ES2242191T3 - Vacuna contra una infeccion por estreptococos del grupo a. - Google Patents
Vacuna contra una infeccion por estreptococos del grupo a.Info
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Abstract
SE PROPORCIONAN METODOS Y COMPOSICIONES PARA IDENTIFICAR UN ESTREPTOCOCO DEL GRUPO A EN CUALQUIERA DE UNA VARIEDAD DE MUESTRAS FISIOLOGICAS, COMO SANGRE, SALIVA, ESPUTOS, FLUIDO CEREBROESPINAL, MATERIAL DE LAVADO BRONQUIAL, Y MATERIAL DE BIOPSIA. LAS COMPOSICIONES UTILIZADAS INCLUYEN UNA PROTEASA DE CISTEINA EXTRACELULAR O UN FRAGMENTO DE LA MISMA, OBTENIBLE DE S. PYOGENES Y QUE CONTIENE AL MENOS UN EPITOPE CONSERVADO, O ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA LA PROTEASA DE CISTEINA O FRAGMENTO DE LA MISMA. LAS COMPOSICIONES TAMBIEN ENCUENTRAN USO EN LA PRODUCCION DE UNA RESPUESTA INMUNE PROTECTORA FRENTE A UNA INFECCION POR ESTREPTOCOCO DEL GRUPO A.
Description
Vacuna contra una infección por estreptococos del
Grupo A.
La presente invención se refiere de manera
general a los campos de la bacteriología molecular y de las
enfermedades infecciosas. Más específicamente, la presente invención
se refiere a vacunas para proteger frente a la infección por
estreptococos del Grupo A, a proteínas exotoxinas B estreptocócicas
(SPEB) no proteolíticas y a la utilización de tales proteínas para
la producción de vacunas.
Streptococcus pyogenes es una bacteria
Gram positiva que es el agente etiológico de varias enfermedades en
humanos, incluyendo faringitis y/o amigdalitis, infecciones cutáneas
(impétigo, erisipelas y otras formas de piodermas), fiebre reumática
aguda (ARF), escarlatina (SF), glomerulonefritis
post-estreptocócica (PSGN) y un síndrome similar al
choque tóxico (TSLS). Globalmente, la ARF es la causa más común de
las enfermedades cardíacas pediátricas. Por ejemplo, se estima que
en la India más de seis millones de niños en edad escolar padecen
enfermedad cardíaca reumática. En los Estados Unidos, el "dolor de
garganta" es la tercera razón más habitual de las visitas a las
consultas del médico y se recupera S. pyogenes del 30%
aproximadamente de los niños con este padecimiento. Hay alrededor de
25-35 millones de casos de faringitis estreptocócica
por año en los Estados Unidos, responsables de 1-2
billones de dólares por año aproximadamente en costes de asistencia
sanitaria.
En los años recientes, ha tenido lugar por
razones desconocidas un incremento intercontinental de la frecuencia
y la gravedad de las enfermedades estreptocócicas, aunque han sido
implicadas dos moléculas variantes de la exotoxina A pirogénica
(SPEA). Los residuos de aminoácidos que caracterizan a las moléculas
de SPEA mutantes están localizados en un área de la toxina que,
sobre la base de la estructura cristalina tridimensional
recientemente publicada de la enterotoxina B de Staphylococcus
aureus relacionada, forma la hendidura de unión al receptor de
células
T.
T.
S. pyogenes sintetiza un zimógeno
extracelular de 371 aminoácidos (40.314 kDa) que puede ser
transformado en una proteasa enzimáticamente activa de 253
aminoácidos (27.588 kDa) por conversión autocatalítica. El zimógeno
contiene uno o más epítopos no asociados con el enzima truncado. El
zimógeno y la proteasa activa contienen ambos una única media
cisteína por molécula que es susceptible a los antagonistas del
sulfhidrilo. En cultivos en caldo, el precursor inactivo se acumula
extracelularmente durante la multiplicación bacteriana y alcanza una
concentración máxima al final del crecimiento logarítmico. Algunas
cepas producen hasta 150 mg/litro de zimógeno, y la molécula es una
proteína extracelular fundamental. Por tanto, la proteasa de
cisteína estreptocócica se asemeja a muchos factores de virulencia
como son las proteasas extracelulares secretadas por las bacterias
en cuanto a que tiene un péptido señal específico y una prosecuencia
que es eliminada de manera autocatalítica para generar un enzima
totalmente
activo.
activo.
La gran morbilidad y mortalidad continuas
causadas por S. pyogenes en las naciones en desarrollo, la
carga financiera significativa para la asistencia sanitaria
atribuible a los estreptococos del grupo A en los Estados Unidos y
los niveles crecientes de resistencia a los antibióticos en este
patógeno, ponen de relieve la necesidad de un conocimiento más
completo de la de la patogénesis molecular de la infección
estreptocócica. Además, el reciente incremento de estas enfermedades
resalta la falta de una vacuna eficaz, a pesar de la inclusión
repetida de S. pyogenes en las listas de patógenos humanos
importantes para los que se necesitan vacunas.
Se cree que la protección contra la infección
estreptocócica sistémica es debida predominantemente a una IgG
anti-proteína M opsónica específica de tipo. Como
consecuencia, se ha llevado a cabo una investigación sobre
inmunoprofilaxis casi exclusivamente en el contexto de formular una
vacuna de proteína M. Sin embargo, dos problemas teóricos y
prácticos muy importantes han dificultado este esfoque. En primer
lugar, se han descrito más de 100 tipos de proteína M distintos
sobre la base de estudios serológicos y de secuenciación génica. La
aparición de esta extensa serie de variantes serotípicas indica que
una vacuna de proteína M eficaz debe ser heterogénea en composición
o bien que deben utilizarse elementos de la proteína M protectores
conservados. La formulación de una vacuna altamente polivalente ha
generado poco entusiasmo y tiene que identificarse todavía un
fragmento de proteína M pan-protector conservado.
Un segundo problema que ha asolado a la investigación de vacunas de
proteína M es la observación de que las proteínas M contienen
epítopos que reaccionan de manera cruzada con el tejido cardíaco y
otros tejidos humanos. Este hecho, junto con los supuestos aspectos
autoinmunes de varias enfermedades estreptocócicas, ha dificultado
también el desarrollo de vacunas de proteína M. La detección de
infecciones estreptocócicas del Grupo A ha estado impedida por el
hecho de que los ensayos actualmente disponibles se han basado en la
detección del antígeno proteína M estreptocócica del Grupo A. Sería
por tanto de interés el desarrollar una vacuna eficaz para la
prevención profiláctica inmune de la infección por estreptococos del
Grupo A basada en una proteína distinta de la proteína M y un método
eficaz para inmunizar a un ser humano frente a las infecciones por
estreptococos del Grupo A. La proteasa extracelular, y los
anticuerpos generados contra la misma, pueden proporcionar la base
para ensayos de selección. De igual modo, pueden utilizarse ensayos
basados en PCR para la detección de secuencias de ácido nucleico que
codifiquen la proteasa extracelular. Es por tanto de interés
identificar epítopos conservados, particularmente epítopos
inmunodominantes conservados en la molécula de proteasa de cisteína,
para el desarrollo
de composiciones y métodos que puedan ser utilizados para someter a selección organismos estreptocócicos del Grupo A.
de composiciones y métodos que puedan ser utilizados para someter a selección organismos estreptocócicos del Grupo A.
Se ha descrito que anticuerpos hacia moléculas
distintas de las proteínas M proporcionan protección contra la
infección por S. pyogenes según se revela en las referencias
siguientes. Chappell y Stuart (Vaccine (1993)
11:643-8) encontraron que la inoculación
intraperitoneal de cultivos bacterianos lavados de un aislado
M-negativo protegían a ratones frente al desafío
letal con cepas de S. pyogenes que expresaban las moléculas
de superficie M3, M18 o la molécula de superficie de tipo 28. La
inmunidad no específica de un tipo fue atribuida a la presencia de
anticuerpos contra tres proteínas de M_{r} 32, 43 y 46 kDa.
Stjernquist-Desatnik y col. (Vaccine (1990)
8:150-2) mostraron que la vacunación
intranasal con aislados destruidos por calor de cepas
M-negativas de S. pyogenes protegía contra el
desafío intranasal con un aislado que expresaba el serotipo M50.
Rotta y col. (J. Exp. Med. (1965)
122:877-90) demostraron una inmunidad
protectora heteróloga en ratones inmunizados por vía intraperitoneal
con preparaciones de la pared celular estreptocócica o con material
enriquecido en peptidoglicano, un componente de la pared celular de
los estreptococos del Grupo A.
O'Connor y colaboradores (J. Infect. Dis.
(1991) 163:109-16) han sugerido que
anticuerpos neutralizantes dirigidos contra el enzima de la
superficie de las células estreptocócicas, peptidasa C5a, podrían
proporcionar protección frente a la colonización estreptocócica,
pero no han analizado directamente esta hipótesis. Un estudio
reciente de Dale y col. (J. Infect. Dis. (1994)
169:319-23) sugería que organismos
pretratados con anticuerpos hacia la molécula de superficie de
estreptococos del Grupo A, ácido lipoteicoico (LTA), están atenuados
significativamente en un modelo de infección en ratón. Sin embargo,
debido a la falta de la inclusión de un anticuerpo control no
específico en ese estudio, no es posible determinar si el efecto
protector de los anticuerpos era debido a una interacción con LTA, o
era debido simplemente a la unión no específica de la
inmunoglobulina a la superficie bacteriana.
Sobrenadantes del cultivo de S. pyogenes
contienen una proteasa que tiene actividad fibrinolítica (Elliot
(1945) J. Exp. Med. 81:573-92). El
enzima fue purificado, mostrándose que era una proteasa de cisteína
(Liu y col. (1963) 238:251-6) y encontrándose
que era idéntico a, o que era una variante alélica de, la exotoxina
B pirogénica de estreptococos (SPEB) (Gerlach y col. (1983) Zbl.
