM con, y de 60 mM sin radiación \gamma) salvo que el flavonoide rutina estuviera presente durante la radiación \gamma y el almacenamiento (25 mM a los 2 días, a 40 mM a los 7 días). Además, cuando el almacenamiento tras el tratamiento es en presencia de rutina 2 mM, los glóbulos rojos muestran una menor pérdida de potasio tras el tratamiento con AlPcS_{4} con o sin radiación \gamma adicional.

c) concentrados de plaquetas: los concentrados de plaquetas se tratan con radiación \gamma a dosis de 15, 25 ó 50 Gy usando una fuente de cobalto-60 en presencia o ausencia de rutina 1 ó 2 mM. La inactivación de los linfocitos se determina mediante la captación de ^{3}H-timidina tras una estimulación con mitógeno, como en 1a) anteriormente. La integridad de las plaquetas se determinó mediante la respuesta de agregación (tasa inicial comparada con el control sin tratar) ante ácido araquidónico 40 \muM y 10 \mug/ml de ADP en los días 1 y 3 tras el almacenamiento.

Como para los concentrados de glóbulos rojos, los linfocitos radiados de los concentrados de plaquetas retuvieron sólo el 1,5% de su captación de ^{3}H-timidina tras una exposición a 15 Gy, y ninguna tras 50 Gy, y esto era independiente de la presencia o de la concentración de rutina. La agregación plaquetar, que disminuyó con una dosis creciente de radiación (un 90% con 15, un 80% con 25 y un 70% del control con 50 Gy después de 1 día), volvió hasta cerca de los niveles de control (95%) mediante la presencia de rutina 2 mM. Con 50 Gy de radiación \gamma los linfocitos eran completamente inactivados, y la tasa de agregación después de 3 días de almacenamiento era del 50% del control en ausencia de inactivadores, y de 80% del control cuando había presente rutina 2 mM durante el tratamiento. Por lo tanto, los inactivadores pueden usarse para aumentar la especificidad de la radiación \gamma de concentrados de plaquetas para la inactivación de linfocitos.

2. Radiación UVB de concentrados de plaquetas

Se radiaron concentrados de plaquetas caninas con 36 mJ/cm^{2} de UVB (una dosis de la que se sabe que evita la aloinmunización por HLA; Slichter y col., 1987, Blood, 69: 414-418) en presencia o ausencia de rutina 2 mM. Las plaquetas tratadas se radiomarcaron (^{51}cromo) y se infundieron. La supervivencia de las plaquetas del donante expuestas a UV se redujo a 2,5 días cuando el tratamiento era en ausencia de rutina, pero la supervivencia era la misma que la de las plaquetas caninas autólogas sin tratar (5 días) cuando la radiación era en presencia de rutina.

Claims

1. Un procedimiento para inactivar un virus extracelular o intracelular con cubierta o sin cubierta que puede estar presente en una composición biológica, comprendiendo dicha composición biológica al menos una de entre una composición biológica con células y una composición de un fluido biológico, comprendiendo dicho procedimiento someter dicha composición biológica a una cantidad viricidamente eficaz de (i) radiación con rayos UV o gamma, o (ii) radiación con rayos UV, con rayos gamma, con rayos X o con luz visible y un sensibilizante en presencia de (a) una mezcla de al menos un compuesto inactivador que inactive las reacciones fotodinámicas de tipo I y al menos un compuesto inactivador que inactive las reacciones fotodinámicas de tipo II, o (b) un compuesto inactivador que inactive ambas reacciones de tipo I y de tipo II, o (c), una mezcla de un compuesto inactivador que inactive ambas reacciones de tipo I y de tipo II y un compuesto inactivador adicional, en la que dicho compuesto inactivador que inactiva ambas reacciones de tipo I y de tipo II de (b) y de (c) está presente a una concentración de al menos 0,2 mM, con la que se obtiene una conservación de la funcionalidad y la estructura de las células intactas mayor del 70% para las composiciones que contienen células, y se obtiene una conservación de la actividad biológica mayor del 75% para los fluidos biológicos.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha composición biológica es expuesta a una cantidad viricidamente eficaz de radiación en presencia de una mezcla de al menos un compuesto inactivador que inactiva las reacciones fotodinámicas de tipo I y al menos un compuesto inactivador que inactiva las reacciones fotodinámicas de tipo II.