Batk. Hyg. 255:221-3; Hauser y Schlievert (1990)
J. Bacteriol. 172:4536-42).
Se proporcionan vacunas para proteger frente a la
infección por estreptococos del Grupo A. Las vacunas inhiben la
replicación del Streptococcus y de este modo impiden o
disminuyen los efectos clínicos adversos causados por las
infecciones estreptocócicas. Las vacunas incluyen una exotoxina B
pirogénica de estreptococos (SPEB) no proteolítica purificada que
confiere inmunidad a un mamífero frente a la infección por
estreptococos del Grupo A, en la que la SPEB contiene al menos una
sustitución de aminoácidos en Cys-192 o
His-340. La vacuna puede contener además un antígeno
proteína M estreptocócica. La invención proporciona también una
proteína exotoxina B pirogénica estreptocócica (SPEB) no
proteolítica purificada que contiene al menos una sustitución de
aminoácidos en Cys-192 o His-340. La
invención proporciona además la utilización de una proteína
exotoxina B pirogénica estreptocócica (SPEB) no proteolítica
purificada que contiene al menos una sustitución de aminoácidos en
Cys-192 o His-340, para la
fabricación de una vacuna para conferir inmunidad a un mamífero
frente a la infección por estreptococos del Grupo A.
Las figuras no están necesariamente a escala.
Ciertas características de la invención pueden estar exageradas en
escala o ser mostradas en forma esquemática por razones de claridad
y concisión.
La Figura 1 muestra los resultados de la
purificación de la proteasa de cisteína estreptocócica. La proteasa
de cisteína estreptocócica fue purificada de la cepa MGAS 1719
utilizando el método descrito en el Ejemplo 2 y resuelta mediante
electroforesis en gel de dodedil sulfato de
sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE).
Calle 1: 2 \mug de la proteasa purificada; Calle 2: estándares de
peso molecular.
La Figura 2 muestra los resultados del corte del
precursor de la interleuquina-1\beta
(IL-1\beta) humana por la proteasa de cisteína
estreptocócica. La Figura 2A muestra la pIL-1\beta
marcada con [^{35}S]metionina (Calle 1) sintetizada en un
sistema de lisado de reticulocitos de conejo e incubada con 250 ng
de proteasa de cisteína purificada (Calle 2), o de proteasa de
cisteína llevada a ebullición (Calle 3) durante 1 hora. Un mutante
Asp-116 \rightarrow Ala-116 de
pIL-1\beta humana fue también cortado por la
proteasa de cisteína (Calle 4). La Figura 2B muestra el análisis de
inmunotransferencia Western de los productos de corte de la
pIL-1\beta madura y recombinante. Calle 1:
mIL-1\beta sola; Calle 2:
mIL-1\beta más la proteasa de cisteína; Calle 3:
pIL-1\beta sola; Calle 4:
pIL-1\beta más la proteasa de cisteína. Las
incubaciones se llevaron a cabo durante 30 minutos a 37ºC. Los
productos de corte fueron resueltos por SDS-PAGE,
transferidos a nitrocelulosa y sondados con la proteasa de cisteína
carboxiterminal; Calle 3: pIL-1\beta sola; Calle
4: pIL-1\beta más el anticuerpo monoclonal
específico (específico para IL-1\beta). El
producto de \sim 18,5 kDa fue convertido en la forma de menor peso
molecular después de una incubación adicional. Las proteínas
inmunorreactivas mayores y menores de \sim 33 kDa de la Calle 3
son producidas en el proceso de fermentación utilizado para producir
pIL-1\beta.
La Figura 3 muestra los resultados de la
estimulación de la actividad de la sintasa del óxido nítrico (NO)
por la proteasa de cisteína y pIL-1\beta en
células de músculo liso de aorta de rata. Las células fueron
tratadas durante 24 horas con medio sin suero (SFM) (1),
pIL-1\beta madura (3 ng/ml) (2), proteasa de
cisteína (4 mg/ml) (3), pIL-1\beta
(\sim 200 ng/ml) (4), o con proteasa de cisteína más pIL-1\beta (5). La concentración de nitrito en las muestras de medio condicionado procedente de las células tratadas fue determinada por comparación con una curva estándar de nitrito de sodio.
(\sim 200 ng/ml) (4), o con proteasa de cisteína más pIL-1\beta (5). La concentración de nitrito en las muestras de medio condicionado procedente de las células tratadas fue determinada por comparación con una curva estándar de nitrito de sodio.
La Figura 4 muestra los resultados del corte de
pIL-1\beta por variantes alélicas de la proteasa
de cisteína estreptocócica. Un lisado de reticulocitos de conejo que
contenía pIL-1\beta marcada con
[^{35}S]metionina (Calle 1) fue incubado con proteasa de
cisteína purificada de la cepa MGAS 279 (Calle 2) o MGAS 289 (Calle
3) según se describió para la Figura 2A.
La Figura 5 muestra los resultados del corte de
proteínas purificadas de la matriz extracelular (ECM).
La Figura 6 muestra la inducción de efecto
citopático y del corte de fibronectina en cultivos de células
endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC).
La Figura 7 muestra la producción de SPEB por
cepas de S. pyogenes.
La Figura 8 muestra los sitios de procesamiento,
la localización de las variaciones de aminoácidos encontradas en las
proteínas producidas por los alelos speB2 y speB4 y
los aminoácidos que son diana para una mutación.
La Figura 9 muestra la producción de mutaciones
aleatorias en speB.
La Figura 10 muestra alelos de speB. Se
muestran los sitios polimórficos dentro de la región no codificadora
corriente arriba de 160 pb y de la región codificadora de 1197 pb
del gen speB. La secuencia descrita por Hauser y Schlievert
(J. Bacteriol. (1990) 172:4536-42) fue
denominada arbitrariamente SpeB1, y la numeración de los nucleótidos
y codones es afín a esa secuencia. Se muestran solamente aquellos
nucleótidos de los otros alelos que difieren de la secuencia de
speB1. La posición de cada sitio de los nucleótidos
polimórficos está mostrada sobre los 39 alelos y está numerada en
formato vertical. Los cambios de nucleótidos no sinónimos están
subrayados y las posiciones de los cambios de codificación están
representadas por un asterisco encima de los sitios polimórficos de
la región codificadora. Los siete sitios de nucleótidos polimórficos
en la región codificadora corriente arriba están mostrados a la
izquierda de la figura, y el asterisco en speB6 indica una
deleción de un residuo de adenina. El codón (numerado en formato
vertical) que contiene los sitios de nucleótidos polimórficos está
mostrado debajo de los 39 alelos. Los datos de la secuencia de ADN
de speB2-speB39 están disponibles en EML/GenBank/DDBJ
bajo los números de acceso L26125-L26162. Los datos
de la secuencia de ADN de speB1 fueron publicados en Hauser y
Schlievert, J. Bacteriol. (1990)
172:4536-42.
La Figura 11 muestra los resultados de la
inmunización activa de ratones con la proteasa de cisteína
estreptocócica que protege frente al desafío letal con S.
pyogenes heterólogo. Los datos muestran que la inmunización
intraperitoneal con proteasa de cisteína estreptocócica purificada
conferían una protección significativa (análisis de rangos
logarítmicos X^{2}; P<0,01) frente al desafío letal con el
aislado MGAS 315 altamente virulento de S. pyogenes.
Un mamífero puede ser inmunizado contra la
infección por estreptococos del Grupo A mediante la administración
al mamífero de una vacuna de la invención en una cantidad suficiente
para conferir inmunidad frente a la infección por estreptococos del
Grupo A. Los métodos de inmunización inhibirán la replicación de las
especies de Streptococcus en el mamífero y disminuirán los
síntomas que están asociados con la enfermedad. La vacuna puede ser
adaptada para que confiera inmunidad frente a faringitis,
amigdalitis, infecciones cutáneas, fiebre reumática aguda,
escarlatina, glomerulonefritis post-estreptocócica,
sepsis y síndrome similar al choque tóxico.
La vacuna puede ser adaptada para ser
administrada mediante administración parenteral. En particular, la
vacuna puede ser adaptada para administración subcutánea o
intramuscular, o para ser administrada oralmente. La vacuna puede
ser adaptada para ser administrada en múltiples dosis y puede ser
adaptada además para ser administrada a un humano.
Una vacuna basada en el producto del gen
speB ofrece varias ventajas sobre las que están basadas en la
proteína M. Por ejemplo, se sabe que los anticuerpos hacia las
proteínas M reaccionan de manera cruzada con varios tejidos del
huésped, y preocupa considerablemente que una vacuna basada en la
proteína M pueda provocar una enfermedad autoinmune humana debido al
hecho de que comparten epítopos. Los más de 100 tipos de proteína M
identificados inducen una inmunidad predominantemente específica de
un tipo. De este modo, una vacuna eficaz basada en la proteína M
necesitaría ser altamente polivalente o estar dirigida contra
epítopos de la proteína M pan-protectores
conservados todavía no identificados. La vacuna de la presente
invención no es específica de un tipo y por tanto es útil en la
prevención de cualquier infección por estreptococos del Grupo A. No
se conoce que los anticuerpos hacia la proteasa de cisteína o su
zimógeno reaccionen de manera cruzada con los tejidos del
hués-
ped.
ped.
Streptococcus pyogenes es un coco gram
positivo que es \beta-hemolítico, expresa un
antígeno del Grupo A y es susceptible a bacitracina. Para esta
descripción, se considera que un microorganismo es igual o
equivalente a Streptococcus pyogenes si en su genoma hay una
secuencia codificadora de una proteasa extracelular que está
implicada en la patogénesis del microorganismo. Con el fin de
acomodar las variaciones cepa a cepa entre los diferentes aislados,
pueden realizarse ajustes para sustituciones conservadoras y
selección entre las alternativas en las que están implicadas
sustituciones no conservadoras.
La proteína codificada por el gen speB
codifica un zimógeno y una proteasa de cisteína extracelular que
corta el precursor de la interleuquina 1\beta humana para formar
IL-1\beta biológicamente activa, una citoquina
muy importante que media la inflamación y el shock. La proteasa
purificada corta la fibronectina y degrada rápidamente la
vitronectina. La proteína no tiene actividad sustancial contra la
laminina. La proteasa de cisteína corta también la fibronectina
procedente de células endoteliales de la vena umbilical humana
cultivadas in vitro. Otros organismos que producen proteasas
extracelulares que están implicadas en la patogénesis del organismo
huésped pueden ser utilizadas también como fuente del enzima o de
fragmentos del mismo, y como fuente de material genético para ser
utilizado en la presente invención.
Varias bacterias patógenas humanas expresan
proteasas extracelulares capaces de degradar proteínas de la ECM.
Entre estos organismos están Pseudomonas aeruginosa,
(Morihara Kamp Homma, En: Holder, I.A., ed., Bacterial enzymes and
virulence, FL CRC Press, 1985; 41-75) y
Porphyromonas (Bacteriodes) gingivalis, (Lantz y col., J.
Bacteriol. 1991, 173:495-504; y Otogoto y
Kuramitsu, Infect. Immun. 1993;
61:117-23), dos especies bacterianas que
producen la destrucción de tejidos del huésped por degradación del
colágeno y de la fibronectina, respectivamente. Es también
destacable que Trypanosoma cruzi, el flagelado parásito que
origina la tripanosomiasis americana (Enfermedad de Chagas), expresa
una proteasa de cisteína en la superficie celular que es un antígeno
fundamental en humanos (Gazzinelli y col., Infect. Immun.
1990; 58:1437-44; y Murta, A.C.M. y col.,
Molec. Biochem. Parasitol. 1990;
43:27-38) y se cree que es un factor de
virulencia importante (Eakin, E.A. y col., J. Biol. Chem.
1992; 267:7411-20). El enzima (cruzipaína)
corta moléculas de inmunoglobulina G e hidroliza el fragmento Fc
(Murta, A.C.M. y col., Molec. Biochem. Parasitol. 1990;
43:27-38), ayudando de este modo al organismo
a evadir las consecuencias inmunológicas de la unión al anticuerpo.
Entamoeba histolytica, la causa de la amebiasis, produce
también una proteasa de cisteína extracelular que muchos creen que
es un factor de virulencia muy importante (Keene, W.E. y col., J.
Exp. Med. 1986; 163:536-49). Igual que la
proteasa de cisteína estreptocócica, el enzima de E.
histolytica degrada varias proteínas de la ECM, incluyendo el
colágeno de tipo I, la fibronectina y la laminina (Keene, W.E. y
col., J. Exp. Med. 1986; 163:536-49).
La proteasa produce también un efecto citopático sobre monocapas de
cultivo celular (Keene, W.E. y col., Exp. Parasitol. 1990;
71:199-206) y está implicada en la producción
de necrosis tisular en modelos de amebiasis aguda en rata (Becker,
I. y col., Exp. Parasitol. 1988;
67:268-80).
SEC ID Nº: 5
Pueden emplearse mutagénesis dirigida a un sitio
y mutagénesis aleatoria para identificar los residuos que alteran la
función de la proteasa de cisteína y el procesamiento del zimógeno,
y para crear mapas de las regiones que constituyen los dominios
antigénicos de la proteína. La Figura 8 muestra los lugares de
procesamiento, las posiciones de las variaciones de aminoácidos
encontradas en las proteínas producidas por los alelos speB y
speB4 y los aminoácidos que son diana para la mutación. Las
dianas para la sustitución de aminoácidos funcionales están basadas
en el análisis bioquímico de la proteasa de cisteína (Tai y col.,
J. Biol. Chem. (1976) 251:1955-91) y
por analogía con residuos similares de la proteasa de cisteína
eucariótica.
Con el fin de crear un zimógeno estable para
facilitar los estudios cristalográficos y generar una proteasa
enzimáticamente deficiente o inactiva para estudios de
estructura-función, se producen y caracterizan
formas mutantes de la proteína proteasa de cisteína. Un esquema de
mutagénesis dirigida crea cambios que: (i) alteran la actividad de
la proteasa; (ii) impiden el procesamiento del zimógeno; (iii)
impiden la unión al sustrato y (iv) alteran la inmunorreactividad.
Los aminoácidos son cambiados por alanina estructuralmente neutra.
Como ejemplo, una proteína mutante que carezca de actividad proteasa
pero que conserve su antigenicidad, puede ser generada por
mutagénesis del único residuo de cisteína (Cys-192
\rightarrow Ala-192) en el sitio catalítico de la
molécula. Se someten también a mutagénesis His-340 y
Gln-185 y Asn-356. Estos tres
cambios son epistáticos respecto a la mutación de
Cys-192, pero solos pueden presentar una actividad
alterada. Trp-357, que se cree que está implicado en
la unión al sustrato y está situado de manera similar dentro de la
papaína, va a ser también convertido en diana.
Se crea también un precursor estable del zimógeno
mediante la mutación de los residuos que rodean el sitio de corte de
la proteasa en Lys-2145. Además, la mutagénesis de
Cys-192 puede impedir la autoproteolisis, como
ocurría con un mutante Cys \rightarrow Ser de la papaína, la
proteasa de cisteína prototipo. Otras dianas para mutagénesis
incluyen un supuesto dominio de unión a nucleótidos (GVGKVG) (SEC ID
Nº:6) y una región potencial de ensamblaje del colágeno
[(GXX)_{3}] en la porción carboxi-terminal
de la proteína. Se utiliza mutagénesis dirigida a un sitio, mediante
el método de barrido para cambiar aminoácidos cargados por alanina,
con el fin de sustituir aminoácidos cargados positivamente y
negativamente (implicados a menudo en el reconocimiento y la
actividad) por alanina. Se espera que muchos de los residuos
cargados (14 residuos de lisina, 7 de arginina, 12 de aspartato y 7
de glutamato en el péptido maduro) residan en la superficie de la
estructura de la proteasa de cisteína, y se espera que algunos
definan epítopos en la molécula. En particular, se examina una
región de aminoácidos cargados, desde el 307 al 321 (8/15 cargados);
esta región incluye el sitio de las sustituciones de aminoácidos de
speB2 y speB4. Están también mutados residuos de las
regiones antigénicas identificadas en los estudios de creación de
mapas epitópi-
cos.
cos.
Por tanto, en una realización la invención
proporciona una proteína exotoxina B pirogénica estreptocócica
(SPEB) no proteolítica purificada que contiene al menos una
sustitución de aminoácidos en Cys-192 o
His-340. En particular, la sustitución de
aminoácidos puede ser Cys-192 \rightarrow
Ala-192, Cys-192 \rightarrow
Ser-192 o His-340 \rightarrow
Ala-340.
Con el fin de crear proteínas de speB
mutantes, como ejemplo, el gen speB es primeramente
amplificado a partir de una cepa de S. pyogenes, con PCR, y
el producto es clonado en un vector filámido de múltiples copias tal
como pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA). Este vector es elegido
porque lleva el promotor de lac regulado y puede ser
replicado como una molécula de hebra sencilla para mutagénesis
dirigida a un sitio. El clonaje es diseñado para colocar en el
vector el promotor, el sitio de unión de ribosomas y el marco de
lectura de speB 3' respecto a un promotor inducible, tal como
un promotor de lac, de tal manera que la proteína pueda ser
sobreexpresada condicionalmente en un huésped bacteriano cuando se
añada al caldo de cultivo un inductor del promotor inducible. Por
ejemplo, con el promotor de lac, en E. coli cuando
pueda añadirse el inductor de lac IPTG. El promotor de
speB está incluido requiriendo la expresión en S.
pyogenes. Extractos de células completas y productos
periplásmicos derivados de un shock de células de E. coli que
llevan este clon primario de speB son examinados para
determinar la presencia de la proteína proteasa de cisteína mediante
SDS-PAGE y mediante transferencia Western con un
anticuerpo anti-proteasa de cisteína. El plásmido
resultante es la diana para la mutagénesis.
Se crean mutaciones dirigidas por
oligonucleótidos, tales como sustituciones, deleciones y pequeñas
inserciones, en moldes de hebra sencilla que contengan uracilo
mediante el método de Kunkel (Kunkel, 1985). Cuando es posible, se
diseñan cebadores mutagénicos con el fin de incorporar un único
sitio de restricción en el gen speB para la creación de mapas
y la selección de mutantes. Se crean sustituciones por alanina
individuales y múltiples en los residuos anteriormente indicados.
Una vez que se han identificado los residuos críticos para la
función, pequeñas regiones que rodean los mismos son eliminadas o
sustituidas mediante la utilización de los mismos métodos, con el
fin de caracterizar adicionalmente la región y de impedir la
reversión. Cuando están disponibles datos cristalográficos, se mutan
aminoácidos adicionales.
Puede emplearse también un esquema de mutagénesis
aleatoria. Las proteínas variantes creadas por este método son muy
útiles para la selección de epítopos, aunque pueden recuperarse
también moléculas con una cinética alterada y con un reconocimiento
alterado del sustrato. Regiones de la secuencia de speB son
aleatorizadas con oligonucleótidos mixtos en el protocolo de
mutagénesis estimulada, o se crean deleciones en marco cortas dentro
del gen con una modificación del protocolo de inserción/deleción de
un adaptador con ADNasa I de Palzkill y Bostein (Palzkill y
Bostein, 1991).
Para identificar mutaciones negativas en la
proteasa, células huésped bacterianas productoras de proteínas
mutantes potenciales son sometidas a selección primeramente por la
actividad proteasa en placas de agar caseína. Como se espera la
secreción de la proteasa de cisteína al periplasma, puede observarse
la actividad proteasa en las placas. Si esta estrategia de selección
tiene éxito, miles de colonias son examinadas rápidamente para
detectar mutaciones funcionales en la proteasa de cisteína. Si la
proteasa de cisteína debe ser secretada completamente por E.
coli para presentar actividad, los productos del choque osmótico
de cada supuesta cepa mutante son analizados para determinar
actividad proteasa.