3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho compuesto inactivador que inactiva las reacciones fotodinámicas de tipo I es al menos uno de manitol, glicerol, glutatión y superóxido dismutasa, y dicho compuesto inactivador que inactiva las reacciones fotodinámicas de tipo II es al menos uno de fosfato de \alpha-tocoferol, triptófano e histidina.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha composición biológica es expuesta a una cantidad viricidamente eficaz de radiación en presencia de un compuesto inactivador que inactiva ambos tipos de reacciones de tipo I y de tipo II.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho compuesto inactivador que inactiva ambos tipos de reacciones de tipo I y de tipo II es un flavonoide.

6. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho compuesto inactivador está presente a una concentración de entre 0,2 y 5 mM.

7. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho flavonoide se selecciona del grupo formado por quercetina, crisina, catequina, rutina, hesperidina y naringina.

8. El procedimiento según la reivindicación 4, que comprende además un compuesto inactivador adicional.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho inactivador adicional es un aminoácido seleccionado del grupo formado por triptófano e histidina.

10. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho inactivador adicional es una vitamina seleccionada del grupo formado por ascorbato y fosfato de \alpha-tocoferol.

11. El procedimiento según las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha composición biológica contiene glóbulos rojos.

12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha composición biológica contiene \geq 1 x 10^{9} células/ml.

13. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha composición biológica se selecciona del grupo formado por sangre completa y concentrados de glóbulos rojos.

14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha composición biológica contiene plaquetas.

15. El procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicha composición biológica contiene \geq 1 x 10^{9}células/
ml.

16. El procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicha composición biológica es un concentrado de plaquetas.

17. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha composición biológica contiene al menos un factor de coagulación.

18. El procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicha composición biológica está desprovista de células.

19. El procedimiento según la reivindicación 18, en el que dicha composición biológica desprovista de células es plasma humano.

20. El procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicho factor de coagulación se selecciona del grupo formado por los factores V, VII, VIII, IX y XI, y fibrinógeno.

21. El procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicho factor de coagulación es el factor VIII.

22. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que dicha composición biológica se somete a radiación y a dicho(s) compuesto(s) inactivador(es) en presencia de un sensibilizante de radiación.

23. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicho sensibilizante de radiación es un psoraleno.

24. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicha radiación es UVA.

25. El procedimiento según la reivindicación 23, en el que dicho psoraleno es 4'-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno.

26. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicho sensibilizante de radiación es una hematoporfirina bromada.

27. El procedimiento según las reivindicaciones 1 a 26, en el que antes, después o al mismo tiempo que se somete dicha composición biológica a dicha radiación y a dicho(s) compuesto(s) inactivador(es), dicha composición biológica se somete a al menos un procedimiento viricida diferente.

28. El procedimiento según la reivindicación 27, en el que dicho procedimiento viricida diferente se selecciona del grupo formado por un tratamiento térmico, una manipulación del pH, un tratamiento con disolvente y/o detergente, un tratamiento con radiación gamma y un tratamiento con formaldehído.

29. El procedimiento según la reivindicación 27, en el que dicho procedimiento viricida diferente es al menos uno de entre un tratamiento con disolvente y detergente.

30. El procedimiento según la reivindicación 29, en el que dicho al menos uno de entre un tratamiento con disolvente y detergente consiste en el tratamiento con fosfato de tri(n-butilo) y Triton X-100.

31. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, en el que dicha composición biológica contiene un virus extracelular o intracelular seleccionado del grupo formado por el virus de la estomatitis vesicular, el virus de la encefalomiocarditis, los virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis A, el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis no A, no B, los virus adenoasociados, el virus de la polio y de M13.

32. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, en el que dicha radiación es UV, radiación gamma, rayos X o luz visible.

33. El procedimiento según la reivindicación 32, en el que dicha radiación es UVA, UVB o UVC.