Alternativamente, puede emplearse la tecnología
de ADN híbrido mediante la cual puede prepararse un gen sintético
empleando hebras sencillas que codifiquen el polipéptido o hebras
sustancialmente complementarias de las mismas, donde las hebras
sencillas se solapan y pueden ser puestas en contacto en un medio de
hibridación con el fin de que hibriden. Las hebras hibridadas pueden
ser ligadas posteriormente para formar el gen completo y, mediante
la elección de los extremos apropiados, el gen puede ser insertado
en un vector de expresión. Alternativamente, la región del genoma
bacteriano que codifica el péptido puede ser clonada mediante
técnicas convencionales de ADN recombinante y expresada. Un ejemplo
de una secuencia codificadora de ADN que puede ser utilizada para
expresar la proteasa de cisteína es según sigue (SEC ID Nº:7):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas SPEB mutantes de la invención
pueden ser utilizadas para generar una respuesta inmune protectora y
en vacunas, particularmente para humanos, pero también en animales
comercialmente valiosos tales como el visón, que son susceptibles a
la infección por estreptococos del Grupo A, o en otros animales
tales como ratones. Por consiguiente, la invención proporciona la
utilización de una proteína exotoxina B pirogénica estreptocócica
(SPEB) no proteolítica purificada que contiene al menos una
sustitución de aminoácidos en Cys-192 o
His-340, para la fabricación de una vacuna para
conferir inmunidad a un mamífero frente a la infección por
estreptococos del Grupo A. La vacuna puede ser adaptada para que
confiera inmunidad frente a una infección seleccionada de entre
faringitis, amigdalitis, infecciones cutáneas, fiebre reumática
aguda, escarlatina, glomerulonefritis
post-estreptocócica, sepsis y síndrome similar al
choque tóxico. La vacuna puede ser adaptada también para ser
administrada a un
humano.
humano.
Las proteínas son formuladas de manera
conveniente, generalmente a concentraciones en el rango de 1 \mug
a 20 mg/kg. Pueden utilizarse como vehículos medios
fisiológicamente aceptables tales como agua estéril, solución
salina, solución salina tamponada con fosfato y similares. Pueden
emplearse adyuvantes tales como gel de hidróxido de aluminio y
similares. La administración puede ser mediante inyección, por
ejemplo intramuscularmente, intraperitonealmente, subcutáneamente,
intravenosamente, etc. Por consiguiente, la vacuna puede ser
adaptada para ser administrada mediante administración parenteral,
subcutánea, intramuscular u oral. La administración puede ser de una
vez o en varias veces, normalmente a intervalos de una a cuatro
semanas. Por tanto, la vacuna puede ser adaptada para que sea
administrada en múltiples dosis. Además, la eficacia de la vacuna
puede ser incrementada por la adición de un antígeno proteína M
estreptocócica. En esta vacuna, el dominio conservado de la proteína
M estreptocócica es combinado con la proteasa de cisteína.
Preferiblemente, la proteína M que es utilizada no reacciona
inmunológicamente de manera cruzada con los tejidos del huésped. La
producción de anticuerpos puede ser utilizada como protección frente
a Streptococcus del Grupo A, donde la protección puede
retrasar la aparición de la muerte o prevenir la mortalidad debida a
la infección.
La proteasa de cisteína purificada tiene varios
usos, incluyendo la utilización como sustituta de la tripsina o de
otras proteasas en la obtención de células aisladas, particularmente
de aquéllas que están en una matriz proteica, por ejemplo una matriz
de colágeno, tal como un espécimen de biopsia, o adheridas a una
placa de cultivo de tejidos o a una placa Petri, o unidas a una
columna de afinidad a través de un brazo proteico. La proteasa es
también útil para eliminar el exceso de tejido en una cicatriz y
para limpiar el tejido de un sustrato biológico tal como el
hueso.
hueso.
Los ejemplos siguientes se presentan con el fin
de ilustrar varias realizaciones de los métodos de la presente
invención y no están destinados a limitar de ninguna manera la
presente invención.
La Tabla 1 muestra las 68 cepas estudiadas de
S. pyogenes. MGAS 1719 es idéntica a la cepa B220, la
denominación asignada por el Dr. R. Lancefield a la cepa 5797. La
cepa expresa el antígeno T de tipo 8 pero no es tipificable
serológicamente por la proteína M.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
^{a} ET, tipo electroforético.
^{b} NT, no tipificable por serotipo de
proteína M.
^{c} MGAS, número de referencia del
Streptococcus de Grupo A de Musser. Las fuentes de las cepas
y las denominaciones originales son según sigue: J.C. Huang,
Laboratory Centre for Disease Control, Ottawa, Canadá, MGAS 579
(11111), 587 (9378), 590 (11078), 2075 (DC 11435); J.E. Peters,
Wilford Hall Medical Center, San Antonio, Texas, MGAS 1991
(BB6672-3), 1990 (BA9812-4); P.M.
Schlievert, University of Minnesota, Minneapolis, Minnesota, MGAS
1253 (119/6, conocida también como SF130/13), MGAS 1251 (C203S), 166
(Reineke), 285 (195), 325 (89.5.5612), 157 (Zinke), 315 (Soldier 1),
282 (192), 289 (199), 262 (Cal 17), 168 (Reinary), 302 (Lambert),
321 (Weckmuller), 156 (Wilson), 300 (Kluss), 303 (Lundeen), 162
(Cygan), 165 (Wicks), 317 (Timmers); E.L. Kaplan, University of
Minnesota, MGAS 480 (90-441); M.A. Kehoe, University
of Newcastle upon Tyne, Newcastle upon Tyne, Inglaterra, MGAS 1841
(M41), 1871 (PT5757), 1893 (PT4854), 1882 (M59), 1842 (M43), 1901
(M23), 1898 (M15), 1864 (M56), 1896 (M10), 1911 (M75), 1881 (M62),
1870 (PT4931), 1872 (TR2612), 1838 (M27), 1914A (TR2233); D.
LeBlanc, University of Texas Health Science Center en San Antonio,
Texas, MGAS 1222 (Cole 36XA87), 1226 (Cole 40XF1), 1233 (Cole
45XA9); K.H. Johnston, Louisiana State University Medical Center,
New Orleans, Louisiana, MGAS 1719 (B220); D.E. Bessen, Yale
University, New Haven, Connecticut, MGAS 1832 (CS110), 1294
(IRP232), 1289 (IRP144); S.K. Hollingshead, Departamento de
Microbiología, University of Alabama School of Medicine, Birmingham,
Alabama, MGAS 660 (D469), 789 (IGL100), 807 (D323), 429 (C256/86/3),
684 (IRP284), 694 (D470), 427 (J137/69/1), 366 (AGL130), 719 (D938),
686 (D316), 800 (A724), 758 (86-809), 796 (D339),
650 (D691), 659 (D474). Todas las demás cepas son de la colección de
J.M.M.
^{d} TSLS, síndrome similar al choque tóxico;
SID, enfermedad invasiva grave; ARF, fiebre reumática aguda; NP,
nasofaringe.
Las bacterias fueron cultivadas durante una noche
a 37ºC en un 5% de CO_{2} en agar con una infusión de
cerebro-corazón (BHI). El cultivo de una noche fue
utilizado para inocular 200 ml de medio líquido BHI, y el cultivo
fue incubado durante 12-14 horas a 37ºC en un 5% de
CO_{2}. Una alícuota de 50 ml del cultivo de una noche fue añadida
a 2 litros de medio definido químicamente (JRH Bioscience, Lenexa,
KS), pH 6,0, y el cultivo fue incubado a 37ºC en un 5% de CO_{2}.
El caldo fue mantenido a pH 5,5-6,0 por la adición
de bicarbonato de sodio estéril (10% p/v). Después de
8-9 horas, las células fueron retiradas por
centrifugación y el sobrenadante fue concentrado hasta 250 ml por el
pase a través de un cartucho de ultrafiltración espiral de 10 kDa de
corte (Amicon). El cambio de tampón (> 99%) por diafiltración se
llevó a cabo con 1,5 litros de etanol 20% - Tris-HCl
20 mM, pH 7,0 (tampón A) a 4ºC, y el material fue almacenado
durante una noche a 4ºC. La solución diafiltrada fue pasada a través
de una columna Matrix Gel Red A (Amicon) (1,5 cm x 15 cm)
equilibrada con tampón A. La columna fue lavada con tampón A hasta
que la absorción (280 nm) regresó a la línea base, y la proteína fue
eluida con tampón A conteniendo NaCl 2 M. El material eluido fue
recogido como una fracción y concentrado hasta 3 ml por
ultrafiltración (Centriprep 10, Amicon) y el tampón fue
intercambiado con PBS, pH 7,2, mediante cromatografía de filtración
en gel (BioRad).
La secuenciación aminoterminal de la proteína
purificada derivada de la cromatografía de afinidad por un
ligando-colorante (Figura 1) revela una secuencia
-QPVVKSLLDSK- (SEC ID Nº:8), correspondiente a los aminoácidos 146
-
156, confirmando de este modo la identidad del material purificado como la forma activa madura truncada de la proteinasa de cisteína estreptocócica. El enzima es estable durante al menos varios meses a -20ºC. Se han purificado tres variantes alélicas características de speB (identificadas mediante estudios de secuenciación). La forma zimógeno puede ser purificada con un protocolo muy similar, excepto en que se omite la cisteína del medio y el cultivo es incubado en ausencia de CO_{2} suplementario.
156, confirmando de este modo la identidad del material purificado como la forma activa madura truncada de la proteinasa de cisteína estreptocócica. El enzima es estable durante al menos varios meses a -20ºC. Se han purificado tres variantes alélicas características de speB (identificadas mediante estudios de secuenciación). La forma zimógeno puede ser purificada con un protocolo muy similar, excepto en que se omite la cisteína del medio y el cultivo es incubado en ausencia de CO_{2} suplementario.
La secuencia de aminoácidos publicada para la
proteasa de cisteína, incluyendo la configuración del supuesto sitio
activo, es incorrecta. La secuencia de aminoácidos pronosticada
codificada por esta secuencia no es afín a la secuencia publicada de
la proteasa de cisteína. En su lugar, la secuencia de nucleótidos se
asemeja a, pero es distinta de, el alelo descrito por Hauser y
Schlievert.
Sin embargo, la configuración de aminoácidos
alrededor del residuo de cisteína activo es idéntica en la cepa B220
y en todas las cepas caracterizadas hasta ahora. Por tanto, la
propuesta de Hauser y Schlievert (1990) de que la falta de actividad
proteasa asociada con la SPEB purificada de su cepa M12
86-858 es una consecuencia de la diferencia en la
secuencia de aminoácidos alrededor del residuo de Cys, es
incorrecta.
Se utilizó un ensayo que empleaba
pIL-1\beta radiomarcada producida en un sistema de
transcripción-traducción de reticulocitos de
conejo. La proteasa de cisteína producía un producto de corte de 18
kDa aproximadamente, un tamaño muy similar al peso molecular
aparente de la mIL-1\beta (Figura 2A). El análisis
de transferencia Western de los productos de corte generados a
partir de pIL-1\beta recombinante producida en
E. coli confirmó este resultado (Figura 2B).
La proteasa de cisteína cortaba un mutante de la
pIL-1\beta humana (Asp-116
\rightarrow Ala-116, creando un enlace
Ala-116 -Ala-117) que no es
degradado por ICE. Según se observó con la
pIL-1\beta de tipo salvaje, la proteasa de
cisteína cortaba el sustrato mutante para formar un producto con un
peso molecular aparente de \sim 18 kDa (Figura 2A). Por tanto, el
sitio de corte primario para la proteasa de cisteína no era el sitio
proteolítico de ICE.
Con el fin de determinar exactamente el lugar en
el que la proteasa de cisteína cortaba pIL-1, se
secuenciaron los 10 residuos de aminoácidos aminoterminales del
producto de \sim 18 kDa producido por degradación de la
pIL-1\beta recombinante. La proteasa de cisteína
cortaba pIL-1\beta entre His-115 -
Asp-116 para crear una molécula un residuo de
aminoácido más larga que mIL-1\beta.
Como se describió una forma muy activa de
mIL-1\beta con Asp-116 en el
extremo amino en el curso de la caracterización de una
metaloproteasa encontrada en células mononucleares de sangre
periférica humana, la proteasa de cisteína estaba procesando la
pIL-1\beta inactiva para dar
IL-1\beta biológicamente activa. La
IL-1\beta madura es un potente inductor de la
actividad sintasa del óxido nítrico (NOS) en células de músculo liso
vascular (SMC). La proteasa de cisteína fue añadida en presencia o
ausencia de pIL-1\beta a cultivos confluentes de
SMC y se analizó la actividad NOS midiendo los niveles del anión
nitrito en el medio después de 24 horas. Ni la proteasa de cisteína
sola ni la pIL-1\beta sola producían un incremento
significativo de los niveles de nitrito. En contraste, la adición de
proteasa de cisteína y pIL-1\beta juntas causó un
incremento de 60 veces aproximadamente de la acumulación de nitrito
(Figura 3).
Se encontró también que la
IL-1\beta generada por el corte de la
pIL-1\beta por la proteasa de cisteína era activa
en el ensayo con la línea celular A375. En un ensayo en el que 500
ng/ml aproximadamente de pIL-1\beta intacta eran
inactivos, un digesto de este material por la proteasa de cisteína
producía 6,1 x 10^{4} unidades/ml de actividad; 500 ng/ml de
IL-1\beta auténtica correspondían a 1,1 x 10^{5}
unidades en este ensayo.
Dos variantes alélicas adicionales de la proteasa
de cisteína que existen de manera natural (SPE B2 y SPE B11)
producían también un fragmento de IL-1\beta con un
peso molecular aparente idéntico al del producido por SPE B7
purificada a partir de MGAS 1719 (Figura 4).
El gen speB fue amplificado por la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con oligonucleótidos
sintéticos.
El fragmento de ADN estudiado (1.437 pb) representa la región codificadora completa (1.197 pb) y 160 pb de la secuencia corriente arriba y 80 pb de la secuencia corriente abajo. Para alrededor de un tercio de las cepas, se preparó ADN de hebra sencilla por el método de la exonucleasa de lambda y se secuenció en ambas orientaciones con Sequenase versión 2.0. Los alelos variantes fueron secuenciados de nuevo con el fin de confirmar los cambios de nucleótidos.
El fragmento de ADN estudiado (1.437 pb) representa la región codificadora completa (1.197 pb) y 160 pb de la secuencia corriente arriba y 80 pb de la secuencia corriente abajo. Para alrededor de un tercio de las cepas, se preparó ADN de hebra sencilla por el método de la exonucleasa de lambda y se secuenció en ambas orientaciones con Sequenase versión 2.0. Los alelos variantes fueron secuenciados de nuevo con el fin de confirmar los cambios de nucleótidos.
Básicamente, la secuenciación del gen estructural
de la proteasa de cisteína fue según sigue. El gen estructural de la
proteasa de cisteína fue amplificado mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), con oligonucleótidos sintéticos. Los
cebadores oligonucleotídicos utilizados para amplificar speB
y las regiones flanqueantes fueron los siguientes:
SPEB-X (SEC ID Nº:9),
5'-GTTGTCAGTGTCAACTAACCGT-3'; y
SPEB-2 (SEC ID Nº:10),
5'-ATCTGTGTCTGATGGATAGCTT-3'.
Los cuatro oligonucleótidos siguientes fueron
utilizados como cebadores de secuenciación internos:
SPEB-1 (SEC ID Nº:11),
5'-CTTTCTGGCTCTAATATGTATGT-3';
SPEB-3 (SEC ID Nº:12),
5'-GTTATTGAAAAAGTAAAACC-3';
SPEB-4 (SEC ID Nº:13),
5'-TTTTCAATAACAGGTGTCAA-3'; y
SPEB-Y (SEC ID Nº:14),
5'-TCTCCTGAAACGATAACAAA-3'.
La amplificación por PCR de 1 \mul de ADN
cromosómico fue realizada en 100 \mul de una mezcla que contenía
KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 1,5
mM, gelatina 0,001%, 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y
dTTP, 200 nM de cada uno de SPEB-X y
SPEB-2 y 2,5 unidades de ADN polimerasa
AmpliTaq. Los parámetros de los ciclos térmicos fueron:
desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, hibridación a 55ºC
durante 2 minutos y extensión a 72ºC durante 2,5 minutos en un total
de 30 ciclos. Se utilizó una extensión final a 72ºC durante 15
minutos.
El fragmento de ADN (1.437 pb) representa la
región codificadora completa (1.197 pb) y 160 pb de la secuencia
corriente arriba y 80 pb de la secuencia corriente abajo. Para un
tercio aproximadamente de las cepas, se preparó ADN de hebra
sencilla mediante el método de la exonucleasa de lambda y se
secuenció en ambas orientaciones con Sequenase versión 2.0. Los
alelos variantes fueron secuenciados de nuevo con el fin de
confirmar los cambios de nucleótidos.
El gen de la proteasa fue caracterizado en dos
tercios aproximadamente de las cepas mediante secuenciación
automatizada del ADN con un instrumento de Applied Biosystems, Inc.,
Modelo 373A. Para el procedimiento automatizado, el gen fue
amplificado por PCR (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3; KCl 50
mM; MgCl_{2} 1,5 mM; 2,5 unidades de polimerasa Taq; 20
picomoles de cada cebador; 1 \mul de ADN cromosómico molde), con
los parámetros siguientes del termociclador: desnaturalización a
94ºC durante 4 minutos, 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC
durante 1 minuto, hibridación de los cebadores a 55ºC durante 2
minutos, extensión a 72ºC durante 2 minutos y una extensión final a
72ºC durante 5 minutos. Los nucleótidos y cebadores no incorporados
fueron eliminados por filtración a través de microconcentradores
Microcon 100 (Amicon Inc., MA). Se llevaron a cabo reacciones de
secuenciación con el kit de secuenciación "Taq DyeDeoxy
Terminator Cycle Sequencing Kit" (Applied Biosystems, Inc., CA)
con 7 \mul de ADN amplificado por PCR como molde y 3,2 picomoles
de cebador. Los terminadores con colorante y los cebadores no
incorporados fueron separados de los productos de extensión mediante
purificación en una columna de centrifugación
(Centri-Sep, Princeton Separations, Inc., NJ). La
muestra fue secada en una centrífuga de vacío. Antes de la carga en
el gel, la muestra fue resuspendida en 4 \mul de tampón de carga
de muestra (formamida desionizada 5:1; EDTA 50 mM, pH 8,0) y
desnaturalizada por calor durante 2 minutos a 90ºC. Los datos fueron
recopilados y editados con los programas EDITSEQ, ALIGN y SEQMAN
(DNASTAR, WI).
Los métodos para estimar relaciones genéticas
entre los clones de S. pyogenes mediante electroforesis de
enzimas multilocus fueron como los descritos por Musser y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2668-72 (1991).
Treinta y seis ETs no identificados previamente fueron numerados
arbitrariamente como ET 34 - ET 53.
El gen spe B
( spe B7) de la cepa MGAS 1719 no codifica una
proteína con la secuencia de aminoácidos presentada previamente. Hay
discrepancias entre la secuencia de la proteína de la cepa B220 y un
alelo de speB (denominado en la presente speB1) en una
cepa de serotipo M12 (86-858).
La presente invención demuestra que clones
estreptocócicos con el mismo alelo de speB, y la combinación
alelo de speB - proteína M, están asociados con varias
enfermedades diferentes. Por ejemplo, cepas de ET 1 - M1 -
speB2 fueron cultivadas de pacientes con faringitis,
escarlatina, celulitis y TSLS; y se recuperaron organismos ET 2 - M3
- speB3 de casos de faringitis, escarlatina y TSLS. De manera
similar, cepas cultivadas procedentes de individuos con fiebre
reumática aguda tenían seis alelos de speB distintos. Por
tanto, no había una asociación preferencial aparente entre el alelo
de speB y el tipo de enfermedad.
La identificación del alelo de speB en una
cepa (MGAS 789) recuperada en los años 1940 y que expresaba la
proteína M1, pero que se asignó al ET 36 en lugar de al ET 1 como
las cepas M1 contemporáneas, sugiere esa variación de las
asociaciones alelo de speB - genotipo del enzima multilocus -
proteína M producida por un factor que contribuye a los cambios
temporales de la frecuencia y la gravedad de la enfermedad
estreptocócica.
La presente invención no ha encontrado una
evidencia convincente de diferenciación análoga de las variantes
alélicas de speB. Las cepas asignadas a cada una de dos
clases distintas sobre la base de la reactividad con un panel de
anticuerpos monoclonales hacia la proteína M, no tenían diferencias
consistentes en la secuencia y en varios casos se encontró un alelo
de speB idéntico en cepas de dos clases de proteína M. Por
ejemplo, el alelo speB3 estaba presente en las cepas de clase
I (M3 y M12) y de clase II (M2) y, de manera similar, se identificó
el alelo speB5 en cepas que expresaban M1 y M4 asignadas a la
clase I y a la clase II, respectivamente (Tabla I). De manera
similar, no había una simple relación congruente entre el alelo de
speB y la arquitectura del regulón vir o el fenotipo
del factor de opacidad. Las cepas M2, M3 y M12 tenían todas el alelo
speB3, pero M3 y M12 son negativas para el factor de opacidad
y M2 es positiva para el factor de opacidad. La falta de una
correlación significativa entre la clase de serotipo M y la
filogenia de speB podría estar causada también por
acontecimientos de transferencia lateral relativamente frecuentes
que implican a parte de, o a todos, los genes emm y
speB.
La proteasa de cisteína estreptocócica degrada
rápidamente la vitronectina (VN) purificada (Figura 5). Después de
cinco minutos de incubación de la proteasa con VN, no pudieron
identificarse productos de degradación ni por tinción con Azul de
Coomassie ni por inmunotransferencia con anticuerpos policlonales
anti-VN. De manera similar, la proteasa
estreptocócica cortaba inmediatamente la fibronectina (FN), según se
mostró por la rápida aparición de productos de menor peso molecular
(Figura 5). Sin embargo, en contraste con la degradación de VN, el
corte de FN tenía lugar aparentemente en un número limitado de
sitios específicos (Figura 5 del manuscrito). La incubación de FN
con la prote-
asa durante un tiempo de hasta 12 horas no tuvo como resultado la formación de productos de degradación adicionales.
asa durante un tiempo de hasta 12 horas no tuvo como resultado la formación de productos de degradación adicionales.
No se observó un corte significativo de la
laminina (LN) humana bajo las condiciones experimentales ensayadas
(Figura 5), o cuando se utilizaron 10 \mug de proteasa y 2 \mug
de sustrato LN.
Debido a que los pacientes con episodios
invasivos de S. pyogenes tienen frecuentemente sepsis
bacteriana con daño a las células endoteliales, se examinó la
capacidad de la proteasa de cisteína estreptocócica para cortar
directamente FN procedente de HUVECs crecidas en cultivo. El
análisis de inmunotransferencia Western de las células en ausencia
de proteasa, o de las células tratadas con proteasa llevada a
ebullición durante un tiempo de hasta 8 horas, no mostró una
degradación detectable de FN (Figura 6). En contraste, células
incubadas con tan solo 6 \mug/ml de proteasa estreptocócica por
pocillo durante 2 horas, conservaban solamente una pequeña fracción
de FN nativa intacta. Por tanto, la proteasa estreptocócica corta FN
de manera dependiente de la dosis y del tiempo en el complejo
entorno de células que crecen en cultivo de tejidos.
Y lo que es más interesante, el tratamiento de
HUVECs con la proteasa estreptocócica inducía rápidamente
sorprendentes efectos citopáticos (Figura 6). Alrededor de 3 horas
después de la adición de la proteasa, aparecían en la monocapa
celular zonas despejadas. Este efecto estaba seguido por la pérdida
de la adherencia celular a la matriz y la eliminación de la
morfología de adoquín característica. El corte de FN fue detectable
por análisis de inmunotransferencia antes de la aparición del efecto
citopático. No se observaron bandas correspondientes a la VN humana
nativa ni en el control solubilizado ni en HUVECs tratadas mediante
análisis de inmunotransferencia Western, debido presumiblemente al
bajo nivel de expresión, o a la falta de expresión, de VN por estas
células.
Virtualmente todos los aislados clínicos de
estreptococos del Grupo A producen SPEB/proteasa de cisteína, y los
pacientes infectados con estreptococos del Grupo A desarrollan
anticuerpos anti-proteinasa. Se utilizó el análisis
de inmunotransferencia de sobrenadantes de cultivo para determinar
la producción de SPEB/proteasa estreptocócica por cepas de S.
pyogenes, y de un aislado de serotipo M11 que existe de forma
natural (MGAS 2075) del que se había descrito que carecía de
speB. Con la excepción de las tres cepas, los demás 64
aislados examinados producían todos proteasa de cisteína, un
resultado consistente con la noción de que virtualmente todas las
cepas de S. pyogenes expresan la molécula extracelularmente
(Figura 7 y Tabla I). Las tres cepas tenían los alelos speB3,
speB13 y speB16, pero otros aislados con estos mismos
alelos producían la proteasa. Por tanto, los 39 alelos de
speB pueden ser todos expresados por las cepas
estreptocócicas del Grupo A bajo condiciones apropiadas. El sitio
polimórfico de los 39 alelos dentro de la región no codificadora
corriente arriba de 160 pb y la región codificadora de 1197 pb del
gen speB se muestran en la Fig. 10.
La protección inmunoprofiláctica de la proteasa
de cisteína se observa mediante la utilización de dos modelos. En
primer lugar, se utiliza el modelo de inmunización intranasal según
fue desarrollado por Bessen y Fischetti (1988) para evaluar el
efecto de la inmunización con proteasa de cisteína sobre la
colonización mucosal por S. pyogenes. En segundo lugar, se
utiliza un modelo de infección cutánea en ratón (Bunce y col., 1992)
frente a un desafío bacteriano subcutáneo. Brevemente, los animales
son inyectados s.c. con proteasa en el flanco y observados
diariamente, incluyendo medidas del peso. Se calculan los volúmenes
de los abscesos y el área de dermonecrosis y se determinan curvas
del tamaño de las lesiones.
La Figura 8 muestra los lugares de procesamiento,
las posiciones de las variaciones de aminoácidos encontradas en las
proteínas producidas por los alelos speB2 y speB4, y
los aminoácidos que son diana para la mutación. Se emplean esquemas
de mutagénesis dirigida a un sitio y de mutagénesis aleatoria para
identificar residuos que alteren la función de la proteasa de
cisteína y el procesamiento del zimógeno, y para generar mapas de
las regiones que constituyen los dominios antigénicos de la
proteína. Las dianas para una sustitución de aminoácidos funcionales
están basadas en el análisis bioquímico de la proteasa de cisteína
(Tai y col., 1976) y por analogía con residuos similares de la
proteasa de cisteína eucariótica.
Con el fin de crear un zimógeno estable para
facilitar los estudios cristalográficos y generar una proteasa
enzimáticamente deficiente o inactiva para los estudios de
estructura-función, se produjeron y caracterizaron
formas mutantes de la proteína proteasa de cisteína. Un esquema de
mutagénesis dirigida crea cambios que: (i) alteran la actividad
proteasa; (ii) impiden el procesamiento del zimógeno; (iii) impiden
la unión al sustrato y (iv) alteran la inmunorreactividad. Los
aminoácidos son cambiados por alanina estructuralmente neutra. Una
proteína mutante que carece de actividad proteasa pero que conserva
su antigenidad, es generada mediante mutagénesis del único residuo
de cisteína (Cys-192 \rightarrow
Ala-192) en el sitio catalítico de la molécula. Son
también mutados His-340 y Gln-185 y
Asn-356. Estos tres cambios son epistáticos respecto
a la mutación de Cys-192, pero solos pueden
presentar una actividad alterada. Trp-357, que se
cree que está implicado en la unión al sustrato y está situado de
forma similar en la papaína, es también convertido en diana. Se crea
también un precursor estable del zimógeno mediante la mutación de
los residuos que rodean el sitio de corte de la proteasa en
Lys-145. Además, la mutagénesis de
Cys-192 puede impedir la autoproteolisis, como
ocurría con un mutante Cys \rightarrow Ser de la papaína, la
proteasa de cisteína prototipo. Otras dianas para mutagénesis
incluyen un supuesto dominio de unión a nucleótidos (GVGKVG) y una
región potencial de ensamblaje del colágeno [(GXX)_{3}] en
la porción carboxiterminal de la proteína. Se utiliza mutagénesis
dirigida a un sitio, mediante el método de barrido para cambiar
aminoácidos cargados por alanina, con el fin de sustituir
aminoácidos cargados positivamente y negativamente (implicados a
menudo en el reconocimiento y la actividad) por alanina. Se espera
que muchos de los residuos cargados (14 residuos de lisina, 7 de
arginina, 12 de aspartato y 76 de glutamato en el péptido maduro)
estén en la superficie de la estructura de la proteasa de cisteína,
y se espera que algunos definan epítopos en la molécula. En
particular, se examinó una región de aminoácidos cargados, desde el
307 al 321 (8/15 cargados); esta región incluye el sitio de las
sustituciones de aminoácidos de speB y speB4. Son
mutados también residuos de las regiones antigénicas identificadas
en los estudios de creación de mapas de los epítopos.
En primer lugar, el gen speB es
amplificado por PCR a partir de una cepa de S. pyogenes
ET1/M1, y el producto es clonado en un vector filámido de múltiples
copias tal como pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA). Este vector
es elegido porque lleva el promotor de lac regulado y puede
ser replicado como una molécula de hebra sencilla para mutagénesis
dirigida a un sitio. El clonaje es diseñado para colocar el
promotor, el sitio de unión de ribosomas y el marco de lectura de
speB 3' respecto al promotor de lac inducible en el
vector, de tal manera que la proteína puede ser sobreexpresada
condicionalmente en E. coli cuando se añade el inductor de
lac, IPTG. Está incluido el promotor de speB requerido
para la expresión en S. pyogenes. Extractos de células
completas y productos periplásmicos derivados de un shock de células
de E. coli portadoras de este clon de speB primario,
son examinados para detectar la presencia de la proteína proteasa de
cisteína por SDS-PAGE y por transferencia Western
con un anticuerpo anti-proteasa de cisteína. El
plásmido resultante es la diana para la mutagénesis.
Se crean mutaciones dirigidas por
oligonucleótidos, tales como sustituciones, deleciones y pequeñas
inserciones, en moldes de hebra sencilla que contienen uracilo
mediante el método de Kunkel (Kunkel, 1985). Cuando es posible, se
diseñan cebadores mutagénicos para incorporar un único sitio de
restricción en el gen speB para la generación de mapas y la
selección de mutantes. Se crean sustituciones de alanina
individuales y múltiples en los residuos indicados anteriormente.
Una vez que se han identificado los residuos críticos para la
función, pequeñas regiones que rodean los mismos son eliminadas o
sustituidas mediante la utilización de los mismos métodos para
caracterizar adicionalmente la región e impedir la reversión. Cuando
están disponibles datos cristalográficos, se mutan aminoácidos
adicionales.
Se emplea también un esquema de mutagénesis
aleatoria. Las proteínas variantes creadas por este método son muy
útiles para la selección de epítopos, aunque pueden recuperarse
también moléculas con una cinética alterada y con un reconocimiento
del sustrato alterado. Regiones de la secuencia de speB son
aleatorizadas con oligonucleótidos mixtos en el protocolo de
mutagénesis estimulada, o se crean deleciones en marco, cortas,
dentro del gen con una modificación del protocolo de
inserción/deleción de un adaptador con ADNasa I de Palzkill y
Bostein (Palzkill y Bostein, 1991). En el mismo, "adaptadores de
escisión" sintéticos son ligados primeramente al ADN diana
linealizado aleatoriamente; posteriormente son escindidos con los
nucleótidos flanqueantes para crear pequeñas sustituciones o
deleciones. Por ejemplo, se utiliza un adaptador con dos copias de
la secuencia de reconocimiento para el enzima SapI (GCTCTTC)
para crear deleciones de seis bases (tres bases en cada extremo del
adaptador) o deleciones de dos aminoácidos aleatorias, a través del
gen speB, según se ilustra en la Figura 9. Las bases
flanqueantes son también aleatorizadas rellenando los extremos de la
secuencia diana después de la escisión del adaptador, insertando
luego un segundo adaptador de extremos romos que incluye una
secuencia aleatoria en lugar de los Ns. El segundo adaptador es
eliminado posteriormente por digestión con SapI y la
secuencia diana es ligada para crear sustituciones.
Con el fin de identificar las mutaciones
negativas en la proteasa, células E. coli productoras de
proteínas mutantes potenciales son primeramente sometidas a
selección por la actividad proteasa en placas de agar caseína. Como
se espera la secreción de la proteasa de cisteína al periplasma, es
posible que la actividad proteasa pueda ser observada en las placas.
Si esta estrategia de selección tiene éxito, posteriormente miles de
colonias son examinadas rápidamente para detectar mutaciones
funcionales de la proteasa de cisteína. Si la proteasa de cisteína
debe ser secretada completamente por E. coli para presentar
actividad, productos resultantes del choque osmótico de cada
supuesta cepa mutante son analizados posteriormente para determinar
la actividad proteolítica.
Los experimentos de inmunización intranasal se
llevan a cabo esencialmente según está descrito por Bessen y
Fischetti (1988). Brevemente, se utilizan ratones Swiss CD1 no
consanguíneos del mismo género, de 4 a 5 semanas de edad al comienzo
de la inmunización. Grupos de 24 ratones son inmunizados
intranasalmente (i.n.) con 0 o de 20 a 100 \mug de zimógeno,
proteasa activa madura o péptido sintético. Los ratones son
inmunizados una vez los días 1, 3 y 5, se dejan descansar durante 3
semanas y se les inyecta un refuerzo i.n. de una única dosis de
antígeno (20 ó 40 g). El grupo inicial de 20 ratones inmunizados es
distribuido aleatoriamente en dos subgrupos de 10 animales. Cada
subgrupo es desafiado con la cepa fuente de la proteasa de cisteína
(desafío homólogo) o con una cepa que exprese una variante distinta
de la proteasa de cisteína (desafío heterólogo). Se administran a
los animales 10 \mul de la suspensión bacteriana por narina 10
días después del refuerzo con la proteasa de cisteína. La vacuna es
administrada i.n. a los ratones no anestesiados (10 \mul por
narina) mediante una jeringa Hamilton modelo 750 equipada con un
dispensador de repetición y una aguja de punta roma. Se realizan
frotis de la garganta comenzando 24 horas después del desafío y
posteriormente a intervalos de 24 y 48 horas hasta el día 11. Se
toman muestras adicionales de la garganta para cultivo el día 15.
Los frotis de la garganta son cultivados en placas de agar sangre
durante una noche a 37ºC en un incubador de CO_{2} y las colonias
betahemolíticas son contadas al día siguiente.
El grupo inicial de 24 ratones inmunizados es
dividido aleatoriamente en dos subgrupos de 12 animales. Cada
subgrupo es desafiado posteriormente con la cepa fuente de la SPEB
(desafío homólogo) o con una cepa que exprese una variante distinta
de la SPEB (desafío heterólogo). Las cepas utilizadas para el
desafío son seleccionadas por su resistencia a 200 \mug/ml de
estreptomicina con el fin de facilitar la recuperación después del
desafío y, si es necesario, son pasadas de manera seriada mediante
inyecciones i.p. repetidas a ratones para incrementar su capacidad
para colonizar e infectar ratones. Se prepara una única solución
madre de cada organismo de desafío que expresa SPEB a partir del
cultivo de una noche, se concentra 10 veces y se almacena a -80ºC.
Las soluciones madre son diluidas 1:500 y cultivadas durante una
noche a 37ºC en caldo BHI, diluidas 1:20 en medio de crecimiento
nuevo y cultivadas hasta una D.O._{650} de 0,5. Las células son
recogidas por centrifugación y suspendidas en solución salina a 2,5
x 10^{5} UFC/ml aproximadamente. En vista de que las cepas de
estreptococos difieren en su capacidad para colonizar ratones
intranasalmente, se utiliza una dosis de desafío que coloniza de
manera reproducible más del 25% de una población de ratones no
inmunes. Los animales son alojados seis por jaula por cohorte. Los
ratones reciben 10 \mul de la suspensión bacteriana por narina 10
días después del refuerzo con la proteasa de cisteína. Se toman
frotis de la garganta comenzando 24 horas después del desafío y
posteriormente a intervalos de 24 a 48 horas hasta el día 11. El día
15 se toman muestras de la garganta para cultivos adicionales. Los
frotis de la garganta son cultivados en placas de agar sangre con
200 \mug/ml de estreptomicina, cultivados durante una noche a 37ºC
en un incubador de CO_{2} y las colonias betahemolíticas son
contadas al día siguiente.
Se llevan a cabo experimentos de inmunización en
ratones sin pelo, inmunocompetentes, no consanguíneos de 4 a 5
semanas de edad (cepa Cr1:SKH1 (hrhr)Br; Clarles River) del
mismo género. Estos ratones son utilizados porque el tamaño y el
carácter de las lesiones son fácilmente valorados y los animales no
necesitan ser afeitados. Grupos de 24 ratones son inmunizados
subcutáneamente (s.c.) con 0, 20 ó 40 \mug de zimógeno o de
proteasa activa madura. Los ratones son inmunizados una vez los días
1, 7, 14 y 21, se dejan descansar durante 3 semanas y se refuerzan
con una única dosis de proteasa (20 ó 50 \mug). Los animales son
analizados para determinar la seroconversión mediante un ELISA
específico de la proteasa de cisteína.
Los ratones inmunizados son divididos
aleatoriamente en dos grupos de 12 animales. Cada grupo es desafiado
posteriormente con la cepa origen de la proteasa de cisteína
(desafío homólogo) o con una cepa que exprese una variante distinta
de la proteasa de cisteína (desafío heterólogo). Se prepara una
única solución madre de cada organismo de desafío que expresa la
proteasa de cisteína a partir de un cultivo de una noche y se ajusta
a 10^{6} UFC/ml. Se administran a los ratones (alojados seis por
jaula por cohorte) 100 \mul de la suspensión bacteriana mezclada
con un volumen igual de esferas de dextrano estériles. Los animales
son inoculados s.c. en el flanco derecho con una jeringa de
tuberculina. Las diluciones bacterianas son preparadas en el momento
del desafío con el fin de determinar el número exacto de UFC
utilizado. Los animales control negativo consisten en un grupo de 12
ratones inmunizados de manera ficticia. Estos ratones son
"desafiados" solamente con medio estéril más las esferas de
dextrano.
Se recoge saliva y suero de todos los ratones
inmunizados y control. La saliva completa es recogida mediante
estimulación con pilocarpina (920 \mug/ratón, subcutánea) y
centrifugada a 15.000 x g durante 20 minutos. El material es
dividido y se añaden inhibidores de proteasa a una de las alícuotas.
El almacenamiento es a -80ºC. El suero es recogido mediante
extracción de sangre de la vena de la cola. Saliva y suero
individuales y agrupados procedentes de los ratones asignados a cada
cohorte, y de los ratones control, son analizados para determinar
anticuerpos específicos hacia la proteasa de cisteína mediante
ELISA.
Los animales son pesados inmediatamente antes del
desafío y cada 24 horas después del desafío. Se calcularán los
volúmenes de los abscesos y el área de dermonecrosis, y se
determinará una curva del tamaño de las lesiones. Los tamaños medios
de las lesiones son comparados estadísticamente entre los grupos
mediante un análisis de varianza (ANOVA).
Ratones macho no consanguíneos Swiss CD1 fueron
inoculados con PBS (n= 10) o con 20 \mug de proteasa de
cisteína estreptocócica purificada en PBS (n=9)
subcutáneamente el día 1, seguido por inoculaciones
intraperitoneales de los mismos tratamientos los días 7, 14, 21, 42,
50, 57, 63 y 79, en un total de nueve inmunizaciones. Se analizaron
los niveles séricos de anticuerpos hacia la proteasa de cisteína
mediante ELISA los días 29, 71 y 84, y los ratones fueron desafiados
con la cepa MGAS 315 el día 93, dos semanas después de la última
inmunización. Los ratones fueron monitarizados a intervalos de 3
horas, se registró la mortalidad y se representaron gráficamente
curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y se
analizaron según se describió anteriormente. Los resultados (Fig.
11) muestran que la inmunización intraperitoneal con proteasa de
cisteína estreptocócica purificada confería también una protección
significativa (análisis de rangos logarítmicos; X^{2}; P <
0,01) frente al desafío letal con el aislado MGAS 315 altamente
virulento de S. pyogenes. Es de resaltar que la inmunización
con la proteasa de cisteína confería también una protección
significativa frente a la mortalidad temprana inducida por S.
pyogenes en los ratones. Por ejemplo, los 10 ratones del grupo
control habían muerto todos 28 horas después del desafío, pero
murieron solamente 4 de 9 ratones en el grupo inmunizado con la
proteasa (diferencia de proporciones; z; P < 0,003). Además, a
la finalización del experimento a las 120 horas, sobrevivieron 2 de
9 ratones en el grupo tratado con la proteasa pero no sobrevivió
ninguno de los 10 ratones del grupo control (diferencia de
proporciones; z; P < 0,059). Por tanto, la inmunización activa
con la proteasa de cisteína estreptocócica confería una protección
significativa frente a la infección letal por estreptococos del
Grupo A.
Todas las patentes y publicaciones mencionadas en
esta especificación son indicativas de los niveles de aquellas
personas expertas en la técnica a la que pertenece la invención.
Una persona experta en la técnica apreciará
fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar
a cabo los objetos y obtener las finalidades y ventajas mencionadas,
además de las inherentes a la misma. Los presentes ejemplos, junto
con los métodos, procedimientos, tratamientos, moléculas y
compuestos específicos descritos en la presente son actualmente
representativos de las realizaciones preferidas, son ejemplares y no
están concebidos como limitaciones del ámbito de la invención. A los
expertos en la técnica se les ocurrirán cambios de la presente y
otras utilizaciones que están incluidas dentro del espíritu de la
invención según está definida por el ámbito de las
reivindicaciones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Musser, M.D., James M.
\hskip3.9cmKapur, M.D., Vivek
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Métodos y Composiciones para la Identificar Streptococcus
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 58
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: LAW OFFICES OF BARBARA RAE-VENTER
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: P.O. Box 60039
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Palo Alto
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 94306
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICUTUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: (A Ser Asignado)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 14-SEP-1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/306.542
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 14-SEP-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Rae-Venter Ph. D., Barbara
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32.750
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: BAYL-004/03WO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (415) 926-6205
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (415) 424-8760
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 171
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Val Ile Glu Lys Val Lys Pro Gly Glu Gln
Ser Phe Val Gly}
\sac{Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 203
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr His Asn Tyr Pro Asn Lys Gly Leu Lys Asp
Tyr Thr Tyr Thr}
\sac{Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 247
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Thr Tyr Ser Gly Arg Glu Ser Asn Val Gln
Lys Met Ala Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 344
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asp Gly Ala Asp Gly Arg Asn Phe Tyr
His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 398 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: MGAS 1719
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPEB7 (proteasa de cisteína)
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN SOBRE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Kapur, V.
\hskip4.65cmTopouzis, S.
\hskip4.65cmMajesky, M.W.
\hskip4.65cmLi, L.-L.
\hskip4.65cmHamrick, M.R.
\hskip4.65cmHamill, R.J.
\hskip4.65cmPatti, J.M.
\hskip4.65cmMusser, J.M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: Una proteasa de cisteína extracelular conservada de Streptococcus pyogenes corta la fibronectina humana y degrada la vitronectina
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Microb. Pathog.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 15
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PÁGINAS: 327-346
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 1993
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: dominio de unión a nucleótidos de la proteasa de cisteína
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Gly Lys Val Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1197 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: MGAS 1719
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB7 (proteasa de cisteína)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: MGAS 1719
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: proteasa de cisteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 146-156
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Pro Val Val Lys Ser Leu Leu Asp Ser
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPEB-X
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTGTCAGTG TCAACTAACC GT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPEB-2
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTGTGTCT GATGGATAGC TT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPEB-1
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTTCTGGCT CTAATATGTA TGT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPEB-3
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTATTGAAA AAGTAAAACC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPEB-4
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTCAATAA CAGGTGTCAA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: SPEB-Y
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTCCTGAAA CGATAACAAA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: Péptido 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 303
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Gln Ile Asn Arg Ser Asp Phe Ser Lys Gln
Asp Trp Glu Ala}
\sac{Gln Ile Asp Lys Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: Péptido 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 304
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Gln Ile Asn Gly Asp Phe Ser Lys Gln Asp
Trp Glu Ala Gln}
\sac{Ile Asp Lys Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: Péptido 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 304
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Gln Ile Asn Ser Asp Phe Ser Lys Gln Asp
Trp Glu Ala Gln}
\sac{Ile Asp Lys Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 304
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Ile Asn Arg Ser Asp Phe Ser Lys
Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 304
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Ile Asn Arg Gly Asp Phe Ser Lys
Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCC CTCCCCAATA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB2
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAGGT GCCCCCGCCT CTCTCCAACG CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB3
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCT CTCCCCAACA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB4
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCTCCCGCCT CTCCCCAACA CTACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB5
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCT CTCCCCAATA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB6
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCC CTCCCTAACA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB7
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCTCCCGCCC CTCTCCAACG CGACTACTAT CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB8
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCTCCCGCCT CTCCCCAACA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB9
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGGCAAAGT GCCCCCGCCT CTCCCCAACA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB10
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGC GCCCCCGCCT CTCCCCAACA CGACCACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB11
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGGTAAAGT GCCCTCGCCC CTCCCCAACA TTACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB12
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAACAAAGT GCCCCCACCC CTCCCCAATA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB13
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCT CGCCCCAACA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB14
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCC CTCCCCAACA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB15
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCT CTCCCCAACG CGACTACTCC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB16
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCT CGCCCCAACA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB17
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCC CTCCCCAACA CTACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB18
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGGTAAAGT GCCCTCGCCT CTCCCCCACA TTACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB19
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GTTCCCGCCC TTCCCCAACA TGACTACTAC TAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB20
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCTCCCGCCC TTCTCCAACA CGACCACTAC CAGGC
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB21
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGTCC CTCCCCAACA CTACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB22
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCC CTCCCCAACG CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB23
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGGCAAAGT GCCCCTGCCT CTCCCCAACA CGGCTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB24
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATAGCAAAGT GCTCCCGCCC TTCTCCAACG CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB25
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAGCAAAGT ACTCCCGCCC CTCCCCAACA TTACTACCAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB26
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCT CGCCCCAACA CGACTATTAC CGGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB27
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCC CTCCTCAATA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB28
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCGAAGT GCCCCCGCCT CTCCCCAACA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB29
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAGTG CCCCCGCCTT TCCCCAACAT GACTACTACC AGGA
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB30
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCTCCCGCCC CTCTCCAACA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB31
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGGCAAAGT GCCCTCGCCT CTCCCCAACA TGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB32
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCT TTCCCCAACA TTACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB33
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCT CTCTCCAACG CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB34
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCT TTCCCCAACG CGACTACTCC CAAGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB35
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCC CTCCCCAGTA CGATTACTAT CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB36
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCCCCGCCT CTTTCCAACG CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB37
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCTCCCGCTC CTCTCCAACA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB38
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAGT GCCTCCGCCT CTCTCCAACG CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: speB39
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGCAAAAT GCCCCCGCCC CTCTCCAACA CGACTACTAC CAGGA
\hfill45
Claims (16)
1. Una vacuna que comprende un vehículo no tóxico
fisiológicamente aceptable que contiene una exotoxina B pirogénica
estreptocócica (SPEB) no proteolítica purificada que confiere
inmunidad a un mamífero frente a la infección por estreptococos del
Grupo A, en la que la SPEB contiene al menos una sustitución de
aminoácidos en Cys-192 o
His-340.
2. Una vacuna como la reivindicada en la
reivindicación 1, cuando es adaptada para conferir inmunidad frente
a una infección seleccionada de entre faringitis, amigdalitis,
infecciones cutáneas, fiebre reumática aguda, escarlatina,
glomerulonefritis post-estreptocócica, sepsis y
síndrome similar al choque tóxico.
3. Una vacuna como la reivindicada en la
reivindicación 1 o en la reivindicación 2, que comprende además un
antígeno proteína M estreptocócica purificada.
4. Una vacuna como la reivindicada en cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, cuando es adaptada para ser
administrada mediante administración parenteral.
5. Una vacuna como la reivindicada en cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, cuando es adaptada para
administración parenteral mediante administración subcutánea o
administración intramuscular.
6. Una vacuna como la reivindicada en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, cuando es adaptada para ser
administrada oralmente.
7. Una vacuna como la reivindicada en cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, cuando es adaptada para ser
administrada en dosis múltiples.
8. Una vacuna como la reivindicada en cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, cuando es adaptada para ser
administrada a un humano.
9. Una proteína exotoxina B pirogénica
estreptocócica (SPEB) no proteolítica purificada, que comprende al
menos una sustitución de aminoácidos en Cys-192 o
His-340.
10. Una proteína como la reivindicada en la
reivindicación 9, en la que la sustitución de aminoácidos es
Cys-
192 \rightarrow Ala-192, Cys-192 \rightarrow Ser-192 o His-340 \rightarrow Ala-340.
192 \rightarrow Ala-192, Cys-192 \rightarrow Ser-192 o His-340 \rightarrow Ala-340.
11. La utilización de una exotoxina B pirogénica
estreptocócica (SPEB) no proteolítica purificada según se definió
en la reivindicación 9 ó 10, para la fabricación de una vacuna para
conferir inmunidad a un mamífero frente a la infección por
estreptococos del Grupo A.
12. La utilización según se reivindicó en la
reivindicación 11, en la que la vacuna es adaptada para conferir
inmunidad frente a una infección seleccionada de entre faringitis,
amigdalitis, infecciones cutáneas, fiebre reumática aguda,
escarlatina, glomerulonefritis post-estreptocócica,
sepsis y síndrome similar al choque tóxico.
13. La utilización según se reivindicó en la
reivindicación 11 ó 12, en la que la vacuna comprende además un
antígeno proteína M estreptocócica purificada.
14. La utilización según se reivindicó en
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que la vacuna es
adaptada para ser administrada mediante administración parenteral,
subcutánea, intramuscular u oral.
15. La utilización según se reivindicó en
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en la que la vacuna es
adaptada para ser administrada en múltiples dosis.
16. La utilización según se reivindicó en
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en la que la vacuna es
adaptada para ser administrada a un humano.
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